CN117625681A - 一种核酸构建物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物基因工程领域，具体而言，本发明提供了一种核酸构建物，本发明采用特定结构的核酸构建物，对植物性状进行改良，提高了植物耐热性，具有广泛的应用前景。
Description
本申请要求申请日为2023年1月12日的中国专利申请CN 202310041727.3的优先权。本申请引用上述中国专利申请的全文。
技术领域
本发明涉及植物基因工程领域，具体地，涉及一种用于改良植物性状的核酸构建物。
背景技术
由于温室气体排放增加，全球气候变暖。高温直接影响植物的生长发育，导致产量和品质下降，植物有多种系统来保护自己免受热胁迫，热胁迫干扰蛋白质在合成过程中的正确折叠，导致错误折叠的蛋白质积累，热激反应(Heat shock response，HSR)和未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)能感知到错误折叠的蛋白质积累，从而减轻热胁迫带来的损害。
植物bZIP转录因子是一类蛋白，在真核生物中广泛分布并且相对保守，其碱性区域高度保守，约包含20个氨基酸残基。根据bZIP结构的不同,可将其划分为10个亚族。不同亚族的转录因子行使不同的功能,主要包括表达植物种子贮藏基因、调控植物生长发育过程、进行光信号转导、预防病害、胁迫应答和ABA敏感性等各种信号的反应。已有研究表明，IRE1(Inositol Requiring Enzyme1)是内质网(ER)应激感受蛋白，IRE1激活后，剪接bZIP60 mRNA，产生截短的转录因子，上调参与UPR的基因，能够降低UPR反应对于生长发育的影响，bZIP60 mRNA是UPR的一个可靠的生物标志物。
玉米(Zea mays)作为重要的粮食作物，易受到不良环境如高温、水涝等影响,从而导致产量和质量下降。目前，关于玉米高温胁迫下热激转录因子(Heat shock factors，HSF)、热激蛋白(Heat shock proteins，HSP)、过氧化氢酶(Catalase，CAT)和抗坏血酸过氧化物酶(Ascorbate peroxidase，APX)基因家族的研究较少，因此，本领域迫切需要开发一种可以提高玉米耐热性的可用于转基因的核酸构建物。
发明内容
本发明目的在于提供一种可以对植物性状进行改良的核酸构建物，本发明的核酸构建物可以提高玉米耐热性。
本发明一方面提供了一种核酸构建物，所述核酸构建物具有5’-3’(5’至3’)的式I结构：
P1-S1(I)
式中，
P1，S1为用于构成所述构建物的元件；
P1为启动子，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
S1为转录因子的编码序列，所述转录因子的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；
并且，各“-”为键或核苷酸连接序列；
所述P1和S1为可操作的连接。
在一个实施方式中，P1和S1直接连接，中间不含有其他的核苷酸连接序列。
在其他的实施方式中，P1和S1中间还可以含有其他的核苷酸连接序列，只要保证P1和S1属于可操作的连接即能够实现在P1的作用下启动S1的表达。所述核苷酸连接序列不影响其他各元件的正常转录和翻译。
如本文中所使用的，术语“可操作的连接”旨在表示感兴趣的核苷酸序列以一种允许该核苷酸序列的表达的方式被连接至该一种或多种调控元件(例如，处于一种体外转录/翻译系统中或当该载体被引入到宿主细胞中时，处于该宿主细胞中)。
术语“启动子”具有本领域技术人员公知的含义，其是指一段位于基因的上游能启动下游基因表达的非编码核苷酸序列。如本文所示，当启动子和目标核酸可操作的连接时，所述启动子可以启动目标核酸的表达。
在一个实施方式中，所述核酸构建物还包括整合元件，整合元件包括同源臂序列，所述整合元件置于式I的5’端和/或3’端。
在一个实施方式中，在式I的5’端和3’端分别设置有第一整合元件和第二整合元件。
本发明中核酸构建物中的整合元件可以使得将位于整合元件中的序列整合到目标宿主的基因组中。
在一个实施方式中，所述核酸构建物的长度为1000-3000bp，优选地，1500-2200bp。
在一个实施方式中，所述启动子来源于玉米，水稻，小麦，大豆，拟南芥，马铃薯或番茄等，优选的，所述启动子来源于玉米。
在一个实施方式中，所述启动子的核苷酸序列与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％的序列同一性。
在一个实施方式中，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
在一个实施方式中，所述转录因子的氨基酸序列与SEQ ID No.3所示的氨基酸序列相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％的序列同一性。
在一个实施方式中，所述转录因子的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，其与野生型转录因子相比，存在氨基酸突变。
本申请SEQ ID No.3所示的突变的转录因子与野生型转录因子相比，可以提高玉米的耐热性。
在一个实施方式中，所述转录因子的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
在一个实施方式中，所述核酸构建物3’端还包含终止子，所述终止子包括适用于植物转基因的终止子。
在一个实施方式中，所述终止子选自下组：NOS、Poly A、T-UBQ、rbcs或其组合。
另一方面，本发明还提供了一种载体，所述载体含有上述的核酸构建物。
在一个实施方式中，所述载体为植物表达载体。
在一个实施方式中，所述的载体为可转染或转化植物细胞的表达载体。
在一个实施方式中，所述的载体为农杆菌Ti载体。
在一个实施方式中，所述载体的骨架为pGWB系列载体如pGWB501，pGWB502，pGWB415，pGWB505，或pCAMBIA系列载体，如pCAMBIA1300，pCAMBIA1301，pCAMBIA1302，pCAMBIA2300，pCAMBIA2301等系列，或pBI系列载体如pBI101，pBI121，pBI221等。
在一个实施方式中，所述的构建物整合到所述载体的T-DNA区。
在一个实施方式中，所述载体是环状的或线状的。
本文所用术语“载体”是指设计用于在不同宿主细胞之间转移的核酸构建体。“表达载体”是指具有外源细胞中掺入和表达异源DNA片段的能力的载体。许多原核和真核表达载体可商购获得。选择合适的表达载体是本领域技术人员所熟知的。
另一方面，本发明还提供一种工程化的宿主细胞，所述宿主细胞包含上述核酸构建物，或上述载体。
在一个实施方式中，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。
在一个实施方式中，所述原核细胞来源于大肠杆菌、酵母或农杆菌。
在一个实施方式中，所述的细胞为植物细胞。
在一个实施方式中，所述的植物选自下组：单子叶植物、双子叶植物、裸子植物或其组合。
在一个实施方式中，所述的植物包括：拟南芥、小麦、大麦、燕麦、玉米、水稻、高粱、粟、大豆、花生、烟草、番茄、拟南芥、马铃薯、白菜、油菜、生菜、黄瓜、茼蒿、空心菜等、或其组合。
在一个实施方式中，所述宿主细胞是用选自下组的方法将上述核酸构建物导入细胞的：农杆菌转化法、基因枪法、显微注射法、电击法、超声波法和聚乙二醇(PEG)介导法。
另一方面，本发明提供了上述核酸构建物，或上述载体，或上述宿主细胞在制备转基因植物中的应用。
另一方面，本发明提供了上述核酸构建物，或上述载体，或上述宿主细胞在制备试剂或试剂盒中的应用，所述试剂或试剂盒用于制备转基因植物。
另一方面，本发明提供了一种制备性状改良的植物的方法，所述方法包括在植物细胞、植物种子、植物组织、植物部分或者植物中过表达转录因子的步骤，所述转录因子的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
在一个实施方式中，所述方法包括利用表达载体过表达转录因子，或将所述转录因子整合到植物基因组或过表达所述转录因子。
在一个实施方式中，所述方法包括使用SEQ ID No.1所示的启动子对所述转录因子进行过表达的操作。
在一个实施方式中，所述方法包括将上述的核酸构建物，或所述载体，或所述宿主细胞导入所述所述植物细胞或植物种子或植物组织或植物部分或者植物中。
在一个实施方式中，所述导入为通过农杆菌导入。
在一个实施方式中，所述导入为通过基因枪导入。
在一个实施方式中，所述植物为经性状改良的植物细胞或愈伤组织再生为植物体，从而获得性状改良的植物。
在一个实施方式中，所述性状改良为提高植物耐热性，优选地，提高植物散粉期的耐热性。
在一个实施方式中，所述植物包括任何可进行转化技术的高等植物类型，包括单子叶植物、双子叶植物和裸子植物。
在一个实施方式中，所述的植物选自下组：禾本科植物、豆科植物、十字花科植物、茄科、伞形科、或其组合。
在一个实施方式中，所述的植物包括：拟南芥、小麦、大麦、燕麦、玉米、水稻、高粱、粟、大豆、花生、烟草、番茄、拟南芥、马铃薯、白菜、油菜、菠菜、生菜、黄瓜、茼蒿、空心菜、芹菜、油麦菜、或其组合。
另一方面，本发明提供了上述核酸构建物，或上述载体，或上述宿主细胞在制备性状改良的植物中的应用。
另一方面，本发明提供了上述核酸构建物，或上述载体，或上述宿主细胞在制备用于对植物进行性状改良的试剂或试剂盒中的应用。
在一个实施方式中，所述性状改良为提高植物耐热性，优选地，提高植物散粉期的耐热性。
所述耐热性是指植物能够耐受高温胁迫，例如，能够耐受环境气温30℃以上的温度，优选的，31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃以上。本发明的提高植物耐热性，是指在环境气温30℃以上(优选的，31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃以上)的情况下，能够提高植物对高温胁迫的耐受性；与野生型植物相比，过表达上述转录因子的植物能够耐受30℃以上(优选的，31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃以上)的高温胁迫。
以玉米为例，提高植物散粉期的耐热性，是指在高温条件下(通常指环境温度在32℃以上的情况，例如33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃以上)，玉米花粉、花丝活性优于对照材料，显示出更高的授粉结实率，并降低产生畸形果穗的比例，提高玉米的产量。
在一个实施方式中，所述耐热性为提高植物在高温胁迫下的授粉率或者降低植物在高温胁迫下的果实畸形率或者提高植物在高温胁迫下的产量。
在一个实施方式中，所述高温为32℃以上但不超过41℃。
本领域中，玉米的散粉期又指开花期，玉米在开花期较适宜的日均温度为26-27℃，当温度过高或过低时会导致生长发育受影响。本申请提高玉米的耐热性，可以使得玉米在开花期能够耐受至少32℃的温度，例如，32℃，33℃，34℃，35℃，36℃，37℃，38℃，39℃，40℃或41℃。
另一方面，本发明还提供了一种制备转基因植物的方法，所述转基因植物为利用上述方法制备得到的植物与其他植物杂交得到的植物。
本发明提供了一种核酸构建物，提高植物中bZip60表达量，能够对植物进行性状改良，提高了玉米的耐热性，尤其是散粉期的耐热性，对于缓解散粉期高温导致授粉不良产量下降具有重要的意义以及广泛的应用前景。
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
本申请涉及的序列信息如下：
附图说明
图1.重组表达载体的示意图。
图2.转基因作物PCR检测；M：Maker，代表分子量不同的DNA片段，由下往上依次是100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp，2000bp；+：阳性对照；-：阴性对照；ddH2O：空白对照；转基因作物AC19:23AC19、AC3:23AC3、AC25:23AC25。
图3.热处理后bZip60过表达的转基因植株苗期表型鉴定；A代表的是Z58野生型对照苗经过热处理的表型，B代表的是Z58背景的经bZip60过表达的转基因株系在热处理后的表型。
图4.热处理后不同株系中bZip60的相对表达量分析；纵坐标为相对表达量，横坐标为不同株系；转基因热处理的株系：23AC19、23AC3、23AC25；野生型热处理株系：Z58；未经热处理的野生型对照组：CK。
图5.散粉期高温胁迫后bZip60转基因材料果穗表型对比；野生型对照组：CK；bZIP60转基因材料：23AC19、23AC3、23AC25。
图6.在正常生长条件下bZip60转基因材料的百粒重数据；野生型对照材料：PH4CV；bZIP60转基因材料：23AC19、23AC3、23AC25。
图7.在正常生长条件下bZip60转基因材料的穗重数据；野生型对照材料：PH4CV；bZIP60转基因材料：23AC19、23AC3、23AC25。
具体实施方式
以下实施例仅用于描述本发明，而非限定本发明。除非特别指明，否则基本上按照本领域内熟知的以及在各种参考文献中描述的常规方法进行实施例中描述的实验和方法。例如，本发明中所使用的免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA等常规技术，可参见萨姆布鲁克(Sambrook)、弗里奇(Fritsch)和马尼亚蒂斯(Maniatis)，《分子克隆：实验室手册》(MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL)，第2次编辑(1989)；《当代分子生物学实验手册》(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)(F.M.奥苏贝尔(F.M.Ausubel)等人编辑，(1987))；《酶学方法》(METHODS IN ENZYMOLOGY)系列(学术出版公司)：《PCR 2：实用方法》(PCR 2:APRACTICAL APPROACH)(M.J.麦克弗森(M.J.MacPherson)、B.D.黑姆斯(B.D.Hames)和G.R.泰勒(G.R.Taylor)编辑(1995))、哈洛(Harlow)和拉内(Lane)编辑(1988)《抗体：实验室手册》(ANTIBODIES,ALABORATORYMANUAL)，以及《动物细胞培养》(ANIMAL CELL CULTURE)(R.I.弗雷谢尼(R.I.Freshney)编辑(1987))。
另外，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。本文中提及的全部公开案和其他参考资料以其全文通过引用合并入本文。
实施例1.转基因植物的培养
(1)启动子与基因的融合
以玉米基因组为模板，使用引物coreP893 bZip60 F和coreP893 bZip60 R进行扩增，得到核心启动子序列，如SEQ ID No.1所示。以玉米B73 cDNA为模板进行bZip60基因的扩增，鉴于bZip60存在可变的剪切位点，对bZip60序列进行了氨基酸突变优化以提高bZIP60的耐热效果(与未优化的bZIP60相比，进行氨基酸突变优化后的bZIP60可以显著的提高玉米的耐热性)；具体而言，以引物对bZip60 F和split bZip60 R扩增bZip60 5’端序列，以引物对split bZip60 F和bZip60 R short扩增bZip60 3’端序列，利用bZip60 F和bZip60 R引物对扩增后得到突变优化后的bZip60全长序列，氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，并在序列两端添加同源臂，引物信息见表1。
(2)植物表达载体的构建
以引物Tnos P705 F和Tnos P705扩增出Tnos终止子，通过同源重组的方法将bZip60 mutanted(SEQ ID No.2所示)、启动子(SEQ ID No.1所示)、终止子连接至骨架载体上，得到最终的植物表达载体示意图如图1所示，引物信息见表1。
表1.载体构建中使用到的引物信息
(2)遗传转化
将上述重组植物表达载体导入农杆菌EHA105菌株，在含有卡那霉素和利福平抗生素的YEP液体培养基中活化培养，收集菌体。将菌体用含有卡那霉素、利福平抗生素和乙酰丁香酮的诱导培养基中诱导培养至OD600 1.0附近。使用该活化后的菌液侵染DAP 10-12天的玉米幼胚，22℃共培养24h后，转至恢复培养基，28℃暗培养7天。随后进行继代培养，待出现芽点后，转移至分化培养基至出苗。提取上述T0代转基因植株DNA，通过特异性引物(表2)筛选转基因阳性植株。结果如图2所示，阳性转基因作物可以检测到目标条带，阴性作物检测不到目标条带，植株23AC19、23AC3、23AC25可以检测到目标条带为转基因阳性作物。挑选阳性植株进行移栽，自交收种。
表2转基因检测的引物信息(438bp)
| 名称 | 序列 |
| bZip60T F | cttgcattgtatgcaacagtag |
| bZip60T R | ccgtggcctggccaatag |
(3)苗期热处理
挑选T1代转基因阳性株系，单株鉴定后保留阳性苗，每个株系至少留苗10株。对出苗14天的材料进行热处理：用培养箱38度/28度，光照条件14小时/10小时处理；对照设置：野生型对照留苗25-30株，常温放置3-5株；其余与转基因材料一起进行热处理。
对处理后的转基因材料与对照材料的表型鉴定如图3所示，A代表的是野生型对照苗，苗期经过热处理后的表型；B代表的是转基因苗，苗期经过热处理后的表型，苗期的表型A和B差异并不显著。
对热处理过的转基因材料、对照材料的bZip60基因进行定量分析，定量分析引物如表3所示，结果如图4所示，其中经热处理的转基因材料有23AC19、23AC3、23AC25，热处理的对照材料为Z58，未经热处理的对照材料：CK。结果显示，在未处理的CK中，bZip60的表达量较低，经过热处理后的转基因材料23AC19、23AC3、23AC25株系以及野生型材料Z58中bZip60的表达量与未处理的材料相比增加，同时，转基因株系23AC19、23AC3、23AC25中bZip60的表达量显著高于处理后的对照材料Z58。
这表明，转基因表达盒能够响应热信号并提高bZip60基因的表达量。
表3定量分析的引物信息(229bp)
| 名称 | 序列 |
| bZip60qRT F | ggatcgttgcacgggagtat |
| bZip60qRT R | aagcttcctcgttcctggca |
(4)表型鉴定
对处在散粉期的玉米进行35℃高温处理，在散粉期结束后恢复到玉米生长的适宜温度，对上述过表达bZip60的转基因玉米进行表型鉴定。结果如图5所示，对照组材料授粉状态较差且果穗畸形率较高，三个转基因株系23AC19、23AC3、23AC25授粉状态均优于对照组，授粉率高且果穗畸形率低，产量明显高于对照组。
实验结果说明：在玉米中过量表达bZip60对缓解散粉期高温导致的授粉不良以及玉米产量具有一定的促进作用。
(5)田间测产
为测试上述转基因玉米在正常生长温度下的田间表现，我们将过表达bZip60的转基因玉米材料在田间进行中间测产实验，正常生长温度下，转基因玉米相关产量数据百粒重如图6所示，穗重如图7所示，其中PH4CV为野生型对照组，即未进行bZip60过表达的野生型玉米；转基因材料：23AC19、23AC3、23AC25，根据上述产量数据显示，在正常的生产生长条件下，转基因材料的百粒重和果穗重量与野生型相比未发生显著变化。
结合上述高温测试的结果，可以证实在玉米中过表达bZip60基因，不仅可以有助于在高温下玉米稳产，而且在正常生长条件下也不会对玉米产量造成不良影响。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。
Claims (10)
1.一种核酸构建物，其特征在于，所述核酸构建物具有5’-3’(5’至3’)的式I结构：
P1-S1(I)
式I中，
P1为启动子，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
S1为转录因子的编码序列，所述转录因子的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；
并且，各“-”为键或核苷酸连接序列；
所述P1和S1为可操作的连接；
优选的，所述转录因子的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
优选的，所述核酸构建物的3’端还包含终止子。
2.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求1所述的核酸构建物。
3.一种工程化的宿主细胞，其特征在于，所述细胞含有权利要求1所述的核酸构建物，或权利要求2所述的载体。
4.权利要求1所述的核酸构建物，或权利要求2所述的载体，或权利要求3所述的宿主细胞在制备转基因植物中的应用；或者，在制备试剂或试剂盒中的应用，所述试剂或试剂盒用于制备转基因植物。
5.一种制备性状改良的植物或者对植物进行性状改良的方法，其特征在于，所述方法包括在植物细胞、植物种子、植物组织、植物部分或者植物中过表达转录因子的步骤，所述转录因子的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；优选的，所述性状改良为提高植物耐热性，优选，提高植物散粉期的耐热性。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括利用表达载体过表达所述转录因子，或将所述转录因子整合到植物基因组中过表达所述转录因子，或使用SEQ ID No.1所示的启动子对所述转录因子进行过表达的操作。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
将权利要求1所述的核酸构建物，或权利要求2所述的载体，或权利要求3所述的宿主细胞导入所述植物细胞或植物种子或植物组织或植物部分或者植物中。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，
所述耐热性选自以下i-iii任意一种或任意几种：
i、提高植物在高温胁迫下的授粉率，
ii、降低植物在高温胁迫下的果实畸形率，
iii、提高植物在高温胁迫下的产量。
9.权利要求1所述的核酸构建物，或权利要求2所述的载体，或权利要求3所述的宿主细胞在制备性状改良的植物中的应用；或者，在制备用于对植物进行性状改良的试剂或试剂盒中的应用；优选的，所述性状改良为提高植物耐热性，优选，提高植物散粉期的耐热性；
更优选的，所述耐热性选自以下i-iii任意一种或任意几种：
i、提高植物在高温胁迫下的授粉率，
ii、降低植物在高温胁迫下的果实畸形率，
iii、提高植物在高温胁迫下的产量。
10.一种制备转基因植物的方法，其特征在于，所述转基因植物为利用权利要求5-8任一方法制备得到的植物与其他植物杂交得到的植物。
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