KR101525144B1 - 신규 철·아연 결합성 제어 인자와, 그 발현 조절에 의한 식물의 철 결핍 내성 향상 및 가식부에의 철·아연 축적의 촉진 기술 - Google Patents

Abstract

본 발명에 의해, 석회질 토양에 있어서 통상의 식물보다 우수한 생육을 나타내고, 석회질 토양 및 우량 토양의 쌍방에 있어서 철 및 아연을 다량으로 축적할 수 있는 형질전환체 및 유전자 파괴주, 및 이들을 작출하기 위해서 사용되는 유전자, 벡터, 단백질, 항체, 철 결핍 내성 및 가식부에의 철·아연 축적이 향상된 식물의 작출 방법·작출용 조성물·작출용 키트·육종 방법이 제공된다. 본 발명의 단백질은 이하의 (a)∼(c) 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 철·아연 결합성 제어 인자인 것을 특징으로 한다.
(a) 서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산 서열,
(b) 서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산 서열에 있어서 1∼수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되어 있는 아미노산 서열,
(c) 서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산 서열과 동일성이 80% 이상인 아미노산 서열.

Description

신규 철·아연 결합성 제어 인자와, 그 발현 조절에 의한 식물의 철 결핍 내성 향상 및 가식부에의 철·아연 축적의 촉진 기술{NOVEL IRON-ZINC BINDING CONTROL FACTOR, AND TECHNIQUE FOR IMPROVING IRON DEFICIENCY TOLERANCE OF PLANT AND ENHANCING IRON AND ZINC ACCUMULATION IN EDIBLE PART THEREOF BY CONTROLLING EXPRESSION OF NOVEL IRON-ZINC BINDING CONTROL FACTOR}

본 발명은 식물의 철 결핍 내성의 향상 및 가식부에의 철·아연 축적의 촉진에 관한 것이다. 상세하게는 식물의 철 결핍 내성 및 가식부에의 철·아연 축적을 제어하는 작용을 갖는 단백질, 유전자, 벡터, 형질전환체, 유전자 파괴주, 항체, 철 결핍 내성 및 가식부에의 철·아연 축적이 향상된 식물의 작출 방법, 철 결핍 내성 및 가식부에의 철·아연 축적이 향상된 식물의 작출용 조성물, 철 결핍 내성 및 가식부에의 철·아연 축적이 향상된 식물의 작출용 키트, 및 철 결핍 내성 및 가식부에의 철·아연 축적이 향상된 식물의 육종 방법에 관한 것이다.

본원은 2012년 7월 26일에 일본에 출원된 특허출원 2012-166233호에 기초해서 우선권을 주장하고, 그 내용을 여기에 인용한다.

식물이 생육하고 탄소 고정과 물질 생산을 행하기 위해서는 철과 아연이 필요하다. 식물은 토양 중의 철 및 아연을 흡수함으로써 이들을 이용한다.

그렇지만, 세계의 토양의 대략 30%를 차지하고 있는 석회질 알칼리 토양에서는 가용화한 철 및 아연이 적고, 그 중에서도 가용화한 철이 극히 적다. 따라서, 석회질 알칼리 토양에서의 식물의 생육에 있어서 철 결핍이 주요한 제한 요인이 되고 있다.

그 때문에, 석회질 알칼리 토양을 비롯한 불량 토양에 있어서도 양호하게 생육하는 식물의 취득이 급무이다.

또한, 토양으로부터 철 및 아연을 흡수한 식물은 인간의 주요한 미네랄 공급원이다. 철 결핍증 및 아연 결핍증은 전세계 사람들, 특히 아이나 여성에 있어서 심각한 문제가 되고 있기 때문에, 가식부에 많은 철 및 아연을 포함하는 식물의 취득이 기대되고 있다.

최근, 철 및 아연(특히 철)의 흡수와 이용에 관여하는 유전자의 동정 및 해석이 진행되고 있다. 그 유전자를 개변해서 식물에 도입함으로써, 철 및 아연의 결핍 내성이 향상된 식물, 또는 가식부에 많은 철 및 아연을 축적하는 식물이 취득되고 있다(예를 들면, 비특허문헌 1∼11 참조).

Takahashi, M., et. al., Nature Biotech., (2001) vol.19, pp.466-469. Ishimaru, Y., et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (2007) vol.104, pp.7373-7378. Suzuki, M., et. al., Soil Sci. Plant Nutr., (2008) vol.54, pp.77-85. Ogo, Y., et. al., Plant Mol. Biol., (2011) vol.75, pp.593-605. Goto, F., et. al., Nature Biotech., (1999) vol.17, pp.282-286. Uauy, C., et. al., Science, (2006) vol.314, pp.1298-1301. Masuda, H., et. al., Rice, (2008) vol.1, pp.100-108. Masuda, H., et. al., Rice, (2009) vol.2, pp.155-166. Lee, S., et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (2009) vol.106, pp.22014-22019. Wirth, J., et. al., Plant Biotech. J., (2009) vol.7, pp.1-14. Ishimaru, Y., et. al., Plant J., (2010) vol.62, pp.379-390.

그렇지만, 석회질 토양에 있어서 우량 토양에 있어서의 생육과 같은 정도나 그 이상의 생육을 나타내는 식물은 취득되어 있지 않다. 또한, 석회질 토양 및 우량 토양의 쌍방에 있어서, 철 및/또는 아연을 다량으로(예를 들면, 종래의 2배량 이상) 축적할 수 있는 식물은 취득되어 있지 않다.

따라서, 이러한 성질을 갖는 식물을 취득한다고 하는 점에서는 아직 개량의 여지가 있었다.

본 발명은 상기 사정을 감안하여 이루어진 것이며, 석회질 토양에 있어서 통상의 식물보다 우수한 생육을 나타내고, 석회질 토양 및 우량 토양의 쌍방에 있어서 철 및 아연을 가식부에 다량으로 축적할 수 있는 형질전환체 및 유전자 파괴주, 및 이들을 작출하기 위해서 사용되는 유전자, 벡터, 단백질, 항체, 철 결핍 내성 및 가식부에의 철·아연 축적이 향상된 식물의 작출 방법, 철 결핍 내성 및 가식부에의 철·아연 축적이 향상된 식물의 작출용 조성물, 철 결핍 내성 및 가식부에의 철·아연 축적이 향상된 식물의 작출용 키트, 및 철 결핍 내성 및 가식부에의 철·아연 축적이 향상된 식물의 육종 방법을 제공한다. 가식부란, 예를 들면 식물의 종자, 지상부, 줄기잎, 뿌리 등을 들 수 있지만, 식용, 사료용으로서 가식인 부분이면 반드시 이들 부분에 한정되지 않는다. 또한, 상기 식물이 벼일 경우, 종자에 상당하는 부분으로서 현미나, 이것을 정미한 배아미, 도정미, 백미 등을 들 수 있다.

본 발명자들은 상기 과제를 해결하도록 예의연구한 결과, 식물의 철 결핍 응답을 억제하는 작용을 갖는 단백질을 찾아냈다. 그 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 억제한 식물을 작출함으로써, 식물의 철 결핍 내성 및 가식부에의 철·아연 축적을 향상시킬 수 있는 것을 발견하고, 본 발명을 완성시켰다.

즉, 본 발명은 하기의 특징을 갖는 단백질, 유전자, 벡터, 형질전환체, 유전자 파괴주, 항체, 철 결핍 내성 및 가식부에의 철·아연 축적이 향상된 식물의 작출 방법, 철 결핍 내성 및 가식부에의 철·아연 축적이 향상된 식물의 작출용 조성물, 철 결핍 내성 및 가식부에의 철·아연 축적이 향상된 식물의 작출용 키트, 및 철 결핍 내성 및 가식부에의 철·아연 축적이 향상된 식물의 육종 방법을 제공하는 것이다.

(1) 이하의 (a)∼(c) 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 철·아연 결합성 제어 인자인 것을 특징으로 하는 단백질.

(a) 서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산 서열,

(b) 서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산 서열에 있어서 1∼수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되어 있는 아미노산 서열, 또는

(c) 서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산 서열과 동일성이 80% 이상인 아미노산 서열

(2) 상기 (1)의 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 하는 유전자.

(3) 이하의 (d)∼(g) 중 어느 하나의 DNA로 이루어지고, 또한 철·아연 결합성 제어 인자인 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 하는 유전자.

(d) 서열번호 3 또는 4로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA,

(e) 서열번호 3 또는 4로 표시되는 염기 서열에 있어서 1∼수 개의 염기가 결실, 치환 또는 부가되어 있는 염기 서열로 이루어지는 DNA,

(f) 서열번호 3 또는 4로 표시되는 염기 서열과 동일성이 80% 이상인 염기 서열로 이루어지는 DNA, 또는

(g) 서열번호 3 또는 4로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA와 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA와 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이징할 수 있는 염기 서열로 이루어지는 DNA

(4) 상기 (2) 또는 (3)의 유전자의 발현을 억제할 수 있는 것을 특징으로 하는 벡터.

(5) 상기 유전자의 발현을 mRNA 레벨에서 억제할 수 있는 RNAi 유도성 핵산을 발현가능한 상기 (4)의 벡터.

(6) 상기 RNAi 유도성 핵산은 서열번호 5로 표시되는 염기 서열인 상기 (5)의 벡터.

(7) 상기 (4)∼(6) 중 어느 하나의 벡터를 숙주에 도입해서 이루어지는 것을 특징으로 하는 형질전환체.

(8) 삽입서열이 도입됨으로써 상기 (2) 또는 (3)의 유전자가 파괴되어 있는 게놈 DNA를 갖는 것을 특징으로 하는 유전자 파괴주.

(9) 상기 (1)의 단백질과 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 항체.

(10) 상기 (4)∼(6) 중 어느 하나의 벡터를 식물에 도입하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 철 결핍 내성 및 가식부에의 철·아연 축적이 향상된 식물의 작출 방법.

(11) 상기 (4)∼(6) 중 어느 하나의 벡터를 구비하고 있는 것을 특징으로 하는 철 결핍 내성 및 가식부에의 철·아연 축적이 향상된 식물의 작출용 조성물.

(12) 상기 (4)∼(6) 중 어느 하나의 벡터를 구비하고 있는 것을 특징으로 하는 철 결핍 내성 및 가식부에의 철·아연 축적이 향상된 식물의 작출용 키트.

(13) 식물로부터의 추출액에 포함되는 상기 (1)의 단백질을 검출하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 철 결핍 내성 및 가식부에의 철·아연 축적이 향상된 식물의 육종 방법.

(14) 식물로부터의 추출액에 포함되는 상기 (2) 또는 (3)의 유전자를 검출하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 철 결핍 내성 및 가식부에의 철·아연 축적이 향상된 식물의 육종 방법.

본 발명에 의하면, 석회질 토양에 있어서 통상의 식물보다 우수한 생육을 나타내고, 석회질 토양 및 우량 토양의 쌍방에 있어서 철 및 아연을 다량으로 축적할 수 있는 형질전환체 및 유전자 파괴주를 작출할 수 있다.

또한, 본 발명에 의하면, 불량 토양에 있어서의 탄산 고정·물질 생산, 및 인간의 철·아연 결핍증의 완화에 공헌할 수 있다.

도 1은 본 발명의 OsHRZ1 단백질 및 OsHRZ2 단백질의 영역 구조를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 유전자 파괴주에 있어서의 게놈 구조를 나타낸다.
도 3은 헤메리트린 영역을 갖는 단백질의 계통수 및 영역 구조를 나타낸다.
도 4는 정량적 RT-PCR을 사용한 OsHRZ1 및 OsHRZ2의 mRNA의 발현 레벨의 해석 결과를 나타낸다.
도 5는 제작한 재조합 단백질의 영역 구조를 나타낸다.
도 6은 야생형 및 변이형 OsHRZ 단백질에 있어서의 금속과의 결합능의 해석 결과를 나타낸다.
도 7은 각 재조합 단백질 용해액을 포함한 튜브의 사진을 나타낸다.
도 8은 OsHRZ2 발현 억제주에 있어서의 정량적 RT-PCR을 사용한 OsHRZ2의 mRNA의 발현 레벨의 해석 결과를 나타낸다.
도 9는 철 결핍 재배 조건하에서의 OsHRZ2 발현 억제주의 최신 잎에 있어서의 클로로필 함량의 정량 결과를 나타낸다.
도 10은 석회질 토양 장기 재배 하에서의 OsHRZ2 발현 억제주의 최신 잎에 있어서의 클로로필 함량의 정량 결과를 나타낸다.
도 11은 석회질 토양 28일간 재배 하에서의 미처리(NT) 벼 및 OsHRZ2 발현 억제주의 모종 길이의 사진을 나타낸다.
도 12는 OsHRZ 파괴주에 있어서의 게놈 PCR의 결과를 나타낸다.
도 13은 철 결핍 재배 조건하에서의 OsHRZ 파괴주의 최신 잎에 있어서의 클로로필 함량의 정량 결과를 나타낸다.
도 14는 철 충분 조건하 및 철 결핍 조건 하에서 7일간 수경 재배를 한 OsHRZ2 발현 억제주의 잎에 있어서의 축적 철 농도를 나타낸다.
도 15는 석회질 토양 중 및 통상의 토양 중에서 포트 재배를 한 OsHRZ2 발현 억제주의 볏짚에 있어서의 축적 철 농도를 나타낸다.
도 16은 석회질 토양 중 및 통상의 토양 중에서 포트 재배를 한 OsHRZ2 발현 억제주의 종자에 있어서의 축적 철 농도를 나타낸다.
도 17은 격리 포장 내의 통상 토양에서 재배한 OsHRZ2 발현 억제주의 현미 및 백미에 있어서의 축적 철 농도를 나타낸다.
도 18은 석회질 토양 중 및 통상의 토양 중에서 포트 재배를 한 OsHRZ2 발현 억제주의 종자에 있어서의 축적 아연 농도를 나타낸다.
도 19는 격리 포장 내의 통상 토양에서 재배한 OsHRZ2 발현 억제주의 현미 및 백미에 있어서의 축적 아연 농도를 나타낸다.
도 20은 통상의 토양 중에서 포트 재배를 한 OsHRZ 파괴주의 종자에 있어서의 축적 철 농도를 나타낸다.
도 21은 통상의 토양 중에서 포트 재배를 한 OsHRZ 파괴주의 종자에 있어서의 축적 아연 농도를 나타낸다.
도 22는 통상의 토양 중에서 포트 재배를 한 OsHRZ 파괴주의 볏짚에 있어서의 축적 철 농도를 나타낸다.
도 23은 통상의 토양 중에서 포트 재배를 한 OsHRZ 파괴주의 볏짚에 있어서의 축적 아연 농도를 나타낸다.
도 24는 철 충분 조건 하 및 철 결핍 조건 하에서 수경 재배된 OsHRZ2 발현 억제주의 뿌리에서의 44K 마이크로어레이를 사용한 유전자 발현 프로파일의 해석 결과를 나타낸다.
도 25는 마이크로어레이 해석에 의해 철 충분 조건 하의 OsHRZ2 발현 억제주의 뿌리에 있어서 발현 상승이 확인된 유전자에 대해서 정량적 RT-PCR을 사용해서 검증한 결과를 나타낸다.

<OsHRZ 단백질>

본 발명의 단백질은 이하의 (a)∼(c) 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 철·아연 결합성 제어 인자이다.

(a) 서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산 서열,

(b) 서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산 서열에 있어서 1∼수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되어 있는 아미노산 서열, 또는

(c) 서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산 서열과 동일성이 80% 이상인 아미노산 서열.

상기 (a)의 아미노산 서열은 서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산 서열이다.

본 발명자는 서열번호 1 및 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 각각 Oryza sativa Hemerythrin motif-containing Really Interesting New Gene(RING)-and Zinc-finger protein(이하, OsHRZ이라고 함)1 및 OsHRZ2이라고 명명했다.

도 1에 나타낸 바와 같이, OsHRZ1은 N말단측으로부터 C말단측에 걸쳐서 3개의 추정 상의 헤메리트린(HHE로서도 알려져 있음) 영역과, 전사 제어·전사 후 제어·단백질 분해 제어 등에 관여한다고 추정되는 2개의 Zn 핑거 영역(CHY 타입 Zn 핑거 영역 및 CTCHY 타입 Zn 핑거 영역)과, E3 리가아제로서 기능해서 단백질 분해 제어에 관여하는 RING-Zn 핑거 영역과, 전자 전달을 위해서 철황 클러스터를 형성한다고 추정되는 루브레독신 타입 모티프를 포함하고 있다.

또한, 도 1에 나타낸 바와 같이, OsHRZ2는 N말단측으로부터 C말단측에 걸쳐서 1개의 헤메리트린 영역과, 3개의 Zn 핑거 영역(CHY 타입 Zn 핑거 영역, CTCHY 타입 Zn 핑거 영역 및 RING-Zn 핑거 영역)과, 루브레독신 타입 모티프를 포함하고 있다.

철 결핍 조건의 재배 하 이들 OsHRZ 단백질을 코딩하는 유전자는 발현 유도된다.

식물 중에서 합성된 OsHRZ 단백질은 헤메리트린 영역을 통해서 철 및 아연과 결합하고, 식물 세포 내의 철과 다른 금속과의 농도비를 검출하는 철 센서로서 기능한다고 생각된다.

또한, OsHRZ1 및 OsHRZ2 단백질은 전사 제어·전사 후 제어·단백질 분해 제어 등에 관여한다고 추정되는 상기 3개의 Zn 핑거 영역을 통해서 철 도입 관련 유전자 및 철 이행 관련 유전자의 발현을 주로 철 충분 조건의 재배 하에서 억제하고 있다.

상기 (b)로서는, 예를 들면 헤메리트린 영역 이외의 부위에 변이(결실, 삽입, 치환, 또는 부가)를 갖는 단백질, 또는 헤메리트린 영역에 있어서의 변이로서 철·아연 결합 활성을 유지하고 있는 변이를 갖는 단백질을 들 수 있다.

또한, 상기 (b)로서는, 예를 들면 전사 제어·전사 후 제어·단백질 분해 제어 등에 관여한다고 추정되는 상기 3개의 Zn 핑거 영역 이외의 부위에 변이를 갖는 단백질, 또는 상기 Zn 핑거 영역에 있어서의 변이로서 철 도입 관련 유전자 및 철 이행 관련 유전자의 발현 억제능을 유지하고 있는 변이를 갖는 단백질을 들 수 있다.

여기에서, 결실, 치환 또는 부가되어도 좋은 아미노산의 수로서는 1∼10개가 바람직하고, 1∼7개가 보다 바람직하고, 1∼5개가 더욱 바람직하고, 1∼3개가 특히 바람직하고, 1∼2개가 가장 바람직하다.

본 발명의 단백질을 구성하는 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 수 개의 아미노산에 변이를 도입하는 것은 주지 기술을 사용해서 용이하게 행해진다.

예를 들면, 공지의 점 변이 도입법에 따르면, 단백질을 코딩하는 유전자 중의 임의의 염기를 변이시킬 수 있다. 또한, 단백질을 코딩하는 유전자 중의 임의의 부위에 대응하는 프라이머를 설계해서 결실 변이체 또는 부가 변이체를 제작할 수 있다.

상기 (c)로서는, 예를 들면 헤메리트린 영역 이외의 부위에 변이(결실, 삽입, 치환 또는 부가)를 갖는 단백질, 또는 헤메리트린 영역에 있어서의 변이로서 철·아연 결합 활성을 유지하고 있는 변이를 갖는 단백질을 들 수 있다.

또한, 상기 (c)로서는, 예를 들면 전사 제어·전사 후 제어·단백질 분해 제어 등에 관여한다고 추정되는 상기 3개의 Zn 핑거 영역 이외의 부위에 변이를 갖는 단백질, 또는 상기 Zn 핑거 영역에 있어서의 변이로서 철 도입 관련 유전자 및 철 이행 관련 유전자의 발현 억제능을 유지하고 있는 변이를 갖는 단백질을 들 수 있다.

여기에서, 서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산 서열과의 상동성(아미노산 서열의 동일성)으로서는 80% 이상이 바람직하고, 85% 이상이 보다 바람직하고, 90% 이상이 더욱 바람직하고, 95% 이상이 특히 바람직하고, 98% 이상이 가장 바람직하다.

본 발명의 단백질을 발현시키기 위해서 사용되는 발현 벡터로서는 숙주 세포에 본 발명의 단백질을 발현시키는 세포계 벡터와, 적당한 세포로부터 추출된 단백질 합성능을 갖는 성분으로 이루어지는 단백질 번역계에 있어서 본 발명의 단백질을 발현시키는 무세포계 벡터를 들 수 있다.

세포계 벡터로서는 숙주 세포에 적합한 공지의 발현 벡터가 사용된다. 예를 들면, 대장균에 있어서는 pBR322 유도체로 대표되는 ColEI계 플러스미드, p15A 오리진을 가지는 pACYC계 플러스미드, pSC계 플러스미드, Bac계 등의 F인자 유래 미니F 플러스미드를 들 수 있다. 그 외, trc나 tac 등의 트립토판 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, T5 프로모터, T3 프로모터, SP6 프로모터, 아라비노스 유도 프로모터, 콜드쇼크 프로모터, 테트라사이클린 유도성 프로모터 등을 갖는 발현 벡터도 들 수 있다.

무세포계 벡터로서는 세포계 벡터에 있어서 열거된 T7 프로모터를 갖는 발현 벡터나 T3 프로모터를 갖는 발현 벡터; SP6 프로모터 또는 T7 프로모터를 갖는 pEU계 플러스미드 등의 소맥 무세포 단백질 합성용 벡터 등을 들 수 있다.

무세포계 벡터를 사용한 단백질 합성에 있어서는 우선 전사계를 사용해서 cDNA를 전사하고 mRNA를 합성한다. 이러한 전사계로서는 RNA 폴리메라아제에 의해 전사시키는 종래 공지의 것을 들 수 있다. RNA 폴리메라아제로서는, 예를 들면 T7RNA 폴리메라아제를 들 수 있다.

그 다음에, 번역계인 무세포 단백질 합성계를 사용해서 mRNA를 번역하고 단백질을 합성한다. 이 계에는 리보솜, 번역 개시 인자, 번역 신장 인자, 해리 인자, 아미노 아실 tRNA 합성 효소 등, 번역에 필요한 요소가 포함되어 있다. 이러한 단백질 번역계로서 대장균 추출액, 토끼 망상 적혈구 추출액, 밀배아 추출액 등을 들 수 있다.

또한, 상기 번역에 필요한 요소가 독립적으로 정제된 인자만으로 이루어지는 재구성형 무세포 단백질 합성계를 들 수 있다.

세포계 벡터 또는 무세포계 벡터를 사용해서 합성된 단백질을 세포소 추출액 중에서 사용할 수도 있지만, 정제해서 사용할 수도 있다. 정제 방법으로서는 염석법이나 각종 크로마토그래피를 사용한 방법을 들 수 있다. 발현 벡터가 목적 단백질의 N말단 또는 C말단에 히스티딘 태그 등의 태그 서열을 발현하도록 설계되어 있을 경우에는 니켈이나 코발트 등, 이 태그에 친화성을 갖는 물질을 사용한 어피니티컬럼에 의한 정제 방법을 들 수 있다. 그 외, 이온교환 크로마토그래피나 겔 여과 크로마토그래피 등을 적당히 조합시켜서 정제함으로써 본 발명의 단백질의 순도를 높일 수 있다.

<OsHRZ 유전자>

본 발명의 유전자는 상기 (a)∼(c) 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 철·아연 결합성 제어 인자인 단백질을 코딩한다.

또한, 본 발명의 유전자는 이하의 (d)∼(g) 중 어느 하나의 DNA로 이루어지고, 또한 철·아연 결합성 제어 인자인 단백질을 코딩한다.

(d) 서열번호 3 또는 4로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA,

(e) 서열번호 3 또는 4로 표시되는 염기 서열에 있어서 1∼수 개의 염기가 결실, 치환 또는 부가되어 있는 염기 서열로 이루어지는 DNA,

(f) 서열번호 3 또는 4로 표시되는 염기 서열과 상동성(염기 서열의 동일성)이 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 98% 이상인 염기 서열로 이루어지는 DNA, 또는

(g) 서열번호 3 또는 4로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA와 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA와 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이징할 수 있는 염기 서열로 이루어지는 DNA.

여기에서, 결실, 치환 또는 부가되어도 좋은 염기의 수로서는 1∼30개가 바람직하고, 1∼20개가 보다 바람직하고, 1∼15개가 더욱 바람직하고, 1∼10개가 특히 바람직하고, 1∼5개가 가장 바람직하다.

본 발명 및 본원명세서에 있어서, 「스트린젠트한 조건 하」란, 예를 들면 Molecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION(Sambrook 외, Cold Spring Harbor Laboratory Press)에 기재된 방법을 들 수 있다. 예를 들면, 5×SSC(20×SSC의 조성: 3M 염화나트륨, 0.3M 시트르산 용액, pH 7.0), 0.1중량％ N-라우로일사르코신, 0.02중량%의 SDS, 2중량%의 핵산 하이브리다이제이션용 블록킹 시약, 및 50% 포름아미드로 이루어지는 하이브리다이제이션 버퍼 중에서 55∼70℃에서 수 시간 내지 밤새 인큐베이션을 행함으로써 하이브리다이징시키는 조건을 들 수 있다. 인큐베이션 후 세정 시에 사용하는 세정 버퍼로서는 바람직하게는 0.1중량% SDS 함유 1×SSC 용액, 보다 바람직하게는 0.1중량% SDS 함유 0.1×SSC 용액이다.

<OsHRZ 유전자 발현 억제 벡터>

본 발명의 벡터는 상술한 본 발명의 유전자의 발현을 억제할 수 있는 것이다. 상기 유전자의 발현을 mRNA 레벨에서 억제할 수 있는 RNAi 유도성 핵산을 발현가능한 것이 바람직하다.

RNAi 유도성 핵산이란 식물 세포 내에 도입됨으로써 RNA 간섭을 유도할 수 있는 핵산을 의미한다. RNA 간섭이란 mRNA(또는 그 부분 서열)에 상보하는 염기 서열을 포함하는 RNA가 그 mRNA의 발현을 억제하는 효과를 말한다.

RNAi 유도성 핵산이 표적으로 하는 mRNA는 코딩 영역이어도, 논코딩 영역이어도 좋다. 상기 RNAi 유도성 핵산으로서는 서열번호 5로 표시되는 염기 서열인 것이 바람직하고, 이 RNAi 유도성 핵산은 OsHRZ의 3' UTR(untranslated region) 전장 및 코딩 영역의 일부를 표적으로 한다.

또한, RNAi 유도성 핵산으로서는, 예를 들면 siRNA나 miRNA를 들 수 있다. 식물 세포 내에 도입되어 siRNA와 마찬가지로 RNAi를 발생시키는 벡터로서는 shRNA(short hairpin RNA/small hairpin RNA) 발현 벡터를 들 수 있다.

본 발명의 벡터에 의하면, 식물의 철 결핍 내성 및 철·아연 축적을 향상시킬 수 있다.

여기에서, 「식물의 철 결핍 내성」이란, 가용화된 철분이 적은 토양에서도 생육할 수 있는 특성을 의미하고, 예를 들면 알칼리 토양에 있어서 클로로시스(클로로필의 결함에 의한 황색화)이라고 칭하는 철 결핍증을 일으키기 어려운 등의 특성을 의미한다.

또한, 「철·아연 축적」이란, 벼의 지상부, 특히 가식부인 종자 중에 고농도의 철 및 아연을 축적할 수 있는 특성을 의미한다. 예를 들면, 상기 벡터를 사용해서 작출된 형질전환체를 격리 포장(소정의 절차에 근거해서 형성된 유전자 재조합용 격리 포장을 의미함) 내의 통상 토양에서 재배해서 얻어진 종자는 미처리 벼의 종자와 비교해서 약 3.8배량의 철을 함유하고, 약 1.2배량의 아연을 함유한다.

본 발명의 벡터는 주지의 유전자 재조합 기술에 의해 제작해도 좋다.

<형질전환체, 및 철 결핍 내성 및 철·아연 축적이 향상된 식물의 작출 방법>

본 발명의 형질전환체(발현 억제주이라고도 하는 경우도 있음)는 본 발명의 벡터를 숙주에 도입해서 이루어지는 것이다. 상술한 바와 같이, 본 발명의 벡터는 숙주인 식물의 철 결핍 내성 및 철·아연 축적을 향상시킬 수 있는 것이다. 따라서, 본 발명의 형질전환체는 철 결핍 내성이 우수하고, 또한 특히 가식부에 고농도의 철·아연을 축적할 수 있다.

또한, 본 발명의 철 결핍 내성 및 철·아연 축적이 향상된 식물의 작출 방법이란, 철 결핍 내성 및 철·아연 축적이 향상된 식물체를 제작하기 위한 방법을 의미한다. 본 발명의 철 결핍 내성 및 철·아연 축적이 향상된 식물의 작출 방법은 본 발명의 벡터를 식물체 내에 도입하는 공정을 포함하고 있으면 특별히 한정되지 않는다.

재조합 발현 벡터를 사용할 경우, 식물체의 형질전환에 사용되어야 할 벡터는 그 식물 내에서 본 발명의 유전자의 발현을 억제시키는 것이 가능한 벡터이면 특별히 한정되지 않는다.

이러한 벡터로서는, 예를 들면 콜리플라워 모자이크 바이러스의 35S 프로모터 등의 식물 세포 내에서 유전자를 구성적으로 발현시키는 프로모터를 갖는 벡터; 외적인 자극에 의해 유도성이 활성화되는 프로모터를 갖는 벡터를 들 수 있다.

본 발명에 있어서 형질전환의 대상이 되는 식물은 식물체 전체, 식물 기관(예를 들면 잎, 꽃잎, 줄기, 뿌리, 종자 등), 식물 조직(예를 들면 표피, 체관부, 유조직, 목부, 관다발, 책상 조직, 해면상 조직 등) 또는 식물 배양 세포, 또는 각종 형태의 식물 세포(예를 들면, 현탁 배양 세포), 프로토플라스트, 잎의 절편, 캘러스 등의 모두를 의미한다. 형질전환에 사용되는 식물로서는 특별히 한정되지 않지만, 벼과 식물인 것이 바람직하고, 벼, 보리, 밀 또는 옥수수인 것이 더욱 바람직하다.

식물로의 유전자의 도입에는 당업자에게 공지된 형질전환 방법(예를 들면, 아그로박테리움법, 유전자총, PEG법, 일렉트로포레이션법 등)이 사용되고, 아그로박테리움을 통한 방법과 직접 식물 세포에 도입하는 방법으로 대별된다. 아그로박테리움법을 사용할 경우는 구축한 식물용 발현 벡터를 적당한 아그로박테리움(예를 들면, 아그로박테리움·투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens))에 도입하고, 이 주를 리프디스크법(나이쿠 히로후미 저, 식물 유전자 조작 메뉴얼(1990) 27∼31쪽, Kodansha Scientific Ltd., 도쿄) 등에 따라서 무균 배양옆편에 감염시켜 형질전환 식물을 얻는 방법을 사용할 수 있을 수 있다.

또한, Nagel 외의 방법(Micribiol. Lett., (1990) vol.67, pp.325)을 사용할 수 있다. 이 방법은, 우선 발현 벡터를 아그로박테리움에 도입하고, 이어서 형질전환된 아그로박테리움을 Plant Molecular Biology Manual(S. B. Gelvin 외, Academic Press Publishers)에 기재된 방법으로 식물 세포 또는 식물 조직에 도입하는 방법이다. 여기에서, 「식물 조직」이란 식물 세포의 배양에 의해 얻어지는 캘러스를 포함한다. 아그로박테리움법을 사용해서 형질전환을 행할 경우에는 pBI계의 바이너리 벡터(예를 들면, pBIG, pBIN19, pBI101, pBI121, pBI221, 및 pPZP202 등)가 사용될 수 있다.

또한, 유전자를 직접 식물 세포 또는 식물 조직에 도입하는 방법으로서는 일렉트로포레이션법, 유전자총법 등을 들 수 있다. 유전자총을 사용할 경우에는 유전자를 도입하는 대상으로서 식물체, 식물기관, 식물 조직 자체를 그대로 사용해도 좋고, 절편을 조제한 후에 사용해도 좋고, 프로토플라스트를 조제해서 사용해도 좋다. 이렇게 조제한 시료를 유전자 도입 장치(예를 들면 PDS-1000(Bio-Rad Laboratories, Inc.) 등)을 사용해서 처리할 수 있다. 처리 조건은 식물 또는 시료에 따라 다르지만, 통상은 450∼2000psi 정도의 압력, 4∼12cm 정도의 거리에서 행한다.

유전자가 도입된 세포 또는 식물 조직은 우선 하이그로마이신 내성 등의 약제내성에 의해 선택되고, 이어서 정법에 의해 식물체에 재생된다. 형질전환 세포로부터 식물체의 재생은 식물 세포의 종류에 따라서 당업자에게 공지된 방법으로 행하는 것이 가능하다. 선택 마커로서는 하이그로마이신 내성에 한정되지 않고, 예를 들면 블레오마이신, 카나마이신, 겐타마이신, 클로람페니콜 등에 대한 약제 내성을 들 수 있다.

식물 배양 세포를 숙주로서 사용할 경우에는, 예를 들면 마이크로인젝션법, 일렉트로포레이션법(전기천공법), 폴리에틸렌글리콜법, 유전자총(파티클 건)법, 프로토플라스트 융합법, 인산 칼슘법 등을 들 수 있다. 이들 방법에 의해 재조합 벡터가 배양 세포에 도입되어서 형질전환된다. 형질전환의 결과로서 얻어지는 캘러스나 슈트(shoot), 모상근 등은 그대로 세포 배양, 조직 배양 또는 기관 배양에 사용하는 것이 가능하다. 이들은 종래 알려져 있는 식물 조직 배양법을 사용하여 적당한 농도의 식물 호르몬(옥신, 시토키닌, 지베렐린, 아브시스산, 에틸렌, 브라시노라이드 등)의 투여 등에 의해 식물체에 재생시킬 수 있다.

유전자가 식물에 도입되었는지의 여부의 확인은 PCR법, 서던 하이브리다이제이션법, 노던 하이브리다이제이션법 등에 의해 행할 수 있다. 예를 들면, 형질전환 식물로부터 DNA를 조제하고, DNA 특이적 프라이머를 설계해서 PCR을 행한다. PCR은 당업자에게 공지된 조건에서 행할 수 있다. 그 후에는 증폭산물에 대해서 아가로스 겔 전기영동, 폴리아크릴아미드겔 전기영동 또는 캐필러리 전기영동 등을 행하고, 브롬화 에티듐, SYBR Green액 등에 의해 염색한다. 그리고 증폭산물을 1개의 밴드로서 검출함으로써 형질전환된 것을 확인할 수 있다. 또한, 미리 형광 색소 등에 의해 표식한 프라이머를 사용해서 PCR을 행하여 증폭산물을 검출할 수도 있다. 또한, 마이크로플레이트 등의 고상으로 증폭산물을 결합시키고, 형광 또는 효소 반응 등에 의해 증폭산물을 확인하는 방법도 채용할 수 있다.

본 발명의 벡터가 게놈 내에 도입된 형질전환 식물체가 일단 취득되면, 그 식물체의 유성 생식 또는 무성 생식에 의해 자손을 얻을 수 있다. 또한, 상기 식물체 또는 그 자손, 또는 이들의 클론으로부터, 예를 들면 종자, 과실, 절단 이삭, 괴경, 괴근, 주, 캘러스, 프로토플라스트 등을 얻고, 그들을 기초로 상기 식물체를 양산할 수 있다.

따라서, 본 발명의 형질전환체에는 본 발명의 벡터가 발현가능하게 도입된 식물체, 또는 그 식물체와 동일한 성질을 갖는 상기 식물체의 자손, 또는 이들 유래의 조직도 포함된다.

<유전자 파괴주>

본 발명의 유전자 파괴주는 삽입서열이 도입됨으로써 본 발명의 유전자가 파괴되어 있는 게놈 DNA를 갖는다. 예를 들면, 도 2에 나타내는 바와 같이, 상동 재조합에 의해 게놈 DNA에 T-DNA(hrz1-1)를 삽입시킴으로써 또는 트랜스포존(hrz2-1)의 전이에 의해 게놈 DNA 상에 존재하는 본 발명의 유전자가 파괴되어 그 발현이 억제된다.

본 발명의 유전자 파괴주에 의하면, 본 발명의 유전자 및 단백질의 발현이 억제되어 있다. 따라서, 철 도입 관련 유전자나 철 이행 관련 유전자의 항상적인 발현 억제가 해제되어 식물 중의 철 결핍 내성 및 철·아연 축적을 향상시킬 수 있다.

본 발명의 유전자 파괴주로서는 Tos17 삽입주 ND6059(벼 게놈 리소스 센터)가 바람직하다. 이 삽입주는 형질전환 식물이 아니기 때문에, 일반 포장에서 바로 생육가능한 점에서 우수하다.

본 발명의 형질전환체 및 유전자 파괴주는 상술한 바와 같이 가식부에의 현저한 철·아연 축적의 향상 이외에, 우수한 철 결핍 내성을 겸비하고 있다. 따라서, 반건조 지대나 석회질 토양 등의 잠재적으로 철 결핍에 빠지기 쉬운 재배 조건에 있어서 안정적으로 철부화 음식물을 생산하는데 특히 유용하다.

<철 결핍 내성 및 철·아연 축적이 향상된 식물의 작출용 조성물, 및 작출용 키트>

본 발명의 철 결핍 내성 및 철·아연 축적이 향상된 식물의 작출용 조성물은 본 발명의 벡터를 포함하고 있다. 또한, 본 발명의 철 결핍 내성 및 철·아연 축적이 향상된 식물의 작출용 키트는 본 발명의 벡터를 구비하고 있다. 여기에서, 「조성물」이란 각종 성분이 한 물질 중에 함유되어 있는 형태를 의미한다. 「키트」는 각종 성분 중 적어도 1개가 별도 물질 중에 함유되어 있는 형태를 의미한다.

또한, 「철 결핍 내성 및 철·아연 축적이 향상된 식물의 작출용 조성물」은 철 결핍 내성 및 철·아연 축적이 향상된 식물체를 제작하기 위해서 사용하는 조성물이다. 「철 결핍 내성 및 철·아연 축적이 향상된 식물의 작출용 키트」는 철 결핍 내성 및 철·아연 축적이 향상된 식물을 제작하기 위해서 사용하는 키트이다.

본 발명의 형질전환체는 본 발명의 벡터가 숙주(식물)에 도입되어 이루어지는 것이다. 이것에 의해 본 발명의 유전자가 발현 억제되어 철 결핍 내성 및 철·아연 축적이 향상될 수 있다. 그리고, 상술한 바와 같이, 본 발명의 벡터를 사용하면 식물체에 본 발명의 벡터를 도입할 수 있다. 따라서, 본 발명의 벡터를 구비하고 있는 조성물 또는 벡터를 구비하고 있는 키트는 철 결핍 내성 및 철·아연 축적이 향상된 식물을 작출하기 위해서 적합하게 사용된다.

다시 말해, 본 발명의 철 결핍 내성 및 철·아연 축적이 향상된 식물의 작출용 조성물 또는 철 결핍 내성 및 철·아연 축적이 향상된 식물의 작출용 키트는 상술한 본 발명의 철 결핍 내성 및 철·아연 축적이 향상된 식물의 작출 방법에 있어서의 벡터의 공급원으로서 사용할 수 있다.

본 발명의 철 결핍 내성 및 철·아연 축적이 향상된 식물의 작출용 조성물은 본 발명의 벡터 이외에 용매, 분산매, 시약 등을 구비하고 있어도 좋다.

또한, 본 발명의 철 결핍 내성 및 철·아연 축적이 향상된 식물의 작출용 키트는 본 발명의 벡터 이외에, 용매, 분산매, 시약, 그들을 사용하기 위한 지시서 등을 구비하고 있어도 좋다. 여기에서, 본 발명의 키트에 있어서, 지시서를 제외하고 용매 등을 「구비하고 있다」란 키트를 구성하는 각각의 용기(예를 들면, 보틀, 플레이트, 튜브, 디시 등) 중의 어느 하나 중에 내포되어 있는 상태를 의미한다.

또한, 본 발명의 키트는, 예를 들면 물질 A 및 물질 B를 동일한 용기에 혼합해서 구비해도 각각의 용기에 구비해도 좋다. 「지시서」는 종이 또는 기타 매체에 쓰여져 있어도 인쇄되어 있어도 좋고, 또는 자기 테이프, 컴퓨터 판독 가능 디스크 또는 테이프, CD-ROM 등과 같은 전자 매체에 기록되어도 좋다. 또한, 본 발명의 키트는 희석제, 용매, 세정액, 기타 시약을 내포한 용기를 구비하고 있어도 좋다.

<항체>

본 발명의 항체는 본 발명의 단백질과 특이적으로 결합하는 항체이면 한정되지 않고, 상기 단백질에 대한 폴리클로날 항체 등이어도 좋지만, 상기 단백질에 대하다 모노클로날 항체인 것이 바람직하다. 모노클로날 항체는 성질이 균일해서 공급하기 쉽고, 그 산생 세포를 하이브리도마로서 반영구적으로 보존이 가능한 것 등의 이점을 갖는 점에서 우수하다.

본 발명의 항체로서는 면역 글로불린(IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, 및 이들의 Fab 프래그먼트, F(ab')₂ 프래그먼트, Fc 프래그먼트)을 들 수 있고, 구체적으로는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 단쇄 항체 및 항이디오타입 항체 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명의 항체는 각종 공지의 방법에 따라 제작될 수 있다. 예를 들면, 모노클로날 항체는 이 분야에 있어서 공지의 기술(예를 들면, 하이브리도마법 (Kohler, G. 및 Milstein, C., Nature 256, 495-497(1975)), 트리오마(trioma)법, 인간 B-세포 하이브리도마법(Kozbor, Immunology Today 4, 72(1983)) 및 EBV-하이브리도마법(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R Liss, Inc., 77-96(1985)) 등 참조)을 사용함으로써 제작될 수 있다.

또한, 펩티드 항체는 이 분야에 공지된 방법(예를 들면, Chow, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1985) vol. 82, pp. 910-914； Bittle, F. J. et al., J. Gen. Virol. (1985) vol.66, pp.2347-2354)에 따름으로써 제작될 수 있다.

본 발명의 항체는 상술한 바와 같이 Fab 프래그먼트나 F(ab')₂ 프래그먼트 등의 프래그먼트를 포함한다. 이러한 프래그먼트는 대표적으로는 파파인(Fab 프래그먼트를 생성함) 또는 펩신(F(ab')₂ 프래그먼트를 생성함)과 같은 효소를 사용하여 항체를 단백질 분해함으로써 산생될 수 있다.

또는, 이러한 프래그먼트는 재조합 DNA 기술의 적용 또는 화학 합성에 의해 산생될 수 있다.

<육종 방법>

[제 1 실시형태]

본 실시형태의 철 결핍 내성 및 철·아연 축적이 향상된 식물의 육종 방법은 식물로부터의 추출물에 포함되는 본 발명의 단백질을 검출하는 공정을 포함한다.

본 실시형태의 철 결핍 내성 및 철·아연 축적이 향상된 식물의 작출 방법은 식물 체내에서 본 발명의 단백질의 발현이 억제되어 있는지의 여부를 판별하기 위해서, 본 발명의 단백질을 검출하는 공정을 포함하고 있으면 좋다. 본 발명의 단백질의 발현 유무에 근거하여 철 결핍 내성 및 가식부에의 철·아연 축적을 갖는 식물을 선발한다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 단백질은 식물이 토양으로부터 철을 획득할 때에 중요한 기능을 갖는 유전자의 발현을 억제한다. 따라서, 상기 단백질의 발현이 억제된 식물은 철을 획득하는 능력이 높아서 철 결핍 내성 및 철·아연 축적이 향상되어 있다.

또한, 본 실시형태의 방법에 따라서 육종된 식물체는 천연 식물체이어도 형질전환체이어도 좋다.

식물로부터의 추출물은 액체 질소를 사용한 동결 파쇄법이나, 시판의 추출 키트를 사용해서 취득할 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 또한, 「추출물」은 조정제물이어도 수 개의 정제 공정을 거친 정제 표품이어도 좋다.

본 실시형태의 육종 방법에 있어서, 상기 식물로부터의 추출물에 포함되는 본 발명의 단백질을 검출하는 공정으로서는 그 식물로부터의 추출물을 본 발명의 항체와 반응시킴으로써 본 발명의 단백질을 검출하는 공정을 들 수 있다. 상술한 바와 같이 상기 항체는 본 발명의 단백질과 특이적으로 결합해서 면역복합체를 형성하므로, 그 복합체의 형성을 검출함으로써 식물체 내에 있어서 발현되어 있는 상기 단백질을 용이하게 검출할 수 있다.

상기 복합체의 형성은, 예를 들면 상기 항체를 미리 동위체 등으로 표식하는 방법, 또는 상기 항체에 대한 2차 항체를 사용하는 방법 등을 사용해서 검출된다. 구체적으로는 주지의 웨스턴 블로팅법, 프로틴칩법 등을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 항체는 본 실시형태의 철 결핍 내성 및 가식부에의 철·아연 축적이 향상된 식물의 육종 방법에 적합하게 사용된다. 따라서, 본 발명의 항체를 포함하고 있는 조성물 또는 상기 항체를 구비하고 있는 키트는 철 결핍 내성 및 가식부에의 철·아연 축적이 향상된 식물을 육종하기 위해서 적합하게 사용된다.

[제 2 실시형태]

본 실시형태의 식물의 육종 방법은 식물로부터의 추출물에 포함되는 본 발명의 유전자를 검출하는 공정을 포함한다.

상기 식물로부터의 추출물에 포함되는 본 발명의 유전자를 검출하는 공정은 본 발명의 유전자의 프래그먼트, 또는 그 상보 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드를 상기 식물로부터의 추출물과 인큐베이팅하는 공정을 포함하는 것이 바람직하고, 식물로부터의 추출물을 목적의 식물 유래의 게놈 DNA, mRNA 또는 mRNA에 대한 cDNA와 하이브리다이징시키는 공정을 포함하는 것이 보다 바람직하다.

본 실시형태의 육종 방법을 사용해서 하이브리다이징한 표적 유전자를 검출 함으로써 본 발명의 유전자의 발현이 억제된 식물체를 용이하게 검출할 수 있다.

또한, 상술한 바와 같이, 본 발명의 단백질은 철 결핍에 대한 식물체의 응답에 있어서 중요한 작용을 한다. 그 때문에, 상기 단백질의 아미노산 서열의 미세한 변이가 식물의 철 결핍 내성 및 가식부에의 철·아연 축적에 영향을 미칠 수 있다. PCR법, 하이브리다이제이션법, 마이크로어레이법 등의 주지의 관용 기술을 사용함으로써 유전자의 1염기 단위의 변이를 검출할 수 있기 때문에, 이들 기술에 의해 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 아미노산 서열의 미세한 변이를 검출할 수 있다.

따라서, 본 실시형태의 식물의 육종 방법을 사용함으로써, 식물의 철 결핍 내성 및 가식부에의 철·아연 축적에 영향을 미치는 상기 단백질의 아미노산 서열의 미세한 변이에 근거하여 식물의 철 결핍 내성 및 가식부에의 철·아연 축적이 향상된 식물을 육종할 수도 있다.

본 실시형태에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드가 수 개 또는 수 십개 또는 수 백개 결합한 것을 의미한다.

본 실시형태의 육종 방법에 있어서 사용되는 올리고뉴클레오티드는 본 발명의 유전자 또는 그 프래그먼트를 얻기 위한 PCR 프라이머 또는 하이브리다이제이션 프로브로서 사용될 수 있다.

본 실시형태에 사용되는 올리고뉴클레오티드의 길이로서는 7염기 이상이 바람직하고, 15염기 이상이 보다 바람직하고, 20염기 이상이 더욱 바람직하고, 40염기 이상이 가장 바람직하다. 이들 올리고뉴클레오티드는, 예를 들면 Applied Biosystems Incorporated(ABI, 850 Lincoln Center Dr., Foster City, CA 94404) 392형 신서사이저 등에 의해 합성된다.

이와 같이, 본 실시형태의 육종 방법에 있어서 사용되는 올리고뉴클레오티드를 본 발명의 단백질을 코딩하는 유전자를 검출하는 하이브리다이제이션 프로브 또는 상기 유전자를 증폭하기 위한 프라이머로서 이용함으로써, 본 발명의 유전자의 발현이 억제된 식물체 또는 조직을 용이하게 검출할 수 있다.

실시예

다음에, 실시예를 나타내서 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이하의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[벼 유래 신규 철 결합 단백질의 동정]

본 발명자들은 철 결핍 유도성 유전자군에 대해서 마이크로어레이를 사용해서 해석했다(Ogo, Y., et al., J. Exp. Bot. (2006) vol.57, pp.2867-2878). 이들 유전자군 중에서 철 센서로서 하나의 후보 유전자 AK068028(NCBI의 Accession No.: 서열번호 4)에 착목했다. 상술한 바와 같이, 이 유전자는 추정 상의 헤메리트린 (HHE로서도 알려져 있음) 영역을 코딩하는 유전자를 포함하고 있다(도 1 참조). 헤메리트린 영역은 무척추 동물, 박테리아 및 포유류까지 보존하고 있고, 2가철 및 분자상 산소와 결합하는 것이 알려져 있다.

무척추 동물에 있어서, 헤메리트린 영역을 갖는 단백질은 산소를 수송하는 단백질로서 기능하고 있다.

한편, 인간에 있어서는 헤메리트린 영역을 갖는 단백질로서 인간 FBXL5 단백질이 알려져 있다(도 3 참조). 인간 FBXL5 단백질에 있어서 헤메리트린 영역은 철 센서로서 작용하고, FBXL5는 유비퀴틴-프로테아좀계의 E3 리가아제로서 기능하는 F-박스 영역을 통해서 철 제어 단백질 2(Iron Regulatory Protein 2; 이하, IRP2이라고 함)을 인식해서 분해하는 것이 알려져 있다(Rouault, T. A., Science (2009) vol. 326, pp. 676-677； Vashisht, A., et al., Science (2009) vol. 326, pp. 718-721； Salahudeen, A. A., et al., Science (2009) vol. 326, pp. 722-726).

흥미롭게도, 서열번호 4로 표시되는 유전자가 코딩하는 단백질은 F-박스 영역을 포함하고 있지 않았지만, F-박스 영역과 마찬가지로 E3 리가아제로서 기능하는 RING-Zn 핑거 영역을 포함하고 있다(도 1 참조). 서열번호 4로 표시되는 유전자가 코딩하는 단백질은 전사 제어·전사 후 제어·단백질 분해 제어 등에 관여한다고 추정되는 2개의 다른 Zn 핑거 영역과, 전자 전달을 위해서 철황 클러스터를 형성한다고 추정되는 루브레독신 타입 모티프를 포함하고 있다(도 1 참조).

데이타베이스 서치에 의해 헤메리트린 영역을 코딩하는 유전자를 포함하는 유전자를 벼에 있어서 2개를 더 발견하고(도 3 참조; OsHORZ1 및 후술하는 OsHRZ1), 애기장대에 있어서 4개 더 발견했다(도 3 참조; BTS, At3g54290, At1g74770, At1g18910). 이들 중, AK288394(NCBI의 Accession No.: 서열번호 3)가 코딩하는 단백질은 서열번호 4로 표시되는 유전자가 코딩하는 단백질이 갖는 모든 영역 구조를 함유하고 있고, 2개의 헤메리트린 영역을 더 갖고 있다(도 1 참조).

따라서, 본 발명자는 서열번호 3 및 4로 표시되는 유전자가 코딩하는 단백질을 각각 Oryza sativa Hemerythrin motif-containing Really Interesting New Gene (RING)-and Zinc-finger protein(이하, OsHRZ라고 함)1 및 OsHRZ2라고 명명했다.

OsHRZ1 및 OsHRZ2의 cDNA를 벼 재배 품종 「츠키노히카리」의 cDNA풀로부터 PCR을 사용해서 증폭하고, 이 증폭산물을 pCR(등록상표)-Blunt II-TOPO(등록상표) 벡터에 삽입하여 염기 서열을 확인했다.

[철 결핍 재배 조건에 응답한 OsHRZ1 및 OsHRZ2의 발현 레벨의 변화]

벼 품종 「니폰바레」의 잎 및 뿌리에 있어서의, 철 충분 조건하 및 철 결핍 조건하에서의 OsHRZ1 및 OsHRZ2의 mRNA의 발현 레벨의 변화를 정량적 RT-PCR을 사용해서 해석했다.

상세하게는, 수경 재배한 벼의 뿌리 또는 엽신으로부터 추출한 RNA 샘플을 NucleoSpin RNA Plant Mini Kit(MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG 제품) 및 ReverTra Ace reverse transcriptase(Toyobo Co., Ltd. 제품), 또는 RNeasy Plant Mini Kit(Qiagen 제품) 및 ReverTra Ace qRT-PCR RT Master Mix with gDNA Remover(Toyobo Co., Ltd. 제품)을 사용하고, DNaseI를 사용해서 처리하여 역전사 반응에 제공했다. 그 다음에, 역전사 반응에 의해 합성한 cDNA를 사용하고, StepOnePlus(상표) Real-Time PCR System(Applied Biosystems 제품)에 의해 리얼타임 PCR을 행했다. 시약으로서 SYBR Green I 및 ExTaq(상표) Real-Time-PCR version(Takara Bio Inc. 제품), 또는 TaqMan Gene Expression Assays(Applied Biosystems 제품)를 사용했다. 표적으로 하는 전사 산물의 양을 벼 α-2 튜블린의 전사 레벨로 보정하고, 1㎍의 전체 RNA당 카피수로서 나타냈다.

결과를 도 4에 나타낸다. 도 4의 그래프 횡축은 철 충분 조건하 및 철 결핍 조건하에서의 재배일수를 나타낸다. +7d는 철 충분 조건하 7일 재배 후의 벼 유래의 샘플을 나타내고, -1d는 철 결핍 조건하 1일 재배 후의 벼 유래의 샘플을 나타내고, -7d는 철 결핍 조건하 7일 재배 후의 벼 유래의 샘플을 나타낸다. 도 4의 그래프 종축은 RNA 1㎍당 OsHRZ1 또는 OsHRZ2의 카피수를 나타낸다. 도 4(a)는 뿌리에 있어서의 발현 레벨을 나타낸 그래프이며, 도 4(b)는 잎에 있어서의 발현 레벨을 나타낸 그래프이다. 도 4 좌측은 OsHRZ1에 있어서의 발현 레벨을 나타낸 그래프이며, 도 4 우측은 OsHRZ2에 있어서의 발현 레벨을 나타낸 그래프이다. 또한, 이후의 실시예에 있어서, 유의차에 대해서는 t검정에 의해 검정을 행했다. 이후의 도면 중, ＊은 P<0.05를 나타내고, ＊＊은 P<0.01을 나타낸다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 잎 및 뿌리 양쪽에 있어서 철 결핍 조건 하에서 OsHRZ1 및 OsHRZ2의 mRNA의 발현 레벨의 상승이 확인되었다.

[재조합 OsHRZ1 단백질 및 OsHRZ2 단백질의 철 결합능의 평가]

식물 유래의 헤메리트린 영역이 철과의 결합능을 갖는지의 여부에 대해서는 알려져 있지 않다. 발명자는 우선 말토오스 결합 단백질(MBP)을 코딩하는 유전자의 하류에 전장 HRZ 유전자 또는 HRZ 결실 변이 유전자를 연결한 것을 pMAL-c2(New England Biolabs 제품)에 삽입한 발현 벡터를 제작했다.

그 다음에, 이들 말토오스 결합 단백질(MBP) 융합 OsHRZ 재조합 단백질의 복수의 결실 변이체를 대장균 BL21(DE3) pLysS에 발현시켜서 제작했다. 재조합 단백질의 발현 정제에 대해서는 MBP 퓨전 시스템(New England Biolabs 제품)을 사용했다. 대장균을 22℃∼25℃에서 배양하고 컬럼 버퍼로부터 EDTA를 제거한 것 이외에는 메뉴얼을 따랐다. 재조합 단백질을 SDS-PAGE에 제공해서 분리한 후, 쿠마시 브릴리언트 블루 염색에 의해 재조합 단백질의 순도를 확인했다. 발현시킨 재조합 단백질을 PD-10 컬럼(GE Healthcare 제품)을 사용해서 탈염한 후, 음 이온 교환 컬럼(Q-Sepharose; GE Healthcare 제품)을 사용해서 정제했다. 제작한 재조합 단백질의 영역 구조를 도 5에 나타낸다.

도 5 중, OsHRZ1 FL은 OsHRZ1 단백질 전장을 나타내고, OsHRZ1 ΔRZ는 OsHRZ1 단백질 전장으로부터 C말단측에 있는 3번째의 헤메리트린 영역과, 전사 제어·전사 후 제어·단백질 분해 제어 등에 관여한다고 추정되는 3개의 Zn 핑거 영역과, 전자 전달을 위해서 철황 클러스터를 형성한다고 추정되는 루브레독신 타입 모티프를 포함하는 C말단 영역을 결실시킨 것을 의미한다. OsHRZ1 ΔH는 OsHRZ1 단백질 전장으로부터 3개의 헤메리트린 영역 모두를 포함하는 N말단 영역을 결실시킨 것을 나타낸다. OsHRZ1 ΔHRZ는 OsHRZ1 단백질 전장으로부터 N말단측에 있는 2개의 헤메리트린 영역 모두를 포함하는 N말단 영역과, C말단측에 있는 3번째의 헤메리트린 영역과, 3개의 Zn 핑거 영역과, 루브레독신 타입 모티프를 포함하는 C말단 영역을 결실시킨 것을 나타낸다.

도 5 중, OsHRZ2 FL은 OsHRZ2 단백질 전장을 나타내고, OsHRZ1 ΔH는 OsHRZ2 단백질 전장으로부터 헤메리트린 영역을 포함하는 N말단 영역을 결실시킨 것을 나타낸다. BTS FL은 OsHRZ1 및 OsHRZ2의 애기장대 호몰로그의 단백질 전장을 나타낸다(도 3 참조).

이들 단백질에 결합하고 있는 금속 농도를 유도 결합 발광분광에 의해 측정했다. 상세하게는 정제한 단백질을 Bio-Rad 프로틴 에세이 키트(Bio-Rad Laboratories, Inc. 제품)를 사용해서 정량하고, MarsXpress 오븐(CEM Corporation 제품)을 사용해서 0.1∼1mg의 정제 단백질 용해액을 13.4M HNO₃ 2mL로 220℃ 20분 처리하여 습식 회화했다. 철 및 아연의 몰농도를 ICP 발광 분석 장치(ICPS-8100; Shimadzu Corporation 제품)를 사용해서 측정했다. 결과를 도 6에 나타낸다.

도 6 중, 그래프 횡축은 사용한 재조합 단백질의 종류를 나타내고, 그래프 종축은 단백질 1몰에 결합하여 있는 철 또는 아연의 몰수를 나타낸다. 도 6에 나타낸 바와 같이, OsHRZ1 단백질 전장 및 OsHRZ2 단백질 전장은 약 2배몰 전후의 양의 철 및 아연을 포함하고 있고, 이 결합능은 헤메리트린 영역을 결실시킴으로써 약 0.5배몰 이하로까지 감소했다. 한편, 3개의 Zn 핑거 영역과 루브레독신 타입 모티프를 결실시켜도 단백질 1몰당 철 및 아연 결합량은 현저하게 감소하지 않았다.

이것은 도 7에 나타낸 바와 같이, 헤메리트린 영역을 포함하는 OsHRZ1 FL 단백질의 농축 용해액이 헤메리트린 영역을 포함하지 않는 OsHRZ1 ΔH 단백질의 농축 용해액과 비교하여 철 유래의 적갈색을 나타내고 있는 것으로부터도 명백하다.

이들로부터, OsHRZ 단백질에 있어서 철 및 아연은 Zn 핑거 영역이나 루브레독신 타입 모티프보다 헤메리트린 영역에 주로 결합하는 것이 확인되었다. 또한, 애기장대의 BTS 단백질도 OsHRZ1 단백질 및 OsHRZ2 단백질과 마찬가지로, 철 및 아연과의 결합을 나타내기 때문에, 헤메리트린 타입의 철·아연 결합성 단백질이 식물종 간에서 보존되어 있는 것이 발견되었다.

[OsHRZ 유전자의 발현을 억제한 벼에 있어서의 철 결핍 내성능의 확인]

OsHRZ의 기능을 조사하기 위해서, RNAi법에 의해 OsHRZ의 발현을 억제한 형질전환 벼를 제작했다. 구체적으로는, OsHRZ2의 3' UTR 전장 및 코딩 영역의 일부에 상당하는 335bp의 단편(서열번호 5로 표시되는 염기 서열)을 증폭하고, 이 증폭산물을 pENTR(등록상표)-Blunt II-TOPO(등록상표) 벡터에 삽입했다. 그 다음에, LR클로나제(Clonase) 반응에 의해 이 단편을 데스티네이션 벡터 pIG121-RNAi-DEST(Ogo, Y., et. al., Plant J.(2007) vol. 51, pp.366-377)에 정역 양방향으로 1카피씩 링커 서열을 통해서 삽입하여 발현 벡터를 제작했다.

그 다음에, 정법에 따라서 OsHRZ2의 발현이 억제된 3개의 형질전환체(2i-1∼2i-3)를 작출했다(Hiei, Y., et. al., Plant J. (1994) vol. 6, pp. 271-282； Kobayashi, T., et. al., Planta ( 2001) vol. 212, pp. 864-871).

작출한 형질전환체를 철 결핍 조건하 7일간 재배하고, 상술한 정량 RT-PCR법을 사용해서 각 형질전환체에 있어서의 OsHRZ2의 mRNA의 발현 레벨을 조사했다.

도 8에 나타낸 바와 같이, 이들 형질전환체에 있어서는 OsHRZ2의 발현 억제가 확인되었다. 또한, 이들 형질전환체는 통상의 재배 조건 하에서 현저한 표현형을 나타내지 않고 건전하게 성장하는 것이 확인되었다.

또한, 철 결핍 재배 조건이 이들 형질전환체에 미치는 영향을 조사하기 위해서 철 결핍 재배 조건하에서의 최신 잎에 있어서의 클로로필 함량을 정량했다. 결과를 도 9에 나타낸다. 도 9 중, 종축은 최신 잎 중의 클로로필(SPAD값)을 나타내고, 횡축은 철 결핍 재배 조건하에서의 재배일수를 나타낸다. 도 9에 나타낸 바와 같이, OsHRZ2 발현 억제주의 잎은 미처리(NT) 벼의 잎과 비교하여 철 결핍 조건하에 있어서도 높은 클로로필 함량을 나타냈다. 이것으로부터, 형질전환체는 철 결핍 재배 조건에 대하여 내성을 나타내는 것이 확인되었다.

더욱이, 유효 철 함유량이 적은 특수 토양에 있어서의 이들 형질전환체의 생육 상태를 평가하기 위해서, 본 발명자는 석회질 토양에 있어서의 이들 형질전환체의 장기 시험을 행했다. 결과를 도 10에 나타낸다. 도 10 중, 종축은 최신 잎 중의 클로로필량(SPAD값)을 나타내고, 횡축은 이식 후의 재배일수를 나타낸다.

도 10에 나타낸 바와 같이, 이식후 20일 이내에 잎 중의 클로로필량의 감소는 모든 벼에 있어서 관찰되었다. 그렇지만, 이 감소의 정도는 OsHRZ2 발현 억제주의 쪽이 미처리 벼보다 적은 것이 확인되었다. 또한, OsHRZ2 발현 억제주의 잎 중의 클로로필량은 이식 후 22일 이후 서서히 회복되었다. 도 11에 나타낸 바와 같이, OsHRZ2 발현 억제주의 모종 길이가 철 결핍 내성을 반영하고 있다. 수확기에 있어서, OsHRZ2 발현 억제주는 미처리(NT) 벼와 비교하여 높은 볏짚의 자원량 및 곡물의 수확량을 나타내는 것이 확인되었다.

더욱이, 발명자는 벼의 게놈 유전자에 T-DNA를 삽입시킨 OsHRZ1 파괴주 및 Tos17을 삽입시킨 OsHRZ2 파괴주를 취득해서 해석했다. OsHRZ1 파괴주는 한국POSTECH(Pohang University of Science and Technology)에 의해 취득한 3A-06066주이다. OsHRZ2 파괴주는 벼 게놈 리소스 센터에 의해 취득한 ND6059주이다. 도 2는 OsHRZ1 파괴주 및 OsHRZ2 파괴주에 있어서의 삽입서열(hrz1-1, hrz2-1)의 게놈에의 삽입 상태를 나타낸다.

OsHRZ1 파괴주 및 OsHRZ2 파괴주의 약 0.1㎠의 잎단편으로부터 100㎕의 10mM Tris-HCl(pH8.0)·0.1mM EDTA 용액을 사용하여 게놈 DNA를 추출했다. 추출한 게놈 DNA를 KOD FX Neo(Toyobo Co., Ltd. 제품)을 사용하여 PCR에 제공했다. 결과를 도 12에 나타낸다.

도 12 중 화살표는 사용한 프라이머를 나타내고, 도 2에 있어서 표시하는 게놈 DNA 상에 아닐링하는 프라이머에 대응한다.

도 12에 나타낸 바와 같이, hrz1-1 및 hrz2-1은 각각 OsHRZ1 및 OsHRZ2에 특이적으로 유전자 단편의 삽입이 일어나고 있는 것이 확인되었다.

이들 파괴주를 철 결핍 조건 하에서 수경 재배하고, 최신 잎 중의 클로로필량을 정량했다. 결과를 도 13에 나타낸다. 도 13 중 종축은 최신 잎 중의 클로로필량(SPAD값)을 나타내고, 횡축은 철 결핍 조건하의 재배일수를 나타낸다. 도 13(a)은 미처리(야생주: WT) 벼와 OsHRZ1 파괴주에 있어서의 최신 잎 중의 클로로필량을 나타내고, 도 13(b)은 미처리(야생주: WT) 벼와 OsHRZ2 파괴주에 있어서의 최신 잎 중의 클로로필량을 나타낸다. 도 13에 나타낸 바와 같이, OsHRZ1 파괴주는 미처리 벼보다도 조금 높은 클로로필량을 유지하고 있었다. 또한, OsHRZ2 파괴주는 미처리 벼보다 명확히 높은 클로로필량을 유지하고 있어, 철 결핍 재배 조건에 대하여 내성을 나타내는 것이 확인되었다.

[OsHRZ 유전자의 발현을 억제한 벼의 잎에 있어서의 철 축적의 확인]

OsHRZ 발현 억제주의 철 결핍 재배 조건에 대한 내성 기구를 조사하기 위해서, 7일간 수경 재배를 한 벼의 잎에 있어서의 금속 농도를 정량했다. 결과를 도 14에 나타낸다. 도 14 중, 횡축은 사용한 벼의 종류를 나타내고, 종축은 잎 중의 철 함유량을 나타낸다. 도 14에 나타낸 바와 같이, OsHRZ2 발현 억제주의 잎은 미처리주의 잎과 비교하여 철 충분 조건하(도 14(a)) 및 철 결핍 조건하(도 14(b)) 모두에 있어서 고농도의 철을 축적하고 있는 것이 확인되었다.

[OsHRZ 유전자의 발현을 억제한 벼의 볏짚 및 종자에 있어서의 철과 아연의 축적의 확인]

OsHRZ 유전자의 발현을 억제한 벼의 가식부에 있어서의 철의 축적을 조사하기 위해서, 포트 재배를 한 벼의 볏짚 및 종자에 있어서의 철 농도를 정량했다.

볏짚에 있어서의 철 축적의 결과를 도 15에 나타내고, 종자에 있어서의 철 축적의 결과를 도 16에 나타낸다. 도 15 및 도 16 중, 횡축은 사용한 벼의 종류를 나타내고, 종축은 볏짚 또는 종자 중의 철 함유량을 나타낸다. 도 15(a) 및 도 16 (a)은 석회질 토양을 사용한 철 결핍 조건하에 있어서의 결과를 나타내고, 도 15(b) 및 도 16(b)은 통상의 토양을 사용한 철 충분 조건하에 있어서의 결과를 나타낸다.

도 15 및 도 16에 나타낸 바와 같이, OsHRZ2 발현 억제주의 볏짚 및 종자는 미처리주의 볏짚 및 종자와 비교하여, 철 충분 조건하(도 15(b) 및 도 16(b)) 및 철 결핍 조건하(도 15(a) 및 도 16(a)) 모두에 있어서 고농도의 철을 축적하고 있는 것이 확인되었다. 이 결과로부터, 볏짚은 가식부가 아니지만, 본 발명을 엽채류 등의 철 부화(富化)에 적응가능하다고 생각된다.

마찬가지로, 격리 포장 내의 통상 토양에서 재배된 현미 및 백미에 있어서의 철의 축적을 조사했다.

결과를 도 17에 나타낸다. 도 17(a)은 현미에 있어서의 결과를 나타내고, 도 17(b)은 백미에 있어서의 결과를 나타낸다. 도 17(a) 및 도 17(b) 모두에 있어서 OsHRZ2 발현 억제주의 종자는 미처리주의 종자와 비교해서 고농도의 철을 축적하고 있었던 점으로부터, OsHRZ 유전자의 발현을 억제한 벼의 가식부에 있어서의 고농도의 철의 축적이 확인되었다.

또한, OsHRZ 유전자의 발현을 억제한 벼의 가식부에 있어서의 아연의 축적을 조사하기 위해서, 포트 재배를 한 벼의 종자에 있어서의 아연 농도를 정량했다. 도 18(a)은 석회질 토양을 사용한 철 결핍 조건하에 있어서의 결과를 나타내고, 도 18(b)은 통상의 토양을 사용한 철 충분 조건하에 있어서의 결과를 나타낸다. 도 18에 나타낸 바와 같이, OsHRZ2 발현 억제주의 종자는 미처리주의 종자와 비교하여, 철 충분 조건하 및 철 결핍 조건하(도 18(a) 및 도 18(b)) 모두에 있어서 고농도의 아연을 축적하고 있는 것이 확인되었다.

동일한 벼에 대해서, 격리 포장 내의 통상 토양에서 재배된 현미 및 백미에 있어서의 아연의 축적을 조사했다. 결과를 도 19에 나타낸다. 도 19(a)는 현미에 있어서의 결과를 나타내고, 도 19(b)는 백미에 있어서의 결과를 나타낸다. 도 19(a) 및 도 19(b) 모두에 있어서, OsHRZ2 발현 억제주의 종자는 미처리주의 종자와 비교하여 고농도의 아연을 축적하고 있었던 점으로부터, OsHRZ 유전자의 발현을 억제한 벼의 가식부에 있어서의 고농도의 아연의 축적이 확인되었다.

더욱이, 상기와 같은 통상의 토양을 사용한 포트 시험을 OsHRZ1 파괴주 (hrz1-1) 및 OsHRZ2 파괴주(hrz2-1)를 사용해서 행했다. 결과를 도 20에 나타낸다.

도 20(a)은 OsHRZ1 파괴주(hrz1-1)의 종자에 있어서의 철 축적의 결과를 나타내고, 도 20(b)은 OsHRZ2 파괴주(hrz2-1)의 종자에 있어서의 철 축적의 결과를 나타낸다. 도 20(a) 및 도 20(b) 모두에 있어서, 미처리 벼(야생주: WT)의 종자와 비교해서 OsHRZ 파괴주의 종자가 고농도의 철을 축적하고 있었다. 이것으로부터, OsHRZ 파괴주의 가식부에 있어서의 고농도의 철의 축적이 확인되었다.

또한, 동일한 재배 조건에서 OsHRZ 파괴주의 종자에 있어서의 아연의 축적을 조사했다. 결과를 도 21에 나타낸다. 도 21(a)은 OsHRZ1 파괴주(hrz1-1)의 종자에 있어서의 아연 축적의 결과를 나타내고, 도 21(b)은 OsHRZ2 파괴주(hrz2-1)의 종자에 있어서의 아연 축적의 결과를 나타낸다. 도 21(a) 및 도 21(b) 모두에 있어서, 미처리 벼(야생주: WT)의 종자와 비교하여 OsHRZ 파괴주의 종자가 고농도의 아연을 축적하고 있었다. 이것으로부터, OsHRZ 파괴주의 가식부에 있어서의 고농도의 아연의 축적이 확인되었다.

또한, 동일한 재배 조건에서 OsHRZ 파괴주의 볏짚에 있어서의 철 및 아연의 축적을 조사했다. 결과를 도 22 및 도 23에 나타낸다. 도 22는 OsHRZ 파괴주(hrz1-1 및 hrz2-1)의 볏짚에 있어서의 철 축적의 결과를 나타내고, 도 23은 OsHRZ 파괴주(hrz1-1 및 hrz2-1)의 볏짚에 있어서의 아연 축적의 결과를 나타낸다. 도 22 및 도 23 모두에 있어서, 미처리의 벼(야생주: WT)의 볏짚과 비교해서 OsHRZ 파괴주의 볏짚이 고농도의 철·아연을 축적하고 있었다. 이것으로부터, OsHRZ 파괴주의 볏짚에 있어서의 고농도의 철·아연의 축적이 확인되었다.

이상, OsHRZ의 발현을 억제한 형질전환 벼 및 OsHRZ 파괴주의 양쪽에서 동일한 표현형을 나타낸 점으로부터, OsHRZ 유전자의 발현을 억제함으로써 벼의 가식부에의 철·아연 축적이 향상되는 것이 확인되었다.

[OsHRZ 유전자의 발현을 억제한 벼의 뿌리에 있어서의 철 도입 관련 유전자나 철 이행 관련 유전자의 발현 증강의 확인]

발명자는 44K 마이크로어레이 해석을 행하여 철 충분 조건하 및 철 결핍 조건 하에서 수경 재배된 OsHRZ2 발현 억제주(2i-1∼2i-3)의 유전자 발현 프로파일을 조사했다. 벼 44K 마이크로어레이(Agilent Technologies 제품)는 벼 전장 cDNA 프로젝트로부터 얻어진 서열 정보에 근거하여 43144 종류의 60mer의 올리고뉴클레오티드를 포함하고 있다. 수경 재배한 OsHRZ2 발현 억제주의 뿌리로부터 NucleoSpin RNA Plant Mini Kit(Macherey-Nagel 제품)를 사용해서 전 RNA를 조제했다. 마이크로어레이 하이브리다이제이션, 데이터 입력, 및 데이터 해석을 이전 보고한 내용에 따라 행하고(Ogo, Y., et. al., J. Exp. Bot. (2006) vol. 57, pp. 2867-2878), 발현비를 (OsHRZ2 발현 억제주의 평균 시그널값)/(미처리(NT) 벼의 평균 시그널값)으로서 산출했다. 결과를 도 24에 나타낸다.

도 24는 각종 유전자의 발현 프로파일을 나타낸 도면이다. 도 24에 나타내는 바와 같이, OsHRZ2 발현 억제주의 뿌리에 있어서 특히 철 충분 조건 하에서 다종의 철 도입 관련 유전자나 철 이행 관련 유전자의 발현 증강이 나타났다.

또한, 정량적 RT-PCR을 사용하여 철 충분 조건하에 있어서의 마이크로어레이 해석 결과를 검증했다. 결과를 도 25에 나타낸다. 도 25 중, 횡축은 사용한 벼를 나타내고, 종축은 각 유전자(OsIRO2, OsNAS2, OsYSL2)의 mRNA의 발현 강도를 나타낸다. 도 25에 나타낸 바와 같이, 각 유전자의 발현 변화는 마이크로어레이 해석 결과와 일치하고 있는 것이 확인되었다.

이들 점으로부터, OsHRZ 단백질은 철 결핍에 응답하는 부의 제어 인자이고, OsHRZ 단백질의 발현을 억제함으로써 주로 철 충분 조건하에 있어서의 철 도입 관련 유전자나 철 이행 관련 유전자의 발현 억제를 해제할 수 있는 것이 확인되었다.

(산업상의 이용 가능성)

본 발명에 의하면, 철 결핍 내성이 향상된 식물을 취득할 수 있으므로, 가용화한 철분이 적은 알칼리성 토양 등에서도 생육가능한 작물을 취득할 수 있다.

또한, 본 발명에 의하면, 가식부에 철과 아연, 특히 철을 현저하게 축적하는 식물을 취득할 수 있으므로, 철 결핍증 및 아연 결핍증을 경감하는 작물을 취득할 수 있다.

특히, 본 발명에 의하면, 상기 철 결핍 내성과 가식부에의 철·아연 축적을 동시에 겸비한 형질이 얻어지므로, 반건조 지대나 석회질 경향 토양 등의 잠재적으로 철 결핍이 되기 쉬운 재배 조건에 있어서 안정적으로 철 부화 음식물을 생산하는데 매우 유리하다고 생각된다.

따라서, 본 발명은 「신규 철·아연 결합성 제어 인자와, 그 발현 조절에 의한 식물의 철 결핍 내성 향상 및 가식부에의 철·아연 축적의 촉진 기술」에 적합하게 이용할 수 있어 산업상 매우 유용하다.

SEQUENCE LISTING <110> JAPAN SCIENCE AND TECHNOLOGY AGENCY <120> novel iron- and zinc-binding regulators, and technology for producing plants with improved tolerance to iron deficiency and iron and zinc accumulation to edible parts by regulating the expression thereof. <130> PC-17017 <150> JP2012-166233 <151> 2012-07-26 <160> 5 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 1236 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 1 Met Ala Thr Pro Thr Pro Met Ala Gly Glu Gly Thr Leu Ala Ala Val 1 5 10 15 Met Pro Arg Ser Pro Ser Pro Thr Ala Ser Ala Ala Ala Gly Ser Ala 20 25 30 Ala Glu Ala Pro Met Leu Ile Phe Leu Tyr Phe His Lys Ala Ile Arg 35 40 45 Ala Glu Leu Glu Gly Leu His Ala Ala Ala Val Arg Leu Ala Thr Glu 50 55 60 Arg Ala Gly Asp Val Gly Ala Leu Ala Glu Arg Cys Arg Phe Phe Val 65 70 75 80 Asn Ile Tyr Lys His His Cys Asp Ala Glu Asp Ala Val Ile Phe Pro 85 90 95 Ala Leu Asp Ile Arg Val Lys Asn Val Ala Gly Thr Tyr Ser Leu Glu 100 105 110 His Lys Gly Glu Asn Asp Leu Phe Ser Gln Leu Phe Ala Leu Leu Gln 115 120 125 Leu Asp Ile Gln Asn Asp Asp Ser Leu Arg Arg Glu Leu Ala Ser Cys 130 135 140 Thr Gly Ala Ile Gln Thr Cys Leu Ser Gln His Met Ser Lys Glu Glu 145 150 155 160 Glu Gln Val Phe Pro Leu Leu Thr Lys Lys Phe Ser Tyr Glu Glu Gln 165 170 175 Ala Asp Leu Val Trp Gln Phe Leu Cys Asn Ile Pro Val Asn Met Met 180 185 190 Ala Glu Phe Leu Pro Trp Leu Ser Ser Ser Val Ser Ser Asp Glu His 195 200 205 Glu Asp Ile Arg Ser Cys Leu Cys Lys Ile Val Pro Glu Glu Lys Leu 210 215 220 Leu Gln Gln Val Val Phe Ala Trp Ile Glu Gly Lys Thr Thr Arg Lys 225 230 235 240 Val Thr Glu Asn Ser Thr Lys Ser Asn Ser Glu Ala Thr Cys Asp Cys 245 250 255 Lys Asp Ala Ser Ser Ile Asp His Ala Asp Asn His Ile Ser Ser His 260 265 270 Glu Asp Ser Lys Ala Gly Asn Lys Lys Tyr Ala Glu Ser Ile Asp Gly 275 280 285 Gln Val Glu Arg His Pro Ile Asp Glu Ile Leu Tyr Trp His Asn Ala 290 295 300 Ile Arg Lys Glu Leu Ile Asp Ile Ala Glu Glu Thr Arg Arg Met Gln 305 310 315 320 Gln Ser Gly Asn Phe Ser Asp Ile Ser Ser Phe Asn Ala Arg Leu Gln 325 330 335 Phe Ile Ala Asp Val Cys Ile Phe His Ser Ile Ala Glu Asp Gln Val 340 345 350 Val Phe Pro Ala Val Asp Ser Glu Leu Ser Phe Val His Glu His Ala 355 360 365 Glu Glu Glu Arg Arg Phe Asn Asn Phe Arg Cys Leu Ile Gln Gln Ile 370 375 380 Gln Ile Ala Gly Ala Lys Ser Thr Ala Leu Asp Phe Tyr Ser Glu Leu 385 390 395 400 Cys Ser His Ala Asp Gln Ile Met Glu Thr Ile Glu Lys His Phe Cys 405 410 415 Asp Glu Glu Thr Lys Val Leu Pro Gln Ala Arg Met Leu Phe Ser Pro 420 425 430 Glu Lys Gln Arg Gln Leu Leu Tyr Lys Ser Leu Cys Val Met Pro Leu 435 440 445 Lys Leu Leu Glu Arg Val Leu Pro Trp Leu Val Ser Lys Leu Ser Asp 450 455 460 Glu Glu Ala Ser Ser Phe Leu Glu Asn Met Arg Leu Ala Ala Pro Ser 465 470 475 480 Ser Glu Thr Ala Leu Val Thr Leu Phe Ser Gly Trp Ala Cys Lys Ala 485 490 495 Arg Ser Glu Asp Lys Ser Asn Ser Gly Glu Tyr Leu Cys Leu Thr Ser 500 505 510 Gly Glu Met Arg Cys Leu Leu Asp Glu Val Asp Gly Leu Glu Lys Cys 515 520 525 Arg Pro Phe Cys Pro Cys Ala Ser Arg Ser Asn Thr Asp Ala Ser Leu 530 535 540 His Pro Gln Thr Glu Asn Gly Ser Arg Pro Gly Lys Arg Gly Asn Asp 545 550 555 560 Ala Glu Ser Val Pro Gly Thr Asn Gly Ser Asp Leu Ser Gln Thr Asp 565 570 575 Asp Thr Glu Ala Arg Pro Cys Ser Lys Lys Pro Cys Cys Ile Pro Gly 580 585 590 Leu Arg Val Glu Thr Gly Asn Leu Ala Ile Ser Ser Ser Leu Ala Ser 595 600 605 Ala Lys Ser Phe Arg Ser Leu Ser Tyr Asn Ser Ser Ala Pro Ser Leu 610 615 620 Tyr Ser Ser Leu Phe Ser Trp Glu Thr Asp Ala Ser Leu Ser Cys Ser 625 630 635 640 Asp Gly Ile Ser Arg Pro Ile Asp Thr Ile Phe Lys Phe His Lys Ala 645 650 655 Ile Arg Lys Asp Leu Glu Tyr Leu Asp Val Glu Ser Gly Lys Leu Ile 660 665 670 Asp Gly Asp Glu Ser Cys Leu Arg Gln Phe Ile Gly Arg Phe Arg Leu 675 680 685 Leu Trp Gly Leu Tyr Arg Ala His Ser Asn Ala Glu Asp Glu Ile Val 690 695 700 Phe Pro Ala Leu Glu Ser Arg Glu Thr Leu His Asn Val Ser His Ser 705 710 715 720 Tyr Thr Leu Asp His Lys Gln Glu Glu Gln Leu Phe Gly Asp Ile Ser 725 730 735 Asp Ala Leu Ala Glu Leu Ser Gln Leu His Glu Arg Leu Thr His Pro 740 745 750 His Ile Glu Val Ser Glu Ala Glu Lys Asn Asp Phe Asn Ser Ser Asp 755 760 765 Glu Ile Asp Trp Thr Arg Lys Tyr Asn Glu Leu Ala Thr Lys Leu Gln 770 775 780 Gly Met Cys Lys Ser Ile Arg Ala Ala Leu Thr Asn His Val His Arg 785 790 795 800 Glu Glu Leu Glu Leu Trp Pro Leu Phe Asp Glu His Phe Ser Val Glu 805 810 815 Glu Gln Asp Lys Leu Val Gly Arg Ile Ile Gly Ser Thr Gly Ala Glu 820 825 830 Val Leu Gln Ser Met Leu Pro Trp Val Thr Ser Ala Leu Thr Gln Glu 835 840 845 Glu Gln Asn Met Met Leu Asp Thr Trp Lys Gln Ala Thr Lys Asn Thr 850 855 860 Met Phe Gly Glu Trp Leu Asn Glu Trp Trp Lys Gly Ala Pro Thr Ser 865 870 875 880 Ser Asp Ser Ser Glu Glu Ala Ser Ser Ala Pro Glu Asp Ser His Leu 885 890 895 Gln Asp Lys Ile Asp Gln Asn Asp Gln Met Phe Lys Pro Gly Trp Lys 900 905 910 Asp Ile Phe Arg Met Asn Gln Ser Glu Leu Glu Ala Glu Val Arg Lys 915 920 925 Val Ser Arg Asp Pro Thr Leu Asp Pro Arg Arg Lys Ala Tyr Leu Ile 930 935 940 Gln Asn Leu Met Thr Ser Arg Trp Ile Ala Ala Gln Gln Lys Leu Pro 945 950 955 960 Glu Pro Lys Ser Glu Glu Cys Ser Glu Gly Ala Gly Ile Pro Gly Cys 965 970 975 Ala Pro Ser Tyr Arg Asp Gln Glu Lys Gln Ile Phe Gly Cys Glu His 980 985 990 Tyr Lys Arg Asn Cys Lys Leu Val Ala Ala Cys Cys Asn Lys Leu Phe 995 1000 1005 Thr Cys Arg Phe Cys His Asp Lys Ile Ser Asp His Thr Met Glu Arg 1010 1015 1020 Lys Ala Thr Gln Glu Met Met Cys Met Val Cys Leu Lys Val Gln Pro 1025 1030 1035 1040 Val Gly Pro Asn Cys Gln Thr Pro Ser Cys Asn Gly Leu Ser Met Ala 1045 1050 1055 Lys Tyr Tyr Cys Asn Ile Cys Lys Phe Phe Asp Asp Glu Arg Thr Val 1060 1065 1070 Tyr His Cys Pro Phe Cys Asn Leu Cys Arg Leu Gly Lys Gly Leu Gly 1075 1080 1085 Val Asp Phe Phe His Cys Met Lys Cys Asn Cys Cys Leu Gly Met Lys 1090 1095 1100 Leu Thr Glu His Lys Cys Arg Glu Lys Gly Leu Glu Thr Asn Cys Pro 1105 1110 1115 1120 Ile Cys Cys Asp Phe Leu Phe Thr Ser Ser Ala Ala Val Arg Ala Leu 1125 1130 1135 Pro Cys Gly His Phe Met His Ser Ala Cys Phe Gln Ala Tyr Thr Cys 1140 1145 1150 Ser His Tyr Thr Cys Pro Ile Cys Cys Lys Ser Leu Gly Asp Met Ala 1155 1160 1165 Val Tyr Phe Gly Met Leu Asp Ala Leu Leu Ala Ala Glu Glu Leu Pro 1170 1175 1180 Glu Glu Tyr Arg Asp Arg Cys Gln Asp Ile Leu Cys Asn Asp Cys Glu 1185 1190 1195 1200 Arg Lys Gly Arg Ser Arg Phe His Trp Leu Tyr His Lys Cys Gly Ser 1205 1210 1215 Cys Gly Ser Tyr Asn Thr Arg Val Ile Lys Thr Asp Thr Ala Asp Cys 1220 1225 1230 Ser Thr Pro Asn 1235 <210> 2 <211> 811 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 2 Met Glu Lys Ile Glu Arg His Phe Lys Asn Glu Glu Thr Lys Val Leu 1 5 10 15 Pro Gln Ala Arg Ile His Phe Ser Ser Glu Lys Gln Arg Glu Leu Leu 20 25 30 Tyr Lys Ser Leu Cys Val Ile Pro Leu Lys Leu Leu Glu Arg Val Leu 35 40 45 Pro Trp Phe Val Ser Lys Leu Asn Asp Gln Asp Ala Glu Ala Phe Leu 50 55 60 Gln Asn Met Phe Leu Ala Ala Pro Ser Ser Glu Ala Ala Leu Val Thr 65 70 75 80 Leu Leu Ser Gly Trp Ala Cys Lys Gly Arg Ser Lys Gly Thr Ser Asn 85 90 95 Ser Gly Lys Phe Ile Cys Leu Thr Pro Arg Ala Leu Ser Ser Pro Leu 100 105 110 Asp Glu Asn Gly Phe Lys Asp Cys Gln Leu Cys Pro Cys Ser Leu Gln 115 120 125 Ser Asp Ile Cys Ser Arg Pro Ala Lys Lys Trp Asn Asp Thr Glu Ser 130 135 140 Ser Asn Ile Ser Asn Cys Ser Gln Thr Ala Asp Ile Ala Leu Thr Cys 145 150 155 160 Lys Asn Arg Pro Cys His Ile Pro Gly Leu Arg Val Glu Ile Ser Asn 165 170 175 Leu Ala Val Asn Ser Phe Ala Ser Ala Glu Ser Phe Arg Ser Leu Ser 180 185 190 Leu Asn Tyr Ser Ala Pro Ser Leu Tyr Ser Ser Leu Phe Ser Trp Glu 195 200 205 Thr Asp Ala Ala Phe Ser Gly Pro Asp Asn Ile Ser Arg Pro Ile Asp 210 215 220 Thr Ile Phe Lys Phe His Lys Ala Ile Arg Lys Asp Leu Glu Phe Leu 225 230 235 240 Asp Val Glu Ser Arg Lys Leu Ile Asp Gly Asp Glu Ser Ser Leu Arg 245 250 255 Gln Phe Ile Gly Arg Phe Arg Leu Leu Trp Gly Leu Tyr Arg Ala His 260 265 270 Ser Asn Ala Glu Asp Glu Ile Val Phe Pro Ala Leu Glu Ser Lys Glu 275 280 285 Thr Leu His Asn Val Ser His Ser Tyr Thr Leu Asp His Lys Gln Glu 290 295 300 Glu Glu Leu Phe Lys Asp Ile Ser Thr Ile Leu Phe Glu Leu Ser Gln 305 310 315 320 Leu His Ala Asp Leu Lys His Pro Leu Gly Gly Ala Asp Ala Val Gly 325 330 335 Ala Asn His Ile His Pro Tyr Asn Arg Ile Asp Trp Ser Lys Lys Asn 340 345 350 Asn Glu Leu Leu Thr Lys Leu Gln Gly Met Cys Lys Ser Ile Arg Val 355 360 365 Thr Leu Ser Asn His Val His Arg Glu Glu Leu Glu Leu Trp Pro Leu 370 375 380 Phe Asp Lys His Phe Ser Val Glu Glu Gln Asp Lys Ile Val Gly Arg 385 390 395 400 Ile Ile Gly Ser Thr Gly Ala Glu Val Leu Gln Ser Met Leu Pro Trp 405 410 415 Val Thr Ser Ala Leu Ser Leu Asp Glu Gln Asn Asn Met Leu Asp Thr 420 425 430 Trp Arg Gln Val Thr Lys Asn Thr Met Phe Asp Glu Trp Leu Asn Glu 435 440 445 Trp Trp Lys Arg Ser Pro Thr Ser Ser Gly Pro Ser Ser Asp Ala Ser 450 455 460 His Pro Glu Glu Asp His Phe Gln Glu Lys Phe Asp Gln Ser Glu Gln 465 470 475 480 Met Phe Lys Pro Gly Trp Lys Asp Ile Phe Arg Met Asn Gln Ser Glu 485 490 495 Leu Glu Ala Glu Ile Arg Lys Val Ser Arg Asp Ser Thr Leu Asp Pro 500 505 510 Arg Arg Lys Ala Tyr Leu Ile Gln Asn Leu Met Thr Ser Arg Trp Ile 515 520 525 Ala Ala Gln Gln Lys Ser Pro Gln Pro Gln Ser Glu Asp Arg Asn Gly 530 535 540 Cys Thr Val Leu Pro Gly Cys Cys Pro Ser Tyr Arg Asp Pro Glu Asn 545 550 555 560 Gln Ile Phe Gly Cys Glu His Tyr Lys Arg Lys Cys Lys Leu Val Ala 565 570 575 Ala Cys Cys Asn Lys Leu Phe Thr Cys Arg Phe Cys His Asp Lys Val 580 585 590 Ser Asp His Thr Met Glu Arg Lys Ala Thr Val Glu Met Met Cys Met 595 600 605 Gln Cys Leu Lys Val Gln Pro Val Gly Pro Asn Cys Gln Thr Pro Ser 610 615 620 Cys Asn Gly Leu Ser Met Ala Lys Tyr Tyr Cys Ser Val Cys Lys Phe 625 630 635 640 Phe Asp Asp Glu Arg Ser Val Tyr His Cys Pro Phe Cys Asn Leu Cys 645 650 655 Arg Leu Gly Gln Gly Leu Gly Ile Asp Phe Phe His Cys Met Lys Cys 660 665 670 Asn Cys Cys Leu Gly Met Lys Leu Ile Glu His Lys Cys Arg Glu Lys 675 680 685 Met Leu Glu Met Asn Cys Pro Ile Cys Cys Asp Phe Leu Phe Thr Ser 690 695 700 Ser Ala Ala Val Lys Gly Leu Pro Cys Gly His Phe Met His Ser Ala 705 710 715 720 Cys Phe Gln Ala Tyr Thr Cys Ser His Tyr Thr Cys Pro Ile Cys Ser 725 730 735 Lys Ser Leu Gly Asp Met Thr Val Tyr Phe Gly Met Leu Asp Gly Leu 740 745 750 Leu Ala Ala Glu Glu Leu Pro Glu Glu Tyr Arg Asp Arg Cys Gln Asp 755 760 765 Ile Leu Cys Asn Asp Cys Glu Arg Lys Gly Arg Ser Arg Phe His Trp 770 775 780 Leu Tyr His Lys Cys Gly Phe Cys Gly Ser Tyr Asn Thr Arg Val Ile 785 790 795 800 Lys Ile Asp Arg Ala Asp Cys Ser Thr Ser Asp 805 810 <210> 3 <211> 3711 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 3 atggcgacgc cgacgcccat ggcgggggag gggacgctcg cggcggtgat gccgcggtcg 60 ccgtccccta cggcttcggc ggcggcgggg tcggcggcgg aggcgccgat gctgatattc 120 ctctacttcc acaaggcgat ccgcgcggag ctcgaggggc tgcacgcggc cgccgtgcgc 180 ctcgccacgg agcgcgccgg cgacgtgggg gcgctcgccg agcgctgccg cttcttcgtc 240 aacatctaca agcaccactg cgacgccgag gacgcggtta tctttccagc acttgatatc 300 cgagtcaaga atgtcgcagg aacctattct cttgagcaca aaggggaaaa tgatctcttc 360 agccagctgt ttgctctgtt acagctggac attcaaaatg atgatagtct tcgaagggaa 420 ctcgcatcct gtacaggggc cattcaaaca tgtctctccc aacatatgtc caaagaagaa 480 gagcaggtct ttccattgct tacgaagaaa ttttcatatg aagagcaagc tgatctagtg 540 tggcagttct tatgtaacat tcctgtaaat atgatggcag agttcctccc ctggctttcg 600 tcttcggttt catctgatga acatgaagat atccgtagct gcttatgtaa aatagtacct 660 gaagagaaac tccttcagca ggttgtcttc gcgtggatcg aagggaaaac aacgagaaaa 720 gtaacagaga attccaccaa gtctaattca gaagcaacct gtgattgcaa ggatgcctcc 780 tccattgatc atgcagataa ccatatttct tcacatgaag attctaaagc tgggaacaaa 840 aagtatgcag aatctattga tggtcaggtt gaaaggcatc ccatagatga gattctgtat 900 tggcacaatg ctatccgtaa agagttaatt gatatagcag aggagacaag aaggatgcag 960 caatctggaa atttctctga tatatcatct ttcaatgcaa ggctgcagtt tattgcagat 1020 gtgtgcatct tccacagtat tgccgaggat caggttgtgt ttcctgcagt tgatagtgag 1080 ctgtcctttg tgcatgagca tgctgaagaa gagcgccggt ttaacaattt tagatgttta 1140 attcagcaaa tccaaatagc aggagcaaaa tcaactgcac tagactttta ctctgaattg 1200 tgttcacatg ctgatcagat aatggagaca attgagaaac acttctgtga tgaagaaacc 1260 aaggtgcttc ctcaagctag gatgcttttc tctcctgaga agcaaaggca acttctgtat 1320 aaaagtttat gtgtgatgcc actgaagtta ttagaacgtg ttctcccatg gttagtgtcc 1380 aagctgagtg atgaggaggc atcttctttt cttgaaaata tgcgcttggc agcaccatca 1440 tcggaaacag cactggttac ccttttctct ggttgggcat gcaaagctcg ttcagaggac 1500 aaatccaatt ctggggagta cttatgctta acatctggag aaatgagatg cctattggat 1560 gaagttgatg gactggaaaa atgtcggcca ttctgtccat gtgcttcacg tagcaataca 1620 gatgcttctc tgcatccgca gactgaaaat ggttctaggc caggaaagcg aggaaatgat 1680 gcagaatctg ttcctggtac taatggaagt gacttgtctc agactgatga cactgaagca 1740 cgtccatgta gcaaaaaacc ttgctgtatt cctgggttga gagtagaaac tggcaatctt 1800 gctattagtt catcgctggc ttctgcaaag tcatttcgct ctctatcata caattcttct 1860 gctccttcat tatattcaag ccttttttct tgggagacag atgcatcttt atcttgttca 1920 gatggcatat caaggccaat cgatactata ttcaaatttc ataaagcaat tcgcaaggac 1980 ttagagtacc tagatgttga atctggaaag cttattgatg gtgatgagtc ttgtcttcgc 2040 cagttcattg gaagattccg tttattgtgg ggtctttaca gggcacacag taatgctgag 2100 gatgaaattg tttttcctgc tttagaatca agagagacat tgcacaatgt cagtcactcg 2160 tacactcttg accacaagca agaagaacaa ttatttggag atatatctga tgccctcgct 2220 gagctttcgc agctacatga gaggttgacc cacccccaca ttgaagtcag tgaagcagag 2280 aaaaacgatt ttaattcctc tgatgagatt gattggacta gaaagtacaa cgagcttgcc 2340 acaaagcttc aaggaatgtg caagtctatc cgggctgcat tgactaatca tgtccataga 2400 gaagaacttg agttgtggcc attgtttgat gagcattttt ctgtggagga acaggataag 2460 cttgtaggtc gtataattgg ttcaactggt gctgaggttc tccaatcgat gctaccctgg 2520 gttacttcag cacttactca ggaagagcag aacatgatgc tggatacatg gaaacaggcc 2580 actaagaata caatgtttgg cgagtggcta aacgagtggt ggaagggagc tccgacatca 2640 tctgattctt cagaagaggc atcctctgct ccagaagata gtcatttaca ggacaagatt 2700 gaccagaatg atcagatgtt caagcctgga tggaaggaca tatttcgaat gaaccagagt 2760 gaacttgagg ctgaggtgcg aaaggtttca cgagatccta cacttgaccc aaggcggaag 2820 gcctatctta tccaaaatct catgaccagt cgctggatag ctgctcagca gaagctacca 2880 gagccaaaat cagaagagtg tagtgaaggt gccggtatcc ctggatgtgc tccttcatat 2940 cgagaccagg agaagcaaat atttggttgt gagcactaca aaaggaactg caagcttgtt 3000 gctgcatgct gcaacaagct gttcacttgc agattctgcc atgataaaat tagtgatcat 3060 acgatggaaa ggaaagcgac acaggagatg atgtgcatgg tatgcttaaa agttcaacct 3120 gttggtccaa attgtcaaac tccgtcttgc aatgggctat ccatggcaaa gtattactgt 3180 aacatctgca aattttttga tgatgaaagg actgtttatc attgcccatt ttgtaatttg 3240 tgccgtcttg ggaaaggtct tggtgttgat ttcttccatt gcatgaagtg caattgctgc 3330 cttgggatga aattaacaga acacaaatgc cgggagaaag ggctagagac aaactgtcca 3390 atctgctgtg atttcctatt tacatcaagc gcggcagtta gagctcttcc ctgtggccat 3450 ttcatgcatt cagcttgctt tcaggcatac acttgtagtc actacacttg tcctatctgc 3510 tgcaaatcct tgggagatat ggcggtgtac tttggcatgt tggacgcctt gctggctgct 3570 gaagagcttc ctgaggaata ccgtgatcgg tgtcaggata tactttgtaa tgattgtgaa 3630 agaaaaggga ggtctcgatt tcactggttg taccataaat gcggctcctg tggttcttat 3690 aataccagag ttatcaagac cgatacagca gattgttcta cgccaaacta g 3711 <210> 4 <211> 2436 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 4 atggagaaaa tcgagaggca cttcaaaaat gaggaaacaa aggtacttcc tcaagctagg 60 attcattttt catcagagaa acaaagggaa cttttatata agagtctctg tgtcataccg 120 ttgaagttat tggagcgtgt tttaccgtgg tttgtatcga agctgaatga tcaggatgca 180 gaagcttttc ttcagaatat gtttttggca gcaccttcct ctgaagctgc attggtcact 240 cttctctctg gttgggcatg caaaggtcgc tcaaagggca cctctaactc tggaaaattc 300 atatgcttga caccaagggc actgagcagc ccattggatg aaaatgggtt taaagactgc 360 cagttatgtc catgttcttt acaatcagat atttgttcta ggccagccaa gaaatggaat 420 gacacagaat ctagtaacat aagcaactgc tcacaaacgg ctgatatagc attgacatgt 480 aaaaacagac cttgtcacat tcctgggtta agggtagaaa ttagcaatct tgctgtcaat 540 tcgtttgctt ctgcagagtc cttccgatcg ctgtctctca attattctgc tccttcattg 600 tattcaagtc ttttttcatg ggagacagat gcagcctttt ctggcccaga taacatttca 660 aggccaattg acacaatatt caaatttcat aaggcaattc gcaaagattt ggagttctta 720 gatgtggaat ctagaaagct catagatggg gatgaatctt cccttcgcca attcatcgga 780 aggtttcgtt tactgtgggg tctttataga gcacacagca atgctgaaga tgaaattgta 840 tttcctgctc ttgaatcgaa agagacactg cacaatgtca gccactcata tactcttgac 900 cacaagcagg aagaagaatt atttaaagat atatccacta ttctttttga gctttcacaa 960 ttgcatgctg atttgaagca tcctcttggt ggtgctgatg cagttggagc gaaccacatt 1020 catccatata ataggatcga ttggtccaaa aagaataatg aacttttgac aaagcttcaa 1080 ggaatgtgca agtctatccg ggttactctg tctaatcatg tccatagaga agaacttgaa 1140 ttgtggccac tatttgataa acatttttct gtagaggagc aggataagat tgtaggccgt 1200 ataattggaa gtacaggagc tgaggttctg cagtcaatgt taccctgggt tacatcagcg 1260 cttagtctag atgaacagaa caatatgctg gacacatgga ggcaagtaac taagaataca 1320 atgtttgatg aatggctaaa tgaatggtgg aagagatcac ctacttcttc tggcccttca 1380 agcgatgcct cccatccaga agaagatcat ttccaggaaa agttcgatca gagtgaacag 1440 atgtttaagc ctggttggaa ggacatcttc cgaatgaacc agagtgagct tgaggctgag 1500 atacgaaagg tttctcgtga ttctactctt gacccaagga ggaaggctta tctaatccaa 1560 aatctcatga ccagccgctg gatagctgct cagcagaaat cgccccaacc tcagtcagaa 1620 gatcgcaatg gatgtacagt attacctgga tgttgtcctt cataccggga tccagagaat 1680 cagatttttg gctgtgagca ttacaaaagg aaatgcaaac ttgttgctgc atgctgcaat 1740 aaactgttca catgcaggtt ttgtcatgat aaagttagtg accatacaat ggaaaggaaa 1800 gcaacggtgg aaatgatgtg catgcaatgc ctgaaagttc aaccagttgg tccaaattgc 1860 cagacccctt cttgcaatgg gctatccatg gcaaagtatt attgcagcgt atgcaagttt 1920 tttgacgatg aaaggagtgt gtaccattgc cccttttgca atttgtgtcg tcttgggcaa 1980 ggattgggta ttgatttttt ccattgcatg aagtgcaact gttgcctggg catgaaattg 2040 atagagcata aatgtcgaga aaagatgcta gagatgaatt gcccaatctg ctgcgacttc 2100 ctatttacat cgagtgcagc agttaaaggt ctaccttgtg gccatttcat gcattcagct 2160 tgctttcagg cgtacacctg tagtcactac acctgcccaa tctgctctaa atccttggga 2220 gatatgacag tatactttgg catgcttgat ggcttgctgg ccgcagaaga gcttcctgag 2280 gaataccggg accggtgcca ggatatactt tgtaacgatt gtgaaagaaa aggaaggtct 2340 cggttccatt ggctgtatca caaatgcggc ttctgcggtt catataacac tagagttatc 2400 aagattgata gagctgattg ttcaacatca gattaa 2436 <210> 5 <211> 335 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: OsHRZ2 partial coding region and whole 3?UTR sequence. <400> 5 cacctgccca atctgctcta aatccttggg agatatgaca gtatactttg gcatgcttga 60 tggcttgctg gccgcagaag agcttcctga ggaataccgg gaccggtgcc aggatatact 120 ttgtaacgat tgtgaaagaa aaggaaggtc tcggttccat tggctgtatc acaaatgcgg 180 cttctgcggt tcatataaca ctagagttat caagattgat agagctgatt gttcaacatc 240 agattaacca ggcgagattt tccctctcat attcgaaatt ccttttgaat atatatattg 300 ttgtaaatat acatcaactt aaagaaatcc atgcg 335

Claims (14)

1. 식물로부터의 추출액에 포함되고, 이하의 (a)∼(c) 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 철·아연 결합성 제어 인자 단백질을 검출하는 단계, 및 상기 단백질의 발현 유무에 근거하여 철 결핍 내성을 갖고 또한 가식부에의 철·아연 축적을 갖는 식물을 선택하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 철 결핍 내성이 향상되고 또한 가식부에의 철·아연 축적이 향상된 식물의 육종 방법.
   (a) 서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산 서열,
   (b) 서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산 서열에 있어서 1∼10개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되어 있는 아미노산 서열, 또는
   (c) 서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산 서열과 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열
2. 삭제
3. 식물로부터의 추출액에 포함되고, 이하의 (a)∼(c) 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 철·아연 결합성 제어 인자 단백질을 코딩하는 유전자, 또는 이하의 (d)∼(g) 중 어느 하나의 DNA로 이루어진 철·아연 결합성 제어 인자 단백질을 코딩하는 유전자를 검출하는 단계, 및 상기 유전자의 발현 유무에 근거하여 철 결핍 내성을 갖고 또한 가식부에의 철·아연 축적을 갖는 식물을 선택하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 철 결핍 내성이 향상되고 또한 가식부에의 철·아연 축적이 향상된 식물의 육종 방법.
   (a) 서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산 서열,
   (b) 서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산 서열에 있어서 1∼10개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되어 있는 아미노산 서열, 또는
   (c) 서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산 서열과 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열,
   (d) 서열번호 3 또는 4로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA,
   (e) 서열번호 3 또는 4로 표시되는 염기 서열에 있어서 1∼30개의 염기가 결실, 치환 또는 부가되어 있는 염기 서열로 이루어지는 DNA,
   (f) 서열번호 3 또는 4로 표시되는 염기 서열과 동일성이 95% 이상인 염기 서열로 이루어지는 DNA, 또는
   (g) 서열번호 3 또는 4로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA에 대해 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA와 하이브리다이징할 수 있는 염기 서열로 이루어지는 DNA
4. 삭제
5. 서열번호 5로 표시되는 RNAi 유도성 핵산을 발현가능한 것을 특징으로 하는 철 결핍 내성이 향상되고 또한 가식부에의 철·아연 축적이 향상된 식물 작출용 벡터.
6. 삭제
7. 제 5 항에 기재된 철 결핍 내성이 향상되고 또한 가식부에의 철·아연 축적이 향상된 식물 작출용 벡터를 숙주에 도입해서 이루어지는 것을 특징으로 하는 형질전환식물.
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10. 제 5 항에 기재된 철 결핍 내성이 향상되고 또한 가식부에의 철·아연 축적이 향상된 식물 작출용 벡터를 식물에 도입하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 철 결핍 내성이 향상되고 또한 가식부에의 철·아연 축적이 향상된 식물의 작출 방법.
11. 제 5 항에 기재된 철 결핍 내성이 향상되고 또한 가식부에의 철·아연 축적이 향상된 식물 작출용 벡터를 유효성분으로 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 철 결핍 내성이 향상되고 또한 가식부에의 철·아연 축적이 향상된 식물의 작출용 조성물.
12. 제 5 항에 기재된 철 결핍 내성이 향상되고 또한 가식부에의 철·아연 축적이 향상된 식물 작출용 벡터를 유효성분으로 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 철 결핍 내성이 향상되고 또한 가식부에의 철·아연 축적이 향상된 식물의 작출용 키트.
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