CN113249354A

CN113249354A - 齐墩果酸葡糖醛酸转移酶及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN113249354A
Application number: CN202110699994.0A
Authority: CN
Inventors: 杨生超; 唐卿雁; 张广辉; 范伟; 陈庚
Original assignee: Yunnan Agricultural University
Current assignee: Yunnan Agricultural University
Priority date: 2018-09-19
Filing date: 2018-09-19
Publication date: 2021-08-13
Also published as: CN113462668A; CN113249355A; CN109266626A; CN109266626B

Abstract

本发明涉及齐墩果酸葡糖醛酸转移酶及其编码基因和应用，属于植物基因工程和生物技术领域。本发明齐墩果酸葡糖醛酸转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。本发明齐墩果酸葡糖醛酸转移酶能够特异性地以尿苷二磷酸葡糖醛酸为糖基供体，催化齐墩果酸C‑3位的糖基化反应，从而生成齐墩果酸3‑O‑β‑葡糖醛酸。该转移酶是在齐墩果烷型皂苷合成过程中上游步骤的酶，这对于解析齐墩果烷型皂苷的合成途径，具有重要意义。

Description

齐墩果酸葡糖醛酸转移酶及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于植物基因工程和生物技术领域，具体涉及齐墩果酸葡糖醛酸转移酶及其编码基因和应用。

背景技术

姜状三七(Panax zingiberensis C.Y.Wu et K.M.Feng)为五加科人参属多年生草本植物，分布于云南东南部、尼泊尔中部、不丹高海拔地区、缅甸东枝、掸邦等地。姜状三七根茎肉质如姜块状，属濒危种，由于过度开发，目前野生资源极其稀少。姜状三七有散瘀、定痛、止血等功效，主治跌打损伤、骨折、吐血、功能性子宫出血、外伤出血等症。

皂苷为姜状三七的主要活性成分，主要含有达玛烷型皂苷和齐墩果烷型皂苷，其中以齐墩果烷型皂苷为主，如人参皂苷R_O，竹节参皂苷IV和竹节参皂苷IVa。齐墩果烷型皂苷具有抗肿瘤、降血脂、降血糖、保肝等药理作用。齐墩果烷型皂苷是从齐墩果酸3-O-β-葡糖醛酸转化而来的，而齐墩果酸3-O-β-葡糖醛酸则是齐墩果酸经过一种未知的葡糖醛酸转移酶(OAGT)催化形成的。

尽管在其他人参属植物中也含有丰富的齐墩果烷型皂苷，并已报道了它们的转录组信息，但是没有鉴定出参与齐墩果烷型皂苷合成的糖基转移酶。因此如何克服现有技术的不足是目前植物基因工程和生物技术领域亟需解决的问题。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供齐墩果酸葡糖醛酸转移酶及其编码基因和应用，该齐墩果酸葡糖醛酸转移酶能在合成齐墩果烷型皂苷的前体中起作用，从而为鉴定齐墩果烷型皂苷的其他修饰奠定基础。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

齐墩果酸葡糖醛酸转移酶，所述齐墩果酸葡糖醛酸转移酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。

本发明同时保护编码上述述齐墩果酸葡糖醛酸转移酶的基因。

具体为：所述基因的编码序列是SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7或SEQID NO.8所示的核苷酸序列。

本发明的另一目的是提供一种含有齐墩果酸葡糖醛酸转移酶基因的重组载体，是将SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示基因直接与不同表达载体连接所构建的重组载体。同时，本发明保护重组载体转化得到的重组基因工程菌。

本发明还涉及上述齐墩果酸葡糖醛酸转移酶在合成齐墩果烷型皂苷中的应用。

具体的应用方法是：以齐墩果酸葡糖醛酸转移酶为催化剂，以尿苷二磷酸葡糖醛酸为底物催化齐墩果酸生成齐墩果酸3-O-β-葡糖醛酸。

本发明申请人发现姜状三七是研究齐墩果烷型皂苷合成的理想材料，在本发明中，利用Illumina HiSeq^TM 2000测序平台建立了姜状三七的转录组数据库，并功能识别了在齐墩果烷型皂苷生物合成中的关键步骤，即催化齐墩果酸形成齐墩果酸3-O-β-葡糖醛酸的葡糖醛酸转移酶编码酶基因。

本发明首次对筛选到的4个编码齐墩果酸葡糖醛酸转移酶的基因(3个来自姜状三七，1个来自另一种含有齐墩果烷型皂苷的人参属植物竹节参)进行酶活性检测，发现这种齐墩果酸葡糖醛酸转移酶特异性地将葡糖醛酸转移到齐墩果酸的C-3位上，形成齐墩果酸3-O-β-葡糖醛酸。本发明为姜状三七研究提供了有价值的遗传信息，为齐墩果烷型人参皂苷的生物合成提供了候选基因，为进一步进行基因功能识别奠定了基础。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：

1、本发明的齐墩果酸糖基转移酶能够以尿苷二磷酸葡糖醛酸(UDP-GlcA)为糖基供体，特异性地催化齐墩果酸C3位的糖基化反应。

2、本发明为姜状三七研究提供了有价值的遗传信息，为齐墩果烷型人参皂苷的生物合成提供了候选基因，为进一步进行基因功能识别奠定了基础。

3、本发明克隆的齐墩果酸糖基转移酶是在皂苷合成过程中关键步骤的酶，这对于解析齐墩果烷型皂苷的合成途径，揭示人参属植物中人参皂苷合成的分子机理，进而为建立药用植物三萜皂苷异源合成系统奠定基础，对于促进人参属植物三萜皂苷生物合成，提高其产量具有重要意义。

附图说明

图1为参与人参皂苷生物合成的UGT聚类分析图。其中，标注三角形的6条unigene与BvUGT73C10–UGT73C13同源性较高。据报道，欧洲山芥UGT73C10–UGT73C13可催化齐墩果烷型皂苷齐墩果酸和常春藤皂苷元的3-O-糖基化(Augustin等，2012)，因此推测这6条基因可能具有催化齐墩果酸3-O-糖基化的作用。

各序列在NCBI数据库中的编号如下：人参，UGTPg101(AKQ76389)，UGTPg1(AIE12479)，UGTPg100(AKQ76388)，PgUGT94Q2(AGR44632)，UGTPg29(AKA44579)，UGTPg45(AKA44586)，PgUGT74AE2(AGR44631)；

西洋参，Pq3-O-UGT2(ALE15280)；

蒺藜苜蓿MtUGT71G1(AAW56092)，MtUGT73F3(ACT34898)，MtUGT73K1(AAW56091)；

水稻，OsUGT707A3(BAC83989)，OsUGT706C1(BAB68090)，OsUGT706D1(BAB68093)，OsUGT709A4(BAC80066)，OsRUGT-10(BAD69345)；

番红花，CsUGT707B1(CCG85331)，CsGT45(ACM66950)，CsUGT84A22(ALO19890)，CsUGT78A14(ALO19888)；

王不留行，SvUGT74M1(ABK76266)；

大豆，GmUGT73F4(BAM29363)，GmUGT73F2(BAM29362)，GmSGT2(BAI99584)，GmSGT3(BAI99585)；

刺茄，SaGT4A(BAD89042)；

拟南芥，AtUGT73C5(OAP09184)，AtUGT73C6(OAP07438)；

欧洲山芥，BvUGT73C10(AFN26666)，BvUGT73C11(AFN26667)，BvUGT73C12(AFN26668)，BvUGT73C13(AFN26669)。

图2为pCzn1-jzsqUnigene0023775(RC)测序验证与预期序列进行比对图。

图3为重组质粒pCzn1-jzsqUnigene0023775(RC)酶切鉴定结果，其中，标记(Marker)：200,500,800,1200,2000,3000,4500；M：标记；1:酶切前质粒；2:酶切后质粒。

图4为重组表达载体图谱；其中，MCS：多克隆位点；TEE：翻译增强元件；cspA：冷休克蛋白；Lac：乳糖操纵子；Amp：氨苄青霉素。

图5为蛋白表达鉴定SDS-PAGE分析图；其中，M:蛋白质分子质量标准；1:未诱导；2:诱导后；3:诱导破碎后上清；4:诱导破碎后沉淀。

图6为蛋白纯化SDS-PAGE分析图；M:蛋白质分子质量标准；1:破碎后处理样品；2:流出；3:洗脱。

图7为蛋白Western Blot鉴定分析图；其中，M:蛋白质分子质量标准；1:纯化后样品。

图8为根据已有报道推测的人参皂苷生物合成途径；

其中，AACT，乙酰辅酶A乙酰基转移酶；HMG-CoA，3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A；HMGS，3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶；HMGR，3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶；MVK，甲羟戊酸激酶；PMK，磷酸甲羟戊酸激酶；MVD，甲羟戊酸二磷酸脱羧酶；FPP，法尼基焦磷酸；DMAPP，二甲丙烯二磷酸；DXP，1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸盐；MEP，甲基赤藓糖醇磷酸酯；FPS，法尼基焦磷酸合成酶；SS，鲨烯合成酶；SE，鲨烯环氧酶；DDS，达玛烯二醇合成酶；β-AS，β-香树脂合成酶；CAS，环阿屯醇合酶；LAS，羊毛甾醇合酶；PPDS，原人参二醇合成酶；PPTS，原人参三醇合成酶；CYP，细胞色素P450；Glc，β-D-吡喃葡萄糖基；Ara(f)，a-L-阿拉伯呋喃基；GlcA，β-D-吡喃葡糖醛酸苷；OAGT，齐墩果酸葡糖醛酸转移酶；GlcT-n表示尿苷二磷酸糖类：糖基转移酶(GlcT)在第n个碳原子上催化第一个糖基化反应；GlcT-n(2)表示在第n个碳原子上催化第二个糖基化反应；UGRdGT，尿苷二磷酸葡萄糖：人参皂苷Rd糖基转移酶。

图9为齐墩果烷型皂苷生物合成中的关键步骤，即葡糖醛酸转移酶催化齐墩果酸形成齐墩果酸3-O-β-葡糖醛酸。

图10为从聚类分析中得到的6条unigene中，筛选出在姜状三七根中高表达的3条unigene进行酶活检验，注：另外1条unigene基因来自于竹节参，从图1可知它与姜状三七这3条unigene具有较高同源性。

图11为HPLC分析齐墩果酸葡糖醛酸转移酶(OAGT)对齐墩果酸C-3位的糖基化作用谱图；

以变性的齐墩果酸葡糖醛酸转移酶纯化蛋白为对照，对筛选到的4个编码葡糖醛酸转移酶的基因(3个来自姜状三七，1个来自竹节参)进行体外酶活检测，发现这四个重组蛋白不能将尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-Glc)作为糖供体，但能以尿苷二磷酸葡糖醛酸(UDP-GlcA)作为糖供体，特异性地将葡糖醛酸转移到齐墩果酸的C-3位上，产生齐墩果酸3-O-β-葡糖醛酸。在酶活验证试验中，姜状三七unigene0023775，unigene0022968和unigene0004252分别命名为PzGAT1，PzGAT2和PzGAT3，竹节参unigene0053366命名为PjGAT。图中，1：齐墩果酸对照品(Authentic OA)；2：齐墩果酸3-O-β-葡糖醛酸(AuthenticOAGA)；Control：对照；“+”表示反应体系中有两种物质的参与，如PzGAT1+UDP-GlcA，表示反应体系中加入重组蛋白PzGAT1和尿苷二磷酸葡糖醛酸(UDP-GlcA)。

图12为齐墩果酸葡糖醛酸转移酶基因编码的蛋白在齐墩果酸糖基化作用中酶活反应体系的液相色谱-质谱(LC-MS)示意图；

a.重组蛋白酶活检测的总离子流图。其中oleanolic acid为底物齐墩果酸标准品，3-O-β-glucuronide oleanolic acid为产物齐墩果酸3-O-β-葡糖醛酸标准品。

b.负离子模式下齐墩果酸糖醛酸化产物的质谱图，其中右上图为齐墩果酸3-O-β-葡糖醛酸，631.3850是[M-H]-，455.3529是[M-Gla-H]-(其中Gla为葡糖醛酸基glucuronide，H为质子)。右下图为齐墩果酸，455.3529是[M-H]-。ESI负离子模式下皂苷类成分特征碎片离子主要是[M-H]-，在二级质谱途中，皂苷易发生糖苷键的断裂，产生去糖基化离子。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。

本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

本发明除非另有说明，否则百分号为质量百分数。

为了找到齐墩果酸糖基转移酶(OGAT)基因，在姜状三七和珠子参的转录组数据中搜索与糖基化相关的基因，将这些基因与其他物种中已知功能的糖基转移酶基因聚类构建进化树(图1)，从中找到预测其功能为C-3位糖基化，并在根部具有高表达的4个unigene作为OGAT的候选基因进行酶活检测，包括来自姜状三七的unigene0023775、unigene0022968和unigene0004252，以及珠子参unigene0053366，分别命名为PzGAT1、PzGAT2、PzGAT3和PjGAT，氨基酸序列依次对应SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4，核苷酸序列依次对应SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8。

以PzGAT1为例，说明蛋白重组的过程。PzGAT2、PzGAT3和PjGAT的蛋白重组过程与之相同。

采用基于全基因合成方法PAS(PCR-based Accurate Synthesis)，设计全长拼接引物，合成基因姜状三七Unigene0023775(RC)，后面缩写为jzsqUnigene0023775(RC)，酶切连接连入载体pCzn1；获得的重组质粒pCzn1-jzsqUnigene0023775(RC)转入TOP10克隆菌株和Arctic-Express^TM表达菌株。

使用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达目的蛋白jzsqUnigene0023775(RC)。优化表达条件，将诱导条件调整至37℃，经分析目标蛋白主要呈包涵体形式。通过变复性的方式，重溶目标蛋白jzsqUnigene0023775(RC)，Ni柱亲和纯化获得目的蛋白。

具体实验方法及结果如下：

1.pCzn1-jzsqUnigene0023775(RC)测序验证

将获得的重组质粒pCzn1-jzsqUnigene0023775(RC)转入TOP10克隆菌株，具体的转入方法是：(1)将重组质粒1μL加入100μL TOP10感受态细菌中，置冰上20min；(2)42℃热激90sec，迅速置冰中5min；加入600μL LB培养液；(3)37℃，220r/min振摇1h，离心后全部涂布于含50μg/mL氨苄的LB平板，37℃倒置培养过夜。挑取阳性克隆子测序。测序结果与预期序列进行比对，截取部分比对序列如图2所示。

2.质粒酶切鉴定

2.1酶切体系

其中，质粒为：jzsqUnigene0023775

酶切鉴定结果如图3所示。酶切后的质粒OD260/OD280:1.82。

3.原核蛋白表达

3.1原核蛋白的表达鉴定

PzGAT1蛋白大小理论分子量为56.857KD左右(含组氨酸标签(His-tag))，氨基酸序列翻译如下：

3.1.1pCzn1-jzsqUnigene0023775(RC)载体转化至大肠杆菌表达体系(ArcticExpress)

(1)将pCzn1-jzsqUnigene0023775(RC)质粒1μl加入100μl感受态细菌(ArcticExpress)中，置冰上20min；

(2)42℃热激90s，迅速置冰中5min；加入600μl LB培养液；

(3)37℃，220r/min振摇1h，离心后全部涂布于含50μg/ml氨苄青霉素(Amp)的LB平板，37℃倒置培养过夜。

3.1.2IPTG诱导pCzn1-jzsqUnigene0023775(RC)载体融合蛋白的表达

(1)挑取转化平板(Amp+LB)上的单克隆接种于含50μg/ml Amp的3ml LB培养液的试管中，37℃、220r/min振摇过夜；

(2)次日按体积比1:100接种于30ml含50μg/ml氨苄青霉素(Amp)的LB培养液中，37℃、220r/min振摇至菌体OD600为0.6-0.8；

(3)取出1ml培养物，10000r/mim室温离心2min，弃上清，用100μl 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀；

(4)向剩余的培养物中加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.5mM，37℃、220r/min振摇4h，诱导融合蛋白表达；

(5)取出1ml培养物，10000r/mim室温离心2min，弃上清，用100μl 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀。剩余培养物4000r/mim，离心10min，弃上清，用pH7.4磷酸盐缓冲液重悬菌体沉淀；重悬液进行超声波破碎后，分别取上清液与沉淀液加入上样缓冲液重悬。

(6)进行SDS-PAGE胶浓度12％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测分析，考马斯亮蓝染色显带，结果如图5所示。

3.1.3表达鉴定结果分析

利用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达，经SDS-PAGE胶浓度12％聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，目标蛋白主要存在于沉淀中，结果如图5所示。

3.2包涵体蛋白的变复性

(1)将菌体沉淀重悬于20ml裂解液[20mM Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液)含有1mM PMSF(苯甲基磺酰氟)和蛋白酶抑制剂混合物]，pH 8.0)，超声破碎，超声功率400W，超声方式为：工作4s，间歇8s，共20min；

(2)将超声破碎的细胞裂解液于4℃10000r/mim离心20min，收集沉淀(包涵体)；

(3)使用包涵体洗涤液[20mM Tris(三羟甲基氨基甲烷)，1mM EDTA，2M尿素，1MNaCl，1％Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)，pH8.0]洗涤包涵体3次；

(4)用30ml溶解缓冲液[20mM Tris(三羟甲基氨基甲烷)，5mM DTT(二巯基苏糖醇)，8M尿素，pH8.0]溶解包涵体，4℃放置过夜；之后于室温下，10000r/mim离心15min；

(5)将上一步离心的上清液逐步滴加(1ml/min)至120ml含有20mM Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液)、0.15M NaCl(氯化钠)，pH8.0缓冲液中，逐步成倍梯度稀释(1:4)缓慢搅拌，将蛋白溶液装入透析袋于2L含有20mM Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液)、0.15M NaCl(氯化钠)，pH8.0溶液中透析过夜。

3.3融合蛋白的镍(Ni)柱亲和纯化及结果分析

3.3.1Ni柱纯化

(1)利用低压层析系统，将上述透析液离心后的上清以0.5ml/min流速上样至Ni-IDA Binding-Buffer(镍-亚氨基二乙酸结合缓冲)预平衡的Ni-IDA-Sepharose(镍-亚氨基二乙酸-琼脂糖凝胶)CL-6B亲和层析柱；

(2)用Ni-IDA Binding-Buffer(镍-亚氨基二乙酸结合缓冲)以0.5ml/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线；

(3)用Ni-IDA Washing-Buffer(镍-亚氨基二乙酸洗涤缓冲液)[20mM Tris-HCl，20mM咪唑，0.15M NaCl，pH8.0]以1ml/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线；

(4)用Ni-IDA Elution-Buffer(镍-亚氨基二乙酸洗脱缓冲液)[20mM Tris-HCl，250mM咪唑，0.15M NaCl，pH8.0)以1ml/min流速洗脱目的蛋白，收集流出液；

(5)上述收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用2L含有20mM Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液)，0.15M NaCl(氯化钠)，pH8.0进行透析过夜；

(6)透析后的纯化蛋白进行胶浓度12％SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)分析，结果如图4所示。

3.3.2纯化结果分析

包涵体经过变复性的方式，重溶目标蛋白，通过镍柱亲和纯化获得目标蛋白，进行12％SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)分析，结果如图6所示，纯化到相应的目的蛋白。

3.4Western Blot(蛋白质印迹法)及结果分析

3.4.1Western Blot(蛋白质印迹法)步骤

(1)取纯化透析后的样品上样5μl

(2)上样完毕后，聚丙烯酰胺凝胶先90V跑完积层胶，再将电压升至200V直到电泳结束。

(3)电泳结束后，取下凝胶进行转膜，恒压100V转膜，为1.5h，恒流250mA

(4)电转结束后，取下膜后先用PBST(含吐温-20的磷酸盐缓冲液)洗涤4次，每次5min。

(5)将膜置于5％(w/v)脱脂奶粉封闭液中封闭37℃1h。

(6)用封闭液稀释一抗，膜在一抗稀释液中4℃过夜。

(7)次日将膜取出后用PBST(含吐温-20的磷酸盐缓冲液)洗膜4次，每次5min，

(8)用含5％(w/v)牛奶的封闭液稀释二抗。膜在二抗中37℃反应1h。

(9)反应完毕后，把膜取出后置于干净的盒子中洗膜4次，每次5min。

(10)ECL(电化学发光)显影，曝光。一抗是Anti His mAb((小鼠)抗His标签单抗)，1:1000二抗是HRP-羊抗兔IgG1:5000。稀释比例如表1所示。

表1

编号	一抗名称	稀释比例	二抗名称	稀释比例
					1	His	1:1000	羊抗兔	1:5000

3.4.2Western Blot(蛋白质印迹法)结果分析

经western blot验证，纯化到的蛋白即为所表达的目的蛋白。

通过以上步骤获得的重组蛋白用于后续酶活验证试验中。

预测皂苷合成的可能途径(图8)，并以途径中的化合物作为底物对该糖基转移酶进行酶活反应试验，酶活反应分别以尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-glucose)和尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(UDP-glucuronide)作为糖基供体，齐墩果酸为糖基受体进行，反应完后用HPLC检测是否有产物生成。

酶活检测条件：200μL混合物中含有25mM TAPS-HCl(pH 8.6)，1mM DTT，1mM受体底物齐墩果酸，5mM UDP-葡萄糖或5mM UDP-葡萄糖醛酸和50μg纯化的重组酶，利用纯化的标记蛋白组蛋白在沸水中加热20min变性后作为对照。将酶反应体系在30℃下温育30min后，加入200μL甲醇终止反应。最后，通过高效液相色谱(HPLC)方法进行产物鉴定和检测。

HPLC测定条件：高效液相色谱分析利用安捷伦1260系列高效液相色谱仪完成。色谱柱为安捷伦ZORBAX SB-C18(250mm×4.6mm,5μm)，流动相为质量浓度为0.1％磷酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脱：0-10min，20％B；10-18min，50％B；18-26min，100％B。流速1.0mL·min^-1，检测波长203nm，柱温25℃，进样体积10μL。

超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(UPLC-QTOF-MS)分析条件：仪器为美国Waters公司IUPLC-QTOF-MS/MS仪器；色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18(2.1x100mm，1.7μm)，流动相：A(质量浓度为0.1％甲酸的水溶液)，B(乙腈)，梯度洗脱：0–1.5min，20％B；1.5–2.0min，35％B；2.0–4.0min，50％B；4.0–6.0min，65％B；6.0–7.5min，85％B；7.5–8.0min，95％B；8.0–10.0min，20％B。流量：0.5mL·min^-1；柱温：35℃，分析时间为10min，进样量1.0μL，采用自动进样方式。

质谱参数：离子扫描模式为ESI负离子扫描；扫描范围为100-1200Da；离子源温度100℃；去溶剂气温度：400℃；去溶剂气体流速：800L·h^-1；毛细管电压：2.5kV(负离子)；锥孔电压：40V；低能量碰撞能：6V；高能量碰撞能：30-50V。

结果如图11所示，与对照相比，4个编码葡糖醛酸转移酶的基因PzGAT1、PzGAT2、PzGAT3和PjGAT重组蛋白，以齐墩果酸作为糖基受体，以尿苷二磷酸葡糖醛酸(UDP-GlcA)为糖基供体的反应，经检测有产物齐墩果酸3-O-β-葡糖醛酸生成，而以尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-Glc)为糖基供体的反应没有上述产物的生成。此结果说明，该齐墩果酸糖基转移酶在皂苷的合成过程中，作用于齐墩果酸的糖基化修饰，使齐墩果酸在C3位被糖基化后最终形成齐墩果酸3-O-β-葡糖醛酸。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

<110> 云南农业大学

<120> 齐墩果酸葡糖醛酸转移酶及其编码基因和应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 492

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 1

Met Ser Lys Met Gln Asn Gln Leu His Phe Val Leu Val Pro Leu Leu

1 5 10 15

Ala Gln Gly His Met Ile Pro Met Ile Asp Met Ala Arg Leu Leu Ala

20 25 30

Gln His Gly Val Val Val Ser Leu Val Thr Thr Pro His Asn Ala Ser

35 40 45

Arg Phe Ala Ser Thr Ile His Arg Ala Arg Asp Ser Gly Leu Lys Ile

50 55 60

Gln Leu Ile Gln Ile Pro Phe Pro Trp Gln Glu Val Gly Leu Pro Pro

65 70 75 80

Gly Cys Glu Asn Leu Asp Ser Leu Pro Ser Arg Asp Leu Ile Gly Asn

85 90 95

Phe Phe Ser Ala Leu Asn Lys Leu Gln Gln Pro Leu Glu Gln His Leu

100 105 110

Gln Glu Leu Met Pro Pro Pro Asn Cys Ile Ile Ser Asp Lys Tyr Leu

115 120 125

Ser Trp Thr Thr Lys Thr Ala Gln Lys Phe His Val Pro Arg Leu Val

130 135 140

Phe His Gly Met Cys Cys Phe Ser Leu Leu Ser Ser His Asn Ile Arg

145 150 155 160

Leu Tyr Asn Ala His Leu Ser Val Thr Ser Asp Ser Gln Pro Phe Val

165 170 175

Val Pro Gly Met Pro Gln Arg Val Glu Ile Thr Lys Ala Gln Leu Pro

180 185 190

Gly Ala Phe Val Thr Leu Pro Asp Leu Asp Asp Ile Arg Asp Gln Met

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210 215 220

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Asp Lys Phe Glu Arg Gly Asn Lys Ala Ser Ile Asp Glu Thr His Cys

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Thr Glu Trp Leu Asp Ser Met Lys Pro Lys Ser Val Ile Tyr Ala Cys

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Leu Gly Ser Gln Cys Arg Leu Val Pro Ala Gln Leu Met Glu Leu Gly

290 295 300

Leu Ala Leu Glu Ser Ser Lys His Pro Phe Ile Trp Val Ile Lys Glu

305 310 315 320

Gly Glu Arg Phe Gln Glu Leu Glu Lys Trp Leu Val Glu Glu Glu Phe

325 330 335

Glu Glu Arg Ile Lys Arg Arg Gly Leu Leu Ile Lys Gly Trp Ala Pro

340 345 350

Gln Val Leu Ile Leu Ser His Pro Ala Ile Lys Ala Phe Leu Thr His

355 360 365

Cys Gly Trp Asn Ser Thr Ile Glu Gly Val Cys Ser Gly Val Pro Met

370 375 380

Ile Thr Trp Pro Met Phe Ala Glu Gln Phe Phe Asn Glu Lys Leu Ile

385 390 395 400

Val Asp Ile Leu Arg Ile Gly Ile Lys Val Gly Val Gln Val Ser Val

405 410 415

Arg Trp Gly Glu Glu Glu Lys Ile Gly Val Leu Val Lys Arg Glu Gln

420 425 430

Ile Gln Lys Ala Ile Glu Thr Ile Met Asn Gly Gly Gly Glu Glu Gly

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Gly Ile Arg Lys Arg Ala Thr Lys Leu Ser Lys Val Gly Ala Arg Ala

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Met Glu Asp Gly Gly Ser Ser His Phe Asn Ile Ser Leu Leu Ile Gln

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Asp Ile Trp Lys Gln Lys Asn Asn Gln Glu Lys Leu

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<210> 2

<211> 486

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 2

Met Asp Ser Pro Ser Asp Gln Leu His Ile Val Met Ile Pro Leu Met

1 5 10 15

Cys Pro Gly His Leu Ile Pro Met Val Asp Met Ala Lys Leu Leu Ala

20 25 30

Gln Arg Ala Val Thr Val Thr Ile Val Ala Thr Pro Arg Asn Ala Ile

35 40 45

Arg Phe Gly Ala Val Ile Gly Arg Ala Ile Glu Ser Gly Leu Pro Ile

50 55 60

Arg Leu Leu Glu Val Arg Phe Pro Ala Leu Glu Ala Gly Leu Pro Glu

65 70 75 80

Gly Cys Glu Ser Val Asp Asp Leu Pro Ser Leu Ala Met Ser Ile Asn

85 90 95

Phe Phe Ala Ala Thr Lys Met Leu Gln Glu Pro Val Glu Lys Met Leu

100 105 110

Lys Asp Ile Lys Pro Ser Pro Ser Cys Ile Leu Ser Asp Lys His Val

115 120 125

Phe Trp Thr Ser Asp Thr Ala Lys Lys Leu Gln Ile Pro Trp Ile Met

130 135 140

Phe Asp Gly Met Ser Cys Phe Thr Gln Leu Cys Thr Glu Asn Ile Tyr

145 150 155 160

Asn Ser Lys Val His Glu Ser Val Ser Ser Glu Ser Glu Ser Phe Val

165 170 175

Val Arg Gly Leu Pro Asp His Ile Glu Phe Thr Lys Ala Gln Leu Pro

180 185 190

Gly Leu Phe Asn Pro Gly Ser Val Pro Ala Ile Asp Glu Ile Arg Glu

195 200 205

Gln Val Arg Ala Thr Glu Val Gly Ala Tyr Gly Val Val Ile Asn Ser

210 215 220

Phe Glu Glu Leu Glu Gln Asp Tyr Val Asp Glu Phe Lys Lys Val Arg

225 230 235 240

Arg Asp Lys Val Trp Cys Val Gly Pro Leu Ser Leu Asn Asn Glu Asn

245 250 255

Met Leu Asp Lys Ala Gln Arg Gly His Asn Asn Ala Ser Ile Asp Gly

260 265 270

Asn Lys Cys Leu Gln Trp Leu Asp Asn Trp Ala Asn Gly Ser Val Ile

275 280 285

Tyr Ala Cys Leu Gly Ser Ile Ser Ser Leu Thr Cys Thr Gln Leu Met

290 295 300

Glu Leu Ala Leu Gly Leu Glu Ala Ser Glu Arg Pro Phe Val Trp Val

305 310 315 320

Val Arg Ala Gly Gly Lys Gln Lys Glu Ile Glu Lys Trp Ile Leu Glu

325 330 335

Glu Gly Phe Glu Glu Ser Thr Lys Gly Arg Gly Leu Leu Ile Arg Gly

340 345 350

Trp Ala Pro Gln Val Leu Ile Leu Ser His Pro Ala Ile Gly Gly Phe

355 360 365

Val Thr His Cys Gly Trp Asn Ser Thr Ile Glu Gly Ile Cys Ser Gly

370 375 380

Val Pro Met Ile Thr Trp Pro Leu Phe Ala Glu Gln Phe Phe Asn Glu

385 390 395 400

Lys Leu Val Val Gln Val Leu Glu Thr Gly Val Ser Val Gly Ala Lys

405 410 415

Glu Val Met Pro Leu Gly Glu Glu Glu Lys Phe Gly Val Lys Val Arg

420 425 430

Ser Lys Asn Val Lys Glu Ala Ile Glu Cys Ile Met Leu Glu Gly Lys

435 440 445

Glu Gly Gln Glu Arg Arg Lys Arg Ala Arg Glu Leu Ala Lys Glu Ala

450 455 460

Val Arg Ala Val Glu Glu Gly Gly Ser Ser His Leu Asn Ile Thr Leu

465 470 475 480

Leu Ile Glu Asp Ile Met

485

<210> 3

<211> 497

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 3

Met Ala Ser Ser Ser Ser Ser Gln Leu Gln Gln Leu His Phe Val Leu

1 5 10 15

Ile Pro Leu Met Ser Pro Gly His Leu Met Pro Ile Val Asp Met Ala

20 25 30

Arg Leu Phe Ala Gln His Gly Val Ile Val Thr Ile Val Ser Thr Pro

35 40 45

Leu Asn Thr Lys Arg Phe Lys Thr Ile Val Asp Arg Ala Ile Asp Ser

50 55 60

Gly Leu Gln Ile Arg Ile Ile Asp Leu Tyr Phe Pro Ala Ala Glu Ala

65 70 75 80

Cys Leu Pro Arg Gly Cys Glu Asn Met Asp Ser Ile Ser Arg Asn Leu

85 90 95

Ile Lys Asn Phe Phe Met Ala Ser Ser Met Leu Gln Gln Pro Phe Asp

100 105 110

Gln Leu Phe Asp Gln Leu Ser Pro Arg Pro Ser Cys Ile Ile Ser Gly

115 120 125

Lys Asn Gln Ala Trp Thr Val Glu Thr Ala Arg Lys Phe Asn Ile Pro

130 135 140

Arg Leu Phe Phe Asp Gly Met Gly Cys Phe Ser Phe Ser Cys Thr His

145 150 155 160

Asn Leu Lys Met Ser Glu Glu Phe Gln Arg Val Thr Ser Lys Phe Glu

165 170 175

Thr Phe Leu Val Pro Gly Leu Pro His Glu Ile Glu Leu Thr Lys Ala

180 185 190

Gln Leu Pro Glu Ser Leu Asn Pro Gly Gly Ser Gly Asp Leu Ile Asp

195 200 205

Val Arg Asn Lys Met Thr Ala Ala Glu Ser Ile Ala Asp Gly Ile Ile

210 215 220

Val Asn Ser Phe Glu Glu Leu Glu Pro Glu Tyr Val Glu Met Tyr Thr

225 230 235 240

Lys Val Lys Gly Gly Asn Ile Trp Cys Ile Gly Pro Val Ser Ala Ser

245 250 255

Asn Lys Leu Ile Leu Asp Lys Ala Glu Arg Gly Ser Phe Ala Pro Thr

260 265 270

Glu Asn Glu Ile Gln Cys Leu Glu Trp Leu Asp Leu Gln Glu Pro Asn

275 280 285

Ser Val Val Tyr Ala Cys Leu Gly Ser Ile Ser Gly Leu Thr Ala Ser

290 295 300

Gln Leu Val Glu Leu Gly Leu Gly Leu Glu Ala Ser Lys Arg Pro Phe

305 310 315 320

Ile Trp Val Ile Arg Gly Gly Glu Arg Ser Lys Glu Leu Glu Arg Trp

325 330 335

Ile Lys Gln Glu Arg Phe Glu Glu Arg Thr Lys Gly Arg Gly Leu Leu

340 345 350

Val Arg Gly Trp Ala Pro Gln Leu Leu Ile Leu Ser His Ser Ser Thr

355 360 365

Gly Gly Phe Leu Thr His Cys Gly Trp Asn Ser Thr Leu Glu Gly Val

370 375 380

Ser Ala Gly Lys Pro Ile Ile Ala Cys Pro Leu Phe Ala Glu Gln Phe

385 390 395 400

Tyr Asn Glu Lys Leu Val Val Lys Val Leu Gly Thr Gly Ala Ser Val

405 410 415

Gly Val Glu Ala Ala Val Thr Trp Gly Met Glu Asp Gln Phe Gly Leu

420 425 430

Val Met Lys Arg Glu Asn Val Glu Lys Ala Ile Gln Glu Val Met Asp

435 440 445

Lys Gly Val Glu Ala Glu Glu Arg Arg Lys Arg Ala Arg Glu Phe Gly

450 455 460

Asp Met Ala Lys Arg Ala Ile Glu Glu Gly Gly Ser Ser Tyr Leu Asn

465 470 475 480

Ile Arg Ser Leu Ile Gln His Val Lys Glu Lys Asn Glu Leu Lys His

485 490 495

Ala

<210> 4

<211> 498

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 4

Met Ser Gln Ser Pro Ala Met Ser Lys Met Gln Asn Gln Leu His Phe

1 5 10 15

Val Leu Val Pro Leu Leu Ala Gln Gly His Met Ile Pro Met Ile Asp

20 25 30

Met Ala Arg Leu Leu Ala Gln His Gly Val Val Val Ser Leu Val Thr

35 40 45

Thr Pro His Asn Ala Ser Arg Phe Ala Ser Thr Ile His Arg Ala Arg

50 55 60

Asp Ser Gly Leu Lys Ile Gln Leu Ile Gln Ile Pro Phe Pro Cys Gln

65 70 75 80

Glu Val Gly Leu Pro Pro Gly Cys Glu Asn Leu Asp Ser Val Pro Ser

85 90 95

Arg Asp Leu Ile Gly Asn Phe Phe Ser Ala Leu Asn Lys Leu Gln Gln

100 105 110

Pro Leu Glu Gln His Leu Gln Glu Leu Met Pro Pro Pro Ser Cys Ile

115 120 125

Ile Ser Asp Lys Tyr Leu Ser Trp Thr Thr Lys Thr Ala Glu Lys Ile

130 135 140

His Val Pro Arg Leu Val Phe His Gly Met Cys Cys Phe Ser Leu Leu

145 150 155 160

Ser Ser His Asn Ile Arg Leu Tyr Asn Ala His Leu Ser Val Thr Ser

165 170 175

Asp Ser Gln Pro Phe Val Val Pro Gly Met Pro Gln Arg Val Glu Ile

180 185 190

Thr Lys Ala Gln Leu Pro Gly Ala Phe Val Thr Leu Pro Gly Leu Asp

195 200 205

Asp Ile Arg Asp Gln Met Arg Glu Ala Glu Ser Ser Ala Tyr Gly Val

210 215 220

Val Val Asn Ser Phe Ser Glu Leu Glu Gln Gly Cys Ser Glu Glu Tyr

225 230 235 240

Lys Lys Ala Ile Ala Lys Lys Val Trp Cys Ile Gly Pro Val Ser Leu

245 250 255

Cys Asn Lys Asp Asn Leu Asp Lys Phe Glu Arg Gly Asn Lys Ala Ser

260 265 270

Ile Asp Glu Thr Leu Cys Thr Glu Trp Leu Asp Ser Met Lys Pro Lys

275 280 285

Ser Val Ile Tyr Ala Cys Leu Gly Ser Gln Cys Arg Leu Val Pro Ala

290 295 300

Gln Leu Met Glu Leu Gly Leu Ala Leu Glu Ser Ser Lys His Pro Phe

305 310 315 320

Ile Trp Val Ile Lys Glu Gly Glu Arg Phe Gln Glu Leu Glu Lys Trp

325 330 335

Leu Val Glu Glu Glu Phe Glu Glu Arg Ile Lys Arg Arg Gly Leu Leu

340 345 350

Ile Lys Gly Trp Ala Pro Gln Val Leu Ile Leu Ser His Pro Ala Ile

355 360 365

Lys Ala Phe Leu Thr His Cys Gly Trp Asn Ser Thr Ile Glu Gly Val

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Cys Ser Gly Val Pro Met Ile Thr Trp Pro Met Phe Ala Glu Gln Phe

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Phe Asn Glu Lys Leu Ile Val Asp Ile Leu Arg Ile Gly Ile Lys Val

405 410 415

Gly Val Gln Val Ser Val Arg Trp Gly Glu Glu Glu Lys Ile Gly Val

420 425 430

Leu Val Lys Arg Glu Gln Ile Gln Lys Ala Ile Glu Thr Ile Met Asn

435 440 445

Gly Gly Gly Glu Glu Gly Gly Ile Arg Lys Arg Ala Thr Lys Leu Ser

450 455 460

Lys Val Gly Ala Arg Ala Met Glu Asp Gly Gly Ser Ser His Phe Asn

465 470 475 480

Ile Ser Leu Leu Ile Gln Asp Ile Trp Lys Gln Lys Asn Asn Gln Glu

485 490 495

Lys Leu

<210> 5

<211> 1476

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

atgtccaaaa tgcaaaacca gcttcacttt gtgctagtac cattactggc tcaaggccac 60

atgatcccaa tgatagacat ggccagacta ctcgcgcaac atggcgtcgt agtaagcttg 120

gtcaccaccc ctcacaacgc ctccagattc gcctcaacaa ttcaccgcgc aagagattct 180

gggcttaaaa ttcaactcat acaaattcca ttcccctggc aagaagtagg gcttccacca 240

ggatgtgaaa atctcgacag cctgccttcc cgagacctta taggaaactt ttttagtgct 300

cttaataaat tacaacagcc tctagaacag cacctgcaag aactaatgcc ccctccaaac 360

tgcataatct cggacaagta cctttcgtgg acaacaaaaa cagcccaaaa attccatgtt 420

ccaagattag tttttcatgg gatgtgctgt ttttcactac taagttccca taatataagg 480

ctttataatg ctcacttatc tgtcacttca gactcccaac cttttgtggt gccaggaatg 540

ccccaaaggg ttgaaataac caaagcccag ctaccaggag catttgttac attgccagat 600

ttggatgata ttcgtgatca aatgcgcgag gccgaatcaa gcgcttatgg ggttgtggtg 660

aacagcttca gtgagcttga gcaggggtgt tccgaagagt acaaaaaggc cattgcgaaa 720

aaagtttggt gcattggacc ggtttctcta tgtaacaagg ataatttaga caaatttgag 780

agaggaaaca aagcttcaat cgatgagaca cactgcaccg aatggcttga ttcaatgaaa 840

ccgaaatctg taatctacgc ttgtttgggt agccaatgca ggcttgtacc agcacaactt 900

atggaacttg ggttggcatt agaatcatca aaacatccat ttatttgggt gattaaagaa 960

ggggaaaggt ttcaagaatt ggagaagtgg ttagtagagg aggaatttga agagagaatc 1020

aaaaggaggg ggcttttgat caaggggtgg gctccacaag ttctcattct ttctcacccg 1080

gcaatcaagg cttttttaac tcattgcggg tggaattcaa ccattgaagg agtttgctct 1140

ggtgtgccaa tgataacatg gccgatgttt gctgagcaat ttttcaatga aaaattaata 1200

gttgatattt taaggattgg gatcaaagtc ggggttcaag tctctgttag atggggagaa 1260

gaagaaaaga ttggagtttt ggttaagagg gagcaaattc agaaagctat agaaacaata 1320

atgaatgggg gaggagaaga aggaggtata agaaagaggg cgacaaagct ttcaaaagtt 1380

ggcgcaaggg caatggaaga tggagggtcc tctcatttca acatatcact gttgattcaa 1440

gatatctgga aacagaagaa caatcaagaa aagttg 1476

<210> 6

<211> 1458

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

atggattcac cgtcagacca gcttcacatt gttatgatac ccttaatgtg cccaggccac 60

cttattccca tggtggacat ggccaaattg ctagcacaac gtgccgtgac cgtcaccatt 120

gtcgccacac cccgtaatgc catccgtttc ggtgcagtca tcggacgtgc catcgaatct 180

ggcctgccga ttcgactcct cgaagtccgt tttccggcct tggaggccgg cttgccggag 240

ggatgcgaaa gcgtggacga tttaccctct ttggctatgt ctataaattt ttttgctgca 300

accaaaatgc tacaagagcc ggtggaaaaa atgttaaaag atataaagcc tagtccaagc 360

tgcatactat ctgacaagca tgttttctgg acgtctgata ctgccaaaaa actccaaatt 420

ccgtggatta tgtttgatgg aatgagttgc ttcacgcaat tatgtacgga aaatatatac 480

aattccaagg tgcacgaaag tgtgtcgtcc gagtcagagt cctttgttgt gcgtggtctg 540

cctgatcata tcgagttcac taaagcccag ctgcccggat tattcaatcc ggggtcagta 600

cctgcgattg atgagatccg tgaacaggta agagctactg aagtaggagc atatggggtt 660

gtgattaata gttttgagga gttggaacaa gattatgttg atgaatttaa aaaagtccga 720

agagataaag tttggtgtgt tggtccgtta tcactcaaca acgagaacat gttggacaag 780

gctcagagag gacataataa tgcgtcgatt gatggaaaca agtgcttaca atggcttgac 840

aattgggcaa atggctccgt catttatgcc tgccttggaa gcataagcag ccttacttgt 900

acacaactca tggagcttgc tctgggctta gaagcatcgg aacgtccgtt tgtatgggtg 960

gtaagggcag ggggcaaaca aaaagagatc gagaaatgga tattggaaga gggattcgag 1020

gaaagtacga aagggagagg gcttttgatc cggggttggg cgccacaagt gcttatattg 1080

tcacaccctg caattggagg attcgtaacg cattgtggtt ggaattcgac tattgaaggg 1140

atttgtagcg gcgttcccat gatcacttgg cctttgtttg ccgagcaatt tttcaatgag 1200

aagttggtag tgcaggtact tgagactggc gtgagtgttg gggctaaaga agttatgcct 1260

ttgggtgagg aagagaagtt cggggtgaaa gtgaggagta agaatgtgaa agaggctata 1320

gagtgcataa tgcttgaagg aaaagaaggt caagagagaa gaaaaagagc tagggagctt 1380

gcaaaagagg ctgtcagggc agttgaagag ggaggatctt ctcaccttaa tatcactctt 1440

ttaattgagg acattatg 1458

<210> 7

<211> 1494

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

atggcctcct cctcctcctc acagcttcaa cagctccact ttgttctcat acccctaatg 60

tcccctggcc accttatgcc tattgtagac atggccagat tatttgccca acatggagtc 120

attgtcacaa tagtcagtac tcccctcaac actaaaagat tcaaaactat tgtggatcgc 180

gcaattgatt caggccttca aatccgaatt attgaccttt attttcctgc agctgaagcc 240

tgtttgcctc ggggatgcga aaacatggat tccatttcac ggaatttgat caagaatttc 300

tttatggcat ctagcatgtt acaacaacca tttgaccaac tatttgatca actaagcccc 360

cgcccgagct gcataatttc gggcaaaaat caagcatgga cagttgagac tgcccggaag 420

tttaacattc caagactttt tttcgatggg atgggctgtt tttctttttc atgtacacat 480

aatttaaaga tgtccgagga atttcagcgt gtcacctcca aatttgagac ctttttggtg 540

cctggtttgc cacatgaaat tgagttgact aaagcccagc taccggagtc tctgaatcca 600

ggcgggtcag gagatctgat tgatgttcgt aacaagatga ccgcagccga gtcgatagcg 660

gatgggatta tagtcaattc attcgaggaa ttagaacccg aatatgtgga aatgtataca 720

aaggtgaaag gtggtaacat ttggtgcatt ggccctgttt cggcttctaa caagttgatc 780

ttggacaagg ctgaaagagg cagtttcgcc cctacagaaa atgagattca atgcttggag 840

tggcttgatt tacaagagcc aaactcagtt gtttatgctt gtttaggcag catcagtggc 900

ctaacagctt cacaactcgt ggagctcggg ttaggcttgg aagcatcaaa aaggccgttt 960

atttgggtga taagaggagg ggagagatca aaagagctgg agagatggat taaacaagag 1020

cgattcgaag agaggactaa agggagggga cttttggtac gaggctgggc gcctcagtta 1080

ctaatcctgt cccattcgtc caccggaggc ttcttaacgc actgcggttg gaattcaacg 1140

ctcgaaggtg tgtccgcggg taagcccata attgcttgtc ctttgtttgc cgagcaattt 1200

tataatgaga agttggtggt caaagtattg ggaactgggg cgagtgtggg agttgaggct 1260

gctgtgacat ggggaatgga agatcagttt gggttggtaa tgaagagaga gaatgtagaa 1320

aaggcaatac aagaggtaat ggataaagga gtagaagcag aagaaagaag aaaaagagca 1380

agagagtttg gggatatggc aaaaagggcg atagaagaag gaggatcttc ttaccttaac 1440

attagaagtt taatccaaca tgtcaaggaa aagaatgaac ttaagcatgc atga 1494

<210> 8

<211> 1494

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

atgtcccaaa gtccagcaat gtccaaaatg caaaaccagc ttcactttgt gctagtccca 60

ttactggctc aaggccacat gatcccaatg atagacatgg ccaggctact cgcgcaacat 120

ggcgtcgtag taagcttggt caccacccct cacaacgcct ccagattcgc ctcaacaatt 180

caccgcgcaa gagattctgg gcttaaaatt caactcatac aaattccatt cccctgccaa 240

gaagtagggc ttccaccagg atgtgaaaat ctcgacagcg tgccttcccg agaccttata 300

ggaaactttt ttagtgctct taataaatta caacagcctc tagaacagca cctgcaagaa 360

ctaatgcccc ctccaagctg cataatctcg gacaagtacc tttcgtggac aacaaaaaca 420

gccgaaaaaa tccatgttcc aagattagtt tttcatggga tgtgctgttt ttcactacta 480

agttcccata atataaggct ttataatgcc cacttatctg tcacttcaga ctcccaacct 540

tttgtggtgc caggaatgcc ccaaagggtt gaaataacca aagcccagct accaggagca 600

tttgttacat tgccaggttt ggatgatatt cgtgatcaaa tgcgcgaggc cgaatcaagc 660

gcttatgggg ttgtggtgaa cagcttcagt gagcttgagc aggggtgttc cgaagagtac 720

aaaaaggcca ttgcgaaaaa agtttggtgc attggaccag tttctctatg taacaaggat 780

aatttagaca aatttgagag aggaaacaaa gcttcaatcg atgagacact ctgcaccgaa 840

tggcttgatt caatgaaacc gaaatctgta atctacgctt gtttgggtag ccaatgcagg 900

cttgtaccag cacaacttat ggaacttggg ttggcattag aatcatcaaa acatccattt 960

atttgggtga ttaaagaagg ggaaaggttt caagaattgg agaagtggtt agtagaggag 1020

gaatttgaag agagaatcaa aaggaggggg cttctgatca aggggtgggc tccacaagtt 1080

ctcattcttt ctcacccggc aatcaaggct tttttaactc attgcgggtg gaattcaacc 1140

attgaaggag tttgctctgg tgtgccaatg ataacatggc cgatgtttgc tgagcaattt 1200

ttcaatgaaa aattaatagt tgatatttta aggattggga tcaaagttgg ggttcaggtc 1260

tctgttagat ggggagaaga agaaaagatt ggagtcttgg ttaaaaggga gcaaattcag 1320

aaagctatag aaacaataat gaatggggga ggagaagaag gaggtataag aaagagggcg 1380

acaaagcttt caaaagttgg cgcaagggca atggaagatg gagggtcctc tcatttcaac 1440

atatcactct tgattcaaga tatctggaaa cagaagaaca atcaagaaaa gtta 1494

Claims

1.齐墩果酸葡糖醛酸转移酶，其特征在于，所述齐墩果酸葡糖醛酸转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.编码权利要求1所述齐墩果酸葡糖醛酸转移酶的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因的编码序列是SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列。

4.含有权利要求2或3所示的基因的重组载体。

5.一种用权利要求4所述重组载体转化得到的重组基因工程菌。

6.权利要求1所述的齐墩果酸葡糖醛酸转移酶在合成齐墩果烷型皂苷中的应用，其特征在于，以齐墩果酸葡糖醛酸转移酶为催化剂，以尿苷二磷酸葡糖醛酸为底物催化齐墩果酸生成齐墩果酸3-O-β-葡糖醛酸。