CN101589149A - 合成具有提高的溶胀力的低直链淀粉的经遗传修饰植物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及经遗传修饰的单子叶植物细胞和植物，其淀粉具有小于5％重量的表观直链淀粉含量并且具有具备淀粉合酶II活性的蛋白质提高的活性和具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质提高的活性。此类植物合成热水溶胀力提高的淀粉。用于产生/制备这些植物细胞、植物、淀粉和面粉的方法和工艺也是本发明的主题。

Description

合成具有提高的溶胀力的低直链淀粉的经遗传修饰植物
本发明涉及经遗传修饰的单子叶植物细胞和植物，其淀粉具有小于5％重量的表观直链淀粉含量和具备淀粉合酶II活性的蛋白质提高的活性及具备葡聚糖/水双激酶(glucan，water dikinase)活性的蛋白质提高的活性。此类植物合成热水溶胀力提高的淀粉。用于产生/制备这些植物细胞、植物、淀粉及面粉的方法和工艺(processes)也是本发明的主题。
除了油、脂肪和蛋白质之外，多糖也是来自植物的最重要的再生性资源。除纤维素之外，淀粉作为高等植物中最重要的储备材料之一在多糖中占据中心地位。
此外，淀粉是人和动物食物的必需营养成分。食物中存在的淀粉的结构特征可以影响极广泛类型食物的功能属性(例如持水力(water-bindingcapacity)、溶胀力)、营养特征(例如消化性、食物对血糖指数的影响)或结构特征(例如可切性、质构、稠度、可加工性)。食品因此经常包含具有特定结构特征的淀粉，所述的特定结构特征带来所讨论食品的所需特征。此外，植物组织中存在的淀粉可以影响包含淀粉贮藏性植物组织(例如谷粒、果实、面粉)的食物的特征。
多糖淀粉是由化学均一的单位-葡萄糖分子构成的聚合物。然而，多糖淀粉构成不同形式分子的高度复杂混合物，所述的分子在聚合度、葡萄糖链分支的出现及其链长度方面是不同的，并且另外可以受到修饰，例如磷酸化。因此，淀粉不构成均一的原材料。尤其，可以区分直链淀粉和支链淀粉。在用于工业淀粉生产或用作食物的常见植物例如玉米、稻、小麦或马铃薯中，直链淀粉占所合成淀粉的大约20％-25％并且支链淀粉占所合成淀粉的大约70％-80％。
淀粉赋予功能、营养或结构的特征，例如溶解度、回生特性(retrogradation behavior)、持水力、成膜特性、黏度、胶凝特性、冻融稳定性、酸稳定性、凝胶强度、溶胀力、消化性、淀粉的淀粉粒大小尤其受淀粉的结构特征如直链淀粉/支链淀粉比、葡萄糖聚合物的分子量、侧链分布模式、离子含量、脂质和蛋白质含量和/或淀粉粒形态影响。
基于植物育种的方法可以用来修饰淀粉的所选结构特征并且因而修饰植物细胞中淀粉赋予功能、营养或结构的特征。然而，在目前，仅有可能修饰淀粉的所选结构特征(例如支链淀粉/直链淀粉含量，US 5,300,145)。目前例如不可能仅通过植物育种方法影响植物中的淀粉磷酸酯含量。
替代植物育种方法的是通过重组方法靶向修饰淀粉生产植物。然而，这样做的一个先决条件是鉴定并表征参与淀粉合成和/或淀粉改性的酶，以及它们在转基因植物中的后续功能性分析。
表征不同反应的多种酶参与植物细胞中淀粉的合成。淀粉合酶(EC2.4.1.21，ADP-葡萄糖：1，4-α-D-葡聚糖4-α-D-葡糖基转移酶)通过将ADP-葡萄糖的葡糖基残基转移至α-1，4-葡聚糖而催化聚合反应，其中转移的葡糖基残基通过生成α-1，4-键与α-1，4-葡聚糖连接。已经在迄今研究的每一植物中鉴定到淀粉合酶的几种同工型。可以区分两类淀粉合酶：颗粒结合性淀粉合酶(GBSS)和可溶性淀粉合酶(在本发明上下文中也缩写成“SS”)。颗粒结合性淀粉合酶催化直链淀粉的合成，而可溶性淀粉合酶参与支链淀粉的合成(Ball和Morell，2003，Annu.Rev，Plant Biol.54，207-233；Teltow等，2004，J.Expt.Bot.55(406)，2131-2145)。可溶性淀粉合酶类具有几种同工型，它们在专业文献中称作SSI、SSII、SSIII、SSIV和SSV。淀粉合酶与各种同工型(SSI、SSII、SSIII、SSIV、SSV)的联系因所讨论酶的相应蛋白质序列的序列同源性而建立(Ball和Morell，2003，Annu.Rev，Plant Biol.54，207-233)。可溶性淀粉合酶的每种同工型已经根据目前教授内容赋予其在淀粉合成中的特定功能。在双子叶植物中仅检测到SSI蛋白的一种同工型，与此同时，已经在一些单子叶植物(例如玉米)中检测到两个不同类别的SSII蛋白，它们分别称作SSIIa和SSIIb。在单子叶植物中，SSIIa偏好地在胚乳中表达，而SSIIb偏好地在叶组织中表达(Teltow等，2004，J.Expt.Bot.55(406)：2131-2145)。目前并没有充分解释尤其是各种可溶性淀粉合酶在淀粉合成中的具体功能(Ball和Morell，2003，Annu.Rev，Plant Biol.54：207-233)。
淀粉赋予功能、营养或结构的特征也受非碳组分-磷酸酯的含量影响。这里，必须区分与淀粉葡萄糖分子共价结合的单酯形式的磷酸酯(在本发明上下文中称作淀粉磷酸酯)和淀粉结合性磷脂形式的磷酸酯。
淀粉磷酸酯(starch phosphate)含量因植物品种而变化。因此，例如，某些玉米突变体合成淀粉磷酸酯含量提高的淀粉(蜡质玉米含0.002％的淀粉磷酸酯，且高直链淀粉玉米含0.013％的淀粉磷酸酯)，而常规玉米品种仅含有痕量淀粉磷酸酯。类似地，在小麦中仅存在少量淀粉磷酸酯(0.001％)，而在燕麦(oat)和高梁(Sorghum)中检测不到淀粉磷酸酯。蜡质稻突变体中的淀粉磷酸酯(0.003％)比常规稻品种中的淀粉磷酸酯(0.013％)更少。在合成块茎或根淀粉贮藏植物例如木薯(0.008％)、甜马铃薯(0.011％)、竹芋(0.021％)或马铃薯(0.089％)检测到显著量的淀粉磷酸酯。以上提及的淀粉磷酸酯含量百分值在每种情况下指淀粉的干重，并且已经由Jane等确定(1996，Cereal Foods World 41(11)，827-832)。
淀粉磷酸酯可以在聚合的葡萄糖单体的C2、C3或C6位置处以单酯形式存在(Takeda和Hizukuri，1971，Starch/
Figure A20088000277600071
23，267-272)。植物合成的淀粉中磷酸酯的分布一般以以下事实为特征：即大约30％-40％的磷酸酯残基在葡萄糖分子的C3位置处共价结合并且大约60％-70％的磷酸酯残基在葡萄糖分子的C6位置处共价结合(Blennow等，2000，Int.J.ofBiological Macromolecules 27：211-218)。Blennow等(2000，CarbohydratePolymers 41：163-174)对多种淀粉确定了结合在葡萄糖分子C6位置处的淀粉磷酸酯含量，所述的淀粉例如是马铃薯淀粉(每毫克淀粉7.8nmol-33.5nmol，取决于品种)、来自姜黄属(Curcuma)多个物种的淀粉(每毫克淀粉1.8nmol-63nmol)、木薯淀粉(每毫克淀粉2.5nmol)、稻淀粉(每毫克淀粉1.0nmol)、绿豆淀粉(每毫克淀粉3.5nmol)和高粱淀粉(每毫克淀粉0.9nmol)。这些作者没有在大麦淀粉和来自多种玉米蜡质突变体的淀粉中检测到在C6位置处结合的任何淀粉磷酸酯。仍没有建立植物基因型与淀粉磷酸酯含量之间的联系(Jane等，1996，Cereal Foods World 41(11)，827-832)。
迄今已经描述了两种蛋白质，它们介导磷酸酯残基的共价键导入至淀粉的葡萄糖分子。第一种蛋白质具有α-葡聚糖/水双激酶(GWD，E.C.：2.7.9.4)的酶活性(Ritte等，2002，PNAS 99：7166-7171)，常称作R1，尤其在较早的科学文献中是这样，并且与马铃薯块茎中贮藏淀粉的淀粉粒结合(Lorberth等，1998，Nature Biotechnology 16：473-477)。催化淀粉磷酸酯导入淀粉的文献中所述第二种蛋白质具有磷酸-葡聚糖/水双激酶(phosphor-glucan，water dikinase；PWD，E.C.：2.7.9.5)的酶活性(
Figure A20088000277600081
等，2005，Plant Physiol.137：2424-252，Baunsgaard等，2005，Plant Journal41：595-605)。
GWD与PWD之间的一个重要差别是GWD能够利用非磷酸化淀粉作为底物，即，非磷酸化淀粉的从头磷酸化可以由GWD催化，而PWD需要已经磷酸化的淀粉作为底物，即，把额外的磷酸酯导入已磷酸化的淀粉(等，2005，Plant Physiol.137：2424-252，Baunsgaard等，2005，PlantJournal 41：595-605)。GWD与PWD之间的又一个重要差别是GWD排他性地在淀粉的葡萄糖分子C6位置中导入磷酸酯基团，而PWD排他性地磷酸化淀粉的葡萄糖分子C3位置(Ritte等，2006，FEBS Letters 580：4872-4876)。
在GWD或PWD催化的反应中，起始材料α-1，4-葡聚糖(在GWD的情况下)、腺苷三磷酸(ATP)和水以及磷酸化的α-1，4-葡聚糖(在PWD的情况下)、腺苷三磷酸(ATP)和水被转化成产物葡聚糖磷酸酯(淀粉磷酸酯)、无机磷酸盐和腺苷单磷酸(
Figure A20088000277600083
等，2005，Plant Physiol.137：2424-252；Ritte等，2002，PNAS 99：7166-7171)。
在WO 02/34923中描述了因表达来自马铃薯的GWD编码基因而具有升高的GWD蛋白质活性的小麦植物。与不能检测到淀粉磷酸酯的相应野生型植物相比较，这些植物合成在葡萄糖分子C6位置具有显著量淀粉磷酸酯的淀粉。
WO 05/002359描述了在玉米植物中表达马铃薯GWD，其中所述的马铃薯GWD已经对于玉米植物中的密码子使用进行了优化。借助31P NMR，基于葡萄糖的量，确定了所讨论玉米淀粉的0.0736％(在葡萄糖分子C6，C3和C2位置处结合的)磷酸酯的总磷酸酯含量。若假定磷酸(H3PO4)的分子量是98，则每毫克淀粉大约7.5nmol磷酸的总磷酸酯含量产生0.0736％的总磷酸酯含量，这在WO 05/002359中已经对分离自转基因玉米植物的淀粉测定。在WO 05/095617中描述了因表达来自拟南芥(Arabidopsisthaliana)的PWD编码基因而显示提高的PWD蛋白质活性的植物。与相应的非转化野生型植物比较，这些植物具有提高的淀粉磷酸酯含量。
例如当食品工业中加工淀粉时，一个重要功能特征是溶胀力。淀粉的多种结构特征，如直链淀粉/支链淀粉比、侧链长度、淀粉聚合物的分子量分布、分支数目和淀粉磷酸酯的量，影响功能特征，尤其影响所讨论淀粉的溶胀力(Narayana和Moorthy，2002，Starch/
Figure A20088000277600091
54：559-592)。
直链淀粉长久以来被视为由α-1，4-糖苷键连接的α-D-葡萄糖单体组成的线性聚合物。然而近来的研究已经证实存在α-1，6-糖苷分支点(大约0.1％)(Hizukuri和Takagi，Carbohydr.Res.134，(1984)，1-10；Takeda等，Carbohydr.Res.132，(1984)，83-92)。
支链淀粉构成具有不同支化模式的葡萄糖链的复杂混合物。与直链淀粉相反，支链淀粉包含更多的分支。侧链通过α-1，6-糖苷键与以α-1，4-糖苷键连接的α-D-葡萄糖单体的主链连接。根据文献(Voet和Voet，1990.Biochemistry，John Wiley&Sons)，平均每隔24-30个葡萄糖残基出现α-1，6-分支。这对应于约3％-4％的支化程度。支化程度的数据可变并且取决于所讨论淀粉的来源(例如植物物种、植物品种等)。在用于淀粉工业生产的常见植物例如玉米、小麦或马铃薯中，直链淀粉占所合成淀粉的大约20％-30％并且支链淀粉占所合成淀粉的大约70％-80％。
直链淀粉与支链淀粉之间的另一个重要差异是它们的分子量。根据淀粉来源，直链淀粉具有5×105-106Da的分子量，而支链淀粉的分子量是107-108Da。这两种大分子可以基于它们的分子量和它们不同的物理化学特征区分，并且观察这种区别的最简单方式是借助于它们不同的碘结合特征。
多种技术用途仅需要支链淀粉，原因在于支链淀粉具有增稠作用。直链淀粉具有胶化作用并且因而对众多用途而言是不受欢迎的。纯的支链淀粉使得同时具备高黏度、稳定性及透明度的极均一性表面结构成为可能。这些淀粉的可能用途是在造纸业、粘合剂工业、纺织工业、建筑工业及化妆品工业中。此外，支链淀粉是制备麦芽糖糊精的优选起始材料，原因是与从包含直链淀粉的淀粉制备的麦芽糖糊精相比较，支链淀粉所制备的麦芽糖糊精在水中的溶解度增加、对溶解稳定并且透明。
在食品工业中，支链淀粉常用作稳定剂、粘合剂并用于改善质构。支链淀粉特别在其中巨大温度变化在加工及整饰期间出现(例如冻融稳定性)的那些加工步骤中是有利的。支链淀粉在食品工业中的用途正在增长，尤其考虑到对(半)成品日益增加的需求。
GBSSI(“颗粒结合性淀粉合酶I)参与直链淀粉形成。迄今，已经描述了其中颗粒结合性淀粉合酶GBSSI活性降低的植物(Shure等，1983，Cell35：225-233；Hovenkamp-Hermelink等，1987，Theoretical and AppliedGenetics 75：217-221；Visser等，1991，Mol.Gen.Genet.225：289-296；Hergersberg，1988，Thesis，University of Cologne；WO 92/11376)。此外，存在缺少有功能的GBSSI基因并且因而合成不含直链淀粉(＝支链淀粉)的淀粉的已知突变体(Kossmann和Lloyd 2000，Critical Reviews in PlantSciences，19(3)：171-226)。玉米的相应GBSSI突变体的胚乳在外观上呈蜡质，这是为何引入术语“蜡质”胚乳作为不含直链淀粉的淀粉之同义词的原因。
当描述淀粉的溶胀力时，必须区分在冷水(例如室温)中的溶胀力和在温水或热水中的溶胀力。天然淀粉在冷水中的溶胀力可忽略不计，假若存在的话，而物理改性(预胶化，干燥)淀粉甚至能够在冷水中溶胀。冷水溶胀性淀粉的制备方法例如在US 4,280,851中描述。在本发明的上下文中，术语“溶胀力”指淀粉在温/热的水质悬液中的性质。该溶胀力常规地通过如此方式确定：在过量水存在下加热淀粉粒，在离心所述悬液后除去非结合水并且从所得残余物的重量和所称重淀粉的重量获得该商(quotient)。当实施该方法时，加热淀粉悬液则造成淀粉粒的晶态区域溶解并造成水分子插入淀粉粒而不溶解淀粉粒自身的结构，即仅仅单个淀粉粒的溶胀发生。
与来自谷类的淀粉相比较，从块茎或块茎样组织分离的淀粉具有显著较高的热水溶胀力。
对于分离自多个品种的马铃薯淀粉而言，使用Leach等(1959，CerealChemistry 36：534-544)方法，已经测得在85℃的74.15g/g最大溶胀力(品种Kufri Jyoti)(Singh等，2002，Journal of the Science of Food andAgriculture 82：1376-1383)。Takizawa等(2004，Brazilian Archives ofBiology and Technology 47(6)：921-931)测得马铃薯淀粉的100g/g溶胀力(90℃，使用上文的Leach等方法)。从多个栽培品种分离的小麦淀粉具有16.6g/g-26.0g/g的溶胀力(温度：沸腾的0.1％AgNO3水质悬液)(Yamamori和Quynh，2000，Theor Appl Genet100：23-38)。从无壳大麦(hullless barley)的多个栽培品种分离的淀粉具有16.5g/g或19.3g/g的溶胀力，并且所述大麦的多个栽培品种的蜡质或不含直链淀粉的淀粉具有36.0g/g-55.7g/g的溶胀力(温度：70℃，0.1％AgNO3水溶液，Yasui等，2002，Starch/
Figure A20088000277600111
54：179-184)。对于玉米淀粉，已经测得22.3g/g的溶胀力，并且对于高含量直链淀粉的玉米淀粉，已经测得9.6g/g(Hylon V)、6.1g/g(Hylon VII)或3.9g/g(LAPS＝低含量支链淀粉)(90℃，Shi等，1998，J.Cereal Sci.27：289-299)的溶胀力。US 6,299,907描述了蜡质玉米淀粉的35.4g/g溶胀力。对于分离自多个稻栽培品种的淀粉，已经使用Leach等方法(上文)测得26.0g/g-33.2g/g的溶胀力(Sodhi和Singh，2003，Food Chemistry 80：99-108)。Chen等(2003，Starch/55：203-212)对蜡质稻淀粉与高含量直链淀粉的稻淀粉的多种混合物测得大约25g/g-大约49g/g的溶胀力(95℃，水质悬液)。Yasui等(2002，Starch/
Figure A20088000277600113
54：179-184)对无淀粉酶的稻淀粉测得55.7g/g的溶胀力(在沸水中于0.1％硝酸银水溶液中测量)。
通过产生天然淀粉的衍生物，可以改变淀粉的功能特征。根据交联程度，交联小麦淀粉具有6.8g/g-8.9g/g的溶胀力；乙酰化小麦淀粉具有10.3g/g的最大溶胀力；并且既交联且乙酰化的小麦淀粉具有9.4g/g的溶胀力，而相应的非衍生化淀粉具有8.8g/g的溶胀力(在90℃测量；Van Hung和Morita，2005，Starch/
Figure A20088000277600121
57：413-420)。
对于乙酰化的蜡质稻淀粉，已经测得大约30g/g的溶胀力，并且对于交联的蜡质稻淀粉，已经测得大约15g/g的溶胀力，而相应的非衍生化蜡质稻淀粉具有大约41g/g的溶胀力。乙酰化稻淀粉具有大约20g/g的溶胀力并且交联的稻淀粉具有大约13g/g的溶胀力，而相应的非衍生化稻淀粉具有大约14g/g的溶胀力(在90℃测量，Liu等，1999，Starch/52：249-252)。US 6,299,907描述了交联淀粉，其中在氢氧化钠/硫酸钠溶液中使所讨论的淀粉预溶胀后实施交联反应。根据交联程度，发现小麦淀粉具有6.8g/g-7.3g/g的溶胀力(相应的小麦非衍生化淀粉的溶胀力14.7g/g)，小麦羟丙基淀粉具有9.7g/g的溶胀力(相应的小麦非衍生化淀粉的溶胀力22.9g/g)，交联的玉米淀粉具有5.9g/g的溶胀力(相应的玉米非衍生化淀粉的溶胀力16.7g/g)，交联的蜡质玉米淀粉具有8.3g/g的溶胀力(相应的非衍生化蜡质玉米淀粉的溶胀力35.4g/g)，并且交联的马铃薯淀粉具有6.7g/g的溶胀力(没有详细说明相应的马铃薯非衍生化淀粉的溶胀力)(在95℃测量)。这表明淀粉的溶胀力假如能够提高的话，不能通过现有的衍生方法显著提高。
本发明的目的是提供具有改变的功能特征的改性蜡质淀粉，和提供合成具有改变的功能特征的蜡质淀粉的新植物细胞及植物以及用于产生所述植物和/或植物细胞的方法和手段。
尤其，所述改变的功能特征在于以下事实，即改性淀粉具有提高的热水溶胀力。
因此，本发明涉及经遗传修饰的单子叶植物细胞或经遗传修饰的单子叶植物，与相应的非遗传修饰野生型植物细胞或相应的非遗传修饰野生型植物相比较，其淀粉具有小于5％重量的表观直链淀粉含量，并且它们额外地具有具备淀粉合酶II酶活性的蛋白质提高的活性及额外地具有具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质提高的活性。
在本上下文中，遗传修饰可以是任意遗传修饰，其中与相应的非遗传修饰野生型植物细胞或野生型植物相比较，所述遗传修饰导致具有小于5％重量直链淀粉的淀粉在经遗传修饰的植物细胞或经遗传修饰的植物中合成，并且同时导致具备淀粉合酶II活性的至少一种蛋白质的活性和(同时)具备葡聚糖/水双激酶活性的至少一种蛋白质的活性提高。
在本发明的上下文中，术语“野生型植物细胞”意指充当产生本发明植物细胞的起始材料的植物细胞，即该植物细胞的遗传信息与本发明植物细胞的遗传信息相对应，除了所导入的遗传修饰之外。
在本发明的上下文中，术语“野生型植物”意指充当产生本发明植物的起始材料的植物，即该植物的遗传信息与本发明植物的遗传信息相对应，除了所导入的遗传修饰之外。
在本发明的上下文中，术语“相应的”意指在比较几个对象时，相互比较的所讨论对象维持在相同条件下。在本发明的上下文中，术语“相应的”在野生型植物细胞或野生型植物的上下文中意指相互比较的植物细胞或植物在相同培养条件培育并具有相同的(栽培)年龄。
术语“单子叶植物”指单子叶植物(monocot)。在植物学上，它们属于被子植物(木兰门(Magnoliophyta))的三个纲之一。与双子叶植物不同，单子叶植物以如下事实为特征：胚一般仅具有一个子叶原基(希腊语：monos＝“单个”和kotyledon＝“子叶”)。此外，它们具有带鞘的维管束，即韧皮部与木质部不被分生组织隔开，这是单子叶植物的茎为何不可能次生加厚的原因。这类植物尤其包括莎草目(Cyperales)和禾本目(Poales)的草，以及许多个其他科。
在本发明的上下文中，术语“具有淀粉合酶II(酶)活性的至少一种蛋白质提高的活性”意指编码细胞中具备淀粉合酶II活性的蛋白质的内源性基因表达增加和/或具备淀粉合酶II活性的蛋白质的量增加和/或细胞中具备淀粉合酶II活性的蛋白质的活性提高。
在本发明的上下文中，术语“具有葡聚糖/水双激酶(酶)活性的蛋白质提高的活性”意指细胞中编码具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质的内源性基因表达增加和/或具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质的量增加和/或细胞中具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质的活性提高。
表达的增加可以例如通过测量转录物的量加以确定，其中所述的转录物编码具备淀粉合酶II活性的蛋白质或具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质。这可以例如通过RNA印迹分析或通过Q-PCR(定量转录聚合酶链反应)进行。
具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质的量增加在本文中优选地意指与相应的非遗传修饰细胞相比较，所讨论蛋白质的量增加至少50％，尤其至少70％，优选至少85％并且尤其优选至少100％。
具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质的量增加还意指含有不可检测到量的具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质的植物或植物细胞在经过本发明的遗传修饰后，含有可检测量的具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质。
用于产生与某蛋白质特异性反应即与该蛋白质特异性结合的抗体的方法是技术人员已知的(参见，例如Lottspeich和Zorbas(编者)，1998，Bioanalytik，Spektrum akad，Verlag，Heidelberg，Berlin，ISBN3-8274-0041-4)。可以委托一些公司(例如Eurogentec，Belgian)产生此类抗体。Lorberth等(1998，Nature Biotechnology 16：473-477)和Ritte等(2000，Plant Journal 21：387-391)描述了可以通过免疫学方法确定具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质的量增加的抗体。Walter(“Untersuchungen derexpression und Funktion der
Figure A20088000277600141
synthase II(SSII)aus Weizen(Triticumaestivum)[来自普通小麦(Triticum aestivum)的淀粉合酶II(SSII)的表达及功能研究(Studies into the expression and function of starch synthase II(SSII)from wheat(Triticum aestivum))]”，汉堡大学生物学系博士答辩论文，ISBN 3-8265-8212-8)描述了通过免疫学方法确定具备淀粉合酶II活性的蛋白质的量增加的抗体。
具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质的活性的量例如可以如文献(Mikkelsen等，2004，Biochemical Journal 377：525-532；Ritte等，2002，PNAS 99：7166-7171)中所述检测。
具备淀粉合酶II活性的蛋白质的活性的量例如可以如文献(Nishi等，2001，Plant Physiology 127：459-472)中所述确定。用于确定具备淀粉合酶II活性的蛋白质的活性的量的优选方法在“一般方法”中描述。
优选地，本发明的植物细胞或本发明的植物具有具备淀粉合酶II活性的蛋白质的活性，其中与相应的非遗传修饰野生型植物细胞或野生型植物相比较，所述活性提高到至少2倍，优选至少6倍。
具备淀粉合酶II活性的蛋白质(ADP-葡萄糖：1，4-α-D-葡聚糖4-α-D-葡糖基转移酶；EC 2.4.1.21)的结构显示一系列的某些结构域。在氨基端，它们具有一个转运入质体的信号肽。从氨基端至羧基端，依次存在氨基端区域和催化结构域(Li等，2003，Funct Integr Genomics 3，76-85)。基于多种具备淀粉合酶II活性的蛋白质的氨基酸序列比对(http://hits.isb-sib.ch/cgi-bin/PFSCAN)，进一步分析表明：这些蛋白质具有3个特定结构域。在如SEQ ID NO 4所示的氨基酸序列中，第322位至第351位氨基酸代表结构域1，第423位至第462位氨基酸代表结构域2并且第641位至第705位氨基酸代表结构域3。结构域1由如SEQ ID NO 3所示的核酸分子序列第1190位至第1279位核苷酸编码，结构域2由此核酸分子序列第1493位至第1612位核苷酸编码，并且结构域3由此核酸分子序列第2147位至第2350位核苷酸编码。
在本发明的上下文中，术语“具备淀粉合酶II活性的蛋白质”理解为意指催化糖基化反应的蛋白质，在所述糖基化反应中底物ADP-葡萄糖的葡萄糖残基转移至α-1，4-连接的葡聚糖链上，从而形成α-1，4-连接的(ADP-葡萄糖+{(1，4)-α-D-葡糖基}(N)<＝>ADP+{(1，4)-α-D-葡糖基}(N+1))，其中具备淀粉合酶II蛋白质活性的蛋白质的氨基酸序列与如SEQ ID NO 4所示的氨基酸序列的第322位至第351位氨基酸(结构域1)具有至少86％、优选至少93％、特别优选至少95％、尤其优选至少98％的同一性，并且与如SEQ ID NO 4所示的氨基酸序列的第423位至第462位氨基酸(结构域2)具有至少83％、优选至少86％、特别优选至少95％、尤其优选至少98％的同一性，并且与如SEQ ID NO 4所示的氨基酸序列的第641位至第705位氨基酸(结构域3)具有至少70％、优选至少82％、优选地86％、特别优选地95％、尤其优选至少98％的同一性。
与结构域1、2和3具有所述同一性并编码具备淀粉合酶II活性的蛋白质的核酸序列及对应氨基酸序列是技术人员已知的，并且例如作为登录号AY133249(大麦(Hordeum vulgare))、登录号AY133248(粗山羊草(Aegilops tauschii))、登录号XP467757、AAK64284(稻(Oryza saiva))、登录号AAK81729(稻)、登录号AAD13341、AAS77569、登录号AAD13342(玉米(Zea mays))、登录号AAF13168(木薯(Manihut esculenta))、登录号BAD18846(菜豆(Phaseolus vulgaris))、登录号CAA61241(马铃薯(Solanumtuberosum))、登录号CAA61269(豌豆(Pisum sativum))、登录号AAC19119(甘薯(Ipomea batatas))、登录号AAF 26156(拟南芥)、登录号AAP41030(芋(Colocasia esculenta))、登录号AAS88880(Ostraeococcustauri)或登录号AAC17970(莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardii))公开。上文提及的编码具备淀粉合酶II活性的蛋白质的核酸分子序列及氨基酸序列可通过NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/)获得并且通过引用的方式明白无误地并入本申请的说明书中。
为了本发明的目的，术语“具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质”理解为意指将来自ATP的β-磷酸残基转移至淀粉的蛋白质。从拟南芥sex1-3突变体的叶分离的淀粉不含有可检测量的共价结合的磷酸酯残基，但是在体外由具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质磷酸化。这意味非磷酸化的淀粉，例如从拟南芥sex1-3突变体的叶分离的淀粉，可用作具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质所催化的磷酸化反应中的底物。
具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质将ATP的β-磷酸残基转移至淀粉的葡萄糖C6位置上，并将ATP的γ-磷酸残基转移至水。产生的另一种反应产物是AMP(腺苷单磷酸)。具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质因此也称作[α-1，4-葡聚糖]：水双激酶，或又叫作淀粉：水双激酶(E.C.：2.7.9.4；Ritte等，2002，PNAS 99：7166-7171)。
由具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质催化的淀粉的磷酸化排他地在葡萄糖分子C6位置产生额外的磷酸单酯键(Ritte等，2006，FEBS Letters580：4872-4876)。具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质催化淀粉的磷酸化反应则产生磷酸化蛋白中间体，其中ATP的β-磷酸残基与具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质的氨基酸共价结合(Ritte等，2002，PNAS 99，7166-7171)。该中间体通过具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质自身磷酸化作用形成，即具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白自身催化产生该中间体的反应。编码具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质的氨基酸序列含有磷酸组氨酸结构域。磷酸组氨酸结构域例如由Tien-Shin Yu等(2001，Plant Cell 13，1907-1918)描述。在具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质自身磷酸化过程中，编码具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质的氨基酸序列中磷酸组氨酸结构域中的组氨酸残基被磷酸化(Mikkelsen等，2004，Biochemical Journal 377：525-532)。在来自马铃薯的具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质的氨基酸序列中，例如SEQ ID NO 2所示，第1064位至第1075位氨基酸构成磷酸组氨酸结构域。若另一种氨基酸替换磷酸组氨酸结构域的保守组氨酸残基(例如SEQ ID NO 2所示的蛋白质序列中的第1069位氨基酸)，则诱变的蛋白质不再发生自身磷酸化和由此的葡聚糖磷酸化(Mikkelsen等，2004，Biochemical Journal 377：525-532)。此外，具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质以如下事实为特征，即该蛋白质具有由SEQ ID NO 2所示氨基酸序列中第1121位至第1464位氨基酸所包含的羧基末端核苷酸结合结构域。此核苷酸结合结构域的缺失导致具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质失活(Mikkelsen和Blennow，2005，Biochemical Journal 385，355-361)。具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质在其氨基末端具有由SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列中第78位至第362位氨基酸包含的糖结合结构域(CBM)。该糖结合结构域尤其因以下事实区分：它们的氨基酸序列含有保守的色氨酸残基。若用其他氨基酸替换这些保守氨基酸残基，则所述糖结合结构域丧失结合葡聚糖的能力。因此，例如，替换如SEQ ID NO 2所示氨基酸序列中的氨基酸W139或W194则导致这个糖结合结构域的功能丧失。然而，若缺失葡聚糖/水双激酶的糖结合结构域(例如缺失第1位至第362位氨基酸，其中如SEQ ID NO 2所示氨基酸序列中第1位至第77位氨基酸构成质体信号肽)，则这不会导致该酶的磷酸化活性失活(Mikkelsen等，2006，Biochemistry 45：4674-4682)。
描述了来自不同物种的编码具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质的核酸序列及其对应氨基酸序列，所述物种例如是马铃薯(WO 97/11188、GenBank登录号：AY027522、Y09533)、小麦(WO 00/77229、US 6,462,256、GenBank登录号：AAN93923、GenBank登录号：AR236165)、稻(GenBank登录号：AAR61445、GenBank登录号：AR400814)、玉米(GenBank登录号：AAR61444、GenBank登录号：AR400813)、大豆(GenBank登录号：AAR61446、GenBank登录号：AR400815；柑橘属(citrus)(GenBank登录号：AY094062)、拟南芥属(GenBank登录号：AF312027)和绿藻Ostreococcus tauri(GenBank登录号：AY570720.1)。上文提及的编码具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质的核酸分子序列和氨基酸序列尤其由NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/)公开并且通过引用的方式明白无误地并入本申请的说明书中。
在本发明的上下文中，术语“GBSSI”应当理解为意指属于颗粒结合性淀粉合酶同工型I(EC 2.4.1.21)组的任意酶。
在本发明的上下文中，术语“GBSSI基因”理解为意指编码颗粒结合性淀粉合酶I(GBSS I)的核酸分子或多核苷酸(cDNA，DNA)。Seq ID NO 7-12包含这样的核酸分子序列或氨基酸序列，在每种情况下它们编码来自稻、小麦和玉米的具有GBSS I活性的蛋白质。
描述了多种单子叶植物物种的编码GBSS I的多核苷酸，例如玉米(GenBank登录号AF079260、AF079261)、小麦(GenBank登录号AB019622、AB019623、AB019624)、稻(GenBank登录号AF092443、AF092444、AF031162)、大麦(GenBank登录号X07931、X07932)、双色蜀黍(Sorghum bicolor)(GenBank登录号U23945)和硬粒小麦(durumwheat)(GenBank登录号AB029063)。上文提及的编码具备GBSS I活性的蛋白质的核酸分子序列和氨基酸序列尤其由NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/)公开并且通过引用的方式明白无误地并入本申请的说明书中。
缺少功能性GBSS I基因的突变体合成不含直链淀粉的淀粉(＝蜡质淀粉)。对一系列作物描述了此类突变体，例如对于玉米(例如Sprague等，1943，J.Am.Soc.Agron.35：817-822；Shure等1983，Cell 35：225-233)、稻(Sano 1984，Theor.Appl.Genet.68：467-473；Villareal和Juliano1986，Starch/Staerke 38：118-119)、大麦(Rohde等1988，Nucleic Acids Res16：7185-7186)，小麦(Nakamura等1995，Mol.Gen.Genet.248：253-259)、马铃薯(Hovenkamp-Hermelink等1987，Theor.Appl.Genet.75：217-221)和谷子(millet)(Okuno和Sakaguchi 1982，J.Hered 73：467)。术语“蜡质突变体”以同义方式使用，原因是胚乳在玉米中具有蜡质外观。GBSS I蛋白也常称作“蜡质蛋白质”(Kossmann和Lloyd 2000“理解并影响淀粉生物化学(U nderstanding and Influencing Starch Biochemistry)”，Critical Reviewsin Plant Sciences，19(3)：171-226)。
用于产生本发明的植物细胞和植物的合适植物细胞或植物是在它们所合成的淀粉中显示表观直链淀粉含量降低至小于5％重量的那些植物细胞或植物。
在本发明的一个实施方案中，对本发明植物细胞的或对本发明植物的遗传修饰通过诱变一个或多个GBSS I基因引起。所述突变的本质不重要，只要它导致GBSSI活性降低或完全消失并且因此降低本发明植物中存在的淀粉的表观直链淀粉含量至小于5％重量。
导致本发明的植物细胞和植物中GBSSI活性降低并且导致淀粉的表观直链淀粉含量下降至小于5％重量的突变可以自发出现，并且可以借助下文所述方法选择并增殖所讨论的植物。
为本发明的目的，“蜡质突变体”理解为意指其淀粉具有小于5％重量的表观直链淀粉含量的植物。同样，“蜡质淀粉”指有小于5％重量的表观直链淀粉含量的淀粉。
在本发明的上下文中，术语“诱变”理解为意指所导入的任意类型突变，例如缺失、点突变(核苷酸替换)、插入、倒位、基因转换或染色体易位。
可以用于产生化学诱导突变的物质并且因而通过所讨论的诱变剂作用而获得的突变类型例如由Ehrenberg和Husain(1981，Mutation Research86：1-113)和Müller(1972，Biologisches Zentralblatt 91(1)：31-48)描述。使用γ射线、甲磺酸乙酯(EMS)、N-甲基-N-亚硝基脲或叠氮钠(NaN3)产生稻突变体例如Jauhar和Siddiq(1999，Indian Journal of Genetics，59(1)：23-28)、Rao(1977，Cytologica 42：443-450)、Gupta和Sharma(1990，Oryza27：217-219)以及Satoh和Omura(1981，Japanese Journal of Breeding31(3)：316-326)描述。使用NaN3或顺丁烯二酸酐产生小麦突变体由Arora等(1992，Annals of Biology 8(1)：65-69)描述。使用多种类型的高能辐射和化学剂产生小麦突变体的综述由Scarascia-Mugnozza等(1993，MutationBreeding Review 10：1-28)描述。Svec等(1998，Cereal ResearchCommunications 26(4)：391-396)描述了使用N-乙基-N-亚硝基脲产生小黑麦中的突变体。使用MMS(甲基甲磺酸)和γ辐射产生谷子突变体由Shashidhara等(1990，Journal of Maharashtra Agricultural Universities15(1)：20-23)描述。
合成具有小于5％重量的表观直链淀粉含量的淀粉的单子叶植物细胞和植物(＝蜡质植物或蜡质植物细胞)也可以通过使用所谓插入诱变法(综述：Thorneycroft等，2001，Journal of Experimental Botany 52(361)：1593-1601)产生。“插入诱变”理解为尤其意指转座子或所谓转移DNA(T-DNA)插入基因内。
转座子可以采取在(野生型)植物细胞中天然存在的转座子(内源性转座子)形式；或不在所述细胞中天然存在，但已经通过重组方法(例如通过转化该细胞)导入细胞的转座子(异源转座子)形式。通过转座子调节基因表达是技术人员已知的。关于植物生物技术中利用内源性和异源性转座子作为工具的综述可以在Ramachandran和Sundaresan(2001，Plant Physiologyand Biochemistry 39，234-252)中找到。可以在Maes等(1999，Trends inPlant Science 4(3)，90-96)的综述中找到鉴定其中已经通过转座子插入诱变致使特定基因失活的突变体的可能性。借助内源性转座子产生稻突变体由Hirochika(2001，Current Opinion in Plant Biology 4，118-122)描述。借助内源性逆转座子鉴定玉米基因例如在Hanley等(2000，The Plant Journal22(4)，557-566)中显示。借助逆转座子产生突变体的可能性和用于鉴定突变体的方法由Kumar和Hirochika(2001，Trends in Plant Science 6(3)，127-134)描述。已经对双子叶植物和对单子叶植物描述了异源转座子在不同物种中的活性，其中所述植物例如稻(Greco等，2001，Plant Physiology125，1175-1177；Liu等，1999，Molecular and General Genetics 262，413-420；Hiroyuki等，1999，The Plant Journal 19(5)，605-613；Jeon和Gynheung，2001，Plant Science 161，211-219)、大麦(Koprek等，2000，ThePlant Journal 24(2)，253-263)、拟南芥(Aarts等，1993，Nature 363，715-717，Sch midt和Willmitzer，1989，Molecular and General Genetics 220，17-24；Altmann等，1992，Theoretical and Applied Gentics 84，371-383；Tissier等，1999，The Plant Cell 11，1841-1852)、番茄(Belzile和Yoder，1992，ThePlant Journal 2(2)，173-179)和马铃薯(Frey等，1989，Molecular andGeneral Genetics 217，172-177；Knapp等，1988，Molecular and GeneralGenetics 213，285-290)。
原则上，单子叶“蜡质”植物细胞和植物可以借助同源转座子和异源转座子、使用同源转座子(也包括使用已经天然存在于植物基因组中的那些转座子)产生。原则上，T-DNA诱变也适于产生“蜡质”植物细胞和植物。
T-DNA插入诱变基于以下事实，即来自农杆菌(Agrobacterium)的Ti质粒的某些节段(T-DNA)能够整合至植物细胞的基因组中。整合至植物染色体的位点是不固定的，不过可以在任何位置处出现。若T-DNA整合至染色体中构成基因功能的节段，则可以导致基因表达的调节并且因此导致由所讨论基因编码的蛋白质的活性改变。尤其，T-DNA整合至基因编码区内往往意味所讨论的蛋白质不能再以活性形式合成，或根本不被所讨论的细胞合成。使用T-DNA插入以产生突变体例如已对拟南芥(Krysan等，1999，The Plant Cell 11，2283-2290；Atipiroz-Leehan和Feldmann，1997，Trends in Genetics 13(4)，152-156；Parinov和Sundaresan，2000，CurrentOpinion in Biotechnology 11，157-161)和稻(Jeon和An，2001，Plant Science161，211-219；Jeon等，2000，The Plant Journal 22(6)，561-570)进行了描述。用于鉴定已经借助T-DNA插入诱变法产生的突变体的方法尤其由Young等(2001，Plant Physiology 125，513-518)、Parinov等(1999，The PlantCell 11，2263-2270)、Thorneycroft等(2001，Journal of ExperimentalBotany 52，1593-1601)和McKinney等(1995，The Plant Journal8(4)，613-622)描述。
可以借助技术人员熟悉的方法找到相应基因中的突变。例如，可以使用基于采用探针的杂交(“DNA印迹”)、基于借助聚合酶链反应(PCR)的扩增、基于对合适的基因组核酸片段测序的分子分析法和单个核苷酸置换搜索法。借助杂交模式鉴定突变的方法的实例是限制性片段长度多态性(RFLP)搜索法(Nam等，1989，The Plant Cell 1：699-705；Leister和Dean，1993，The Plant Journal 4(4)：745-750)。基于PCR的方法例如是扩增片段长度多态性(AFLP)分析法(Castiglioni等，1998，Genetics 149：2039-2056；Meksem等，2001，Molecular Genetics and Genomics 265：207-214；Meyer等1998，Molecular and General Genetics 259：150-160)。利用已经以限制性核酸内切酶切割的扩增片段(“切割的扩增多态性序列”，CAPS)是鉴定突变的又一种可能选择(Konieczny和Ausubel，1993，The Plant Journal 4：403-410；Jarvis等，1994，Plant Mol.Biol.24：685-687；Bachem等，1996，The Plant Journal 9(5)：745-753)。确定SNP的方法尤其已经由Qi等(2001，Nucleic Acids Research 29(22)：116)、Drenkard等(2000，Plant Physiology124：1483-1492)和Cho等(1999，Nature Genetics 23：203-207)描述。特别合适的方法是允许短时间内研究大量植物在某些基因内的突变的那些方法。称作TILLING(“基因组中靶向诱导的局部损伤”)的这种方法已经由McCallum等(2000，Plant Physiology 123：439-442)描述。
技术人员知道上文所述的突变原则上是隐性突变。为表现蜡质表型，因此需要产生不分离的(纯合)植物细胞或植物。产生不分离的植物的方法是技术人员已知的。
纯合“蜡质”突变体可以通过用碘染色淀粉而鉴定。为此目的，包含淀粉的组织样品(例如胚乳，花粉)用碘溶液染色并且例如在显微镜下研究。蜡质淀粉染成棕色(与野生型染成蓝色相对比)。
在本发明的又一个实施方案中，一种或多种外源核酸分子/多核苷酸的导入、一种或多种外源核酸分子/多核苷酸的存在和/或表达导致编码GBSSI蛋白的内源性基因表达抑制并导致本发明植物细胞或本发明植物中存在的淀粉的表观直链淀粉含量降低至小于5％重量。
这可以通过技术人员熟悉的多种方法进行。这些方法包括例如表达合适的反义RNA或表达双链RNA，提供赋予共抑制效应的分子或载体、表达可特异性切割编码GBSSI的转录物的适当构建的核酶或称作“体内诱变法”的方法。此外，降低植物细胞中GBSS I活性/诸活性和/或降低GBSSI基因的基因表达也可以通过同时表达待抑制的特定靶基因、优选GBSSI基因的有义和反义RNA分子而引致。这些方法是技术人员已知的。
此外，已知启动子序列的双链RNA的反式(in trans)形成可以引起该启动子在植物中(in planta)的同源拷贝甲基化和转录性失活(Mette等，2000，EMBO J.19：5194-5201)。
为通过反义或共抑制技术抑制基因表达，例如，可以使用包含完整GBSS I编码序列(包括存在的任意侧翼序列)的DNA分子，或使用仅包含所述编码序列的部分的DNA分子，其中这些部分必须足够长以在细胞中产生反义作用或共抑制作用。通常适用的是最小长度15bp、优选最小长度20-30bp，尤其优选长度100-500bp的序列，并且对于高度有效的反义抑制或共抑制抑制，长度大于500bp的序列尤其是适用的。
使用与内源性序列具有高度同一性的多核苷酸序列也适用于反义抑制或共抑制方法，其中所述的内源性序列存在于植物细胞中并且编码GBSS I。最小同一性应当大于约65％。优选使用具有至少90％、尤其95％-100％同一性的序列。
为实现反义作用或共抑制作用，也可行是的使用内含子，即来自编码GBSSI的基因的非编码区的序列。
用于抑制编码淀粉生物合成蛋白的基因表达的内含子序列的用途在WO 97/04112、WO 97/04113、WO 98/37213、WO 98/37214中描述。
技术人员知道如何实现反义作用和共抑制作用。共抑制的方法已经例如由Jorgensen(1990，Trends Biotechnol.8：340-344)、Niebel等(1995，Top.Microbiol.Immunol.197：91-103)、Flavell等(1995，Curr.Top.Microbiol.Immunol.197：43-46)、Palauqui和Vaucheret(1995，Plant Mol.Biol.29：149-159)、Vaucheret等(1995，Mol.Gen.Genet.248：311-317)、de Borne等(1994，Mol.Gen.Genet.243：613-621)描述。
此外，降低植物细胞中的GBSSI活性也可以通过同时表达待抑制的特定靶基因、优选GBSSI基因的有义和反义RNA分子引起。
这可以例如通过使用嵌合构建体实现，其中所述的嵌合构建体包含所讨论靶基因或该靶基因部分的“反向重复序列”。该嵌合构建体编码所讨论靶基因的有义和反义RNA分子。使有义和反义RNA在植物中(in planta)作为一个RNA分子同时合成，有可能通过间隔序列使有义和反义RNA相互隔开以形成双链RNA分子(RNAi技术)。
已经证实将反向重复的DNA构建体导入植物基因组是用于抑制与所述反向重复DNA构建体相应的基因的高度有效方法(Waterhouse等，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，13959-13964；Wang和Waterhouse，2000，Plant Mol.Biol.43，67-82；Singh等，2000，Biochemical SocietyTransactions 28(6)，925-927；Liu等，2000，Biochemical SocietyTransactions 28(6)，927-929；Smith等，2000，Nature 407，319-320；WO99/53050)。靶基因或诸多靶基因的有义和反义序列也可以通过相同或不同启动子彼此独立地表达(Nap等，第六届植物分子生物学大会，2000年6月18-24日，魁北克，Poster S7-27，系列讲座S7)。
细胞中表达核酶以降低特定酶的活性也是技术人员已知的并且在例如EP-B10321201中描述。核酶在植物细胞中的表达已经例如由Feyter等(1996，Mol.Gen.Genet.250：329-338)描述。
此外，降低GBSSI活性和/或降低植物细胞中存在的淀粉的表观直链淀粉含量至小于5％重量也可以通过所谓“体内”诱变法实现，其通过转化细胞将RNA-DNA寡核苷酸杂合体(“嵌合体(chimeroplast)”)导入细胞(Kipp等，在第五届植物分子生物学大会，1997年9月21-27日的PosterSession，新加坡；R.A.Dixon和C.J.Arntzen，转基因植物中的代谢工程会议报告(Meeting report regarding Metabolic Engeneering in TransgenicPlants)，Keystone Symposia，Copper Mountain，CO，USA，1997，TIBTECH15：441-447；WO 95/15972；Kren等，1997，Hepatology 25：1462-1468；Cole-Strauss等，1996，Science 273：1386-1389；Beetham等，1999，PNAS96：8774-8778)。
所述RNA-DNA寡核苷酸的DNA组分的部分与内源性GBSSI基因的多核苷酸序列同源，但是与内源性GBSSI基因的多核苷酸序列相比较包含突变或包含被同源区包围的异源区。由于该RNA-DNA寡核苷酸的同源区与所述内源性多核苷酸的同源区发生碱基配对，随后经同源重组，在所述RNA-DNA寡核苷酸的DNA组分中存在的突变或异源区可以转移至植物细胞的基因组中。
因此，降低植物细胞中的GBSSI活性也可以通过产生GBSSI基因的双链RNA分子实现。为此目的，优选将DNA分子的反向重复序列导入植物的基因组，其中所述DNA分子从GBSSI基因所形成的核苷酸序列或此类基因所形成的cDNA中衍生，其中待转录的所述DNA分子处于控制所述RNA分子表达的启动子控制下。
降低植物细胞或植物中蛋白质活性的又一种可能性是称作免疫调节的方法。已知在植物中表达特异性地识别植物蛋白质的抗体导致相应植物细胞或植物中该蛋白质的活性因形成蛋白质/抗体复合物而降低(Conrad和Manteufel，2001，Trends in Plant Science 6：399-402；De Jaeger等，2000，Plant Molecular Biology 43：419-428；Jobling等，2003，NatureBiotechnology 21：77-80)。
上文提及的全部方法基于导入一种或多种外源核酸分子至植物细胞或植物的基因组并且因此原则上适用于产生本发明的植物细胞和本发明的植物。
所述表达的降低可以通过测量编码所讨论酶的转录物的量加以确定，例如通过RNA印迹分析或定量RT-PCR确定。
GBSSI蛋白的量降低可以例如由免疫学方法如蛋白质印迹分析、ELISA(“酶联免疫吸附测定”)或RIA(“放射免疫测定”)测定。
本发明植物细胞或植物中GBSSI活性的降低也可以通过定量GBSSI蛋白的反应产物直链淀粉间接地检测。技术人员知道用于确定植物淀粉中直链淀粉含量的多种方法。对于谷物，尤其稻，表观直链淀粉含量优选地通过与Juliano(1971，Cereal Science Today 16(10)：334-340)方法相似的方法确定，如在下文“材料和方法”章节中进一步描述的那样。
在产生本发明植物细胞或本发明植物的又一个实施方案中，可以使用以以下事实为特征的突变体替代野生型植物细胞或野生型植物，即该突变体已经合成了表观直链淀粉含量小于5％重量的淀粉和/或具有具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质提高的活性和/或具备淀粉合酶II活性的蛋白质提高的活性。这些突变体可以是天然存在的突变体或是通过定向使用诱变剂所产生的那些突变体。产生此类突变体的可能性已经在上文中描述。
本发明还包含本发明的经遗传修饰单子叶植物细胞或植物，它们的遗传修饰在于导入至少一种外源核酸分子至用于转化的植物的基因组中。
作为导入外源核酸分子的结果是，改变了本发明植物细胞的或本发明植物的遗传信息。至少一种外源核酸分子的存在导致改变的“表型”。这里，“改变的表型”意指一种或多种细胞功能的可测量性改变。例如，本发明的经遗传修饰植物细胞和本发明的经遗传修饰植物因存在所导入的外源核酸分子或在该核酸分子表达的情况下，显示具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质的活性提高和具备淀粉合酶II活性的蛋白质的活性提高和/或具有GBSSI活性的蛋白质的活性降低。
在本发明的上下文中，术语“外源核酸分子”理解为意指这样的分子，其不在用于转化的植物细胞中天然存在，或不以特定空间排列在用于转化的植物细胞中天然存在，或处在转化用植物细胞的基因组中的该分子并不天然存在于其中的基因座处。该外源核酸分子优选地是由多种元件组成的重组分子，其中所述多种元件的组合或特定空间排列不在植物细胞中天然地存在。因此，除了编码具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质和/或具备淀粉合酶II活性的蛋白质的核酸分子和/或引起GBSSI活性降低的核酸分子之外，重组核酸分子也可以例如具有不天然地与上文所提及的核酸分子组合存在的额外核酸分子序列。上文提及的额外核酸分子序列可以是任意序列，其中所述的额外核酸分子序列与编码具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质和/或具备淀粉合酶II活性的蛋白质的核酸分子组合或与适用于介导降低具备GBSSI活性的蛋白质的活性的核酸分子组合存在于重组核酸分子上。它们可以是例如基因组和/或植物核酸分子序列。优选地，这些额外的核酸分子序列是调节序列(启动子、终止信号、增强子)，特别优选地是在植物组织中有活性的调节序列；尤其优选地是组织特异性调节序列。
产生重组核酸分子的方法是技术人员已知的并且包括基因工程方法，例如通过连接作用连接核酸分子、遗传重组或核酸分子的从头合成(参见，例如，Sambrok等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第三版(2001)Cold Spring Harbour Laboratory Press，Cold Spring Harbour，NY，ISBN：0879695773；Ausubel等，Short Protocols in Molecular Biology，JohnWiley&Sons；第五版(2002)，ISBN：0471250929)。
在本发明的上下文中，术语“基因组”理解为意指植物细胞中存在的全部遗传材料。技术人员知道不仅细胞核包含遗传材料，其他区室(例如质体、线粒体)也包含遗传材料。
原则上，外源核酸分子可以是这样的任意核酸分子，其在植物细胞或植物中引起具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质的活性和具备淀粉合酶II活性的蛋白质的活性提高，并且引起具备GBSSI活性的蛋白质的活性降低。
在一个优选的实施方案中，编码具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质外源核酸分子采取来自多个植物物种的已提及的核酸分子形式，其中所述核酸分子是技术人员已知的。在本上下文中特别优选来自马铃薯的编码具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质的核酸分子，尤其优选具有SEQ ID NO 2中所示氨基酸序列或由SEQ ID NO 1中所示核酸分子序列编码的具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质。
在又一个优选的实施方案中，编码具备淀粉合酶II活性的蛋白质的外源核酸分子采取来自多个植物物种的已提及的核酸分子形式，其中所述核酸分子是技术人员已知的。在本上下文中特别优选来自小麦的编码具备淀粉合酶II活性的蛋白质的核酸分子，尤其优选具有SEQ ID NO 4中所示氨基酸序列或由SEQ ID NO 3中所示核酸分子序列编码的具备淀粉合酶II活性的蛋白质。
又一个优选的实施方案采取来自稻的核酸分子形式，其中所述核酸分子编码具备淀粉合酶II活性的蛋白质、尤其优选地编码具有SEQ ID NO 6中所示氨基酸序列或由SEQ ID NO 5中所示核酸分子序列编码的具备淀粉合酶II活性的蛋白质。
在又一个优选的实施方案中，编码具备GBSSI活性的蛋白质的外源核酸分子采取来自多个植物物种的已提及的核酸分子形式，其中所述核酸分子是技术人员已知的。在本上下文中特别优选来自稻的编码具备GBSSI活性的蛋白质的核酸分子，尤其优选具有SEQ ID NO 8中所示氨基酸序列或由SEQ ID NO 7中所示核酸分子序列编码的具备GBSSI活性的蛋白质。
又一个优选的实施方案采取来自小麦的核酸分子形式，其中所述核酸分子编码具备GBSSI活性的蛋白质、尤其优选地编码具有SEQ ID NO 10中所示氨基酸序列或由SEQ ID NO 9中所示核酸分子序列编码的具备GBSSI活性的蛋白质。
又一个优选的实施方案采取来自玉米的核酸分子形式，其中所述核酸分子编码具备GBSSI活性的蛋白质、尤其优选地编码具有SEQ ID NO 12中所示氨基酸序列或由SEQ ID NO 11中所示核酸分子序列编码的具备GBSSI活性的蛋白质。
在又一个实施方案中，本发明的植物细胞和植物是对蜡质突变纯合的并且以因而合成其表观直链淀粉含量小于5％重量的淀粉。
在本发明的上下文中，术语“对蜡质突变纯合的”理解为意指植物对于无功能性GBSSI基因进行纯合育种(breeds true)。对技术人员而言，纯合性意指在细胞的遗传材料中，关于特定性状的全部等位基因是相同的，换句话说，某个基因的两个或多个相同拷贝存在于染色体的两条染色单体上，其中所述染色单体包含该基因。它们对于这个基因是纯合的(＝纯种)并且在自交时，把所讨论的性状传递至全部子代。技术人员知道多倍体植物(例如小麦)可以在某些环境下需要纯和形式的3个无功能性GBSSI等位基因(在亚基因组A、B和D)以表现蜡质表型。
出于遗传修饰目的而向表现蜡质表型的植物细胞或植物导入的外源核酸分子可以采取单个核酸分子或多个核酸分子的形式。它们可以采取这样的核酸分子形式，其中所述的核酸分子包含编码具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质的核酸分子序列和编码具备淀粉合酶II活性的蛋白质的核酸分子序列，也包含在所述核酸分子中，编码具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质的核酸分子序列和编码具备淀粉合酶II活性的蛋白质的核酸分子序列存在于不同的核酸分子上。例如，编码具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质的核酸分子序列和编码具备淀粉合酶II活性的蛋白质的核酸分子序列可以同时存在于一个载体、质粒或线性核酸分子中(“双重构建体”)或作为在每一情况下均分开的两个载体、质粒或线性核酸分子的组分。
若编码具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质的核酸分子序列和编码具备淀粉合酶II活性的蛋白质的核酸分子序列存在于两个分开的核酸分子中，则它们可以同时地(“共转化”)或先后即时间上间隔地(“超转化(supertransformation)”)被导入所述植物细胞或植物的基因组。独立的核酸分子也可以导入某物种的各个不同植物细胞或植物。因此，可以产生其中具备葡聚糖/水双激酶活性的至少一种蛋白质的活性升高或具备淀粉合酶II活性的至少一种蛋白质的活性升高的植物细胞或植物。随后可以按照以下方式产生本发明的植物，即通过将其中具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质的活性升高的那些植物随后与其中具备淀粉合酶II活性的蛋白质的活性升高的那些植物杂交。选择用于所讨论方法步骤的参数在下文进一步定义。
在又一个实施方案中，本发明植物细胞或植物的蜡质表型因通过导入适用于降低GBSSI活性的一种或多种重组核酸分子引起。
出于遗传修饰目的而向野生型植物细胞或植物导入的外源核酸分子可以采取单个核酸分子或多个核酸分子的形式。它们可以采取这样的核酸分子形式，其中所述的核酸分子包含编码具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质的核酸分子序列和编码具备淀粉合酶II活性的蛋白质的核酸分子序列，并且额外地包含适用于抑制GBSSI活性的核酸分子序列(三重构建体)。同样地，它们也可以采取这样的核酸分子形式，在所述核酸分子中编码具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质的核酸分子序列和编码具备淀粉合酶II活性的蛋白质的核酸分子序列存在于不同的核酸分子上，其中这两种核酸分子中的一种或另一种额外地包含适用于抑制GBSSI活性的核酸序列。另外，它们也可以采取这样的核酸分子形式，在所述核酸分子中编码具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质的核酸分子序列和编码具备淀粉合酶II活性的蛋白质的核酸分子序列存在于一个核酸分子中并且适用于抑制GBSSI活性的核酸分子存在于不同的核酸分子上(一个双重构建体和一个简单构建体的三重变体)。
在又一个实施方案中，它们也可以采取3种不同核酸分子的形式，其中一种核酸分子包含编码葡聚糖/水双激酶蛋白质的核酸分子序列，另一种核酸分子包含编码淀粉合酶II的核酸分子序列并且又一种核酸分子包含适用于抑制GBSSI活性的核酸分子序列(3个简单构建体)。
适于产生本发明植物细胞或植物的核酸分子可以存在于例如载体、质粒或线性核酸分子中。
若待用以产生本发明植物细胞或植物的构建体存在于两个或三个独立的核酸分子中，则它们可以同时地(“共转化”)或先后即时间上间隔地(“超转化”)被导入所述植物细胞或植物的基因组。独立的核酸分子也可以导入某物种的各个不同植物细胞或植物。因此，可以产生这样的植物细胞或植物，其中具备葡聚糖/水双激酶活性的至少一种蛋白质和/或具备淀粉合酶II活性的至少一种蛋白质的活性升高和/或具有GBSSI活性的至少一种蛋白质减少至如此程度，从而由所述植物细胞或植物合成的淀粉具有小于5％重量的表观直链淀粉含量。本发明的植物随后可以通过使所述植物杂交而产生。
此外，也可以产生这样的植物，在所述植物中具有GBSSI(酶)活性的至少一种蛋白质的活性降低至如此程度，从而由所述植物细胞或植物合成的淀粉具有小于5％重量的表观直链淀粉含量，并且在又一个步骤中，通过与其中具备淀粉合酶II活性的至少一种蛋白质的活性升高的植物杂交，产生本发明的植物细胞或植物。
当下述一种或多种核酸分子在一个方法学步骤中/同时导入植物细胞基因组的情况下，本发明的植物可以从所述转化产生的植物中直接选出，其中所述一种或多种核酸分子包含适用于提高植物细胞中具备葡聚糖/水双激酶和/或淀粉合酶II活性的至少一种蛋白质的活性和降低植物细胞中GBSSI的活性至由所述植物细胞或植物合成的淀粉具有小于5％的表观直链淀粉含量的核酸分子序列。
在又一个实施方案中，本发明的植物细胞和本发明的植物包含了编码具备淀粉合酶II活性的蛋白质的至少一种外源核酸分子和编码具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质的第二外源核酸分子。在又一个实施方案中，本发明的植物细胞和本发明的植物包含了编码具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质的第一外源核酸分子和编码具备淀粉合酶II活性的蛋白质的第二外源核酸分子。
多种技术可用于将DNA导入植物宿主细胞。这些技术包括使用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)作为转化剂，以T-DNA转化植物细胞、原生质体融合、注射法、DNA电穿孔法、通过生物射弹法导入DNA和其他可能方法。
使用农杆菌介导植物细胞转化已经得到深入研究并且尤其已在EP120516；Hoekema(在：The Binary Plant Vector System，OffsetdrukkerijKanters B.V.Alblasserdam(1985)，第V章中)；Fraley等，Crit.Rev.PlantSci.4：1-46)中，并且由An等(1985，EMBO J.4：277-287)中描述。
还已经描述了借助基于农杆菌转化的载体对单子叶植物的转化(Chan等1993，Plant Mol.Biol.22：491-506；Hiei等，1994，Plant J.6，271-282；Dcng等，1990，Science in China 33：28-34；Wilmink等，1992，Plant CellReports 11：76-80；May等，1995，Bio/Technology 13：486-492；Conner和Domisse，1992，Int.J.Plant Sci.153：550-555；Ritchie等，1993，Transgenic Res.2：252-265)。用于转化单子叶植物的备选方法是生物射弹转化法(Wan和Lemaux，1994，Plant Physiol.104：37-48；Vasil等，1993，Bio/Technology 11：1553-1558；Ritala等，1994，Plant Mol.Biol.24：317-325；Spencer等，1990，Theor.Appl.Genet.79：625-631)、原生质体转化法、部分透化细胞的电穿孔法或通过玻璃纤维导入DNA。尤其，玉米的转化在文献中反复描述(参考，例如，WO95/06128，EP0513849，EP0465875，EP0292435；Fromm等，1990，Biotechnology 8：833-844；Gordon-Kamm等，1990，Plant Cell 2：603-618；Koziel等，1993，Biotechnology 11：194-200；Moroc等，1990，Theor.Appl.Genet.80：721-726)。
还已经描述了其他谷类物种的成功转化，例如在大麦(Wan和Lemaux，s.o.；Ritala等，s.o.；Krens等，1982，Nature 296：72-74)和小麦(Nehra等，1994，Plant J.5：285-297；Becker等，1994，Plant Journal 5：299-307)的情形中。在本发明的范围内，上文方法均是适用的。
其淀粉具有小于5％重量的直链淀粉含量并且受到遗传修饰的植物细胞和植物(其中所述遗传修饰因导入编码具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质的基因和/或编码具备淀粉合酶II活性的蛋白质的基因所致)尤其可以因它们包含不在野生型植物细胞或野生型植物中天然存在的至少一种外源核酸分子或因这种分子存在于本发明植物细胞的基因组或本发明植物的基因组中如此位置处而与野生型植物细胞或野生型植物区分，其中所述分子不在所述野生型植物细胞或野生型植物的所述位置处存在，即处在不同的基因组环境中。此外，本发明的这类植物细胞或本发明的这类植物可以因以下事实而与野生型植物细胞或野生型植物区分，即它们包含稳定整合在其基因组内的至少一个拷贝的所述外源核酸分子，以及根据需要额外地包含在所述野生型植物细胞或野生型植物中天然存在的此种分子的多个拷贝。若已经导入本发明植物细胞或本发明植物的外源核酸分子采取额外拷贝的形式，除了在所述野生型植物细胞或野生型植物中天然存在的分子之外，本发明的植物细胞和本发明的植物尤其可以因以下事实而与野生型植物细胞或野生型植物区分，即这种额外的拷贝或这些额外的拷贝处于基因组中的如此位置处，其中所述拷贝在该野生型植物细胞或野生型植物的所述位置处不存在。这可以例如借助DNA印迹分析法验证。
本发明的植物细胞或本发明的植物还可以优选地因至少一个以下特征与野生型植物细胞或野生型植物区分：若已导入的外源核酸分子相对于植物细胞或植物是异源的，则本发明的植物细胞或本发明的植物包含已导入的核酸分子的转录物。这些转录物可以例如通过RNA印迹分析或通过RT-PCR(逆转录聚合酶链反应)检测。
表达反义转录物和/或RNAi转录物的本发明植物细胞或本发明植物可以例如借助与编码所述蛋白质(并且天然存在于所述植物细胞中)的RNA互补的特异性核酸探针进行检测。优选地，本发明的植物细胞和本发明的植物包含由已导入的核酸分子编码的蛋白质。这种蛋白质可以例如通过免疫学方法、尤其通过蛋白质印迹分析法检测。
优选地，本发明的植物细胞或本发明的植物包含由已导入的核酸分子编码的蛋白质。这种蛋白质可以例如通过免疫学方法、尤其通过蛋白质印迹分析法检测。
若已导入的外源核酸分子相对于所述植物细胞或植物是同源的，则本发明的植物细胞或本发明的植物可以例如基于已导入的所述外源核酸分子的额外表达与野生型植物细胞或野生型植物区分。本发明的植物细胞和本发明的植物优选地包含该外源核酸分子的转录物。这可以例如通过RNA印迹分析法或借助称为定量PCR法的方法检测。
本发明的又一个主题涉及经遗传修饰的单子叶植物细胞或经遗传修饰的单子叶植物，其合成与从相应的非遗传修饰野生型植物细胞分离或从相应的非遗传修饰野生型植物分离的淀粉相比较的被改性淀粉。
本发明还涉及包含本发明植物细胞的经遗传修饰单子叶植物。此类植物可以通过再生从本发明的植物细胞产生。
原则上，本发明的植物可以采取任意单子叶植物的形式。优选地，它们采取单子叶作物植物的形式，即出于营养目的或出于技术目的，尤其工业目的而人工培育的植物。
在又一个实施方案中，本发明的植物采取贮藏淀粉的单子叶植物形式，或本发明的植物细胞源自淀粉贮藏植物。
在本发明的上下文中，术语“淀粉贮藏植物”意指具有包含贮藏淀粉的植物部分的所有植物，例如玉米、稻、小麦、黑麦、燕麦、大麦、西米(sago)、芋头(taro)和谷子/高粱。
在优选的实施方案中，本发明涉及(系统命名(systematic))禾本科(Poaceae)单子叶植物。这些植物特别优选地采取稻、玉米或小麦植物的形式。这些植物非常特别优选地采取稻植物形式。
在本发明的上下文中，术语“小麦植物”意指小麦属(Triticum)植物物种或源于与小麦属植物杂交的植物，尤其是农业中出于商业目的而培育的小麦属植物物种，或源于与小麦属植物杂交、尤其优选与普通小麦杂交的植物。
在本发明的上下文中，术语“玉米植物”意指玉米属(Zea)植物物种，尤其是农业中出于商业目的而培育的玉米属植物物种，特别优选地是玉米。
在本发明的上下文中，术语“稻植物”意指稻属(Oryza)植物物种，尤其是农业中出于商业目的而培育的稻属植物物种，特别优选地是稻。
本发明也涉及包含经遗传修饰植物细胞的单子叶植物的繁殖材料。
这里，术语“繁殖材料”包括植物中适用于通过无性途径或有性途径产生子代的那些部分。适于无性繁殖的繁殖材料实例是插条、愈伤组织培养物、根茎或块茎。其他繁殖材料包括例如果实、种子、籽苗、原生质体、细胞培养物等。
在又一个实施方案中，本发明涉及能够从本发明植物中收获的植物部分，如果实、贮藏根、根、花、芽、枝条或茎，优选种子或核仁，能够收获的这些部分包含本发明的植物细胞。
在又一个实施方案中，本发明的经遗传修饰单子叶植物细胞以以下事实为特征，即它们合成热水溶胀力升高并且直链淀粉含量小于5％重量的(蜡质)淀粉。
在一个优选的实施方案中，经遗传修饰单子叶植物细胞以以下事实为特征，即它包含具有60-100g/g热水溶胀力的蜡质淀粉。
在本上下文中特别优选70-95g/g、非常特别优选80-95g/g并且异乎寻常地优选80-90g/g的热水溶胀力。
本发明的又一主题涉及产生经遗传修饰单子叶植物的方法，其中
a)对植物细胞进行遗传修饰，所述的遗传修饰包括以下的步骤i至iii：
i)向所述植物细胞导入遗传修饰，其中与相应的非遗传修饰野生型植物细胞相比较，所述遗传修饰导致具备淀粉合酶II活性的蛋白质的活性提高，
ii)向所述植物细胞导入遗传修饰，其中与相应的非遗传修饰野生型植物细胞相比较，所述遗传修饰导致具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质的活性提高，
iii)向所述植物细胞导入遗传修饰，其中与相应的非遗传修饰野生型植物细胞相比较，所述遗传修饰导致具备GBSSI活性的蛋白质的活性降低，
其中步骤i至iii可以按照任意想要的顺序，单独地或作为步骤i至iii的任意想要的组合同时地实施，
b)从步骤a)的植物细胞再生出植物；
c)根据需要，借助步骤b)的植物产生进一步的植物，
其中根据需要，从根据步骤b)或c)的植物分离植物细胞并且重复方法步骤a)至c)直至产生这样的植物，其与相应的非遗传修饰野生型植物细胞相比具有具备淀粉合酶II活性的蛋白质提高的活性，并且与相应的非遗传修饰野生型植物细胞相比具有降低的具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质的活性，以及与相应的非遗传修饰野生型植物细胞相比具有降低的具备GBSSI活性的蛋白质的活性。
另外，本发明也涉及产生经遗传修饰植物的方法，在所述经遗传修饰植物中其淀粉具有小于5％重量的直链淀粉含量的植物细胞受到遗传修饰，其中所述遗传修饰以任意想要的顺序分别或同时包括以下步骤a)和b)：
a)向所述植物细胞导入遗传修饰，其中与相应的非遗传修饰野生型植物细胞相比较，所述遗传修饰导致具备淀粉合酶II活性的蛋白质的活性提高，
b)向所述植物细胞导入遗传修饰，其中与相应的非遗传修饰野生型植物细胞相比较，所述遗传修饰导致具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质的活性提高，并且
c)从步骤a)和b)的植物细胞再生出植物；
d)根据需要，借助来自步骤a)和b)的植物产生进一步的植物，
其中根据需要，从根据步骤a)或b)的植物分离植物细胞并且重复方法步骤a)至c)直至产生这样的植物，其包含编码具备淀粉合酶II活性的蛋白质的外源核酸分子和编码具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质的外源核酸分子。
本发明的优选主题涉及产生单子叶植物的方法，其中
a)遗传修饰植物细胞，其中所述的遗传修饰以任意想要的顺序包括以下步骤i至iii，或单独地或同时地实施以下步骤i至iii的任意所需组合
i)向所述植物细胞导入遗传修饰，其中与相应的非遗传修饰野生型植物细胞相比较，所述遗传修饰导致具备淀粉合酶II活性的蛋白质的活性提高，
ii)向所述植物细胞导入遗传修饰，其中与相应的非遗传修饰野生型植物细胞相比较，所述遗传修饰导致具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质的活性提高，
iii)向所述植物细胞导入遗传修饰，其中与相应的非遗传修饰野生型植物细胞相比较，所述遗传修饰导致具备GBSSI活性的蛋白质的活性降低，
b)从包含根据以下步骤遗传修饰的植物细胞再生出植物
i)a)i
ii)a)ii
iii)a)iii
iv)a)i与a)ii，
v)a)i与a)iii，
vi)a)ii与a)iii，或
vii)a)i和a)ii及a)iii
c)向根据以下前者步骤的植物的植物细胞导入以下后者的遗传修饰
i)b)i，根据步骤a)ii的遗传修饰，
ii)b)i，根据步骤a)iii的遗传修饰，
iii)b)i，根据步骤a)ii的遗传修饰和同时根据步骤a)iii的遗传修饰，
iv)b)ii，根据步骤a)i的遗传修饰，
v)b)ii，根据步骤a)iii的遗传修饰，
vi)b)ii，根据步骤a)i的遗传修饰和同时根据步骤a)iii的遗传修饰，
vii)b)iii，根据步骤a)i的遗传修饰，
viii)b)iii，根据步骤a)ii的遗传修饰，
ix)b)iii，根据步骤a)i的遗传修饰和同时根据步骤a)ii的遗传修饰，
x)b)iv，根据步骤a)iii的遗传修饰，
xi)b)v，根据步骤a)ii的遗传修饰，或
xii)b)vi，根据步骤a)i的遗传修饰
并且使所述植物再生，
d)向根据以下前者步骤的植物的植物细胞导入以下后者的遗传修饰
i)c)i，根据步骤a)iii的遗传修饰，
ii)c)ii，根据步骤a)ii的遗传修饰，
iii)c)iv，根据步骤a)iii的遗传修饰，
iv)c)v，根据步骤a)ii的遗传修饰，
v)c)vii，根据步骤a)ii的遗传修饰，
vi)c)vii，根据步骤a)i的遗传修饰，或
vii)c)ix，根据步骤a)ii的遗传修饰，
并且使植物再生，
根据需要，借助根据步骤b)vii、c)iii、c)vi、c)x、c)xi、c)xii之一步骤或根据步骤d)i-d)vii之任意步骤的植物产生进一步的植物。
根据步骤a)导入所述植物细胞的遗传修饰原则上可以采取任意类型的修饰形式，其中所述的修饰导致具备淀粉合酶II活性的蛋白质的活性提高和/或导致具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质的活性提高和/或导致具备GBSSI活性的蛋白质的活性降低。
根据本发明方法的步骤b)-e)的植物再生可以通过技术人员已知的方法实现(例如在″Plant Cell Culture Protocols″，1999，R.D.Hall编辑，Humana Press，ISBN 0-89603-549-2中描述)。
通过本发明方法产生进一步的植物可以例如通过无性繁殖(例如通过插条、块茎或通过愈伤组织培养物并且再生出完整植物)或通过有性繁殖完成。有性繁殖优选地以受控方式进行，即具有特定特征的所选择植物相互杂交并繁殖。所述选择优选地以这样的方式进行，从而所述进一步的植物(其取决于方法，根据步骤c)或步骤d)或步骤e)产生)具有在先前步骤中导入的修饰。
用于选择可以通过杂交或通过转化而产生的本发明植物细胞或植物的参数于下文详述：
在其中仅具备葡聚糖/水双激酶活性的至少一种蛋白质增加的情况下，合适的植物或植物细胞是具有在淀粉C6位置处每mg淀粉至少2.5nmol的磷酸酯含量的那些植物或植物细胞。在其中仅具备淀粉合酶II活性的至少一种蛋白质增加的情况下，合适的植物或植物细胞是具有以下SSII活性的植物或植物细胞，其中所述的SSII活性提高到用于导入本发明核酸分子或用于杂交的植物细胞或植物中的SSII活性至少2倍。
在其中具备葡聚糖/水双激酶活性的至少一种蛋白质和具备淀粉合酶II活性的至少一种蛋白质增加的情况下，合适的植物或植物细胞是具有在淀粉C6位置处每mg淀粉至少2.5nmol的磷酸酯含量并且额外具有以下SSII活性的植物或植物细胞，其中它们的SSII活性提高到用于导入本发明核酸分子或用于杂交的植物细胞或植物中的SSII活性至少2倍。
在其中GBSSI活性降低或使用蜡质突变体的情况下，当突变以纯合形式存在时，合适的植物是具有小于5％重量的表观直链淀粉含量的那些植物。
另一个合适的选择标准是在C6位置中淀粉磷酸酯含量的水平。优选选择的植物是这样的植物，它们包含根据步骤a)和b)的遗传修饰并且其淀粉磷酸酯含量是至少2.5nmol C6P/mg淀粉并且其淀粉具有小于5％重量的表观直链淀粉含量。
在用于产生经遗传修饰植物的本发明方法中，用于产生本发明的经遗传修饰植物细胞的遗传修饰可以同时地或在连续步骤中实施。在这个上下文中，就导致具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质的活性提高的遗传修饰和/或就导致具备GBSSI活性的蛋白质的活性降低的遗传修饰而言，相同方法是否用于导致具备淀粉合酶II活性的蛋白质的活性提高的连续遗传修饰是不重要的。
可以选择多种选择标准以选择本发明的植物或用于进一步修饰的那些植物。
在用于产生经遗传修饰植物的本发明方法的又一个实施方案中，方法步骤c)-1在步骤c)后进行，其中选择这样的植物，其淀粉具有小于5％重量的表观直链淀粉含量并且具有根据步骤a)i)的具备淀粉合酶II活性的蛋白质的活性提高和/或具有根据步骤a)ii)的具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质的活性提高。所选择的植物随后用于其他方法步骤。
在用于产生经遗传修饰植物的本发明方法的又一个实施方案中，至少一种外源核酸分子编码来自马铃薯、小麦、稻、玉米、大豆、柑桔、姜黄属(Curcuma)或拟南芥属(Arabidopsis)的具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质。优选地，至少一种外源核酸分子编码来自马铃薯的具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质并且尤其优选地编码具有SEQ ID NO 2中所示氨基酸序列或由SEQ ID NO 1中所示核酸分子序列编码的蛋白质。已经在上文详述了核酸分子序列的参考，其中所述的核酸分子序列编码来自上文提及植物的具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质。
在用于产生经遗传修饰植物的本发明方法的又一个实施方案中，至少一种外源核酸分子编码来自小麦、大麦、山羊草属(Aegilops)、稻、玉米、木薯(cassava)、豆类(bean)、马铃薯、豌豆(pea)、甜马铃薯、拟南芥属、西米、Ostreococcus或衣藻属(Chlamydomonas)的具备淀粉合酶II活性的蛋白质。优选地，至少一种外源核酸分子编码来自小麦的具备淀粉合酶II活性的蛋白质并且尤其优选地编码具有SEQ ID NO 3的蛋白质。已经在上文进一步详述了核酸分子序列的参考，其中所述的核酸分子序列编码来自上文提及植物的具备淀粉合酶II活性的蛋白质。
如上文已经对出于遗传修饰目的而导入植物细胞或植物的外源核酸分子所描述的那样，用于产生经遗传修饰植物的本发明方法的步骤a)中的核酸分子可以采取单个核酸分子或多个核酸分子的形式，其中所述经遗传修饰植物的淀粉具有小于5％重量的直链淀粉含量。因此，编码具备淀粉合酶II活性的蛋白质或编码具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质的外源核酸分子可以共同存在于一个单一核酸分子上或它们可以存在于分立的核酸分子上。若编码具备淀粉合酶II活性的蛋白质或编码具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质的核酸分子存在于多个核酸分子上，则这些核酸分子可以同时地或以连续步骤导入植物细胞。
在用于产生本发明经遗传修饰植物的本发明方法的又一个实施方案中，至少一种外源核酸分子编码来自单子叶植物、优选来自稻、小麦、大麦、玉米、山羊草属植物、高粱或燕麦的具备GBSSI活性的蛋白质。
已经在上文中进一步详述了上文提及的核酸序列的参考，其中所述的核酸分子序列编码来自上文提及植物的具备GBSS1活性的蛋白质。
优选地，至少一种外源核酸分子编码来自稻的具备GBSS1活性的蛋白质并且尤其优选地编码由SEQ ID NO 7中所示核酸序列或由SEQ IDNO 8中所示氨基酸序列所编码的蛋白质。
在又一个优选的实施方案中，至少一种外源核酸分子编码来自小麦的具备GBSS1活性的蛋白质并且尤其优选地编码由SEQ ID NO 9中所示或SEQ ID NO 10中所示氨基酸序列所编码的蛋白质。
在又一个优选的实施方案中，至少一种外源核酸分子编码来自玉米的具备GBSS1活性的蛋白质并且尤其优选地编码由SEQ ID NO 11中所示核酸序列或由SEQ ID NO 12中所示氨基酸序列所编码的蛋白质。
这里，所述外源核酸分子导致GBSS1的活性抑制并且因此导致具有小于5％重量的直链淀粉含量的淀粉合成。上文已经就所讨论核酸分子用于产生本发明植物细胞或植物的用途而描述的内容也类似地适用于此处。
用于遗传修饰的外源核酸分子可以采取一个组合的核酸构建体形式或采取多个分立的核酸构建体，特别采取所谓简单构建体、二重构建体或三重构建体形式。因此，所述外源核酸分子可以是所谓的“三重构建体”，这理解为意指用于转化植物的单个载体，其中所述单个载体不仅包含用于抑制内源性GBSSI基因表达的遗传信息，还包含用于过量表达一个或多个SSII基因和用于过量表达一个或多个GWD基因的信息。
构建外源核酸分子用于抑制GBSSI活性的基本原理是使用反义、共抑制、核酶和双链RNA构建体和有义构建体，所述的使用导致编码GBSSI的内源性基因的表达降低并同时导致具有SSII和/或GWD活性的蛋白质的活性提高。
在本上下文中，所述外源核酸分子可以可以同时地(“共转化”)或先后即时间上间隔地(“超转化”)导入所述植物细胞的基因组。
外源核酸分子也可以导入一个物种的不同单个植物。以这种方式，可以产生这样的植物，其中具备GBSSI活性的蛋白质的活性降低和/或具有SSII或GWD活性的蛋白质的活性提高。随后，可以接着进行杂交以产生这样的植物，其中具备GBSSI活性的蛋白质的活性降低并且具有SSII和GWD活性的蛋白质的活性提高。
在本发明的上下文中，术语“同一性”理解为意指与其他蛋白质/核酸分子一致(相同性)的氨基酸/核苷酸的数目，以百分数表述。
优选地，借助计算机程序，具备淀粉合酶II活性的蛋白质的同一性通过SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 6中详述的氨基酸序列与其他蛋白质比较而确定，或编码具备淀粉合酶II活性的蛋白质的核酸分子的同一性通过SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 5中详述的核酸序列与其他核酸比较而确定，并且具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质的同一性通过SEQ ID NO 2中详述的氨基酸序列与其他蛋白质比较而确定，或编码具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质的核酸分子的同一性通过SEQ ID NO 1中详述的核酸序列与其他核酸比较而确定，并且编码具备GBSSI活性的蛋白质的核酸分子的同一性通过SEQ ID NO 7或SEQ ID NO 9或SEQ ID NO 11中详述的核酸序列与其他核酸比较而确定，或具备GBSSI活性的蛋白质的同一性通过SEQ ID NO 8或SEQ ID NO 10或SEQ ID NO 12中详述的氨基酸序列与其他蛋白质比较而确定。
若相互比较的序列具有不同长度，则同一性将以如此方式确定，从而较短序列同较长序列共有的氨基酸/核苷酸的数目决定同一性百分数。同一性优选地通过公众可获得的已知计算机程序例如ClustalW(Thompson等，Nucleic Acids Research 22(1994)，4673-4680)确定。ClustalW由德国海德堡Meyerhofstrasse 1，D 69117，欧洲分子生物学实验室的JulieThompson(Thompson@EMBL-Heidelberg.DE)和Toby Gibson(Gibson@EMBL-Heidelberg.DE)向公众发布。ClustalW也可从多个互联网页面下载，尤其从IGBMC(Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire etCellulaire，B.P.163，67404 Illkirch Cedex，France；ftp://ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pub/)和EBI(ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/software/)以及EBI的全部镜像互联网页面(欧洲生物信息研究所，Wellcome TrustGemone Campus，Hinxton，Cambridge CB101SD，UK)下载。
为确定本发明范围内所述蛋白质与其他蛋白质之间的同一性，优选地使用ClustalW计算机程序1.8版。设置如下参数：KTUPLE＝1，TOPDIAG＝5，WINDOW＝5，PAIRGAP＝3，GAPOPEN＝10，GAPEXTEND＝0.05，GAPDIST＝8，MAXDIV＝40，MATRIX＝GONNET，ENDGAPS(OFF)，NOPGAP，NOHGAP。
为确定例如本发明范围内所述核酸分子的核苷酸序列与其他核酸分子的核苷酸序列之间的同一性，优选地使用ClustalW计算机程序1.8版。设置如下参数：KTUPLE＝2，TOPDIAGS＝4，PAIRGAP＝5，DNAMATRIX：IUB，GAPOPEN＝10，GAPEXT＝5，MAXDIV＝40，TRANSITIONS：非加权。
同一性还意指所讨论的核酸分子之间或由它们编码的蛋白质之间存在功能性和/或结构性等同。与以上所述分子同源并且作为这些分子的衍生物的核酸分子原则上会采取相对于这些分子的变异形式，其中所述的变异是具有相同生物学功能的修饰。这些变异可以采取天然存在的变异形式，例如来自其他物种的序列或采取突变的形式，其中这些突变已经天然地存在或可能通过特定诱变导入。此外，变异可以采取人工合成的序列形式。等位变体可以采取天然存在的变体形式，或采取人工产生的变体或已通过重组DNA技术产生的变体形式。衍生物的具体形式例如是因遗传密码子的简并性而与本发明范围内所述核酸分子不同的核酸分子。
在本发明的范围内，术语“杂交”意指在常规杂交条件，优选在严格条件下杂交，如在例如Sambrock等，Molecular Cloning，A LaboratoryManual，第三版(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY.ISBN：0879695773；Ausubel等，Short Protocols in MolecularBiology，John Wiley&Sons；第5版(2002)，ISBN：0471250929)中描述。特别优选地，“杂交”意指如下条件下杂交：
杂交缓冲液：
2×SSC；10×Denhardt溶液(菲克400+PEG+BSA；比例1∶1∶1)；0.1％SDS；5mM EDTA；50mM Na2HPO4；250μg/ml鲱精DNA；50μg/mltRNA；或
25M磷酸钠缓冲液pH 7.2；1mM EDTA；7％SDS
杂交温度：
T＝65-68℃
洗涤缓冲液：0.1×SSC；0.1％SDS
洗涤温度：T＝65-68℃。
与上文提及的分子杂交的核酸分子可以从例如基因组文库或从cDNA文库分离。此类核酸分子的鉴定和分离可以使用上文提及的核酸分子或这些分子的部分或使用这些分子的反向互补物，例如通过根据标准方法杂交或借助PCR扩增而实现。
可以用于分离编码具备淀粉合酶II活性或葡聚糖/水双激酶活性或GBSSI活性的蛋白质的核酸序列的杂交探针例如是完全具有或基本上具有在SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 5(淀粉合酶II)中或在SEQ ID NO 1(葡聚糖/水双激酶)中或在SEQ ID NO 7，9或11(GBSSI)中详述的核苷酸序列或这些序列之部分的核酸分子。
用作杂交探针的片段也可以采取已借助常规合成技术产生并且其序列与本发明范围内所述核酸分子的序列基本上一致的合成性片段或寡核苷酸形式。当已经分离并鉴定与本发明范围内所述核酸序列杂交的基因时，应当对该序列实施测序并且分析由该序列编码的蛋白质的特征，以确证这些蛋白质分别是具备淀粉合酶II活性或葡聚糖/水双激酶活性或GBSSI活性的蛋白质。
与本发明范围内所述核酸分子杂交的分子尤其包含上文所提及核酸分子的片段、衍生物和等位变体。在本发明的上下文中，术语“衍生物”意指在这些分子的一个或多个位置处与上文所述核酸分子的序列不同并且与这些序列具有高度同一性的序列。与上文所述核酸分子的差异可以通过例如缺失、添加、替换、插入或重组产生。
为表达编码具备淀粉合酶II活性的蛋白质和/或具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质和/或具备GBSSI活性的蛋白质的本发明核酸分子，这些分子优选地与确保在植物细胞中转录的调节DNA序列连接。这些调节DNA序列尤其包括启动子。通常，在植物细胞中有活性的任意启动子适用于表达。
所述启动子可以按照这样的方式选择，从而表达以组成型方式发生或仅在某种组织中、在植物发育的某个时间点或在由外界因素决定的某个时间点处发生。启动子可以与所述植物或与所述核酸分子是同源的或异源的。
合适启动子的实例是：旨在组成型表达的花椰菜花叶病毒35S RNA启动子和玉米遍在蛋白启动子、稻遍在蛋白启动子(Liu等，Plant Science165，(2003)、稻肌动蛋白启动子(Zhang等，Plant Cell 3：1150-1160，1991)、木薯脉花叶病毒(Cassava Vein Mosaic Virus；CVMV)启动子(Verdaguer等，Plant Mol.Biol.31：1129-1139)、玉米组蛋白H3C4启动子(US6,750,378)或夜香树属(Cestrum)YLCV启动子(黄叶卷曲病毒；WO 0173087；Stavolone等，2003，Plant Mol.Biol.53，703-713)。也可以使用确保仅在光合活跃组织中表达的启动子，如ST-LS1启动子(Stockhaus等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(1987)，7943-7947；Stockhaus等，EMBO J.8(1989)，2445-2451)，或对于胚乳特异性表达，使用小麦HMW启动子、蚕豆(Viciafaba)USP启动子(Fiedler等，1993，Plant Mol.Biol.22：669-679；等，1991，Mol.Gen.Genet.225：459-467)、菜豆的菜豆球蛋白启动子、来自玉米的玉米醇溶蛋白基因启动子(Pedersen等，Cell 29(1982)，1015-1026；Quatroccio等，Plant Mol.Biol.15(1990)，81-93)、谷蛋白启动子(Leisy等，Plant Mol.Biol.14(1990)，41-50；Zheng等，Plant J.4(1993)，357-366；Yoshihara等，FEBS Lett.383(1996)，213-218)、球蛋白启动子(Nakase等，1996，Gene 170(2)：223-226)，谷醇溶蛋白启动子(Qu和Takaiwa，2004，Plant Biotechnology Journal 2(2)：113-125)。然而，也可使用仅在由外界因素影响决定的一个时间点处活化的启动子(参见例如WO 9307279)。也有兴趣的启动子是使简单诱导成为可能的热休克蛋白启动子。此外，可以使用种子特异性启动子，如蚕豆USP启动子(见上文)。
也可以存在终止序列(聚腺苷酸化信号)。这种序列的作用是向转录物添加聚腺苷酸尾。认为聚腺苷酸尾具有稳定转录物的功能。此类元件在文献中描述(参考Gielen等，1989，EMBO J.8：23-29)并且可以根据需要进行交换。
内含子序列也有可能存在于启动子与编码区之间。此类内含子序列可以在植物中导致表达稳定和导致表达增加(Callis等，1987，Genes Devel.1，1183-1200；Luehrsen和Walbot，1991，Mol.Gen.Genet.225，81-93；Rethmeier等，1997；Plant Journal.12(4)：895-899；Rose和Beliakoff，2000，Plant Physiol.122(2)，535-542；Vasil等，1989，Plant Physiol.91，1575-1579；Xu等，2003，中国科学C第46卷(6)，561-569)。合适内含子序列的实例是玉米sh1基因的第一内含子、玉米多聚遍在蛋白基因1的第一内含子、稻EPSPS基因的第一内含子或拟南芥PAT1基因的头两个内含子之一。
本发明的又一个实施方案涉及产生本发明的经遗传修饰单子叶植物的方法，其中其淀粉具有小于5％重量的表观直链淀粉含量的植物细胞
a)受到遗传修饰，其中与相应的非遗传修饰野生型植物细胞相比较，所述遗传修饰导致具备淀粉合酶II活性的蛋白质的活性提高；
b)从步骤a)的植物细胞再生出植物；
c)根据需要，借助步骤b)的植物产生进一步的植物，和
d)根据步骤b)或c)获得的植物与这样的植物杂交，其中所述植物与相应的非遗传修饰野生型植物细胞相比较显示具备葡聚糖/水双激酶I活性的蛋白质的活性提高。
本发明的又一个实施方案涉及产生本发明的经遗传修饰单子叶植物的方法，其中其淀粉具有小于5％重量的表观直链淀粉含量的植物细胞
a)受到遗传修饰，其中与相应的非遗传修饰野生型植物细胞相比较，所述遗传修饰导致具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质的活性提高；
b)从步骤a)的植物细胞再生出植物；
c)根据需要，借助步骤b)的植物产生进一步的植物，和
d)根据步骤b)或c)获得的植物的植物与这样的植物杂交，其中所述植物与相应的非遗传修饰野生型植物细胞相比较显示具备淀粉合酶II活性的蛋白质的活性提高。
本发明的又一个实施方案涉及产生本发明的经遗传修饰单子叶植物的方法，其中植物细胞受到遗传修饰，其中与相应的非遗传修饰野生型植物细胞相比较，
a)i)所述遗传修饰导致具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质的活性提高；
a)ii)实施导致具备淀粉合酶II活性的蛋白质的活性提高的又一种遗传修饰；
其中步骤a)i)和ii)可以按照想要的任意顺序实施，
b)从步骤a)i)和ii)的植物细胞再生出植物；
c)根据需要，借助步骤b)的植物产生进一步的植物，和
d)根据步骤a)至c)获得的植物与这样的植物杂交，其中与相应的非遗传修饰野生型植物细胞相比较，所述植物的淀粉因而具有小于5％重量的直链淀粉含量。
在上文所提的产生经遗传修饰植物的最后三种方法中，所述植物可以受到如上所述根据步骤a)的遗传修饰。根据步骤b)使植物再生和根据步骤c)和d)产生进一步的植物也已经在上文中详细描述。
根据头两个实施方案的步骤d)与从步骤b)或c)获得的植物或其子代杂交的植物可以是任意植物，其中与相应的野生型植物相比较，所述的任意植物显示具备淀粉合酶II活性的蛋白质的活性提高或具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质的活性提高。具备淀粉合酶II活性的蛋白质的活性提高或具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质的活性提高可以由导致相应植物中所讨论蛋白质的活性提高的任意修饰引起。这些植物可以采取突变体或已经由重组方法修饰的植物形式。所述突变体可以采取自发(天然)存在的突变体形式或采取已经通过定向使用诱变剂(如化学品、离子辐射)或重组方法(例如转座子激活标签法、T-DNA激活标签法、体内(in vivo)诱变法)产生的那些突变体形式。
在所提到的最后2个本发明方法中优选用于杂交的植物是这样的植物，它们具有具备淀粉合酶II活性的蛋白质的活性，其中与相应的非遗传修饰野生型植物相比较，所述活性提高到至少3倍、优选6倍、优选至少8倍并且特别优选至少10倍。
具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质的活性提高的此类所讨论植物在所提到的最后2个本发明方法中用于杂交并且优选地是合成下述淀粉的植物，其中所述淀粉具有至少2.5nmol C6P/mg淀粉的淀粉磷酸酯含量。
在一个优选的实施方案中，本发明方法用于产生经遗传修饰植物，其中所述的经遗传修饰植物用于产生本发明的植物或用于产生具有本发明植物特征的植物。
本发明也涉及通过本发明方法可获得的植物。
出人意料地，已经发现本发明的植物细胞和本发明的植物合成改性淀粉，其中所述植物细胞和植物的淀粉具有小于5％重量的表观直链淀粉含量和具备淀粉合酶II活性的蛋白质提高的活性和具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质提高的活性。由本发明植物细胞或本发明植物合成的淀粉具有提高的热水溶胀力的事实特别出人意料。可以从本发明植物细胞或本发明植物分离的淀粉的提高的热水溶胀力赋予本发明淀粉这样的特性，所述特性使本发明淀粉比常规淀粉更好地适合某些用途。如淀粉用作增稠剂，则所述淀粉提高的热水溶胀力意味着需要少得多的淀粉以实现同样的增稠力。
本发明的又一个主题涉及具有小于5％重量的表观直链淀粉含量和提高的热水溶胀力的改性淀粉。与分离自相应的非遗传修饰野生型植物细胞或分离自相应的非遗传修饰野生型植物的淀粉相比较，本发明改性淀粉的热水溶胀力优选地提高到至少1.5倍、特别优选地至少2倍、尤其优选地至少2.5倍并且非常特别优选地至少3倍。
用于确定热水溶胀力的方法是技术人员已知的并且在文献(例如Leach等，1959，Cereal Chemistry 36：534-544)中描述。在下文“一般方法”中进一步描述根据本发明优选地使用以确定热水溶胀力的方法。
本发明的又一个主题涉及从单子叶植物细胞或从单子叶植物分离的改性淀粉，所述改性淀粉具有5％重量的表观直链淀粉含量并且具有从至少60g/g、优选从60-100g/g、特别优选从70-95g/g、尤其优选从80-95g/g和特别优选从80-90g/g的热水溶胀力。
本发明的又一个主题涉及从稻植物细胞或稻植物分离的改性淀粉，所述改性淀粉具有5％重量的表观直链淀粉含量并且具有从至少60g/g、优选从60-100g/g、特别优选从70-95g/g、尤其优选从80-95g/g和特别优选从80-90g/g的热水溶胀力。
由本发明的经遗传修饰植物细胞或本发明的经遗传修饰植物合成的淀粉优选地具有淀粉C6位置处升高的磷酸酯含量。本文中，从本发明植物细胞和本发明植物分离的淀粉的淀粉磷酸酯含量明显比基于所讨论亲代植物的总淀粉磷酸酯含量在开展杂交后本应预期到的淀粉磷酸酯含量显著更高。
结合于葡萄糖分子C6位置处的淀粉磷酸酯的量可以通过技术人员已知的方法测定，例如按照由Kasemusuwan和Jane(1996，Cereal Chemistry73：702-707)描述的方法，通过偶联酶测定法或借助31P NMR以光度测定方式测定。在本发明的上下文中，结合于葡萄糖分子C6位置处的淀粉磷酸酯的量优选地如“一般方法”中所述测定。
本发明的又一个优选主题涉及本发明的改性淀粉，所述改性淀粉已经从单子叶植物细胞或从单子叶植物分离并且具有每mg淀粉至少1.5nmol、特别优选每mg淀粉至少2.5nmol的结合于淀粉的葡萄糖分子C6位置处的淀粉磷酸酯含量。本发明的这种改性淀粉特别优选地采取玉米淀粉、稻淀粉或小麦淀粉形式。
在本发明的又一个实施方案，本发明的改性淀粉采取天然淀粉形式。
在本发明的上下文中，术语“天然淀粉”意指通过本领域技术人员已知的方法从本发明植物、本发明的可收获植物部分、本发明的淀粉贮藏部分或本发明的植物繁殖材料分离的淀粉。
本发明也涉及这样的本发明改性淀粉，所述改性淀粉可从本发明植物细胞或本发明植物、从本发明的繁殖材料或从本发明的可收获植物部分获得，或可从已经使用产生经遗传修饰植物的本发明方法所产生的植物获得。
合成本发明改性淀粉的植物细胞或植物也是本发明的主题。
本发明还涉及产生改性淀粉的方法，包括从本发明植物细胞或本发明植物、从这种植物的本发明繁殖材料和/或从这种植物的本发明可收获植物部分，优选从这种植物的本发明淀粉贮藏部分提取淀粉的步骤。优选地，这种方法也包括在提取淀粉前收获已经生长的植物或植物部分和/或这些植物的繁殖材料的步骤，并且特别优选地还包括在收获前生长本发明植物的步骤。
用于从植物或从淀粉贮藏性植物部分提取淀粉的方法是技术人员已知的。此外，用于从多种淀粉贮藏性植物提取淀粉的方法已经描述，例如在《淀粉：化学和技术》(Starch：Chemistry and Technology)(编者：Whistler，BeMiller和Paschall(1994)，第二版，Academic Press Inc.LondonLtd；ISBN 0-12-746270-8；参见，例如第十二章第412-468页Watson所著《玉米淀粉和高粱淀粉：生产》(Mais and Sorghum Starches：Production)；第十三章第469-479页Corbishley和Mille所著《木薯、菊芋和西米淀粉：生产》(Tapioca，Arrowroot and Sago Starches：Production)；第十四章第479-490页Mitch所著《马铃薯淀粉：生产和用途》(Potato starch：Production and Uses)；第十五章第491至506页Knight和Oson所著《小麦淀粉：生产、改性和用途》(Wheat starch：Production，Modification and Uses)以及第十六章第507至528页Rohmer和Klem所著《稻淀粉：生产和用途》(Rice starch：Production and Uses)；Eckhoff等玉米淀粉(Maize starch)：Cereal Chem.73(1996)，54-57，玉米淀粉的工业规模提取一般通过所谓“湿磨法”完成)中描述。在用于从植物材料中提取淀粉的工艺中通常使用的装置是分离器、倾析器、水力旋流器、喷雾干燥器和流化床干燥器。
在本发明的上下文中，术语“淀粉贮藏部分”理解为意指植物的这些部分，在所述部分中与暂时性叶淀粉不同，淀粉作为储藏物质被贮藏，用于存活更长时间。优选的淀粉贮藏性植物部分例如是块茎、贮藏根和谷粒，特别优选包含胚乳的谷粒，尤其优选来自玉米、稻或小麦植物的包含胚乳的谷粒。
在一个优选的实施方案中，用于制备改性淀粉的本发明方法用来制备本发明的淀粉。
可通过制备改性淀粉的本发明方法获得的改性淀粉也是本发明的主题。
本发明的植物细胞或本发明植物用于制备改性淀粉的用途也是本发明的主题。
本领域技术人员知道淀粉的特性可以例如通过热、化学、酶或机械衍生作用改变。衍生淀粉特别适合在食品和/或非食品领域中的多种用途。本发明淀粉比常规淀粉更好地适合作为起始材料用于制造衍生淀粉，原因是它们例如因淀粉磷酸酯含量较高而包含较高比例的活性官能团。由于本发明淀粉的热水溶胀力提高，衍生过程还可以在较高的温度上进行，而淀粉粒结构没有受到明显程度的破坏。
本发明因此也涉及用于制备衍生淀粉的方法，其中本发明的改性淀粉随后进行衍生化。本发明还涉及通过已知方法之一制备的衍生淀粉。
在本发明的上下文中，术语“衍生淀粉(derivatized starch)”理解为意指在淀粉从植物细胞分离后已经借助化学方法、酶方法、热方法或机械方法改变了特性的本发明改性淀粉。
在本发明的另一个实施方案中，本发明的衍生淀粉是用热处理和/或酸处理的淀粉。
在又一个实施方案中，所述衍生淀粉采取以下形式：淀粉醚，尤其淀粉烷基醚、O-烯丙基醚、羟烷基醚、O-羧甲基醚、含氮的淀粉醚、含磷酸的淀粉醚或含硫的淀粉醚。
在又一个实施方案中，所述衍生淀粉采取交联淀粉的形式。
在又一个实施方案中，所述衍生淀粉采取淀粉接枝聚合物的形式。
在又一个实施方案中，所述衍生淀粉采取氧化淀粉的形式。
在又一个实施方案中，所述衍生淀粉采取淀粉酯的形式，尤其采取已经使用有机酸导入淀粉的淀粉酯形式。它们特别优选地采取称为磷酸酯淀粉、硝酸酯淀粉、硫酸酯淀粉、黄原酸酯淀粉、乙酸酯淀粉或柠檬酸酯淀粉的形式。
本发明的衍生淀粉适合制药工业、食品领域和/或非食品领域中的多种用途。制备本发明衍生淀粉的方法是技术人员已知的，并且广泛地在一般文献中描述。制备衍生淀粉的综述可以在Orthoefer(1987年Watson和Ramstad编辑的《Corn，Chemistry and Technology》第16章第479-499页)中找到。
通过用于制备衍生淀粉的本发明方法可获得的衍生淀粉是本发明的又一主题。
本发明改性淀粉用于制备衍生淀粉的用途是本发明的又一主题。
本发明也包括了包含本发明淀粉的产品。
本发明也包括了包含本发明淀粉的混合物。
淀粉贮藏性植物部分经常加工成面粉。从中制备面粉的植物部分的实例是例如马铃薯植物的块茎和谷类植物的谷粒。为从谷类植物制备面粉，将这些植物的含胚乳的谷粒研磨并过筛。淀粉是胚乳的主要组分。在不包含胚乳但包含其他淀粉贮藏部分(例如块茎或根)的其他植物中，经常通过粉碎、干燥并随后研磨所讨论的贮藏器官制备面粉。胚乳或存在于淀粉贮藏性植物部分中的淀粉占据从所讨论植物部分中制备的面粉的绝大部分。面粉的特性因而也受到所讨论面粉中存在的淀粉影响。与相应的非遗传修饰野生型植物细胞或非遗传修饰野生型植物相比较，本发明的植物细胞和本发明的植物合成改性淀粉。从本发明植物细胞、本发明植物、本发明的繁殖材料或本发明的可收获部分制备的面粉因而具有改变的特性。也可以通过将淀粉与面粉混合或通过混入特性不同的面粉来影响面粉的特性。
本发明的又一个主题因此涉及包含本发明淀粉的面粉。
本发明的又一个主题涉及可以从本发明植物细胞、本发明植物、本发明的淀粉贮藏性植物部分、从本发明繁殖材料或从本发明的可收获植物部分制备的面粉。用于制备面粉的本发明优选的淀粉贮藏性植物部分是块茎、贮藏根和包含胚乳的谷粒。在本发明上下文中，特别优选来自(系统命名法)禾本科植物的谷粒；尤其优选地，从玉米、稻或小麦植物获得谷粒。
在本发明的上下文中，术语“面粉”理解为意指可以通过研磨植物部分获得的粉末。根据需要，植物部分在研磨前进行干燥和过筛。
由于存在于本发明面粉中的本发明淀粉，本发明的面粉以如下事实为特征，即它们具有提高的热水溶胀力。这在例如食品工业中为多种用途而加工面粉，尤其在焙烤商品生产中是受欢迎的。
本发明的优选主题涉及从单子叶蜡质植物的谷粒中制备的面粉，其中所述面粉具有至少25g/g，优选25-50g/g，特别优选30-45g/g并且尤其优选35-45g/g的热水溶胀力。
在本上下文中，面粉的热水溶胀力测定以类似于上文所述测定淀粉的热水溶胀力的方法的方式进行，不同之处在于使用面粉替代淀粉。测定面粉的热水溶胀力的优选方法在“一般方法”中描述。
本发明的又一个主题是制备面粉的方法，包括步骤：研磨本发明的植物细胞、本发明的植物、本发明的植物部分、本发明的淀粉贮藏性植物部分、本发明的繁殖材料或本发明的可收获材料。
面粉可以通过研磨本发明的淀粉贮藏性植物部分产生。技术人员知道如何产生面粉。优选地，产生面粉的方法也包括在研磨前收获所生长的植物或植物部分和/或这些植物的繁殖材料和/或淀粉贮藏部分的步骤，并且特别优选地还包括在收获前生长本发明的植物。
包含本发明面粉的产品也是本发明的主题。
在本发明的又一个实施方案，用于产生面粉的方法包括在研磨前加工本发明的植物、本发明的淀粉贮藏性植物部分、本发明的繁殖材料或本发明的可收获材料。
在这个上下文中，加工可以是热处理和/或干燥步骤。在干燥热处理的材料后，热处理例如用于从贮藏根或块茎例如从马铃薯块茎产生面粉，随后进行研磨。研磨前，粉碎本发明的植物、本发明的淀粉贮藏性植物部分、本发明的繁殖材料或本发明的可收获材料也可以构成本发明意思范围内的加工。在研磨前除去植物组织(例如谷粒脱皮)也构成本发明意思范围内的加工。
在本发明的又一个实施方案中，用于制造面粉的方法包括研磨后加工研磨料(mill base)。在此上下文中，可以在研磨后筛分所述研磨料以制备多种类型的面粉。
本发明也包括包含本发明面粉的混合物。
本发明的又一个主题是本发明的经遗传修饰植物细胞、本发明的植物、本发明的植物部分、本发明的淀粉贮藏性植物部分、本发明的繁殖材料或本发明的可收获材料用于制造面粉的用途。
本专利申请中所引用的全部文件的公开内容旨在整合入本发明说明书的公开内容中。
序列描述
SEQ ID NO 1：编码具备来自马铃薯的葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质的核酸序列
SEQ ID NO 2：由SEQ ID NO 1编码的具备来自马铃薯的葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO 3：编码具备来自普通小麦的淀粉合酶II活性的蛋白质的核酸序列。
SEQ ID NO 4：由SEQ ID NO 3编码的具备来自普通小麦的淀粉合酶II活性的蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO 5：编码具备来自稻的淀粉合酶II活性的蛋白质的核酸序列。
SEQ ID NO 6：由SEQ ID NO 5编码的具备来自稻的淀粉合酶II活性的蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO 7：编码具备来自稻的GBSS I活性的蛋白质的核酸序列。
SEQ ID NO 8：由SEQ ID NO 7编码的具备来自稻的GBSS I活性的蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO 9：编码具备来自普通小麦的GBSS I活性的蛋白质的核酸序列。
SEQ ID NO 10：由SEQ ID NO 9编码的具备来自普通小麦的GBSS I活性的蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO 11：编码具备来自玉米的GBSS I活性的蛋白质的核酸序列。
SEQ ID NO 12：由SEQ ID NO 11编码的具备来自玉米的GBSS I活性的蛋白质的氨基酸序列。
一般方法
在下文将描述可以用于实施本发明方法/工艺的方法。这些方法是本发明的具体实施方案，然而本发明不限于这些方法。技术人员知道可以通过修改所述方法和/或通过用备选的方法部分替换所述方法的各个部分而以相同方式实施本发明。全部所引用出版物的内容通过引用的方式并入本申请的描述内容。
1.稻植物的转化和再生
稻植物通过Hiei等(1994，Plant Journal 6(2)，271-282)描述的方法进行转化。
温室中稻植物的方案涉及以下条件：播种：基质：1.6L玫瑰钵(制造商：H.Meyer，德国)中100％水藓泥炭与100L沙/m2及180kg/m2粘土的混合物，pH：5.4-6.2；绿肥：Hakaphos(Compo，德国)14％N-16％P-18％K+2％Mg；2kg/m2；
施肥：3.5g/每株植物，直至开花：NH4NO3(1.75g)和Flory 2基础混合物(制造商：Euflor，德国)：1.75g；3％N-16％P-15％K+5％Mg。
温度：白昼28℃/夜晚：24℃(16小时/8小时)；相对空气湿度：85-95％；
光照：16小时，350μEinstein/s x m2
2.用于转化的序列及构建体的来源
来自小麦的序列T.a.-SSIIa用于稻的转化。该序列如WO 97-45545中所述进行分离和克隆(以其当时名称“pTaSS1”)。所用转化载体AH32-191在实施例2中描述。
还使用来自马铃薯的葡聚糖/水双激酶的序列(R1St)。该序列如实施例5中所述进行分离和克隆。所用转化载体pML82在WO 05/095619中描述。
蜡质性状通过实施例1中描述的合适突变体导入。
3.通过RNA印迹法分析基因的表达水平
通过RNA印迹分析法研究编码蛋白质的核酸的表达。为此目的，收获通过转化所获得的每个单独植物的不成熟的3粒稻谷粒(开花后大约15日)并在液氮中冷冻。为均化该材料，在96孔微量滴定平板中用Retsch磨(型号MM300)使用4.5mm钢球以30赫兹频率粉碎冷冻的稻谷粒30秒。此后，通过Promega RNA提取试剂盒，按照制造商说明书(SV 96总RNA分离系统，订单号Z3505，Promega，Mannheim)分离RNA。各个样品中RNA的浓度通过测光方式测量260nm处的吸收确定。
对于每个样品，将2μg RNA调整至均一体积并且用相同体积的RNA样品缓冲液(65％(v/v)甲酰胺，8％甲醛，13％(v/v)凝胶缓冲液(见上文)，50μg/ml溴乙锭)处理。在加热(10分钟，65℃)并立即在冰上冷却后，该RNA使用1.2％(w/v)琼脂糖凝胶(20mM MOPS pH 8.0，5mM乙酸钠，1mMEDTA，6％(v/v)甲醛)，利用RNA运行缓冲液(20mM MOPS pH 8.0，5mM乙酸钠，1mM EDTA)以50-80mA的恒定电流分离大约2小时。
此后，将该RNA通过使用10×SSC(1.5M NaCl，150mM柠檬酸钠pH7.0)的扩散印迹法转移至Hybond N膜并且通过UV照射固定在该膜上。
用于检测核酸分子表达的RNA印迹物的杂交利用了在质粒AH32-191中包含cDNA 5′区域的约1kb SpeI/BspHI片段(第4568-5686bp)，其中所述的核酸分子编码来自小麦的具备淀粉合酶II活性的蛋白质。该DNA片段通过来自Roche的随机引发DNA标记试剂盒(订单号1004760)，使用32P-α-dCTP并按照制造商说明书进行放射标记。
包含转移的RNA的尼龙膜在60℃的水浴中与杂交缓冲液(250mM磷酸钠缓冲液pH 7.2，1mM EDTA，6％(w/v)SDS，1％(w/v)BSA)温育4小时，轻轻摇动，同时将放射标记的DNA添加至该杂交缓冲液。温育16小时后，除去杂交缓冲液，并将所述膜在60℃依次用3×SSC洗涤一次及用2×SSC(见上文)洗涤一次，同时柔和摇动，旨在除去非特异性结合的DNA分子。
为检测标记的RNA，此尼龙膜在-70℃于X射线胶片上放射自显影1至3日。
4.通过活性凝胶(酶谱)法确定具备淀粉合酶II活性的蛋白质的活性
通过活性凝胶(酶谱)法检测不成熟稻谷粒中具有淀粉合酶活性的蛋白质的活性，其中蛋白质提取物在天然条件下的聚丙烯酰胺凝胶中分离并且随后与适宜底物温育。凝胶中形成的反应产物(α-葡聚糖)使用鲁戈溶液(Lugol′s solution)染色。
将单个不成熟的稻谷粒(开花后约15日)在液氮中冷冻并在150-200μl的冷提取缓冲液(50mM Tris/HCl pH 7.6，2.5mM EDTA，2mM DTT，4mM PMSF，0.1％(w/v)糖原，10％(v/v)甘油)中均化。离心(15分钟，13000g，4℃)后，将清亮上清液转移至一只新的反应容器内，并且该提取物的等份试样用于通过Bradford法(1976，Anal Biochem 72：248-254)确定蛋白质含量。
所述蛋白质提取物通过7.5％强度连续聚丙烯酰胺凝胶(7.5％丙烯酰胺∶双丙烯酰胺37.5∶1；25mM Tris/HClpH 7.6，192mM甘氨酸，0.1％(w/v)APS，0.05％(v/v)TEMED)，使用单一浓度的运行缓冲液(25mMTris/HCl，192mM甘氨酸)进行分离。对于每个样品，在每种情况下使用与15μg蛋白质相应的量，并且在4℃进行电泳2-2.5小时。
此后，凝胶在室温于15ml温育缓冲液(0.5mM柠檬酸钠pH 7.0，25mM乙酸钾，2mM EDTA，2mM DTT，0.1％(w/v)支链淀粉，50mM三(羟甲基)甲基甘氨酸/NaOH pH 8.5，1mM ADP-葡萄糖)中温育过夜，持续摇动。形成的淀粉借助鲁戈溶液染色。
为确定与相应的非遗传修饰野生型植物相比较，具备淀粉合酶II活性的蛋白质的活性提高多少倍，来自经遗传修饰品系的蛋白质提取物在每种情况下作连续稀释并且根据上文所述的方法通过电泳分离。其余步骤如上文已描述那样实施。在酶谱已经用鲁戈溶液染色后，对于来自经遗传修饰植物的蛋白质提取物的不同稀释度，目视比较由具备淀粉合酶II活性的蛋白质产生的有色产物的强度(由图1中箭头确定)与非稀释的野生型蛋白质提取物的相关产物。因为产物的颜色强度与具备淀粉合酶II活性的蛋白质的活性直接相关，故具有相同强度的产物条带具有相同的活性。若稀释的蛋白质提取物中具备淀粉合酶II活性的蛋白质的产物条带与来自野生型植物的相应的非稀释蛋白质提取物的对应产物条带具有相同的强度，则稀释倍数与相应的经遗传修饰植物中活性提高的程度相对应(关于比较，参见图1)。
5.从分离的稻胚产生植物(胚拯救)
从穗中取出种子并除去外壳。将胚乳用手术刀片从胚中切下并且用于合适的分析法。为改善湿润度，该胚用70％乙醇短暂处理并且随后在包含2％NaOCl和一滴市售洗涤液溶液中温育20分钟以使胚消毒。
此后，尽可能地除去消毒液，并且将胚用无菌去离子水洗涤一次1分钟，以及洗涤两次，每次10分钟。将种子铺在培养皿内的琼脂固化培养基上，所述的琼脂固化培养基在每种情况下包含MS培养基(Murashige-Skoog培养基)的四分之一盐浓度和4％蔗糖。此后，培养皿用石蜡膜密封并在23℃于黑暗中温育。在萌发后(所述胚铺种后约5-7日)，将培养皿转移至光照下。当籽苗的下胚轴长度达到约2cm时，将植物转移至包含了具有2％蔗糖的琼脂固化MS培养基的罐内。在足够的根已经发育后，植物可以盆栽于混合肥料中。
6.稻谷粒的加工以及稻粉的制备
为准备足够量的试验材料，将稻植物在温室中培育并且在充分成熟时收获。成熟的稻谷粒在37℃贮藏3-7日以使其进一步干燥。
此后，所述谷粒通过去皮机(Laboratory Paddy sheller，Grainman，迈阿密，弗罗里达州，美国)与外壳分离，并且获得的糙米通过精碾1分钟(Pearlest Rice Polisher，Kett，Villa Park，CA，USA)进行加工以产生白米。对于谷粒组成研究和淀粉特性研究，将白色谷粒借助实验磨(Cyclotec，Sample mill，Foss，Denmark)研磨以产生所称的稻粉。
7.从稻粉中提取稻淀粉
通过与Wang和Wang(2004；Journal of Cereal Science 39：291-296)所述方法相似的方法从稻粉中提取稻淀粉。
约10g稻粉在室温于摇床上与40ml 0.05％(w/v)NaOH温育16-18小时。此后，将悬液转移至Waring搅拌机以完成消化，并且在低速度上混合15秒并随后在高速度上混合45秒。为除去粗成分(例如细胞壁)，将悬液依次倾入经过具有125μm和63μm筛目大小的筛子。1500转/分钟离心15分钟(Microfuge 3.OR；Heraeus)后，倾析出上清液，并且使用刮铲除去沉积物顶部的蛋白质层。沉积物的剩余部分重悬于0.05％(w/v)NaOH中，并且重复上文所述过程。此后，将沉积物重悬于水中并使用HCl调节悬液的pH至6.5至7。获得的稻淀粉用水共洗涤三次，其中每个洗涤步骤包括沉淀(在室温于1500转/分钟离心15分钟)、弃去上清液并且将沉积物重悬于新鲜水中。在最后的洗涤步骤前，再次检查pH，并根据需要用HCl调节至pH 7。将最后洗涤步骤的沉积物重悬于丙酮中，沉淀并且弃去上清液。在沉积物再次重悬于丙酮后，将悬液倾入培养皿并且在通风橱内于室温干燥至少18小时。
在最后步骤中，将所得稻淀粉通过在研钵(pestel and mortar)中粉碎产生细粉末，并且这种粉末可以直接用于其他研究。
8.热水溶胀力(SP)的确定
将100mg样品(淀粉或面粉)悬浮在10ml水中并且随后在92.5℃溶胀20分钟。样品在92.5℃温育期间，通过小心地360°转动样品容器而反复混合悬液(在头2分钟内连续地混合，随后在第3、4、5、10、15和25分钟混合)。在92.5℃温育总计30分钟后，悬液在冰水中冷却约1分钟，随后在25℃温育5分钟。离心(室温，1000×g，15分钟)后，将获得的上清液从凝胶样沉积物小心地移去，并且测定沉积物重量。使用以下公式计算热水溶胀力：
SP＝(凝胶样沉积物的重量)/(称重样品(面粉或淀粉)的重量)
9.葡萄糖分子中C6位置的淀粉磷酸酯含量的确定
淀粉中，葡萄糖单位的位置C2、C3和C6可以被磷酸化。为确定淀粉或面粉的C6-P含量(Nielsen等，1994，Plant Physiol.105：111-117的改良方法)，50mg稻粉或稻淀粉在95℃于500μl 0.7M HCl中水解4小时，同时持续摇动。此后，该混合物在15500×g离心10分钟，并且借助滤膜(0.45μM)滤除上清液的悬浮物质和云雾状物质。20μl清亮的水解产物与180μl咪唑缓冲液(300mM咪唑，pH 7.4；7.5mM MgCl2，1mM EDTA和0.4mM NADP)混合，并且样品在340nm处于光度计中测量。在记录基础吸收后，通过添加2单位葡萄糖6-磷酸脱氢酶(来自肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)，Boehringer Mannheim)启动酶反应。所测量的变化(OD)是基于等摩尔地转换葡萄糖6-磷酸和NADP以产生6-磷酸葡糖酸和NADPH，其中在上文提及的波长处记录NADPH的形成。监测该反应直至已经达到终点。这种测量的结果可以用于计算水解产物中的葡萄糖6-磷酸含量：
Figure A20088000277600601
随后确定水解程度，旨在避免因(面粉或淀粉)称重材料中淀粉的不完全水解所致的错误结果。为此目的，从已测量其葡萄糖6-磷酸含量的相应水解产物中取出10μl水解产物，以10μl的0.7M NaOH中和并用水稀释至2ml终体积(稀释度1∶200)。4μl这种稀释物以196μl测量缓冲液(100mM咪唑pH 6.9；5mM MgCl2，1mM ATP，0.4mM NADP)处理并用于葡萄糖含量的光度测定。确定在340nm处的基础吸收后，通过添加2μl酶混合物(测量缓冲液中的己糖激酶1∶10；来自酵母的葡萄糖6-磷酸脱氢酶1∶10)在光度计(340nm)中监测该反应直至达到终点。测量原理与第一反应的测量原理对应。使用获得的数据，可以计算所讨论样品的葡萄糖量：
各个样品中检测到的葡萄糖的量对应于可用于C6-磷酸测定的淀粉的量。为简化后续计算，将葡萄糖含量转换成淀粉含量。
Figure A20088000277600612
在下文中，测量葡萄糖6-磷酸的结果与所讨论样品的淀粉含量以如下方式相关，所述方式表述为每毫克水解淀粉的葡萄糖6-磷酸含量：
Figure A20088000277600613
与葡萄糖6-磷酸的量和称重的样品(面粉或淀粉)的重量相关这一点不同的是，这种类型的计算仅将葡萄糖6-磷酸的量与已经被彻底水解以产生葡萄糖的淀粉的量相关。
10.表观直链淀粉含量的确定
通过与Juliano(1971，Cereal Science Today 16(10)：334-340)类似的方法实施表观直链淀粉含量的确定。
对于每个样品，重复两次在100ml锥形瓶称取50mg稻粉，并且使稻粉依次用1ml 95％浓度乙醇和9ml 1M NaOH湿润。
平行地，含有定义量的来自马铃薯的纯直链淀粉的烧瓶按照与针对面粉样品相同的方式处理，旨在建立标准曲线。将烧瓶短暂旋转以混合内容物并且随后在沸水浴中温育20分钟，同时温和振荡。在室温冷却5-10分钟后，用水补足体积至100ml。
100μl等分试样用1ml测量溶液(10mM乙酸，0.004％(w/v)I2；0.04％(w/v)KI)处理，彻底混合，并且在620nm处针对合适的空白测定吸收。借助用于建立标准曲线的直链淀粉标准品实施直链淀粉含量的确定。
11.定量PCR
从各粒不成熟的稻种子(开花后10-12日)制备RNA。已经在液氮中冷冻的所述种子使用4mm钢球(Retsch磨，30Hz，45秒)均化后，使用Promega的“SV 96总RNA分离系统”，按照第294号方案(Promega)制备RNA。在每种情况下，将RNA用10μl“RQ1无RNA酶的DNA酶”(Promega)按照制造商说明书处理。
在每种情况下，将相等量的来自一株植物的四粒种子的RNA合并。
定量RT-PCR用Promega“Access RT-PCR系统”的试剂实施。
RT-PCR的反应条件是：55℃，30分钟；94℃，2分钟；40次×(94℃，15秒；60℃，1分钟)。在每种情况下，使用ABI Prism 7700仪(AppliedBiosystems)记录合并的退火/延伸阶段期间的荧光信号。
本方法中使用的对照在每种情况下是无逆转录酶的混合物。
相对表达如M.W.Pfaffl(2001，用于实时RT-PCR中相对定量的新算术模型(A new mathematical model for relative quantification in real-timeRT-PCR)，Nucleic Acids Research 29，No 900)所述进行计算。
实施例
1.蜡质(GBSSI敲除)突变体的产生和选择
蜡质突变体源于农杆菌介导的稻转化。对子代的分析表明：稻谷粒的蜡质表型独立于随所述转化导入的草铵膦抗性而遗传。GBSSI(蜡质)基因的序列分析表明：蜡质表型基因的表现可以归因于两个核苷酸的交换，其结果是产生提前终止的终止密码子，从而产生截短且可能无活性的蛋白质。稻谷粒中存在的淀粉的表观直链淀粉含量的RFLP分析证实小于5％重量的值，这意味着所鉴定的突变体是“蜡质”突变体。因此，术语“蜡质表型”理解为意指其淀粉具有小于5％的表观直链淀粉含量的蜡质突变体。
对上文提及的突变为纯合的品系738-104和738-106用于与转基因方法联合。
                    BamHI
M202           GAG TGG GAT CCT AGC
蜡质_突变体    GAG TGA AAT CCT AGC
                     终止
2.制备植物表达载体pAH32-191，该植物表达载体包含具备淀粉合酶II活性的蛋白质的编码序列
通过限制性核酸内切酶Ecl136II和Xho I从质粒pCF31(其在WO97/45545中以名称pTaSS1描述)中切下来自小麦的具备淀粉合酶II活性的蛋白质的完整编码序列(T.a.-SSII)，并且克隆入已经用限制性核酸内切酶EcoRV和Xho I切割的质粒pIR103-123(其在WO 05/030941中描述)。获得的表达载体命名为pAH32-191。植物表达载体pIR103-123用于使得靶基因在源自稻的胚乳特异性球蛋白启动子(Nakase等(1996)Gene 170(2)：223-226)控制下发生胚乳特异性表达。此外，植物表达载体pIR103-123包含在CaMV 35S启动子控制下的bar基因，其中所述bar基因用作植物转化的选择标记。
3.稻植物的产生，所述的稻植物具有具备淀粉合酶II活性的蛋白质提高的活性
通过包含质粒pAH32-191的农杆菌，使用由Hiei等(1994，PlantJournal 6(2)，271-282)描述的方法转化稻植物(品种M202)。所得植物命名为oe-SSII-O.s.-X，其中X意指从所述转化中获得的独立植物。
4.已用表达载体pAH32-191转化的稻植物的分析
在温室中的土壤培育名为oe-SSII-O.s.-X并源自用表达载体pAH32-191所转化品系的稻植物(T0植物)。将RNA从多种品系的不成熟谷粒(T1种子)分离，并且使用SSII特异性探针，根据“一般方法”中描述的方法实施RNA印迹分析。鉴定到与相应的非遗传修饰野生型植物相比较，具有小麦淀粉合酶II的转录物的量增加的多个品系(见通过举例方式在图2中显示的图形)。
此外，通过酶谱确定了不成熟T1种子的蛋白质提取物中具备淀粉合酶II活性的蛋白质提高的活性，其中所述的不成熟T1种子来自上文所提及转化的不同品系(见通过举例方式在图1和图2中显示的图形)。所述分析通过如“一般方法”中所述的酶谱实施。
基于所描述分析的结果，选择以下品系用于与其他方法组合：
oe-SSII-O.s-01502
在多种分析的基础上，可以显示这个品系对载体pAH32-191的T-DNA整合是纯合的。
5.稻植物的产生，所述的稻植物具有具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质提高的活性
通过包含质粒pML82(在WO 05/095619中描述)的农杆菌，使用由Hiei等(1994，Plant Journal 6(2)，271-282)描述的方法转化稻植物(品种M202)。所得植物命名为oe-GWD-O.s.-X，其中X意指从所述转化中获得的独立植物。
6.已用表达载体pML82转化的稻植物的分析
在温室中的土壤培育名为oe-GWD-O.s.-X并且源于用表达载体pML82所转化品系的稻植物(T0植物)。将来自不同品系的各成熟谷粒(T1种子)制成面粉。为此目的，将各谷粒在Eppendorf反应容器内的球磨(来自Retsch，型号MM300)中使用碳化钨球以30赫兹频率粉碎30秒。随后如“一般方法”中所述确定存在于该面粉中的淀粉的葡萄糖分子C6位置处的淀粉磷酸酯含量。
对所选植物获得以下结果：
  品系   nmol C6P/mg称重材料
  oe-GWD-O.s.-2   1.68
  oe-GWD-O.s.-4   1.70
  oe-GWD-O.s.-9   1.47
  WT   0.30
表1：与品种M202的相应非遗传修饰野生型植物(WT)的种子相比较，来自名为oe-GWD-O.s.-X的不同品系的各T1种子的葡萄糖分子C6位置的淀粉磷酸酯含量。
从表1可以看出，可以鉴定到这样的独立品系，其是用植物表达载体pML82转化的结果并且与相应的非遗传修饰野生型植物相比较，在葡萄糖分子C6位置具有提高的淀粉磷酸酯含量。已知与相应的非遗传修饰野生型植物相比较，具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质表达提高的植物细胞合成了淀粉磷酸酯含量更高的淀粉(见，例如WO 02/34923)。
基于上文所述分析，选择以下品系用于与其他方法组合：
oe-GWD-O.s.-2
oe-GWD-O.s.-4
oe-GWD-O.s.-9
在多种分析的基础上，可以证实这些品系对载体pML82的T-DNA整合是纯合的。
7.产生具有蜡质表型和具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质的活性提高的植物
实施以下杂交：
  谱系杂交   雌性亲本名称   雌性亲本质粒   雄性亲本名称   雄性亲本质粒
  XPOS0001   M202蜡质   ---   oe-GWD-O.s.   pML82
  -01   738-106   ---   oe-GWD-O.s-2   pML82
  -02   738-104   ---   oe-GWD-O.s-2   pML82
  -03   738-104   ---   oe-GWD-O.s-4   pML82
  -04   738-106   ---   oe-GWD-O.s-4   pML82
  -05   738-104   ---   oe-GWD-O.s-9   pML82
  -06   738-106   ---   oe-GWD-O.s-9   pML82
表2：738-104/4(M202蜡质)与oe GWD O.s组合的杂交。
研究了作为杂交结果的F1种子的胚乳中葡萄糖分子C6位置的淀粉磷酸酯含量(C6P)。通过组织培养技术使与雌性亲本相比淀粉磷酸酯含量(C6P)明显提高的那些谷粒的胚萌发。在已经达到足够尺度后，将相关植物转移至温室以产生F2种子。
通过目视评分从成熟的F2种子中选出具有蜡质表型的谷粒并且置于温室中。在萌发后，对植物喷洒(Bayer CropScience)，并且从
Figure A20088000277600662
-耐受植物获取叶样品。使用针对bar基因的侵入物技术(invadertechnology)(http://www.twt.com/invader_chemistry/invaderchem.htm；Ledford等(2000，J.of Mol.Diagnostics 2(2)：97-104；Mein等，2000，Genome Res.10：330-343)，通过拷贝数测定法鉴定对于载体pML82的TDNA整合为纯合的植物。如此选出的植物在温室中生长以产生F3种子。
分别研究潜在双重纯合的植物的一些成熟F3种子的淀粉磷酸酯(C6P)含量。保留其中全部谷粒具有所预期的高淀粉磷酸酯(C6P)含量的那些植物。
汇集亲本组合的全部双重纯合植物的种子并用于进一步繁殖和用于分析谷粒和面粉特性。
对于与品系oe-SSII-O.s的组合而言，选择对于蜡质突变和对于载体pML82的T-DNA均为纯合的事件XPOS0001-05。
8.植物的产生，所述的植物具有蜡质表型并且具有具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质提高的活性及具备淀粉合酶II活性的蛋白质提高的活性
实施以下杂交：
谱系杂交 雌性亲本   雌性亲本的质粒 雄性亲本   雄性亲本的质粒
  XPOS0025-01   oe-SSII-O.s.-01502   pAH31-191   XPOS0001-05   pML82
  XPOS0026-01   XPOS0001-05   pML82   oe-SSII-O.s.-01502   pAH32-191
表3：oe-SSII-O.s.与XPOS0001-05组合的杂交
通过测量F1胚乳的淀粉磷酸酯含量而鉴定杂交中的成功事件，原因在于该组合的淀粉磷酸酯含量明显高于亲本品系。
9.对植物的分析，所述的植物具有蜡质表型并且具有具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质提高的活性及具备淀粉合酶II活性的蛋白质提高的活性。
通过组织培养技术使F1种子的胚萌发，其中所述F1种子的胚乳具有大于5nmol C6P/mg淀粉的淀粉磷酸酯含量并且因此明显高于两个亲本的淀粉磷酸酯含量(对于oe-GWD-O.s.是2.5nmol/mg淀粉，并且对于oe SSIIO.s.是至少0.8nmol/mg淀粉)，并且所讨论的植物一旦达到合适尺度，则转移至温室以产生F2种子。
为鉴定对两种转基因以及对蜡质突变均为纯合的子代，对于已经就“蜡质表型”进行过目视预选择的F2种子重复上文所述过程，包括胚拯救。
10.F2植物的选择和分析
基于淀粉磷酸酯测量结果，选择F2种子(C6P＞8nmol/mg淀粉)，使其胚萌发并且在温室中生长所讨论的F2植物。
从F2植物的叶材料提取基因组DNA，并且通过定量PCR测定所述两种转基因的拷贝数及bar基因的拷贝数(对于这两种转基因的总值)。
使用RFLP(Bam HI)在所述蜡质突变体的GBSSI基因(定义和/或方法)中证明蜡质突变为纯合的。
在温室中生长对两种转基因为潜在纯合并且对蜡质RFLP为纯合的F2植物并且用于产生F3种子。
11.F3植物的选择/F3种子的分析
为鉴定三重纯合品系，以目视方式检验适宜选择的植物的一些单个谷粒的蜡质表型并且随后研究它们的淀粉磷酸酯含量。若全部谷粒具有蜡质表型，并且若发现一株植物的全部谷粒具有大致同样的高淀粉磷酸酯含量，则可以推定该植物对蜡质突变且对pML82及pAH32-191的T-DNA是纯合的。
12.F4材料的产生
在上文提及的分析中发现以下品系是三重纯合的：
XPOS002501-1-37
XPOS002501-1-13
XPOS002601-1-19
来自这些品系的植物在温室中生长，并且收获并干燥产生的F4种子，并且随后汇集为用于全部后代的一个品系。
13.F4材料中成分的功能性和分析
a)谷粒组成
表观直链淀粉含量：
样品名称  稻粉的表观直链淀粉含量(％直链淀粉/FW)   稻淀粉的表观直链淀粉含量(％直链淀粉/FW)
  野生型   8.9   11.8
  oe-GWD-O.s.-4   10.6   14.4
  oe-GWD-O.s.-9   10.6   14.3
  oe-SSII-O.s.-01502   6.6   9.2
  738-104/6   2.3   2.2
  XPOS025-01-1-37   3.7   3.5
  XPOS025-01-1-13   3.7   3.7
  XPOS026-01-1-19   3.9   4.1
表4：单基因方法和三重组合的稻粉和稻淀粉中的表观直链淀粉含量
显示出组合XPOS0025/6具有高于蜡质突变体(738-104/6)的淀粉酶含量。
淀粉磷酸酯含量(C6P含量)
样品名称   稻粉中存在的淀粉C6位置的淀粉磷酸酯含量(nmolC6P/mg淀粉)   稻淀粉的C6位置淀粉磷酸酯含量(nmol C6P/mg淀粉)
  野生型   0.46   0.37
  Oe-GWD-O.s.-4   2.85   2.65
  Oe-GWD-O.s.-9   3.27   2.56
  Oe-SSII-O.s.-01502 1.22 0.91
  738-104/6   0.52   0.38
  XPOS02501-1-37   11.45   9.50
  XPOS02501-1-13   11.20   10.24
  XPOS02601-1-19   11.06   10.23
表5：对于单基因方法和对于三重组合的稻粉或淀粉的C6位置的淀粉磷酸酯含量
三重组合的C6位置的淀粉磷酸酯含量明显地高于单基因方法的C6位置的淀粉磷酸酯含量。
b)稻粉和稻淀粉的功能性
热水溶胀力
样品名称   稻粉的热水溶胀力(g/g)   稻淀粉的热水溶胀力(g/g)
  野生型   15.7   31.9
  oe-GWD-O.s.-4   21.6   38.6
  oe-GWD-O.s.-9   21.3   39.9
  oe-SSII-O.s.-01502   20.2   40.8
  738-104/6   19.9   47.3
  XPOS025-01-1-37   40.6   86.0
  XPOS025-01-1-13   41.9   89.1
  XPOS026-01-1-19   38.3   87.2
表6：单基因方法和三重组合的稻粉或稻淀粉的热水溶胀力
如“一般方法”中所述完成面粉或淀粉的热水溶胀力测定，其中所述的面粉或淀粉从上文提及的品系的F4种子和从野生型植物制备。
三重组合的热水溶胀力明显高于单基因方法的热水溶胀力。
附图简述
图1显示用于确定与野生型相比较，具备淀粉合酶II活性的蛋白质的活性的酶谱。所用材料是来自野生型植物(WT)和三株独立的经遗传修饰植物的不成熟谷粒(开花后15日)的总蛋白提取物，其中所述的经遗传修饰植物是用表达载体AH32-191(oe-SSII-O.s.-5、oe-SSII-O.s.-12、oe-SSII-O.s.-19)转化的结果。在泳道WT和pur中，在每种情况下应用相同量的来自各提取物的蛋白质。将经遗传修饰植物的蛋白质提取物进行连续稀释(1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶20、1∶50或1∶100)，并且将这些稀释物通过电泳分开，并且还彼此相互分开。与野生型植物相比的淀粉合酶II活性提高可以通过比较来自野生型植物的蛋白质提取物的特定产物的强度与来自经遗传修饰植物的蛋白质提取物的相应条带的强度进行确定，其中所述的特定产物存在于经鲁戈溶液染色后的酶谱中并且已经由(箭头标记的)具备淀粉合酶II活性的蛋白质合成。相同强度意指相同活性。
图2显示与非遗传修饰的野生型植物(WT)相比较，稻品系oe-SSII-O.s.-19、oe-SSII-O.s.-20、oe-SSII-O.s.-21、oe-SSII-O.s.-22、oe-SSII-O.s.-23的不成熟T1种子的RNA印迹分析的放射自显影图。为此目的，在每种情况下，RNA提取自独立地源自用表达载体AH32-191转化的品系的三颗种子并且根据一般方法第8项中所述的方法进行分析。与标记的核酸探针杂交的条带鉴定为SSII，其中所述的核酸探针编码来自小麦的具备淀粉合酶II活性的蛋白质。
图3显示用鲁戈溶液染色后，与非遗传修饰野生型植物(WT)的种子相比较，稻品系oe-SSII-O.s.-8，oe-SSII-O.s.-19，oe-SSII-O.s.-23的不成熟T1种子的蛋白质提取物的酶谱。每个品系分析来自两颗(oe-SSII-O.s.-8)或三颗(oe-SSII-O.s.-19、oe-SSII-O.s.-23)不同谷粒的蛋白质提取物。按照在一般方法第9项中所述的方法进行借助酶谱的分析。酶谱中对具备淀粉合酶II活性的蛋白质为特异的条带鉴定为SSII。
序列表
<110>拜尔作物科学股份公司
<120>合成具有提高的溶胀力的低直链淀粉的经遗传修饰植物
<130>BCS 07-5002 PCT
<150>EP 07090009.7
<151>2007-0126
<150>US 60/898,427
151>2007-01-30
<160>12
<170>Patent In版本3.3
<210>1
<211>4851
<212>DNA
<213>马铃薯(Solanum tuberosum)
<220>
<221>transit_peptide
<222>(1).(77)
<220>
<221>CDS
<222>(105)..(4499)
<300>
<308>EMBL/Y09533
<309>1998-0730
<313>(1)..(4499)
<400>1
catcttcatc gaatttctcg aagcttcttc gctaatttcc tggtttcttc actcaaaatc     60
gacgtttcta gctgaacttg agtgaattaa gccagtggga ggat atg agt aat tcc      116
                                                 Met Ser Asn Ser
                                                 1
tta ggg aat aac ttg ctg tac cag gga ttc cta acc tca aca gtg ttg       164
Leu Gly Asn Asn Leu Leu Tyr Gln Gly Phe Leu Thr Ser Thr Val Leu
5                   10                  15                  20
gaa cat aaa agt aga atc agt cct cct tgt gtt gga ggc aat tct ttg       212
Glu His Lys Ser Arg Ile Ser Pro Pro Cys Val Gly Gly Asn Ser Leu
                25                  30                  35
ttt caa caa caa gtg atc tcg aaa tca cct tta tca act gag ttt cga      260
Phe Gln Gln Gln Val Ile Ser Lys Ser Pro Leu Ser Thr Glu Phe Arg
            40                  45                  50
ggt aac agg tta aag gtg cag aaa aag aaa ata cct atg gaa aag aag      308
Gly Asn Arg Leu Lys Val Gln Lys Lys Lys Ile Pro Met Glu Lys Lys
        55                  60                  65
cgt gct ttt tct agt tct cct cat gct gta ctt acc act gat acc tct      356
Arg Ala Phe Ser Ser Ser Pro His Ala Val Leu Thr Thr Asp Thr Ser
    70                  75                  80
tct gag cta gca gaa aag ttc agt cta ggg ggg aat att gag cta cag      404
Ser Glu Leu Ala Glu Lys Phe Ser Leu Gly Gly Asn Ile Glu Leu Gln
85                  90                  95                  100
gtt gat gtt agg cct ccc act tca ggt gat gtg tcc ttt gtg gat ttt      452
Val Asp Val Arg Pro Pro Thr Ser Gly Asp Val Ser Phe Val Asp Phe
                105                 110                 115
caa gta aca aat ggt agt gat aaa ctg ttt ttg cac tgg ggg gca gta      500
Gln Val Thr Asn Gly Ser Asp Lys Leu Phe Leu His Trp Gly Ala Val
            120                 125                 130
aaa ttc ggg aaa gaa aca tgg tct ctt ccg aat gat cgt cca gat ggg      548
Lys Phe Gly Lys Glu Thr Trp Ser Leu Pro Asn Asp Arg Pro Asp Gly
        135                 140                 145
acc aaa gtg tac aag aac aaa gca ctt aga act cca ttt gtt aaa tct      596
Thr Lys Val Tyr Lys Asn Lys Ala Leu Arg Thr Pro Phe Val Lys Ser
    150                 155                 160
ggc tct aac tcc atc ctg aga ctg gag ata cga gac act gct atc gaa      644
Gly Ser Asn Ser Ile Leu Arg Leu Glu Ile Arg Asp Thr Ala Ile Glu
165                 170                 175                 180
gct att gag ttt ctc ata tac gat gaa gcc cac gat aaa tgg ata aag      692
Ala Ile Glu Phe Leu Ile Tyr Asp Glu Ala His Asp Lys Trp Ile Lys
                185                 190                 195
aat aat ggt ggt aat ttt cgt gtc aaa ttg tca aga aaa gag ata cga      740
Asn Asn Gly Gly Asn Phe Arg Val Lys Leu Ser Arg Lys Glu Ile Arg
            200                 205                 210
ggc cca gat gtt tct gtt cct gag gag ctt gta cag atc caa tca tat      788
Gly Pro Asp Val Ser Val Pro Glu Glu Leu Val Gln Ile Gln Ser Tyr
        215                 220                 225
ttg agg tgg gag agg aag gga aaa cag aat tac ccc cct gag aaa gag      836
Leu Arg Trp Glu Arg Lys Gly Lys Gln Asn Tyr Pro Pro Glu Lys Glu
    230                 235                 240
aag gag gaa tat gag gct gct cga act gtg cta cag gag gaa ata gct      884
Lys Glu Glu Tyr Glu Ala Ala Arg Thr Val Leu Gln Glu Glu Ile Ala
245                 250                 255                 260
cgt ggt gct tcc ata cag gac att cga gca agg cta aca aaa act aat      932
Arg Gly Ala Ser Ile Gln Asp Ile Arg Ala Arg Leu Thr Lys Thr Asn
                265                 270                 275
gat aaa agt caa agc aaa gaa gag cct ctt cat gta aca aag agt gat      980
Asp Lys Ser Gln Ser Lys Glu Glu Pro Leu His Val Thr Lys Ser Asp
            280                 285                 290
ata cct gat gac ctt gcc caa gca caa gct tac att agg tgg gag aaa     1028
Ile Pro Asp Asp Leu Ala Gln Ala Gln Ala Tyr Ile Arg Trp Glu Lys
        295                 300                 305
gca gga aag ccg aac tat cct cca gaa aag caa att gaa gaa ctc gaa      1076
Ala Gly Lys Pro Asn Tyr Pro Pro Glu Lys Gln Ile Glu Glu Leu Glu
    310                 315                 320
gaa gca aga aga gaa ttg caa ctt gag ctt gag aaa ggc att acc ctt      1124
Glu Ala Arg Arg Glu Leu Gln Leu Glu Leu Glu Lys Gly Ile Thr Leu
325                 330                 335                 340
gat gag ttg cgg aaa acg att aca aaa ggg gag ata aaa act aag gtg      1172
Asp Glu Leu Arg Lys Thr Ile Thr Lys Gly Glu Ile Lys Thr Lys Val
                345                 350                 355
gaa aag cac ctg aaa aga agt tct ttt gcc gtt gaa aga atc caa aga      1220
Glu Lys His Leu Lys Arg Ser Ser Phe Ala Val Glu Arg Ile Gln Arg
            360                 365                 370
aag aag aga gac ttt ggg cat ctt att aat aag tat act tcc agt cct      1268
Lys Lys Arg Asp Phe Gly His Leu Ile Asn Lys Tyr Thr Ser Ser Pro
        375                 380                 385
gca gta caa gta caa aag gtc ttg gaa gaa cca cca gcc tta tct aaa      1316
Ala Val Gln Val Gln Lys Val Leu Glu Glu Pro Pro Ala Leu Ser Lys
    390                 395                 400
att aag ctg tat gcc aag gag aag gag gag cag att gat gat ccg atc      1364
Ile Lys Leu Tyr Ala Lys Glu Lys Glu Glu Gln Ile Asp Asp Pro Ile
405                 410                 415                 420
cta aat aaa aag atc ttt aag gtc gat gat ggg gag cta ctg gta ctg      1412
Leu Asn Lys Lys Ile Phe Lys Val Asp Asp Gly Glu Leu Leu Val Leu
                425                 430                 435
gta gca aag tcc tct ggg aag aca aaa gta cat cta gct aca gat ctg     1460
Val Ala Lys Ser Ser Gly Lys Thr Lys Val His Leu Ala Thr Asp Leu
            440                 445                 450
aat cag cca att act ctt cac tgg gca tta tcc aaa agt cct gga gag     1508
Asn Gln Pro Ile Thr Leu His Trp Ala Leu Ser Lys Ser Pro Gly Glu
        455                 460                 465
tgg atg gta cca cct tca agc ata ttg cct cct ggg tca att att tta     1556
Trp Met Val Pro Pro Ser Ser Ile Leu Pro Pro Gly Ser Ile Ile Leu
    470                 475                 480
gac aag gct gcc gaa aca cct ttt tca gcc agt tct tct gat ggt cta     1604
Asp Lys Ala Ala Glu Thr Pro Phe Ser Ala Ser Ser Ser Asp Gly Leu
485                 490                 495                 500
act tct aag gta caa tct ttg gat ata gta att gaa gat ggc aat ttt     1652
Thr Ser Lys Val Gln Ser Leu Asp Ile Val Ile Glu Asp Gly Asn Phe
                505                 510                 515
gtg ggg atg cca ttt gtt ctt ttg tct ggt gaa aaa tgg att aag aac     1700
Val Gly Met Pro Phe Val Leu Leu Ser Gly Glu Lys Trp Ile Lys Asn
            520                 525                 530
caa ggg tcg gat ttc tat gtt ggc ttc agt gct gca tcc aaa tta gca     1748
Gln Gly Ser Asp Phe Tyr Val Gly Phe Ser Ala Ala Ser Lys Leu Ala
        535                 540                 545
ctc aag gct gct ggg gat ggc agt gga act gca aag tct tta ctg gat     1796
Leu Lys Ala Ala Gly Asp Gly Ser Gly Thr Ala Lys Ser Leu Leu Asp
    550                 555                 560
aaa ata gca gat atg gaa agt gag gct cag aag tca ttt atg cac cgg     1844
Lys Ile Ala Asp Met Glu Ser Glu Ala Gln Lys Ser Phe Met His Arg
565                 570                 575                 580
ttt aat att gca gct gac ttg ata gaa gat gcc act agt gct ggt gaa     1892
Phe Asn Ile Ala Ala Asp Leu Ile Glu Asp Ala Thr Ser Ala Gly Glu
                585                 590                 595
ctt ggt ttt gct gga att ctt gta tgg atg agg ttc atg gct aca agg     1940
Leu Gly Phe Ala Gly Ile Leu Val Trp Met Arg Phe Met Ala Thr Arg
            600                 605                 610
caa ctg ata tgg aac aaa aac tat aac gta aaa cca cgt gaa ata agc     1988
Gln Leu Ile Trp Asn Lys Asn Tyr Asn Val Lys Pro Arg Glu Ile Ser
        615                 620                 625
aag gct cag gac aga ctt aca gac ttg ttg cag aat gct ttc acc agt     2036
Lys Ala Gln Asp Arg Leu Thr Asp Leu Leu Gln Asn Ala Phe Thr Ser
    630                 635                 640
cac cct cag tac cgt gaa att ttg cgg atg att atg tca act gtt gga     2084
His Pro Gln Tyr Arg Glu Ile Leu Arg Met Ile Met Ser Thr Val Gly
645                 650                 655                 660
cgt gga ggt gaa ggg gat gta gga cag cga att agg gat gaa att ttg     2132
Arg Gly Gly Glu Gly Asp Val Gly Gln Arg Ile Arg Asp Glu Ile Leu
                665                 670                 675
gtc atc cag agg aac aat gac tgc aag ggt ggt atg atg caa gaa tgg     2180
Val Ile Gln Arg Asn Asn Asp Cys Lys Gly Gly Met Met Gln Glu Trp
            680                 685                 690
cat cag aaa ttg cat aat aat act agt cct gat gat gtt gtg atc tgt     2228
His Gln Lys Leu His Asn Asn Thr Ser Pro Asp Asp Val Val Ile Cys
        695                 700                 705
cag gca tta att gac tac atc aag agt gat ttt gat ctt ggt gtt tat     2276
Gln Ala Leu lle Asp Tyr Ile Lys Ser Asp Phe Asp Leu Gly Val Tyr
    710                 715                 720
tgg aaa acc ctg aat gag aac gga ata aca aaa gag cgt ctt ttg agt     2324
Trp Lys Thr Leu Asn Glu Asn Gly Ile Thr Lys Glu Arg Leu Leu Ser
725                 730                 735                 740
tat gac cgt gct atc cat tct gaa cca aat ttt aga gga gat caa aag     2372
Tyr Asp Arg Ala Ile His Ser Glu Pro Asn Phe Arg Gly Asp Gln Lys
                745                 750                 755
ggt ggt ctt ttg cgt gat tta ggt cac tat atg aga aca ttg aag gca     2420
Gly Gly Leu Leu Arg Asp Leu Gly His Tyr Met Arg Thr Leu Lys Ala
            760                 765                 770
gtt cat tca ggt gca gat ctt gag tct gct att gca aac tgc atg ggc     2468
Val His Ser Gly Ala Asp Leu Glu Ser Ala Ile Ala Asn Cys Met Gly
        775                 780                 785
tac aaa act gag gga gaa ggc ttt atg gtt gga gtc cag ata aat cct     2516
Tyr Lys Thr Glu Gly Glu Gly Phe Met Val Gly Val Gln Ile Asn Pro
    790                 795                 800
gta tca ggc ttg cca tct ggc ttt cag gac ctc ctc cat ttt gtc tta     2564
Val Ser Gly Leu Pro Ser Gly Phe Gln Asp Leu Leu His Phe Val Leu
805                 810                 815                 820
gac cat gtg gaa gat aaa aat gtg gaa act ctt ctt gag aga ttg cta     2612
Asp His Val Glu Asp Lys Asn Val Glu Thr Leu Leu Glu Arg Leu Leu
                825                 830                 835
gag gct cgt gag gag ctt agg ccc ttg ctt ctc aaa cca aac aac cgt     2660
Glu Ala Arg Glu Glu Leu Arg Pro Leu Leu Leu Lys Pro Asn Asn Arg
            840                 845                 850
cta aag gat ctg ctg ttt ttg gac ata gca ctt gat tct aca gtt aga     2708
Leu Lys Asp Leu Leu Phe Leu Asp Ile Ala Leu Asp Ser Thr Val Arg
        855                 860                 865
aca gca gta gaa agg gga tat gaa gaa ttg aac aac gct aat cct gag     2756
Thr Ala Val Glu Arg Gly Tyr Glu Glu Leu Asn Asn Ala Asn Pro Glu
    870                 875                 880
aaa atc atg tac ttc atc tcc ctc gtt ctt gaa aat ctc gca ctc tct     2804
Lys Ile Met Tyr Phe Ile Ser Leu Val Leu Glu Asn Leu Ala Leu Ser
885                 890                 895                 900
gtg gac gat aat gaa gat ctt gtt tat tgc ttg aag gga tgg aat caa     2852
Val Asp Asp Asn Glu Asp Leu Val Tyr Cys Leu Lys Gly Trp Asn Gln
                905                 910                 915
gct ctt tca atg tcc aat ggt ggg gac aac cat tgg gct tta ttt gca     2900
Ala Leu Ser Met Ser Asn Gly Gly Asp Asn His Trp Ala Leu Phe Ala
            920                 925                 930
aaa gct gtg ctt gac aga acc cgt ctt gca ctt gca agc aag gca gag     2948
Lys Ala Val Leu Asp Arg Thr Arg Leu Ala Leu Ala Ser Lys Ala Glu
        935                 940                 945
tgg tac cat cac tta ttg cag cca tct gcc gaa tat cta gga tca ata     2996
Trp Tyr His His Leu Leu Gln Pro Ser Ala Glu Tyr Leu Gly Ser Ile
    950                 955                 960
ctt ggg gtg gac caa tgg gct ttg aac ata ttt act gaa gaa att ata     3044
Leu Gly Val Asp Gln Trp Ala Leu Asn Ile Phe Thr Glu Glu Ile Ile
965                 970                 975                 980
cgt gct gga tca gca gct tca tta tcc tct ctt ctt aat aga ctc gat     3092
Arg Ala Gly Ser Ala Ala Ser Leu Ser Ser Leu Leu Asn Arg Leu Asp
                985                 990                 995
ccc gtg ctt cgg  aaa act gca aat cta  gga agt tgg cag att  atc      3137
Pro Val Leu Arg  Lys Thr Ala Asn Leu  Gly Ser Trp Gln Ile  Ile
            1000                 1005                 1010
agt cca gtt gaa  gcc gtt gga tat gtt  gtc gtt gtg gat gag  ttg      3182
Ser Pro Val Glu  Ala Val Gly Tyr Val  Val Val Val Asp Glu  Leu
            1015                 1020                 1025
ctt tca gtt cag  aat gaa atc tac gag  aag ccc acg atc tta  gta       3227
Leu Ser Val Gln  Asn Glu Ile Tyr Glu  Lys Pro Thr Ile Leu  Val
            1030                 1035                 1040
gca aaa tct gtt  aaa gga gag gag gaa  att cct gat ggt gct  gtt       3272
Ala Lys Ser Val  Lys Gly Glu Glu Glu  Ile Pro Asp Gly Ala  Val
            1045                 1050                 1055
gcc ctg ata aca  cca gac atg cca gat  gtt ctt tca cat gtt  tct       3317
Ala Leu Ile Thr  Pro Asp Met Pro Asp  Val Leu Ser His Val  Ser
            1060                 1065                 1070
gtt cga gct aga  aat ggg aag gtt tgc  ttt gct aca tgc ttt  gat       3362
Val Arg Ala Arg  Asn Gly Lys Val Cys  Phe Ala Thr Cys Phe  Asp
            1075                 1080                 1085
ccc aat ata ttg  gct gac ctc caa gca  aag gaa gga agg att  ttg       3407
Pro Asn Ile Leu  Ala Asp Leu Gln Ala  Lys Glu Gly Arg Ile  Leu
            1090                 1095                 1100
ctc tta aag cct  aca cct tca gac ata  atc tat agt gag gtg  aat       3452
Leu Leu Lys Pro  Thr Pro Ser Asp Ile  Ile Tyr Ser Glu Val  Asn
            1105                 1110                 1115
gag att gag ctc  caa agt tca agt aac  ttg gta gaa gct gaa  act       3497
Glu Ile Glu Leu  Gln Ser Ser Ser Asn  Leu Val Glu Ala Glu  Thr
            1120                 1125                 1130
tca gca aca ctt  aga ttg gtg aaa aag  caa ttt ggt ggt tgt  tac       3542
Ser Ala Thr Leu  Arg Leu Val Lys Lys  Gln Phe Gly Gly Cys  Tyr
            1135                 1140                 1145
gca ata tca gca  gat gaa ttc aca agt  gaa atg gtt gga gct  aaa       3587
Ala Ile Ser Ala  Asp Glu Phe Thr Ser  Glu Met Val Gly Ala  Lys
            1150                 1155                 1160
tca cgt aat att  gca tat ctg aaa gga  aaa gtg cct tcc tcg  gtg       3632
Ser Arg Asn Ile  Ala Tyr Leu Lys Gly  Lys Val Pro Ser Ser  Val
            1165                 1170                 1175
gga att cct acg  tca gta gct ctt cca  ttt gga gtc ttt gag  aaa       3677
Gly Ile Pro Thr  Ser Val Ala Leu Pro  Phe Gly Val Phe Glu  Lys
            1180                 1185                 1190
gta ctt tca gac  gac ata aat cag gga  gtg gca aaa gag ttg  caa       3722
Val Leu Ser Asp  Asp Ile Asn Gln Gly  Val Ala Lys Glu Leu  Gln
            1195                 1200                 1205
att ctg atg aaa  aaa cta tct gaa gga  gac ttc agc gct ctt  ggt       3767
Lle Leu Met Lys  Lys Leu Ser Glu Gly  Asp Phe Ser Ala Leu  Gly
            1210                 1215                 1220
gaa att cgc aca  acg gtt tta gat ctt  tca gca cca gct caa  ttg       3812
Glu Ile Arg Thr  Thr Val Leu Asp Leu  Ser Ala Pro Ala Gln  Leu
            1225                 1230                 1235
gtc aaa gag ctg  aag gag aag atg cag  ggt tct ggc atg cct  tgg       3857
Val Lys Glu Leu  Lys Glu Lys Met Gln  Gly Ser Gly Met Pro  Trp
            1240                 1245                 1250
cct ggt gat gaa  ggt cca aag cgg tgg  gaa caa gca tgg atg  gcc       3902
Pro Gly Asp Glu  Gly Pro Lys Arg Trp  Glu Gln Ala Trp Met  Ala
            1255                 1260                 1265
ata aaa aag gtg  tgg gct tca aaa tgg  aat gag aga gca tac  ttc       3947
Ile Lys Lys Val  Trp Ala Ser Lys Trp  Asn Glu Arg Ala Tyr  Phe
            1270                 1275                 1280
agc aca agg aag  gtg aaa ctg gat cat  gac tat ctg tgc atg  gct       3992
Ser Thr Arg Lys  Val Lys Leu Asp His  Asp Tyr Leu Cys Met  Ala
            1285                 1290                 1295
gtc ctt gtt caa  gaa ata ata aat gct  gat tat gca ttt gtc  att       4037
Val Leu Val Gln  Glu Ile Ile Asn Ala  Asp Tyr Ala Phe Val  Ile
            1300                 1305                 1310
cac aca acc aac  cca tct tcc gga gac  gac tca gaa ata tat  gcc       4082
His Thr Thr Asn  Pro Ser Ser Gly Asp  Asp Ser Glu Ile Tyr  Ala
            1315                 1320                 1325
gag gtg gtc agg  ggc ctt ggg gaa aca  ctt gtt gga gct tat  cca       4127
Glu Val Val Arg  Gly Leu Gly Glu Thr  Leu Val Gly Ala Tyr  Pro
            1330                 1335                 1340
gga cgt gct ttg  agt ttt atc tgc aag  aaa aag gat ctc aac  tct       4172
Gly Arg Ala Leu  Ser Phe Ile Cys Lys  Lys Lys Asp Leu Asn  Ser
            1345                 1350                 1355
cct caa gtg tta  ggt tac cca agc aaa  ccg atc ggc ctt ttc  ata       4217
Pro Gln Val Leu  Gly Tyr Pro Ser Lys  Pro Ile Gly Leu Phe  Ile
            1360                 1365                 1370
aaa aga tct atc  atc ttc cga tct gat  tcc aat ggg gaa gat  ttg       4262
Lys Arg Ser Ile  Ile Phe Arg Ser Asp  Ser Asn Gly Glu Asp  Leu
            1375                 1380                 1385
gaa ggt tat gcc  ggt gct ggc ctc tac  gac agt gta cca atg  gat       4307
Glu Gly Tyr Ala  Gly Ala Gly Leu Tyr  Asp Ser Val Pro Met  Asp
            1390                 1395                 1400
gag gag gaa aaa  gtt gta att gat tac  tct tcc gac cca ttg  ata      4352
Glu Glu Glu Lys  Val Val Ile Asp Tyr  Ser Ser Asp Pro Leu  Ile
            1405                 1410                 1415
act gat ggt aac  ttc cgc cag aca atc  ctg tcc aac att gct  cgt      4397
Thr Asp Gly Asn  Phe Arg Gln Thr Ile  Leu Ser Asn Ile Ala  Arg
            1420                 1425                 1430
gct gga cat gct  atc gag gag cta tat  ggc tct cct caa gac  att      4442
Ala Gly His Ala  Ile Glu Glu Leu Tyr  Gly Ser Pro Gln Asp  Ile
            1435                 1440                 1445
gag ggt gta gtg  agg gat gga aag att  tat gtc gtt cag aca  aga      4487
Glu Gly Val Val  Arg Asp Gly Lys Ile  Tyr Val Val Gln Thr  Arg
            1450                 1455                 1460
cca cag atg tga ttatattctc gttgtatgtt gttcagagaa gaccacagat         4539
Pro Gln Met
gtgatcatat tctcattgta tcagatctgt gaccacttac ctgatacctc ccatgaagtt   4599
acctgtatga ttatacgtga tccaaagcca tcacatcatg ttcaccttca gctattggag   4659
gagaagtgag aagtaggaat tgcaatatga ggaataataa gaaaaacttt gtaaaagcta   4719
aattagctgg gtatgatata gggagaaatg tgtaaacatt gtactatata tagtatatac   4779
acacgcatta tgtattgcat tatgcactga ataatatcgc agcatcaaag aagaaatcct   4839
ttgggtggtt tc                                                       4851
<210>2
<211>1464
<212>PRT
<213>马铃薯
<400>2
Met Ser Asn Ser Leu Gly Asn Asn Leu Leu Tyr Gln Gly Phe Leu Thr
1               5                   10                  15
Ser Thr Val Leu Glu His Lys Ser Arg Ile Ser Pro Pro Cys Val Gly
            20                  25                  30
Gly Asn Ser Leu Phe Gln Gln Gln Val Ile Ser Lys Ser Pro Leu Ser
        35                  40                  45
Thr Glu Phe Arg Gly Asn Arg Leu Lys Val Gln Lys Lys Lys Ile Pro
    50                  55                  60
Met Glu Lys Lys Arg Ala Phe Ser Ser Ser Pro His Ala Val Leu Thr
65                  70                  75                  80
Thr Asp Thr Ser Ser Glu Leu Ala Glu Lys Phe Ser Leu Gly Gly Asn
                85                  90                  95
Ile Glu Leu Gln Val Asp Val Arg Pro Pro Thr Ser Gly Asp Val Ser
            100                 105                 110
Phe Val Asp Phe Gln Val Thr Asn Gly Ser Asp Lys Leu Phe Leu His
        115                 120                 125
Trp Gly Ala Val Lys Phe Gly Lys Glu Thr Trp Ser Leu Pro Asn Asp
    130                 135                 140
Arg Pro Asp Gly Thr Lys Val Tyr Lys Asn Lys Ala Leu Arg Thr Pro
145                 150                 155                 160
Phe Val Lys Ser Gly Ser Asn Ser Ile Leu Arg Leu Glu Ile Arg Asp
                165                 170                 175
Thr Ala Ile Glu Ala Ile Glu Phe Leu Ile Tyr Asp Glu Ala His Asp
            180                 185                 190
Lys Trp Ile Lys Asn Asn Gly Gly Asn Phe Arg Val Lys Leu Ser Arg
        195                 200                 205
Lys Glu Ile Arg Gly Pro Asp Val Ser Val Pro Glu Glu Leu Val Gln
    210                 215                 220
Ile Gln Ser Tyr Leu Arg Trp Glu Arg Lys Gly Lys Gln Asn Tyr Pro
225                 230                 235                 240
Pro Glu Lys Glu Lys Glu Glu Tyr Glu Ala Ala Arg Thr Val Leu Gln
                245                 250                 255
Glu Glu Ile Ala Arg Gly Ala Ser Ile Gln Asp Ile Arg Ala Arg Leu
            260                 265                 270
Thr Lys Thr Asn Asp Lys Ser Gln Ser Lys Glu Glu Pro Leu His Val
         275                 280                 285
Thr Lys Ser Asp Ile Pro Asp Asp Leu Ala Gln Ala Gln Ala Tyr Ile
    290                 295                 300
Arg Trp Glu Lys Ala Gly Lys Pro Asn Tyr Pro Pro Glu Lys Gln Ile
305                 310                 315                 320
Glu Glu Leu Glu Glu Ala Arg Arg Glu Leu Gln Leu Glu Leu Glu Lys
                325                 330                 335
Gly Ile Thr Leu Asp Glu Leu Arg Lys Thr Ile Thr Lys Gly Glu Ile
            340                 345                 350
Lys Thr Lys Val Glu Lys His Leu Lys Arg Ser Ser Phe Ala Val Glu
        355                 360                 365
Arg Ile Gln Arg Lys Lys Arg Asp Phe Gly His Leu Ile Asn Lys Tyr
    370                 375                 380
Thr Ser Ser Pro Ala Val Gln Val Gln Lys Val Leu Glu Glu Pro Pro
385                 390                 395                 400
Ala Leu Ser Lys Ile Lys Leu Tyr Ala Lys Glu Lys Glu Glu Gln Ile
                405                 410                 415
Asp Asp Pro Ile Leu Asn Lys Lys Ile Phe Lys Val Asp Asp Gly Glu
            420                 425                 430
Leu Leu Val Leu Val Ala Lys Ser Ser Gly Lys Thr Lys Val His Leu
        435                 440                 445
Ala Thr Asp Leu Asn Gln Pro Ile Thr Leu His Trp Ala Leu Ser Lys
    450                 455                 460
Ser Pro Gly Glu Trp Met Val Pro Pro Ser Ser Ile Leu Pro Pro Gly
465                 470                 475                 480
Ser Ile Ile Leu Asp Lys Ala Ala Glu Thr Pro Phe Ser Ala Ser Ser
                485                 490                 495
Ser Asp Gly Leu Thr Ser Lys Val Gln Ser Leu Asp Ile Val Ile Glu
            500                 505                 510
Asp Gly Asn Phe Val Gly Met Pro Phe Val Leu Leu Ser Gly Glu Lys
        515                 520                 525
Trp Ile Lys Asn Gln Gly Ser Asp Phe Tyr Val Gly Phe Ser Ala Ala
    530                 535                 540
Ser Lys Leu Ala Leu Lys Ala Ala Gly Asp Gly Ser Gly Thr Ala Lys
545                 550                 555                 560
Ser Leu Leu Asp Lys Ile Ala Asp Met Glu Ser Glu Ala Gln Lys Ser
                565                 570                 575
Phe Met His Arg Phe Asn Ile Ala Ala Asp Leu Ile Glu Asp Ala Thr
            580                 585                 590
Ser Ala Gly Glu Leu Gly Phe Ala Gly Ile Leu Val Trp Met Arg Phe
        595                 600                 605
Met Ala Thr Arg Gln Leu Ile Trp Asn Lys Asn Tyr Asn Val Lys Pro
    610                 615                 620
Arg Glu Ile Ser Lys Ala Gln Asp Arg Leu Thr Asp Leu Leu Gln Asn
625                 630                 635                 640
Ala Phe Thr Ser His Pro Gln Tyr Arg Glu Ile Leu Arg Met Ile Met
                645                 650                 655
Ser Thr Val Gly Arg Gly Gly Glu Gly Asp Val Gly Gln Arg Ile Arg
            660                 665                 670
Asp Glu Ile Leu Val Ile Gln Arg Asn Asn Asp Cys Lys Gly Gly Met
        675                 680                 685
Met Gln Glu Trp His Gln Lys Leu His Asn Asn Thr Ser Pro Asp Asp
    690                 695                 700
Val Val Ile Cys Gln Ala Leu Ile Asp Tyr Ile Lys Ser Asp Phe Asp
705                 710                 715                 720
Leu Gly Val Tyr Trp Lys Thr Leu Asn Glu Asn Gly Ile Thr Lys Glu
                725                 730                 735
Arg Leu Leu Ser Tyr Asp Arg Ala Ile His Ser Glu Pro Asn Phe Arg
            740                 745                 750
Gly Asp Gln Lys Gly Gly Leu Leu Arg Asp Leu Gly His Tyr Met Arg
        755                 760                 765
Thr Leu Lys Ala Val His Ser Gly Ala Asp Leu Glu Ser Ala Ile Ala
    770                 775                 780
Asn Cys Met Gly Tyr Lys Thr Glu Gly Glu Gly Phe Met Val Gly Val
785                 790                 795                 800
Gln Ile Asn Pro Val Ser Gly Leu Pro Ser Gly Phe Gln Asp Leu Leu
                805                 810                 815
His Phe Val Leu Asp His Val Glu Asp Lys Asn Val Glu Thr Leu Leu
            820                 825                 830
Glu Arg Leu Leu Glu Ala Arg Glu Glu Leu Arg Pro Leu Leu Leu Lys
        835                 840                 845
Pro Asn Asn Arg Leu Lys Asp Leu Leu Phe Leu Asp Ile Ala Leu Asp
    850                 855                 860
Ser Thr Val Arg Thr Ala Val Glu Arg Gly Tyr Glu Glu Leu Asn Asn
865                 870                 875                 880
Ala Asn Pro Glu Lys Ile Met Tyr Phe Ile Ser Leu Val Leu Glu Asr
                885                 890                 895
Leu Ala Leu Ser Val Asp Asp Asn Glu Asp Leu Val Tyr Cys Leu Lys
            900                 905                 910
Gly Trp Asn Gln Ala Leu Ser Met Ser Asn Gly Gly Asp Asn His Trp
        915                 920                 925
Ala Leu Phe Ala Lys Ala Val Leu Asp Arg Thr Arg Leu Ala Leu Ala
    930                 935                 940
Ser Lys Ala Glu Trp Tyr His His Leu Leu Gln Pro Ser Ala Glu Tyr
945                 950                 955                 960
Leu Gly Ser Ile Leu Gly Val Asp Gln Trp Ala Leu Asn Ile Phe Thr
                965                 970                 975
Glu Glu Ile Ile Arg Ala Gly Ser Ala Ala Ser Leu Ser Ser Leu Leu
            980                 985                 990
Asn Arg Leu Asp Pro Val Leu Arg  Lys Thr Ala Asn Leu  Gly Ser Trp
        995                 1000                 1005
Gln Ile  Ile Ser Pro Val Glu  Ala Val Gly Tyr Val  Val Val Val
    1010                 1015                 1020
Asp Glu  Leu Leu Ser Val Gln  Asn Glu Ile Tyr Glu  Lys Pro Thr
    1025                 1030                 1035
Ile Leu  Val Ala Lys Ser Val  Lys Gly Glu Glu Glu  Ile Pro Asp
    1040                 1045                 1050
Gly Ala  Val Ala Leu Ile Thr  Pro Asp Met Pro Asp  Val Leu Ser
    1055                 1060                 1065
His Val  Ser Val Arg Ala Arg  Asn Gly Lys Val Cys  Phe Ala Thr
    1070                 1075                 1080
Gys Phe  Asp Pro Asn Ile Leu  Ala Asp Leu Gln Ala  Lys Glu Gly
    1085                 1090                 1095
Arg Ile  Leu Leu Leu Lys Pro  Thr Pro Ser Asp Ile  Ile Tyr Ser
    1100                 1105                 1110
Glu Val  Asn Glu Ile Glu Leu  Gln Ser Ser Ser Asn  Leu Val Glu
    1115                 1120                 1125
Ala Glu  Thr Ser Ala Thr Leu  Arg Leu Val Lys Lys  Gln Phe Gly
    1130                 1135                 1140
Gly Cys  Tyr Ala Ile Ser Ala  Asp Glu Phe Thr Ser  Glu Met Val
    1145                 1150                 1155
Gly Ala  Lys Ser Arg Asn Ile  Ala Tyr Leu Lys Gly  Lys Val Pro
    1160                 1165                 1170
Ser Ser  Val Gly Ile Pro Thr  Ser Val Ala Leu Pro  Phe Gly Val
    1175                 1180                 1185
Phe Glu  Lys Val Leu Ser Asp  Asp Ile Asn Gln Gly  Val Ala Lys
    1190                 1195                 1200
Glu Leu  Gln Ile Leu Met Lys  Lys Leu Ser Glu Gly  Asp Phe Ser
    1205                 1210                 1215
Ala Leu  Gly Glu Ile Arg Thr  Thr Val Leu Asp Leu  Ser Ala Pro
    1220                 1225                 1230
Ala Gln  Leu Val Lys Glu Leu  Lys Glu Lys Met Gln  Gly Ser Gly
    1235                 1240                 1245
Met Pro  Trp Pro Gly Asp Glu  Gly Pro Lys Arg Trp  Glu Gln Ala
    1250                 1255                 1260
Trp Met  Ala Ile Lys Lys Val  Trp Ala Ser Lys Trp  Asn Glu Arg
    12651                 270                 1275
Ala Tyr  Phe Ser Thr Arg Lys  Val Lys Leu Asp His  Asp Tyr Leu
    1280                 1285                 1290
Cys Met  Ala Val Leu Val Gln  Glu Ile Ile Asn Ala  Asp Tyr Ala
    1295                 1300                 1305
Phe Val  Ile His Thr Thr Asn  Pro Ser Ser Gly Asp  Asp Ser Glu
    1310                 1315                 1320
Ile Tyr  Ala Glu Val Val Arg  Gly Leu Gly Glu Thr  Leu Val Gly
    1325                 1330                 1335
Ala Tyr  Pro Gly Arg Ala Leu  Ser Phe Ile Cys Lys  Lys Lys Asp
    1340                 1345                 1350
Leu Asn  Ser Pro Gln Val Leu  Gly Tyr Pro Ser Lys  Pro Ile Gly
    1355                 1360                 1365
Leu Phe  Ile Lys Arg Ser Ile  Ile Phe Arg Ser Asp  Ser Asn Gly
    1370                 1375                 1380
Glu Asp  Leu Glu Gly Tyr Ala  Gly Ala Gly Leu Tyr  Asp Ser Val
    1385                 1390                 1395
Pro Met  Asp Glu Glu Glu Lys  Val Val Ile Asp Tyr  Ser Ser Asp
    1400                 1405                 1410
Pro Leu  Ile Thr Asp Gly Asn  Phe Arg Gln Thr Ile  Leu Ser Asn
    1415                 1420                 1425
Ile Ala  Arg Ala Gly His Ala  Ile Glu Glu Leu Tyr  Gly Ser Pro
    1430                 1435                 1440
Gln Asp  Ile Glu Gly Val Val  Arg Asp Gly Lys Ile  Tyr Val Val
    1445                 1450                 1455
Gln Thr  Arg Pro Gln Met
    1460
<210>3
<211>3000
<212DNA
<213>普通小麦(Triticum aestivum)
<220>
<221>CDS
<222>(227)..(2623)
<400>3
ctccaccgcg gtggcggccg ctctagaact agtggatccc ccgggctgca ggaattcggc     60
acgagcttcg gcctgacccc gttcgtttac ccccacacag agcacactcc agtccagtcc    120
agcccactgc caccgcgcta ctctccactc ccactgccac cacctccgcc tgcgccgcgc    180
tctgggcgga ccaacccgcg aaccgtacca tctcccgccc cgatcc atg tcg tcg       235
                                                   Met Ser Ser
                                                   1
gcg gtc gcg tcc gcc gca tcc ttc ctc gcg ctc gcg tca gcc tcc ccc       283
Ala Val Ala Ser Ala Ala Ser Phe Leu Ala Leu Ala Ser Ala Ser Pro
    5                   10                  15
ggg aga tca cgc agg egg gcg agg gtg agc gcg cag cca ccc cac gcc       331
Gly Arg Ser Arg Arg Arg Ala Arg Val Ser Ala Gln Pro Pro His Ala
20                  25                  30                  35
ggg gcc ggc agg ttg cac tgg ccg ccg tgg ccg ccg cag cgc acg gct       379
Gly Ala Gly Arg Leu His Trp Pro Pro Trp Pro Pro Gln Arg Thr Ala
                40                  45                  50
cgc gac gga gct gtg gcg gcg ctc gcc gcc ggg aag aag gac gcg ggg       427
Arg Asp Gly Ala Val Ala Ala Leu Ala Ala Gly Lys Lys Asp Ala Gly
            55                  60                  65
atc gac gac gcc gcc gcg tcc gtg agg cag ccc cgc gca ctc cgc ggt      475
Ile Asp Asp Ala Ala Ala Ser Val Arg Gln Pro Arg Ala Leu Arg Gly
        70                  75                  80
ggc gcc gcc acc aag gtc gcg gag cga agg gat ccc gtc aag acg ctc      523
Gly Ala Ala Thr Lys Val Ala Glu Arg Arg Asp Pro Val Lys Thr Leu
    85                  90                  95
gac cgc gac gcc gcg gaa ggc ggc ggg ccg tcc ccg ccg gca gcg agg      571
Asp Arg Asp Ala Ala Glu Gly Gly Gly Pro Ser Pro Pro Ala Ala Arg
100                 105                 110                 115
cag gac gcc gcc cgt ccg ccg agt atg aac ggc atg ccg gtg aac ggc      619
Gln Asp Ala Ala Arg Pro Pro Ser Met Asn Gly Met Pro Val Asn Gly
                120                 125                 130
gag aac aaa tct acc ggc ggc ggc ggc gcg act aaa gac agc ggg ctg      667
Glu Asn Lys Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ala Thr Lys Asp Ser Gly Leu
            135                 140                 145
ccc acg ccc gca cgc gcg ccc cat ccg tcg acc cag aac aga gca ccg      715
Pro Thr Pro Ala Arg Ala Pro His Pro Ser Thr Gln Asn Arg Ala Pro
        150                 155                 160
gtg aac ggt gaa aac aaa gct aac gtc gcc tcg ccg ccg acg agc ata      763
Val Asn Gly Glu Asn Lys Ala Asn Val Ala Ser Pro Pro Thr Ser Ile
    165                 170                 175
gcc gag gcc gcg gct tcg gat tcc gca gct acc att tcc atc agc gac      811
Ala Glu Ala Ala Ala Ser Asp Ser Ala Ala Thr Ile Ser Ile Ser Asp
180                 185                 190                 195
aag gcg ccg gag tcc gtt gtc cca gct gag aag acg ccg ccg tcg tcc      859
Lys Ala Pro Glu Ser Val Val Pro Ala Glu Lys Thr Pro Pro Ser Ser
                200                 205                 210
ggc tca aat ttc gag tcc tcg gcc tct gct ccc ggg tct gac act gtc      907
Gly Ser Asn Phe Glu Ser Ser Ala Ser Ala Pro Gly Ser Asp Thr Val
            215                 220                 225
agc gac gtg gaa caa gaa ctg aag aag ggt gcg gtc gtt gtc gaa gaa      955
Ser Asp Val Glu Gln Glu Leu Lys Lys Gly Ala Val Val Val Glu Glu
        230                 235                 240
gct cca aag cca aag gct ctt tcg ccg cct gca gcc ccc gct gta caa     1003
Ala Pro Lys Pro Lys Ala Leu Ser Pro Pro Ala Ala Pro Ala Val Gln
    245                 250                 255
gaa gac ctt tgg gat ttc aag aaa tac att ggt ttc gag gag ccc gtg     1051
Glu Asp Leu Trp Asp Phe Lys Lys Tyr Ile Gly Phe Glu Glu Pro Val
260                 265                 270                 275
gag gcc aag gat gat ggc cgg gct gtc gca gat gat gcg ggc tcc ttt     1099
Glu Ala Lys Asp Asp Gly Arg Ala Val Ala Asp Asp Ala Gly Ser Phe
                280                 285                 290
gaa cac cac cag aat cac gac tcc gga cct ttg gca ggg gag aat gtc     1147
Glu His His Gln Asn His Asp Ser Gly Pro Leu Ala Gly Glu Asn Val
            295                 300                 305
atg aac gtg gtc gtc gtg gct gct gag tgt tct ccc tgg tgc aaa aca     1195
Met Asn Val Val Val Val Ala Ala Glu Cys Ser Pro Trp Cys Lys Thr
        310                 315                 320
ggt ggt ctg gga gat gtt gcg ggt gct ctg ccc aag gct ttg gca aag     1243
Gly Gly Leu Gly Asp Val Ala Gly Ala Leu Pro Lys Ala Leu Ala Lys
    325                 330                 335
aga gga cat cgt gtt atg gtt gtg gta cca agg tat ggg gac tat gaa     1291
Arg Gly His Arg Val Met Val Val Val Pro Arg Tyr Gly Asp Tyr Glu
340                 345                 350                 355
gaa gcc tac gat gtc gga gtc cga aaa tac tac aag gct gct gga cag     1339
Glu Ala Tyr Asp Val Gly Val Arg Lys Tyr Tyr Lys Ala Ala Gly Gln
                360                 365                 370
gat atg gaa gtg aat tat ttc cat gct tat atc gat gga gtt gat ttt     1387
Asp Met Glu Val Asn Tyr Phe His Ala Tyr Ile Asp Gly Val Asp Phe
            375                 380                 385
gtg ttc att gac gct cct ctc ttc cga cac cgt cag gaa gac att tat     1435
Val Phe Ile Asp Ala Pro Leu Phe Arg His Arg Gln Glu Asp Ile Tyr
        390                 395                 400
ggg ggc agc aga cag gaa att atg aag cgc atg att ttg ttc tgc aag     1483
Gly Gly Ser Arg Gln Glu Ile Met Lys Arg Met Ile Leu Phe Cys Lys
    405                 410                 415
gcc gct gtt gag gtt cca tgg cac gtt cca tgc ggc ggt gtc cct tat     1531
Ala Ala Val Glu Val Pro Trp His Val Pro Cys Gly Gly Val Pro Tyr
420                 425                 430                 435
ggg gat gga aat ctg gtg ttt att gca aat gat tgg cac acg gca ctc     1579
Gly Asp Gly Asn Leu Val Phe Ile Ala Asn Asp Trp His Thr Ala Leu
                440                 445                 450
ctg cct gtc tat ctg aaa gca tat tac agg gac cat ggt ttg atg cag     1627
Leu Pro Val Tyr Leu Lys Ala Tyr Tyr Arg Asp His Gly Leu Met Gln
            455                 460                 465
tac act cgg tcc att atg gtg ata cat aac atc gct cac cag ggc cgt      1675
Tyr Thr Arg Ser Ile Met Val Ile His Asn Ile Ala His Gln Gly Arg
        470                 475                 480
ggc cct gta gat gaa ttc ccg ttc acc gag ttg cct gag cac tac ctg      1723
Gly Pro Val Asp Glu Phe Pro Phe Thr Glu Leu Pro Glu His Tyr Leu
    485                 490                 495
gaa cac ttc aga ctg tac gac ccc gtg ggt ggt gaa cac gcc aac tac      1771
Glu His Phe Arg Leu Tyr Asp Pro Val Gly Gly Glu His Ala Asn Tyr
500                 505                 510                 515
ttc gcc gcc ggc ctg aag atg gcg gac cag gtt gtc gtg gtg agc ccc      1819
Phe Ala Ala Gly Leu Lys Met Ala Asp Gln Val Val Val Val Ser Pro
                520                 525                 530
ggg tac ctg tgg gag ctg aag acg gtg gag ggc ggc tgg ggg ctt cac      1867
Gly Tyr Leu Trp Glu Leu Lys Thr Val Glu Gly Gly Trp Gly Leu His
            535                 540                 545
gac atc ata cgg cag aac gac tgg aag acc cgc ggc atc gtc aac ggc      1915
Asp Ile Ile Arg Gln Asn Asp Trp Lys Thr Arg Gly Ile Val Asn Gly
        550                 555                 560
atc gac aac atg gag tgg aac ccc gag gtg gac gcc cac ctc aag tcg      1963
Ile Asp Asn Met Glu Trp Asn Pro Glu Val Asp Ala His Leu Lys Ser
    565                 570                 575
gac ggc tac acc aac ttc tcc ctg agg acg ctg gac tcc ggc aag cgg      2011
Asp Gly Tyr Thr Asn Phe Ser Leu Arg Thr Leu Asp Ser Gly Lys Arg
580                 585                 590                 595
cag tgc aag gag gcc ctg cag cgc gag ctg ggc ctg cag gtc cgc gcc      2059
Gln Cys Lys Glu Ala Leu Gln Arg Glu Leu Gly Leu Gln Val Arg Ala
                600                 605                 610
gac gtg ccg ctg ctc ggc ttc atc ggc cgc ctg gac ggg cag aag ggc      2107
Asp Val Pro Leu Leu Gly Phe Ile Gly Arg Leu Asp Gly Gln Lys Gly
            615                 620                 625
gtg gag atc atc gcg gac gcc atg ccc tgg atc gtg agc cag gac gtg      2155
Val Glu Ile Ile Ala Asp Ala Met Pro Trp Ile Val Ser Gln Asp Val
        630                 635                 640
cag ctg gtg atg ctg ggc acc ggg cgc cac gac ctg gag agc atg ctg      2203
Gln Leu Val Met Leu Gly Thr Gly Arg His Asp Leu Glu Ser Met Leu
    645                 650                 655
cag cac ttc gag cgg gag cac cac gac aag gtg cgc ggg tgg gtg ggg     2251
Gln His Phe Glu Arg Glu His His Asp Lys Val Arg Gly Trp Val Gly
660                 665                 670                 675
ttc tcc gtg cgc ctg gcg cac cgg atc acg gcg ggg gcg gac gcg ctc     2299
Phe Ser Val Arg Leu Ala His Arg Ile Thr Ala Gly Ala Asp Ala Leu
                680                 685                 690
ctc atg ccc tcc cgg ttc gag ccg tgc ggg ctg aac cag ctc tac gcc     2347
Leu Met Pro Ser Arg Phe Glu Pro Cys Gly Leu Asn Gln Leu Tyr Ala
            695                 700                 705
atg gcc tac ggc acc gtc ccc gtc gtg cac gcc gtc ggc ggc ctc agg     2395
Met Ala Tyr Gly Thr Val Pro Val Val His Ala Val Gly Gly Leu Arg
        710                 715                 720
gac acc gtg ccg ccg ttc gac ccc ttc aac cac tcc ggg ctc ggg tgg     2443
Asp Thr Val Pro Pro Phe Asp Pro Phe Asn His Ser Gly Leu Gly Trp
    725                 730                 735
acg ttc gac cgc gcc gag gcg cac aag ctg atc gag gcg ctc ggg cac     2491
Thr Phe Asp Arg Ala Glu Ala His Lys Leu Ile Glu Ala Leu Gly His
740                 745                 750                 755
tgc ctc egc acc tac cga gac ttc aag gag agc tgg agg gcc ctc cag     2539
Cys Leu Arg Thr Tyr Arg Asp Phe Lys Glu Ser Trp Arg Ala Leu Gln
            760                 765                 770
gag cgc ggc atg tcg cag gac ttc agc tgg gag cac gcc gcc aag ctc     2587
Glu Arg Gly Met Ser Gln Asp Phe Ser Trp Glu His Ala Ala Lys Leu
            775                 780                 785
tac gag gac gtc ctc gtc aag gcc aag tac cag tgg tgaacgctag          2633
Tyr Glu Asp Val Leu Val Lys Ala Lys Tyr Gln Trp
        790                 795
ctgctagccg ctccagcccc gcatgcgtgc atgacaggat ggaactgcat tgcgcacgca   2693
ggaaagtgcc atggagcgcc ggcatccgcg aagtacagtg acatgaggtg tgtgtggttg   2753
agacgctgat tccaatccgg cccgtagcag agtagagcgg aggtatatgg gaatcttaac   2813
ttggtattgt aatttgttat gttgtgtgca ttattacaat gttgttactt attcttgtta   2873
agtcggaggc caagggcgaa agctagctca catgtctgat ggatgcacgt gccatggttg   2933
gtttggtagc gcagtgcaaa cggcaagaat gggaagtgaa ttcctccctg cttgaaaaaa   2993
aaaaaaa                                                             3000
<210>4
<211>799
<212>PRT
<213>普通小麦
<400>4
Met Ser Ser Ala Val Ala Ser Ala Ala Ser Phe Leu Ala Leu Ala Ser
1               5                   10                  15
Ala Ser Pro Gly Arg Ser Arg Arg Arg Ala Arg Val Ser Ala Gln Pro
            20                  25                  30
Pro His Ala Gly Ala Gly Arg Leu His Trp Pro Pro Trp Pro Pro Gln
        35                  40                  45
Arg Thr Ala Arg Asp Gly Ala Val Ala Ala Leu Ala Ala Gly Lys Lys
    50                  55                  60
Asp Ala Gly Ile Asp Asp Ala Ala Ala Ser Val Arg Gln Pro Arg Ala
65                  70                  75                  80
Leu Arg Gly Gly Ala Ala Thr Lys Val Ala Glu Arg Arg Asp Pro Val
                 85                  90                  95
Lys Thr Leu Asp Arg Asp Ala Ala Glu Gly Gly Gly Pro Ser Pro Pro
            100                 105                 110
Ala Ala Arg Gln Asp Ala Ala Arg Pro Pro Ser Met Asn Gly Met Pro
        115                 120                 125
Val Asn Gly Glu Asn Lys Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ala Thr Lys Asp
    130                 135                 140
Ser Gly Leu Pro Thr Pro Ala Arg Ala Pro His Pro Ser Thr Gln Asn
145                 150                 155                 160
Arg Ala Pro Val Asn Gly Glu Asn Lys Ala Asn Val Ala Ser Pro Pro
                165                 170                 175
Thr Ser Ile Ala Glu Ala Ala Ala Ser Asp Ser Ala Ala Thr Ile Ser
        180                 185                 190
Ile Ser Asp Lys Ala Pro Glu Ser Val Val Pro Ala Glu Lys Thr Pro
        195                 200                 205
Pro Ser Ser Gly Ser Asn Phe Glu Ser Ser Ala Ser Ala Pro Gly Ser
    210                 215                 220
Asp Thr Val Ser Asp Val Glu Gln Glu Leu Lys Lys Gly Ala Val Val
225                 230                 235                 240
Val Glu Glu Ala Pro Lys Pro Lys Ala Leu Ser Pro Pro Ala Ala Pro
                245                 250                 255
Ala Val Gln Glu Asp Leu Trp Asp Phe Lys Lys Tyr Ile Gly Phe Glu
             260                 265                 270
Glu Pro Val Glu Ala Lys Asp Asp Gly Arg Ala ValAla Asp Asp Ala
        275                 280                 285
Gly Ser Phe Glu His His Gln Asn His Asp Ser Gly Pro Leu Ala Gly
    290                 295                 300
Glu Asn Val Met Asn Val Val Val Val Ala Ala Glu Cys Ser Pro Trp
305                 310                 315                 320
Cys Lys Thr Gly Gly Leu Gly Asp Val Ala Gly Ala Leu Pro Lys Ala
                325                 330                 335
Leu Ala Lys Arg Gly His Arg Val Met Val Val Val Pro Arg Tyr Gly
            340                 345                 350
Asp Tyr Glu Glu Ala Tyr Asp Val Gly Val Arg Lys Tyr Tyr Lys Ala
        355                 360                 365
Ala Gly Gln Asp Met Glu Val Asn Tyr Phe His Ala Tyr Ile Asp Gly
    370                 375                 380
Val Asp Phe Val Phe Ile Asp Ala Pro Leu Phe Arg His Arg Gln Glu
385                 390                 395                 400
Asp Ile Tyr Gly Gly Ser Arg Gln Glu Ile Met Lys Arg Met Ile Leu
            405                 410                 415
Phe Cys Lys Ala Ala Val Glu Val Pro Trp His Val Pro Cys Gly Gly
            420                 425                 430
Val Pro Tyr Gly Asp Gly Asn Leu Val Phe Ile Ala Asn Asp Trp His
        435                 440                 445
Thr Ala Leu Leu Pro Val Tyr Leu Lys Ala Tyr Tyr Arg Asp His Gly
    450                 455                 460
Leu Met Gln Tyr Thr Arg Ser Ile Met Val Ile His Asn Ile Ala His
465                 470                 475                 480
Gln Gly Arg Gly Pro Val Asp Glu Phe Pro Phe Thr Glu Leu Pro Glu
                485                 490                 495
His Tyr Leu Glu His Phe Arg Leu Tyr Asp Pro Val Gly Gly Glu His
            500                 505                 510
Ala Asn Tyr Phe Ala Ala Gly Leu Lys Met Ala Asp Gln Val Val Val
        515                 520                 525
Val Ser Pro Gly Tyr Leu Trp Glu Leu Lys Thr Val Glu Gly Gly Trp
    530                 535                 540
Gly Leu His Asp Ile Ile Arg Gln Asn Asp Trp Lys Thr Arg Gly Ile
545                 550                 555                 560
Val Asn Gly Ile Asp Asn Met Glu Trp Asn Pro Glu Val Asp Ala His
                565                 570                 575
Leu Lys Ser Asp Gly Tyr Thr Asn Phe Ser Leu Arg Thr Leu Asp Ser
            580                 585                 590
Gly Lys Arg Gln Cys Lys Glu Ala Leu Gln Arg Glu Leu Gly Leu Gln
        595                 600                 605
Val Arg Ala Asp Val Pro Leu Leu Gly Phe Ile Gly Arg Leu Asp Gly
    610                 615                 620
Gln Lys Gly Val Glu Ile Ile Ala Asp Ala Met Pro Trp Ile Val Ser
625                 630                 635                 640
Gln Asp Val Gln Leu Val Met Leu Gly Thr Gly Arg His Asp Leu Glu
                645                 650                 655
Ser Met Leu Gln His Phe Glu Arg Glu His His Asp Lys Val Arg Gly
            660                 665                 670
Trp Val Gly Phe Ser Val Arg Leu Ala His Arg Ile Thr Ala Gly Ala
        675                 680                 685
Asp Ala Leu Leu Met Pro Ser Arg Phe Glu Pro Cys Gly Leu Asn Gln
    690                 695                 700
Leu Tyr Ala Met Ala Tyr Gly Thr Val Pro Val Val His Ala Val Gly
705                 710                 715                 720
Gly Leu Arg Asp Thr Val Pro Pro Phe Asp Pro Phe Asn His Ser Gly
                725                 730                 735
Leu Gly Trp Thr Phe Asp Arg Ala Glu Ala His Lys Leu Ile Glu Ala
            740                 745                 750
Leu Gly His Cys Leu Arg Thr Tyr Arg Asp Phe Lys Glu Ser Trp Arg
        755                 760                 765
Ala Leu Gln Glu Arg Gly Met Ser Gln Asp Phe Ser Trp Glu His Ala
    770                 775                 780
Ala Lys Leu Tyr Glu Asp Val Leu Val Lys Ala Lys Tyr Gln Trp
785                 790                 795
<210>5
<211>2433
<212>DNA
<213>稻(Oryza sativa)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(2430)
<400>5
atg tct agc gcg gtg gtt gcg tcc agc aca act ttt ctc gtc gca ctt        48
Met Ser Ser Ala Val Val Ala Ser Ser Thr Thr Phe Leu Val Ala Leu
1               5                  10                  15
gcc tct agc gcg agc cgg ggc ggg cca cgt agg ggg cgc gtc gtg ggc        96
Ala Ser Ser Ala Ser Arg Gly Gly Pro Arg Arg Gly Arg Val Val Gly
            20                  25                  30
gtg gcc gct ccc cca gcc ctc ctg tat gac ggg aga gct ggc agg cta       144
Val Ala Ala Pro Pro Ala Leu Leu Tyr Asp Gly Arg Ala Gly Arg Leu
        35                  40                  45
gcc ctg cgc gcc cct ccg cca ccc cgc cct aga cct agg cgc agg gat       192
Ala Leu Arg Ala Pro Pro Pro Pro Arg Pro Arg Pro Arg Arg Arg Asp
    50                  55                  60
geg ggt gtt gtc agg cgg gct gat gac ggg gag aac gag gcc gca gtg       240
Ala Gly Val Val Arg Arg Ala Asp Asp Gly Glu Asn Glu Ala Ala Val
65                  70                  75                  80
gag cgg gcc ggc gag gac gat gac gag gag gag gag ttc tcg tcc ggg       288
Glu Arg Ala Gly Glu Asp Asp Asp Glu Glu Glu Glu Phe Ser Ser Gly
                85                  90                  95
gcc tgg cag cca ccg cgt tca agg cgc ggt gga gtt ggc aag gtc ctc       336
Ala Trp Gln Pro Pro Arg Ser Arg Arg Gly Gly Val Gly Lys Val Leu
            100                 105                 110
aaa cgt cgc ggt acc gtg ccg cca gtc gga agg tac ggc tcc ggt gga       384
Lys Arg Arg Gly Thr Val Pro Pro Val Gly Arg Tyr Gly Ser Gly Gly
        115                 120                 125
gac gcc gct cgg gtg aga gga gcc gcg gca ccc gct cca gca ccg acg      432
Asp Ala Ala Arg Val Arg Gly Ala Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Thr
    130                 135                 140
caa gac gca gcg tcg tct aag aat ggc gcg ctt ttg tca ggc agg gat      480
Gln Asp Ala Ala Ser Ser Lys Asn Gly Ala Leu Leu Ser Gly Arg Asp
145                 150                 155                 160
gac gac aca cct gcc tca cgg aac gga tcg gtc gtt acc ggc gcc gac      528
Asp Asp Thr Pro Ala Ser Arg Asn Gly Ser Val Val Thr Gly Ala Asp
                165                 170                 175
aag cct gcc gcc gcc acg ccg ccg gtg acc ata acg aag ctc cca gcg      576
Lys Pro Ala Ala Ala Thr Pro Pro Val Thr Ile Thr Lys Leu Pro Ala
            180                 185                 190
ccg gac tcc ccc gtg atc ctt cca tcc gta gac aag ccg cag ccg gag      624
Pro Asp Ser Pro Val Ile Leu Pro Ser Val Asp Lys Pro Gln Pro Glu
        195                 200                 205
ttc gtc atc cca gac gcg acg gcg ccg gcg ccg cca ccg ccc ggt tca      672
Phe Val Ile Pro Asp Ala Thr Ala Pro Ala Pro Pro Pro Pro Gly Ser
    210                 215                 220
aat ccc agg tcg tcc gct cct ctc ccc aag cct gac aat tcg gaa ttt      720
Asn Pro Arg Ser Ser Ala Pro Leu Pro Lys Pro Asp Asn Ser Glu Phe
225                 230                 235                 240
gca gag gat aag agc gca aaa gtt gtt gag agt gct ccg aag cca aag      768
Ala Glu Asp Lys Ser Ala Lys Val Val Glu Ser Ala Pro Lys Pro Lys
                245                 250                 255
geg act aga tct tcc cct att cct gcg gta gaa gag gag acg tgg gat      816
Ala Thr Arg Ser Ser Pro Ile Pro Ala Val Glu Glu Glu Thr Trp Asp
            260                 265                 270
ttc aag aaa tat ttt gat ctg aac gaa ccg gac gcc gcg gag gat ggc      864
Phe Lys Lys Tyr Phe Asp Leu Asn Glu Pro Asp Ala Ala Glu Asp Gly
        275                 280                 285
gat gac gat gat gac tgg gct gat tca gat gcg tca gat tct gag atc      912
Asp Asp Asp Asp Asp Trp Ala Asp Ser Asp Ala Ser Asp Ser Glu Ile
    290                 295                 300
gac cag gat gac gat tcg ggt cct ttg gct ggg gag aat gtc atg aac      960
Asp Gln Asp Asp Asp Ser Gly Pro Leu Ala Gly Glu Asn Val Met Asn
305                 310                 315                 320
gtg atc gtg gtg gct gct gaa tgt tct ccc tgg tgc aaa aca ggt ggg      1008
Val Ile Val Val Ala Ala Glu Cys Ser Pro Trp Cys Lys Thr Gly Gly
                325                 330                 335
ctt gga gat gtt gca ggt gct tta ccc aag gct ttg gcg agg aga gga      1056
Leu Gly Asp Val Ala Gly Ala Leu Pro Lys Ala Leu Ala Arg Arg Gly
            340                 345                 350
cat cgt gtt atg gtt gtc gta cca agg tac ggt gat tac gcg gaa gcc      1104
His Arg Val Met Val Val Val Pro Arg Tyr Gly Asp Tyr Ala Glu Ala
        355                 360                 365
cag gat gta gga atc agg aaa tac tac aag gct gct gga cag gat ctg      1152
Gln Asp Val Gly Ile Arg Lys Tyr Tyr Lys Ala Ala Gly Gln Asp Leu
    370                 375                 380
gaa gtg aaa tat ttc cat gca ttt atc gac gga gtt gat ttt gtg ttc      1200
Glu Val Lys Tyr Phe His Ala Phe Ile Asp Gly Val Asp Phe Val Phe
385                 390                 395                 400
att gac gct cct ctc ttc cgt cac cgt cag gat gac atc tat ggg ggg      1248
Ile Asp Ala Pro Leu Phe Arg His Arg Gln Asp Asp Ile Tyr Gly Gly
                405                 410                 415
aac aga cag gaa atc atg aag cgc atg att ctg ttt tgt aag gct gct      1296
Asn Arg Gln Glu Ile Met Lys Arg Met Ile Leu Phe Cys Lys Ala Ala
            420                 425                 430
gtt gag gtt cct tgg cac gtt cca tgc ggt ggt gtg ccc tat ggg gat      1344
Val Glu Val Pro Trp His Val Pro Cys Gly Gly Val Pro Tyr Gly Asp
        435                 440                 445
ggc aac ttg gtg ttc ctt gca aac gat tgg cac act gca ctc ctg cct      1392
Gly Asn Leu Val Phe Leu Ala Asn Asp Trp His Thr Ala Leu Leu Pro
    450                 455                 460
gtt tat ctg aag gca tat tac aga gac aat ggc atg atg cag tac act      1440
Val Tyr Leu Lys Ala Tyr Tyr Arg Asp Asn Gly Met Met Gln Tyr Thr
465                 470                 475                 480
cgc tct gtc ctt gtg ata cat aat atc gct tac cag ggc cgt ggc cca      1488
Arg Ser Val Leu Val Ile His Asn Ile Ala Tyr Gln Gly Arg Gly Pro
                485                 490                 495
gta gat gaa ttc ccc tac atg gaa ttg ccg gag cac tac ctg gat cac      1536
Val Asp Glu Phe Pro Tyr Met Glu Leu Pro Glu His Tyr Leu Asp His
            500                 505                 510
ttc aag ctg tac gac ccc gtc ggc ggc gag cac gcc aac atc ttc ggc      1584
Phe Lys Leu Tyr Asp Pro Val Gly Gly Glu His Ala Asn Ile Phe Gly
        515                 520                 525
gcg ggc ctg aag atg gcg gac cgg gtg gtg acc gtg agc ccc ggc tac      1632
Ala Gly Leu Lys Met Ala Asp Arg Val Val Thr Val Ser Pro Gly Tyr
    530                 535                 540
ctc tgg gag ctg aag acg acg gag ggc ggc tgg ggc ctc cac gac atc      1680
Leu Trp Glu Leu Lys Thr Thr Glu Gly Gly Trp Gly Leu His Asp Ile
545                 550                 555                 560
ata cgg gag aac gac tgg aag atg aac ggc atc gtg aac ggc atc gac      1728
Ile Arg Glu Asn Asp Trp Lys Met Asn Gly Ile Val Asn Gly Ile Asp
                565                 570                 575
tac cgg gag tgg aac ccg gag gtg gac gtg cac ctg cag tcc gac ggc      1776
Tyr Arg Glu Trp Asn Pro Glu Val Asp Val His Leu Gln Ser Asp Gly
            580                 585                 590
tac gcc aac tac acc gtg gcc tcg ctg gac tcc agc aag ccg cgg tgc      1824
Tyr Ala Asn Tyr Thr Val Ala Ser Leu Asp Ser Ser Lys Pro Arg Cys
        595                 600                 605
aag gcg gcg ctg cag cgc gag ctg ggg ctg gag gtg cgc gac gac gtg      1872
Lys Ala Ala Leu Gln Arg Glu Leu Gly Leu Glu Val Arg Asp Asp Val
    610                 615                 620
ccg ctg atc ggg ttc atc ggg cgg ctc gac ggg cag aaa ggt gtg gac      1920
Pro Leu Ile Gly Phe Ile Gly Arg Leu Asp Gly Gln Lys Gly Val Asp
625                 630                 635                 640
atc atc ggc gac gcg atg ccg tgg atc gcc ggg cag gac gtg cag ctg      1968
Ile Ile Gly Asp Ala Met Pro Trp Ile Ala Gly Gln Asp Val Gln Leu
                645                 650                 655
gtg ctg ctg ggc tcc ggc cgc cgc gac ctg gag gtg atg ctg cag cgg      2016
Val Leu Leu Gly Ser Gly Arg Arg Asp Leu Glu Val Met Leu Gln Arg
            660                 665                 670
ttc gag gcg cag cac aac agc aag gtg cgc ggg tgg gtg ggg ttc tcg      2064
Phe Glu Ala Gln His Asn Ser Lys Val Arg Gly Trp Val Gly Phe Ser
        675                 680                 685
gtg aag atg gcg cac cgg atc acg gcg ggc gcc gac gtg ctg gtc atg      2112
Val Lys Met Ala His Arg Ile Thr Ala Gly Ala Asp Val Leu Val Met
    690                 695                 700
ccg tcg cgg ttc gag ccg tgc ggc ctc aac cag ctc tac gcc atg gcg      2160
Pro Ser Arg Phe Glu Pro Cys Gly Leu Asn Gln Leu Tyr Ala Met Ala
705                 710                 715                 720
tac ggc acc gtc ccc gtc gtg cac gcc gtc ggc ggg ctg agg gac acc     2208
Tyr Gly Thr Val Pro Val Val His Ala Val Gly Gly Leu Arg Asp Thr
                725                 730                 735
gtg tcg gcg ttc gac ccg ttc gag gac acc ggc ctc ggg tgg acg ttc     2256
Val Ser Ala Phe Asp Pro Phe Glu Asp Thr Gly Leu Gly Trp Thr Phe
            740                 745                 750
gac cgc gcc gag ccg cac aag ctc atc gag gcg ctc ggc cac tgc ctg     2304
Asp Arg Ala Glu Pro His Lys Leu Ile Glu Ala Leu Gly His Cys Leu
        755                 760                 765
gag acg tac cgc aag tac aag gag agc tgg agg ggg ctc cag gtg cgc     2352
Glu Thr Tyr Arg Lys Tyr Lys Glu Ser Trp Arg Gly Leu Gln Val Arg
    770                 775                 780
ggc atg tcg cag gac ctc agc tgg gac cac gcc gcc gag ctc tac gag     2400
Gly Met Ser Gln Asp Leu Ser Trp Asp His Ala Ala Glu Leu Tyr Glu
785                 790                 795                 800
gag gtc ctt gtc aag gcc aag tac caa tgg tga                         2433
Glu Val Leu Val Lys Ala Lys Tyr Gln Trp
                805                 810
<210>6
<211>810
<212>PRT
<213>稻
<400>6
Met Ser Ser Ala Val Val Ala Ser Ser Thr Thr Phe Leu Val Ala Leu
1               5                   10                  15
Ala Ser Ser Ala Ser Arg Gly Gly Pro Arg Arg Gly Arg Val Val Gly
            20                  25                  30
Val Ala Ala Pro Pro Ala Leu Leu Tyr Asp Gly Arg Ala Gly Arg Leu
        35                  40                  45
Ala Leu Arg Ala Pro Pro Pro Pro Arg Pro Arg Pro Arg Arg Arg Asp
    50                  55                  60
Ala Gly Val Val Arg Arg Ala Asp Asp Gly Glu Asn Glu Ala Ala Val
65                  70                  75                  80
Glu Arg Ala Gly Glu Asp Asp Asp Glu Glu Glu Glu Phe Ser Ser Gly
                85                  90                  95
Ala Trp Glr Pro Pro Arg Ser Arg Arg Gly Gly Val Gly Lys Val Leu
            100                 105                 110
Lys Arg Arg Gly Thr Val Pro Pro Val Gly Arg Tyr Gly Ser Gly Gly
        115                 120                 125
Asp Ala Ala Arg Val Arg Gly Ala Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Thr
    130                 135                 140
Gln Asp Ala Ala Ser Ser Lys Asn Gly Ala Leu Leu Ser Gly Arg Asp
145                 150                 155                 160
Asp Asp Thr Pro Ala Ser Arg Asn Gly Ser Val Val Thr Gly Ala Asp
                165                 170                 175
Lys Pro Ala Ala Ala Thr Pro Pro Val Thr Ile Thr Lys Leu Pro Ala
            180                 185                 190
Pro Asp Ser Pro Val Ile Leu Pro Ser Val Asp Lys Pro Gln Pro Glu
        195                 200                 205
Phe Val Ile Pro Asp Ala Thr Ala Pro Ala Pro Pro Pro Pro Gly Ser
    210                 215                 220
Asn Pro Arg Ser Ser Ala Pro Leu Pro Lys Pro Asp Asn Ser Glu Phe
225                 230                 235                 240
Ala Glu Asp Lys Ser Ala Lys Val Val Glu Ser Ala Pro Lys Pro Lys
                245                 250                 255
Ala Thr Arg Ser Ser Pro Ile Pro Ala Val Glu Glu Glu Thr Trp Asp
            260                 265                 270
Phe Lys Lys Tyr Phe Asp Leu Asn Glu Pro Asp Ala Ala Glu Asp Gly
        275                 280                 285
Asp Asp Asp Asp Asp Trp Ala Asp Ser Asp Ala Ser Asp Ser Glu Ile
    290                 295                 300
Asp Gln Asp Asp Asp Ser Gly Pro Leu Ala Gly Glu Asn Val Met Asn
305                 310                 315                 320
Val Ile Val Val Ala Ala Glu Cys Ser Pro Trp Cys Lys Thr Gly Gly
                325                 330                 335
Leu Gly Asp Val Ala Gly Ala Leu Pro Lys Ala Leu Ala Arg Arg Gly
            340                 345                 350
His Arg Val Met Val Val Val Pro Arg Tyr Gly Asp Tyr Ala Glu Ala
        355                 360                 365
Gln Asp Val Gly Ile Arg Lys Tyr Tyr Lys Ala Ala Gly Gln Asp Leu
    370                 375                 380
Glu Val Lys Tyr Phe His Ala Phe Ile Asp Gly Val Asp Phe Val Phe
385                 390                 395                 400
Ile Asp Ala Pro Leu Phe Arg His Arg Gln Asp Asp Ile Tyr Gly Gly
                405                 410                 415
Asn Arg Gln Glu Ile Met Lys Arg Met Ile Leu Phe Cys Lys Ala Ala
            420                 425                 430
Val Glu Val Pro Trp His Val Pro Cys Gly Gly Val Pro Tyr Gly Asp
        435                 440                 445
Gly Asn Leu Val Phe Leu Ala Asn Asp Trp His Thr Ala Leu Leu Pro
    450                 455                 460
Val Tyr Leu Lys Ala Tyr Tyr Arg Asp Asn Gly Met Met Gln Tyr Thr
465                 470                 475                 480
Arg Ser Val Leu Val Ile His Asn Ile Ala Tyr Gln Gly Arg Gly Pro
                485                 490                 495
Val Asp Glu Phe Pro Tyr Met Glu Leu Pro Glu His Tyr Leu Asp His
            500                 505                 510
Phe Lys Leu Tyr Asp Pro Val Gly Gly Glu His Ala Asn Ile Phe Gly
        515                 520                 525
Ala Gly Leu Lys Met Ala Asp Arg Val Val Thr Val Ser Pro Gly Tyr
    530                 535                 540
Leu Trp Glu Leu Lys Thr Thr Glu Gly Gly Trp Gly Leu His Asp Ile
545                 550                 555                 560
Ile Arg Glu Asn Asp Trp Lys Met Asn Gly Ile Val Asn Gly Ile Asp
                565                 570                 575
Tyr Arg Glu Trp Asn Pro Glu Val Asp Val His Leu Gln Ser Asp Gly
            580                 585                 590
Tyr Ala Asn Tyr Thr Val Ala Ser Leu Asp Ser Ser Lys Pro Arg Cys
        595                 600                 605
Lys Ala Ala Leu Gln Arg Glu Leu Gly Leu Glu Val Arg Asp Asp Val
    610                 615                 620
Pro Leu Ile Gly Phe Ile Gly Arg Leu Asp Gly Gln Lys Gly Val Asp
625                 630                 635                 640
Ile Ile Gly Asp Ala Met Pro Trp Ile Ala Gly Gln Asp Val Gln Leu
                645                 650                 655
Val Leu Leu Gly Ser Gly Arg Arg Asp Leu Glu Val Met Leu Gln Arg
            660                 665                 670
Phe Glu Ala Gln His Asn Ser Lys Val Arg Gly Trp Val Gly Phe Ser
        675                 680                 685
Val Lys Met Ala His Arg Ile Thr Ala Gly Ala Asp Val Leu Val Met
    690                 695                 700
Pro Ser Arg Phe Glu Pro Cys Gly Leu Asn Gln Leu Tyr Ala Met Ala
705                 710                 715                 720
Tyr Gly Thr Val Pro Val Val His Ala Val Gly Gly Leu Arg Asp Thr
                725                 730                 735
Val Ser Ala Phe Asp Pro Phe Glu Asp Thr Gly Leu Gly Trp Thr Phe
            740                 745                 750
Asp Arg Ala Glu Pro His Lys Leu Ile Glu Ala Leu Gly His Cys Leu
        755                 760                 765
Glu Thr Tyr Arg Lys Tyr Lys Glu Ser Trp Arg Gly Leu Gln Val Arg
    770                 775                 780
Gly Met Ser Gln Asp Leu Ser Trp Asp His Ala Ala Glu Leu Tyr Glu
785                 790                 795                 800
Glu Val Leu Val Lys Ala Lys Tyr Gln Trp
                805                 810
<210>7
<211>1830
<212>DNA
<213>稻
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1827)
<400>7
atg tcg gct ctc acc acg tcc cag ctc gcc acc tcg gcc acc ggc ttc        48
Met Ser Ala Leu Thr Thr Ser Gln Leu Ala Thr Ser Ala Thr Gly Phe
1               5                   10                  15
ggc atc gcc gac agg tcg gcg ccg tcg tcg ctg ctc cgc cac ggg ttc        96
Gly Ile Ala Asp Arg Ser Ala Pro Ser Ser Leu Leu Arg His Gly Phe
            20                  25                  30
cag ggc ctc aag ccc cgc agc ccc gcc ggc ggc gac gcg acg tcg ctc       144
Gln Gly Leu Lys Pro Arg Ser Pro Ala Gly Gly Asp Ala Thr Ser Leu
        35                  40                  45
agc gtg acg acc agc gcg cgc gcg acg ccc aag cag cag cgg tcg gtg       192
Ser Val Thr Thr Ser Ala Arg Ala Thr Pro Lys Gln Gln Arg Ser Val
    50                  55                  60
cag cgt ggc agc cgg agg ttc ccc tcc gtc gtc gtg tac gcc acc ggc       240
Gln Arg Gly Ser Arg Arg Phe Pro Ser Val Val Val Tyr Ala Thr Gly
65                  70                  75                  80
gcc ggc atg aac gtc gtg ttc gtc ggc gcc gag atg gcc ccc tgg agc       288
Ala Gly Met Asn Val Val Phe Val Gly Ala Glu Met Ala Pro Trp Ser
                85                  90                  95
aag acc ggc ggc ctc ggt gac gtc ctc ggt ggc ctc ccc cct gcc atg       336
Lys Thr Gly Gly Leu Gly Asp Val Leu Gly Gly Leu Pro Pro Ala Met
            100                 105                 110
gct gcg aat ggc cac agg gtc atg gtg atc tct cct cgg tac gac cag       384
Ala Ala Asn Gly His Arg Val Met Val Ile Ser Pro Arg Tyr Asp Gln
        115                 120                 125
tac aag gac gct tgg gat acc agc gtt gtg gct gag atc aag gtt gca       432
Tyr Lys Asp Ala Trp Asp Thr Ser Val Val Ala Glu Ile Lys Val Ala
    130                 135                 140
gac agg tac gag agg gtg agg ttt ttc cat tgc tac aag cgt gga gtc       480
Asp Arg Tyr Glu Arg Val Arg Phe Phe His Cys Tyr Lys Arg Gly Val
145                 150                 155                 160
gac cgt gtg ttc atc gac cat ccg tca ttc ctg gag aag gtt tgg gga       528
Asp Arg Val Phe Ile Asp His Pro Ser Phe Leu Glu Lys Val Trp Gly
                165                 170                 175
aag acc ggt gag aag atc tac gga cct gac act gga gtt gat tac aaa       576
Lys Thr Gly Glu Lys Ile Tyr Gly Pro Asp Thr Gly Val Asp Tyr Lys
            180                 185                 190
gac aac cag atg cgt ttc agc ctt ctt tgc cag gca gca ctc gag gct       624
Asp Asn Gln Met Arg Phe Ser Leu Leu Cys Gln Ala Ala Leu Glu Ala
        195                 200                 205
cct agg atc cta aac ctc aac aac aac cca tac ttc aaa gga act tat       672
Pro Arg Ile Leu Asn Leu Asn Asn Asn Pro Tyr Phe Lys Gly Thr Tyr
    210                 215                 220
ggt gag gat gtt gtg ttc gtc tgc aac gac tgg cac act ggc cca ctg      720
Gly Glu Asp Val Val Phe Val Cys Asn Asp Trp His Thr Gly Pro Leu
225                 230                 235                 240
gcg agc tac ctg aag aac aac tac cag ccc aat ggc atc tac agg aat      768
Ala Ser Tyr Leu Lys Asn Asn Tyr Gln Pro Asn Gly Ile Tyr Arg Asn
                245                 250                 255
gca aag gtt gct ttc tgc atc cac aac atc tcc tac cag ggc cgt ttc      816
Ala Lys Val Ala Phe Cys Ile His Asn Ile Ser Tyr Gln Gly Arg Phe
            260                 265                 270
gct ttc gag gat tac cct gag ctg aac ctc tcc gag agg ttc agg tca      864
Ala Phe Glu Asp Tyr Pro Glu Leu Asn Leu Ser Glu Arg Phe Arg Ser
        275                 280                 285
tcc ttc gat ttc atc gac ggg tat gac acg ccg gtg gag ggc agg aag      912
Ser Phe Asp Phe Ile Asp Gly Tyr Asp Thr Pro Val Glu Gly Arg Lys
    290                 295                 300
atc aac tgg atg aag gcc gga atc ctg gaa gcc gac agg gtg ctc acc      960
Ile Asn Trp Met Lys Ala Gly Ile Leu Glu Ala Asp Arg Val Leu Thr
305                 310                 315                 320
gtg agc ccg tac tac gcc gag gag ctc atc tcc ggc atc gcc agg gga     1008
Val Ser Pro Tyr Tyr Ala Glu Glu Leu Ile Ser Gly Ile Ala Arg Gly
                325                 330                 335
tgc gag ctc gac aac atc atg cgg ctc acc ggc atc acc ggc atc gtc     1056
Cys Glu Leu Asp Asn Ile Met Arg Leu Thr Gly Ile Thr Gly Ile Val
            340                 345                 350
aac ggc atg gac gtc agc gag tgg gat ccc agc aag gac aag tac atc     1104
Asn Gly Met Asp Val Ser Glu Trp Asp Pro Ser Lys Asp Lys Tyr Ile
       355                 360                 365
acc gcc aag tac gac gca acc acg gca atc gag gcg aag gcg ctg aac     1152
Thr Ala Lys Tyr Asp Ala Thr Thr Ala Ile Glu Ala Lys Ala Leu Asn
    370                 375                 380
aag gag gcg ttg cag gcg gag gcg ggt ctt ccg gtc gac agg aaa atc     1200
Lys Glu Ala Leu Gln Ala Glu Ala Gly Leu Pro Val Asp Arg Lys Ile
385                 390                 395                 400
cca ctg atc gcg ttc atc ggc agg ctg gag gaa cag aag ggc tct gac     1248
Pro Leu Ile Ala Phe Ile Gly Arg Leu Glu Glu Gln Lys Gly Ser Asp
                405                 410                 415
gtc atg gcc gcc gcc atc ccg gag ctc atg cag gag gac gtc cag atc      1296
Val Met Ala Ala Ala Ile Pro Glu Leu Met Gln Glu Asp Val Gln Ile
            420                 425                 430
gtt ctt ctg ggt act gga aag aag aag ttc gag aag ctg ctc aag agc      1344
Val Leu Leu Gly Thr Gly Lys Lys Lys Phe Glu Lys Leu Leu Lys Ser
        435                 440                 445
atg gag gag aag tat ccg ggc aag gtg agg gcc gtg gtg aag ttc aac      1392
Met Glu Glu Lys Tyr Pro Gly Lys Val Arg Ala Val Val Lys Phe Asn
    450                 455                 460
gcg ccg ctt gct cat ctc atc atg gcc gga gcc gac gtg ctc gcc gtc      1440
Ala Pro Leu Ala His Leu Ile Met Ala Gly Ala Asp Val Leu Ala Val
465                 470                 475                 480
ccc agc cgc ttc gag ccc tgt gga ctc atc cag ctg cag ggg atg aga      1488
Pro Ser Arg Phe Glu Pro Cys Gly Leu Ile Gln Leu Gln Gly Met Arg
                485                 490                 495
tac gga acg ccc tgt gct tgc gcg tcc acc ggt ggg ctc gtg gac acg      1536
Tyr Gly Thr Pro Cys Ala Cys Ala Ser Thr Gly Gly Leu Val Asp Thr
            500                 505                 510
gtc atc gaa ggc aag act ggt ttc cac atg ggc cgt ctc agc gtc gac      1584
Val Ile Glu Gly Lys Thr Gly Phe His Met Gly Arg Leu Ser Val Asp
        515                 520                 525
tgc aag gtg gtg gag cca agc gac gtg aag aag gtg gcg gcc acc ctg      1632
Gys Lys Val Val Glu Pro Ser Asp Val Lys Lys Val Ala Ala Thr Leu
    530                 535                 540
aag cgc gcc atc aag gtc gtc ggc acg ccg gcg tac gag gag atg gtc      1680
Lys Arg Ala Ile Lys Val Val Gly Thr Pro Ala Tyr Glu Glu Met Val
545                 550                 555                 560
agg aac tgc atg aac cag gac ctc tcc tgg aag ggg cct gcg aag aac      1728
Arg Asn Cys Met Asn Gln Asp Leu Ser Trp Lys Gly Pro Ala Lys Asn
                565                 570                 575
tgg gag aat gtg ctc ctg ggc ctg ggc gtc gcc ggc agc gcg ccg ggg      1776
Trp Glu Asn Val Leu Leu Gly Leu Gly Val Ala Gly Ser Ala Pro Gly
            580                 585                 590
atc gaa ggc gac gag atc gcg ccg ctc gcc aag gag aac gtg gct gct      1824
Ile Glu Gly Asp Glu Ile Ala Pro Leu Ala Lys Glu Asn Val Ala Ala
        595                 600                 605
cct tga                                                              1830
Pro
<210>8
<211>609
<212>PRT
<213>稻
<400>8
Met Ser Ala Leu Thr Thr Ser Gln Leu Ala Thr Ser Ala Thr Gly Phe
1               5                   10                  15
Gly Ile Ala Asp Arg Ser Ala Pro Ser Ser Leu Leu Arg His Gly Phe
            20                  25                  30
Gln Gly Leu Lys Pro Arg Ser Pro Ala Gly Gly Asp Ala Thr Ser Leu
        35                  40                  45
Ser Val Thr Thr Ser Ala Arg Ala Thr Pro Lys Gln Gln Arg Ser Val
    50                  55                  60
Gln Arg Gly Ser Arg Arg Phe Pro Ser Val Val Val Tyr Ala Thr Gly
65                  70                  75                  80
Ala Gly Met Asn Val Val Phe Val Gly Ala Glu Met Ala Pro Trp Ser
                    85                  90                  95
Lys Thr Gly Gly Leu Gly Asp Val Leu Gly Gly Leu Pro Pro Ala Met
            100                 105                 110
Ala Ala Asn Gly His Arg Val Met Val Ile Ser Pro Arg Tyr Asp Gln
        115                 120                 125
Tyr Lys Asp Ala Trp Asp Thr Ser Val Val Ala Glu Ile Lys Val Ala
    130                 135                 140
Asp Arg Tyr Glu Arg Val Arg Phe Phe His Cys Tyr Lys Arg Gly Val
145                 150                 155                 160
Asp Arg Val Phe Ile Asp His Pro Ser Phe Leu Glu Lys Val Trp Gly
                165                 170                 175
Lys Thr Gly Glu Lys Ile Tyr Gly Pro Asp Thr Gly Val Asp Tyr Lys
            180                 185                 190
Asp Asn Gln Met Arg Phe Ser Leu Leu Cys Gln Ala Ala Leu Glu Ala
        195                 200                 205
Pro Arg Ile Leu Asn Leu Asn Asn Asn Pro Tyr Phe Lys Gly Thr Tyr
    210                 215                 220
Gly Glu Asp Val Val Phe Val Cys Asn Asp Trp His Thr Gly Pro Leu
225                 230                 235                 240
Ala Ser Tyr Leu Lys Asn Asn Tyr Gln Pro Asn Gly Ile Tyr Arg Asn
                245                 250                 255
Ala Lys Val Ala Phe Cys Ile His Asn Ile Ser Tyr Gln Gly Arg Phe
        260                 265                 270
Ala Phe Glu Asp Tyr Pro Glu Leu Asn Leu Ser Glu Arg Phe Arg Ser
        275                 280                 285
Ser Phe Asp Phe Ile Asp Gly Tyr Asp Thr Pro Val Glu Gly Arg Lys
    290                 295                 300
Ile Asn Trp Met Lys Ala Gly Ile Leu Glu Ala Asp Arg Val Leu Thr
305                 310                 315                 320
Val Ser Pro Tyr Tyr Ala Glu Glu Leu Ile Ser Gly Ile Ala Arg Gly
                325                 330                 335
Cys Glu Leu Asp Asn Ile Met Arg Leu Thr Gly Ile Thr Gly Ile Val
            340                 345                 350
Asn Gly Met Asp Val Ser Glu Trp Asp Pro Ser Lys Asp Lys Tyr Ile
        355                 360                 365
Thr Ala Lys Tyr Asp Ala Thr Thr Ala Ile Glu Ala Lys Ala Leu Asn
    370                 375                 380
Lys Glu Ala Leu Gln Ala Glu Ala Gly Leu Pro Val Asp Arg Lys Ile
385                 390                 395                 400
Pro Leu Ile Ala Phe Ile Gly Arg Leu Glu Glu Gln Lys Gly Ser Asp
                405                 410                 415
Val Met Ala Ala Ala Ile Pro Glu Leu Met Gln Glu Asp Val Gln Ile
           420                 425                 430
Val Leu Leu Gly Thr Gly Lys Lys Lys Phe Glu Lys Leu Leu Lys Ser
        435                 440                 445
Met Glu Glu Lys Tyr Pro Gly Lys Val Arg Ala Val Val Lys Phe Asn
    450                 455                 460
Ala Pro Leu Ala His Leu Ile Met Ala Gly Ala Asp Val Leu Ala Val
465                 470                 475                 480
Pro Ser Arg Phe Glu Pro Cys Gly Leu Ile Gln Leu Gln Gly Met Arg
                485                 490                 495
Tyr Gly Thr Pro Cys Ala Cys Ala Ser Thr Gly Gly Leu Val Asp Thr
            500                 505                 510
Val Ile Glu Gly Lys Thr Gly Phe His Met Gly Arg Leu Ser Val Asp
        515                 520                 525
Cys Lys Val Val Glu Pro Ser Asp Val Lys Lys Val Ala Ala Thr Leu
    530                 535                 540
Lys Arg Ala Ile Lys Val Val Gly Thr Pro Ala Tyr Glu Glu Met Val
545                 550                 555                 560
Arg Asn Cys Met Asn Gln Asp Leu Ser Trp Lys Gly Pro Ala Lys Asn
                565                 570                 575
Trp Glu Asn Val Leu Leu Gly Leu Gly Val Ala Gly Ser Ala Pro Gly
            580                 585                 590
Ile Glu Gly Asp Glu Ile Ala Pro Leu Ala Lys Glu Asn Val Ala Ala
       595                 600                 605
Pro
<210>9
<211>1818
<212>DNA
<213>普通小麦
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1815)
<400>9
atg gcg gct ctg gtc acg tcg cag ctc gcc acc tcc ggc acc gtc ctc        48
Met Ala Ala Leu Val Thr Ser Gln Leu Ala Thr Ser Gly Thr Val Leu
1               5                   10                  15
ggc atc acc gac agg ttc cgg cgt gca ggt ttt cag ggt gtg agg ccc        96
Gly Ile Thr Asp Arg Phe Arg Arg Ala Gly Phe Gln Gly Val Arg Pro
            20                  25                  30
cgg agc ccg gca gat gcg ccg ctc ggc atg agg act acc gga gcg agc       144
Arg Ser Pro Ala Asp Ala Pro Leu Gly Met Arg Thr Thr Gly Ala Ser
        35                  40                  45
gcc gcc ccg aag caa caa agc cgg aaa gcg cac cgc ggg acc cgg cgg       192
Ala Ala Pro Lys Gln Gln Ser Arg Lys Ala His Arg Gly Thr Arg Arg
    50                  55                  60
tgc ctc tcc atg gtg gtg cgc gcc acg ggc agc gcc ggc atg aac ctc       240
Cys Leu Ser Met Val Val Arg Ala Thr Gly Ser Ala Gly Met Asn Leu
65                  70                  75                  80
gtg ttc gtc ggc gcc gag atg gcg ccc tgg agc aag acc ggc ggc ctc       288
Val Phe Val Gly Ala Glu Met Ala Pro Trp Ser Lys Thr Gly Gly Leu
                85                  90                  95
ggc gac gtc ctc ggg ggc ctc ccc cca gcc atg gcc gcc aac ggt cac      336
Gly Asp Val Leu Gly Gly Leu Pro Pro Ala Met Ala Ala Asn Gly His
            100                 105                 110
cgg gtc atg gtc atc tcc ccg cgc tac gac cag tac aag gac gcc tgg      384
Arg Val Met Val Ile Ser Pro Arg Tyr Asp Gln Tyr Lys Asp Ala Trp
        115                 120                 125
gac acc agc gtc gtc tcc gag atc aag gtc gcg gac gag tac gag agg      432
Asp Thr Ser Val Val Ser Glu Ile Lys Val Ala Asp Glu Tyr Glu Arg
    130                 135                 140
gtg agg tac ttc cac tgc tac aag cgc ggg gtg gac cgc gtg ttc gtc      480
Val Arg Tyr Phe His Cys Tyr Lys Arg Gly Val Asp Arg Val Phe Val
145                 150                 155                 160
gac cac ccg tgc ttc ctg gag aag gtc cgg ggc aag acc aag gag aag      528
Asp His Pro Cys Phe Leu Glu Lys Val Arg Gly Lys Thr Lys Glu Lys
                165                 170                 175
atc tac ggg ccc gat gcc ggc acg gac tac gag gac aac cag cta cgc      576
Ile Tyr Gly Pro Asp Ala Gly Thr Asp Tyr Glu Asp Asn Gln Leu Arg
            180                 185                 190
ttc agc ctg ctc tgc cag gca gcg ctt gag gca ccc agg atc ctc gac      624
Phe Ser Leu Leu Cys Gln Ala Ala Leu Glu Ala Pro Arg Ile Leu Asp
        195                 200                 205
ctc aac aac aac cca tac ttc tcc gga ccc tac ggg gaa gac gtg gtg      672
Leu Asn Asn Asn Pro Tyr Phe Ser Gly Pro Tyr Gly Glu Asp Val Val
    210                 215                 220
ttc gtg tgc aac gac tgg cac acg ggc ctt ctg gcc tgc tac ctc aag      720
Phe Val Cys Asn Asp Trp His Thr Gly Leu Leu Ala Cys Tyr Leu Lys
225                 230                 235                 240
agc aac tac cag tcc agt ggc atc tat agg acg gcc aag gta gcg ttc      768
Ser Asn Tyr Gln Ser Ser Gly Ile Tyr Arg Thr Ala Lys Val Ala Phe
                245                 250                 255
tgc atc cac aac atc tcg tat cag ggc cgc ttc tcc ttc gac gac ttc      816
Gys Ile His Asn Ile Ser Tyr Gln Gly Arg Phe Ser Phe Asp Asp Phe
            260                 265                 270
gcg cag ctc aac ctg ccc gac agg ttc aag tcg tcc ttc gac ttc atc      864
Ala Gln Leu Asn Leu Pro Asp Arg Phe Lys Ser Ser Phe Asp Phe Ile
        275                 280                 285
gac ggc tac gac aag ccg gtg gag ggg cgc aag atc aac tgg atg aag       912
Asp Gly Tyr Asp Lys Pro Val Glu Gly Arg Lys Ile Asn Trp Met Lys
    290                 295                 300
gcc ggg atc ctg cag gcc gac aag gtg ctc acg gtg agc ccc tac tac       960
Ala Gly Ile Leu Gln Ala Asp Lys Val Leu Thr Val Ser Pro Tyr Tyr
305                 310                 315                 320
gcg gag gag ctc atc tcc ggc gaa gcc agg ggc tgc gag ctc gac aac      1008
Ala Glu Glu Leu Ile Ser Gly Glu Ala Arg Gly Cys Glu Leu Asp Asn
                325                 330                 335
atc atg cgc ctc acg ggc atc acc ggc atc gtc aac ggc atg gac gtc      1056
Ile Met Arg Leu Thr Gly Ile Thr Gly Ile Val Asn Gly Met Asp Val
            340                 345                 350
agc gag tgg gac ccc gcc aag gac aag ttc ctc gcc gcc aac tac gac      1104
Ser Glu Trp Asp Pro Ala Lys Asp Lys Phe Leu Ala Ala Asn Tyr Asp
        355                 360                 365
gtc acc acc gcg ttg gag ggg aag gcg ctg aac aag gag gcg ctg cag      1152
Val Thr Thr Ala Leu Glu Gly Lys Ala Leu Asn Lys Glu Ala Leu Gln
    370                 375                 380
gcc gag gtg ggg ctg ccg gtg gac cgg aag gtg ccc ctg gtg gcc ttc      1200
Ala Glu Val Gly Leu Pro Val Asp Arg Lys Val Pro Leu Val Ala Phe
385                 390                 395                 400
atc ggc agg ctg gag gag cag aag ggc ccc gac gtg atg atc gcc gcc      1248
Ile Gly Arg Leu Glu Glu Gln Lys Gly Pro Asp Val Met Ile Ala Ala
                405                 410                 415
atc ccg gag atc ttg aag gag gag gac gtc cag atc gtt ctc ctg ggc      1296
Ile Pro Glu Ile Leu Lys Glu Glu Asp Val Gln Ile Val Leu Leu Gly
            420                 425                 430
acc ggg aag aag aag ttt gag cgg etg ctc aag agc gtg gag gag aag      1344
Thr Gly Lys Lys Lys Phe Glu Arg Leu Leu Lys Ser Val Glu Glu Lys
        435                 440                 445
ttc ccg agc aag gtg agg gcc gtg gtc agg ttc aac gcg ccg ctg gct      1392
Phe Pro Ser Lys Val Arg Ala Val Val Arg Phc Asn Ala Pro Leu Ala
    450                 455                 460
cac cag atg atg gcc ggc gcc gac gtg ctc gcc gtc acc agc cgc ttc      1440
His Gln Met Met Ala Gly Ala Asp Val Leu Ala Val Thr Ser Arg Phe
465                 470                 475                 480
gag ccc tgc ggc ctc atc cag ctc cag ggg atg cgc tac gga acg ccg      1488
Glu Pro Cys Gly Leu Ile Gln Leu Gln Gly Met Arg Tyr Gly Thr Pro
                485                 490                 495
tgc gcg tgc gcg tcc acc ggc ggg ctc gtc gac acg atc atg gag ggc      1536
Cys Ala Cys Ala Ser Thr Gly Gly Leu Val Asp Thr Ile Met Glu Gly
            500                 505                 510
aag acc ggg ttc cac atg ggc cgc ctc agc gtc gac tgc aac gtg gtg      1584
Lys Thr Gly Phe His Met Gly Arg Leu Ser Val Asp Cys Asn Val Val
        515                 520                 525
gag ccg gcc gac gtg aag aag gtg gtg acc acc ctg aag cgc gcc gtc      1632
Glu Pro Ala Asp Val Lys Lys Val Val Thr Thr Leu Lys Arg Ala Val
    530                 535                 540
aag gtc gtc ggc acg cca gcc tac cat gag atg gtc aag aac tgc atg      1680
Lys Val Val Gly Thr Pro Ala Tyr His Glu Met Val Lys Asn Cys Met
545                 550                 555                 560
atc cag gat ctc tcc tgg aag ggg cca gcc aag aac tgg gag gac gtg      1728
Ile Gln Asp Leu Ser Trp Lys Gly Pro Ala Lys Asn Trp Glu Asp Val
                565                 570                 575
ctt ctg gaa ctg ggg gtc gag ggg agc gag cca ggg gtc atc ggc gag      1776
Leu Leu Glu Leu Gly Val Glu Gly Ser Glu Pro Gly Val Ile Gly Glu
            580                 585                 590
gag att gcg ccg ctc gcc atg gag aac gtc gcc gct ccc tga              1818
Glu Ile Ala Pro Leu Ala Met Glu Asn Val Ala Ala Pro
        595                 600                 605
<210>10
<211>605
<212>PRT
<213>普通小麦
<400>10
Met Ala Ala Leu Val Thr Ser Gln Leu Ala Thr Ser Gly Thr Val Leu
1               5                   10                  15
Gly Ile Thr Asp Arg Phe Arg Arg Ala Gly Phe Gln Gly Val Arg Pro
            20                  25                  30
Arg Ser Pro Ala Asp Ala Pro Leu Gly Met Arg Thr Thr Gly Ala Ser
        35                  40                  45
Ala Ala Pro Lys Gln Gln Ser Arg Lys Ala His Arg Gly Thr Arg Arg
    50                  55                  60
Cys Leu Ser Met Val Val Arg Ala Thr Gly Ser Ala Gly Met Asn Leu
65                  70                  75                  80
Val Phe Val Gly Ala Glu Met Ala Pro Trp Ser Lys Thr Gly Gly Leu
                85                  90                  95
Gly Asp Val Leu Gly Gly Leu Pro Pro Ala Met Ala Ala Asn Gly His
            100                 105                 110
Arg Val Met Val Ile Ser Pro Arg Tyr Asp Gln Tyr Lys Asp Ala Trp
        115                 120                 125
Asp Thr Ser Val Val Ser Glu Ile Lys Val Ala Asp Glu Tyr Glu Arg
    130                 135                 140
Val Arg Tyr Phe His Cys Tyr Lys Arg Gly Val Asp Arg Val Phe Val
145                 150                 155                 160
Asp His Pro Cys Phe Leu Glu Lys Val Arg Gly Lys Thr Lys Glu Lys
                165                 170                 175
Ile Tyr Gly Pro Asp Ala Gly Thr Asp Tyr Glu Asp Asn Gln Leu Arg
            180                 185                 190
Phe Ser Leu Leu Cys Gln Ala Ala Leu Glu Ala Pro Arg Ile Leu Asp
        195                 200                 205
Leu Asn Asn Asn Pro Tyr Phe Ser Gly Pro Tyr Gly Glu Asp Val Val
    210                 215                 220
Phe Val Cys Asn Asp Trp His Thr Gly Leu Leu Ala Cys Tyr Leu Lys
225                 230                 235                 240
Ser Asn Tyr Gln Ser Ser Gly Ile Tyr Arg Thr Ala Lys Val Ala Phe
                245                 250                 255
Cys Ile His Asn Ile Ser Tyr Gln Gly Arg Phe Ser Phe Asp Asp Phe
            260                 265                 270
Ala Gln Leu Asn Leu Pro Asp Arg Phe Lys Ser Ser Phe Asp Phe Ile
        275                 280                 285
Asp Gly Tyr Asp Lys Pro Val Glu Gly Arg Lys Ile Asn Trp Met Lys
    290                 295                 300
Ala Gly Ile Leu Gln Ala Asp Lys Val Leu Thr Val Ser Pro Tyr Tyr
305                 310                 315                 320
Ala Glu Glu Leu Ile Ser Gly Glu Ala Arg Gly Cys Glu Leu Asp Asn
                325                 330                 335
Ile Met Arg Leu Thr Gly Ile Thr Gly Ile Val Asn Gly Met Asp Val
            340                 345                 350
Ser Glu Trp Asp Pro Ala Lys Asp Lys Phe Leu Ala Ala Asn Tyr Asp
        355                 360                 365
Val Thr Thr Ala Leu Glu Gly Lys Ala Leu Asn Lys Glu Ala Leu Gln
    370                 375                 380
Ala Glu Val Gly Leu Pro Val Asp Arg Lys Val Pro Leu Val Ala Phe
385                 390                 395                 400
Ile Gly Arg Leu Glu Glu Gln Lys Gly Pro Asp Val Met Ile Ala Ala
                405                 410                 415
Ile Pro Glu Ile Leu Lys Glu Glu Asp Val Gln Ile Val Leu Leu Gly
            420                 425                 430
Thr Gly Lys Lys Lys Phe Glu Arg Leu Leu Lys Ser Val Glu Glu Lys
        435                 440                 445
Phe Pro Ser Lys Val Arg Ala Val Val Arg Phe Asn Ala Pro Leu Ala
    450                 455                 460
His Gln Met Met Ala Gly Ala Asp Val Leu Ala Val Thr Ser Arg Phe
465                 470                 475                 480
Glu Pro Cys Gly Leu Ile Gln Leu Gln Gly Met Arg Tyr Gly Thr Pro
                485                 490                 495
Cys Ala Cys Ala Ser Thr Gly Gly Leu Val Asp Thr Ile Met Glu Gly
            500                 505                 510
Lys Thr Gly Phe His Met Gly Arg Leu Ser Val Asp Cys Asn Val Val
        515                 520                 525
Glu Pro Ala Asp Val Lys Lys Val Val Thr Thr Leu Lys Arg Ala Val
    530                 535                 540
Lys Val Val Gly Thr Pro Ala Tyr His Glu Met Val Lys Asn Cys Met
545                 550                 555                 560
Ile Gln Asp Leu Ser Trp Lys Gly Pro Ala Lys Asn Trp Glu Asp Val
                565                 570                 575
Leu Leu Glu Leu Gly Val Glu Gly Ser Glu Pro Gly Val Ile Gly Glu
            580                 585                 590
Glu lle Ala Pro Leu Ala Met Glu Asn Val Ala Ala Pro
        595                 600                 605
<210>11
<211>1818
<212>DNA
<213>玉米(Zea mays)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1815)
<400>11
atg gcg gct ctg gcc acg tcg cag ctc gtc gca acg cgc gcc ggc ctg       48
Met Ala Ala Leu Ala Thr Ser Gln Leu Val Ala Thr Arg Ala Gly Leu
1               5                   10                  15
ggc gtc ccg gac gcg tcc acg ttc cgc cgc ggc gcc gcg cag ggc ctg       96
Gly Val Pro Asp Ala Ser Thr Phe Arg Arg Gly Ala Ala Gln Gly Leu
            20                  25                  30
agg ggg gcc cgg gcg tcg gcg gcg gcg gac acg ctc agc atg egg acc       144
Arg Gly Ala Arg Ala Ser Ala Ala Ala Asp Thr Leu Ser Met Arg Thr
        35                  40                  45
agc gcg cgc gcg gcg ccc agg cac cag cag cag gcg cgc cgc ggg ggc       192
Ser Ala Arg Ala Ala Pro Arg His Gln Gln Gln Ala Arg Arg Gly Gly
    50                  55                  60
agg ttc ccg tcg ctc gtc gtg tgc gcc agc gcc ggc atg aac gtc gtc       240
Arg Phe Pro Ser Leu Val Val Cys Ala Ser Ala Gly Met Asn Val Val
65                  70                  75                  80
ttc gtc ggc gcc gag atg gcg ccg tgg agc aag acc ggc ggc ctc ggc       288
Phe Val Gly Ala Glu Met Ala Pro Trp Ser Lys Thr Gly Gly Leu Gly
                85                  90                  95
gac gtc ctc ggc ggc ctg ccg ccg gcc atg gcc gcg aac ggg cac cgt       336
Asp Val Leu Gly Gly Leu Pro Pro Ala Met Ala Ala Asn Gly His Arg
                100                 105                 110
gtc atg gtc gtc tct ccc cgc tac gac cag tac aag gac gcc tgg gac       384
Val Met Val Val Ser Pro Arg Tyr Asp Gln Tyr Lys Asp Ala Trp Asp
            115                 120                 125
acc agc gtc gtg tcc gag atc aag atg gga gac ggg tac gag acg gtc       432
Thr Ser Val Val Ser Glu Ile Lys Met Gly Asp Gly Tyr Glu Thr Val
    130                 135                 140
agg ttc ttc cac tgc tac aag cgc gga gtg gac cgc gtg ttc gtt gac       480
Arg Phe Phe His Cys Tyr Lys Arg Gly Val Asp Arg Val Phe Val Asp
145                 150                 155                 160
cac cca ctg ttc ctg gag agg gtt tgg gga aag acc gag gag aag atc       528
His Pro Leu Phe Leu Glu Arg Val Trp Gly Lys Thr Glu Glu Lys Ile
                165                 170                 175
tac ggg cct gtc gct gga acg gac tac agg gac aac cag ctg cgg ttc       576
Tyr Gly Pro Val Ala Gly Thr Asp Tyr Arg Asp Asn Gln Leu Arg Phe
            180                 185                 190
agc ctg cta tgc cag gca gca ctt gaa gct cca agg atc ctg agc ctc       624
Ser Leu Leu Cys Gln Ala Ala Leu Glu Ala Pro Arg Ile Leu Ser Leu
        195                 200                 205
aac aac aac cca tacttc tcc gga cca tac ggg gag gac gtc gtg ttc       672
Asn Asn Asn Pro Tyr Phe Ser Gly Pro Tyr Gly Glu Asp Val Val Phe
    210                 215                 220
gtc tgc aac gac tgg cac acc ggc cct ctc tcg tgc tac ctc aag agc      720
Val Cys Asn Asp Trp His Thr Gly Pro Leu Ser Cys Tyr Leu Lys Ser
22                 5230                 235                 240
aac tac cag tcc cac ggc atc tac agg gac gca aag acc gct ttc tgc      768
Asn Tyr Gln Ser His Gly Ile Tyr Arg Asp Ala Lys Thr Ala Phe Cys
                245                 250                 255
atc cac aac atc tcc tac cag ggc cgg ttc gcc ttc tcc gac tac ccg      816
Ile His Asn Ile Ser Tyr Gln Gly Arg Phe Ala Phe Ser Asp Tyr Pro
            260                 265                 270
gag ctg aac ctc ccg gag aga ttc aag tcg tcc ttc gat ttc atc gac      864
Glu Leu Asn Leu Pro Glu Arg Phe Lys Ser Ser Phe Asp Phe Ile Asp
        275                 280                 285
ggc tac gag aag ccc gtg gaa ggc cgg aag atc aac tgg atg aag gcc      912
Gly Tyr Glu Lys Pro Val Glu Gly Arg Lys Ile Asn Trp Met Lys Ala
    290                 295                 300
ggg atc ctc gag gcc gac agg gtc ctc acc gtc agc ccc tac tac gcc      960
Gly Ile Leu Glu Ala Asp Arg Val Leu Thr Val Ser Pro Tyr Tyr Ala
305                 310                 315                 320
gag gag ctc atc tcc ggc atc gcc agg ggc tgc gag ctc gac aac atc      1008
Glu Glu Leu Ile Ser Gly Ile Ala Arg Gly Cys Glu Leu Asp Asn Ile
                325                 330                 335
atg cgc ctc acc ggc atc acc ggc atc gtc aac ggc atg gac gtc agc      1056
Met Arg Leu Thr Gly Ile Thr Gly Ile Val Asn Gly Met Asp Val Ser
            340                 345                 350
gag tgg gac ccc agc agg gac aag tac atc gcc gtg aag tac gac gtg      1104
Glu Trp Asp Pro Ser Arg Asp Lys Tyr lle Ala Val Lys Tyr Asp Val
        355                 360                 365
tcg acg gcc gtg gag gcc aag gcg ctg aac aag gag gcg ctg cag gcg      1152
Ser Thr Ala Val Glu Ala Lys Ala Leu Asn Lys Glu Ala Leu Gln Ala
    370                 375                 380
gag gtc ggg ctc ccg gtg gac cgg aac atc ccg ctg gtg gcg ttc atc      1200
Glu Val Gly Leu Pro Val Asp Arg Asn Ile Pro Leu Val Ala Phe Ile
385                 390                 395                 400
ggc agg ctg gaa gag cag aag ggc ccc gac gtc atg gcg gcc gcc atc      1248
Gly Arg Leu Glu Glu Gln Lys Gly Pro Asp Val Met Ala Ala Ala Ile
                405                 410                 415
ccg cag ct c atg gag atg gtg gag gac gtg cag atc gtt ctg ctg ggc     1296
Pro Gln Leu Met Glu Met Val Glu Asp Val Gln Ile Val Leu Leu Gly
            420                 425                 430
acg ggc aag aag aag ttc gag cgc atg ctc atg agc gcc gag gag aag      1344
Thr Gly Lys Lys Lys Phe Glu Arg Met Leu Met Ser Ala Glu Glu Lys
        435                 440                 445
ttc cca ggc aag gtg cgc gcc gtg gtc aag ttc aac gcg gcg ctg gcg      1392
Phc Pro Gly Lys Val Arg Ala Val Val Lys Phe Asn Ala Ala Leu Ala
    450                 455                 460
cac cac atc atg gcc ggc gcc gac gtg ctc gcc gtc acc agc cgc ttc      1440
His His Ile Met Ala Gly Ala Asp Val Leu Ala Val Thr Ser Arg Phe
465                 470                 475                 480
gag ccc tgc ggc ctc atc cag ctg cag ggg atg cga tac gga acg ccc      1488
Glu Pro Cys Gly Leu Ile Gln Leu Gln Gly Met Arg Tyr Gly Thr Pro
                485                 490                 495
tgc gcc tgc gcg tcc acc ggt gga ctc gtc gac acc atc atc gaa ggc      1536
Cys Ala Cys Ala Ser Thr Gly Gly Leu Val Asp Thr Ile Ile Glu Gly
            500                 505                 510
aag acc ggg ttc cac atg ggc cgc ctc agc gtc gac tgt aac gtc gtg      1584
Lys Thr Gly Phe His Met Gly Arg Leu Ser Val Asp Cys Asn Val Val
        515                 520                 525
gag ccg gcg gac gtc aag aag gtg gcc acc aca ttg cag cgc gcc atc      1632
Glu Pro Ala Asp Val Lys Lys Val Ala Thr Thr Leu Gln Arg Ala Ile
    530                 535                 540
aag gtg gtc ggc acg ccg gcg tac gag gag atg gtg agg aac tgc atg      1680
Lys Val Val Gly Thr Pro Ala Tyr Glu Glu Met Val Arg Asn Cys Met
545                 550                 555                 560
atc cag gat ctc tcc tgg aag ggc cct gcc aag aac tgg gag aac gtg      1728
Ile Gln Asp Leu Ser Trp Lys Gly Pro Ala Lys Asn Trp Glu Asn Val
                565                 570                 575
ctg ctc agc ctc ggg gtc gcc ggc ggc gag cca ggg gtc gaa ggc gag      1776
Leu Leu Ser Leu Gly Val Ala Gly Gly Glu Pro Gly Val Glu Gly Glu
            580                 585                 590
gag atc gcg ccg ctc gcc aag gag aac gtg gcc gcg ccc tga              1818
Glu Ile Ala Pro Leu Ala Lys Glu Asn Val Ala Ala Pro
        595                 600                 605
<210>12
<211>605
<212>PRT
<213>玉米
<400>12
Met Ala Ala Leu Ala Thr Ser Gln Leu Val Ala Thr Arg Ala Gly Leu
1               5                   10                  15
Gly Val Pro Asp Ala Ser Thr Phe Arg Arg Gly Ala Ala Gln Gly Leu
            20                  25                  30
Arg Gly Ala Arg Ala Ser Ala Ala Ala Asp Thr Leu Ser Met Arg Thr
        35                  40                  45
Ser Ala Arg Ala Ala Pro Arg His Gln Gln Gln Ala Arg Arg Gly Gly
    50                  55                  60
Arg Phe Pro Ser Leu Val Val Cys Ala Ser Ala Gly Met Asn Val Val
65                  70                  75                  80
Phe Val Gly Ala Glu Met Ala Pro Trp Ser Lys Thr Gly Gly Leu Gly
                85                  90                  95
Asp Val Leu Gly Gly Leu Pro Pro Ala Met Ala Ala Asn Gly His Arg
            100                 105                 110
Val Met Val Val Ser Pro Arg Tyr Asp Gln Tyr Lys Asp Ala Trp Asp
        115                 120                 125
Thr Ser Val Val Ser Glu Ile Lys Met Gly Asp Gly Tyr Glu Thr Val
    130                 135                 140
Arg Phe Phe His Cys Tyr Lys Arg Gly Val Asp Arg Val Phe Val Asp
145                 150                 155                 160
His Pro Leu Phe Leu Glu Arg Val Trp Gly Lys Thr Glu Glu Lys Ile
                165                 170                 175
Tyr Gly Pro Val Ala Gly Thr Asp Tyr Arg Asp Asn Gln Leu Arg Phe
            180                 185                 190
Ser Leu Leu Cys Gln Ala Ala Leu Glu Ala Pro Arg Ile Leu Ser Leu
        195                 200                 205
Asn Asn Asn Pro Tyr Phe Ser Gly Pro Tyr Gly Glu Asp Val Val Phe
    210                 215                 220
Val Cys Asn Asp Trp His Thr Gly Pro Leu Ser Cys Tyr Leu Lys Ser
225                 230                 235                 240
Asn Tyr Gln Ser His Gly Ile Tyr Arg Asp Ala Lys Thr Ala Phe Cys
                245                 250                 255
Ile His Asn Ile Ser Tyr Gln Gly Arg Phe Ala Phe Ser Asp Tyr Pro
            260                 265                 270
Glu Leu Asn Leu Pro Glu Arg Phe Lys Ser Ser Phe Asp Phe Ile Asp
        275                 280                 285
Gly Tyr Glu Lys Pro Val Glu Gly Arg Lys Ile Asn Trp Met Lys Ala
    290                 295                 300
Gly Ile Leu Glu Ala Asp Arg Val Leu Thr Val Ser Pro Tyr Tyr Ala
305                 310                 315                 320
Glu Glu Leu Ile Ser Gly Ile Ala Arg Gly Cys Glu Leu Asp Asn Ile
                325                 330                 335
Met Arg Leu Thr Gly Ile Thr Gly Ile Val Asn Gly Met Asp Val Ser
            340                 345                 350
Glu Trp Asp Pro Ser Arg Asp Lys Tyr Ile Ala Val Lys Tyr Asp Val
        355                 360                 365
Ser Thr Ala Val Glu Ala Lys Ala Leu Asn Lys Glu Ala Leu Gln Ala
    370                 375                 380
Glu Val Gly Leu Pro Val Asp Arg Asn Ile Pro Leu Val Ala Phe Ile
385                 390                 395                 400
Gly Arg Leu Glu Glu Gln Lys Gly Pro Asp Val Met Ala Ala Ala Ile
                405                 410                 415
Pro Gln Leu Met Glu Met Val Glu Asp Val Gln Ile Val Leu Leu Gly
            420                 425                 430
Thr Gly Lys Lys Lys Phe Glu Arg Met Leu Met Ser Ala Glu Glu Lys
        435                 440                 445
Phe Pro Gly Lys Val Arg Ala Val Val Lys Phe Ash Ala Ala Leu Ala
    450                 455                 460
His His Ile Met Ala Gly Ala Asp Val Leu Ala Val Thr Ser Arg Phe
465                 470                 475                 480
Glu Pro Cys Gly Leu Ile Gln Leu Gln Gly Met Arg Tyr Gly Thr Pro
                485                 490                 495
Cys Ala Cys Ala Ser Thr Gly Gly Leu Val Asp Thr Ile Ile Glu Gly
            500                 505                 510
Lys Thr Gly Phe His Met Gly Arg Leu Ser Val Asp Cys Asn Val Val
        515                 520                 525
Glu Pro Ala Asp Val Lys Lys Val Ala Thr Thr Leu Gln Arg Ala Ile
    530                 535                 540
Lys Val Val Gly Thr Pro Ala Tyr Glu Glu Met Val Arg Asn Cys Met
545                 550                 555                 560
Ile Gln Asp Leu Ser Trp Lys Gly Pro Ala Lys Asn Trp Glu Asn Val
                565                 570                 575
Leu Leu Ser Leu Gly Val Ala Gly Gly Glu Pro Gly Val Glu Gly Glu
            580                 585                 590
Glu Ile Ala Pro Leu Ala Lys Glu Asn Val Ala Ala Pro
        595                 600                 605

Claims (21)

1.经遗传修饰的单子叶植物细胞，其淀粉具有小于5％重量的表观直链淀粉含量，并且与相应的非遗传修饰野生型植物细胞相比较，其额外地具有具备淀粉合酶II酶活性的蛋白质提高的活性和具备葡聚糖/水双激酶酶活性的蛋白质提高的活性。
2.如权利要求1所述的经遗传修饰的单子叶植物细胞，其中所述遗传修饰在于将至少一种外源核酸分子导入该植物的基因组。
3.如权利要求1或2所述的经遗传修饰的单子叶植物细胞，与分离自相应的非遗传修饰野生型植物细胞的淀粉相比较，其合成改性的淀粉。
4.如权利要求1、2或3中任一项所述的经遗传修饰的单子叶植物细胞，其合成热水溶胀力提高的淀粉。
5.如权利要求4所述的经遗传修饰的单子叶植物细胞，其淀粉具有60至100g/g的提高的热水溶胀力。
6.单子叶植物，其包含如权利要求1至5中任一项所述的经遗传修饰的植物细胞。
7.如权利要求6所述的单子叶植物，其选自稻、玉米和小麦。
8.如权利要求6或7所述的单子叶植物的繁殖材料，其包含如权利要求1至5中任一项所述的经遗传修饰的植物细胞。
9.产生经遗传修饰的单子叶植物的方法，其中
a)遗传修饰植物细胞，所述的遗传修饰包括以下步骤i至iii：
i)将遗传修饰导入植物细胞，其中与相应的非遗传修饰野生型植物细胞相比较，所述的遗传修饰导致具备淀粉合酶II活性的蛋白质的活性提高，
ii)将遗传修饰导入植物细胞，其中与相应的非遗传修饰野生型植物细胞相比较，所述的遗传修饰导致具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质的活性提高，
iii)将遗传修饰导入植物细胞，其中与相应的非遗传修饰野生型植物细胞相比较，所述的遗传修饰导致具有GBSSI活性的蛋白质的活性降低，
其中步骤i至iii可以按照任意所需顺序、各自地或作为步骤i至iii的任意所需组合同时地实施，
b)从步骤a)的植物细胞再生出植物；
c)根据需要，借助步骤b)的植物产生进一步的植物，其中根据需要，将植物细胞从根据步骤b)或c)的植物分离并且重复步骤a)至c)，直至已经产生下述植物，所述植物具有与相应的非遗传修饰野生型植物细胞相比较具备淀粉合酶II活性的蛋白质提高的活性，和与相应的非遗传修饰野生型植物细胞相比较具备葡聚糖/水双激酶活性的蛋白质提高的活性以及与相应的非遗传修饰野生型植物细胞相比较具备GBSSI活性的蛋白质降低的活性。
10.用于制备改性淀粉的方法，包括从如权利要求1至5中任一项所述的经遗传修饰的植物细胞、如权利要求6或7所述的植物、如权利要求8所述的繁殖材料或通过如权利要求9所述方法能够获得的植物提取淀粉的步骤。
11.权利要求6或7所述的植物的部分、权利要求8所述的繁殖材料、或通过权利要求9所述方法能够获得的植物的用途，用于制备淀粉。
12.改性淀粉，其能够通过权利要求10所述的方法获得。
13.如权利要求12所述的改性淀粉，与分离自相应的非遗传修饰单子叶野生型植物的淀粉相比较，其具有小于5％重量的表观直链淀粉含量和60至100g/g的提高的热溶胀力。
14.用于制备衍生淀粉的方法，其中权利要求12或13所述的改性淀粉随后被衍生化。
15.衍生淀粉，其能够通过权利要求14所述的方法获得。
16.如权利要求12或13所述的改性淀粉的用途，用于制备衍生淀粉。
17.面粉，其包含能够通过权利要求10所述方法获得的改性淀粉或包含权利要求12或13所述的改性淀粉。
18.用于制备面粉的方法，包括步骤：研磨权利要求6或7所述的植物的部分、权利要求8所述的繁殖材料的部分、或通过权利要求9所述方法能够获得的植物的部分。
19.如权利要求1至5中任一项所述经遗传修饰的单子叶植物细胞、如权利要求6或7所述的单子叶植物、如权利要求8所述的繁殖材料或通过权利要求9所述方法能够获得的单子叶植物的用途，用于产生面粉。
20.产品，其包含如权利要求10、12、13或15中任一项所述的淀粉。
21.产品，其包含如权利要求17中所述的面粉。
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