TWI363799B - Udp-glucuronosyltransferase and polynucleotide encoding the same - Google Patents

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1363799 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明涉及UDP-葡萄糖醛酸轉移酶、編碼該酶的多核 *苷酸、含有該多核苷酸的載體、轉形體等。 【先前技術】 • 以食用經驗豐富的類黃酮（f lavonoid)、木脂素 (1 ignan)為代表的多紛類植物次生代謝產物，其由抗氧化 性為代表的功能性，從很早以前就作為功能性材料受到注 癱 目，且已作為保健食品進行銷售。例如，槲皮素（quercetiη) (類黃酮）、0ΤΡΡ(類黃酮）、芝麻素（sesamin)(木脂素）等均 是保健食品的代表性材料。 對植物細胞中類黃酮的生物合成途徑的研究從很早以 前就已開始，且催化代謝途徑的生物合成酶及編碼該酶的 基因係經分離，對其分子結構的理解也正在深入探討。 另一方面，對植物次生代謝產物被攝入體内（i n vi vo) ^ 後，是以何種形態代謝、是否表現功能這方面的認知還很 缺乏。 已知一般植物的次生代謝產物的糖苦化係不論糖的種 類（葡萄糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖等）為何，均由 屬於被稱作 UDP-糖轉移酶（UGT: UDP-glycosyl transferase) - 的超家族的酶進行催化。且在芝麻素的研究例中顯示出， 次生代謝產物在體内係經過兒茶酚而作為葡萄糖醛酸接合 物存在，所以，認為此葡萄糖酸酸接合物係擔負植物次生 代謝產物在體内功能表現的一部分作用。 320627 1363799 已證實作為哺乳類中的槲皮素代謝物，存在有4種單 葡萄糖駿酸苷（m〇noglucuronide)(Q-3-GlcA、Q-7-GlcA、 Q-3’-GlcA、Q-4’-GlcA)(非專利文獻l:Day，AJetal,FΓee Radic. Res. 35，941-952，2001 ;非專利文獻 2 : Moon, JH. et al. Free Radical Biology & Medicine 30, 1274-1285，2001 ;非專利文獻 3 : O’Leary, KA. et al. Biochemical Pharmacology 65，479-491, 2003;非專利 文獻 4 : van der Woude, H. et al· Chem Res Toxicol. 17, 1520-1530，2004)，但要瞭解該等在生物體内的功能，則 需要獲得充分量的化合物以測定其活性。但是，至今為止， 基質特異性廣泛的適合的UDP-葡萄糖醛酸轉移酶還不為人 所知’且結合位置特異的反應生成物在現實中還不可能以 化學合成。

已知唇形科黃芩（Scutellaria bai cal ensis)的根被 稱為黃答’其蓄積有抗氧化性高的黃酮的7位葡萄糖醛酸 接合物’在食品藥品劃分上被分類為醫藥品（非專利文獻 5 Gao, Z. et al. Biochemica et Biophysica Acta 1472, 643__65()· 1999)。到目前為止，從唇形科黃芩中，作為黃 酉同的7位葡萄糖醛酸轉移酶的Sb7GAT已被純化，但該酶只 對汽S同7位羥基的鄰位上具有羥基等取代基的黃酮（黃芩 ”素（ba^Calein)、高黃芩素（scutel larein)等）具有活 +於作為主要的黃酮的芹菜素（ap i gen i η) '毛地黃 汽酉同（lute〇iin)、還有作為黃酮醇的一種的槲皮素不具有 專矛】文獻 6. NagashimaS. etal.，Phytochemistry 4 320627 1363799 53，533-538，2000.)。此外，對應此Sb7GAT的基因雖已 在GenBank中註冊（註冊號No. AB042277)，但其功能還未 付到確認。 另外，已知在具有食用經驗的唇形科紫蘇（Perilla frutescens a red-leaf variety)中，蓄積有比黃答更多 種的黃酮7位葡萄糖酿酸接合物（非專利文獻7: Yamazaki, M. et al. Phytochemistry 62， 987-998. 2003)。 非專利文獻 1 : Day, AJ et al. Free Radic. Res. 35, 941-952, 2001 非專利文獻 2:Moon, JH. etal. Free Radical Biology & Medicine 30, 1274-1285, 2001 非專利文獻 3 : O’Leary, KA. et al. Biochemical Pharmacology 65, 479-491, 2003 非專利文獻 4 : van der Woude, H. et al. Chem Res Toxicol. 17, 1520-1530, 2004 非專利文獻 5 : Gao, Z. et al.Biochemica et

Biophysica Acta 1472, 643-650, 1999 与隹專矛1J 文獻 6 : Nagashima S. et al. , Phytochemistry 53, 533-538, 2000. 非專利文獻 7 : Yamazaki, M. et al. Phytochemistry 62, 987-998, 2003 【發明内容】 (發明欲解決之課題） 此種狀况下，希望鑒定出基質特異性廣泛的新型UDP- 320627 葡萄糖醛酸轉移酶及編碼該酶的基因。 (解決課題之手段） 本發明鑒於上述狀況，提供如下述所 醛酸轉移酶、編碼該 1自糖 的载體及轉形體等。 t技从含有該多核苦酸 (1)一種多核苷酸，其是以 ㈣： F(a)至⑴t任—項所述的多核 種户核苦酉夂’其含有由選自序列號碼：4所表示 的驗基序列的第1位至第】^ 主弟1359位鹼基序列 '序列號碼：i 〇 所表不的鹼基序列的第1位至坌 ❹-他Λ 位驗基序列、序列號 :皮1:斤表不的鹼基序列的第1位至第咖位驗基序列 =!_22所表示的驗基序列的第1位至第1371位 如土序列巾的Η紐基序列所組成的多核苦酸. .㈤一種多核苷酸，其含有編碼具有選自序列號碼：5、 U、13及23中的1種胺基酸序列的蛋白質的多核苦酸； (c)種夕核苷酉夂’其含有編碼由選自序列號碼：5、 1卜13及23中的1種胺基酸序列中有個胺基酸發 生缺失、取代、插入及/或加成的胺基酸序列所組成且具 有UDP-葡萄贿酸轉移酶活性的蛋白質的多核誓酸； ⑷種夕核皆g义’其含有編石馬具有與選自序列號碼： 5、11 13及23中的1種胺基酸序列有繼以上同源性的 胺基酸序列且具有脈-葡萄糖搭酸轉移酶活性的蛋白質的 多核苷酸； (e)-種多核賊’其含有與由選自序列號碼：4所表 320627 6 示的驗基序列的第】位至第】359位鹼基序列、序列號碼： 10所表示的驗基序列的第1位至第1365位㈣㈣、序 .列號碼.12所表示的驗基序列的第ι位至第聊位驗基 ，序列及序列號碼：22所表示的驗基序列的第！位至第1371 ••位驗基㈣中的1種驗基序列的互補驗基序列所組成的多 核皆酸在嚴謹條件下雜交，且編碼具有卿一葡萄祕酸轉 移酶活性的蛋白質的多核苷酸；或 # ⑴―種多核賴’其含有與由編碼選自序列號碼：5、 11 13及23 t的1種胺基酸序列所組成的蛋白質的多核 苦酸的鹼基序列的互補驗基序列組成的多核苦酸在嚴謹條 件下雜*且編碼具有卿_葡萄糖酸酸轉移酶活性的蛋白 質的多核苷酸。 ⑵上述⑴中所述的多核純，其是以下⑷至⑴中的任 一項： (g)-種多核魏，其含有編碍由選自序列號碼：5、 1卜13及23甲的i種胺基酸序列中有1〇個以下（〇至1〇 個）的胺基酸發生缺失、取代、插入及/或加成的胺基酸序 列所組成且具有UDP_葡萄祕酸轉移酶活性的蛋白質 核苷酸； ' ⑹-種多核倾，其含有編碼具有與選自序列號碼： 5' 1卜13及23中的】種胺基酸序列有_以上同源性的 胺基酸序列且具有聊-葡萄祕酸轉移酶活性的蛋白質 多核普酸； ' ⑴一種多核魏，其含有與由選自序列號碼：4所表 320627 7 1363799 示的驗基序列的第1位至第1359位驗基序列、序列號碼： 10所表示的驗基序列的帛1位至第1365位驗基序列、序 .列號碼：12所表示的驗基序列的第i位至第1371位驗基 .序列、及序列號喝：22所表示的驗基序列的第丄位至第1371 •位鹼基序^的i種驗基序列的互補驗基序列所組成的多 核苦嚴祕件下雜交，且編碼具有UDpn糖酿酸 轉移酶活性的蛋白質的多核苷酸；或 • (])種夕核苷酸，其含有與由編碼選自序列號碼：5、 11 13及23中的1種胺基酸序列所組成的蛋白質的多核 苦酸的鹼，序列的互補驗基序列組成的多核皆酸在高嚴謹 条件下雜& i編媽具有贈_葡萄糖酿酸轉移酶活性的蛋 白質的多核苷酸。 L )一上<(1)中所逃的多核苦酸，其含有由序列號碼：4所 、不的驗基序列的第1位至第1359位驗基序列所組成的多 核苷酸。 • )_上、⑴中所述的多核㈣’其含有由序列號碼：10所 =的驗基序_第丨，位至第讓位驗基序列所組成的多 序哀甘酸。 一）中所述的多核苷酸，其含有由序列號碼：12所 .^基序列的苐1位至第1371位驗基序列所組成的多 不亥甘酸^。 处⑴中所述的多核芽酸，其含有由序列號碼：22所 核^吏驗基序列的第1位至第1371位驗基序列所組成的多 320627 8 的胺美辦i中所迷的多核苦酸’其含有由編碼序列號碼：' ，基酸相賴成的蛋自質的多核魏。 11的脸其i中所返的多核苦酸，其含有由編碼序列號碼： 11的心基酸相所組成

⑼上述⑴中所述的，，㈣I η ^ Ηώ a ^ ^ 私甘馱，其含有由編碼序列號碼： =酸序列所組成的蛋白質的多核苦酸。 ((iHH0。)中任"'項所述的多核芽酸，其是臟。 核普酸所編碼。 过⑴至⑴）中任一項所述的多 =:種載體’其含有上述⑴至⑼中任一項所述的多核 (14) 一種轉形體，其.導入^ 多核苷酸。 $ ^⑴至⑴）中任-項所述的 (15) -種轉形體，其導人有上述（13)中所述的載體。 ⑽-種上述⑽中的蛋白㈣製造方法 (14)或（15)中所述的轉形體。 使用上述 ⑽-種葡萄_酸接合物的製造方法，其係以上述 中所述的蛋白質作為催化劑’由U，葡萄糖醛 生成葡萄糖醛酸接合物。 '只嗣 (發明之效果） 本發明的多核㈣，係藉由例如導人至轉妒 於新型UDP-葡萄糖醛酸轉移酶的製造。本發明之浐户〜矜 320627 9 1363799 的UDP-葡萄糖酸酸轉移酶，其基質特異性廣泛， 種糖叉體基質予以葡萄糖醛酸化的活性。 。有將多

[序列表非關鍵詞] 序列號碼： 1 :合成DNA 序列號碼： 2 :合成DNA 序列號喝： 6 :合成DNA 序列號碼： 7 :合成DNA 序列號碼： 8 :合成DNA 序列號碼： 9 :合成DNA 序列號碼： 14 :合成DNA 序列號碼： 15 :合成DNA 序列號碼： 16 :合成DNA 序列號碼： 17 :合成DNA 序列號碼： 18 :合成DNA 序列號碼： 19 :合成DNA 序列號碼： 20 :合成DNA 序列號碼： 21 :合成DNA 序列號碼： 24 :合成DNA 序列號碼： 25 :合成DNA 【實施方式】 以下詳細說明本發明的UDP-葡萄糖醛酸轉移“ 該If的多核苦酸、含有該多核苷酸的載體、轉形㈣*、、爲瑪 1.本發明的多核苷酸 &等° 首先，本發明提供（a)—種多核苷酸，其含有由選自序 320627 10 1363799 列號碼.4所表示的驗基序列的第j位至第1359位驗基序 列、序列號碼：1〇所表示的驗基序列的第i位至第1365 位驗基序列、序列號碼：i2所表示的驗基序列的第】位至 第1371位驗基序列及序列號碼：22所表示的驗基序列的 第1位至第1371位驗基序列中的！種驗基序列所組成的多 核苷酸（具體而言為臟，以下，也將此等單稱丨“臟”广 及⑻-種多核魏，其含有編碼具有選自序列號碼· 5、 η ' 13及23 t的1種胺基酸相的蛋自f的多核皆酸。 本發明中作為對象的DMA，不限於編碼上述的腳_葡萄糖 酸酸轉移酶的DNA，還包含編碼與此蛋白質功能相同的蛋 白質的其他DNA。功能相同的蛋白質，例如， 由選自序列號碼:5'„、13及23中的〗種胺基=;) 有1至15個胺基酸發生缺失、取代、插入及/或加成的胺 基酸序列所組成，且具有UDP—葡萄糖醛酸轉移酶活性的蛋 白質。此種蛋白質，可例舉為由選自序列號碼· 5、u、13 及23中的1種胺基酸序列中例如有丨至15個、丨至丨4個' 1至13個、1至12個、1至u個、！至1〇個、j至9個、 1至8個、1至7個、1至6個（1至數個）、；[至5個、工至 4個、1至3個、1至2個、1個胺基酸殘基發生缺失、取 代、插入及/或加成的胺基酸序列所組成，且具有卯卜葡 萄糖醛酸轉移酶活性的蛋白質。上述胺基酸殘基之缺失、 取代、插入及/或加成的數量，一般以越小越佳。並且， 此種蛋白質可例舉為具有與選自序列號碼：5、u、13及 23中的1種胺基酸序列有約8〇%以上、81%以上、82%以上、 11 320627 1363799 83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以 上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94% 以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、 99. 1%以上、99. 2%以上、99. 3%以上、99. 4%以上、99. 5% 以上、99. 6%以上、99. 7%以上、99. 8%以上' 99. 9°/◦以上同 源性的胺基酸序列，且具有UDP-葡萄糖醛酸轉移酶活性的 蛋白質。上述同源性的數值，一般以越大越佳。 在此處，“UDP-葡萄糖醛酸轉移酶活性”是指催化將 類黃酮、芪（st i 1 bene)及木脂素等的經基予以葡萄糖搭酸 化（例如將黃酮的7位的羥基予以葡萄糖醛酸化）而生成葡 萄糖酸酸接合物的反應的活性。 UDP-葡萄糖醛酸轉移酶活性，例如，可藉由使UDP-葡 萄糖醛酸與糖受體基質（例如，黃酮）在作為評價對象的酶 的存在下反應，用HPLC等分析反應物而進行測定（更具體 而言i參照後述實施例中的記載）。 此外，本發明還包含（e)—種多核苦酸，其含有與由選 自序列號碼：4所表示的鹼基序列的第1位至第1359位鹼 基序列、序列號碼：10所表示的鹼基序列的第1位至第1365 位鹼基序列、序列號碼：12所表示的鹼基序列的第1位至 第1371位鹼基序列及序列號碼：22所表示的鹼基序列的 第1位至第1371位鹼基序列中的1種鹼基序列的互補鹼基 序列所組成的多核苷酸在嚴謹條件下雜交，且編碼具有 UDP-葡萄糖醛酸轉移酶活性的蛋白質的多核苷酸；及（f) 一種多核苷酸，其含有與由編碼選自序列號碼：5、11、13 320627 1363799 及23中的1種胺基酸序列所組成的蛋白質的多核苦酸的驗 基序列的互補驗基序列組成的多核苦酸在嚴謹條件下雜 交，且編碼具有UDP-葡萄糖醛酸轉移酶活性的蛋白質的多 核誓酸。 • 本說明書中，“多核苷酸”指DNA或RNA。 本說明書中，“在嚴謹條件下雜交的多核苦酸，，是指 例如’以由選自序列號碼：4所表示的鹼基序列的第1位 至第1359位鹼基序列、序列號碼：1〇所表示的驗基序列 ® 的第1位至第1365位鹼基序列、序列號碼：12所表示的 驗基序列的第1位至第1371位驗基序列及序列號碼：22 所表示的驗基序列的第1位至第1371位驗基序列中的1種 驗基序列的互補驗基序列所組成的多核苦酸、或由編石馬選 自序列號碼：5、11、13及23中的1種胺基酸序列的多核 苦酸的驗基序列的互補驗基序列所組成的多核苷酸的全部 或一部分作為探針’藉由使用菌落雜交法、噬菌斑雜交法 • 或Southern雜交法等所得到的多核苷酸。雜交的方法，例 如可使用 “Sambrook& Russell，Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor,

Laboratory Press 2001”、“Ausubel，Current Protocols in Molecular Biology， John Wiley & Sons 1987-1997” 等中所記載的方法。 本說明書卡所述的“嚴謹條件”，可為低嚴謹條件、 中嚴謹條件及高嚴謹條件中的任一種。“低嚴謹條件”， 例如，為 5xSSC、5xDenhardt 溶液、〇. 5% SDS、50%曱醯胺、 320627 1363799 32ΐ的條件。“中嚴謹條件”，例如，為5xSSC、5xDenhardt 溶液、0. 5%SDS、50%曱酿胺、42°C的條件。“高嚴謹條件”， 例如，為 5xSSC、5xDenhardt 溶液、0. 5% SDS、50%曱醯胺、 5〇°C的條件。在上述條件中，越提高溫度，越能期待有效 地獲得具有高同源性的DNA。但影響雜交嚴謹性的因素還 可為溫度、探針濃度、探針長度、離子強度、時間 '鹽濃 度等多種因素，本領域業者可藉由適當選擇此等因素而實 I 現同樣的嚴謹條件。 並且，當雜交中使用市售的套組B寺，例如，可使用 Alkphos Direct Labelling Reagents(Amersham Pharmacia 公司製）。此時，根據套組中附帶的說明方案，與經標記的 探針進行保溫一夜後，將膜在55°C的條件下用含有0.1% (w/v)SDS的1次洗滌緩衝液洗滌，之後可檢測經雜交的 DNA。 除上述以外，就可雜交的多核苷酸而言，在藉由 • FASTA、BLAST等同源性搜索軟體並使用默認參數計算時， 可例舉為與選自序列號碼：4所表示的鹼基序列的第1位 至第1359位鹼基序列、序列號碼：10所表示的鹼基序列 的第1位至第13 6 5位驗基序列、序列號碼：12所表示的 鹼基序列的第1位至第1371位鹼基序列及序列號碼：22 所表示的鹼基序列的第1位至第1371位鹼基序列中的1種 鹼基序歹彳、.或與編碼選，自序列號碼：5、11、13及23中的 1種胺基酸序列的DNA有約60%以上、約70%以上、71%以 上、、72%以上、73%以上、74%以上、75%以上、76%以上、77% 14 320627 1363799 以上、78%以上、79%以上、80%以上、81%以上、82%以上、 83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以 上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94% 以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、 * 99. 1%以上、99. 2%以上、99. 3%以上、99. 4%以上、99. 5% 以上、99. 6%以上、99. 7%以上、99. 8%以上、或99. 9%以上 同源性的DNA。 並且，胺基酸序列、鹼基序列的同源性係可使用根據 籲 Karlin 及 Altschul 的 BLAST 演算法（proc. Natl. Acad. Sci· USA, 872264-2268， 1990; Proc. Natl. Acad. Sci. USA，90:5873，1993)決定。開發了基於BLAST演算法而 被稱為 BLASTN'BLASTX 的程式（Altschul SF，et al: J. Mol. Biol. 215: 403，1990)。使用BLASTN分析鹼基序列時， 參數例如為 score= 100 ·、wordlength= 12 ° 且使用 BLASTX. 分析胺基酸序列時，參數例如為score=50、wordlength φ = 3。使用BLAST和Gapped BLAST程式時’使用各程式的 默認參數。 上述本發明的多核苷酸可藉由公知的基因工程的方法 或公知的合成方法獲得。 2.本發明的蛋白質 本發明在其他的實施態樣中，提供經上述多核苷酸（a) 至（f)中任一者所編碼的蛋白質。本發明的較佳蛋白質，是 由選自序列號碼：5、11、13及23中的1種胺基酸序列中 有1至15個胺基酸發生缺失、取代、插入及/或加成的胺 15 320627 1363799 基酸序列所組成，且具有UDP-葡萄糖醛酸轉移酶活性的蛋 白質。此種蛋白質，可例舉為由選自序列號碼·· 5、u、13 及23中的1種胺基酸序列中有如上述數量的胺基酸殘基發 生缺失、取代、插入及/或加成的胺基酸序列所組成，且 具有UDP-葡萄糖醛酸轉移酶活性的蛋白質。並且，此種蛋 白質可例舉為具有與選自序列號碼：5、11 ' 13及23中的 1種胺基酸序列有如上所述的同源性的胺基酸序列，且具 有UDP-葡萄糖醛酸轉移酶活性的蛋白質。此種蛋白質，可 使用 “Sambrook & Russell, Molecular Cloning : A Laboratory Manual Vol.3， Cold Spring Harbor, Laboratory Press 2001”、“Ausubel，Current Protocols in Molecular Biology, John Wiely & Sons 1987-1997”、 “Nuc.Acids.Res.，10’6487 (1982)，’、“Proc.Natl· Acad. Sci. USA, 79， 6409 (1982)” 、 “Gene, 34’· 315 (1985)” 、 “Nuc. Acids. Res.， 13, 4431 (1985)” 、“Proc. φ Natl. Acad. Sci. USA，82，488 (1985)” 等中所述的定 點誘變法獲得。 本發明的蛋白質的胺基酸序列中有1個以上的胺基酸 殘基發生缺失、取代、插入及/或加成，是指在同一序列 中任意的且1個或多個胺基酸序列的位置上有1個或多個 胺基酸殘基發生缺失、取代、插入及/或加成之意，也可 同時發生缺失、取代、插入及加成中的2種以上情形。 以下，舉例表示可相互取代的胺基酸殘基。同一組中 包含的胺基酸殘基可相互取代。A組：白胺酸、異白胺酸、 16 320627 1363799 正白胺酸、纈胺酸、正纈胺酸、丙胺酸、2-胺基丁酸、甲 硫胺酸（methionine)、鄰-曱基絲胺酸（o-methylserine)、 第三丁基甘胺酸（t-butyl glycine)、第三丁基丙胺酸 (t-butyl alanine)、環己基丙胺酸（cyclohexyl ‘ alanine) ; B組：天冬胺酸、麩胺酸、異天冬胺酸、異麩 胺酸（isoglutamic acid)、2-胺基己二酸、2-胺基辛二酸 (2-aminosuberic acid) ; C組：天冬酿胺、麵酿胺；D組： 離胺酸、精胺酸、鳥胺酸、2, 4-二胺基丁酸、2, 3-二胺基 鲁 丙酸；E組：脯胺酸、3-羥基脯胺酸、4-羥基脯胺酸；F組： 絲胺酸、蘇胺酸、高絲胺酸；G組：苯基丙胺酸、酪胺酸。 本發明的蛋白質亦可藉由Fmoc法（9-第基曱氧羰基 法）、tBoc法（第三丁氧羰基法）等化學合成法製造。也可 利用Advanced Chem Tech公司製、珀金埃爾默（Perkin Elmer)公司製、Pharmacia 公司製、Protein Technology Instruments 公司製、Synthecel 1-Vega 公司製、 • PerSeptive公司製、島津製作所等的肽合成儀而進行化學 合成。 在此’本發明的蛋白質是UDP-葡萄糖盤酸轉移酶。 UDP-葡萄糖搭酸轉移酶”是催化以UDP-葡萄糖醒·酸作為 糖供體而將葡萄糖醛酸殘基轉移到糖受體基質並生成葡萄 糖搭酸接合物和UDP的反應。本發明中，糖受體基質例如 為類黃酮、、及木脂素。 類黃酮中，包含黃酮、黃酮醇、二氫黃酮（flavan〇ne)、 異黃酮、黃酮C糖苷、噢。弄（aurone)、及兒茶素（catechin) 320627 17 1363799 等。其中’黃酮’例如可例舉為黃芩黃素、高黃芩素、芹 菜素、毛地黃黃酮、五羥黃酮（tricetin)、洋芫荽黃素 (diosmetin)及金聖草黃素（chryS〇eri〇i)。黃_醇，例如 可例舉為槲皮素、楊梅黃素（myricetin)及山奈黃素 (kaempferol)。二氫黃酮，例如可例舉為柑桔素 (naringenin)。異黃酮，例如可例舉為染料木素 (genistein)、大豆黃素（daidzein)及刺芒柄花素 ❿ （formon〇netin)。黃酮c糖苷’例如可例舉為牡荊葡基黃 酮（vitexin)、異牡荊葡基黃酮及狂草素（orientin)。嗅 D弄，例如可例舉為金魚草素（aureusidin)。兒茶素，例如 可例舉為兒茶素及表沒食子兒茶素沒食子酸酯 (epigallocatechin gallate)。 E中包含白藜產醇（Resveratoi)及其糖苷的雲杉新 苷（piceid)等。 木脂素中包含（+ )一松脂醇（（ + )_Pinoresin〇l)、（ + )_胡 # 椒醇（（ + )-PiPeritol)、（ + )-芝麻素酚（（ + )-Sesaminol)、 (+ )-開環異落葉松樹脂齡（（+ )_36〇〇15〇131^以1^以11〇1)、 ( + )_之麻素兒茶驗 1 (( + )_Sesamin catechol 1 )(SC1 )、（+)-芝麻素兒茶盼 2(( + )-Sesamin catechol 2)(SC2)、（ + )-表 之麻素兒茶齡 2(( + )-Episesamin catechol 2)(EC2)及羅 /莫松脂素（matairesinol)等。 而且’例如，關於具有序列號碼：5的胺基酸序列的 UDP-葡萄糖醛酸轉移酶（pfUGT5〇)，當糖受體基質為黃芩黃 ,r' 芹朱素、高黃答素、毛地黃黃酮、五經黃酮、洋完荽 1S 320627 1363799 黃素、金聖草黃素、槲皮素、楊梅黃素、山奈黃素、掛桔 素及金魚草素等類黃酮時、為白藜蘆醇等芪時以及為SCI 等木脂素時，係具有活性；特別是為黃芩黃素、芹菜素、 高黃答素、毛地黃黃酮、五經黃酮、洋芜荽黃素、金聖草 *黃素、槲皮素及金魚草素時，與其他糖受體基質相比具有 強力之活性。 關於具有序列號碼：11的胺基酸序列的UDP-葡萄糖醛 酸轉移酶（S1UGT)，當糖受體基質為黃答黃素、芹菜素、高 I 黃答素、毛地黃黃酮、五經黃酮、洋宪荽黃素、金聖草黃 素、槲皮素、山奈黃素、柑桔素、染料木素、大豆黃素、 刺芒柄花素、及楊梅黃素等類黃酮時、為七葉亭（escu 1 et i η) 等香豆素時、為白藜蘆醇等芪時、以及為SCI、SC2及EC2 等木脂素時，係具有活性；特別是為黃答黃素及芹菜素時， 與其他糖受體基質相比具有強力之活性。 關於具有序列號碼：13的胺基酸序列的UDP-葡萄糖醛 φ 酸轉移酶（AmUGTcglO)，當糖受體基質為黃芩黃素、芹菜 素、高黃荅素、毛地黃黃酮、五經黃酮、洋完荽黃素、金 聖草黃素、槲皮素、山奈黃素、掛桔素及金魚草素等類黃 酮時、以及為白藜蘆醇等芪時，係具有活性；特別是為黃 答黃素、芹菜素、高黃荅素、毛地黃黃酮、五經黃酮、洋 芫荽黃素、金聖草黃素、山奈黃素及柑桔素等類黃目同時， 與其他的糖受體基質相比具有強力之活性。 關於具有序列號碼：23的胺基酸序列的UDP-葡萄糖醛 酸轉移酶（SiUGT23)，當糖受體基質為黃芩黃素、芹菜素、 19 320627 问！芩素、毛地黃黃酮、五羥黃酮、洋芫荽黃素'金聖草 更素'異牡荊葡基黃酮、槲皮素、山奈黃素、柑桔素、金 魚草素、刺芒柄花素等類黃_時、為七葉亭等香豆素時、 為白藜蘆醇等篆時、以及為SC1等木脂素時，係具有活性，· 特別是為黃答黃素、高黃荅素'毛地黃黃酮、五經黃嗣、 山奈黃素及金魚草素㈣黃酮時，與其他的糖受體基質相 比具有強力之活性。

3·载體及導入有該載體的轉形體 本發明在其他的實施態樣中，提供含有本發明的多核 皆酸的表現龍。本發明的表現載體含有上述⑷至⑴中 的任一種多核㈣。本發_表現载驗㈣含有（gh(j 的任-種多核苷酸。本發明的表現載體更佳係含有一種多 =，，其含有：選自由序列號碼:4所表示的驗基序列 =1位至第1359位驗基序列所組成的多料酸、由序列

示⑽基序列的第1位至第_位驗基序 的第1位/由序列麵：12所表示的驗基序列 驗基序列所組成的㈣酸及由序列 列轳瑪· 5 # 種夕核苷酸；或選自編碼由序 碼由:二 =广所組成的蛋白質的多纖 酸、編碼由序列號喝所組成的蛋白質的鳩 多核㈣、以及編喝由序列=酸^所組成的蛋白質的 的蛋白質的多核㈣ =·2 3的胺基酸序列所組成 1 w i種多核苷酸。 320627 20 1363799 本發明的載體’通常如下述所構成，其含有⑴在宿主 細胞内可轉錄的啓動子；（ii)與該啓動子結合的上述⑷ .至⑴中任-項所述的多核苦酸；及⑴i)與舰分子 錄終止及多聚腺苦化（polyadenylati〇n)有關且含有在宿 主細胞内會起作用的信號作為構成因子的表現盒 (exPressi’assette)。如此構建的載體係被導入至宿主 細胞。表現載體的製備方法，可例舉為使用質體 (P1細id)、韻體或賴質體（c_id)等的方法但無特 別限定。 ，體的具體種類無特別限定，可適當選擇在宿主細胞 中可表現的«。即對應宿主細胞_類 Γ的多讓表現，可選擇適合的啓動子序列將ΐί =的多核繼合進各種質體等中的載體作為表現載 本發明的表現載體，依賴於應導人的宿主的種類，含 2現馳區（例如，啓動子、終止子及/或複製起點等）。 ❹相的啓動子（例如， 。動子、心啓動子、lac啓動子等），酵母用 =如=舉為3-_甘祕職酶啓動子、娜啓動子 :，、、.糸狀菌用啓動子例如可例舉為殿粉酶、邮等。且動 ==用啓動子可例舉為病毒性啓動子(例如，㈣ 早期啓動子、SV40晚期啓動子等）。 可使係以含有至少1個選擇標記為佳。此種標記 了使用呂養缺陷型標記（ura5、niaD)、抗藥性標記 320627 21 1363799 (hygromycine、Zeocin)、胺基糖苷類抗生素（Geneticin) 抗性基因（G418r)、銅抗性基因（CUPl)(Marinet al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81，337，1984)、淺藍菌素 (ceru 1 en i η)抗性基因（f as2m，PDR4)(分别參照猪腰淳嗣 等人，生化學，64，660，1992; Hussain et al.，gene，101， 149，1991)等。 且本發明提供導入了上述（a)至（j)中任一項所述的多 $ 核苷酸的轉形體。 轉形體的製備方法（生產方法）無特別限定，例如，可 為將上述重組載體導入至宿主而轉形的方法。在此所使用 的宿主細胞無特別限定，可適當使用以往公知的各種細 胞。具體地說，例如，可例舉為大腸桿菌（E s c h e r i c h i a c 〇⑴ 等細菌、酵母（釀酒酵母（8狂(：(：11&1'011^〇63 06^713丨36)、裂 歹直酵母（Schizosaccharomyces pombe))、線蟲 (Caenorhabditis elegans)、非洲爪蟾（xenopus laevis) • 的卵母細胞等。用於上述宿主細胞的適合的培養基及條件 為本領域所公知。且作為轉形對象的生物也無特別限定， 可為上述宿主細胞中例舉的各種微生物、植物或動物。 宿主細胞的轉形方法可利用一般使用的公知的方法。 例如，可用電穿孔法（Mackenxie D. A. et al. Appl.

Environ. Microbiol.’ 66，4655-4661，2000)、粒子轟擊 法（particle delivery)(日本特開 2〇〇5_2874〇3《脂質生 產菌的育種方法》中記載的方法）、原生質球（spher〇plast) 法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 75 pl929(1978)]、醋 320627 22 1363799 酸裡法[J. Bacteriology, 153，pl63(1983)]、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 pl929(1978) ' Methods in yeast genetics, 2000 Edition : A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual等中記載的方法）實施，但不 限於此。 4.本發明的蛋白質的製造方法 本發明在其他的實施態樣中，提供使用上述轉形體的 I 本發明的蛋白質的製造方法。 具體地說，可藉由從上述轉形體的培養物中分離•純 化本發明的蛋白質，來獲得本發明的蛋白質。在此，培養 物是指培養液、培養菌體或培養細胞、或培養菌體或培養 細胞的破碎物的任一種。本發明的蛋白質的分離·純化， 可根據通常的方法進行。 具體地說，本發明的蛋白質在培養菌體内或培養細胞 内蓄積時，可在培養後，用通常的方法（例如，超音波、溶 • 菌酶、冷凍溶解等）破碎菌體或細胞後，藉由通常的方法（例 如，離心分離、過濾等）得到本發明的蛋白質的粗萃取液。 本發明的蛋白質在培養液中蓄積時，可在培養終止後，藉 由通常的方法（例如，離心分離、過濾等）將菌體或細胞與 培養上清液分離，來獲得含有本發明的蛋白質的培養上清 液。 如此得到的萃取液或培養上清液中所含有的本發明的 蛋白質的純化，可根據通常的分離•純化方法進行。分離 •純化方法，例如，可單獨或適當组合使用硫酸銨沉澱、 23 320627 1363799 凝膠過濾色譜法'離子交換色譜法、親和色譜法、反相高 效液相色譜法、透析法、超濾法等。 5.葡萄糖醛·酸接合物的製造方法 本發明還進一步提供使用本發明的蛋白質製造葡萄糖 ' 醛酸接合物的方法。本發明的蛋白質因催化將葡萄糖醛酸 從UDP-葡萄糖醛酸轉移到糖受體基質（例如，類黃酮、芪 或木脂素）的反應，所以，藉由使用本發明的蛋白質，以糖 受體基質及UDP-葡萄糖醛酸作為原料，可製造葡萄糖醛酸 ^ 接合物。糖受體基質係以類黃酮為佳。 例如，配製含有1 mM的糖受體基質、2mM的UDP-葡萄 糖醛酸、50mM的磷酸鈣緩衝液（pH7. 5)及20#Μ的本發明 的蛋白質的溶液，藉由在30°C下反應30分鐘，可製造葡 萄糖醛酸接合物。葡萄糖醛酸接合物可藉由公知的方法從 此溶液中分離·•純化。具體地說，例如，可單獨或適當組 合使用硫酸銨沈澱、凝膠過濾色譜法、離子交換色譜法、 φ 親和色譜法、反相高效液相色譜法、透析法、超濾法等。 如此得到的葡萄糖醛酸接合物，係有用作為用以測定 在生物體内的功能的試劑、抗氧化劑等（Gao, Z.，Huang， K. , Yang, X., and Xu, H.(1999) Biochimica et Biophysica Acta 1472， 643-650.)。 藉由以下的實施例進一步詳細說明本發明，但本發明 不限於實施例。 實施例1 1.實施例1的概括 24 320627 1363799 本實施例進行了如下嘗試’從唇形科屋久島光_ 中藉由卿而將Sb7GAT同源基因⑶财）予以選殖以: 基因為探針，從來自蓄積有《細的7位葡萄糖_接人 物的唇形科紫蘇葉的cDNA文庫（cDNAllbrary)中分離類^ 納的7位葡萄糖醛酸轉移酶。 、

歸選的結果，敎了來自紫蘇的糖苷化酶（pfUGT)中對 於黃_的7位羥基具有轉移葡萄糖醛酸的活性的 pfUGT5〇。此Ρ·Τ50不僅對於黃答黃素、高黃芩素、序菜 素、毛地黃黃崎黃酮類’對作為黃酮醇賴皮素也具有 葡萄糠醛酸轉移活性。因此，可藉由使用pfUGT5〇，將含 有黃酮的多種類黃酮的7位在試管内（in vitr〇)進行葡萄 糠醛酸化。 並且，關於作為篩選探針而分離的來自屋久島光紫黃 答的S1UGT ’其對多種類黃_也具有葡萄糖酸酸轉移活性。 此外’對於玄參科金魚草’還探討了與pfUGT50及S1UGT 同源性高的 UGTQJDP-glucuronosyltransferase)，雲定了 作為來自金魚草的UGT的AmUGTcglO。大腸捍菌表現的 AmUGTcg 10蛋白質係對於芹菜素、樹皮素、杻桔素具有葡 萄糖醛酸轉移活性。因此，可表明結構類似的上述紫蘇 pfUGT50、光紫黃芩S1UGT及金魚草AmUGTcglO是具有類黃 0同的7位葡萄糠醛酸轉移活性的酶。 2.紫蘇cDNA文庫中的糖苷化酶基因的分離 (1)探針的製備 本實施例令使用的分子生物學的方法，只要無其他詳 320627 1363799 細敍述，均按照 Molecular Cioning(Sambr〇ok 等人、Cold Spring Harbour Laboratory Press, 2001)中記載的方法。 使用 RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)，從屋久島光 紫黃芩的根中萃取總RNA後，將用於RT-PCR的第一鏈合成 # 10.[Superscript™ First-Strand Synthesis System for RT-PCR( Invi trogen公司）]按照製造商推薦的條件使用， 由l//g總RNA合成cDNA。根據黃芩的Sb7GAT的序列 • (GenBank註冊號碼No. AB042277)設計引子-Fw(序列號 碼：1)和引子-Rv(序列號碼：2)，使用該引子以屋久島光 紫黃芩cDNA為模板進行PCR。 序列號碼：1 : SlUGT-Fw : 5’ -AAACATATGGCGGTGCTGGCGAAGTTC-3,(下線為 Ndel 位 點） 序列號碼：2 : S1UGT-Rv : 5’ -TTTTGATCATTAATCCCGAGTGGCGTGAAG-3’ (下線為 Bell • 位點） 具體地5兄’ PCR反應液（50//1)的組成為：屋久島光紫 黃答（Scutellaria laeteviolaceav· yakusimensis)cDNA 1 V 1、lxTaq 缓衝液（buffer)(TaKaRa)、0. 2mM dNTPs ' 引 子（序列號碼：1及2)各0. 4pmol/ // 1、rTaq聚合酶 (polymerase)2· 5U。PCR反應係在94°C反應3分鐘後，進 行30個循環的94°C 1分鐘、53°C 1分鐘、72°C 2分鐘的 反應來進行擴增。 將經擴增的片段插入到pCR-TOPOII載體（Invitrogen) 26 320627 Ι3ύ3799 的多重選殖位點（multi-cloning site)，使用插 片的 驗基序列 DNA Sequencer model 3100(Applie(j

Biosystems)，藉由使用合成寡核苷酸引子之弓丨子+ - / it (primer walking)而確定驗基序列。所得到的驗義序， 以 CLUSTAL-W 程式（MACVECTOR 7. 2. 2 軟體、Acr。， cerly公司） 分析的結果，可證實得到與黃芩有高同源性的屋久〜％» 黃芩UGT的部分序列（序列號碼：3)。將此來自足A A ” 曰屋久島光紫

黃芩的UGT作為S1UGT部分序列而用作篩選探針的模& 將非放射性DIG-核酸檢測系統（Roche公司）按照穿4造 者推薦的PCR條件使用，在藉由RT-PCR得到的片段 (fragment)中導入DIG標記。具體地說，PCR反應液（50# 1) 的組成為：各 cDNA 1// 卜 lxTaq 緩衝液（buffer)(TaKaRa)、 0.2mM dNTPs、引子（序列號碼：1 及 2)各 〇.4pmol//zl、 rTaq 聚合酶（polymerase)2. 5U。PCR 反應係在 94°C 反應 5 分鐘後，進行30個循環的94°C 1分鐘、53°C 1分鐘、78°C • 2分鐘的反應的擴增。藉由瓊脂糖電泳證明siUGT片段已 被標記，將此DIG標記化片段（fragment)作為雜交用探針 而用於以下的實驗。 (2)雜交 將非放射性DIG-核酸檢測系統（Roche公司）按照製造 者推薦的PCR條件使用，將來自紫蘇（品種：赤縮緬紫蘇） 的葉的 cDNA 文庫（Yonekura-Sakakibara，K. et al.， Plant Cell Physiol. 41，495-502. 2000)使用前述 SIUGT 探針進行筛選。 27 320627 丄‘363799 使用雜交缓衝液（5xSSC、30%曱醯胺、50mM碟酸鈉缓 衝液（PH7. 〇)、1%SDS、2%封閉試劑（Roche)、〇· 1%十二烷醯 基肌胺酸、80g/ml鮭魚精子DNA) , 40°C下進行1小時預雜 父後’添加變性之探針’保溫一夜。將膜在含有1%SDS的 4xSSC洗滌液中於58。(：下洗滌30分鐘。篩選約ixi〇6pfu 的嗟菌斑，得到約3〇〇個陽性無性繁殖系（p〇sitive clone)。 φ (3)基因鑒定 將陽性無性繁殖系藉由二次篩選而形成單噬斑，使用 M13RV及M13M4(-20)的引子對，擴增插入物片段，確定插 入部分的DNA序列。使用基於所得到的DNA序列而得到的 推測之胺基酸序列’藉由Blastx的數據庫檢索的結果，得 到與S1UGT及Sb7GAT有高同源性的紫蘇UGT(PfUGT50)(序 列號碼：4、5)。 將所得到的全長PfUGT50與S1UGT及Sb7GAT以 • CLUSTAL-W 程式（MACVECTOR 7. 2. 2 軟體、Accerly 公司）分 析的結果，有力地證明S1UGT及Sb7GAT均是5’端區域欠 缺的不完整 0RF(0pen Reading Frame)。因此，將 Gene Racer kit(Invitrogen公司）用製造商推薦的方法進行 cDNA 末端快速擴增（Rapid Ampl i f ication of cDNA End.)(以 下稱RACE) ’擴增了 S1UGT的5’及3’端區域。RACE中， 使用如下所示的對各S1UGT基因為特異性的引子組 (primer set)(序列號碼：6 至 9)。

序列號碼：6 : GR-SIUGT-Rv: 5’ -TGG GAG GCA AAC CAG GGA 28 320627 1363799

TCT CGA CAA

序列號碼：7 : SlUGT-nest-Rv: 5’ -AAT CAT CCA AAT CTT TAA GGT

序列號碼：8 : GR-SIUGT-Fw: 5’ -AGA AGG GGT GTG TTC TCC G.CT GAG CAA

序列號碼：9 : SlUGT-nest-Fw: 5’ -GAA CAG CGG TCA CAG ATT TCT I 對於各擴增產物，藉由使用合成寡核苷酸引子之引子 步查法確定鹼基序列，得到包含全長ORF的S1UGT基因及 胺基酸序列（序列號碼：10、11)。 下述文獻揭示不僅在紫蘇及屋久島光紫黃芩中，在玄 參科金魚草（Ant i rrh i num ma j us )中也有作為黃酮的一種 的芹菜素7位葡萄糖搭酸接合物（Harborne，J. b. Phytochemistry 2，327二334· 1963)。因以前分離的以序-列號碼：12及13表示的功能未知的金魚草糠苷化酶 • AmUGTcglO與本實施例中分離的PfUGT50及S1UGT有高的 同源性，所以，AmUGTcgl 0也作為酶分析用的候補基因（〇no， E. etal·，proc. Natl. Acad. Sci. USA 103，1 1075-1 1080. 2006)。 上述得到的來自金魚草的AmUGTcgl 0、來自屋久島光 紫黃芩的S1UGT及來自紫蘇的PfUGT50的比對如第1圖所 示。且第1圖尹一同記載有來自黃芩的Sb7GAT。 3·從紫蘇葉中萃取與純化類黃酮 (1)南！答素 7-葡萄糖酸酸（Scutellarein 7-giucuronide) 29. 320627 1363799 的純化 將200片青紫蘇的葉（愛知產·豐橋溫室聯合）144.4g 在液氮中粉碎，在1. 5L的50°/〇CH3CN、0. 1%HC00H中浸漬一 •夜，以矽藻土過濾。減壓濃縮濾液，將濃縮液裝入600ml •的 CHP-20P 中，用水、10, 20, 30, 40, 50%CH3CN/H2〇 各 300mlx2 進行階段梯度洗脫（stepwise elution)，將經綠認多紛類 的洗脫的10%-2至50%-1的各組分進行濃縮、冷凍乾燥， 用 HPLC 分析。收量為 10%_2(12. lmg)、20°/〇-l(52.5mg)、 籲 20%-2(122.4mg) ' 30%-1(227.5mg) ' 30%-2(262.8mg) ' 40%-1(632.4mg)、40%-2(192. Omg)、50%-1(113. 2mg)，40%-1 係高純度含有迷迭香酸（rosmarinicacid)，其它均為含有 黃酮的組分。將30%-2組分用下述製備型HPLC純化，得到 16mg高黃荅素7-葡萄糖酸酸。 f備型HPLC條件. 色譜·柱：Develosil C-30-UG5，20mmx250mm， φ 流動相：A-0. 1%TFA, Β-0. 05% TFA/90% CH3CN， 流速：6ml/min. 梯度：B20—B60%(100min)，B60%iso(20min) 檢測：A280nm (2)尚黃答素7-葡萄糖酸酸的水解和苷元（aglyC〇ne)的純 化

將上述（1)中得到的高黃芩素7-葡萄糖醛酸中的3mg >谷解於100 # L的DMS0中’用15ml的離心管（Falcon tube) 分為兩份。在各離心管中加入l〇ml的H2〇和2. 5ml的0. 2M 30 320627 1363799

醋酸鈉缓衝液（ρΗ5· 0)及0. 8ml β -葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸 酉旨酶（A -Glucronidase/Arylsul fatase)(EC3. 2. 1. 31 /EC3. 1. 6. 1、Roche Diagnostics GmbH 製）溶液，在 37°C 下保溫2小時。將反應終止液裝入Sep-Pak-C18(20cc)中， 先用20ml的水再用20ml的10%EtOH除去鹽類、蛋白質類， 用40ml的80% CHaCN+O. 05%TFA將生成的苷元予以洗脫， 並濃縮、冷凍乾燥。將此組分用下述製備型HPLC純化，得 φ 到〇· 4mg的高黃芩素（苷元）。 製備型HPLC條f 色譜柱：Develosii C-30-UG5，20mmx250mm， 流云力相：A-0.1%TFA，B-0.05% TFA/90% CH3CN， 流速：6m 1/miη. 梯度：B15_>B7〇%(60min)，B70%iso(10min) 檢測：A330nm· 4.重組紫蘇糖苷化酶的表現和活性測定 •⑴表現载體構建 人將上述相互間同源性高且含有來自紫蘇的PfUGT50、 "自屋久島光紫黃荅的S1UGT及來自金魚草的AmUGTcglO ' 3種糖皆化酶的全長0RF的cDNA分別藉由基因特異性引 + & (Pf UGT50 ’ 序列號碼：14-15 ; S1UGT，序列號碼：16-17 ;

AmUGTcg10 ’序列號碼：18-19)而擴增。模板係使用分別由 紫蘇鸯 ,'·、果 '屋久島光紫黃芩根、金魚草花瓣中萃取的總RNA 戶斤合成的cDNA。 序列唬碼：14 : PfUGT50-fw: 320627 13.63799 5’ -AAACATATGGAAGGCGTCATACTTC-3,(下線為 Ndel 位點） 序列號碼：15: PfUGT50-rv: 5’ -TTTTGATCATTAATCACGAGTTACGGAATC-3,(下線為 Bell 位點） * 序列號碼：16 : SlUGT-fw: 5’ -AAACATATGGAGGACACGATTGTTATC-3’ (下線為 Ndel 位 點） 序列號碼：17 : SlUGT-rv: 5’ -TTCATATGTCAATCCCTCGTGGCCAGAAG-3,(下線為 Ndel 位點） 序列號碼：18: AmUGTcglO-fw: 5’ -AAACATATGGAGGACACTATCGTTCTC-3’ (下線為 Ndel 位 點） 序列號碼：19: AmUGTcglO-rv:

5’ -TTGGATCCTTAAGAAACCACCATATCAAC-3’ (下線為 BamHI _ 位點） PCR 反應（KOD -Plus-, TOYOBO)係在 94°C 下反應 2 min 後以[94°C，15 sec; 50°C，30 sec; 68°C，1. 5 min]x35 # 環（cycles)進行。將經擴增的DNA片段予以次選殖 (subcloning)到 pCR-Blunt II-TOPO vector(Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, invitrogen)，藉由 ABI3100Avant (Applied Biosystems)進行驗基序列的確認。關於 PfUGT50，藉由將所得到的plus株予以轉形而得到非甲基 化質體。關於所得到的質體，在PfUGT50用Ndel和Bell、 32 320627 1363799 在 S1UGT 用 τ , 行酶切，Μ AmUGTCg10用_和Β_分別進 冬產生的約15奶的DNA片段與經在 AmUGTcglO m τ 你 riublbO 和 用 Ndel 和 BamHI S#切、在 S1UGT 用 Nd 的PET-15連接。 miei扭切

CM重Μ大腸桿菌的培養和蛋白質的純化 使用上述4-(1)中得到的各個質體 则株予叫形。將所得躺轉形體在4ml^囷有助 5〇"g/ml的胺苄青黴素(ampicillin)的lb培養基(10 " 令立 g/l酵母萃取物，1 g/l NaCl)中於37。(：下振 仪將達到靜止期的4 ml培養液接種到同樣組成 =80 ml培養基中，於机下振蕩培養。菌體濁度⑽6— 約達到〇.5時’添加最終濃度為0.4 mM的IPTG(異丙基 -点-D-硫代半乳糖苷），於22〇c下振蕩培養2〇小時。以下 賴有操作均在4°c下進行。將培養後的轉形體用離心分

’ 〇x g，15 min)· ，添加緩衝液 s(Buf fer S)[20 mM 磷酸鈉緩衝液（pH7 4)，2〇mM 咪唑（imidaz〇ie)，〇 5 M NaC卜l4 mM/3 一魏基乙醇]2ml/gceU，進行懸浮。然後 進行超音波破碎（15secx8次），離心分離（15,〇〇())<2 , 1〇 min)。在所得到的上清液中添加最終濃度為〇. 12%(w/v)的 眾伸乙亞胺，而懸浮，靜置3〇 mb。進行離心分離 (15, OOOxg，1〇 ηΰη)，將上清液作為粗酶液回收。將粗酶 /夜使用在經緩衝液S(Buffer S)平衡的His SpinTrap(GE Healthcare)中，進行離心（70xg，30 sec)。用缓衝液 S(Buf fer S)600 # 1 洗蘇後，用含有 1〇〇、2〇〇、500 mM 咪 320627 33 1363799 唾（imidazole)的緩衝液S(Buffer S)各600 // 1，將與色譜 枉結合的蛋白質進行階段梯度洗脫。將各洗脫組分使用離 心超濾管（1^〇*〇(：〇11)丫1^-30(八111丨(：〇11)進行緩衝液置換成含 有14 -巯基乙醇的20 raM填酸鉀緩衝液（pH 7. 5)。 SDS-PAGE分析的結果，因在100 mM及200 mM °米°坐 (imidazole)洗脫組分中確認有目的大小的蛋白質，所以， 將上述組分混合用於分析。且這些組分中不單是目的蛋白 質。 (3)酶反應和HPLC分析條件 標準的反應條件如下所示。配製50# 1反應液[2 mM UDP-葡萄糖醛酸，100 // Μ糖受體基質，50 mM磷酸鉀緩 衝液（pH 7, 5) ’酶溶液]，藉由添加酶溶液而開始反應，30°C 下反應30分鐘。藉由添加50# 1的含有〇. 5%TFA的CH3CN .以終止反應’用HPLC分析。HPLC條件如下所示。色譜柱： Develosil C30-UG-5(4. 6x150 mm);洗脫液 A : 0. 1% TFA / 參 H2〇;洗脫液B·· 0. 08%TFA/90%CH3CN;洗脫條件A(噢。弄、 兒茶素、香豆素、苯丙素（phenylpropanoid)以外）： 0min/5%B—18min/100%B 液—18. 1 min/5%B—25 min/5°/〇B ; 洗脫條件B(嗅°弄、兒茶素、香豆素、苯丙素）：〇m i η/5%B— 20min/50%B 液—20.5 min/5%B->25 min/5%B ;流速：1 ml/min ;檢測波長：280，350 nm。以下表示各種鑒定的方 法及結果。 糖受體基質特異性分析' 根據上述方法，分析針對各種糖受體基質的特異性（第 34 320627 丄J.63799 2至4圖）。 第2圖表示Pfi)GT50糖受體基質的基質特異性的分析 •結果。第2圖表示對於高黃芩素（Scuteilarein)的活性為 100%時對各基質的相對活性。分析的結果，PfUGT50對高 黃芩素具有最大活性’與糖苷以外的黃酮充分反應[黃芩黃 素（Baicalein)(對高黃芩素的相對活性，73%)、芹菜素 (Apigenin)(44%) ' 毛地黃黃酮（Luteolin)(4lW、五羥黃酮 鲁（Tricetin)(87. 9%)、洋笼荽黃素（Di〇smetin)(62%)、金聖草 黃素（〇1巧3〇61^〇1)(18°/〇]。且對黃酮醇[槲皮素（(311打(^1^11) (26%)、楊梅黃素（Myricetin)(9%)、山奈黃素（Kaempfer〇i) (3%)]、二氫黃酮[柑桔素（Naringenin)(3%)]及噢噚[金魚草 素（Aureusidin)(40%)]也具有活性。但對黃酮c糖苷[牡荊 葡基黃蜩（Vitexin)、異牡荊葡基黃酮（Is〇vitexin)、荭草 素（Orientin)]、異黃酮[染料·木素（Genistein) '大豆黃素 (Daidzein)、刺芒柄:^匕素（Form〇n〇netin)]、兒茶素[兒茶素 春（Catechin)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（Epi辟

CateChingallate)]、香豆素[七葉亭（ESCUletin)]及苯丙 素[松柏醇（Coniferyl aiC0h0l)]無活性。此外，在 2二：芩素、黃芩黃素'芽菜素、槲皮素與其反應生成 物的各自7位葡萄糖醛酸化物的保留時間—致。 第3圖表示分析S1UGT糖受體基質的基質特 果。第3圖絲對高黃答素的活性為1〇〇%時對各基質_ 對活性。分析的結杲，顯示S1UGT對高普X夸 活性，對除黃答黃素(對高黃答素的相對活性 320627 35 1363799 黃酮的反應性低[芹菜素（3%)、毛地黃黃酮（0. 6%)、五羥黃 酮（1. 1%)、洋芫荽黃素（0. 3%)、金聖草黃素（0. 02%)]。且 對黃酮醇[槲皮素（1%)、山奈黃素（14%)、二氫黃酮（6%)]、 異黃酮[染料木素（1«、大豆黃素（0. 3«、刺芒柄花素 '(0. 08°/〇]、香豆素[七葉亭（0· 3°/。）]的活性也低，對黃酮C 糖苷（牡莉葡基黃鲷、異牡荊葡基黃S同、草素）、嗔。弄（金 魚草素）、兒茶素（兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯） 及苯丙素（松柏醇）無活性。也就是說，說明在S1UGT的活 性中，類黃酮7位的鄰位修飾很重要。且在HPLC中，高黃 荅素、黃答黃素、芹菜素與其反應生成物的各自7位葡萄 糖醛酸化物的保留時間一致。另一方面，檢測出槲皮素中 多個反應生成物，其中之一與7位葡萄糖醛酸化物的保留 時間一致。 第4圖表示分析AmUGTcglO糖受體基質的基質特異性 的結果。第4圖表示對高黃芩素的活性為100°/。時對各基質 _ 的相對活性。分析的結果，顯示AmUGTcgl 0對高黃答素具 有最大活性，與除糖苦以外的黃嗣也反應[黃答黃素（對高 黃芩素的相對活性，22%)、芹菜素（40%)、毛地黃黃酮 (34%)、五羥黃酮（23. 8%)、洋芫荽黃素（26%)、金聖草黃素 (18%)]。且對黃酮醇[槲皮素（4%)、山奈黃素（28%)]、二氫 黃酮[柑桔素（15°/。）]及噢。弄[金魚草素（2%)]也具有活性。 但是，對黃酮C糖苷（牡荊葡基黃酮、異牡荊葡基黃酮、荭 草素）、異黃酮（染料木素、大豆黃素、刺芒柄花素）、兒茶 素（兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯）、香豆素（七葉亭） 36 320627 13-63799 及苯丙素（松柏醇）無活性。且在HPLC中，高黃答素、黃答 黃素、芹菜素、槲皮素與其反應生成物的各自7位葡萄糖 醛酸化物的保留時間一致。 以上結果表明，PfUGT50和AmUGTcglO對黃酮等類黃 ' 酮具有低特異性，S1UGT具有高特異性。且來自紫蘇的的 PfUGT50具有特別低的特異性，亦即可知其為基質特異性 廣泛的酶。 糖供體基質特異性分析 將芹菜素作為糖受體基質使用，對各種UDP活性化糖 供體分析特異性。其結果，PfUGT50、S1UGT及AmllGTcglO 只對UDP-葡萄糖醛酸具有活性，而對UDP-葡萄糖、UDP-半乳糖無活性。 以上結果表明，上述酶是對黃酮特異性高的7位葡萄 糖醛酸轉移酶（黃銅· 7-0-葡萄糖醛酸轉移酶）。 -· pH及溫度特性分析 φ 溫度穩定性如下分析。酶溶液在15至55°C下處理1 小時後，冷卻至4°C。使用冷卻後的樣品，在標準的反應 條件下計算殘存活性。pH穩定性如下分析。在酶溶液中添 加緩衝液（pH 4、4. 5、5，Acetate-NaOH ; pH 5. 5、6、6. 5、 7、7. 5，NaH2P〇4-NaOH ; pH 8、8· 5、9，Tris-HCl)到最終 濃度為167 mM，4°C下處理1小時後，添加磷酸鉀緩衝液 (pH 7. 5)到最終濃度為500 mM。使用處理後的樣品，計算 在標準反應條件下的殘存活性。反應溫度依賴性係在反應 溫度設定成10至55°C的標準反應條件下進行反應而分析。 37 320627 1363799 關於反應pH依賴性，在代替磷酸鉀緩衝液（ρΗ 7· 5)而使用 緩衝液（pH 4、4· 5、5，Acetate-NaOH ; pH 5. 5、6、6. 5、 7、7· 5，Naifif2p〇4-NaOH ; pH 8、8. 5、9，Tris-HCl)的標準 反應條件下進行反應，而分析。以上的分析結果表明， PfUGT50在pH 7至9的範圍内穩定，其催化活性在pH 7 至8的範圍内最大，在酸性區域内基本上不具有活性。且 在30 C以下穩定（1小時’ pH 7. 5) ’ 30分鐘内的活性測定 鲁中反應最適溫度為3(TC。S1UGT在ρΗ4·5至8的範圍内穩 疋’其催化活性在pH 7至8的範圍内最大，在酸性區域内 基本上不具有活性。此外，本酶在40¾以下穩定（1小時， pH 7.5) ’ 30分鐘内的活性測定中反應最適溫度為35它。 AmUGTcglO在pH 7.5至9. 5範圍内穩定，其催化劑活性在 pH 8·. 5至9.5的範圍内為最大，在酸性區域内基本上不具 有活性。另外’本酶在30〇C以下穩定（1小時，PH 7.5)， 30分鐘内的活性測定中反應最適溫度為45°c。這些性質與 # 已知的植物次生代謝相關的GT類似。 5.結果 如上所述，鑒定了結構上類似的來自唇形科紫蘇的 PfUGT50、來自唇形科屋久島光紫黃芩的S1UGT及來自玄參 科金魚草的AmUGTcglO。PfUGT50及AmUGTcglO糖苷化酶與 黃芩Sb7GAT相比，糖受體基質特異性廣泛，具有黃酮、黃 嗣醇、嗔π弄等多種類黃酮的7位葡萄糖酸酸轉移活性。另 一方面，S1UGT具有與Sb7GAT類似的基質特異性。藉由使 用上述糖苷化酶，可廉價地使類黃酮的7位進行葡萄糖醛

3S 320627 13-63799 酸接合反應。 因此，可使槲皮素7-葡萄糖盤酸苷（Quercetin 7-glucronide)等生物體内存在的葡萄糖路酸接合物在試 管内（in vitro)大量生成，並評價生理活性。 •實施例2 1.實施例2的概括 本實施例中，從唇形目胡麻科芝麻（Sesamum indiciun) 中鑒定與光紫黃芩S1UGT及金魚草AmUGTcgl2同源性高的 Sil)GT23,證實其大腸桿菌表現蛋白對高黃芩素及毛地黃黃 酮具有葡萄糖醛酸轉移活性。 2.SiUGT23基因的鑒定 著眼於光紫黃芩及金魚草的類黃酮7位葡萄糖醛酸轉 移酶基因（UGT基因）的序列保守性，測定與這些基因同源 性高的基因的結果，發現在唇形目胡麻科芝麻中也具有與 上述UGT基因有高同源性的芝麻UGT基因SiUGT23。因從 • 芝麻cDNA文庫内中分離的SiUGT23不具有全長序列，所 以，使用下述序列號碼：20及21的引子，藉由前述實施 例1的2(3)中所述的RACE法而確定SiUGT23的全長序列 (序列號碼：2 2及2 3)。 序列號碼：20 : GR_SiUGT23_Rv 5’-GGCCAAACGCGCCGGAGCTGATGTAGA-3’ 序列號碼：21 : SiUGT23-nest-Rv 5’-AGTGGGTATATTCAAGCCTGT-3’ 3.來自芝麻的SiUGT23的表現和活性測定 39 320627 Ι3ύ3799 將包含來自芝麻的SiUGT23的全長ORp之cdna藉由美 因特異性引子組（序列號碼：24及25)擴增。模板係使用由 從芝麻種子中萃取的總RNA所合成的cDNA。與前述實施例 1的紫蘇、光紫黃芩及金魚草的UGT同樣地整合到大腸桿 菌表現載體，藉由同樣的方法使重組SiUGT23蛋白質f 現，測定酶活性。 序列號碼：24 : SiUGT23-fw: 5’ -CACCATATGGAAGACACCGTTGTCCTCTA-3’ (下、線 ^ Ndel >(立 點） 序列號碼：25 : SiUGT23-rv: 位

5, -GGATCCTAACATCACTCAAACCCGAGTCA-3,(下線為 BamHI 點） 第5圖表示分析SiUGT23的糖受體基質的笑質特1 的結果。第5圖表示對高黃荅素的活性為1〇〇%時對各 的相對活性。分析的結果，顯示SiUGT23對高普父素^有 最大的活性，與以下的黃酮也發生反應[黃芩黃素（對言龙 芩素的相對活性（以下同樣）24%)、芹菜素（7%)、毛地:: 酮（29%)、五羥黃S同（14.0%)、洋芫荽黃素（4%)、金聖 素（6«、異牡莉葡基黃酮（0.3%)]。且對黃g同醇= = (4%)、山奈黃素（18%)]、二氫黃g同[相·桂素（2%)]、 ' 魚草素（13%)]、香豆素[七葉亭（0.03%)]及以下的異 [刺芒柄花素（0· 03%)]也具有活性。但對異牡袖諮廿 5 x基黃S同以 外的黃嗣c糖苷（牡荊葡基黃_、狂草素）、制* β J亡柄花素以 外的異黃酮（染料木黃酮、大豆素）、兒茶素（兒各責 320627 40 1363799 食子兒茶素沒食子酸酯）及苯丙素[咖啡酸（Caffeic acid)] 無活性。此外，HPLC中，高黃芩素、黃芩黃素、芽菜素、 槲皮素與其反應生成物的各自7位葡萄糖醛酸化物的保留 時間一致。 由以上結果可知，芝麻SiUGT23與紫蘇pfGT50及金魚 草AmUGTcglO同樣，是對黃酮等類黃酮具有低特異性的類 黃酮7位葡萄糖醛酸轉移酶。 $ 實施例3 使用紫蘇PfUGT50、屋久島光紫黃芩S1UGT、金魚草 AmUGTcglO重組蛋白質及芝麻的SiUGT23重組蛋白質，探 討對於植物性多酚的芪及木脂素之葡萄糖醛酸轉移活性。 甚·的基質係使用白藜蘆醇（Resveratrol)，木脂素的基質係 使用（ + )-松脂醇（Pinoresinol)、（ + )-胡椒醇（Piperitol)、 ·(+)-芝麻素酚（Sesaminol)、（ + )-開環異落葉松樹脂酚 (Secoisolariciresinol)、（+)-芝麻素兒茶酚丨^⑶⑽化 鲁 catechol 1 )(SC1 )，（+)-芝麻素兒茶驗 2 (Sesamin catechol 2)(SC2)、及（+)-表芝麻素兒茶驗 2(Episesamincatechol 2) (EC2)(Nakai M, et al.(2003) J Agric Food Chem. 51, 1666-1670.)，用與上述同樣的條件進行酶反應。 HPLC分析的結果’在紫蘇PfUGT50 '屋久島光紫黃芩 S1UGT、金魚草AmUGTcglO及芝麻的SiUGT23的全部反應液 中均得到生成物（參照第2至5圖）。此外，關於木脂素類， 以SC 1及SC2為基質時’得到新型生成物。將得到最多生 成物的S1UGT和SCI的反應進行lc-MS分析的結果，可表 41 320627 13*63799 明SCI在R.T. =12. 8分鐘時洗脫，反應生成物是R.T. =10.8 分鐘（第 6 圖）、111/2=517.1328[1^-11]-(0251125012、。31〇(1· 517. 1346、err. -2. 5ppm)的SCI單葡萄糖酸酸苷（第7圖）。 LC-MS的條件如下所示。 色譜柱：Develosil C30-UG3，3mmxl50 mm 流動相：A : Μ), B : CH3CN，C : 2. 5%HC00H，0. 2ml/min. 梯度：B20%—B70%(10 分鐘）、B70%(5 分鐘）、C4% $ 檢測：A280nm MS 條件：Q-TOF-Premier (Micromass、Manchester、 UK製）

V模式、陰性（negative)、毛細管電壓（Capi 1 lary): 2. 3KV、錐孔電壓（cone voltage) : 45V 以上結果可表明，藉由使用紫蘇PfUGT50、屋久島光 紫黃芩S1UGT、金魚草AmUGTcglO及芝麻的SiUGT23，不僅 可生產多種類黃酮的葡萄糖醛酸苷，還可生產芪及木脂素 # 的葡萄糖醛酸茌。 實施例4 來自屋久島光紫黃芩的S1UGT提供在與槲皮素（QU)反 應時其7位葡萄糖醛酸以外的多個生成物（第8圖）。 此寺是在來自芝麻的SiUGT23、來自金魚草的 AmUGTcglO、及來自紫蘇的PfUGT50中不被認為有存在的特 徵性生成物。LC-MS分析的結果，當保留時間在7至9分 鐘之間時，檢測出認為是對槲皮素轉移兩個葡萄糖醛酸的 m/z= 653. 1009 [M-H]'(C27H25019, calcd. 653.0990, err. 42 320627 1363799 2. 9ppm)的槲皮素二葡萄糖醛酸苷。當保留時間在9至11 分鐘之間時’檢測出3種認為是對槲皮素轉移一個葡萄糖 醛酸的ιη/ζ= 477.〇6[Μ-ΗΓ的槲皮素單葡萄糖醛酸苷。因為 R.T. =10. 12分鐘時的成分與將紫蘇的GAT的反應生成物予 以純化並進行結構分析的產物一致，所以，可知其是槲皮 素7-0-葡萄糖醛酸苷。且r.t.=1〇.34分鐘時的成分與將 葡萄葉的主要黃酮醇予以純化並進行結構分析的產物一 鲁致’所以’可知其是槲皮素3-0-葡萄糖酸酸苦。[Hmamouch， M. et al.(l996) Am J Enol Vitic.，47，186-192]作為 主要反應生成物的R.T. =11.3分鐘的成分，用反相HPLC純 化、用NMR進行結構分析的結果，證明其是槲皮素3, _〇一 葡萄糖酸酸苷。確認主要的3個譜峰分別是槲皮素的7位、 3位、3’位的單葡萄糠醛酸苷。 LC-MS的條件如下所示。 色譜柱：YMC-pack polymer C18，2mm X 150 _，6/zm • 流動相：A : H2〇, B : CH3CN, C : 2· 5%HC00H, 0. 2ml/min. 梯度·· Bl〇%—B5〇%(1〇 分鐘）、B5⑽（5 分鐘）、C4% 檢測：A35〇nni MS 條件：Q〜T〇F-Premier (Micromass、Manchester、 UK制） V模式、陰性（negative)、毛細管電壓（Capillary):

3. 0KV、錐孔電壓：3〇V 以上結果表明，藉由使用屋久島光紫黃芩SI UGT，可 由槲皮素得到多種槲皮素葡萄糖醛酸苷。 43 320627 13-63799 本發明的UDP-葡萄糖醛酸轉移酶的基質特異性廣泛， 有助於各種葡萄糖醛酸接合物的製造。製造出的葡萄糖醛 酸接合物，例如，可有用於作為用以測定其在生物體内的 功能的試劑、抗氧化劑等。 '【圖式簡單說明】 第1圖表示來自金魚草的AmllGTcgl 0、來自屋久島光 紫黃芩的S1UGT、及來自紫蘇的PfUGT50以及來自黃答的 Sb'7GAT的胺基酸序列的比對。 * 第2圖表示分析PfUGT50的糖受體基質的基質特異性 的結果。 第3圖表示分析S1UGT的糖受體基質的基質特異性的 結果。 第4圖表示分析AmUGTcglO的糖受體基質的基質特異 性的結果。 第5圖表示分析SiUGT23的糖受體基質的基質特異性 φ 的結果。 第6圖表示對S1UGT與SCI的反應液中之生成物的 LC-MS分析結果。圖中的箭頭表示生成物。 第7圖表示SCI與S1UGT1的反應生成物的MS分析結 果。 第8圖表示槲皮素與S1UGT1的反應生成物的LC分析 結果。 【主要元件符號說明】 益 44 320627 1363799 序列表 <110〉三得利股份有限公司 <120〉UDP-葡萄糖醛酸轉移酶及编碼該酶的多核苷酸 <130> G08-0079 <150〉 JP 2007-267050 <151〉 2007-10-12 <150〉 JP 2008-067185 <151〉 2008-03-17

<160〉 25 <170> Patent In version 3.4 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213〉人造序列 <220> <223〉合成DNA <400> 1 aaacatatgg cggtgctggc gaagttc 27

<210〉 2 <211> 30 <212〉 DNA <213〉人造序列 <220〉 <223〉合成DNA <400〉 2 ttttgatcat taatcccgag tggcgtgaag 30 <210> 3 1/29 320627 1363799 <211> 1326

<212> DNA <213〉屋久島光紫黃荅 <400> 3 atggcggtgc tggcgaagtt catcagcaag aaccacccct ccgtccccat catcattatc 60 agcaacgccc cggaatccgc cgccgcctcc gtggcggcca tcccttccat ctcctaccac 120 cgccttcccc tcccggagat ccctcccgac atgacaacag accgcgtgga gctcttcttc 180 gagctccctc gtctcagcaa ccctaacctc ctcactgctc tgcaacagat ctcccagaag 240 acaagaatca gagctgttat cctcgatttc ttctgcaacg cggcttttga ggttccgacc 300

agcctcaata tacccaccta ctactacttc agcgccggaa ctccaaccgc catcctcacc 360 ttgtacttcg aaaccatcga tgagaccatc cctgttgacc ttcaagacct caatgactat 420 gtcgacatcc ctggtttgcc gccgattcac tgcctcgata tccccgtggc tttgtcaccg 480 cgtaagagtc ttgtttacaa gagctccgtc gacatttcga agaacctgcg cagatcggca 540 ggcatcctcg ttaatggctt cgatgcactc gagtttagag ccataggaag ccatagtcaa 600 cggcctatgc atttcaaagg cccaactcct ccggtttact tcatcgggcc attggtcgga 660 gatgtcgaca ctaaggccgg cagcgaggag catgagtgtc tgagatggct tgatacacag 720 ccaagtaaga gtgtcgtctt cctttgtttt gggagaaggg gtgtcttctc tgctaagcag 780 ctgaaggaga cggcggcggc gttggagaac agtggccaca ggtttctctg gtcagtgaga 840 aacccaccgg、.agttgaagaa ggcgacgggg tccgatgagc cggacctgga tgagctgctg 900 cccgagggct tcctggagag aaccaaggat cggggtttcg tgataaagtc gtgggctcca 960 cagaaggagg tgctggctca cgactcggta ggtggattcg tgactcactg tgggcggagc 1020 tccgtgtctg aaggggtgtg gttcggagtg ccgatgatcg ggtggccggt ggacgcggag 1080 ctgaggttga atcgggcggt gatggtggat gatctgcagg tggcgctgcc gctggaggag 1140 gaggcgggtg ggttcgtgac ggcggctgag ttggagaaac gagttagaga gttgatggag 1200 2/29 2 320627 12601363799

acgaaggcgg ggaaggcggt gaggcaacga gtcaccgaac tgaaactctc cgccagggcg gcggtggcgg agaatggatc ctcgctaaat gatttgaaaa aatttcttca cgccactcgg gattaa <210> 4 <211> 1490 <212> DNA <213〉紫蘇 <220〉 <221> CDS <222〉 (1).. (1362) <400〉 4 atg gaa ggc gtc ata ctt ctt tac tea teg get gag cac ttg aac tee

Met 6lu 6ly Val Me Leu Leu Tyr Ser Ser Ala Glu His Leu Asn Ser 1 5 10 15 atg tta ttg etc gee acc ttc ate gee aaa cac cat ccc tee ate ccc

Met Leu Leu Leu Ala Thr Phe Ile Ala Lys His His Pro Ser Ile Pro 20 25 30 ate aca ate ctt age tee gee gac tac tea gee gee gee tee gtc tee lie Thr lie Leu Ser Ser Ala Asp Tyr Ser Ala Ala Ala Ser Val Ser 35 40 45 acc ttg cct tee att act tat ege ege etc ccg ccc gtc geg ata ccc

Thr Leu Pro Ser lie Thr Tyr Arg Arg Leu Pro Pro Val Ala Me Pro 50 55 60 cct gac tea ata aag aac ccg gtc gaa gee ttc ttc gaa ate cct cgt

Pro Asp Ser I le Lys Asn Pro Val Glu Ala Phe Phe Glu Ile Pro Arg 65 70 75 80 etc caa aac cca aac ctt ege gtc gee etc gaa gaa ate tee cag aaa

Leu Gin Asn Pro Asn Leu Arg Val Ala Leu Glu Glu lie Ser Gin Lys 85 9〇 95 aca aga ate aga gca ttt gtg att gat ttc ttc tgc aat tee gca ttt 3/29 320627 1320 1326 48 96 144 192 240 288 336 384IJ3.63799

Thr Arg lie Arg Ala Phe Val lie Asp Phe Phe Cys Asn Ser Ala Phe 100 105 110 gaa gtc teg acc age etc age ata ccc act tac ttc tac gtc age acc Glu Val Ser Thr Ser Leu Ser lie Pro Thr Tyr Phe Tyr Val Ser Thr 115 120 125 ggt tcc gcc ggc gtc tgc ate ttc etc tat ttc ccc acc acc gat gag 6ly Ser Ala Gly Val Cys lie Phe Leu Tyr Phe Pro Thr Thr Asp Glu 130 135 140 432

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Gly Ser Ala Gly Val Cys lie Phe Leu Tyr Phe Pro Thr Thr Asp Glu 130 135 140

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Ser Val Thr Arg Asp 450 <210〉 6 8/29 8 320627 1363799 <211〉 27 <212> DNA <213〉人造序列 <220〉 <223〉合成DNA <400〉 6 tgggaggcaa accagggatc tcgacaa <210〉 7 <211〉 21 <212> DNA <213〉人造序列

<220〉 <223〉合成DNA <400〉 7 aatcatccaa atctttaagg t <210〉 8 <211〉 27 <212> DNA <213〉人造序列 <220〉

<223〉合成ΜΑ <400〉 8 agaaggggtg tgttctccgc tgagcaa <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213〉人造序列 <220〉 <223〉合成DNA <400〉 9 13-63799 gaacagcggt cacagatttc t 21 <210> 10 <211> 1446 <212〉 DNA <213〉屋久島光紫黃芩

<220〉 <221〉 CDS <222〉 (1).. (1368) <400> 10 atg gag gac acg att gtt ate tac acc aeg ccg gag cac ctg aac acc Met Glu Asp Thr lie Val lie Tyr Thr Thr Pro Glu His Leu Asn Thr 15 i〇 15 atg geg gtg etc gee aag ttc ate age aaa cac cac ccc tee gtc ccc Met Ala Val Leu Ala Lys Phe lie Ser Lys His His Pro Ser Val.Pro 20 25 30 48 96 ate ata etc ate age acc gee gee gaa tea gee gee gee tee ate gee 144 lie lie Leu lie Ser Thr Ala Ala Glu Ser Ala Ala Ala Ser lie Ala 35 40 45 gee gtc ccc tee ate acc tac cac ege etc ccc etc ccc gag ate cct 192 Ala Val Pro Ser lie Thr Tyr His Arg Leu Pro Leu Pro Glu lie Pro 50 55 60

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115 120 125 gga teg ccc aca gcc acc etc gtt ctg cac ttc caa acc ctt gat gag Gly Ser Pro Thr Ala Thr Leu Val Leu His Phe Gin Thr Leu Asp Glu 130 135 HO acc ate cct ggt gac ett aaa gat ttg gat gat ttt gtc gag ate cct Thr Ile Pro Gly Asp Leu Lys Asp Leu Asp Asp Phe Val Glu Ile Pro 145 150 155 160 ggt ttg cct ccc att tac tcc ctg gat ate cct gtt get ctg ett aeg Gly Leu Pro Pro Ile Tyr Ser Leu Asp lie Pro Val Ala Leu Leu Thr 165 170 175 cgt cag age ett gtt tac cag age tet gtt gac ate teg aaa aac ctg Arg Gin Ser Leu Val Tyr Gin Ser Ser Val Asp Ile Ser Lys Asn Leu 180 185 190 ege aaa tea gca ggc ttc ett gtt aat ggc ttc gat gee etc gag ttc Arg Lys Ser Ala Gly Phe Leu Val Asn Gly Phe Asp Ala Leu Glu Phe 195 200 205 ’ aga get aag gaa gee ata gtc aac ggc etc tgc gtt ccc aat ggc ccg Arg Ala Lys Glu Ala lie Val Asn Gly Leu Cys Val Pro Asn Gly Pro 210 215 220 act cct ccg gtt tac ttc ate ggc cca etc gtc gga gat gtc gat gee Thr Pro Pro Val Tyr Phe lie Gly Pro Leu Val Gly Asp Val Asp Ala 225 230 235 240 aaa gee ggc ggc gaa gag cat gaa tgt etc aga tgg ett gat aca cag Lys Ala Gly Gly Glu Glu His Glu Cys Leu Arg Trp Leu Asp Thr Gin 245 250 255 cca agt aag agt gtg ate ttc ett tgc ttt ggc aga agg ggt gtg ttc Pro Ser Lys Ser Val lie Phe Leu Cys Phe Gly Arg Arg Gly Val Phe 260 265 270 tec get gag caa ctg aag gag aeg geg gtg geg ttg gag aac age ggt Ser Ala Glu Gin Leu Lys Glu Thr Ala Val Ala Leu Glu Asn Ser Gly 275 280 285 cac aga ttt ctg tgg teg gtg ega aac cca ccg gag ate atg aag aac His Arg Phe Leu Trp Ser Val Arg Asn Pro Pro Glu lie Met Lys Asn 11/29 480 528 576 624 672 720 768 816 864 11 320627 912 9601363799 290 295 300 tcc gat gag ccg gac ctg gat gag ctg ctg ccc gag ggg ttt ctg gag

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<212> PRT <213〉屋久島光紫黃答 <400> 11

Met Glu Asp Thr He

Val lie Tyr Thr Thr Pro Glu His Leu Asn Thr 10 15

Met Ala Val Leu Ala Lys Phe lie Ser Lys His His Pro Ser Val Pro 20 25 30

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Ala Arg lie Arg Ala Phe Val lie Asp Phe Phe Cys Asn Ala Ala Phe 100 105 110

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Gly Ser Pro Thr Ala Thr Leu Val Leu His Phe Gin Thr Leu Asp Glu 130 135 140 13/29 13 320627 1363799

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Arg Thr Lys Asp Arg Gly Phe Val lie Lys Ser Trp Ala Pro Gin Lys 325 330 335

Glu Val Leu Ser His Asp Ser Val Gly Gly Phe Val Thr His Cys Gly 340 345 350

Arg Ser Ser lie Ser Glu Gly Val Trp Phe Gly Val Pro Met lie Gly 355 360 365

Trp Pro Val Asp Ala Glu Gin Lys Leu Asn Arg Thr Val Leu Val Glu 370 375 380

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Arg Ala Ala Val Thr Gly Asn Gly Ser Ser Leu Ser Asp Phe Lys Lys 435 440 445

Phe Leu Leu Ala Thr Arg Asp 450 455 <210> 12 <211〉 1374 <212〉 DNA <213〉金魚草 <220>

<221> CDS 15/29 15 320627 481363799

<222〉⑴..（1374) <400〉 12 atg gag gac act ate gtt etc tac get tea gca gag cac ett aac tee Met Glu Asp Thr lie Val Leu Tyr Ala Ser Ala Glu His Leu Asn Ser 15 10 15 atg eta eta etc ggc aaa etc ate aac aaa cac cac ccc aca ate tee Met Leu Leu Leu Gly Lys Leu lie Asn Lys His His Pro Thr lie Ser 20 25 30 gtc gee att ate age acc gee cca aac gee gee get agt tee gtc gee Val Ala lie lie Ser Thr Ala Pro Asn Ala Ala Ala Ser Ser Val Ala 35 40 45 gac gtg geg gee ata tet tat cag caa etc aaa ccg gee act etc cct Asp Val Ala Ala lie Ser Tyr Gin Gin Leu Lys Pro Ala Thr Leu Pro 50 55 60 teg gat eta acc aaa aac cca ate gag etc ttc ttc gaa ate cca cgt Ser Asp Leu Thr Lys Asn Pro Ile Glu Leu Phe Phe Glu lie Pro Arg 65 70 75 80 eta cat aat cct aac ttg etc gaa geg ctg gaa gaa ctg tea eta aaa Leu His Asn Pro Asn Leu Leu Glu Ala Leu Glu Glu Leu Ser Leu Lys 85 90 95 tea aaa gta agg gca ttt gtg ata gat ttc ttt tgc aat ccc gca ttt Ser Lys Val Arg Ala Phe Val lie Asp Phe Phe Cys Asn Pro Ala Phe 100 105 110 gag gtt teg act age ttg aac ata ccc act tac ttc tat gtc age age Glu Val Ser Thr Ser Leu Asn lie Pro Thr Tyr Phe Tyr Val Ser Ser 115 120 125 ggc geg ttt ggg eta tgc ggg ttc ttg cat ttt ccg aca ate gac gaa Gly Ala Phe Gly Leu Cys Gly Phe Leu His Phe Pro Thr lie Asp Glu 130 135 140 act gtc gaa aaa gac ate ggt gaa ctg aac gat ate ttg gag ate ccg Thr Val Glu Lys Asp lie Gly Glu Leu Asn Asp I le Leu Glu lie Pro 145 150 155 160 ggt tgc ccc ccg gtt ttg tee teg gat ttt ccg aaa ggt atg ttc ttt 16/29 96 144 192 240 288 336 384 432 480 528 16 320627 5761363799

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Gin Lys Glu Val Leu Ser His 6ly Ala Val Gly 6ly Phe Val Thr His 340 345 350 tgt ggg agg agt teg ata ttg gaa geg gtg teg ttt ggg gtg ccg atg Cys Gly Arg Ser Ser Ile Leu Glu Ala Val Ser Phe Gly Val Pro Met 355 360 365 1152 ate ggg tgg ccg ata tac geg gag cag agg atg aat agg gtg ttc atg Ile Gly Trp Pro Ile Tyr Ala Glu Gin Arg Met Asn Arg Val Phe Met 370 375 380

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Met Glu Asp Thr lie Val Leu Tyr Ala Ser Ala Glu His Leu Asn Ser 15 10 15

Met Leu Leu Leu Gly Lys Leu lie Asn Lys His His Pro Thr lie Ser 18/29 18 320627 1—363799 鵝* 20 25 30

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Leu His Asn Pro Asn Leu Leu Glu Ala Leu Glu Glu Leu Ser Leu Lys 85 90 95

Ser Lys Val Arg Ala Phe Val lie Asp Phe Phe Cys Asn Pro Ala Phe 100 105 110

Glu Val Ser Thr Ser Leu Asn Ile Pro Thr Tyr Phe Tyr Val Ser Ser 115 120 125

Gly Ala Phe Gly Leu Cys Gly Phe Leu His Phe Pro Thr lie Asp Glu 130 135 140

Thr Val Glu Lys Asp lie Gly Glu Leu Asn Asp lie Leu Glu lie Pro 145 150 155 160

Gly Cys Pro Pro Val Leu Ser Ser Asp Phe Pro Lys Gly Met Phe Phe 165 170 175

Arg Lys Ser Asn Thr Tyr Lys His Phe Leu Asp Thr Ala Lys Asn Met 180 185 190

Arg Arg Ala Lys Gly lie Val Val Asn Ala Phe Asp Ala Met Glu Phe 19/29 19 320(527 1363799 195 200 205 Arg Ala Lys Glu Ala Leu Val Asn Asn Leu Cys Val Pro Asn Ser Pro 210 215 220 Thr Pro Pro Val Phe Leu Val Gly Pro Leu Val Gly Ala Ser Thr Thr 225 230 235 240 Thr Lys Thr Thr Asn Glu Gin His Glu Cys Leu Lys Trp Leu Asp Val 245 250 255 Gin Pro Asp Arg Ser Val lie Phe Leu Cys Phe Gly Arg Arg Gly Leu 260 265 270 Phe Ser Ala Asp Gin Leu Lys Glu lie Ala lie Gly Leu Glu Asn Ser 275 280 285 Gly His Arg Phe Leu Trp Ser Val Arg Cys Pro Pro Ser Lys Pro Asn 290 295 300 Ser Tyr Asn Thr Asp Pro Asp Leu Asp Glu Leu Leu Pro Glu Gly Phe 305 310 315 320

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Gin Lys Glu Val Leu Ser His Gly Ala Val Gly Gly Phe Val Thr His 340 345 350

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Ala Ala Glu Val Ala Val Glu Lys Gly Gly Ser Ser Val Val Ala Leu 435 440 445 Gin Arg Phe Val Asp Met Val Val Ser 450 455

<210> 14 〈211〉 25 <212〉 DNA <213〉人造序列 <220〉

<223〉合成 DNA <400> 14 aaacatatgg aaggcgtcat acttc <210> 15 <211〉 30 <212> DNA <213〉人造序列 <220〉 <223〉合成DNA <400〉 15 21/29 21 320627 13-63799 30 ttttgatcat taatcacgag ttacggaatc <210〉 16 <211> 27 <212> DNA <213〉人造序列 <220〉 <223〉合成 DNA <400> 16 aaacatatgg aggacacgat tgttatc 27

<210〉 17 <211> 29 <212〉 DNA <213〉人造序列 <220〉

<223〉合成DNA <400〉 17 ttcatatgtc aatccctcgt ggccagaag 29 <210〉 18 <211> 27 <212〉 DMA <213〉人造序列 <220〉 <223〉合成 DNA <400〉 18 aaacatatgg aggacactat cgttctc 27 <210〉 19 <211〉 29 <212〉 DNA <213〉人造序列 22/29 22 320627 1363799 <220〉 <223〉合成DNA <400> 19 ttggatcctt aagaaaccac catatcaac 29 <210> 20 <211> 27 <212> DNA <213〉人造序列 <220>

<223〉合成DNA

<400〉 20 ggccaaacgc gccggagctg atgtaga 27 <210> 21 <211> 21 ' <212> DNA <213〉人造序列 <220〉 <223〉合成 DNA <400〉 21 agtgggtata ttcaagcctg t 21

<210> 22 <211〉 1433 <212> DNA <213〉芝麻 <220> <221> CDS <222> (1).. (1374) <400〉 22 atg gaa gac acc gtt gtc etc tac act teg gca gag cac ttg aat tee 48

Met Glu Asp Thr Val Val Leu Tyr Thr Ser Ala Glu His Leu Asn Ser 23/29 23 320627 96ΙΪ63799 15 10 15 atg tta gtg ctg gcc aaa ttc att age aaa cat tat ccc tee ate ccc Met Leu Val Leu Ala Lys Phe lie Ser Lys His Tyr Pro Ser lie Pro 20 25 30 etc eta ate ett tgc tee gcc ccc gag tee gcc geg get tee gtc gcc Leu Leu lie Leu Cys Ser Ala Pro Glu Ser Ala Ala Ala Ser Val Ala. 35 40 45 acc gtg cct tee ate act tac cac ege etc cca cct ccc get ett cct Thr Val Pro Ser lie Thr Tyr His Arg Leu Pro Pro Pro Ala Leu Pro 50 55 60 144 192

ccc aac ttg acc acc aat cct ett gaa etc tta ttc gaa ata cct cgt Pro Asn Leu Thr Thr Asn Pro Leu Glu Leu Leu Phe Glu lie Pro Arg 65 70 75 80 etc aac aac cca aat gtt age aaa gcc ett caa gag ate tee cag aag Leu Asn Asn Pro Asn Val Ser Lys Ala Leu 6ln Glu lie Ser Gin Lys 85 90 95 240 288

tea aga ate aaa gca ttt gtc att gat ttc ttc tgc aat cca gtt ttt Ser Arg Ile Lys Ala Phe Val lie Asp Phe Phe Cys Asn Pro Val Phe 100 105 110 gaa gtt tet aca ggc ttg aat ata ccc act tac ttc tac ate age tee Glu Val Ser Thr Gly Leu Asn lie Pro Thr Tyr Phe Tyr lie Ser Ser 115 120 125 ggc geg ttt ggc ett tgc ccc ttt ctg aat ttc ccc act ate gag gaa Gly Ala Phe Gly Leu Cys Pro Phe Leu Asn Phe Pro Thr lie Glu Glu 130 135 140 336 384 432 480 acc gtt cct gga gac ett get gac ttg aat gat ttt gtc gaa att cct

Thr Val Pro Gly Asp Leu Ala Asp Leu Asn Asp Phe Val Glu lie Pro 145 150 155 160 528 ggc tgc cca ccc gtt cac tea tea gat ttc ccc gag get atg att cat

Gly Cys Pro Pro Val His Ser Ser Asp Phe Pro Glu Ala Met lie His 165 170 175 cgt aag agt aat ate tac aaa cat ttt atg gac gcc gca aga aac atg

Arg Lys Ser Asn lie Tyr Lys His Phe Met Asp Ala Ala Arg Asn Met 24/29 24 320627 576 6241363799 180 185 190

gca aaa tea acc gga aac ctg gta aac gca ttt gat gcg etc gag ttt Ala Lys Ser Thr Gly Asn Leu Val Asn Ala Phe Asp Ala Leu Glu Phe 195 200 205 agg get aag gaa gca ctg ata aac ggt ttg tgc att ccc aat gcg cca Arg Ala Lys Glu Ala Leu lie Asn Gly Leu Cys lie Pro Asn Ala Pro 210 215 220 aca ccg cct gtt tac ttg gtt gga ccc tta gtt ggt gat age aac cgt Thr Pro Pro Val Tyr Leu Val Gly Pro Leu Val Gly Asp Ser Asn Arg 225 230 235 240 aac aac ggc tgc ata cag cat gaa tgc ctg aag tgg ett gat teg cag Asn Asn Gly Cys lie Gin His Glu Cys Leu Lys Trp Leu Asp Ser Gin 245 250 255 ccc age aaa age gtg att ttc etc tgc ttc ggc agg agg ggc ttg ttt Pro Ser Lys Ser Val lie Phe Leu Cys Phe Gly Arg Arg Gly Leu.Phe 260 265 270 tcc gtt gaa cag ett aaa gaa atg gcg ett ggt ctg gaa aat age ggc Ser Val Glu Gin Leu Lys Glu Met Ala Leu Gly Leu Glu Asn Ser Gly 275 280 285 tat aga ttt ett tgg tcc gtg ege agt cca ccg ggc aag cag aat tea Tyr Arg Phe Leu Trp Ser Val Arg Ser Pro Pro Gly Lys Gin Asn Ser 290 295 300 gca gcg gcg gag cca gac ttg gat gag ctg eta cca aag ggt ttc ctg Ala Ala Ala Glu Pro Asp Leu Asp Glu Leu Leu Pro Lys Gly Phe Leu 305 310 315 320 gag aga act aaa gac agg ggc ttc ata att aag tea tgg gcg ccg cag Glu Arg Thr Lys Asp Arg Gly Phe He lie Lys Ser Trp Ala Pro Gin 325 330 335 aeg gaa gtg ctg agt cac gat teg gtg ggt ggg ttc gtg aca cac tgc Thr Glu Val Leu Ser His Asp Ser Val Gly Gly Phe Val Thr His Cys 340 345 350 ggt agg age tea att ctg gaa gcg gtg teg ctg ggg gtg ccg atg ate Gly Arg Ser Ser lie Leu Glu Ala Val Ser Leu Gly Val Pro Met Me 25/29 672 720 768 816 864 912 960 1008 1056 25 320627 1104 115213-63799

355 360 365 ggg tgg ccg ttg tac gcg gag cag agg atg aat egg gtt ttc atg gtg Gly Trp Pro Leu Tyr Ala Glu Gin Arg Met Asn Arg Val Phe Met Val 370 375 380 gag gaa atg aag gtg gcg ctg cca tta gag gag aeg gcg gat ggg tta Glu Glu Met Lys Val Ala Leu Pro Leu Glu Glu Thr Ala Asp Gly Leu 385 390 395 400 gtg aeg gcg gtt gag ttg gag aag ega gtc aga cag ttg atg gac tcc Val Thr Ala Val Glu Leu Glu Lys Arg Val Arg Gin Leu Met Asp Ser 405 410 415 cag aeg gga aga get gtg ega cac ega gtg acc gaa ttg aaa age tec Gin Thr Gly Arg Ala Val Arg His Arg Val Thr Glu Leu Lys Ser Ser 420 425 430 get gcg gcg gcg gtg egg aag aat gga teg teg eta gtg gcg ttg caa Ala Ala Ala Ala Val Arg Lys Asn Gly Ser Ser Leu Val Ala Leu.GIn 435 440 445 aat ttc att gcg teg gtg act egg gtt tga gtgatgttat tactccaagt Asn Phe lie Ala Ser Val Thr Arg Val 450 455 aataaaattt aattaccgtg taaaaaaaaa aaaaaaaaa 1200 1248 1296 1344 1394 1433

<210〉 23 <211> 457 <212> PRT <213〉芝麻 <400〉 23

Met Glu Asp Thr Val Val Leu Tyr Thr Ser Ala Glu His Leu Asn Ser 15 10 15

Met Leu Val Leu Ala Lys Phe lie Ser Lys His Tyr Pro Ser lie Pro 20 25 30 26/29 26 320627 B63799

Leu Leu lie Leu Cys Ser Ala Pro Glu Ser Ala Ala Ala Ser Val Ala 35 40 45

Thr Val Pro Ser lie Thr Tyr His Arg Leu Pro Pro Pro Ala Leu Pro 50 55 60

Pro Asn Leu Thr Thr Asn Pro Leu Glu Leu Leu Phe Glu lie Pro Arg 65 70 75 80

Leu Asn Asn Pro Asn Val Ser Lys Ala Leu Gin Glu lie Ser 61n Lys 85 90 95

Ser Arg lie Lys Ala Phe Val lie Asp Phe Phe Cys Asn Pro Val Phe 100 105 110

Glu Val Ser Thr Gly Leu Asn lie Pro Thr Tyr Phe Tyr lie Ser Ser 115 120 125

Gly Ala Phe Gly Leu Cys Pro Phe Leu Asn Phe Pro Thr lie Glu Glu 130 135 140

Thr Val Pro Gly Asp Leu Ala Asp Leu Asn Asp Phe Val Glu lie Pro 145 150 155 160

Gly Cys Pro Pro Val His Ser Ser Asp Phe Pro Glu Ala Met lie His 165 170 175

Arg Lys Ser Asn lie Tyr Lys His Phe Met Asp Ala Ala Arg Asn Met 180 185 190

Ala Lys Ser Thr Gly Asn Leu Val Asn Ala Phe Asp Ala Leu Glu Phe 195 200 205 27/29 27 320627 1363799

Arg Ala Lys Glu Ala Leu I le Asn Gly Leu Cys Ile Pro Asn Ala Pro 210 215 220

Thr Pro Pro Val Tyr Leu Val Gly Pro Leu Val Gly Asp Ser Asn Arg 225 230 235 240

Asn Asn Gly Cys lie Gin His Glu Cys Leu Lys Trp Leu Asp Ser Gin 245 250 255

Pro Ser Lys Ser Val lie Phe Leu Cys Phe Gly Arg Arg Gly Leu Phe 260 265 270

Ser Val Glu Gin Leu Lys Glu Met Ala Leu Gly Leu Glu Asn Ser Gly 275 280 285

Tyr Arg Phe Leu Trp Ser Val Arg Ser Pro Pro Gly Lys Gin Asn Ser 290 295 300

Ala Ala Ala Glu Pro Asp Leu Asp Glu Leu Leu Pro Lys Gly Phe Leu 305 310 315 320

Glu Arg Thr Lys Asp Arg Gly Phe lie lie Lys Ser Trp Ala Pro Gin 325 330 335

Thr Glu Val Leu Ser His Asp Ser Val Gly Gly Phe Val Thr His Cys 340 345 350

Gly Arg Ser Ser lie Leu Glu Ala Val Ser Leu Gly Val Pro Met Me 355 360 365

Gly Trp Pro Leu Tyr Ala Glu Gin Arg Met Asn Arg Val Phe Met Val 370 375 380 28/29 28 320627 1363799

Glu Glu Met Lys Val Ala Leu Pro Leu Glu Glu Thr Ala Asp Gly Leu 385 390 395 400

Val Thr Ala Val Glu Leu Glu Lys Arg Val Arg Gin Leu Met Asp Ser 405 410 415

Gin Thr Gly Arg Ala Val Arg His Arg Val Thr Glu Leu Lys Ser Ser 420 425 430

Ala Ala Ala Ala Val Arg Lys Asn Gly Ser Ser Leu Val Ala Leu Gin 435 440 445

Asn Phe lie Ala Ser Val Thr Arg Val 450 455 〈210〉 24 <211〉 29 <212> DNA <213〉人造序列 <220〉 <223〉.合成DNA <400〉 24 caccatatgg aagacaccgt tgtcctcta 29

<210〉 25 <211> 29 <212〉 DNA <213〉人造序列 <220〉 <223〉合成DNA <400〉 25 ggatcctaac atcactcaaa cccgagtca 29 29/29 29 320627

Claims (1)

1363799 七1. 公告本 、申請專利範圍： 4年\月々曰修正本 一種多核苷酸，其為以下（a)至（d)中任一項所述的多核 第097138365號專利申請案 101年1月16日修正替換頁 苷酸： (a)—種多核苷酸，其含有由序列號碼：以4所表 示的鹼基序列的第1位至第1359位鹼基序列所組成的 多核苦酸； (b) —種多核苷酸，其含有編碼具有序列號碼：5 的胺基酸序列的蛋白質的多核苷酸； (c) 一種多核苷酸，其含有編碼由序列號碼：5的 胺基酸序列中有1至15個胺基酸發生缺失、取代、插 入及/或加成的胺基酸序列所組成且具有UDP-葡萄糖 醛酸轉移酶活性的蛋白質的多核苷酸；或 (d) —種多核苷酸，其含有編碼具有與序列號碼：5 的胺基酸序列有80%以上同源性的胺基酸序列且具有 UDP-葡萄糖醛酸轉移酶活性的蛋白質的多核苷酸。 2.如申請專利範圍第1項之多核苷酸，其為以下（e)或（〇 中任一項之多核苦酸： (e) —種多核苷酸，其含有編碼由序列號碼：5的 胺基酸序列中有10個以下的胺基酸發生缺失、取代、 插入及/或加成的胺基酸序列所組成且具有UDP-葡萄 糖醛酸轉移酶活性的蛋白質的多核苷酸；或 (f) 一種多核苷酸，其含有編碼具有與序列號碼：5 的胺基酸序列有90%以上同源性的胺基酸序列且具有 UDP-葡萄糖醛酸轉移酶活性的蛋白質的多核苷酸。 1 320627(修正版) 1363799 I第097138365號專ψ!〗申請案 3.如申請專利範園第項之多^ 碼：4所表示的齡美^ 酸，其含有由序列號 列所組成的多核^第1位至第1359位驗基序 4. 如申請專利範圍苐 號碼:5的，序列所二㈣酸白==序列 5. ΓΝΑ申凊專利範圍第1至4項中任—項之多酸，其為 6. -種蛋白質，其係經申請專 之多核芽酸所編竭。 圍第1至5項中任-項 ;=:其含有申請專利範圍第丨至5項中任一項之 8. 項3 =酸其導入有申請專利範圍第1至5項中任- 形體’其導入有申請專利範圍第7項之。 10. —種蛋白質的製 戰體 或9項之轉形:：由使用如申請專利範圍第8 11. -種葡萄糖酸上 ==利範圍第6項之蛋白質。 物造方法，其係以申請專利範 之蛋白質作為催化劑，由UDP-葡萄糖 類黃鋼生成葡萄糖喊接合物。 肖糖純和 320627(修正版) 2