KR102052557B1 - Ddmp 사포닌의 생합성에 관여하는 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

Ddmp 사포닌의 생합성에 관여하는 유전자 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 Glyma.16G033700 유전자를 포함하는 DDMP(2,3-dihydro-2,5-dihydroxy- 6-methyl-4H-pyran-4-one) 사포닌 생합성 촉진용 조성물에 관한 것으로, DDMP 사포닌이 결핍된 돌연변이체를 분리하여 분석한 결과, 상기 Glyma.16G033700 유전자에 점돌연변이가 발생한 것을 확인하였는바, 상기 유전자는 UGT73B4(Uridine diphosphate-glycosyltransferase 73B4) 효소를 암호화 하여 콩에서 DDMP 사포닌을 생합성하며, 이를 포함하는 재조합 벡터를 두과작물에 도입하여 과발현시킬 경우, DDMP 사포닌의 생합성을 증가시켜 DDMP 사포닌이 축적된 식물체를 얻을 수 있을 것으로 기대된다.

Description

DDMP 사포닌의 생합성에 관여하는 유전자 및 이의 용도{Gene involved in the biosynthesis of DDMP saponin and use thereof}
본 발명은 콩에서 DDMP(2,3-dihydro-2,5-dihydroxy- 6-methyl-4H-pyran-4-one) 사포닌의 생합성에 관여하는 Glyma.16G033700 유전자, 이를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 미생물, 및 상기 재조합 벡터를 이용하여 DDMP 사포닌을 생합성 하는 방법 등에 관한 것이다.
사포닌은 식물계에 널리 분포되어있는 자연적으로 발생하는 식물 화학 물질로, 이들은 하나 이상의 당 사슬을 가진 steroid 또는 triterpenoid aglycone을 함유한 구조에 따라 steroidal 및 triterpenoid 사포닌으로 분류된다(Guclu-Ustundag and Mazza, 2007). Steroidal 사포닌은 주로 자엽 식물(예: Agavaceae, Liliaceae 및 Dioscoreaceae)에서 발견되며 triterpenoid 사포닌은 주로 쌍자엽 식물(Leguminosae, Araliaceae 및 Caryophyllaceae)에서 발견된다.
Steroid와 triterpenoid 사포닌의 생합성은 mevalonic pathway를 통해 이루어지며, oxidosqualene cylases(OSCs), cytochrome P450- dependent monooxygenases(P450s) 및 UDP-dependent glycosyltransferases (UGTs)의 3 가지 다중 유전자 군의 효소가 사포닌 생합성에서 중요한 역할을 한다(도 1 참조).
구체적으로, triterpenoid aglycone은 30-carbon linear 2,3-oxidosqualene 전구체로부터 유도되며, 생합성의 첫 번째 단계에서, 2,3-oxidosqualene은 OSC에 의해 다환성 triterpene으로 고리화된다. 그 다음, 다환성 tripenoid backbone은 사포게닌(sapogenin)이라고 불리는 소수성 아글리콘(aglycone)을 생성하기 위해 P450s에 의해 산화되며, 최종 단계는 UGT, acyltransferase, malonyltransferase 및 malonyltransferase를 포함하는 transferase의 배열에 의한 O- 글리코실화를 통하여 사포닌 합성에 관여한다.
한편, 사포닌의 축적은 장기 및/또는 조직 특이적 방식으로 발생한다. 두과 식물인 Medipago truncatula 및 인삼(Panax ginseng)에서 사포닌은 지상부 보다는 뿌리에서 풍부하게 발견되었으며, 사포닌은 잎, 괴경, 뿌리혹, 꽃과 과일, 씨앗과 같은 다른 기관에도 축적된다.
콩 종자에는 이소플라본, 레시틴, 사포닌과 같은 단백질, 지방 및 활성 이차 대사 산물이 풍부하다. 콩 종자는 일반적으로 약 0.5 %의 사포닌을 함유하고 있지만, 이 값은 재배 품종, 성숙 정도 및 재배 위치에 따라 크게 다를 수 있으며, 대두에서는 특히 배축에 사포닌 함량이 풍부하다. 금잔화(Calendula officinalis)에서 oleanolic acid glycoside 사포닌은 세포질에서 합성되어 액포막을 통해 수송되고 마지막에는 액포에 축적되는 것으로 보고된 바 있으나, 대두에서 사포닌 생합성의 위치는 여전히 알려져 있지 않다.
대두 사포닌은 주로 당 사슬에 따라 그룹 A 및 2,3-디하이드로-2,5-디하이드록시-6-메틸-4H-피란-4-온(2,3-dihydro-2,5-dihydroxy- 6-methyl-4H-pyran-4-one; DDMP) 사포닌으로 각각 불리는 비스데스모사이드(bisdesmoside) 사포닌 및 모노데스모사이드(monodesmoside) 사포닌으로 분류된다. DDMP는 Maillard 반응에서, 가열된 단당류(과당 또는 포도당)의 부산물 중 하나인 당 부분 중 하나이다. 그룹 A 사포닌은 soyasapogenol A(SS-A; 3β, 21β, 22β, 24-tetrahydroxyolean-12-ene)로 알려진 triterpenoid aglycone의 C-3 및 C-22 하이드록실 그룹에 두 개의 당 사슬을 포함하고 있다. DDMP 사포닌은 C-22 위치에 DDMP 부분을 포함하고 있으며, aglycone의 C-3 수산기 위치에 있는 단일 당 사슬은 soyasapogenol B(SS-B; 3β, 22β, 24-trihydroxyolean-12-ene)로 알려져 있다(도 2 참조). 대두 사포닌의 생합성 경로에서 β-amyrin에서 C-22의 수산화에 의해 SS-B가 생합성되지만 SS-B의 C-21 위치의 추가적인 수산화를 통해 SS-A가 생합성된다. 식품 가공과 사포닌 추출 과정에서, 불안정한 DDMP 사포닌은 가수 분해와 연속적인 수산화 및 광산화 때문에 그룹 B 및 그룹 E 사포닌으로 각각 분해된다(도 3 및 표 1 참조).
하기 표 1에서 * 표시한 것은 본 발명에서 분석된 사포닌이다.
Figure 112018044571903-pat00001
콩 식품의 불쾌한 맛과 쓴 맛은 대두 종자에서 아세틸화된 그룹 A 사포닌의 존재에 기인하며, 이에 비해 그룹 B 및 DDMP 사포닌은 덜 쓰며 인간 건강에 더 유익하다. DDMP 사포닌은 라디칼(radical) 제거 및 항돌연변이 활성을 나타내는 것으로 보고된 바 있으며, 그룹 B 사포닌은 in vitro에서 HIV 감염에 대한 억제 효과를 나타내었고 결장암의 증식과 종양의 증식을 예방한다고 알려져 있다. 대두 사포닌의 다양한 건강상의 이점으로 인해 사포닌 성분 및 함량의 변화가 필요하며 이를 위해 여러 연구들은 사포닌 생합성에 관여하는 유전자의 동정에 초점을 맞추고 있다.
이와 관련하여, 최근 CYP72A69 효소를 암호화하는 hydroxylase 유전자인 Sg -5가 대두에서 알려졌으며, 지금까지 대두 사포닌의 당 부분의 다양성과 관련된 6개의 UGT, 즉 Sg -1a, Sg -1b, Sg -3, Sg -4, GmSGT2 및 GmSGT3가 확인되었다. 그러나, 사포닌 생합성과 관련된 대부분의 단계는 분자 수준에서, 특히 DDMP 사포닌 생산과 관련된 단계에서는 아직 밝혀지지 않았다.
본 발명자들은 DDMP 사포닌이 결핍된 ethyl methanesulfonate(EMS) 유도 돌연변이체, 'PE2248' 및 'PE2371'를 분리 및 동정한 결과, 상기 돌연변이체들의 Glyma.16G033700 유전자에 점돌연변이가 발생한 것을 확인하여, 상기 유전자가 UGT73B4(Uridine diphosphate-glycosyltransferase 73B4) 효소를 암호화하고 DDMP 사포닌의 생합성에 관여한다는 것을 밝혀냄으로써 본 발명을 완성하였다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 Glyma.16G033700 유전자를 포함하는 DDMP(2,3-dihydro-2,5-dihydroxy- 6-methyl-4H-pyran-4-one) 사포닌 생합성 촉진용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 Glyma.16G033700 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 두과 작물에 도입하는 단계를 포함하는 DDMP(2,3-dihydro-2,5-dihydroxy- 6-methyl-4H-pyran-4-one) 사포닌 생합성을 증가시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 DDMP(2,3-dihydro-2,5-dihydroxy- 6-methyl-4H-pyran-4-one) 사포닌 생합성을 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 일구현예로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 유전자는 콩으로부터 분리될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 유전자는 UGT73B4(Uridine diphosphate-glycosyltransferase 73B4)를 암호화할 수 있다.
본 발명에 따른 DDMP(2,3-dihydro-2,5-dihydroxy- 6-methyl-4H-pyran-4-one) 사포닌 생합성 촉진용 조성물은 Glyma.16G033700 유전자를 포함하며, DDMP 사포닌이 결핍된 돌연변이체를 분리하여 분석한 결과, 상기 Glyma.16G033700 유전자에 점돌연변이가 발생한 것을 확인하였는바, 상기 유전자는 UGT73B4(Uridine diphosphate-glycosyltransferase 73B4) 효소를 암호화 하여 콩에서 DDMP 사포닌을 생합성하며, 이를 포함하는 재조합 벡터를 두과작물에 도입하여 과발현 시킬 경우, DDMP 사포닌의 생합성을 증가시켜 DDMP 사포닌이 축적된 식물체를 얻을 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 대두에서 triterpenoid 사포닌의 일반적인 생합성 경로를 나타낸 도면이다.
도 2는 대두에서 그룹 A 및 DDMP triterpenoid 사포닌의 화학 구조식을 나타낸 도면이다.
도 3은 대두에서 triterpenoid 사포닌의 화학 구조식을 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 일구현예에 따른 Uram, 풍산나물, PE2248, 및 PE2371로 박층 크로마토그래피(TLC) 분석을 실시한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5a는 본 발명의 일구현예에 따른 풍산나물 종자 배축에서의 사포닌 성분을 나타낸 도면이다.
도 5b는 본 발명의 일구현예에 따른 풍산나물 종자 배축에서의 사포닌 함량을 나타낸 도면이다.
도 6a는 본 발명의 일구현예에 따른 풍산나물 종자 자엽에서의 사포닌 성분을 나타낸 도면이다.
도 6b는 본 발명의 일구현예에 따른 풍산나물 종자 자엽에서의 사포닌 함량을 나타낸 도면이다.
도 7은 본 발명의 일구현예에 따른 두 돌연변이체 PE2248와 PE2371를 교배하여 대립성 검사(allelism test)를 수행한 결과를 나타낸 도면이다.
도 8은 본 발명의 일구현예에 따른 DDMP 사포닌의 생합성에 관여하는 유전자 Glyma.16g033700(Sg-9)의 유전자 자리를 physical mapping 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 9a는 본 발명의 일구현예에 따른 Glyma .16g033700(Sg -9) 유전자의 구조를 나타낸 도면이다
도 9b 및 9c는 본 발명의 일구현예에 따른 Sg-9 단백질의 다중 정렬 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 10은 본 발명의 일구현예에 따른 대두에서 UGT73B4 subfamily 유전자의 다양성을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 11은 본 발명의 일구현예에 따른 풍산나물과 돌연변이체 PE2248 및 PE2371에서 Sg -9 유전자의 발현 수준을 RT-PCR로 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 12는 본 발명의 일구현예에 따른 '풍산나물' 및 'Williams 82'에서 조직 특이적 Sg -9 유전자의 발현 수준을 qRT-PCR로 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 13은 본 발명의 일구현예에 따른 호르몬 조절에 의한 Sg -9 유전자 발현 수준을 qRT-PCR로 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 14a 및 14b는 본 발명의 일구현예에 따른 Sg -9 유전자의 동일 분리(co-segregation) 패턴을 확인하기 위해 dCAPS 분석을 수행한 결과를 나타낸 도면이다.
도 15는 대두에서 Soyasapogenol-DDMP 및 Soyasapogenol-A의 예상 생합성 경로를 나타낸 도면이다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 하기에서 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 Glyma.16G033700(Sg-9)유전자를 포함하는 DDMP(2,3-dihydro-2,5-dihydroxy- 6-methyl-4H-pyran-4-one) 사포닌 생합성 촉진용 조성물을 제공한다.
이 때, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어지고 콩에서 분리될 수 있으며 UGT73B4(Uridine diphosphate-glycosyltransferase 73B4)를 암호화할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 Glyma.16G033700(Sg -9) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
이 때, 상기 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호화된 단백질을 발현하는 것을 지칭하는 것이다. 상기 벡터로 형질전환된 재조합 세포는 상기 세포의 자연 형태에서는 발현되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 자연 상태의 세포에서 발현되는 유전자를 발현할 수 있으나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
상기 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭하는 것으로, 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용될 수 있다. "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.
또한, 본 발명은 상기 DDMP(2,3-dihydro-2,5-dihydroxy- 6-methyl-4H-pyran-4-one) 사포닌 생합성을 증가시키는 방법으로, 상기 서열번호 1로 표시되는 유전자를 과발현 시키는 단계를 포함하며, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 두과 작물에 도입하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일실험예에서는 DDMP 사포닌이 결핍된 돌연변이체를 분리하고 사포닌 함량을 확인하였다(실험예 1 참조).
본 발명의 다른 실험예에서는 DDMP 사포닌이 결핍된 새로운 돌연변이체의 유전을 확인하였다(실험예 2 참조).
본 발명의 또 다른 실험예에서는 sg -9 돌연변이체 대립유전자에 대한 대립성 검사(allelism test)를 실시하였다(실험예 3 참조).
본 발명의 또 다른 실험예에서는 DDMP 사포닌의 존재를 제어하는 Sg -9 유전자 자리의 physical mapping을 통해 Sg -9 유전자의 위치를 확인하였다(실험예 4 참조).
본 발명의 또 다른 실험예에서는 sg -9a 및 sg -9b 대립유전자의 분자적 분석을 실시하였다(실험예 5 참조).
본 발명의 또 다른 실험예에서는 콩에서 UGT73B4 subfamily 유전자의 다양성을 확인하였다(실험예 6 참조).
본 발명의 또 다른 실험예에서는 Sg -9 유전자 발현의 조직 특이적 조절을 확인하였다(실험예 7 참조).
본 발명의 또 다른 실험예에서는 호르몬 조절에 의한 Sg -9 유전자 발현을 확인하였다(실험예 8 참조).
본 발명의 또 다른 실험예에서는 돌연변이체와 DDMP 사포닌 표현형의 동일 분리(co-segregation)를 실시하였다(실험예 9 참조).
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 실험예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예 및 실험예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 식물 재료 준비
DDMP 사포닌이 결핍된 0.3% EMS 유도 돌연변이체 ('PE2248' 및 'PE2371')를 대두 품종 '풍산나물(Pungsannamul)' 개체로부터 분리하였다. 분리 분석을 수행하기 위해 대두 품종 '풍산나물'과 상기 두 개의 돌연변이체 라인을 교배시켰다. DDMP-사포닌 생합성에 관여하는 유전자를 분리하고 동정하기 위해 'PE2248' 및 'PE2371'와 함께 'Uram'의 교배로부터 얻은 분리한 개체군을 이용하여 physical mapping을 수행하였다. 또한, 대립성 검사를 수행하기 위해 두 돌연변이체 라인을 교배시켰다. 모든 실험 개체군은 경북대학교(Gunwi, 36 ° 07'N, 128 ° 38'E, 대한민국)의 실험 필드에서 재배되었다.
실시예 2. 사포닌 추출 및 EMS 돌연변이체 라인의 박층 크로마토그래피(TLC) 분석 방법
상기 실시예 1의 각각의 돌연변이체로부터 성숙한 건조 종자의 배축에서 사포닌을 추출 하였다. 사포닌 추출은 실온에서 80% (v/v) 메탄올 (수성)의 10 배 부피 (v/w)에서 24 시간 동안 수행하였다. 추출물을 TLC 분석에 직접 사용하거나 4 ℃에서 보관 하였다. TLC는 Krishnamurthy et al. (2012 년)에 기재된 방법을 약간 수정하여 수행하였다. 즉, 각 샘플의 사포닌 추출물 5 ㎕를 마이크로 피펫을 사용하여 pre-silica gel plate(TLC 실리카겔 60 F254, Merck, Darmstadt, Germany)에 직접 넣고 건조시켰다. 건조된 plate를 developing chamber에서 develop시키고, 이를 클로로포름 : 메탄올 : 물 (65:35:10, v/v/v)의 lower phase로 포화시키고 50분 동안 혼합하였다. 플레이트를 90 ℃에서 5 분 동안 건조시킨 다음, H2SO4로 8 분 동안 밀폐된 chamber에서 develop시켰다. 그 후, 100 ~ 110 ℃에서 10 분간 가열함으로써 사포닌을 시각화 시켰다.
SS-A 및 SS-B를 검출하기 위해 사포닌의 가수 분해를 Takada et al.(2013)에 기재된 방법을 약간 수정하여 진행하였다. 즉, 각 시료의 사포닌 추출물 110 ㎕에 12N HCl 10 ㎕를 첨가하고 85℃에서 2 시간 동안 가수 분해를 하였다. 그 후 240㎕의 diethyl ether와 120㎕의 ddH2O를 첨가하고 7000 rpm에서 5 분간 원심분리 하고 상등액을 새로운 튜브로 옮긴 다음 질소 증발에 의해 증발 건조시켰다. 잔류 물을 에탄올 30㎕에 용해시키고, 마이크로 피펫을 사용하여 pre-silica gel plate(TLC 실리카겔 60 F254, Merck, Darmstadt, Germany)에 직접 놓은 후 건조시켰다. 건조된 plate를 developing chamber에서 develop시키고, 이를 클로로포름 : 메탄올 : 물 (65:35:10, v/v/v)의 저상으로 포화시키고 30 분 동안 혼합 하였다. 플레이트를 90℃에서 5 분 동안 건조시킨 다음, H2SO4로 8 분 동안 밀폐된 chamber에서 develop시켰다. 그 후, 100 ~ 110℃에서 10 분간 가열함으로써 사포닌을 시각화 시켰다.
실시예 3. LC -PDA/MS/MS 분석 방법
상기 실시예 1의 'PE2248' 및 'PE2371'에서 사포닌의 상세한 조성을 얻기 위해, C30 역상 column상의 LC-PDA/MS/MS를 Takada et al.(2013)에 따라 수행하였다.
구체적으로, 80% 수성 메탄올(v/v)의 50배 및 7.5배(v/w) 용액의 10 및 20㎕를 각각 첨가하여 각 돌연변이체의 배축 및 자엽으로부터 사포닌을 추출하였다. Xcalibur 소프트웨어 버전 3.1 (Thermo Fisher, Santa Clara, CA, USA)을 사용하여 UV 및 MS 스펙트럼을 분석 하였다.
실시예 4. Sg -9 유전자 자리의 physical mapping 및 Sg -9 유전자의 서열 분석 방법
게놈 DNA를 CTAB 추출 방법(Doyle, 1987)을 사용하여 삼출엽(trifoliate leaves)에서 분리 하였다. 그룹 A 사포닌 돌연변이에 관련있는 유전자 자리를 식별하기 위해 'Uram'과 'PE2248' 사이, 및 'Uram'과 'PE2371' 사이의 교배로부터 Affymetrix 180K Axiom® SNP array를 사용하여 physical map을 구성하였다. 돌연변이 표현형을 가진 총 29개의 F2 개체 각각은 physical map 구성을 위해 F3 개체의 표현형 후 선별 하였다. Sg -9 유전자 자리는 Microsoft Excel software를 통해 F2 개체에서 재조합체의 검출에 의해 표시되었다. 미세 mapping은 Affymatrix 180K Axiom® SNP array에서 사용할 수 있는 SNP(single nucleotide polymorphism) 정보를 사용하여 수행되었다. 'PE2248'및 'PE2371' 개체의 각각 총 62 및 237개의 F3은 본 발명에서 개발된 SNP 마커를 통해 미세 매핑에 사용되었다 (표 2 참조).
SNP marker Physical position Primer
name 		Primer sequence PCR product size (bp) Restriction Enzyme Marker cuts 서열번호
SGM02
 1880255
 GM16-dcaps-2-F GCTTCTCATTCTCTTTACAGCATTTCTACTATATAAACC 320
 NcoI
 Wild
 4
GM16-dcaps-2-R CACCAATCTGAACCCTCCAT 5
SGM08
 3242468
 GM16-dcaps-8-F TGCTTACTAACTCCCGGAAAA 299
 HhaI
 Wild
 6
GM16-dcaps-8-R CCCTTCATATGACAGTGATAACAAGCATAGCG 7
SGM10
 3072764
 GM16-dcaps-10-F CAAGGGCTCTTAAACGGG CTTTGTTGGTTGCTCTTCGATGTGTTAA 383
 HpaI
 Wild
 8
GM16-dcaps-10-R ATCTAGTGGGCTGAGGGTGA 9
SGM14
 2803142
 GM16-dcaps-14-F AAGTGAATGGGAAGCACGAG 369
 DdeI
 Wild
 10
GM16-dcaps-14-R GCCATTACCATGTCTGCTAGGCAATCATCTT 11
SGM18
 3205680
 GM16-dcaps-18-F ACTTGAACAATTGAACTAACTAGGGTAC 402
 KpnI
 Mutant
 12
GM16-dcaps-18-R CAGCTGTATCCCCAAACCAT 13
SGM06
 3645034
 GM16-dcaps-6-F TGTTGAACTAATTTTTAATGGTGTTTTCTGGGATC 199
 BamHI
 Wild
 14
GM16-dcaps-6-R GTTCCCATTTGCTATTTCTGTG 15
후보 유전자의 코딩 서열은 하기와 같은 PCR 조건을 사용하여 증폭시킨 후, 수득한 PCR 산물을 시퀀싱 하였다(SolGent Co., Daejeon, Republic of Korea).
염기 서열 분석에 사용된 프라이머는 표 3에 나타내었다.
[PCR 조건]
94℃에서 5 분 동안 초기 변성, 94℃에서 20초 동안 35 cycle 변성, 55 ~ 58℃에서 40초 동안 annealing, 72℃에서 1 분 동안 extension; 및 72℃에서 5 분간 최종 extension.
Figure 112018044571903-pat00002
Figure 112018044571903-pat00003
Figure 112018044571903-pat00004
실시예 5. Sg -9 단백질의 다중 정렬 분석 방법
다중 정렬 분석은 ClustalW 프로그램(http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw)을 사용하여 수행되었다. NCBI conserved domain database(CDD) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml)로부터 얻은 UGT superfamily 단백질은 계통 발생 수를 구성하고 다중 정렬 분석을 위해 사용되었다. 상기 다중 정렬 분석은 'PE2248'과 'PE2371'에서 검출된 SNP의 특이성의 영향을 입증하였다. Sg-9 단백질의 3D 모델은 웹 기반 3D 구조 모델링 프로그램인 Phyre2(Kelley et al., 2015)를 사용하여 개발되었다.
실시예 6. RNA 분리 및 cDNA 합성 방법
총 RNA는 phenol-chloroform and lithium chloride precipitation 방법 (McCarty, 1986)을 사용하여 대두 돌연변이체의 동결 건조 샘플로부터 분리 하였다. RNA 샘플을 DNase I으로 처리하여 오염된 DNA를 제거하였다(TaKaRa, Japan). 제조사의 지침(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 따라 oligo-dT(20) 프라이머와 Superscript Ⅲ를 사용하여 전체 RNA의 역전사로 첫 번째 가닥 cDNA를 합성 하였다.
실시예 7. Semi - qRT - PCR 분석 방법
두 돌연변이체 라인에서 Sg -9 (Glyma .16G033700)의 전체 코딩 영역의 발현을 확인하기 위하여, 상기 실시예 6에서 합성한 첫 번째 가닥 cDNA를 사용하여 PCR을 수행하였다. housekeeping 유전자(Cons7)도 분석하였고, 사용된 프라이머는 표 3에 나타내었다.
실시예 8. qRT - PCR 분석 방법
qRT-PCR은 LightCycler® 480 Real-Time PCR System(Roche, Germany)을 사용하여 수행되었다. qRT-PCR(20㎕)은 첫 번째 가닥 cDNA 2㎕, 정방향 및 역방향 프라이머 10 p㏖, SYBR green I Master(Roche, Germany) 10 ㎕가 필요하였다. 대두 유전자 Cons7이 참조 유전자로 사용되었으며(Libault et al., 2008), 실험은 3 회 반복하였다. PCR cycle은 95℃에서 5 분간 수행되었고, 95℃에서 10 초간, 58℃에서 10 초간, 및 72℃에서 20 초간 45 cycle을 수행 하였다. qRT-PCR 데이터 및 PCR 효율은 LightCycler® 480 소프트웨어(Roche, Germany)를 사용하여 분석하였다. 이 분석에서 사용된 프라이머는 표 3에 나타내었다.
실시예 9. Derived cleaved amplified polymorphic sequence( dCAPS ) 분석 방법
'풍산나물'과 'PE2248'의 사이, 및 '풍산나물'과 'PE2371' 사이의 교배로부터 얻은 모든 F2 개체에서 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 DNA들은 Derived cleaved amplified polymorphic sequence(dCAPS) 분석에 사용되었다. PCR 프라이머는 'PE2248'과 'PE2371'의 sg -9a와 sg -9b에서 SNP를 검출하기 위해 고안되었다(표 3 참조). 'PE2248'에서 뉴클레오타이드 치환(C에서 T)은 야생 부모로부터 증폭된 PCR 산물에서 HhaI 부위(GCGC)를 생성한다. 'PE2371'에서, 뉴클레오티드 치환(G에서 A)은 돌연변이체 부모로부터 증폭된 PCR 산물에서 MboI 부위(GATC)를 생성한다. PCR 조건은 상기 실시예 8과 동일하게 진행하였다. 증폭된 생성물을 각각 HhaI 및 MboI 로 각각 절단하고(Takara Bio Inc, Shiga, Japan), 1.2% agarose 겔에서 분리 하였다.
실험예 1. DDMP 사포닌이 결핍된 돌연변이체의 분리 및 사포닌 함량 확인
DDMP 사포닌 생합성 관련 유전자를 확인하기 위해 상기 실시예 1에서 준비한 풍산나물 품종의 0.3% EMS 처리에 의한 돌연변이 개체군으로부터 두 가지 DDMP 사포닌 null 돌연변이체('PE2248' 및 'PE2371')를 분리했다. soyasaponin은 다른 식물 조직보다 특히 종자의 배축에 풍부하게 존재하므로(Shiraiwa et al., 1991), 두 돌연변이체에서 배축과 자엽의 사포닌 함량을 분석하였다. 2개의 대두 품종(풍산나물 및 Uram)과 비교할 때 상기 두 돌연변이체의 배축 추출물은 상기 실시예 2의 방법으로 박층 크로마토 그래피(TLC)로 분석한 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 DDMP 사포닌의 부재를 나타내었으며, 'PE2248'과 'PE2371'의 가수 분해된 배축 추출물의 TLC 패턴 역시 SS-B와 soyasapogenol E에서 대조군 (Pungsannamul과 Uram)과 비교하여 밴드가 거의 나타나지 않음을 알 수 있었다.
또한, 상기 실시예 3의 방법으로 LC-PDA/MS/MS 분석한 결과, 도 5a에 나타낸 바와 같이 PE2248과 PE2371의 배축 추출물은 '풍산나물' 품종과 비교하여 DDMP 사포닌에 대해 예상되는 체류 시간 peak가 약하게 나타났다.
상기 결과로 두 돌연변이체('PE2248' 및 'PE2371')에는 DDMP 사포닌 aglycon인 SS-B가 없음을 확인하였다.
한편, 배축과 달리, 자엽은 도 6a에 나타낸 바와 같이 DDMP 사포닌이 풍산나물에 비해 'PE2248'과 'PE2371'에서 유의하게 감소되는 것을 알 수 있었다.
또한, 풍산나물 품종의 총 사포닌 함량은 도 5b에 나타낸 바와 같이 배축 100g 당 3258μ㏖이었으며, 자엽 100g에서는 도 6b에 나타낸 바와 같이 423μ㏖ 검출되었다.
상기 결과는 배축 조직이 자엽보다 총 사포닌 함량이 8 배 이상 높은 것을 나타내었으며, 도 5b 및 6b에서 나타난 바와 같이 두 돌연변이체는 모두 종자의 배축과 자엽에서 대조군인 풍산나물에 비해 그룹 A 사포닌 함량이 유의하게 증가됨을 알 수 있었다. 이는 DDMP 사포닌의 제거 또는 감소가 그룹 A 사포닌의 증가를 초래한다는 것을 의미한다.
상기 결과로부터, 사포닌의 다른 그룹이 결핍되었을 때 콩의 총 사포닌 함량이 어느 정도 보상된다는 것을 확인하였다.
실험예 2. DDMP 사포닌이 결핍된 새로운 돌연변이체의 유전
상기 실시예 1에서 수득한 풍산나물과 PE2248 사이의 교배 및 풍산나물과 PE2371 사이의 교배로부터 얻은 F2 종자의 배축은 'PE2248'과 'PE2371'에서 DDMP 사포닌 null 대립유전자의 유전을 분석하는데 이용되었다. 표 4에 나타낸 바와 같이, 2개의 F2 개체의 분리 패턴은 3(DDMP 존재): 1(DDMP 부재) 비율과 일치하였다. 또한, 'Uram'과 두 돌연변이체 사이의 교배로부터 얻은 두 F2 개체군은 두 개체군 모두에서 분리율이 3 : 1과 일치한다는 것을 보여 주었다.
이러한 결과는 DDMP 사포닌의 결핍이 단일 열성 대립유전자에 의해 조절될 것이라는 예측과 일치하였다.
Figure 112018044571903-pat00005
실험예 3. sg -9 돌연변이체 대립유전자에 대한 대립성 검사( allelism test)
상기 실시예 1에서 분리된 두 EMS 돌연변이체는 표현형 분석에서 동일한 표현형을 나타내었다. 따라서, 두 돌연변이체를 교배하여 대립성 검사를 수행한 결과, 도 7 및 표 4에 나타낸 바와 같이 F2 표현형의 80 개의 개별 종자들 각각은 동형접합성 열성 부모 모두와 동일하였다. F2 자손에서 분리가 발생하지 않은 것으로부터, 두 돌연변이체에서 DDMP-사포닌의 결핍이 같은 유전자의 동일한 대립 유전자 또는 다른 대립 유전자 둘 중 하나에 의해 조절된다는 것을 알 수 있었다.
실험예 4. DDMP 사포닌의 존재를 제어하는 sg -9 유전자 자리의 physical mapping
돌연변이체에서 DDMP 사포닌 생합성에 관여하는 유전자를 확인하기 위해 상기 실시예 4의 방법으로 Affymetrix Axiom® SNP array를 사용하여 physical mapping 분석을 수행하였다. physical map은 'Uram'과 'PE2248', 'Uram'과 'PE2371'사이의 교배로부터 얻은 돌연변이체 표현형을 가진 58개의 F2 개별 line을 사용하여 구성하였다. 초기 mapping에서, 유전자 자리는 도 8에 나타낸 바와 같이 염색체 16(J)에서 Affx-89135537과 Affx-89136101 SNP array 사이의 1.8Mb 영역에 매핑되었다. 매핑된 영역은 본 발명에서 개발된 SNP 마커를 사용하여 더욱 좁혀졌다. 'PE2248'에서 SGM10과 SGM08 마커 사이에 한 영역이 170kb로 매핑되었다. 'PE2371'의 경우, SGM14와 SGM18 마커 사이에 한 영역이 400kb로 매핑되었다. 대립성 검사는 두 돌연변이체의 두 대립 유전자가 동일한 유전자에 상응한다는 것을 보여 주었다. 따라서, DDMP 사포닌 합성에 관여하는 Sg -9 유전자 자리가 위치한 SGM10과 SGM18 마커 사이에 두 돌연변이체에 공통적인 130kb 영역이 매핑된 것을 확인하였다.
실험예 5. Sg -9a 및 sg -9b 대립유전자의 분자적 분석
Wm82.a2.v1 대두 데이터베이스(Schmutz et al., 2010)에 따르면, Sg -9 유전자 자리가 매핑된 영역에 16개의 예상 유전자가 있으며, 이를 표 5에 나타내었다.
Figure 112018044571903-pat00006
예측된 유전자들 중에서 Glyma .16G033200, Glyma .16G033300 및 Glyma . 16G033700은 glucosyl/glucuronosyl transferase 유전자로 밝혀졌다. 각 후보 유전자의 염기 서열은 코딩 서열을 분석 한 결과 '풍산나물'에 비해 15개의 후보 유전자에서 다형성이 발견되지 않았다. 그 중에서도 Glyma.16G033700(position +1 에서 2016, GenBank accession 번호 MH255998)은 '풍산나물'과 비교하여 'PE2248'와 'PE2371' 돌연변이체 모두에서 단일 염기 변화로 분석되었다.
이에, 상기 Glyma . 16G033700유전자를 Sg - 9(서열번호 1로 표시)으로 지정하였으며, 상기 유전자는 단백질에 대한 PANTHER 분류 시스템(http://www.pantherdb.org/)에서 UGT73B4 효소(UGT73B4)를 암호화한다.
'PE2248'의 서열 분석은 도 9a에 나타낸 바와 같이 첫 번째 엑손에서 단일 염기 다형성(single-nucleotide polymorphism; SNP)(G626A)을 나타내어 결과적으로 glycine에서 aspartic acid로의 아미노산 변화(G209D)로 이어졌다. 또한, 돌연변이체 'PE2371'은 일반적인 품종인 풍산나물과 Williams 82와 비교했을 때 첫 번째 엑손에서 SNP(C137T)를 보였으며 그 결과 threonine에서 isoleucine로의 아미노산 변화(T46I)가 일어났다.
식물 triterpenoid는 수산기 및/또는 카르복실기에서 UGT에 의한 당화를 통해 더욱 다양화된다. UGT는 UDP-glucose, UDP-galactose, UDP-arabinose, UDP-rhamnose, UDP-xylose 또는 UDP-glucuronic acid와 같은 UDP-sugar 공여체를 사용하여 글리코실화를 촉매한다. UGT는 식물에서 큰 유전자 패밀리를 형성한다. UGT는 3 차원으로 접힌 구조(GT-A, GT-B, GT-C), 촉매 반응 매커니즘, 및 아미노산 서열의 유사 정도를 포함하는 많은 특징에 기초한 superfamily에 그룹핑되었다. 지금까지 대두 게놈의 242 개 유전자가 UGT를 암호화하고 있다. NCBI 데이터베이스에서 Sg-9 단백질의 보존 영역 검색은 그것이 glycosyltransferase GT-B superfamily(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)에 속한다는 것을 보여 주었다. Sg-9 단백질과 45 ~ 99 %의 서열 유사성을 보인 식물 종을 위해 등록된 25 GT-B superfamily UGT의 단백질 서열은 NCBI 데이터베이스 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 얻었다. 'PE2248'과 'PE2371'에서 대립 유전자 변이에 대한 단일 염기 치환의 영향을 조사하기 위해 상기 실시예 5의 방법으로 GT-B superfamily 단백질의 25 UGT와 함께 Sg-9 단백질의 다중 정렬 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 9b 및 9c에 나타낸 바와 같이 'PE2248' 및 'PE2371'에서의 아미노산 변화가 UGT 단백질의 GT-B topology 공유 구성원 사이에서 높게 보존되었음(highly conserved)을 보여주었다. 따라서, 이들 SNP는 돌연변이체에서 단백질 기능에 영향을 미치고 DDMP-사포닌 생합성의 저해를 초래할 수 있다. 'PE2248'과 'PE2371'의 돌연변이체 대립 유전자는 sg -9a(서열번호 2로 표시)와 sg -9b(서열번호 3으로 표시)로 각각 지정하였다.
실험예 6. 대두에서 UGT73B4 subfamily 유전자의 다양성 확인
상기 실험예 4에서 physical mapping을 통해 Sg -9의 단일 유전자 특성을 확인하였으나, 대두 게놈은 PANTHER 단백질 분류 시스템(http://www.pantherdb.org/panther/family.do? clsAccession = PTHR11926 : SF500)에서 동일한 기능을 가진 아미노산 400개 이상의 단백질을 암호화하는 추정UGT73B4 서브 패밀리 유전자의 적어도 13개의 복제본을 운반한다. 상기 유전자들 중 두 개는 도 10에 나타낸 바와 같이 neighbor-joining clustering을 통해 clade Ⅲ에서 Sg-9의 상동체와 밀접한 관련이 있다고 확인되었다. 이는 대두의 UGT73B4 서브 패밀리 단백질이 돌연변이체 라인의 자엽 조직에서 DDMP-사포닌 잔여물에 영향을 줄 수 있음을 나타내었다.
실험예 7. Sg -9 유전자 발현의 조직 특이적 조절
두 돌연변이체에서 Sg -9 유전자의 전체 코딩 영역의 발현을 확인하기 위해 상기 실시예 7의 방법으로 역전사(RT)-PCR 분석을 통해 돌연변이체 및 대조군 '풍산나물'의 발현 수준을 확인하였고 1-kb 분자 마커를 M으로 표시하였다.
그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이 Sg -9 유전자의 전체 코딩 영역의 발현은 대조군에 비해 이상이 없었으며 두 돌연변이체 모두에서 PCR 산물의 예상 크기(1482 bp)가 얻어졌다. 상기 데이터는 돌연변이체의 SNP가 Sg-9 효소 활성에 잠재적으로 영향을 줄 가능성이 있음을 나타낸다.
또한, DDMP 사포닌의 생합성에 대한 유전자 발현과 관련성을 정량하기 위해 우성의 Sg -9를 지닌 두 재배 품종('풍산나물' 및 'Williams 82')에서 상기 실시예 8의 방법으로 정량적 역전사 PCR (qRT-PCR) 분석을 통해 조직 특이적 Sg -9 발현을 확인 하였다. 사포닌 생합성에 관여하는 유전자 중 이전에 확인된 유전자인 Sg -1과 Sg -5를 대조군으로 사용하였으며, 파종 후 15일(15 DAS)의 뿌리(root)를 R-A, 새싹(shoot)을 S-A, 잎(leaf)을 L-A, 배축(hypocotyl)과 자엽(cotyledon)을 혼합한 것을 HC로, 파종 후 30일(30 DAS)의 뿌리(root)를 R-B, 새싹(shoot)을 S-B, 잎(leaf)을 L-B로, 개화 후 50일의 종자 자엽(seed cotyledon)을 SC, 종자 배축(seed hypocotyl)을 SH로 나타내었다.
그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이 Sg -1 및 Sg -5 유전자 모두의 결과는 다른 조직의 것과 비교하여 종자 배축 조직에서 더 높은 수준의 발현을 나타내었다. 양 품종의 종자 자엽 조직은 Sg -1의 유의한 발현을 보였으나 Sg -5의 유의한 발현은 보이지 않았다. 또한, 파종 후(days after sowing; DAS) 15 일 및 30 일의 뿌리는 Sg -1 및 Sg -5의 다소 유의한 발현을 나타내었다.
결과적으로, 가장 높은 Sg -9 발현 수준은 자라나는 종자의 자엽과 배축에서 관찰되었다. Sg -9 발현은 15 DAS 식물의 뿌리와 30 DAS 식물의 뿌리 및 잎에서 관찰되었다. 그러나 발현 수준은 종자의 발달보다 유의하게 낮았다. 상기 결과는 Sg -9 발현이 다른 조직보다 대두 종자 및 뿌리에서 DDMP 사포닌의 축적을 조절할 가능성이 있음을 나타낸다.
실험예 8. 호르몬 조절에 의한 Sg -9 유전자 발현 확인
일부 식물에서 methyl jasmonate(MeJA) 적용의 결과는 사포닌 및 다른 2 차 대사 산물의 생합성을 자극하는 것으로 보고된 바 있다. 따라서, 상기 methyl jasmonate(MeJA)를 풍산나물 모종에 적용하여 실험을 수행하였다.
7일된 풍산나물 모종을 100μM-abscisic acid (ABA), ethephon, gibberellin A3(GA3), indole-3-acetic acid(IAA), methyl-jasmonate(MeJA), 또는 salicylic acid (SA)를 포함하는 흙에 옮기고 1일 동안 28℃에서 배양하였다. 호르몬 조절에 의한 Sg -9 유전자 발현을 조사하기 위해 상기 ABA, GA3, IAA, MeJA, 또는 SA를 8시간 및 24시간동안 처리한 7일된 '풍산나물' 모종의 뿌리를 분석하였다.
그 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이 MeJA를 8시간 및 24시간 처리한 뿌리에서 Sg -9 발현 수준이 대조군(mock)에 비해 각각 3 배 및 6 배 이상 높았다. 또한, MeJA는 대두 사포닌에 대한 Sg -1, Sg -5 및 BAS1 유전자의 발현 수준을 상향 조정했다. 상기 결과는 대두 모종에서 jasmonate 신호 전달 경로가 대두 사포닌 생합성 유전자의 발현을 자극한다는 것을 보여주었다.
실험예 9. 돌연변이체와 DDMP 사포닌 표현형의 동일 분리(co-segregation)
sg -9a 및 sg -9b 대립 유전자 및 DDMP 사포닌 표현형의 동일 분리(co-segregation) 패턴을 확인하기 위해 상기 실시예 9의 방법으로 dCAPS 분석을 수행하여 도 14a에 나타내었다. sg -9a 대립 유전자의 경우 한 쌍의 dCAPS 프라이머가 299-bp DNA 산물을 증폭시켰다. 야생형 대조군 대두인 풍산나물 유래 산물은 HhaI로 절단되어 258-bp DNA 단편을 생성하는 반면, sg -9a ('PE2248') 유래 산물은 절단되지 않았다. DDMP 사포닌을 생성하지 않은 F2 개체들은 긴 단편만 포함하는 반면, DDMP 사포닌을 생성한 F2 개체들은 짧은 단편만 가지거나 또는 긴 단편과 짧은 단편 모두를 가졌다. 유사하게, sg -9b 대립 형질에 대해, 한 쌍의 dCAPS 프라이머는 202 bp DNA 산물을 증폭시켰다. 돌연변이체 'PE2371' 유래 산물은 MboI로 절단되어 160-bp의 DNA 단편을 생성하는 반면, 대조군 '풍산나물' 유래 산물은 절단되지 않았다. DDMP 사포닌을 생성하지 않은 F2 개체들은 짧은 단편만을 포함하는 반면, DDMP 사포닌을 생성한 F2 개체들은 긴 단편만 가지거나 또는 긴 단편과 짧은 단편 모두를 가졌다. 이러한 결과는 두 개의 dCAPS 마커가 '풍산나물'과 'PE2248'(sg-9a) 사이의 교배로부터 얻은 100개의 F2 식물 및 '풍산나물'과 'PE2371'(sg -9b) 사이의 교배로부터 얻은 79개의 F2 식물의 사포닌 표현형으로 각각 동일 분리(co-segregation) 되었음을 나타내었고, 분리는 표 4에 나타낸 바와 같이 1 : 2 : 1의 비율이었다. 이러한 결과는 사포닌 표현형과 함께 Sg -9 다형성의 완벽한 동일 분리(co-segregation)를 보여 주었는데, 이는 Sg -9 유전자 자리가 DDMP 사포닌 생합성과 밀접하게 연관되어 있고, 새로운 sg -9a 및 sg -9b 대립 유전자는 Sg -9에 열성이라는 것을 나타내었다.
또한, sg -9 돌연변이체 대립 유전자가 Glyma .16g033700 유전자의 돌연변이와 일치한다는 것을 확인하기 위해 두 돌연변이체 대립 유전자 sg -9a 및 sg -9b 모두에 대해 dCAPS 마커를 사용하여 'PE2248'과 'PE2371' 사이의 교배로부터 얻은 80개의 F2 개체에서 동일 분리(co-segregation) 분석을 수행하였다. 그 결과, 도 14b에 나타낸 바와 같이 sg -9a 마커는 sg -9b 마커로 보완되었다. 결론적으로, 상기 데이터로부터 sg -9a 및 sg -9b가 Glyma .16g033700 유전자에 상응하는 Sg - 9에 대한 대립 유전자임을 확인하였다.
결론적으로, 상기 실험예들의 결과에 따라, 본 발명의 Sg -9 유전자는 도 15에 나타낸 바와 같이 C-22-DDMP 전이 효소를 암호화 하여 DDMP 사포닌의 합성에 관여하고, Sg -9 유전자에 돌연변이가 발생하면 그룹 A 사포닌 양이 증가하여 DDMP 사포닌의 손실에 대해 보상을 하는 것으로 확인되었다.
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예 및 실험예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Gene involved in the biosynthesis of DDMP saponin and use thereof <130> MP18-066 <160> 133 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1482 <212> DNA <213> Glyma.16G033700.1 (Sg-9) <400> 1 atggaaagag tagcatcagt atctcggcca ctgaaaatat acttcctccc attcttctca 60 ccggggcacc taatccctct ggtccagctg gctcgcttgg tggcggcacg aggccagcac 120 gtgaccatca tcaccacccc cgccaacgct caactcttcg accagaacat cgacaaggac 180 accgcctccg gccaccacat ccgcgtccac atcatcaagt tccccaacgc ccacgtaggg 240 ctaccggaag gcatcgagca cctctccgcc gccaccaaca atgaaaccgc ctacaagatc 300 cacatggcgg cgcatctcat catgccccag ctcgagtctc tggtcaaaca ctctccaccg 360 gacgtcttca tccctgacat cctcttcacc tggaccaaag acttctccca gaaactctcc 420 atctcgcggc tagtcttcaa ccctatttcc atcttcgacg tctgcatgat ccacgccatt 480 aaaacccacc ctgaagcctt cgcttccgac tctgggcctt ttctaattcc tgatctaccc 540 caccctttaa ctctccccgt caagccttcc cccggtttcg ccgccttaac cgaatctctc 600 ctcgacgggg aacaggacag tcacggcgtc atcgtaaaca gcttcgccga tctcgacgcc 660 gagtacactc aacactacca gaaacttaca gggcgcaagg tgtggcatgt tgggccaagc 720 tccctcatgg tgcaaaagac ggtgaaaagt agtactgttg atgagagtag acacgattgt 780 ctcacgtggc ttgactcaaa gaaagaatct tcggttctct acatttgttt cggaagcctt 840 tctctcatct ccgacgagca gctttaccag attgctaccg gactcgaagg gtcagggcat 900 tgttttcttt gggtggtgca tcgcaaaaac aaagacggag aagaaggaga ttcttcttct 960 tcttccggaa agtggttgcc ggaagggttt gaggaaaaga tagctaagga gaacagaggc 1020 atgctgatta agggatgggc gccgcagccg ttgatcctga accaccctgc ggtgggagga 1080 tttttaacgc actgcgggtg gaacgcggtg gcggaggcga tcagctccgg ggttccgatg 1140 gtgacaatgc cggctttcgg ggaccagtac tataacgaga agctgataac ggaggtgcac 1200 gggttcgggg tggaggtggg ggcggcggag tggagcattt cgccgtacga ggggaagaag 1260 aaggtggtga gtggggagag gatagagagt gccgtgaaga ggttgatgga tgatggagag 1320 aaagggaaga gaatgagaag caaggccaaa gagatgcagg agaaggcttg gaaagctgtt 1380 caagaaggtg gttcttctta cgacagtctc acggctctga ttcatcattt caagactctt 1440 gtgcctaatc atgtgaatgg gaatgggaat atcgatcact ga 1482 <210> 2 <211> 1482 <212> DNA <213> Sg-9a <400> 2 atggaaagag tagcatcagt atctcggcca ctgaaaatat acttcctccc attcttctca 60 ccggggcacc taatccctct ggtccagctg gctcgcttgg tggcggcacg aggccagcac 120 gtgaccatca tcaccacccc cgccaacgct caactcttcg accagaacat cgacaaggac 180 accgcctccg gccaccacat ccgcgtccac atcatcaagt tccccaacgc ccacgtaggg 240 ctaccggaag gcatcgagca cctctccgcc gccaccaaca atgaaaccgc ctacaagatc 300 cacatggcgg cgcatctcat catgccccag ctcgagtctc tggtcaaaca ctctccaccg 360 gacgtcttca tccctgacat cctcttcacc tggaccaaag acttctccca gaaactctcc 420 atctcgcggc tagtcttcaa ccctatttcc atcttcgacg tctgcatgat ccacgccatt 480 aaaacccacc ctgaagcctt cgcttccgac tctgggcctt ttctaattcc tgatctaccc 540 caccctttaa ctctccccgt caagccttcc cccggtttcg ccgccttaac cgaatctctc 600 ctcgacgggg aacaggacag tcacgacgtc atcgtaaaca gcttcgccga tctcgacgcc 660 gagtacactc aacactacca gaaacttaca gggcgcaagg tgtggcatgt tgggccaagc 720 tccctcatgg tgcaaaagac ggtgaaaagt agtactgttg atgagagtag acacgattgt 780 ctcacgtggc ttgactcaaa gaaagaatct tcggttctct acatttgttt cggaagcctt 840 tctctcatct ccgacgagca gctttaccag attgctaccg gactcgaagg gtcagggcat 900 tgttttcttt gggtggtgca tcgcaaaaac aaagacggag aagaaggaga ttcttcttct 960 tcttccggaa agtggttgcc ggaagggttt gaggaaaaga tagctaagga gaacagaggc 1020 atgctgatta agggatgggc gccgcagccg ttgatcctga accaccctgc ggtgggagga 1080 tttttaacgc actgcgggtg gaacgcggtg gcggaggcga tcagctccgg ggttccgatg 1140 gtgacaatgc cggctttcgg ggaccagtac tataacgaga agctgataac ggaggtgcac 1200 gggttcgggg tggaggtggg ggcggcggag tggagcattt cgccgtacga ggggaagaag 1260 aaggtggtga gtggggagag gatagagagt gccgtgaaga ggttgatgga tgatggagag 1320 aaagggaaga gaatgagaag caaggccaaa gagatgcagg agaaggcttg gaaagctgtt 1380 caagaaggtg gttcttctta cgacagtctc acggctctga ttcatcattt caagactctt 1440 gtgcctaatc atgtgaatgg gaatgggaat atcgatcact ga 1482 <210> 3 <211> 1482 <212> DNA <213> Sg-9b <400> 3 atggaaagag tagcatcagt atctcggcca ctgaaaatat acttcctccc attcttctca 60 ccggggcacc taatccctct ggtccagctg gctcgcttgg tggcggcacg aggccagcac 120 gtgaccatca tcaccatccc cgccaacgct caactcttcg accagaacat cgacaaggac 180 accgcctccg gccaccacat ccgcgtccac atcatcaagt tccccaacgc ccacgtaggg 240 ctaccggaag gcatcgagca cctctccgcc gccaccaaca atgaaaccgc ctacaagatc 300 cacatggcgg cgcatctcat catgccccag ctcgagtctc tggtcaaaca ctctccaccg 360 gacgtcttca tccctgacat cctcttcacc tggaccaaag acttctccca gaaactctcc 420 atctcgcggc tagtcttcaa ccctatttcc atcttcgacg tctgcatgat ccacgccatt 480 aaaacccacc ctgaagcctt cgcttccgac tctgggcctt ttctaattcc tgatctaccc 540 caccctttaa ctctccccgt caagccttcc cccggtttcg ccgccttaac cgaatctctc 600 ctcgacgggg aacaggacag tcacggcgtc atcgtaaaca gcttcgccga tctcgacgcc 660 gagtacactc aacactacca gaaacttaca gggcgcaagg tgtggcatgt tgggccaagc 720 tccctcatgg tgcaaaagac ggtgaaaagt agtactgttg atgagagtag acacgattgt 780 ctcacgtggc ttgactcaaa gaaagaatct tcggttctct acatttgttt cggaagcctt 840 tctctcatct ccgacgagca gctttaccag attgctaccg gactcgaagg gtcagggcat 900 tgttttcttt gggtggtgca tcgcaaaaac aaagacggag aagaaggaga ttcttcttct 960 tcttccggaa agtggttgcc ggaagggttt gaggaaaaga tagctaagga gaacagaggc 1020 atgctgatta agggatgggc gccgcagccg ttgatcctga accaccctgc ggtgggagga 1080 tttttaacgc actgcgggtg gaacgcggtg gcggaggcga tcagctccgg ggttccgatg 1140 gtgacaatgc cggctttcgg ggaccagtac tataacgaga agctgataac ggaggtgcac 1200 gggttcgggg tggaggtggg ggcggcggag tggagcattt cgccgtacga ggggaagaag 1260 aaggtggtga gtggggagag gatagagagt gccgtgaaga ggttgatgga tgatggagag 1320 aaagggaaga gaatgagaag caaggccaaa gagatgcagg agaaggcttg gaaagctgtt 1380 caagaaggtg gttcttctta cgacagtctc acggctctga ttcatcattt caagactctt 1440 gtgcctaatc atgtgaatgg gaatgggaat atcgatcact ga 1482 <210> 4 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer GM16-dcaps-2-F <400> 4 gcttctcatt ctctttacag catttctact atataaacc 39 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer GM16-dcaps-2-R <400> 5 caccaatctg aaccctccat 20 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer GM16-dcaps-8-F <400> 6 tgcttactaa ctcccggaaa a 21 <210> 7 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer GM16-dcaps-8-R <400> 7 cccttcatat gacagtgata acaagcatag cg 32 <210> 8 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer GM16-dcaps-10-F <400> 8 caagggctct taaacgggct ttgttggttg ctcttcgatg tgttaa 46 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer GM16-dcaps-10-R <400> 9 atctagtggg ctgagggtga 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer GM16-dcaps-14-F <400> 10 aagtgaatgg gaagcacgag 20 <210> 11 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer GM16-dcaps-14-R <400> 11 gccattacca tgtctgctag gcaatcatct t 31 <210> 12 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer GM16-dcaps-18-F <400> 12 acttgaacaa ttgaactaac tagggtac 28 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer GM16-dcaps-18-R <400> 13 cagctgtatc cccaaaccat 20 <210> 14 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer GM16-dcaps-6-F <400> 14 tgttgaacta atttttaatg gtgttttctg ggatc 35 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer GM16-dcaps-6-R <400> 15 gttcccattt gctatttctg tg 22 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G032600 primer 32600-F1 <400> 16 acaagaatca cagcgcacag 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G032600 primer 32600-R1 <400> 17 gcaaatgccc caaagttaca 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G032600 primer 32600-F2 <400> 18 tgatttcatg ccaaaaccag 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G032600 primer 32600-R2 <400> 19 cctcagaaaa tggccttcaa 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G032600 primer 32600-F3 <400> 20 tgacattgca attgttgtgc 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G032600 primer 32600-R3 <400> 21 tgctccacca ctttatgtgc 20 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G032700 primer 32700-F1 <400> 22 ctcacacaca tgttccctcc t 21 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G032700 primer 32700-R1 <400> 23 tcgcgtgatt catgtagctg 20 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G032700 primer 32700-F2 <400> 24 tgtcgttgtc actttcagga g 21 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G032700 primer 32700-R2 <400> 25 ctctggtgca acgtaactgc 20 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G032700 primer 32700-F3 <400> 26 gcattttcct agctttgttg c 21 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G032700 primer 32700-R3 <400> 27 caactgggga cattatgcaa 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G032800 primer 32800-F1 <400> 28 gccatccttc actctttgct 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G032800 primer 32800-R1 <400> 29 accgagcatc caaaagaaaa 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G032800 primer 32800-F2 <400> 30 ggtttgcccc tgaacctact 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G032800 primer 32800-R2 <400> 31 acaagaggct tttgcacacc 20 <210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G032900 primer 32900-F1 <400> 32 tcaagtgtcg gaaagtttgc t 21 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G032900 primer 32900-R1 <400> 33 aaaacaagga tacccctttg c 21 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G032900 primer 32900-F2 <400> 34 tcagatgggg tcgttcttct 20 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G032900 primer 32900-R2 <400> 35 aaaccatgag cacccctaga t 21 <210> 36 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G032900 primer 32900-F3 <400> 36 ttgggaacaa gagcttagaa cc 22 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G032900 primer 32900-R3 <400> 37 gaggtcgata tggacggaaa 20 <210> 38 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G032900 primer 32900-F4 <400> 38 gtgttctagc ttgctgccaa c 21 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G032900 primer 32900-R4 <400> 39 atcttctgtg cgctgcaact 20 <210> 40 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033000 primer 33000-F1 <400> 40 gagagtaaac aatcgtcggt ta 22 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033000 primer 33000-R1 <400> 41 gaggaacgta gattacaaga 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033000 primer 33000-F2 <400> 42 aaattgggtt cgtgggaaag 20 <210> 43 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033000 primer 33000-R2 <400> 43 agcaatcatc acacttgacc a 21 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033000 primer 33000-F3 <400> 44 gcaagctggt tagtcgtttg 20 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033000 primer 33000-R3 <400> 45 atggggtgag aacgttgaaa 20 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033000 primer 33000-F4 <400> 46 acaggacaat tgagtagatt 20 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033000 primer 33000-R4 <400> 47 ctggatgaaa tgggaaaaga 20 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033100 primer 33100-F1 <400> 48 cttggtggct ggttgaactt 20 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033100 primer 33100-R1 <400> 49 tccggtctat atttaaaacc 20 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033100 primer 33100-F2 <400> 50 gaaggctgca cttcaggaac 20 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033100 primer 33100-R2 <400> 51 gtcggcaatc ctcttttgtc 20 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033100 primer 33100-F3 <400> 52 cctttgtgct tgccagattt 20 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033100 primer 33100-R3 <400> 53 acaataccat tcccgtccaa 20 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033100 primer 33100-F4 <400> 54 gcgtgctgaa tattgctctg 20 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033100 primer 33100-R4 <400> 55 ggacggactg gttttgagag 20 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033100 primer 33100-F5 <400> 56 tcccatttcc tttccatgtt 20 <210> 57 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033100 primer 33100-R5 <400> 57 caaaatgctg tttccccttc 20 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033200 primer 33200-F1 <400> 58 tgtaggtgta gattgtgtca 20 <210> 59 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033200 primer 33200-R1 <400> 59 cttgctcagc ttgcactcac 20 <210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033200 primer 33200-F2 <400> 60 ttgcctgtag atagggcaca 20 <210> 61 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033200 primer 33200-R2 <400> 61 acagaacagt gccacaagga 20 <210> 62 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033300 primer 33300-F1 <400> 62 tgtgtacgtg taacgcatgt t 21 <210> 63 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033300 primer 33300-R1 <400> 63 tcacaggctt cccaactagc 20 <210> 64 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033300 primer 33300-F2 <400> 64 cggtaaatgc ttctggggta 20 <210> 65 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033300 primer 33300-R2 <400> 65 cagtcatcaa tccaacccaa a 21 <210> 66 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033300 primer 33300-F3 <400> 66 tgtacgggtg taacgcatgt 20 <210> 67 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033300 primer 33300-R3 <400> 67 gaatcacagg cttcccaact 20 <210> 68 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033300 primer 33300-F4 <400> 68 gtgctggtgc taacgacgta 20 <210> 69 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033300 primer 33300-R4 <400> 69 cactgtctgc acgtccctaa 20 <210> 70 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033400 primer 33400-F1 <400> 70 gctcacaaac acacgatgct 20 <210> 71 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033400 primer 33400-R1 <400> 71 ttgaccaagt gtatataacc c 21 <210> 72 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033400 primer 33400-F2 <400> 72 gttcccttcc ttttgcttcc 20 <210> 73 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033400 primer 33400-R2 <400> 73 ccattaacac aaccccaacc 20 <210> 74 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033400 primer 33400-F3 <400> 74 ccctacctgt caatcctgct 20 <210> 75 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033400 primer 33400-R3 <400> 75 gcatgatgta tgagtgccaa a 21 <210> 76 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033400 primer 33400-F4 <400> 76 gcccacacac gactgataca 20 <210> 77 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033400 primer 33400-R4 <400> 77 ccaaacacac ctaaagctca ca 22 <210> 78 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033500 primer 33500-F1 <400> 78 ttcggtggaa ctatgtgcaa 20 <210> 79 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033500 primer 33500-R1 <400> 79 catcccaagc ctgagtgtct 20 <210> 80 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033500 primer 33500-F2 <400> 80 ggttggagca aaaggtcaaa 20 <210> 81 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033500 primer 33500-R2 <400> 81 tctccgccac ttccaataat 20 <210> 82 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033500 primer 33500-F3 <400> 82 ccaaattcgt aactcttgca g 21 <210> 83 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033500 primer 33500-R3 <400> 83 cgccaagaaa tcctcaaagt 20 <210> 84 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033600 primer 33600-F1 <400> 84 tctaccattt gatcgaaagc 20 <210> 85 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033600 primer 33600-R1 <400> 85 gacacaccca tgagggactt 20 <210> 86 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033600 primer 33600-F2 <400> 86 agccaaactc aaggctcaaa 20 <210> 87 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033600 primer 33600-R2 <400> 87 ttcggaaagg acttgagtaa cc 22 <210> 88 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033700 primer 33700-F1 <400> 88 agggtatcat cagactagag aga 23 <210> 89 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033700 primer 33700-R1 <400> 89 cggtaaaagg tttccagttt 20 <210> 90 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033700 primer 33700-F2 <400> 90 attttcccca tgctgttacg 20 <210> 91 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033700 primer 33700-R2 <400> 91 gaagccttgt tggatttgga 20 <210> 92 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033700 primer 33700-F3 <400> 92 gtggagttta ggtctgagat gaa 23 <210> 93 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033700 primer 33700-R3 <400> 93 tggcattcat gcattcactt 20 <210> 94 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033700 primer 33700-F4 <400> 94 ccataagatg aatttggtta gg 22 <210> 95 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033700 primer 33700-R4 <400> 95 agccagttac ccggattaag a 21 <210> 96 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033800 primer 33800-F1 <400> 96 tgtgttggtg tcctatgcct aa 22 <210> 97 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033800 primer 33800-R1 <400> 97 gacatggtat cacgtaagaa c 21 <210> 98 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033800 primer 33800-F2 <400> 98 gagggtgggg acaagtcttt 20 <210> 99 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033800 primer 33800-R2 <400> 99 gagctatctc tccagccaca a 21 <210> 100 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033800 primer 33800-F3 <400> 100 ttctcatggc ctttgctaca 20 <210> 101 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033800 primer 33800-R3 <400> 101 caacttttgg ggtcttgcat 20 <210> 102 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033800 primer 33800-F4 <400> 102 ccagccatga cactcttgtg 20 <210> 103 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033800 primer 33800-R4 <400> 103 caaggctgac tgagccaaa 19 <210> 104 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033900 primer 33900-F1 <400> 104 ccacttggtc attgagcatt 20 <210> 105 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033900 primer 33900-R1 <400> 105 tcttggggaa tgggaacata 20 <210> 106 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033900 primer 33900-F2 <400> 106 caacttccca ccctctttcc 20 <210> 107 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033900 primer 33900-R2 <400> 107 ggctcttggt tagtgtgtta atga 24 <210> 108 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033900 primer 33900-F3 <400> 108 tcgttttacc ttggatttgc 20 <210> 109 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033900 primer 33900-R3 <400> 109 tgcctggatc atttggagat 20 <210> 110 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033900 primer 33900-F4 <400> 110 cggttatcat cccgaaattg 20 <210> 111 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033900 primer 33900-R4 <400> 111 ggctatgagg caatttgagg 20 <210> 112 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033900 primer 33900-F5 <400> 112 gcctcaactg ccttcctagt t 21 <210> 113 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033900 primer 33900-R5 <400> 113 ctgggaagag ggagttcctg 20 <210> 114 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033900 primer 33900-F6 <400> 114 tctggtcttc cccacattct 20 <210> 115 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G033900 primer 33900-R6 <400> 115 ggatggatga acctccgtta 20 <210> 116 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G034000 primer 34000-F1 <400> 116 tcccaggagc aaagtgctat 20 <210> 117 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G034000 primer 34000-R1 <400> 117 ttcgcacttc aaggcataca 20 <210> 118 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G034100 primer 34100-F1 <400> 118 cgatcaaaca tggaaaccaa 20 <210> 119 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glyma.16G034100 primer 34100-R1 <400> 119 gtgaccccaa aagccacata 20 <210> 120 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sg-9 primer Sg9-RT-F <400> 120 atggaaagag tagcatcagt atctcg 26 <210> 121 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sg-9 primer Sg9-RT-R <400> 121 tcagtgatcg atattcccat tcccattca 29 <210> 122 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sg-1 primer Sg1-qRT-F <400> 122 gtcatggcgg atcagtttta c 21 <210> 123 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sg-1 primer Sg1-qRT-R <400> 123 ggcagtctca atggtatctc tg 22 <210> 124 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sg-5 primer Sg5-qRT-F <400> 124 tgatatgggc atggaagaag c 21 <210> 125 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sg-5 primer Sg5-qRT-R <400> 125 atggcttgca tttgcatctt c 21 <210> 126 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sg-9 primer Sg9-qRT-F <400> 126 ctgatctacc ccacccttta ac 22 <210> 127 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sg-9 primer Sg9-qRT-R <400> 127 cgccctgtaa gtttctggta g 21 <210> 128 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BasI primer BasI-qRT-F <400> 128 aagccgttaa atttctactt a 21 <210> 129 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BasI primer BasI-qRT-R <400> 129 tgcagcacgg tgaagaggca 20 <210> 130 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sg-9a primer dCAPS-sg-9a-F <400> 130 tccctgacat cctcttcacc 20 <210> 131 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sg-9a primer dCAPS-sg-9a-R <400> 131 agtgtactcg gcgtcgagat cggcgaagct gtttacgatg gcg 43 <210> 132 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sg-9b primer dCAPS-sg-9b-F <400> 132 tcgcttggtg gcggcacgag gccagcacgt gaccatcatc acga 44 <210> 133 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sg-9b primer dCAPS-sg-9b-R <400> 133 gtaggcggtt tcattgttgg 20

Claims (8)

  1. Glyma.16G033700 유전자를 포함하는 DDMP(2,3-dihydro-2,5-dihydroxy- 6-methyl-4H-pyran-4-one) 사포닌 생합성 촉진용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 유전자는 콩으로부터 분리되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 유전자는 UGT73B4(Uridine diphosphate-glycosyltransferase 73B4)를 암호화하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  5. 상기 제1항의 Glyma.16G033700 유전자를 포함하는, DDMP 사포닌 생합성 촉진용 재조합 벡터.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, DDMP 사포닌 생합성 촉진용 재조합 벡터.
  7. DDMP(2,3-dihydro-2,5-dihydroxy- 6-methyl-4H-pyran-4-one) 사포닌 생합성을 증가시키는 방법으로,
    상기 방법은 상기 제5항의 재조합 벡터를 두과 작물에 도입하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  8. DDMP(2,3-dihydro-2,5-dihydroxy- 6-methyl-4H-pyran-4-one) 사포닌 생합성을 증가시키는 방법으로,
    상기 방법은 서열번호 1로 표시되는 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
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The Plant Cell, Vol. 24, p. 2123-2138, May 2012
Thesis for the Degree of Master of Agriculture, School of Applied Biosciences, Major in Agronomy, Jiho Park, December 2014, The Graduate School, Kyungpook National University

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KR20190127445A (ko) 2019-11-13

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