KR20170058862A - 담배 유래의 탈메틸화 관련 NtROS2a 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 담배 유래의 탈메틸화 관련 NtROS2a 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명에 따른 담배 유래의 탈메틸화 관련 NtROS2a 유전자 과발현 형질전환 식물체의 경우, 고염, 건조, 산화 및 알루미늄 스트레스 조건에서 야생형(WT) 및 RNAi 식물체에 비해 종자의 발아율 또는 뿌리 및 신초의 길이가 현저하게 증가된 것을 확인하였다. 따라서 NtROS2a 유전자를 이용하면 조건 불리 지역에 적합한 환경 스트레스에 내성을 갖는 형질전환 식물체 및 바이오 연료 작물 등 GM(genetically modified) 작물을 개발하는데 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

Description

담배 유래의 탈메틸화 관련 NtROS2a 유전자 및 이의 용도{NtROS2a gene involved in demethylation from Nicotiana tabacum and uses thereof}

본 발명은 담배 유래의 탈메틸화 관련 NtROS2a 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다.

환경 스트레스는 식물의 성장을 저해하고 농업 분야에서 수확물의 생산성을 제한하는 요소로서, 수분, 저온, 염해, 산화, 금속물질 스트레스 등이 있다. 특히 수분 스트레스는 탈수, 고염도 및 저온과 같은 외부 환경에 의해 유발되며, 식물의 생장을 저해하는 환경 스트레스에 있어서 가장 가혹한 스트레스 중의 하나이다. 또 다른 환경 스트레스의 대표 인자인 건조 스트레스는 식물 세포 내 삼투압 불균형 및 이온 불균형을 발생시켜 식물의 생장 및 광합성을 저해한다. 상기 식물의 건조 스트레스 저항성 기작으로는 ABA(엡시스산) 의존성 신호전달 경로 또는 ABA 비의존성 신호 전달 경로가 있다. 금속물질 중 산성토양 속의 많은 가용성 알루미늄은 식물의 생장을 감소시킨다. 가용성 알루미늄은 세포분열의 억제, 세포막 투과성의 변화, 눈의 개아와 잎의 확장 지연, 뿌리 정단생장의 억제, 생물량과 세근량의 감소, 뿌리 호흡의 감소와 칼슘, 마그네슘 및 수분 흡수의 감소를 가져온다.

식물은 상기 스트레스에 대한 방어 기작을 가지고 있어서 생육에 부적합한 환경에 처하게 되면 그들의 형태를 조절하거나 생리적 대사과정을 조절함으로써 환경에 적응하여 생존하고자하는 경향이 있다. 상기 스트레스 조건을 극복하기 위해, 식물은 신속하고 효율적인 유전자 발현 프로그램을 통해 스트레스 적응 또는 내성과 연관된 수많은 유전자를 발현한다. 수많은 스트레스-유도성 유전자들이 다양한 식물 종에서 밝혀진 바 있고, 상기 유전자 산물의 기능이 보고된 바 있다.

담배(Nicotiana tabacum) 잎으로부터 분리된 탈메틸화 관련 NtROS2a(Nicotiana tabacum repressor of silencing 2a) 유전자는 식물의 DNA 글리코실화 효소(5-methylcytosine DNA glycosylase)로 잘 알려진 DNA 글리코실화 효소(glycosylase) 도메인을 포함하고 있다. DNA 글리코실화 효소는 DNA 내에 생긴 이상 염기와 데옥시리보오스 사이의 N-글리코시드 결합을 가수분해하는 반응을 촉매하는 효소로서 DNA 수선(DNA repair) 기능을 갖고 있다.

한편, 한국공개특허 제2014-0050218호에는 배추 유래의 BrRZFP1 유전자를 이용한 환경 스트레스 내성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법 및 그에 따른 식물체에 대해 개시하고 있으며, 한국등록특허 제1515152호에는 LCY -β 유전자를 이용한 환경 스트레스에 대한 내성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법 및 그에 따른 식물체에 대해 개시하고 있다. 하지만 본 발명의 담배 유래의 탈메틸화 관련 NtROS2a 유전자 및 이의 용도에 대해 아직 언급된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 NtROS2a 유전자의 발현이 조절된 식물체를 이용하여, NtROS2a 유전자가 식물체의 환경 스트레스 내성 조절에 관여한다는 것을 확인하였다. 특히, NtROS2a 유전자는 건조, 염 및 산화 스트레스 조건하에서 높게 발현되었으며, NtROS2a 유전자 과발현 형질전환 식물체의 경우, 고염, 건조, 산화 및 알루미늄 스트레스 조건하에서 야생형(WT) 및 RNAi 식물체에 비해 종자의 발아율 또는 뿌리 및 신초의 길이가 현저하게 증가된 것을 확인할 수 있었다. 따라서 상기 NtROS2a 유전자를 이용하여 식물체의 환경 스트레스 내성을 조절하는 방법을 제공할 수 있는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 담배 유래의 탈메틸화 관련 NtROS2a(Nicotiana tabacum repressor of silencing 2a) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 NtROS2a 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물체의 환경 스트레스 내성을 조절하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 환경 스트레스 내성이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 환경 스트레스 내성이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 유효성분으로 함유하는 식물체의 환경 스트레스 내성 조절용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 담배 유래의 탈메틸화 관련 NtROS2a 유전자 과발현 형질전환 식물체의 경우, 고염, 건조, 산화 및 알루미늄 스트레스 조건에서 야생형(WT) 및 RNAi 식물체에 비해 종자의 발아율 또는 뿌리 및 신초의 길이가 현저하게 증가된 것을 확인하였다. 따라서 NtROS2a 유전자를 이용하면 조건 불리 지역에 적합한 환경 스트레스에 내성을 갖는 형질전환 식물체 및 바이오 연료 작물 등 GM(genetically modified) 작물을 개발하는데 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 담배 유래의 NtROS2a(N. tabacum) 및 NtROS2b, 포도 유래의 XP_002267310 및 애기장대 유래의 ABC61677의 아미노산 서열 차이(A) 및 계통수 분석 결과(B)를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 GFP 융합 유전자를 이용하여 양파 세포 내로 NtROS2a 유전자의 도입 여부를 나타낸 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 담배 식물체에서 염, ABA(abscisic acid) 및 산화 스트레스에 반응하는 NtROS2a 유전자의 발현 양상을 나타낸 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 NtROS2a 유전자의 과발현 벡터(A) 및 RNAi 벡터(B)의 모식도 및 각각의 벡터를 이용하여 형질전환된 담배 식물체(C) 사진을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 NtROS2a 유전자의 과발현 벡터(A) 및 RNAi 벡터(B) 형질전환 담배 식물체 내에서 NtROS2a 유전자의 발현 양상을 나타낸 결과이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 NtROS2a 유전자의 과발현 벡터 및 RNAi 벡터 형질전환 담배 식물체에 20mM NaCl(A) 및 3% H₂O₂(B)를 처리하였을 때, 엽록소의 함량 변화를 나타낸 결과이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 NtROS2a 유전자의 과발현 벡터 및 RNAi 벡터 형질전환 담배 식물체의 종자에 125mM의 NaCl 및 2%의 PEG를 처리하였을 때, 발아율(A 및 B) 및 뿌리생장(C) 사진을 나타낸 결과이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 NtROS2a 유전자의 과발현 벡터 및 RNAi 벡터 형질전환 담배 식물체의 종자에 1,000μM의 염화알루미늄을 처리하였을 때, 곁뿌리(lateral root), 신초(shoot) 및 뿌리(root)의 생장을 나타낸 결과이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 담배 유래의 탈메틸화 관련 NtROS2a 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 NtROS2a 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물체의 환경 스트레스 내성을 조절하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 NtROS2a 단백질의 범위는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환, 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시된 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다.

또한, 본 발명은 상기 NtROS2a 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 유전자는 식물체의 환경 스트레스 내성을 조절하는 특징이 있으며, NtROS2a 단백질을 암호화하는 게놈 DNA와 cDNA를 모두 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기 서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 "유전자 발현 조절"은 식물체 내의 NtROS2a 유전자의 발현을 증가시키거나 또는 감소시키는 것을 말한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 식물체의 환경 스트레스 내성을 조절할 수 있는 방법으로, 서열번호 1의 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 NtROS2a 유전자를 과발현시켜 식물체의 환경 스트레스 내성을 증가시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 환경 스트레스는 건조, 염, 산화 또는 알루미늄 스트레스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 코딩된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate), 포스피노트리신(phosphinothricin) 및 글루포시네이트(glufosinate)와 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(Kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

"프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 식물 발현 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

상기 "유전자 과발현"이란 야생형 식물에서 발현되는 수준 이상으로 상기 유전자가 발현되도록 하는 것을 의미한다. 식물체 내로 상기 유전자를 도입하는 방법으로는 프로모터의 조절을 받는 상기 유전자가 포함된 발현 벡터를 이용하여 식물체를 형질전환하는 방법이 있다. 상기에서 프로모터로는 식물체 내에 삽입 유전자를 과발현시킬 수 있는 것이라면 특별히 제한되지 않는다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens et al., 1982, Nature 296: 72-74; Negrutiu et al., 1987, Plant Mol. Biol. 8: 363-373), 원형질체의 전기천공법 (Shillito et al., 1985, Bio/Technol. 3: 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법 (Crossway et al.,1986, Mol. Gen. Genet. 202: 179-185), 각종 식물 요소의(DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein et al.,1987, Nature 327: 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서(비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EPA 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 바이너리 벡터 기술을 이용하는 것이다.

식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양기관 또는 전체 식물이다. "식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 담배 유래의 탈메틸화 관련 NtROS2a(Nicotiana tabacum repressor of silencing 2a) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 환경 스트레스 내성이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 NtROS2a 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 제조 방법에서, NtROS2a 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 염기서열일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 제조 방법에서, 상기 NtROS2a 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 NtROS2a 유전자를 과발현시켜 식물체의 환경 스트레스 내성을 증가시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 제조 방법에서, 상기 환경 스트레스는 건조, 염, 산화 또는 알루미늄 스트레스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 환경 스트레스 내성이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

또한 본 발명에 따른 방법이 적용될 수 있는 식물체로는 애기장대, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 완두 등의 쌍자엽 식물 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물이 될 수 있으며, 바람직하게는 쌍자엽 식물이다. 상기 식물체는 바람직하게는 담배 식물체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 담배 유래의 탈메틸화 관련 NtROS2a 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는 식물체의 환경 스트레스 내성 조절용 조성물을 제공한다.

본 발명의 식물체의 환경 스트레스 내성 조절용 조성물은 유효성분으로서 본 발명의 담배 유래의 탈메틸화 관련 NtROS2a 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하며, 상기 유전자를 식물체에 형질전환시킴으로써 식물체의 환경 스트레스 내성을 조절할 수 있는 것이다. 바람직하게는 상기 NtROS2a 유전자를 과발현시켜 식물체의 환경 스트레스 내성을 증가시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.

재료 및 방법

1. 유전자의 분리 및 클로닝

총 RNA는 0.1g의 식물조직을 미리 차갑게 준비해 놓은 막자사발과 막대를 이용하여 액체질소로 마쇄하였다. 마쇄한 조직은 계량스푼을 사용하여 1㎖의 TRIzol-reagent(1㎖ TRIzol-reagent/50~100mg 조직)가 담긴 1.5㎖의 원심분리용 튜브에 넣어 섞어주고, 핵단백질체(nucleocapsid)가 완전히 분리되도록 상온에 15분간 두었다. 1㎖의 TRIzol-reagent에 대해 0.2㎖의 클로로포름을 넣어 15초 동안 볼텍스하고, 상온에서 5분간 방치한 후 11,000rpm으로 4℃에서 15분간 원심분리하여 상층액을 새 튜브로 옮겼다. 상층액은 0.5㎖의 이소프로판올(1㎖ TRIzol-reagent당)과 0.25㎖의 고염 침전 용액(high salt precipitation solution, 0.8M 시트르산나트륨/1.2M NaCl)을 넣어 잘 섞어주고 상온에서 10분간 방치하여 RNA를 침전시켰다. 이렇게 추출한 산물을 11,000rpm으로 4℃에서 10분간 원심분리하여 상층액을 버리고 RNA 침전물에 1㎖의 75%(v/v) 에탄올을 넣고 11,000rpm으로 4℃에서 5분 동안 원심분리하였다. 그 다음 상층액을 제거하고 RNA 침전을 진공상태에서 5~10분간 건조시켰다. 마지막으로 50㎕~100㎕의 DEPC(diethyl pyrocarbonate)가 처리된 멸균수에 녹이고, 분광광도계를 이용하여 RNA를 정량하였다.

2. cDNA 합성 및 RT - PCR 분석

총 RNA는 RNase H-역전사효소(Gibco SuperscriptII) 프로토콜에 따라 수행하였으며, 첫 가닥(first stand) cDNA는 5㎍의 총 RNA로부터 합성하였다. 5㎍의 주형 RNA에 1㎕의 50mM 올리고-dT, 1㎕의 10mM dNTP 및 10㎕의 DEPC가 첨가된 멸균수를 첨가하여 최종 부피 17㎕로 맞추고 65℃의 인큐베이터에서 5분간 변성시킨 후, 얼음에 두어 냉각시키고 4㎕의 5×첫 가닥 버퍼, 1㎕의 0.1M DTT(dithiothreitol), 1㎕의 RNase 억제제(40units/㎕) 및 1㎕의 SuperscriptII RTase(200units/㎕)를 첨가하여 최종 부피 20㎕로 조제한 후 25℃에서 5분, 42℃에서 1시간 반응시키고 72℃에서 15분간 가열하여 효소를 불활성화하였다. 합성된 2㎕의 cDNA를 주형으로 5㎕의 10×PCR 버퍼(200mM Tris-HCl(pH 8.4) 및 500mM KCl), 1.5㎕의 50mM MgCl₂, 1㎕의 10mM dNTP 믹스, 0.4㎕의 Taq DNA 폴리메라아제(5units/㎕), 정방향 프라이머(10μM, 서열번호 3) 및 역방향 프라이머(10μM, 서열번호 4)를 각각 1㎕씩 첨가하고 멸균수로 최종 부피 50㎕를 만든 후 PCR을 실시하였다. 이때 사용한 프라이머는 NCBI 데이터베이스 정보로부터 합성하여 사용하였다. PCR 반응은 94℃에서 4분간 전-변성(pre-denaturation)시킨 후, 94℃에서 1분간 변성(denaturation), 55℃에서 1분간 어닐링(annealing), 72℃에서 2분간 연장(extension) 과정을 35 사이클로 하였으며, 마지막으로 72℃에서 10분간 연장(extension)을 실시하였다. PCR 산물은 1.5% 아가로오스 겔상에 전기영동한 후, EtBr(ethidium bromide)로 염색하여 밴드를 확인하였다. 증폭산물은 pGEM T-Easy 벡터(Promega)에 클로닝하여 염기서열을 조사하였고, 유전자간 상동성 비교는 BLAST 분석에 의하여 실시하였다.

분리된 cDNA는 ZapII 벡터(Stratagene, La Jolla, CA, USA)에 제한효소 EcoRI 및 XhoI 영역을 이용하여 클로닝하였다. 클로닝된 벡터의 염기서열 분석을 수행하여 확인하고, NCBI에 등록하였다(accession number AB281588).

3. 식물형질전환 벡터의 구축

식물형질전환을 위하여 NtROS2a 유전자를 pBI121 및 pKANNIBAL 벡터에 라이게이션하여 구축하고, E. coli DH5에 전기충격법으로 도입하여 얻어진 콜로니를 배양하여 35S 프로모터 영역의 프라이머(서열번호 9)및 NtROS2a 프라이머(서열번호 10)를 이용하여 PCR 분석으로 유전자의 도입여부를 확인하였다(표 1). 확인된 벡터를 식물에 도입하기 위하여 아그로박테리움(Agrobacterium) LBA4404에 형질전환하였다. 28℃에서 동일 방법으로 제조된 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 컴피턴트 세포 LBA4404는 얼음에서 녹인 후 1㎕의 플라스미드 DNA와 섞어서 일렉트로포레이션 큐벳(electroporation cuvette)에 주입하였다. 그 다음 1440V로 전기충격을 가해서 형질전환시킨 후 1㎖의 SOC 배지를 주입하여 혼합한 후, 멸균된 시험관에 넣고 28℃에서 200rpm으로 1시간 동안 배양하였다. 배양액은 카나마이신(kanamycin, 50mg/ℓ)을 포함한 AB 아가배지(stock I: K₂HPO₄ 3g, stock II: NaH₂PO₄ 1g, NH₄Cl 1g, MgSO₄7H₂O 0.3g, KCl 0.15g, CaCl₂ 0.01g, stock III: FeSO₄7H₂O 2.5mg, glucose 5g/ℓ)에 200㎕를 피펫으로 떨어뜨려서 도말하고, 28℃의 항온기에서 2~3일 동안 배양하여 콜로니를 관찰하였다. 하얀 콜로니는 모두 콜로니 PCR 방법으로 형질전환 여부를 확인하고, 확인된 균주의 배양은 카나마이신(50mg/ℓ)이 첨가된 AB 액체배지에 접종한 후, 2~3일 동안 28℃의 항온기에서 200rpm으로 배양했다. 배양액은 50% 글리세롤을 동량 첨가하여 초저온냉동고(-80℃)에 저장하였다.

4. 담배 식물체의 형질전환

펄프 재질의 티백(6cm×4.5cm)에 종자를 넣어 봉하고 멸균한 비커에 70% 에탄올 80㎖을 넣고 티백을 적신 후 종자를 2분간 소독하였다. 1% 차아염소산 용액이 들어있는 비커에 티백을 옮긴 후 15분간 소독하였다. 멸균수가 들어있는 비커에 티백을 옮기고 1분씩 3회 수세하였다. 마지막으로 티백을 멸균된 페트리 디쉬에 옮기고 3방향으로 매스를 이용해 자른 후, 0.8% 피토 아가(phyto agar)에 1/10 MS 배지(1/10 MS salts stock, 1/10 vitamins, pH 5.8)가 들어있는 무균배양용기에 1cm의 간격으로 15~20립 정도 파종하였다. 파종한 종자는 28℃에서 18시간 일장으로 7일간 배양하였다. 어린잎 조각을 잘라서 아그로박테리움(Agrobacterium)에 감염시키고 난 후 MS 배지에 1mg/ℓ의 6-BA(6-benzylaminopurine) 및 0.1mg/ℓ의 1- NAA(1-naphtalene acetic acid)가 첨가된 배지에서 캘러스를 형성시켰다. 신초(new shoot)는 히그로마이신(hygromycin, 50mg/ℓ) 및 카르베니실린(carbenicillin, 400mg/ℓ)이 첨가된 MS 배지에서 유도되었다. 신초 유도 후 재분화된 개체는 호르몬이 첨가되지 않은 MS 배지에 옮겨서 뿌리를 유도하여 순화하였다.

5. DNA 의 분리 및 분석

유전자의 도입여부를 확인하기 위해, 총 DNA의 분리는 CTAB(Cetyltrimethyl ammonium bromide)법을 이용하였다. 형질전환체 및 대조구 식물로부터 채취한 0.5g의 잎은 액체질소를 이용하여 미세하게 분쇄하였고, 400㎕의 DNA 추출버퍼(100mM Tris-HCl(pH 8.0), 50mM EDTA 및 500mM NaCl]가 담긴 1.5㎖ 원심분리용 튜브에 갈아진 조직을 넣고 상하로 20회 혼합하였다. 그 후, 200㎕의 2×CTAB 버퍼[2% (w/v) CTAB, 100mM Tris-HCl(pH8.0), 20mM EDTA, 1.4M NaCl 및 1% pvp-40 (polyvinylpyrrolidine)]를 첨가하여 같은 방법으로 혼합하고 10% SDS를 넣고 10회 정도 상하로 섞어준 후, 65℃의 항온수조에 20분간 방치하였다. 5M 아세트산칼륨(potassium acetate(pH 7.5)) 200㎕를 첨가하고 50회 정도로 상하로 섞어준 후, 700㎕의 PCI[페놀/클로로포름/이소아밀알코올(25: 24: 1)]를 넣고 30회 정도 상하로 섞은 후 실온에서 12,000rpm 및 10분간 원심분리하여 단백질을 분리하였다. 상층 400㎕ 정도를 새 튜브로 옮긴 후 동량의 이소프로판올을 첨가하여 -20℃ 냉동고에 20분간 보관하였다가 4℃ 및 12,000rpm에서 15분간 원심분리하여 DNA를 침전시켰다. 침전된 DNA를 70% 에탄올 1㎖를 넣고 세척한 다음 실온에서 완전히 건조시키고 2㎕의 RNase(1mg/㎖)가 첨가된 50㎕의 TE 버퍼(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA 및 pH7.4)에 충분히 녹인 후 37℃에서 1시간 방치하여 사용하였다.

유전자의 발현을 분석하기 위하여 qRT-PCR을 수행하였으며, 사용된 프라이머 정보는 하기 표 1에 개시된 바와 같다.

실시예 1. NtROS2a 유전자의 클로닝 및 아미노산 서열 분석

잎에서 분리된 유전자는 NtROS2a( Nicotiana tabacum Repressor Of Silencing 2a)로 명명하였다(accession numbers AB281588). 이 유전자는 5,879bp의 염기로 이루어져 있으며, XP _002267310(Vitis vinifera) 및 ABC61677(A. thaliana) 유전자와 높은 상동성을 보였다. NtROS2a는 1,673개의 아미노산으로 구성되어 있으며. 분자량은 186kDa이다. NtROS2a는 ABC61677(A. thaliana )과의 아미노산 서열에서 32.2%의 높은 상동성을 나타내었고, 글리코실화 효소 도메인에서는 94.3%의 상동성을 보였다(도 1A). 또한 NtROS2a는 유래의 NtROS2b와 99.6%의 유사성을 보였으며, 총 1,673개의 아미노산 중에서 단 5개의 아미노산 서열(0.4%)만이 다르게 분석되었다. 이는 내 NtROS2a와 NtROS2b 유전자는 동형 단백질(isoforms)인 것으로 사료된다.

실시예 2. NtROS2a 유전자의 발현 검정 및 기능 분석

NtROS2a 유전자의 세포 내 발현 여부를 확인하기 위하여, GFP 융합 유전자를 이용하여 NtROS2a의 양파 세포 내로 도입하여 유전자의 발현양상을 살펴본 결과, 세포의 핵에서 발현함을 확인할 수 있었다(도 2).

식물에서 NtROS2a는 다양한 신호전달 자극에 반응하여 직접적으로 조절하는 역할을 한다. 즉, 다양한 환경 스트레스 조건하에서 유전자가 반응하여 작물의 생육에 영향을 미치는 것으로 사료된다. 이러한 NtROS2a의 기능을 분석하기 위하여 염분(250mM)이 첨가된 물, 100μM의 ABA 및 산화적 스트레스를 검정하기 위한 3%의 과산화수소를 배지에 첨가하고 식물체에 처리한 후 RNA를 추출하여 NtROS2a 유전자의 발현을 검토하였다. 그 결과, 상기 스트레스를 처리한 후 6시간째 NtROS2a 유전자의 발현이 가장 높게 유도되었음을 확인할 수 있었다(도 3).

실시예 3. 형질전환 식물체에서 NtROS2a 유전자의 발현 유도

상기 실시예 2와 같은 환경 스트레스에 반응하는 NtROS2a 유전자를 식물체에 도입하기 위하여 벡터구축을 시행하였다. 식물 과발현용 Ti-플라스미드 벡터는 CaMV 35S 프로모터에 의해 제어되도록 구축하였고, 선발마커는 카나마이신을 사용하였다(도 4A). 또한 게놈 내 존재하는 NtROS2a 유전자의 발현을 억제시켜 과발현 양상과 비교 분석하기 위하여 RNAi 벡터를 구축하였다. RNAi(interference) 벡터는 PDK 인트론(intron)의 양 말단에 양방향으로 디자인된 염기를 삽입하여 두 가닥의 RNA에 의해 배열 특이적으로 mRNA가 분해되어 유전자 발현이 억제되도록 작성하였다. 또한 CaMV 35S 프로모터에 의해 제어되도록 구축하였으며, 선발마커는 카나마이신을 사용하였다(도 4B). 이와 같이 구축된 각각의 벡터를 이용하여 아그로박테리움(Agrobacterium) LBA4404에 형질전환하여 식물체 내로 도입하여 재분화를 유도하여 형질전환 식물체를 제작하였다(도 4C). 제작된 형질전환체로부터 NtROS2a 유전자의 도입 여부를 확인하기 위하여, RT-PCR 분석을 수행하였다. 분석을 위하여 사용된 프라이머(서열번호 9 및 10) 정보는 하기 표 1과 같다. 유전자의 도입과 발현 검정을 위하여 수행한 RT-PCR 분석 결과, NtROS2a 유전자가 과발현된 형질전환체들(OX1, OX2 및 OX3)에서는 야생형(WT)보다 유전자의 발현이 3배 이상 높게 발현되고 있음을 확인하였으며(도 5A), 상기 유전자의 발현 억제를 위하여 작성한 RNAi 벡터가 삽입되어 유전자의 발현 제어가 일어난 형질전환체들(RNAi12, RNAi13 및 RNAi15)에서는 야생형(WT)보다 유전자의 발현이 현저하게 억제된 넉-아웃(Knock-out)이 일어난 것을 확인할 수 있었다(도 5B).

본 발명에 사용된 프라이머

프라이머	서열번호	염기서열(5'-3')
NtROS2a-F	3	AATGGATGTAGGCCAAGGCA
NtROS2a-R1	4	CTTCACGTATGCTGTTGCATG
NtROS2a-RT F	5	TGTAAGTCTGAGCGAAGAGC
NtROS2a-RT R	6	GGAAAGCTAGGTGGTGAAGT
actin-RT F	7	TACATGTTCACCACCACTGC
actin-RT R	8	AAGCTCCTGCTCGTAGTCAA
35S-F	9	TGAGACTTTTCAACAAAGGGTA
NtROS2a-R2	10	ACAATGGGCTCTGGTGTTGC

실시예 4. 형질전환 식물체에서 NtROS2a 발현 증가에 의한 환경 스트레스 내성 분석

형질전환된 식물체로부터 비생물적 스트레스(abiotic stress) 조건에 노출되었을 경우, NtROS2a 유전자의 발현 양상 및 기능을 분석하기 위하여, 비형질전환체인 야생형(WT, wild type)과 비교하여 조사하였다. 또한 유전자의 발현을 억제시킨 넉-아웃된 형질전환체(RNAi13)와의 비교 실험도 수행하였다. 이러한 분석은 형질전환체의 후대(T₂ 세대)를 육성하여 T₂ 세대에서 고염(20mM NaCl) 및 산화(3% H₂O₂) 조건에 노출이 되었을 때, NtROS2a 유전자의 발현과 식물체의 반응을 살펴보았다. 본 실시예의 진행은 대조구로는 WT, 실험구로는 과발현 형질전환체 OX1 계통 및 넉-아웃 형질전환체 RNAi13 계통을 각각 250mM의 NaCl 및 3%의 H₂O₂가 포함된 액체배지에서 5일 동안 배양한 뒤 엽록소의 함량을 측정하여 분석하였다. 그 결과, WT의 잎의 엽록소 함량은 DDW 처리 시 약 1.45mg/g으로 측정되었으나, 고염에 노출되었을 경우, 약 0.3mg/g으로 감소하였으며, 잎의 세포가 염분에 의해 고사되어 엽록소 함량이 감소된 것으로 판단되었다. NtROS2a 유전자가 과발현된 OX1 계통의 잎은 DDW 처리 시 약 1.40mg/g으로 측정되었으나, 고염 처리 시 약 0.8mg/g으로 감소하여 WT보다는 고염에 대한 내성이 있음을 확인하였다. 그리고 RNAi13 계통의 잎은 DDW 처리 시 약 1.80mg/g으로 측정되었으나, 고염에 노출되었을 경우, 약 0.6mg/g으로 감소하여 OX1 계통보다 고염에 민감하게 반응하는 것으로 분석되었다(도 6A). 산화스트레스 반응 결과에서, 잎이 3%의 H₂O₂에 노출된 경우, WT의 잎의 엽록소 함량은 DDW 처리 시 약 1.40mg/g으로 측정되었으나, 산화스트레스 처리 시 약 0.05mg/g으로 감소하여 고염에 노출된 경우와 같이 H₂O₂ 처리에 의해 잎이 거의 고사하여 엽록소 함량이 감소된 것으로 판단되었다. 이에 반해 OX1 계통의 잎은 DDW 처리 시 약 1.40mg/g으로 측정되었으나, H₂O₂ 처리 시 약 0.25mg/g으로 감소되어 WT보다는 H₂O₂ 에 대한 내성이 있음을 확인하였다. RNAi13 계통의 잎은 DDW 처리 시 엽록소의 함량이 약 1.90mg/g으로 측정되었으나, H₂O₂ 처리 시 약 0.01mg/g으로 감소하여 약 99%가 고사한 것을 확인하였다(도 6B). 따라서, 이러한 결과를 토대로 과발현 형질전환체가 WT 및 RNAi 계통에 비하여 고염 및 산화 스트레스에 대한 내성이 있는 것으로 사료된다.

또한, 형질전환 식물체(OX1 및 RNAi13)가 염 또는 건조 스트레스에 노출되었을 경우, 발아시기부터 뿌리 생장의 변화 양상을 살펴보기 위하여 1/2 MS 고체배지에 125mM의 NaCl 및 2%의 PEG6000을 첨가하여 형질전환 식물체의 종자를 파종하여 발아하는 동안 뿌리 생장을 살펴보았다. 그 결과, 대조구인 WT 식물체는 아무것도 처리하지 않은 배지(control)에서 건전하게 생육한 것에 비하여 125mM의 NaCl 및 2%의 PEG6000을 첨가한 배지에서는 생육이 불량하고, 뿌리의 생장조차 저조하였다. 그러나 OX1 형질전환체는 125mM의 NaCl 및 2%의 PEG6000을 첨가한 배지에서도 대조구(WT)에 비하여 생육이 양호하였고, 뿌리의 생육은 무처리 상태에 비해 저조하지만, 같은 처리구의 WT보다 월등히 길게 생장하였다. 2%의 PEG6000 처리구에서는 WT에 비하여 약 34% 길게 생장한 것을 확인하였다. 넉-아웃계통인 RNAi13 형질전환체는 WT에 비해 뿌리의 길이 생장을 보였으나, 유전자가 과발현된 OX1 계통에 비하여는 현저하게 저조한 것을 확인할 수 있었다(도 7).

실시예 5. 형질전환 담배 식물체에서 NtROS2a 발현 증가에 의한 알루미늄 스트레스 내성 분석

NtROS2a 유전자를 포함하는 담배의 알루미늄 독성에 대한 내성을 확인하기 위해, 야생형 및 NtROS2a 형질전환체 유래의 각 담배종자 20개를 최적화된 MS 배지에 파종하여 21일간 배양 후, 1,000μM의 염화알루미늄을 포함한 MS 배지에 옮겨 생육시켰다. 곁뿌리 길이, 뿌리 길이 및 발아된 유묘의 신초의 생장 정도는 알루미늄 처리 2주 후 측정하였다.

그 결과, 도 8에 개시한 바와 같이 NtROS2a 형질전환 담배 계통은 야생형(WT)에 비해 더 우수한 신초(shoots) 및 뿌리(roots) 생장을 나타내었을 뿐만 아니라, 곁뿌리 길이도 더 증가한 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 NtROS2a 형질전환 담배 계통이 높은 농도의 염화알루미늄에 대해 내성을 가진다는 것을 나타내며, NtROS2a 유전자가 넉-아웃(knock-out)된 RNAi 형질전환체에서는 탈메틸화 되지 못하기 때문에 야생형(WT)과 유사하게 생장저해를 보인 것으로 판단된다. 따라서, NtROS2a 유전자는 담배 세포 내에 알루미늄 등의 비생물적 스트레스에 내성을 지니는 탈메틸화효소 기능을 갖고 있다고 할 수 있다.

<110> Hankyong Industry Academic Cooperation Center <120> NtROS2a gene involved in demethylation from Nicotiana tabacum and uses thereof <130> PN16459 <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 5879 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 1 aggaaaaatg ccttgccgtt tctgtttggc ctttttccta ctttccctcc ccctctttaa 60 tggtgtactc tgcttccatg agatctccgt caattatcca tttctcagga taatttcata 120 aaaaaaaaaa attggtactg aagaattaat aatcttctct aagtcctgga caaggttgag 180 ttttctcata aaaaattgtt tatgtcaaat tgaagaagat aaaggggaga aaagattgga 240 tttttaccag ttttccagag ctgcaaaatg gatgtaggcc aaggcagctc gattgaagaa 300 attaaggatt tacagaccaa cacttcatgg attccagcaa ctccggggaa gccaggtttt 360 gcgacattgc caccaattag caagaatagg caggaaaccc agccagctca agttgattgg 420 tcggagttgc agacgaaaaa agcagaagca gtagcagcac atgctgctgg cgccacagcc 480 gaagctcaaa atgcggctgc atacaatggt tcaacaagtt cagtaacagt agatcagtgc 540 ttcaccacct gggaagcagc agtaggcaca aaatcggaaa tgtatggagg tggtataaag 600 atgtgcaata acttctctag tgataacgta gacatgtgga ctaatgtgtc 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ccaaacaaac taacagcatt caatatcatg cagttctaag ccagatggtg aaagaagata 5760 ggtatcttgt taacttataa agtagaaacg aaagtgagat gataattttt ttgtaaataa 5820 cagttatgat gtttctttaa atagcaacaa tttattgggt caaaaaaaaa aaaaaaaaa 5879 <210> 2 <211> 1673 <212> PRT <213> Nicotiana tabacum <400> 2 Met Asp Val Gly Gln Gly Ser Ser Ile Glu Glu Ile Lys Asp Leu Gln 1 5 10 15 Thr Asn Thr Ser Trp Ile Pro Ala Thr Pro Gly Lys Pro Gly Phe Ala 20 25 30 Thr Leu Pro Pro Ile Ser Lys Asn Arg Gln Glu Thr Gln Pro Ala Gln 35 40 45 Val Asp Trp Ser Glu Leu Gln Thr Lys Lys Ala Glu Ala Val Ala Ala 50 55 60 His Ala Ala Gly Ala Thr Ala Glu Ala Gln Asn Ala Ala Ala Tyr Asn 65 70 75 80 Gly Ser Thr Ser Ser Val Thr Val Asp Gln Cys Phe Thr Thr Trp Glu 85 90 95 Ala Ala Val Gly Thr Lys Ser Glu Met Tyr Gly Gly Gly Ile Lys Met 100 105 110 Cys Asn Asn Phe Ser Ser Asp Asn Val Asp Met Trp Thr Asn Val Ser 115 120 125 Phe Gly Asp Leu Leu Ala Met Ala His Ala Ala Gly Thr Thr Pro Ala 130 135 140 Ala Glu Asn Ala Lys Asp Asp Thr Val Tyr Ser Ala Gly Ser Ser Phe 145 150 155 160 Lys Pro Leu Ile Ser Ser Gln Ser Pro Asp Gly Ser Ser Thr Ile Pro 165 170 175 Ser Ser Pro Phe Asn Leu Asn Ser Pro Leu Arg Met Thr Asp Ala Ile 180 185 190 Leu Ser Asn Val Pro Phe Lys Phe Glu Pro Val Thr Pro Asp Leu Ile 195 200 205 Lys Ser Thr Arg Gln Ala Ser Asn Ala Ser Asn Leu Asp Ile Asn Val 210 215 220 Thr Thr Leu Pro Arg Gly Val Gln Ser Asn Glu Asp Thr Ile Lys Arg 225 230 235 240 Thr Glu Ala Asn Glu Leu Gln Gln Ser Arg Glu Gln Ser Glu Leu Val 245 250 255 Leu Asn Gln Ser Glu Leu Gln Glu Asn His Lys Leu Asp Met Glu Gly 260 265 270 Lys Gln Asp Ser Glu Leu Asn Asn Thr Pro Glu Gln Lys Gln Arg Arg 275 280 285 Arg Lys His Arg Pro Lys Val Val Val Glu Gly Lys Pro Lys Arg Thr 290 295 300 Pro Lys Arg Arg Thr Glu Lys Gln Pro Gly Ser Val Glu Thr Lys Thr 305 310 315 320 Glu Lys Arg Lys Tyr Val Arg Arg Asn Lys Val Gly Ser Pro Ala Pro 325 330 335 Thr Ser Ala Glu Glu Val Asn Asn Thr Ile Asp Glu Gly Lys Thr Pro 340 345 350 Ser Ser Lys Glu Thr Pro Pro Ala Lys Arg Lys Tyr Val Arg Arg Asn 355 360 365 Gln Val Lys Lys Ser Thr Glu Lys Pro Ser Glu Glu Gly Asn Gly Gly 370 375 380 Thr Thr Glu Pro Lys Lys Val Ser Leu Pro Arg Lys Ser Cys Arg Arg 385 390 395 400 Thr Leu Asn Phe Glu Phe Glu Arg Gln Ala Ser Asp Glu Asn Ser Ser 405 410 415 Tyr Arg Ser Ser Thr Leu Asp Leu His Ala Asn Gln Thr Glu Ser Thr 420 425 430 Ala Gln Cys Val Gln Ser Ala Gln Leu Gly Gln Gly Val Glu Ala Pro 435 440 445 Asn Glu Lys Thr Ala Val Gly Thr Thr Tyr Asn Ile Asn Cys Ser Leu 450 455 460 Asn Gln Glu Leu Arg Asn Tyr Leu Ser Gln His Glu Val Gln Tyr Leu 465 470 475 480 Gly Ser Pro Ser Leu Asp Lys Val Gly Trp Asn His Asp Lys Val Ile 485 490 495 Val Gly Asn Gln Asn Glu Ser Thr Arg Gly Asn Tyr Arg Ile Asn Phe 500 505 510 Ser Asp Leu Thr Arg Asp Lys Gln Ala Ser Ile Val Gln Met Thr Pro 515 520 525 Gln Ser Pro Asn Cys Ser Asn Cys Ser Ser Ser Thr Cys Leu Pro His 530 535 540 Gly Lys Gly Leu Lys Arg Gln His Ser Tyr Arg Thr Asp Glu Ala Gln 545 550 555 560 Phe Tyr Ser Leu Asn Ala Arg Gly Val Tyr Phe Asn Ser Met Gln Ala 565 570 575 Tyr Gln Ala Ile Leu Pro Ala Asn Glu Pro Glu Val Tyr Ser Asn Leu 580 585 590 Gly Met His Cys Pro Ala Ile Tyr Lys Lys Lys Arg Thr Glu Glu Gly 595 600 605 His Ser Ser Ala Ala Phe Tyr Ile Lys His Phe Thr Ser Lys Ile Asn 610 615 620 Cys Val Pro Ser Ser Gln Cys Asn Ile Ser Gly Ser Pro Ser Asn Asn 625 630 635 640 Ser Ser Thr Asn Ile Ala Tyr Asn Arg Leu Gln Asn Ser Asp Phe Val 645 650 655 Pro Ala Val Val Glu Ala Glu Lys Leu Arg Lys Arg Arg Ser Lys Gly 660 665 670 Ala Thr Gln Val His Glu Leu Ala Ser Val His Glu Ile Tyr Lys Gln 675 680 685 Phe Gln Thr Ser Thr Ser Lys Tyr Ala Thr Lys Cys Arg Leu Gly Glu 690 695 700 Arg Tyr Lys Thr Ser His Leu Ser Asn Ala Cys Met Glu Ala Pro Ile 705 710 715 720 Ala Asp Thr Arg Ala Pro Met Lys Thr Lys Lys Gln Ser Lys Lys Ser 725 730 735 Thr Phe Val Ser Ser Thr Ala Ser Asn Met Tyr Ile His Gln Gln Phe 740 745 750 Thr Thr Asn Ala Arg Gly Pro Pro Pro Ala Leu Thr Trp Arg Gly Met 755 760 765 Ser Pro Ile Asp Glu Ile Ala Glu His Leu Gln Arg Leu Asp Leu Asn 770 775 780 Arg Glu Ser Ser Gln Ile Gln Gly Gln His Gly Ser Val Thr Tyr His 785 790 795 800 Thr Lys Phe Gln Gly Glu Ser Ala Leu Val Leu Tyr Gln Arg Asp Gly 805 810 815 Ser Ile Val Pro Phe Gly Ser Ser Leu Val Arg Lys Arg Lys Pro Arg 820 825 830 Pro Lys Val Asp Val Asp Asp Glu Thr Asp Arg Val Trp Lys Leu Leu 835 840 845 Leu Gln Asp Ile Asn Ser Glu Gly Val Asp Gly Thr Asp Glu Asp Lys 850 855 860 Ala Lys Trp Trp Glu Glu Glu Arg Arg Val Phe Asn Ser Arg Ala Asp 865 870 875 880 Ser Phe Ile Ala Arg Met Arg Leu Val Gln Gly Asp Arg Arg Phe Ser 885 890 895 Pro Trp Lys Gly Ser Val Val Asp Ser Val Val Gly Val Phe Leu Thr 900 905 910 Gln Asn Val Ser Asp His Leu Ser Ser Ser Ala Phe Met Ser Leu Ala 915 920 925 Ala His Phe Pro Leu Lys Thr Lys Ser Ser Thr Gln Lys His Glu Gly 930 935 940 Arg Thr Ala Ile Ile Ile Glu Glu Pro Glu Ala Cys Ala Thr Asp Pro 945 950 955 960 Ile Val Ser Ile Arg Trp His Glu Asp Gln Glu Asn Gln Ser Thr Arg 965 970 975 Cys Gln Asp Ser Trp Arg Val His Asn Thr Tyr Ser Asn Glu Glu Lys 980 985 990 Thr Ala Ala Ser Ser Ser Glu Ser Ser Glu Asn Ser Thr His Cys Ile 995 1000 1005 Lys Ser Ala Glu His Ser Val Ile Leu Gln Ser Asp Ser Ser Arg Glu 1010 1015 1020 Gly Ser Asp Leu Tyr His Glu Ser Thr Leu Met Gly Phe Arg Asp Lys 1025 1030 1035 1040 Lys Glu Leu Asn Asp Leu Pro Ser Ser Pro Ser Ser Val Val Ser Ser 1045 1050 1055 Glu Asn Ser Ala Val Ile Gln Thr Ser Glu Arg Thr Asp Thr Ser Ser 1060 1065 1070 Phe Cys Ser Ser Thr Ser Phe Leu Lys Leu Leu Gln Met Ala Gly Thr 1075 1080 1085 Ser Gly Ala Arg Gly Thr Thr Cys Thr Glu Tyr Leu His Glu Cys Gly 1090 1095 1100 Asn Phe Pro Val Leu Arg Lys Glu Gly Ser Ala Leu Glu Gln Ser Gly 1105 1110 1115 1120 Ser Leu Val Glu Cys Ala His Pro Glu Leu Tyr Thr Thr Leu Arg Ser 1125 1130 1135 Glu Thr Tyr Ile Ser Cys Asn Ser Pro Gln Asn Lys Leu Asp Ile Glu 1140 1145 1150 Thr Val Asn Asn Ala Glu Val Asn Val Glu Leu Gln Phe Gln Thr Glu 1155 1160 1165 Asp Arg Asn Cys Asn Val Pro Gln Val Pro Glu Ala Pro Thr Ser Ser 1170 1175 1180 Glu Thr Asn Ile Glu Val Thr Glu Arg Ala Ser Ile Val Val Asp Ser 1185 1190 1195 1200 Cys Lys Ser Glu Arg Arg Ala Val Glu Ser Asn Leu Lys Asn Val Ser 1205 1210 1215 Asp His Ala Cys Ser Lys Val Asp Ser Val Asn Asp Asn Pro Ser Lys 1220 1225 1230 Ala Lys Lys Gly Gln Leu Gly Lys Glu Lys Glu Asn Ile Asp Trp Asp 1235 1240 1245 Ser Leu Arg Leu Glu Ala Gln Ala Asn Gly Lys Lys Arg Glu Lys Thr 1250 1255 1260 Ala Asn Thr Leu Asp Ser Leu Asp Trp Glu Ala Val Arg Cys Ala Asn 1265 1270 1275 1280 Val Asn Glu Ile Ala His Thr Ile Arg Glu Arg Gly Met Asn Asn Lys 1285 1290 1295 Leu Ala Glu Arg Ile Lys Asn Phe Leu Asn Arg Ile Val Ser Glu His 1300 1305 1310 Gly Ser Ile Asp Leu Glu Trp Leu Arg Asp Val Pro Pro Asp Lys Ala 1315 1320 1325 Lys Glu Tyr Leu Leu Ser Ile Arg Gly Leu Gly Leu Lys Ser Val Glu 1330 1335 1340 Cys Val Arg Leu Leu Thr Leu His His Leu Ala Phe Pro Val Asp Thr 1345 1350 1355 1360 Asn Val Gly Arg Ile Ala Val Arg Leu Gly Trp Val Pro Leu Gln Pro 1365 1370 1375 Leu Pro Glu Ser Leu Gln Leu His Leu Leu Glu Leu Tyr Pro Ile Leu 1380 1385 1390 Glu Ser Ile Gln Lys Tyr Leu Trp Pro Arg Leu Cys Lys Leu Asp Gln 1395 1400 1405 Arg Thr Leu Tyr Glu Leu His Tyr His Met Ile Thr Phe Gly Lys Val 1410 1415 1420 Phe Cys Thr Lys Ser Lys Pro Asn Cys Asn Ala Cys Pro Leu Arg Gly 1425 1430 1435 1440 Glu Cys Arg His Phe Ala Ser Ala Phe Ala Ser Ala Arg Leu Ala Leu 1445 1450 1455 Pro Ala Pro Glu Glu Lys Ser Ile Val Ser Ala Thr Glu Asn Lys Ala 1460 1465 1470 Ser Asn Asn Asn Pro Arg Glu Asn Phe Thr His Leu Pro Leu Pro Leu 1475 1480 1485 Pro Pro Gly Asn Gln Gln Pro Val Glu His Gln Lys Leu Ile Asn Ser 1490 1495 1500 Ala Pro Ile Ile Glu Val Pro Ala Thr Pro Glu Pro Ile Val Glu Leu 1505 1510 1515 1520 Pro Ala Thr Pro Glu Gln Glu Gln Ile Gln Ala Pro Glu Ile Asp Ile 1525 1530 1535 Glu Asp Thr Tyr Phe Glu Asp Pro Cys Glu Ile Pro Thr Ile Glu Leu 1540 1545 1550 Asn Met Ala Glu Phe Thr Gln Asn Leu Lys Lys Tyr Val Lys Asn Asn 1555 1560 1565 Met Glu Leu His Gln Val Glu Ile Ser Asn Ala Leu Val Ala Leu Thr 1570 1575 1580 Ser Glu Ala Ala Ser Ile Pro Val Pro Lys Leu Lys Asn Val Ser Arg 1585 1590 1595 1600 Leu Arg Thr Glu His Gln Val Tyr Glu Leu Pro Asp Ser His Pro Leu 1605 1610 1615 Leu Glu Gly Leu Asp Lys Arg Glu Pro Asp Asp Pro Cys Ser Tyr Leu 1620 1625 1630 Leu Ala Ile Trp Thr Pro Gly Glu Thr Ala Asn Ser Phe Gln Pro Pro 1635 1640 1645 Glu Thr Gln Cys Asn Ser Gln Glu Ser Gly Lys Leu Cys Glu Asn Glu 1650 1655 1660 Thr Met Phe Leu Met Gln Gln His Thr 1665 1670 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 aatggatgta ggccaaggca 20 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 cttcacgtat gctgttgcat g 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 tgtaagtctg agcgaagagc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ggaaagctag gtggtgaagt 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 tacatgttca ccaccactgc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 aagctcctgc tcgtagtcaa 20 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 tgagactttt caacaaaggg ta 22 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 acaatgggct ctggtgttgc 20

Claims (8)

1. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 담배 유래의 탈메틸화 관련 NtROS2a(Nicotiana tabacum repressor of silencing 2a) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 NtROS2a 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물체의 환경 스트레스 내성을 조절하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 NtROS2a 유전자를 과발현시켜 식물체의 환경 스트레스 내성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 식물체의 환경 스트레스 내성을 조절하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 환경 스트레스는 건조, 염, 산화 또는 알루미늄 스트레스인 것을 특징으로 하는 식물체의 환경 스트레스 내성을 조절하는 방법.
4. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 담배 유래의 탈메틸화 관련 NtROS2a(Nicotiana tabacum repressor of silencing 2a) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
   상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 환경 스트레스 내성이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 NtROS2a 유전자를 과발현시켜 식물체의 환경 스트레스 내성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 환경 스트레스 내성이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법.
6. 제4항 또는 제5항의 방법에 의해 제조된 환경 스트레스 내성이 조절된 형질전환 식물체.
7. 제6항의 환경 스트레스 내성이 조절된 식물체의 형질전환된 종자.
8. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 담배 유래의 탈메틸화 관련 NtROS2a(Nicotiana tabacum repressor of silencing 2a) 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는 식물체의 환경 스트레스 내성 조절용 조성물.

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