JP3855055B2 - Ｗｘ遺伝子発現抑制方法および該方法に用いられる遺伝子 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物胚乳のアミロース産生量を制御する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、イネを始めとする植物の育種は、変異の収集（野性種）、栽培種からの無作為的な変異の誘発、あるいはそれらの交配により行われてきた。これは方向性のない雑多な変異の中から目的の形質を持つものを選び出し、純系を作り上げるという、実に多大な労力と時間を要するプロセスである。
【０００３】
これに対して遺伝子操作を用いた組換え植物の作出は、目的の形質を司る遺伝子のみを対象にして人工的に改変し導入するので、極めて方向性の高い育種方法を提供することができる。
【０００４】
ところで、イネ種子においてデンプン成分の一種であるアミロースは、その含有量によって炊飯米の食味や、コメデンプンの加工特性を左右する。日本人の米飯に供されるうるち米は、デンプンの１５−３０％程度がアミロース、７０−８５％程度がアミロペクチンであるが、一般にアミロース含量の低い、従って、粘りのある物が良食味の傾向にある。また、アミロースを全くもたないものは、もち米としてうるち米と区別して食している。
【０００５】
胚乳のアミロース産生を司るのはデンプン合成酵素であるということがトウモロコシの遺伝生化学的解析から明らかにされ、またイネ胚乳のアミロース含量は登熟期におけるデンプン合成酵素タンパク質の生産量および活性に依存することが判明している。デンプン合成酵素（WXタンパク質）の遺伝子（Wx遺伝子）はトウモロコシ、大麦、イネ、ジャガイモなどで単離され、各配列が決定されている。
【０００６】
このアミロース合成の鍵酵素であるWx遺伝子の発現を制御し、アミロース量を変える方法として、アンチセンス法が試みられてきた。しかしながらこの方法の欠点は、直接導入法を用いているために形質転換植物の作成効率が悪く、抑制効果が低いことである。また、アンチセンス遺伝子を導入した個体毎に抑制効果にばらつきが生じるという問題もある（例えば特許文献１および２を参照）。
【０００７】
さらにアンチセンス遺伝子導入のためのプロモーターを換えることによって遺伝子発現の抑制程度を変える方法では、様々なプロモーターを単離し、転写活性を調べたうえでベクターに用いなければならない。
【０００８】
近年、遺伝子発現の抑制法としてＲＮＡｉ法が利用されつつある。ＲＮＡｉ（RNA interference）とは、ｄｓＲＮＡ（２本鎖ＲＮＡ）の細胞内への導入によって、ｄｓＲＮＡと相同な配列を持つ遺伝子の発現が抑制される現象であり、様々な生物種で遺伝子機能解析に用いられている。ただし、一般的に植物では、細胞壁が存在しｄｓＲＮＡを細胞内に直接導入することが難しいとされている。
【０００９】
【特許文献１】
特開平５−１５３９８１号公報
【特許文献２】
特開平５−１６８４８２号公報
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的はデンプン合成遺伝子であるWx遺伝子の発現を効率よく抑制する方法、およびWx遺伝子発現の抑制量を調節する方法を提供することである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ｄｓＲＮＡ（２本鎖ＲＮＡ）の細胞内での発現により、ｄｓＲＮＡと相同な配列を持つ遺伝子の発現が抑制される現象であるＲＮＡｉ（RNA interference）法を利用して、遺伝子導入植物において胚乳特異的に顆粒結合型デンプン合成遺伝子であるWx遺伝子の発現を抑制する方法、および、Wx遺伝子発現の抑制量を調節する方法を開発した。
【００１２】
即ち、本発明は、上流から順に、胚乳で発現するプロモーター、Wx遺伝子の第１エクソンと相同な正方向配列、および、該正方向配列に相補的な逆方向配列を含む遺伝子を提供する。
【００１３】
「胚乳で発現するプロモーター」は、胚乳で発現するものであれば特に限定されないが、ベクターの構築が容易であるため、特にWx遺伝子由来のプロモーターが好適に用いられる。
【００１４】
「Wx遺伝子の第１エクソンと相同な正方向配列」とは、Wx遺伝子の第１エクソンの配列に対して相同性を有する配列であって、その長さが２１ｂｐ以上の配列からなり、ベクターなどのコンストラクトにおいて転写と同じ方向に挿入された配列のことを指す。
【００１５】
「該正方向配列に相補的な逆方向配列」とは、上記の「Wx遺伝子の第１エクソンと相同な正方向配列」に対して相補性を有する配列からなる。即ち、ベクターなどのコンストラクトにおいて正方向配列と相同性を有する配列が転写と逆方向に挿入された配列を指す。
【００１６】
本発明の遺伝子を植物に導入することによって、胚乳におけるWx遺伝子の発現が抑制される。
【００１７】
即ち、Wx遺伝子の第１エクソンと相同な正方向配列、および、該正方向配列に相補的な逆方向配列を含むＤＮＡは、胚乳においてプロモーターにより誘導されてｍＲＮＡへと転写される。正方向配列から転写された一本鎖ＲＮＡと逆方向配列から転写された一本鎖ＲＮＡは、相補的であるため互いに水素結合により、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を形成し、これがＲＮＡｉ、即ち、標的Wx遺伝子の発現の抑制を引き起こすと考えられる。
【００１８】
Wx遺伝子の第１エクソンは、Wx遺伝子の５’ＵＴＲ領域に位置するが、ＲＮＡｉはこのような非コード領域の配列を用いることによっても起こる現象である。
【００１９】
正方向配列と逆方向配列とは直接連結していてもよいが、それらの間に介在するスペーサー配列を有していてもよい。スペーサー配列は特に限定されないが、例えばイントロン配列、具体的には、Wx遺伝子由来の第１イントロン配列が好適に用いられる。
【００２０】
本発明による第１の態様において好適に用いられるイントロンとしては、イネWx遺伝子由来の第１イントロン、例えば、野生型イネ対立遺伝子Wx a 由来の第１イントロンが挙げられる。イネ対立遺伝子Wx a 遺伝子の塩基配列を図１〜５（配列番号１）に示す。
【００２１】
本発明の第２の態様においては、スペーサー配列として、Wx遺伝子の第１イントロンのスプライスコンセンサス配列に置換配列を持つ配列が用いられる。このような置換配列を有する対立遺伝子由来の第１イントロンをスペーサー配列として用いることによって、イントロンのスプライシングによる切り出し効率が変化し、Wx遺伝子発現の抑制の程度が変化する。
【００２２】
本発明は、上述したような遺伝子を含有するベクターを提供する。更に本発明は、該ベクターを植物、好ましくはイネ科植物、さらに好ましくは、イネに導入することによって、胚乳においてWx遺伝子の発現を抑制する方法を提供する。
【００２３】
本発明はまた、上記のような遺伝子を導入した植物を提供する。
【００２４】
本発明はさらに、スペーサー配列をWx遺伝子の第１イントロン配列とし、その切り出し効率を変化させることによって、Wx遺伝子の発現の抑制量を制御する方法を提供する。
【００２５】
【発明の実施の態様】
本発明において用いるWx遺伝子の第１エクソンとしては、あらゆる植物由来のものを用いることができるが、イネ科植物、特にイネ由来のものが好適である。
【００２６】
また、遺伝子を導入される標的植物の起源と、導入するWx遺伝子の起源は、同じであっても異なっていてもよい。標的遺伝子と導入遺伝子の相同性を考慮すると、同じ植物種由来のものが特に好ましい。
【００２７】
本発明において、Wx遺伝子発現の抑制に用いる「胚乳で発現するプロモーター」としては、植物へ導入した際に胚乳で目的とする遺伝子を発現させることができるものであれば特に限定されない。かかるプロモーターは当業者によく知られており、例えば、Wxプロモーター、アクチン１、ユビキチン、Ａｄｈ、イネアレルゲンタンパク質、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターなどが挙げられる。これらの中では、ベクターの構築が容易であることからWxプロモーターが好適に用いられる。Wxプロモーターとしては、イネおよびトウモロコシ由来のものが特に好適に用いられる。
【００２８】
本発明の遺伝子において、正方向配列および逆方向配列と標的遺伝子Wxとの完全な相同性は、必須ではない。即ち、遺伝子の突然変異、多型、又は進化上の分岐による配列の変動は容認される。標的遺伝子に対する挿入、欠失、及び一塩基点突然変異を有するｄｓＲＮＡ鎖もまた、抑制に有効である。具体的には、ＲＮＡｉに用いる遺伝子は、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列の同一性を有するものが好適に用いられる。
【００２９】
また、正方向配列と逆方向配列は、転写された後に二本鎖ＲＮＡを形成し得るものであればよい。両者の相補性は、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％であると、効率的にｄｓＲＮＡが形成される。
【００３０】
正方向配列および逆方向配列の長さは、ＲＮＡｉが起こり得る長さであればよく、典型的には、２１ｂｐ以上、好ましくは９０ｂｐ以上、最も好ましくは第１エクソンの全長である。
【００３１】
本発明の第１の態様においては、イネの野生型対立遺伝子である、Wx a 遺伝子由来の第１イントロンが好適に用いられる。この場合、イントロン配列はスプライシングによって効率的に切り出され、正方向配列と逆方向配列とからなるｄｓＲＮＡによるＲＮＡｉが高い抑制効率で起こる。
【００３２】
本発明の第２の態様においては、スペーサー配列として、Wx遺伝子のスプライスコンセンサス配列に置換配列を持つ第１イントロンが用いられる。例えば、イネの対立遺伝子であって、Wx a と比較した場合、第一イントロンの５’側に位置するスプライスコンセンサス配列ＡＧ／ＧＴにおいて、第１イントロンの５’末端に置換変異ＡＧ／ＴＴを有することによりスプライス効率が低くなっている、Wx b 遺伝子由来の第１イントロンが好適に用いられる。この場合、イントロンのスプライシングによる切り出し効率が低く、ｄｓＲＮＡによるＲＮＡｉ阻害効果が、第１の態様による場合と比べて低くなる。
【００３３】
本発明において標的とする植物は、単子葉穀類、好ましくはイネ科植物、例えばイネ、コムギ、オオムギ、トウモロコシ等、さらに好ましくはイネである。植物へのベクターの導入には、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、アグロバクテリウムを介する方法、パーティクルガン法など、当業者に公知の種々の方法を用いることができる。それぞれの方法に適したベクターの調製、形質転換植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である（Toki S, et al: Plant Physiol 100: 1503, 1995）。
【００３４】
例えば、イネにおいて形質転換植物体を作出する手法については、ポリエチレングリコールを用いてプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（インド型イネ品種が適している）を再生させる方法（Datta SK: In Gene Transfer To Plants（Potrykus I and Spangenberg, Eds） pp.66-74, 1995）、電気パルスによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（日本型イネ品種が適している）を再生させる方法（Toki S, et al: Plant Physiol 100: 1503, 1992）、パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を再生させる方法（Christou P,et al: Biotechnology 9: 957, 1991）、およびアグロバクテリウムを介して遺伝子を導入し、植物体を再生させる方法（Hiei Y, et al: Plant J 6: 271, 1994）など、いくつかの技術が既に確立し、本願発明の技術分野において広く用いられている。本発明においては、これらの方法を好適に用いることができる。
【００３５】
本発明において、Wx遺伝子発現の抑制のために植物を遺伝子へ導入する際に用いるベクターは、遺伝子導入手段に応じて適宜選択すればよく、特に限定されない。例えば、アグロバクテリウムによる遺伝子導入法を用いる場合は、薬剤耐性遺伝子などの選択用の遺伝子を有するバイナリーベクター、例えば、ｐＰＺＰ２Ｈ−ｌａｃ等が好適に用いられる。
【００３６】
本発明のベクターの作成方法としては、特に限定されず、当業者に周知のいかなる方法を用いてもよい。本発明のベクターにおいては、３’末端側へターミネーターを挿入するが、ターミネーターとしては公知のものがいずれも好適に用いられ、nosT、CMV35Sなどが例示される。
【００３７】
第１の態様の具体例として、上流から順に、イネWx a プロモーター、Wx a 第一エクソンの正方向配列、Wx a 第一イントロンおよびWx a 第一エクソンの逆方向配列が含まれる遺伝子を用いる場合、イントロンの効率的な切り出しによって、Wx遺伝子の発現が高度に抑制される。
【００３８】
一方、第２の態様の具体例として、上流から順に、イネWx b プロモーター、Wx b 第一エクソンの正方向配列、Wx b 第一イントロンおよびWx b 第一エクソンの逆方向配列が含まれる遺伝子である場合、イントロンの切り出し効率が低いため、Wx遺伝子の発現の抑制は中程度のものとなる。
【００３９】
したがって、本発明はまた、上流から順に、胚乳で発現するプロモーター、Wx遺伝子の第１エクソンと相同な正方向配列、Wx遺伝子由来の第１イントロン、および、該正方向配列に相補的な逆方向配列を含む遺伝子を導入して胚乳においてWx遺伝子の発現を抑制する方法であって、イントロンの切り出し効率を変化させることによって、胚乳におけるWx遺伝子の発現を制御する方法を提供する。
【００４０】
好適な態様において、イントロンの切り出し効率は、スプライスコンセンサス配列に変異を導入することによって変化させることができる。なお、イントロンをスペーサー配列として用いた場合、イントロンが切り出されない状況では成熟したｍＲＮＡとして核外に放出されず、ＲＮＡｉをトリガーすることはできないと考えられる。したがって、例えば、イントロンのスプライス効率を変える方法としては、スプライス部位の認識・受容部位の置換、切り出しに関わる遺伝子産物の発現量の変化、温度感受性の導入、イントロンの構造の改変などによって、ＲＮＡｉの効果を制御することができ、それによって標的Wx遺伝子の発現量を調節することができる。特に、スプライスコンセンサス配列に変異を誘導することによって好適な制御が可能となる。
【００４１】
具体的には上述の第２の態様におけるように、スペーサー配列として、イネWx遺伝子の第一イントロンの５’側に位置するスプライスコンセンサス配列ＡＧ／ＧＴにおいて、第１イントロンの５’末端の置換変異ＡＧ／ＴＴを有することによりスプライス効率が低くなっている(Isshiki et al.,Plant J 15, 133-138, 1998)、Wx b 遺伝子由来の第１イントロンを用いた場合はイントロンのスプライシングによる切り出し効率が低く、ｄｓＲＮＡによるＲＮＡｉ阻害効果が、第１の態様、即ちイネ野生型対立遺伝子Wx a 遺伝子由来の第１イントロンを用いた場合と比べて低くなる。このようにスプライスコンセンサス配列を置換変異を持つWx b 型配列へ換えることによりスプライシング効率を低く抑え、ｄｓＲＮＡの合成量を低下させ、遺伝子発現の中程度の抑制が可能となる。
【００４２】
本明細書中、塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムBLAST（Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:2264-2268, 1990、Karlin S &Altschul SF: Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993）を用いて決定できる。BLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTNやBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403, 1990）。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。
【００４３】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はその要旨を越えない限り本実施例に制約されるものではない。
【００４４】
イネ種子においてデンプン成分の一種であるアミロースの合成を担うWx遺伝子のプロモーターの下流に第１エクソンの逆向反復配列（即ち、正方向配列と逆方向配列の反復）の中心に野生型遺伝子Wx a 由来の第一イントロンをスペーサーとして挿入することにより、高い効率でWx遺伝子の発現を抑制するWxＲＮＡｉ遺伝子（ＷＲＩ−Ａ）を構築した（図６）。
このＷＲＩ−Ａ遺伝子を持つバイナリーベクター（ｐＷＲＩ−Ａ）をアグロバクテリウム法によりイネに導入したところ、高い効率でWx遺伝子の発現を抑制した。具体的には、９５％以上の遺伝子導入イネにおいて胚乳特異的にデンプン合成遺伝子の発現を抑制した。
【００４５】
一方、Wx a 第１イントロンの５’側切り出し部位のコンセンサス配列ＡＧ／ＧＴがＡＧ／ＴＴとなっているWx b 遺伝子由来の第１イントロンをスペーサーとして挿入した、WxＲＮＡｉ遺伝子（ＷＲＩ−Ｂ）を構築した（図６）。
このＷＲＩ−Ｂを持つバイナリーベクター（ｐＷＲＩ−Ｂ）を導入したところ、中程度の抑制効果が見られ、スプライス効率を変化させることでｄｓＲＮＡの合成量を低下させ、遺伝子発現効率を変化させることを可能にした。
【００４６】
実施例１
ＷＲＩ−Ａを含むバイナリベクターｐＷＲＩ−Ａの構築
イネWx遺伝子の野生型対立遺伝子であるWx a のプロモーター、第一イントロン、およびｃＤＮＡを含むｐWxＲ（ 図７, Itoh et al., 1997 Mol. Gen. Genet. 255, 351-358,）を鋳型として、プロモーター５'末端側ベクター配列（表１，ＰＵＣ−Ｆプライマー）より、第一イントロンの下流にある制限酵素ＢｇｌIIの切断部位下流（表１，ＷＡＸＹ−Ｒプライマー）までの領域をＰＣＲ法を用いて増幅した。得られた増幅産物は制限酵素ＢｇｌIIにより部分消化し、１％アガロースゲル電気泳動で分画後、約３.４ｋｂｐのバンドをゲルより切り出し、ＤＮＡ断片を精製・回収した。この断片を制限酵素ＳｍａIおよびＢａｍＨIで二重消化したｐＵＣ１９と連結したｐＷＲＩＡ−１を作成した（図７）。
【００４７】
次にｐＷＲＩＡ−１の第一イントロン３'側に第一エクソンを逆向きに挿入する為に、第一エクソン領域を増幅するプライマーを作成した。この際５'側プライマー（表１，Wx１ｅｘＨＦプライマー）にはＨｉｎｄIII認識配列、３'側プライマー（表１，Wx１ｅｘＳｓｅＲプライマー）配列にはＳｓｅ８３８７Iの認識配列が含まれるように作成した（表１）。次にＰＣＲ法により増幅した目的ＤＮＡ断片（約１４０ｂｐ）を、上記のＨｉｎｄIII及びＳｓｅ８３８７Iで切断し、ＨｉｎｄIII及びＳｓｅ８３８７Iで切断したｐＷＲＩＡ−１に連結し、ｐＷＲＩＡ−２を作成した（図８）。
【００４８】
アグロバクテリウム法を用いての遺伝子導入を行うためのバイナリーベクターとしてｐＰＺＰ２Ｈ−ｌａｃ（Fuse et al., 2001, Plant Biotechnology 18, 219-222；独立行政法人農業物資源研究所 矢野昌裕博士より分譲）を使用した。また、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ−ＲＮＡ遺伝子由来のターミネーターを用いた。ｐＣＫＲ５３２（Shimamoto et al., 1993, Mol. Gen. Genet. 239:354-360）１μｇを制限酵素ＫｐｎI及びＳａｌIを用いて二重消化し、１％アガロースゲル電気泳動によって２００ｂｐの断片（ターミネーターシグナル配列）を分画・精製し、ＫｐｎI及びＳａｌIで切断したｐＰＺＰ２Ｈ−ｌａｃに連結した（ｐＰＺＰ２Ｈ−３５ＳＴ）。
【００４９】
ｐＷＲＩＡ−２をＳａｃI及びＨｉｎｄIIIで切断し、アガロースゲル電気泳動によって、約３.５ｋｂｐの断片を分画・精製し、ＳａｃIおよびＨｉｎｄIIIで二重消化したｐＰＺＰ２Ｈ−３５Ｓと連結したｐＷＲＩ−Ａを構築し、形質転換用のプラスミドとした（図９）。ｐＷＲＩ−Ａをアグロバクテリウム（ＥＨＡ１０１株）に導入した。
【００５０】
実施例２
ＷＲＩ−Ｂを含むバイナリベクターｐＷＲＩ−Ｂの構築
ＰＣＲ増幅の鋳型にはWx b を持つキヌヒカリゲノムＤＮＡを用い、ｐＷＲＩＢ−１構築の際のＰＣＲプライマーにはＰＵＣ−Ｆプライマーの代わりにWxＰｒｏＥＫプライマーを、ＷＡＸＹ−Ｒプライマーの代わりにWxＯＲＦＢｇＲプライマー（共に表１）を使用した（図１０）。その後はｐＷＲＩ−Ａの構築と同様に行い、ｐＷＲＩ−Ｂを構築した。
【００５１】
実施例３
ｐＷＲＩ−ＡおよびｐＷＲＩ−Ｂを導入した形質転換カルスの選抜
粳米（品種：金南風）の完熟種子由来カルスの形成及びアグロバクテリウム法を利用した遺伝子導入法（Hiei et al., 1994, Plant J 6:271-282）に準じて行い、５０％次亜塩素酸ナトリウム溶液で表面消毒した金南風の完熟種子約３００粒をカルス誘導培地（Ｎ６培地）に植え、２〜３週間２８℃暗所で静置した。その後、直径１〜３ｍｍ程度のカルスをｐＷＲＩ−Ａを持つアグロバクテリウムとＮ６ＣＯ培地を用いて３日間２８℃で共存培養した。その後、５００μｇ／ｍｌのクラフォランを含む滅菌水でカルスを除菌洗浄し、５０μｇ／ｍｌのハイグロマイシンを含むＮ６ＳＥ選抜培地にて２８℃暗所にて２〜３週間培養した。形質転換したカルスは再生培地である３０μｇ／ｍｌハイグロマイシン／ＭＳＲＥ培地に移植し、１６ｈｒ明期／８ｈｒ暗期，ＴＡＩＴＥＣ社の人工気象器で培養し、植物体を再生させた。シュートの生じたカルスを発根培地であるＭＳＲＴ（ハイグロマイシンを含む）に移植し、再生したイネをプラスチックポットに移植し、閉鎖系温室にて生育させた。
【００５２】
実施例４
形質転換植物の選抜
ハイグロマイシンによって選抜し再生した形質転換イネよりゲノムＤＮＡを抽出し、サザンハイブリダイゼーション法によってさらに選抜した。ゲノムＤＮＡはヌクレアーペレット(nuclear pellet)法（Walbot and Warren,1988, Mol. Gen. Genet., 211, 27-34,）に準じて次のように調整した。形質転換体５０〜１００ｍｇを緩衝液（１５％ショ糖、５０ｍＭトリスー塩酸（ｐＨ８.０）、５０ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ、５００ｍＭ塩化ナトリウム）中で磨砕し、核画分を遠心分離した。これを界面活性剤（１.５％ＳＤＳ、２０ｍＭトリスー塩酸（ｐＨ８.０）、１０ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ）で処理し、遊離した核内成分を０.６倍容のイソプロパノールで沈殿させて核酸を得、これを７０％エタノールで洗浄後乾燥させてゲノム画分とした。この画分５μｇをサザンハイブリダイゼーションに用いた。ゲノムＤＮＡを切断する酵素としてＨｉｎｄIIIを用いることにより、導入遺伝子のコピー数を調べた。
【００５３】
５μｇのＤＮＡを３μｌのＨｉｎｄIIIで１００μｌのスケールで一晩切断し、エタノール沈殿で回収した。沈殿を１０μｌのＴＥ緩衝液（５０ｍＭトリスー塩酸、１０ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ、ｐＨ８.０）で懸濁し、０.７％アガロースゲル（１ｘＴＢＥバッファー）で２０Ｖ、一晩電気泳動した。
ナイロン膜への転写及びハイブリダイゼーションは別冊細胞工学「遺伝子工学の基礎」に準じて行った。電気泳動終了後のゲルを加水分解液（０.２５Ｍ ＨＣｌ）で１０分間、変性溶液（１.５Ｍ ＮａＯＨ， ０.５Ｍ ＮａＣｌ）で３０分間振とうさせた。アルカリトランスファー緩衝液（０.４Ｍ ＮａＯＨ）を用いてナイロン膜（Nylon Membrane positively charged：Roche diagnostics社）にキャピラリートランスファーした。一晩トランスファーしたナイロン膜は２ｘＳＳＣ（Molecular Cloning, Maniatis）で洗浄後、８０℃２時間で核酸を固定した。
【００５４】
内在性Wx遺伝子および導入遺伝子の両方を検出するために、WxＰｒｏＰ−Ｆプライマー及びWxＰｒｏＰ−Ｒプライマー（表１）を用いてWx遺伝子のプロモーター領域３'側約５００ｂｐの領域をＰＣＲによって増幅し、［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰによって標識し、プローブとして用いた。その結果、内在性のWx遺伝子は約１４.７ｋｂに単一のバンドとして、導入したｐＷＲＩ−Ａ，ｐＷＲＩ−Ｂはその他の分子サイズに検出された。そのバンド数により、導入遺伝子が１コピー保有系統から１０数コピー保有される系統まで分類し、ＷＲＩ−ＡおよびＷＲＩ−Ｂの効果を検討した。結果を表２および表３に示す。
【００５５】
ＷＲＩ−Ａ遺伝子を持つバイナリーベクター（ｐＷＲＩ−Ａ）をアグロバクテリウム法によりイネに導入、内在Wx遺伝子の発現を抑制する効率を調べたところ、９５％以上の独立の形質転換個体でWx遺伝子の発現が抑制された。また、ＷＲＩ−Ｂ遺伝子を持つバイナリーベクター（ｐＷＲＩ−Ｂ）を同様にイネに導入したところ、独立の形質転換個体のうち１００％の個体において、Wx遺伝子の発現を抑制し、その抑制の程度は中間的であった。
【００５６】
実施例５
ｐＷＲＩ−ＡおよびｐＷＲＩ−Ｂ導入イネにおけるWx遺伝子の機能抑制と遺伝ｐＷＲＩ−ＡおよびｐＷＲＩ−Ｂ導入イネにおけるWx遺伝子の機能抑制と遺伝を、胚乳のヨード染色により調べた。機能が抑制されない場合、青紫色、完全に機能抑制が働いた場合、茶褐色の表現型（モチ型胚乳）を示し、機能抑制の程度が弱ければその中間型の表現型になる。実験では１０−２０粒の自殖種子の胚乳を用いた。
【００５７】
その結果、ｐＷＲＩ−Ａを導入して得られた独立の再生植物体６０個体のうち５８個体（９６％）で強い機能抑制が観察された。つぎに、ｐＷＲＩ−Ｂを導入して得られた独立の再生植物体５３個体ではすべての個体の胚乳において抑制表現型が見られたが、抑制の程度は低かった。
さらに１コピーのみ遺伝子が導入された系統に限定して詳細な評価を行った。ｐＷＲＩ−Ａを導入して得られた１コピー導入系統では、１８系統のうち１７系統に完全なモチ型が観察された。また、ｐＷＲＩ−Ｂを導入して得られた１コピー導入系統の胚乳では１８系統のうち１７系統に中間型の抑制表現型が観察された。残りの１系統ではほぼ完全なモチ型を示す胚乳が一部に見られた。
【００５８】
実施例おいて使用したプライマーを以下の表１に示す。
【００５９】
【表１】
【００６０】
【表２】
【００６１】
【表３】
【００６２】
本発明によるＷＲＩ−ＡおよびＷＲＩ−Ｂ遺伝子をイネに導入した結果、均一で高い遺伝子機能抑制効果と、スプライス効率を変えて抑制程度を変化させることが可能になった。
【００６３】
即ち、Wx ＲＮＡｉ遺伝子（ＷＲＩ−Ａ）遺伝子を導入することで、形質転換イネ個体においてデンプン合成遺伝子の発現を胚乳特異的に抑制することができた。さらに、Wx ＲＮＡｉ遺伝子（ＷＲＩ−Ａ）内に挿入したWx第一イントロンの切り出し部位の配列に置換変異を導入したWxＲＮＡｉ遺伝子（ＷＲＩ−Ｂ）によって、Wx遺伝子と相同な配列を持つｄｓＲＮＡの発現量を低いレベルに制御し、アミロース合成を中程度に抑制する事が可能になった。
【図面の簡単な説明】
【図１】 公知のWx a 遺伝子の配列を示す図である。
【図２】 公知のWx a 遺伝子の配列（図１の続き）を示す図である。
【図３】 公知のWx a 遺伝子の配列（図２の続き）を示す図である。
【図４】 公知のWx a 遺伝子の配列（図３の続き）を示す図である。
【図５】 公知のWx a 遺伝子の配列（図４の続き）を示す図である。
【図６】 ＷＲＩ−Ａ遺伝子とＷＲＩ−Ｂ遺伝子の構造を示す図である。
【図７】 ｐＷＲＩ−Ａの作成過程（１）を示す図である。
【図８】 ｐＷＲＩ−Ａの作成過程（２）を示す図である。
【図９】 ｐＷＲＩ−Ａの作成過程（３）を示す図である。
【図１０】 ｐＷＲＩ−Ｂの作成過程を示す図である。
【配列表】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物胚乳のアミロース産生量を制御する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、イネを始めとする植物の育種は、変異の収集（野性種）、栽培種からの無作為的な変異の誘発、あるいはそれらの交配により行われてきた。これは方向性のない雑多な変異の中から目的の形質を持つものを選び出し、純系を作り上げるという、実に多大な労力と時間を要するプロセスである。
【０００３】
これに対して遺伝子操作を用いた組換え植物の作出は、目的の形質を司る遺伝子のみを対象にして人工的に改変し導入するので、極めて方向性の高い育種方法を提供することができる。
【０００４】
ところで、イネ種子においてデンプン成分の一種であるアミロースは、その含有量によって炊飯米の食味や、コメデンプンの加工特性を左右する。日本人の米飯に供されるうるち米は、デンプンの１５−３０％程度がアミロース、７０−８５％程度がアミロペクチンであるが、一般にアミロース含量の低い、従って、粘りのある物が良食味の傾向にある。また、アミロースを全くもたないものは、もち米としてうるち米と区別して食している。
【０００５】
胚乳のアミロース産生を司るのはデンプン合成酵素であるということがトウモロコシの遺伝生化学的解析から明らかにされ、またイネ胚乳のアミロース含量は登熟期におけるデンプン合成酵素タンパク質の生産量および活性に依存することが判明している。デンプン合成酵素（WXタンパク質）の遺伝子（Wx遺伝子）はトウモロコシ、大麦、イネ、ジャガイモなどで単離され、各配列が決定されている。
【０００６】
このアミロース合成の鍵酵素であるWx遺伝子の発現を制御し、アミロース量を変える方法として、アンチセンス法が試みられてきた。しかしながらこの方法の欠点は、直接導入法を用いているために形質転換植物の作成効率が悪く、抑制効果が低いことである。また、アンチセンス遺伝子を導入した個体毎に抑制効果にばらつきが生じるという問題もある（例えば特許文献１および２を参照）。
【０００７】
さらにアンチセンス遺伝子導入のためのプロモーターを換えることによって遺伝子発現の抑制程度を変える方法では、様々なプロモーターを単離し、転写活性を調べたうえでベクターに用いなければならない。
【０００８】
近年、遺伝子発現の抑制法としてＲＮＡｉ法が利用されつつある。ＲＮＡｉ（RNA interference）とは、ｄｓＲＮＡ（２本鎖ＲＮＡ）の細胞内への導入によって、ｄｓＲＮＡと相同な配列を持つ遺伝子の発現が抑制される現象であり、様々な生物種で遺伝子機能解析に用いられている。ただし、一般的に植物では、細胞壁が存在しｄｓＲＮＡを細胞内に直接導入することが難しいとされている。
【０００９】
【特許文献１】
特開平５−１５３９８１号公報
【特許文献２】
特開平５−１６８４８２号公報
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的はデンプン合成遺伝子であるWx遺伝子の発現を効率よく抑制する方法、およびWx遺伝子発現の抑制量を調節する方法を提供することである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ｄｓＲＮＡ（２本鎖ＲＮＡ）の細胞内での発現により、ｄｓＲＮＡと相同な配列を持つ遺伝子の発現が抑制される現象であるＲＮＡｉ（RNA interference）法を利用して、遺伝子導入植物において胚乳特異的に顆粒結合型デンプン合成遺伝子であるWx遺伝子の発現を抑制する方法、および、Wx遺伝子発現の抑制量を調節する方法を開発した。
【００１２】
即ち、本発明は、上流から順に、胚乳で発現するプロモーター、Wx遺伝子の第１エクソンと相同な正方向配列、および、該正方向配列に相補的な逆方向配列を含む遺伝子を提供する。
【００１３】
「胚乳で発現するプロモーター」は、胚乳で発現するものであれば特に限定されないが、ベクターの構築が容易であるため、特にWx遺伝子由来のプロモーターが好適に用いられる。
【００１４】
「Wx遺伝子の第１エクソンと相同な正方向配列」とは、Wx遺伝子の第１エクソンの配列に対して相同性を有する配列であって、その長さが２１ｂｐ以上の配列からなり、ベクターなどのコンストラクトにおいて転写と同じ方向に挿入された配列のことを指す。
【００１５】
「該正方向配列に相補的な逆方向配列」とは、上記の「Wx遺伝子の第１エクソンと相同な正方向配列」に対して相補性を有する配列からなる。即ち、ベクターなどのコンストラクトにおいて正方向配列と相同性を有する配列が転写と逆方向に挿入された配列を指す。
【００１６】
本発明の遺伝子を植物に導入することによって、胚乳におけるWx遺伝子の発現が抑制される。
【００１７】
即ち、Wx遺伝子の第１エクソンと相同な正方向配列、および、該正方向配列に相補的な逆方向配列を含むＤＮＡは、胚乳においてプロモーターにより誘導されてｍＲＮＡへと転写される。正方向配列から転写された一本鎖ＲＮＡと逆方向配列から転写された一本鎖ＲＮＡは、相補的であるため互いに水素結合により、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を形成し、これがＲＮＡｉ、即ち、標的Wx遺伝子の発現の抑制を引き起こすと考えられる。
【００１８】
Wx遺伝子の第１エクソンは、Wx遺伝子の５’ＵＴＲ領域に位置するが、ＲＮＡｉはこのような非コード領域の配列を用いることによっても起こる現象である。
【００１９】
正方向配列と逆方向配列とは直接連結していてもよいが、それらの間に介在するスペーサー配列を有していてもよい。スペーサー配列は特に限定されないが、例えばイントロン配列、具体的には、Wx遺伝子由来の第１イントロン配列が好適に用いられる。
【００２０】
本発明による第１の態様において好適に用いられるイントロンとしては、イネWx遺伝子由来の第１イントロン、例えば、野生型イネ対立遺伝子Wx a 由来の第１イントロンが挙げられる。イネ対立遺伝子Wx a 遺伝子の塩基配列を図１〜５（配列番号１）に示す。
【００２１】
本発明の第２の態様においては、スペーサー配列として、Wx遺伝子の第１イントロンのスプライスコンセンサス配列に置換配列を持つ配列が用いられる。このような置換配列を有する対立遺伝子由来の第１イントロンをスペーサー配列として用いることによって、イントロンのスプライシングによる切り出し効率が変化し、Wx遺伝子発現の抑制の程度が変化する。
【００２２】
本発明は、上述したような遺伝子を含有するベクターを提供する。更に本発明は、該ベクターを植物、好ましくはイネ科植物、さらに好ましくは、イネに導入することによって、胚乳においてWx遺伝子の発現を抑制する方法を提供する。
【００２３】
本発明はまた、上記のような遺伝子を導入した植物を提供する。
【００２４】
本発明はさらに、スペーサー配列をWx遺伝子の第１イントロン配列とし、その切り出し効率を変化させることによって、Wx遺伝子の発現の抑制量を制御する方法を提供する。
【００２５】
【発明の実施の態様】
本発明において用いるWx遺伝子の第１エクソンとしては、あらゆる植物由来のものを用いることができるが、イネ科植物、特にイネ由来のものが好適である。
【００２６】
また、遺伝子を導入される標的植物の起源と、導入するWx遺伝子の起源は、同じであっても異なっていてもよい。標的遺伝子と導入遺伝子の相同性を考慮すると、同じ植物種由来のものが特に好ましい。
【００２７】
本発明において、Wx遺伝子発現の抑制に用いる「胚乳で発現するプロモーター」としては、植物へ導入した際に胚乳で目的とする遺伝子を発現させることができるものであれば特に限定されない。かかるプロモーターは当業者によく知られており、例えば、Wxプロモーター、アクチン１、ユビキチン、Ａｄｈ、イネアレルゲンタンパク質、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターなどが挙げられる。これらの中では、ベクターの構築が容易であることからWxプロモーターが好適に用いられる。Wxプロモーターとしては、イネおよびトウモロコシ由来のものが特に好適に用いられる。
【００２８】
本発明の遺伝子において、正方向配列および逆方向配列と標的遺伝子Wxとの完全な相同性は、必須ではない。即ち、遺伝子の突然変異、多型、又は進化上の分岐による配列の変動は容認される。標的遺伝子に対する挿入、欠失、及び一塩基点突然変異を有するｄｓＲＮＡ鎖もまた、抑制に有効である。具体的には、ＲＮＡｉに用いる遺伝子は、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列の同一性を有するものが好適に用いられる。
【００２９】
また、正方向配列と逆方向配列は、転写された後に二本鎖ＲＮＡを形成し得るものであればよい。両者の相補性は、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％であると、効率的にｄｓＲＮＡが形成される。
【００３０】
正方向配列および逆方向配列の長さは、ＲＮＡｉが起こり得る長さであればよく、典型的には、２１ｂｐ以上、好ましくは９０ｂｐ以上、最も好ましくは第１エクソンの全長である。
【００３１】
本発明の第１の態様においては、イネの野生型対立遺伝子である、Wx a 遺伝子由来の第１イントロンが好適に用いられる。この場合、イントロン配列はスプライシングによって効率的に切り出され、正方向配列と逆方向配列とからなるｄｓＲＮＡによるＲＮＡｉが高い抑制効率で起こる。
【００３２】
本発明の第２の態様においては、スペーサー配列として、Wx遺伝子のスプライスコンセンサス配列に置換配列を持つ第１イントロンが用いられる。例えば、イネの対立遺伝子であって、Wx a と比較した場合、第一イントロンの５’側に位置するスプライスコンセンサス配列ＡＧ／ＧＴにおいて、第１イントロンの５’末端に置換変異ＡＧ／ＴＴを有することによりスプライス効率が低くなっている、Wx b 遺伝子由来の第１イントロンが好適に用いられる。この場合、イントロンのスプライシングによる切り出し効率が低く、ｄｓＲＮＡによるＲＮＡｉ阻害効果が、第１の態様による場合と比べて低くなる。
【００３３】
本発明において標的とする植物は、単子葉穀類、好ましくはイネ科植物、例えばイネ、コムギ、オオムギ、トウモロコシ等、さらに好ましくはイネである。植物へのベクターの導入には、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、アグロバクテリウムを介する方法、パーティクルガン法など、当業者に公知の種々の方法を用いることができる。それぞれの方法に適したベクターの調製、形質転換植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である（Toki S, et al: Plant Physiol 100: 1503, 1995）。
【００３４】
例えば、イネにおいて形質転換植物体を作出する手法については、ポリエチレングリコールを用いてプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（インド型イネ品種が適している）を再生させる方法（Datta SK: In Gene Transfer To Plants（Potrykus I and Spangenberg, Eds） pp.66-74, 1995）、電気パルスによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（日本型イネ品種が適している）を再生させる方法（Toki S, et al: Plant Physiol 100: 1503, 1992）、パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を再生させる方法（Christou P,et al: Biotechnology 9: 957, 1991）、およびアグロバクテリウムを介して遺伝子を導入し、植物体を再生させる方法（Hiei Y, et al: Plant J 6: 271, 1994）など、いくつかの技術が既に確立し、本願発明の技術分野において広く用いられている。本発明においては、これらの方法を好適に用いることができる。
【００３５】
本発明において、Wx遺伝子発現の抑制のために植物を遺伝子へ導入する際に用いるベクターは、遺伝子導入手段に応じて適宜選択すればよく、特に限定されない。例えば、アグロバクテリウムによる遺伝子導入法を用いる場合は、薬剤耐性遺伝子などの選択用の遺伝子を有するバイナリーベクター、例えば、ｐＰＺＰ２Ｈ−ｌａｃ等が好適に用いられる。
【００３６】
本発明のベクターの作成方法としては、特に限定されず、当業者に周知のいかなる方法を用いてもよい。本発明のベクターにおいては、３’末端側へターミネーターを挿入するが、ターミネーターとしては公知のものがいずれも好適に用いられ、nosT、CMV35Sなどが例示される。
【００３７】
第１の態様の具体例として、上流から順に、イネWx a プロモーター、Wx a 第一エクソンの正方向配列、Wx a 第一イントロンおよびWx a 第一エクソンの逆方向配列が含まれる遺伝子を用いる場合、イントロンの効率的な切り出しによって、Wx遺伝子の発現が高度に抑制される。
【００３８】
一方、第２の態様の具体例として、上流から順に、イネWx b プロモーター、Wx b 第一エクソンの正方向配列、Wx b 第一イントロンおよびWx b 第一エクソンの逆方向配列が含まれる遺伝子である場合、イントロンの切り出し効率が低いため、Wx遺伝子の発現の抑制は中程度のものとなる。
【００３９】
したがって、本発明はまた、上流から順に、胚乳で発現するプロモーター、Wx遺伝子の第１エクソンと相同な正方向配列、Wx遺伝子由来の第１イントロン、および、該正方向配列に相補的な逆方向配列を含む遺伝子を導入して胚乳においてWx遺伝子の発現を抑制する方法であって、イントロンの切り出し効率を変化させることによって、胚乳におけるWx遺伝子の発現を制御する方法を提供する。
【００４０】
好適な態様において、イントロンの切り出し効率は、スプライスコンセンサス配列に変異を導入することによって変化させることができる。なお、イントロンをスペーサー配列として用いた場合、イントロンが切り出されない状況では成熟したｍＲＮＡとして核外に放出されず、ＲＮＡｉをトリガーすることはできないと考えられる。したがって、例えば、イントロンのスプライス効率を変える方法としては、スプライス部位の認識・受容部位の置換、切り出しに関わる遺伝子産物の発現量の変化、温度感受性の導入、イントロンの構造の改変などによって、ＲＮＡｉの効果を制御することができ、それによって標的Wx遺伝子の発現量を調節することができる。特に、スプライスコンセンサス配列に変異を誘導することによって好適な制御が可能となる。
【００４１】
具体的には上述の第２の態様におけるように、スペーサー配列として、イネWx遺伝子の第一イントロンの５’側に位置するスプライスコンセンサス配列ＡＧ／ＧＴにおいて、第１イントロンの５’末端の置換変異ＡＧ／ＴＴを有することによりスプライス効率が低くなっている(Isshiki et al.,Plant J 15, 133-138, 1998)、Wx b 遺伝子由来の第１イントロンを用いた場合はイントロンのスプライシングによる切り出し効率が低く、ｄｓＲＮＡによるＲＮＡｉ阻害効果が、第１の態様、即ちイネ野生型対立遺伝子Wx a 遺伝子由来の第１イントロンを用いた場合と比べて低くなる。このようにスプライスコンセンサス配列を置換変異を持つWx b 型配列へ換えることによりスプライシング効率を低く抑え、ｄｓＲＮＡの合成量を低下させ、遺伝子発現の中程度の抑制が可能となる。
【００４２】
本明細書中、塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムBLAST（Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:2264-2268, 1990、Karlin S &Altschul SF: Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993）を用いて決定できる。BLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTNやBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403, 1990）。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。
【００４３】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はその要旨を越えない限り本実施例に制約されるものではない。
【００４４】
イネ種子においてデンプン成分の一種であるアミロースの合成を担うWx遺伝子のプロモーターの下流に第１エクソンの逆向反復配列（即ち、正方向配列と逆方向配列の反復）の中心に野生型遺伝子Wx a 由来の第一イントロンをスペーサーとして挿入することにより、高い効率でWx遺伝子の発現を抑制するWxＲＮＡｉ遺伝子（ＷＲＩ−Ａ）を構築した（図６）。
このＷＲＩ−Ａ遺伝子を持つバイナリーベクター（ｐＷＲＩ−Ａ）をアグロバクテリウム法によりイネに導入したところ、高い効率でWx遺伝子の発現を抑制した。具体的には、９５％以上の遺伝子導入イネにおいて胚乳特異的にデンプン合成遺伝子の発現を抑制した。
【００４５】
一方、Wx a 第１イントロンの５’側切り出し部位のコンセンサス配列ＡＧ／ＧＴがＡＧ／ＴＴとなっているWx b 遺伝子由来の第１イントロンをスペーサーとして挿入した、WxＲＮＡｉ遺伝子（ＷＲＩ−Ｂ）を構築した（図６）。
このＷＲＩ−Ｂを持つバイナリーベクター（ｐＷＲＩ−Ｂ）を導入したところ、中程度の抑制効果が見られ、スプライス効率を変化させることでｄｓＲＮＡの合成量を低下させ、遺伝子発現効率を変化させることを可能にした。
【００４６】
実施例１
ＷＲＩ−Ａを含むバイナリベクターｐＷＲＩ−Ａの構築
イネWx遺伝子の野生型対立遺伝子であるWx a のプロモーター、第一イントロン、およびｃＤＮＡを含むｐWxＲ（ 図７, Itoh et al., 1997 Mol. Gen. Genet. 255, 351-358,）を鋳型として、プロモーター５'末端側ベクター配列（表１，ＰＵＣ−Ｆプライマー）より、第一イントロンの下流にある制限酵素ＢｇｌIIの切断部位下流（表１，ＷＡＸＹ−Ｒプライマー）までの領域をＰＣＲ法を用いて増幅した。得られた増幅産物は制限酵素ＢｇｌIIにより部分消化し、１％アガロースゲル電気泳動で分画後、約３.４ｋｂｐのバンドをゲルより切り出し、ＤＮＡ断片を精製・回収した。この断片を制限酵素ＳｍａIおよびＢａｍＨIで二重消化したｐＵＣ１９と連結したｐＷＲＩＡ−１を作成した（図７）。
【００４７】
次にｐＷＲＩＡ−１の第一イントロン３'側に第一エクソンを逆向きに挿入する為に、第一エクソン領域を増幅するプライマーを作成した。この際５'側プライマー（表１，Wx１ｅｘＨＦプライマー）にはＨｉｎｄIII認識配列、３'側プライマー（表１，Wx１ｅｘＳｓｅＲプライマー）配列にはＳｓｅ８３８７Iの認識配列が含まれるように作成した（表１）。次にＰＣＲ法により増幅した目的ＤＮＡ断片（約１４０ｂｐ）を、上記のＨｉｎｄIII及びＳｓｅ８３８７Iで切断し、ＨｉｎｄIII及びＳｓｅ８３８７Iで切断したｐＷＲＩＡ−１に連結し、ｐＷＲＩＡ−２を作成した（図８）。
【００４８】
アグロバクテリウム法を用いての遺伝子導入を行うためのバイナリーベクターとしてｐＰＺＰ２Ｈ−ｌａｃ（Fuse et al., 2001, Plant Biotechnology 18, 219-222；独立行政法人農業物資源研究所 矢野昌裕博士より分譲）を使用した。また、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ−ＲＮＡ遺伝子由来のターミネーターを用いた。ｐＣＫＲ５３２（Shimamoto et al., 1993, Mol. Gen. Genet. 239:354-360）１μｇを制限酵素ＫｐｎI及びＳａｌIを用いて二重消化し、１％アガロースゲル電気泳動によって２００ｂｐの断片（ターミネーターシグナル配列）を分画・精製し、ＫｐｎI及びＳａｌIで切断したｐＰＺＰ２Ｈ−ｌａｃに連結した（ｐＰＺＰ２Ｈ−３５ＳＴ）。
【００４９】
ｐＷＲＩＡ−２をＳａｃI及びＨｉｎｄIIIで切断し、アガロースゲル電気泳動によって、約３.５ｋｂｐの断片を分画・精製し、ＳａｃIおよびＨｉｎｄIIIで二重消化したｐＰＺＰ２Ｈ−３５Ｓと連結したｐＷＲＩ−Ａを構築し、形質転換用のプラスミドとした（図９）。ｐＷＲＩ−Ａをアグロバクテリウム（ＥＨＡ１０１株）に導入した。
【００５０】
実施例２
ＷＲＩ−Ｂを含むバイナリベクターｐＷＲＩ−Ｂの構築
ＰＣＲ増幅の鋳型にはWx b を持つキヌヒカリゲノムＤＮＡを用い、ｐＷＲＩＢ−１構築の際のＰＣＲプライマーにはＰＵＣ−Ｆプライマーの代わりにWxＰｒｏＥＫプライマーを、ＷＡＸＹ−Ｒプライマーの代わりにWxＯＲＦＢｇＲプライマー（共に表１）を使用した（図１０）。その後はｐＷＲＩ−Ａの構築と同様に行い、ｐＷＲＩ−Ｂを構築した。
【００５１】
実施例３
ｐＷＲＩ−ＡおよびｐＷＲＩ−Ｂを導入した形質転換カルスの選抜
粳米（品種：金南風）の完熟種子由来カルスの形成及びアグロバクテリウム法を利用した遺伝子導入法（Hiei et al., 1994, Plant J 6:271-282）に準じて行い、５０％次亜塩素酸ナトリウム溶液で表面消毒した金南風の完熟種子約３００粒をカルス誘導培地（Ｎ６培地）に植え、２〜３週間２８℃暗所で静置した。その後、直径１〜３ｍｍ程度のカルスをｐＷＲＩ−Ａを持つアグロバクテリウムとＮ６ＣＯ培地を用いて３日間２８℃で共存培養した。その後、５００μｇ／ｍｌのクラフォランを含む滅菌水でカルスを除菌洗浄し、５０μｇ／ｍｌのハイグロマイシンを含むＮ６ＳＥ選抜培地にて２８℃暗所にて２〜３週間培養した。形質転換したカルスは再生培地である３０μｇ／ｍｌハイグロマイシン／ＭＳＲＥ培地に移植し、１６ｈｒ明期／８ｈｒ暗期，ＴＡＩＴＥＣ社の人工気象器で培養し、植物体を再生させた。シュートの生じたカルスを発根培地であるＭＳＲＴ（ハイグロマイシンを含む）に移植し、再生したイネをプラスチックポットに移植し、閉鎖系温室にて生育させた。
【００５２】
実施例４
形質転換植物の選抜
ハイグロマイシンによって選抜し再生した形質転換イネよりゲノムＤＮＡを抽出し、サザンハイブリダイゼーション法によってさらに選抜した。ゲノムＤＮＡはヌクレアーペレット(nuclear pellet)法（Walbot and Warren,1988, Mol. Gen. Genet., 211, 27-34,）に準じて次のように調整した。形質転換体５０〜１００ｍｇを緩衝液（１５％ショ糖、５０ｍＭトリスー塩酸（ｐＨ８.０）、５０ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ、５００ｍＭ塩化ナトリウム）中で磨砕し、核画分を遠心分離した。これを界面活性剤（１.５％ＳＤＳ、２０ｍＭトリスー塩酸（ｐＨ８.０）、１０ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ）で処理し、遊離した核内成分を０.６倍容のイソプロパノールで沈殿させて核酸を得、これを７０％エタノールで洗浄後乾燥させてゲノム画分とした。この画分５μｇをサザンハイブリダイゼーションに用いた。ゲノムＤＮＡを切断する酵素としてＨｉｎｄIIIを用いることにより、導入遺伝子のコピー数を調べた。
【００５３】
５μｇのＤＮＡを３μｌのＨｉｎｄIIIで１００μｌのスケールで一晩切断し、エタノール沈殿で回収した。沈殿を１０μｌのＴＥ緩衝液（５０ｍＭトリスー塩酸、１０ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ、ｐＨ８.０）で懸濁し、０.７％アガロースゲル（１ｘＴＢＥバッファー）で２０Ｖ、一晩電気泳動した。
ナイロン膜への転写及びハイブリダイゼーションは別冊細胞工学「遺伝子工学の基礎」に準じて行った。電気泳動終了後のゲルを加水分解液（０.２５Ｍ ＨＣｌ）で１０分間、変性溶液（１.５Ｍ ＮａＯＨ， ０.５Ｍ ＮａＣｌ）で３０分間振とうさせた。アルカリトランスファー緩衝液（０.４Ｍ ＮａＯＨ）を用いてナイロン膜（Nylon Membrane positively charged：Roche diagnostics社）にキャピラリートランスファーした。一晩トランスファーしたナイロン膜は２ｘＳＳＣ（Molecular Cloning, Maniatis）で洗浄後、８０℃２時間で核酸を固定した。
【００５４】
内在性Wx遺伝子および導入遺伝子の両方を検出するために、WxＰｒｏＰ−Ｆプライマー及びWxＰｒｏＰ−Ｒプライマー（表１）を用いてWx遺伝子のプロモーター領域３'側約５００ｂｐの領域をＰＣＲによって増幅し、［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰによって標識し、プローブとして用いた。その結果、内在性のWx遺伝子は約１４.７ｋｂに単一のバンドとして、導入したｐＷＲＩ−Ａ，ｐＷＲＩ−Ｂはその他の分子サイズに検出された。そのバンド数により、導入遺伝子が１コピー保有系統から１０数コピー保有される系統まで分類し、ＷＲＩ−ＡおよびＷＲＩ−Ｂの効果を検討した。結果を表２および表３に示す。
【００５５】
ＷＲＩ−Ａ遺伝子を持つバイナリーベクター（ｐＷＲＩ−Ａ）をアグロバクテリウム法によりイネに導入、内在Wx遺伝子の発現を抑制する効率を調べたところ、９５％以上の独立の形質転換個体でWx遺伝子の発現が抑制された。また、ＷＲＩ−Ｂ遺伝子を持つバイナリーベクター（ｐＷＲＩ−Ｂ）を同様にイネに導入したところ、独立の形質転換個体のうち１００％の個体において、Wx遺伝子の発現を抑制し、その抑制の程度は中間的であった。
【００５６】
実施例５
ｐＷＲＩ−ＡおよびｐＷＲＩ−Ｂ導入イネにおけるWx遺伝子の機能抑制と遺伝ｐＷＲＩ−ＡおよびｐＷＲＩ−Ｂ導入イネにおけるWx遺伝子の機能抑制と遺伝を、胚乳のヨード染色により調べた。機能が抑制されない場合、青紫色、完全に機能抑制が働いた場合、茶褐色の表現型（モチ型胚乳）を示し、機能抑制の程度が弱ければその中間型の表現型になる。実験では１０−２０粒の自殖種子の胚乳を用いた。
【００５７】
その結果、ｐＷＲＩ−Ａを導入して得られた独立の再生植物体６０個体のうち５８個体（９６％）で強い機能抑制が観察された。つぎに、ｐＷＲＩ−Ｂを導入して得られた独立の再生植物体５３個体ではすべての個体の胚乳において抑制表現型が見られたが、抑制の程度は低かった。
さらに１コピーのみ遺伝子が導入された系統に限定して詳細な評価を行った。ｐＷＲＩ−Ａを導入して得られた１コピー導入系統では、１８系統のうち１７系統に完全なモチ型が観察された。また、ｐＷＲＩ−Ｂを導入して得られた１コピー導入系統の胚乳では１８系統のうち１７系統に中間型の抑制表現型が観察された。残りの１系統ではほぼ完全なモチ型を示す胚乳が一部に見られた。
【００５８】
実施例おいて使用したプライマーを以下の表１に示す。
【００５９】
【表１】
【表２】
【表３】
本発明によるＷＲＩ−ＡおよびＷＲＩ−Ｂ遺伝子をイネに導入した結果、均一で高い遺伝子機能抑制効果と、スプライス効率を変えて抑制程度を変化させることが可能になった。
【００６３】
即ち、Wx ＲＮＡｉ遺伝子（ＷＲＩ−Ａ）遺伝子を導入することで、形質転換イネ個体においてデンプン合成遺伝子の発現を胚乳特異的に抑制することができた。さらに、Wx ＲＮＡｉ遺伝子（ＷＲＩ−Ａ）内に挿入したWx第一イントロンの切り出し部位の配列に置換変異を導入したWxＲＮＡｉ遺伝子（ＷＲＩ−Ｂ）によって、Wx遺伝子と相同な配列を持つｄｓＲＮＡの発現量を低いレベルに制御し、アミロース合成を中程度に抑制する事が可能になった。
【図面の簡単な説明】
【図１】 公知のWx a 遺伝子の配列を示す図である。
【図２】 公知のWx a 遺伝子の配列（図１の続き）を示す図である。
【図３】 公知のWx a 遺伝子の配列（図２の続き）を示す図である。
【図４】 公知のWx a 遺伝子の配列（図３の続き）を示す図である。
【図５】 公知のWx a 遺伝子の配列（図４の続き）を示す図である。
【図６】 ＷＲＩ−Ａ遺伝子とＷＲＩ−Ｂ遺伝子の構造を示す図である。
【図７】 ｐＷＲＩ−Ａの作成過程（１）を示す図である。
【図８】 ｐＷＲＩ−Ａの作成過程（２）を示す図である。
【図９】 ｐＷＲＩ−Ａの作成過程（３）を示す図である。
【図１０】 ｐＷＲＩ−Ｂの作成過程を示す図である。
【配列表】
Claims (18)
- 上流から順に、胚乳で発現するプロモーター、Wx遺伝子の第１エクソンと相同な正方向配列、および、該正方向配列に相補的な逆方向配列を含む遺伝子。
- プロモーターがWx遺伝子由来のプロモーターである請求項１に記載の遺伝子。
- 正方向配列と逆方向配列との間にスペーサー配列を含む請求項１または２に記載の遺伝子。
- スペーサー配列がWx遺伝子由来の第１イントロンである請求項３に記載の遺伝子。
- Wx遺伝子由来の第１イントロンが、イネの野生型Wx対立遺伝子であるWx a 遺伝子由来の第１イントロンである請求項４に記載の遺伝子。
- 上流から順に、イネWx a プロモーター、Wx a 第１エクソンの正方向配列、Wx a 第１イントロン、および、Wx a 第１エクソンの逆方向配列を含む、請求項５に記載の遺伝子。
- スペーサー配列がWx遺伝子のスプライスコンセンサス配列に置換配列を持つ第１イントロンである請求項３に記載の遺伝子。
- Wx遺伝子のスプライスコンセンサス配列に置換配列を持つ第１イントロンが、イネのWx a 遺伝子の第１イントロンの５’側スプライスコンセンサス配列ＡＧ／ＧＴにおいて、第１イントロンの５’末端に置換変異ＡＧ／ＴＴを有するものである、請求項７に記載の遺伝子。
- 上流から順に、イネWx b プロモーター、Wx b 第１エクソンの正方向配列、Wx b 第１イントロン、および、Wx b 第１エクソンの逆方向配列を含む、請求項８に記載の遺伝子。
- 請求項１〜９いずれかに記載の遺伝子を含むベクター。
- 請求項１から９のいずれかに記載の遺伝子を導入した植物。
- 植物がイネ科植物である請求項１１に記載の植物。
- 植物がイネである、請求項１２に記載の植物。
- 請求項１０記載のベクターを植物に導入することによって、胚乳特異的に Wx遺伝子の発現を抑制する方法。
- 植物がイネ科植物である請求項１４に記載の方法。
- 植物がイネである請求項１５に記載の方法。
- 上流から順に、胚乳で発現するプロモーター、Wx遺伝子の第１エクソンと相同な正方向配列、Wx遺伝子由来の第１イントロン、および、該正方向配列に相補的な逆方向配列を含む遺伝子を植物へ導入して胚乳特異的に Wx遺伝子の発現を抑制する方法であって、イントロンの切り出し効率を変化させることによって、胚乳特異的に Wx遺伝子の発現を制御する方法。
- イントロンの切り出し効率をスプライスコンセンサス配列に変異を導入することによって変化させる、請求項１７記載の方法。
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