KR20100081981A

KR20100081981A - Ｕｄｐ-글루쿠론산 전이 효소 및 그것을 코딩하는 폴리뉴클레오티드

Info

Publication number: KR20100081981A
Application number: KR1020107006934A
Authority: KR
Inventors: 에이이치로 오노; 아키오 노구치; 유코 후쿠이; 마사코 미츠타니
Original assignee: 산토리 홀딩스 가부시키가이샤
Priority date: 2007-10-12
Filing date: 2008-09-29
Publication date: 2010-07-15
Also published as: EP2199388A4; ECSP10010082A; TW200920844A; EP2199388B1; JP2009106265A; WO2009047992A1; CO6210706A2; JP4927774B2; CA2702035A1; CA2702035C; AU2008310396A1; US8628938B2; BRPI0818531A2; US20100323402A1; CN101407816B; CN101407816A; TWI363799B; EP2199388A1; RU2010119028A

Abstract

본 발명은, 새로운 UDP-글루쿠론산 전이 효소, 및 그것을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(예컨대, 서열 번호 4로 표시되는 염기 서열의 제1번째∼제1359번째의 염기 서열, 서열 번호 10으로 표시되는 염기 서열의 제1번째∼제1365번째의 염기 서열, 서열 번호 12로 표시되는 염기 서열의 제1번째∼제1371번째의 염기 서열, 및 서열 번호 22로 표시되는 염기 서열의 제1번째∼제1371번째의 염기 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 하나의 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드; 또는 서열 번호 5, 11, 13 및 23으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드) 등을 제공한다. 이에 따라, 기질 특이성이 넓은, 새로운 UDP-글루쿠론산 전이 효소가 제공된다.

Description

ＵＤＰ-글루쿠론산 전이 효소 및 그것을 코딩하는 폴리뉴클레오티드{UDP-GLUCURONYL TRANSFERASE AND POLYNUCLEOTIDE ENCODING THE SAME}

본 발명은, UDP-글루쿠론산 전이 효소, 그것을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 그것을 함유하는 벡터, 형질 전환체 등에 관한 것이다.

식경험이 풍부한 플라보노이드나 리그난을 비롯한 폴리페놀계의 식물 이차 대사 산물은, 항산화성으로 대표되는 기능성으로부터 기능성 소재로서 예로부터 주목받아, 건강 식품으로서 이미 판매되고 있다. 예컨대, 케르세틴(플라보노이드), OTPP(플라보노이드)나 세사민(리그난) 등은 건강 식품의 대표적인 소재이다.

식물 세포에 있어서의 플라보노이드의 생합성 경로는 예로부터 연구가 진행되고 있으며, 대사 경로를 촉매하는 생합성 효소 및 그것을 코딩하는 유전자에 대해서는 단리되어, 그 분자 기구의 이해가 진행되고 있다.

그 한편으로, 식물 이차 대사 산물이 체내(in vivo)에 받아들여진 후, 어떠한 형태로 대사되어 기능 발현하는지에 대한 지견은 부족하다.

일반적으로 식물의 이차 대사 산물의 글리코시드화는 당의 종류(글루코오스, 람노오스, 글루쿠론산, 갈락토오스 등)를 불문하고 UDP-당전이 효소(UGT: UDP-glycosyltransferase)라고 불리는 수퍼 패밀리에 속하는 효소에 의해 촉매되는 것이 알려져 있다. 또한, 세사민의 연구예에 있어서 이차 대사 산물은 체내에서는 카테콜체를 거쳐, 글루쿠론산 포합체로서 존재하는 것이 나타난 점에서, 이 글루쿠론산 포합체가 식물 이차 대사 산물의 체내에서의 기능 발현의 일단을 담당하고 있다고 생각되고 있다.

포유류에 있어서의 케르세틴 대사물로서 4종류의 모노글루쿠로나이드(Q-3-GlcA, Q-7-GlcA, Q-3'-GlcA, Q-4'-GlcA)가 존재하는 것이 확인되어 있으나(문헌 1; Day, AJ et al. Free Radic. Res. 35, 941-952, 2001, 문헌 2; Moon, JH. et al. Free Radical Biology & Medicine 30, 1274-1285, 2001, 문헌 3; O'Leary, KA. et al. Biochemical Pharmacology 65, 479-491, 2003, 문헌 4; van der Woude, H. et al. Chem Res Toxicol. 17, 1520-1530, 2004), 이들의 생체 내에서의 기능을 알기 위해서는 충분한 양의 화합물을 얻어 그 활성을 조사할 필요가 있다. 그러나, 지금까지 기질 특이성이 넓은 적당한 UDP-글루쿠론산 전이 효소는 알려져 있지 않고, 또한, 결합 위치 특이적인 반응 생성물을 화학 합성하는 것은 현실적으로 불가능하였다.

꿀풀과 황금화(Scutellaria baicalensis)의 뿌리는 황금이라고 불리며, 항산화성이 높은 플라본의 7위치 글루쿠론산 포합체가 축적되어 있는 것이 알려져 있으나, 식약 구분에서는 의약품으로 분류된다(문헌 5: Gao, Z. et al. Biochemica et Biophysica Acta 1472, 643-650, 1999). 지금까지 꿀풀과 황금화로부터 플라본의 7위치 글루쿠론산 전이 효소로서 Sb7GAT가 정제되어 있으나, 본 효소는 플라본 7위치 수산기의 오르토 위치에 수산기 등의 치환기를 갖는 플라본(바이칼레인, 스쿠텔라레인(scutellarein) 등)에만 활성을 나타내고, 주요한 플라본인 아피제닌이나 루테올린, 또한 플라보놀의 일종인 케르세틴에 대해서는 활성을 나타내지 않는다(문헌 6: Nagashima S. et al., Phytochemistry 53, 533-538, 2000). 또한, 이 Sb7GAT에 대응하는 유전자는 GenBank에 등록되어 있으나(수탁 No. AB042277), 그 기능에 대해서는 확인되어 있지 않다.

한편, 식경험이 있는 꿀풀과 차조기(Perilla frutescens a red-leaf variety)에는 황금보다도 다양한 플라본 7위치 글루쿠론산 포합체가 축적되어 있는 것이 알려져 있다(문헌 7: Yamazaki, M. et al. Phytochemistry 62, 987-998. 2003).

1. Day, AJ et al. Free Radic. Res. 35, 941-952, 2001 2. Moon, JH. et al. Free Radical Biology & Medicine 30, 1274-1285, 2001 3. O'Leary, KA. et al. Biochemical Pharmacology 65, 479-491, 2003 4. van der Woude, H. et al. Chem Res Toxicol. 17, 1520-1530, 2004 5. Gao, Z. et al. Biochemica et Biophysica Acta 1472, 643-650, 1999 6. Nagashima S. et al., Phytochemistry 53, 533-538, 2000 7. Yamazaki, M. et al. Phytochemistry 62, 987-998, 2003

이러한 상황하에서, 기질 특이성이 넓은, 새로운 UDP-글루쿠론산 전이 효소, 및 그것을 코딩하는 유전자를 동정(同定)하는 것이 요구되고 있었다.

본 발명은 상기 상황을 감안하여 이루어진 것으로, 하기에 나타내는, UDP-글루쿠론산 전이 효소, 그것을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 그것을 함유하는 벡터, 및 형질 전환체 등을 제공한다.

(1) 이하의 (a)∼(f) 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드:

(a) 서열 번호 4로 표시되는 염기 서열의 제1번째∼제1359번째의 염기 서열, 서열 번호 10으로 표시되는 염기 서열의 제1번째∼제1365번째의 염기 서열, 서열 번호 12로 표시되는 염기 서열의 제1번째∼제1371번째의 염기 서열, 및 서열 번호 22로 표시되는 염기 서열의 제1번째∼제1371번째의 염기 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 하나의 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드;

(b) 서열 번호 5, 11, 13 및 23으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드;

(c) 서열 번호 5, 11, 13 및 23으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나의 아미노산 서열에 있어서 1개∼15개의 아미노산이 결실(缺失), 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 UDP-글루쿠론산 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드;

(d) 서열 번호 5, 11, 13 및 23으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나의 아미노산 서열에 대하여, 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 가지며, 또한 UDP-글루쿠론산 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드;

(e) 서열 번호 4로 표시되는 염기 서열의 제1번째∼제1359번째의 염기 서열, 서열 번호 10으로 표시되는 염기 서열의 제1번째∼제1365번째의 염기 서열, 서열 번호 12로 표시되는 염기 서열의 제1번째∼제1371번째의 염기 서열, 및 서열 번호 22로 표시되는 염기 서열의 제1번째∼제1371번째의 염기 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 하나의 염기 서열과 상보적인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 엄격(stringent)한 조건하에서 하이브리드화하고, 또한 UDP-글루쿠론산 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드; 또는

(f) 서열 번호 5, 11, 13 및 23으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기 서열과 상보적인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에서 하이브리드화하고, 또한 UDP-글루쿠론산 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드.

(2) 이하의 (g)∼(j) 중 어느 하나인 상기 (1)에 기재된 폴리뉴클레오티드:

(g) 서열 번호 5, 11, 13 및 23으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나의 아미노산 서열에 있어서 10개 이하(0∼10개)의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 UDP-글루쿠론산 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드;

(h) 서열 번호 5, 11, 13 및 23으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나의 아미노산 서열에 대하여, 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 가지며, 또한 UDP-글루쿠론산 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드;

(i) 서열 번호 4로 표시되는 염기 서열의 제1번째∼제1359번째의 염기 서열, 서열 번호 10으로 표시되는 염기 서열의 제1번째∼제1365번째의 염기 서열, 서열 번호 12로 표시되는 염기 서열의 제1번째∼제1371번째의 염기 서열, 및 서열 번호 22로 표시되는 염기 서열의 제1번째∼제1371번째의 염기 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 하나의 염기 서열과 상보적인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 고엄격(high stringent) 조건하에서 하이브리드화하고, 또한 UDP-글루쿠론산 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드; 또는

(j) 서열 번호 5, 11, 13 및 23으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기 서열과 상보적인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 고엄격 조건하에서 하이브리드화하고, 또한 UDP-글루쿠론산 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드.

(3) 서열 번호 4로 표시되는 염기 서열의 제1번째∼제1359번째의 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 함유하는, 상기 (1)에 기재된 폴리뉴클레오티드.

(4) 서열 번호 10으로 표시되는 염기 서열의 제1번째∼제1365번째의 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 함유하는, 상기 (1)에 기재된 폴리뉴클레오티드.

(5) 서열 번호 12로 표시되는 염기 서열의 제1번째∼제1371번째의 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 함유하는, 상기 (1)에 기재된 폴리뉴클레오티드.

(6) 서열 번호 22로 표시되는 염기 서열의 제1번째∼제1371번째의 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 함유하는, 상기 (1)에 기재된 폴리뉴클레오티드.

(7) 서열 번호 5의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는, 상기 (1)에 기재된 폴리뉴클레오티드.

(8) 서열 번호 11의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는, 상기 (1)에 기재된 폴리뉴클레오티드.

(9) 서열 번호 13의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는, 상기 (1)에 기재된 폴리뉴클레오티드.

(10) 서열 번호 23의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는, 상기 (1)에 기재된 폴리뉴클레오티드.

(11) DNA인, 상기 (1) 내지 (10) 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드.

(12) 상기 (1) 내지 (11) 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 단백질.

(13) 상기 (1) 내지 (11) 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터.

(14) 상기 (1) 내지 (11) 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드가 도입된 형질 전환체.

(15) 상기 (13)에 기재된 벡터가 도입된 형질 전환체.

(16) 상기 (14) 또는 (15)에 기재된 형질 전환체를 이용하는 상기 (12)의 단백질의 제조 방법.

(17) 상기 (12)에 기재된 단백질을 촉매로 하여, UDP-글루쿠론산과 플라보노이드로부터 글루쿠론산 포합체를 생성하는, 글루쿠론산 포합체의 제조 방법.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 예컨대, 형질 전환체에 도입됨으로써, 새로운 UDP-글루쿠론산 전이 효소의 제조에 유용하다. 본 발명의 바람직한 형태의 UDP-글루쿠론산 전이 효소는, 기질 특이성이 넓고, 다양한 당수용체 기질을 글루쿠론산화하는 활성을 갖는다.

도 1은 금어초(Antirrhinum majus) 유래 AmUGTcg10, 야쿠시마 골무꽃(Scutellaria laeteviolacea v. yakusimensis) 유래 SlUGT, 및 차조기(Perilla frutescens a red-leaf variety) 유래 PfUGT50, 및 황금화(Scutellaria baicalensis) 유래의 Sb7GAT의 아미노산 서열의 얼라이먼트이다.
도 2는 PfUGT50의 당수용체 기질의 기질 특이성을 해석한 결과를 도시하는 도면이다.
도 3은 SlUGT의 당수용체 기질의 기질 특이성을 해석한 결과를 도시하는 도면이다.
도 4는 AmUGTcg10의 당수용체 기질의 기질 특이성을 해석한 결과를 도시하는 도면이다.
도 5는 SiUGT23의 당수용체 기질의 기질 특이성을 해석한 결과를 도시하는 도면이다.
도 6은 SlUGT와 SC1의 반응액 중의 생성물에 대한 LC-MS 분석 결과의 도면이다. 도면 중의 화살표는 생성물을 나타낸다.
도 7은 SC1과 SlUGT1의 반응 생성물의 MS 분석 결과의 도면이다.
도 8은 케르세틴과 SlUGT1의 반응 생성물의 LC 분석 결과의 도면이다.
[서열표 프리텍스트]
서열 번호 1: 합성 DNA
서열 번호 2: 합성 DNA
서열 번호 6: 합성 DNA
서열 번호 7: 합성 DNA
서열 번호 8: 합성 DNA
서열 번호 9: 합성 DNA
서열 번호 14: 합성 DNA
서열 번호 15: 합성 DNA
서열 번호 16: 합성 DNA
서열 번호 17: 합성 DNA
서열 번호 18: 합성 DNA
서열 번호 19: 합성 DNA
서열 번호 20: 합성 DNA
서열 번호 21: 합성 DNA
서열 번호 24: 합성 DNA
서열 번호 25: 합성 DNA

이하에, 본 발명의 UDP-글루쿠론산 전이 효소, 그것을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 그것을 함유하는 벡터, 형질 전환체 등을 상세히 설명한다.

1. 본 발명의 폴리뉴클레오티드

먼저, 본 발명은, (a) 서열 번호 4로 표시되는 염기 서열의 제1번째∼제1359번째의 염기 서열, 서열 번호 10으로 표시되는 염기 서열의 제1번째∼제1365번째의 염기 서열, 서열 번호 12로 표시되는 염기 서열의 제1번째∼제1371번째의 염기 서열, 및 서열 번호 22로 표시되는 염기 서열의 제1번째∼제1371번째의 염기 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 하나의 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드(구체적으로는, DNA, 이하, 이들을 간단히 「DNA」라고도 칭함); 및 (b) 서열 번호 5, 11, 13 및 23으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명에서 대상으로 하는 DNA는, 상기한 UDP-글루쿠론산 전이 효소를 코딩하는 DNA에 한정되는 것은 아니며, 이 단백질과 기능적으로 동등한 단백질을 코딩하는 다른 DNA를 포함한다. 기능적으로 동등한 단백질로서는, 예컨대, (c) 서열 번호 5, 11, 13 및 23으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나의 아미노산 서열에 있어서 1개∼15개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 UDP-글루쿠론산 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 들 수 있다. 이러한 단백질로서는, 서열 번호 5, 11, 13 및 23으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나의 아미노산 서열에 있어서, 예컨대, 1개∼15개, 1개∼14개, 1개∼13개, 1개∼12개, 1개∼11개, 1개∼10개, 1개∼9개, 1개∼8개, 1개∼7개, 1개∼6개(1개∼수개), 1개∼5개, 1개∼4개, 1개∼3개, 1개∼2개, 1개의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 UDP-글루쿠론산 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 들 수 있다. 상기 아미노산 잔기의 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가의 수는, 일반적으로는 작을수록 바람직하다. 또한, 이러한 단백질로서는, 서열 번호 5, 11, 13 및 23으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나의 아미노산 서열에 대하여, 약 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.1% 이상, 99.2% 이상, 99.3% 이상, 99.4% 이상, 99.5% 이상, 99.6% 이상, 99.7% 이상, 99.8% 이상, 99.9% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 가지며, 또한 UDP-글루쿠론산 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 들 수 있다. 상기 상동성의 수치는 일반적으로 클수록 바람직하다.

여기서, 「UDP-글루쿠론산 전이 효소 활성」이란, 플라보노이드, 스틸벤 및 리그난 등의 수산기를 글루쿠론산화하여(예컨대 플라본을 그 7위치의 수산기로 글루쿠론산화하여), 글루쿠론산 포합체를 발생시키는 반응을 촉매하는 활성을 말한다.

UDP-글루쿠론산 전이 효소 활성은, 예컨대, UDP-글루쿠론산과 당수용체 기질(예컨대, 플라본)을 평가 대상이 되는 효소의 존재하에서 반응시키고, 얻어지는 반응물을 HPLC 등으로 분석함으로써 측정할 수 있다(보다 구체적으로는, 후술하는 실시예의 기재를 참조).

또한, 본 발명은, (e) 서열 번호 4로 표시되는 염기 서열의 제1번째∼제1359번째의 염기 서열, 서열 번호 10으로 표시되는 염기 서열의 제1번째∼제1365번째의 염기 서열, 서열 번호 12로 표시되는 염기 서열의 제1번째∼제1371번째의 염기 서열, 및 서열 번호 22로 표시되는 염기 서열의 제1번째∼제1371번째의 염기 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 하나의 염기 서열과 상보적인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에서 하이브리드화하고, 또한 UDP-글루쿠론산 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드; 및 (f) 서열 번호 5, 11, 13 및 23으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기 서열과 상보적인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에서 하이브리드화하고, 또한 UDP-글루쿠론산 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드도 포함한다.

본 명세서 중, 「폴리뉴클레오티드」란, DNA 또는 RNA를 의미한다.

본 명세서 중, 「엄격한 조건하에서 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드」란, 예컨대, 서열 번호 4로 표시되는 염기 서열의 제1번째∼제1359번째의 염기 서열, 서열 번호 10으로 표시되는 염기 서열의 제1번째∼제1365번째의 염기 서열, 서열 번호 12로 표시되는 염기 서열의 제1번째∼제1371번째의 염기 서열, 및 서열 번호 22로 표시되는 염기 서열의 제1번째∼제1371번째의 염기 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 하나의 염기 서열과 상보적인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 또는 서열 번호 5, 11, 13 및 23으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기 서열과 상보적인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부를 프로브로 하여, 콜로니 하이브리드화법, 플라크 하이브리드화법(plaque hybridization method), 또는 서던 하이브리드화법(southern hybridization method) 등을 이용함으로써 얻어지는 폴리뉴클레오티드를 말한다. 하이브리드화의 방법으로서는, 예컨대 "Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol.3, Cold Spring Harbor, Laboratory Press 2001", "Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997" 등에 기재되어 있는 방법을 이용할 수 있다.

본 명세서 중, 「엄격한 조건」이란, 저엄격 조건, 중엄격 조건 및 고엄격 조건의 어느 것이라도 좋다. 「저엄격 조건」은, 예컨대, 5×SSC, 5×덴하르트 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아미드, 32℃의 조건이다. 또한, 「중엄격 조건」은, 예컨대, 5×SSC, 5×덴하르트 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아미드, 42℃의 조건이다. 「고엄격 조건」은, 예컨대, 5×SSC, 5×덴하르트 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아미드, 50℃의 조건이다. 이들 조건에 있어서, 온도를 올릴수록 높은 상동성을 갖는 DNA가 효율적으로 얻어지는 것을 기대할 수 있다. 단, 하이브리드화의 엄격도(stringency)에 영향을 주는 요소로서는 온도, 프로브 농도, 프로브의 길이, 이온 강도, 시간, 염 농도 등 복수의 요소가 생각되고, 당업자라면 이들 요소를 적절하게 선택함으로써 동일한 엄격도를 실현하는 것이 가능하다.

또, 하이브리드화에 시판의 키트를 이용하는 경우에는, 예컨대 Alkphos Direct Labelling Reagents(아머샴 파마시아사 제조)를 이용할 수 있다. 이 경우에는, 키트에 첨부된 프로토콜에 따라, 표지(標識)된 프로브와의 인큐베이션을 하룻밤 행한 후, 멤브레인을 55℃의 조건하에서 0.1%(w/v) SDS를 포함하는 1차 세정 버퍼로 세정한 후, 하이브리드화된 DNA를 검출할 수 있다.

상기 이외에 하이브리드화 가능한 폴리뉴클레오티드로서는, FASTA, BLAST 등의 상동성 검색 소프트웨어에 의해, 디폴트 파라미터를 이용하여 계산했을 때에, 서열 번호 4로 표시되는 염기 서열의 제1번째∼제1359번째의 염기 서열, 서열 번호 10으로 표시되는 염기 서열의 제1번째∼제1365번째의 염기 서열, 서열 번호 12로 표시되는 염기 서열의 제1번째∼제1371번째의 염기 서열, 및 서열 번호 22로 표시되는 염기 서열의 제1번째∼제1371번째의 염기 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 하나의 염기 서열, 또는 서열 번호 5, 11, 13 및 23으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA와 약 60% 이상, 약 70% 이상, 71% 이상, 72% 이상, 73% 이상, 74% 이상, 75% 이상, 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 79% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.1% 이상, 99.2% 이상, 99.3% 이상, 99.4% 이상, 99.5% 이상, 99.6% 이상, 99.7% 이상, 99.8% 이상, 또는 99.9% 이상의 상동성을 갖는 DNA를 들 수 있다.

또, 아미노산 서열이나 염기 서열의 상동성은, Karlin 및 Altschul에 의한 알고리즘 BLAST(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 2264-2268, 1990; Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993)를 이용하여 결정할 수 있다. BLAST의 알고리즘에 기초한 BLASTN이나 BLASTX라고 불리는 프로그램이 개발되어 있다(Altschul SF, et al.: J Mol Biol 215: 403, 1990). BLASTN을 이용하여 염기 서열을 해석하는 경우에는, 파라미터는, 예컨대 score=100, wordlength=12로 한다. 또한, BLASTX를 이용하여 아미노산 서열을 해석하는 경우에는, 파라미터는, 예컨대 score=50, wordlength=3으로 한다. BLAST와 Gapped BLAST 프로그램을 이용하는 경우에는, 각 프로그램의 디폴트 파라미터를 이용한다.

상기한 본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 공지되어 있는 유전자 공학적 수법 또는 공지되어 있는 합성 수법에 의해 취득하는 것이 가능하다.

2. 본 발명의 단백질

본 발명은, 또 다른 실시형태에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 (a)∼(f) 중 어느 하나에 코딩되는 단백질도 제공한다. 본 발명의 바람직한 단백질은, 서열 번호 5, 11, 13 및 23으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나의 아미노산 서열에 있어서 1개∼15개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 UDP-글루쿠론산 전이 효소 활성을 갖는 단백질이다. 이러한 단백질로서는, 서열 번호 5, 11, 13 및 23으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나의 아미노산 서열에 있어서, 상기한 바와 같은 수의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 UDP-글루쿠론산 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 들 수 있다. 또한, 이러한 단백질로서는, 서열 번호 5, 11, 13 및 23으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나의 아미노산 서열과 상기한 바와 같은 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖고, 또한 UDP-글루쿠론산 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 들 수 있다. 이러한 단백질은, "Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol.3, Cold Spring Harbor, Laboratory Press 2001", "Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997", "Nuc. Acids. Res., 10, 6487(1982)", "Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409(1982)", "Gene, 34, 315(1985)", "Nuc. Acids. Res., 13, 4431(1985)", "Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488(1985)" 등에 기재된 부위 특이적 변이 도입법을 이용하여, 취득할 수 있다.

본 발명의 단백질의 아미노산 서열에 있어서 1 이상의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가되었다고 하는 것은, 동일 서열 중의 임의이며 또한 1 또는 복수의 아미노산 서열 중의 위치에 있어서, 1 또는 복수의 아미노산 잔기의 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가가 있는 것을 의미하고, 결실, 치환, 삽입 및 부가 중 2종 이상이 동시에 발생해도 좋다.

이하에, 서로 치환 가능한 아미노산 잔기의 예를 나타낸다. 동일군에 포함되는 아미노산 잔기는 서로 치환 가능하다. A군: 류신, 이소류신, 노르류신, 발린, 노르발린, 알라닌, 2-아미노부탄산, 메티오닌, o-메틸세린, t-부틸글리신, t-부틸알라닌, 시클로헥실알라닌; B군: 아스파라긴산, 글루타민산, 이소아스파라긴산, 이소글루타민산, 2-아미노아디프산, 2-아미노수베린산; C군: 아스파라긴, 글루타민; D군: 리신, 아르기닌, 오르니틴, 2,4-디아미노부탄산, 2,3-디아미노프로피온산; E군: 프롤린, 3-히드록시프롤린, 4-히드록시프롤린; F군: 세린, 트레오닌, 호모세린; G군: 페닐알라닌, 티로신.

또한, 본 발명의 단백질은, Fmoc법(플루오레닐메틸옥시카르보닐법), tBoc법(t-부틸옥시카르보닐법) 등의 화학 합성법에 의해서도 제조할 수 있다. 또한, 어드밴스드 켐텍사 제조, 퍼킨엘머사 제조, 파마시아사 제조, 프로테인테크놀로지 인스트루먼트사 제조, 신세셀베가사 제조, 퍼셉티브사 제조, 시마즈 세이사쿠쇼 등의 펩티드 합성기를 이용하여 화학 합성할 수도 있다.

여기서, 본 발명의 단백질은, UDP-글루쿠론산 전이 효소이다. 「UDP-글루쿠론산 전이 효소」는, UDP-글루쿠론산을 당공여체로 해서 당수용체 기질에 글루쿠론산 잔기를 전이하여, 글루쿠론산 포합체와 UDP를 발생시키는 반응을 촉매한다. 본 발명에 있어서, 당수용체 기질은, 예컨대 플라보노이드, 스틸벤, 및 리그난이다.

플라보노이드에는, 플라본, 플라보놀, 플라바논, 이소플라본, 플라본 C 배당체, 올론, 및 카테킨 등이 포함된다. 이 중, 플라본으로서는, 예컨대, 바이칼레인, 스쿠텔라레인, 아피제닌, 루테올린, 트리세틴, 디오스메틴, 및 크리소에리올을 들 수 있다. 플라보놀로서는, 예컨대, 케르세틴, 미리세틴, 및 캠페롤을 들 수 있다. 플라바논으로서는, 예컨대, 나린제닌을 들 수 있다. 이소플라본으로서는, 예컨대, 제니스테인, 다이드제인 및 포르모노네틴을 들 수 있다. 플라본 C 배당체로서는, 예컨대, 비텍신, 이소비텍신 및 오리엔틴을 들 수 있다. 올론으로서는, 예컨대, 아우레우시딘(아우레우시딘)을 들 수 있다. 카테킨으로서는, 예컨대, 카테킨 및 에피갈로카테킨 갈레이트를 들 수 있다.

스틸벤에는, 레스베라트롤(resveratrol) 및 그의 글리코시드의 피세이드(piceid) 등이 포함된다.

리그난에는, (+)-피노레시놀((+)-Pinoresinol), (+)-피페리톨((+)-Piperitol), (+)-세사미놀((+)-Sesaminol), (+)-세코이소라리시레시놀((+)-Secoisolariciresinol), (+)-세사민 카테콜 1((+)-Sesamim catecol 1)(SC1), (+)-세사민 카테콜 2((+)-Sesamim catecol 2)(SC2), (+)-에피세사민카테콜 2((+)-Episesamim catecol 2)(EC2), 및 마타이레시놀(matairesinol) 등이 포함된다.

그리고, 예컨대, 서열 번호 5의 아미노산 서열을 갖는 UDP-글루쿠론산 전이 효소(PfUGT50)는, 당수용체 기질이, 바이칼레인, 아피제닌, 스쿠텔라레인, 루테올린, 트리세틴, 디오스메틴, 크리소에리올, 케르세틴, 미리세틴, 캠페롤, 나린제닌, 및 아우레우시딘 등의 플라보노이드일 때, 레스베라트롤 등의 스틸벤일 때, 및 SC1 등의 리그난일 때에 활성을 나타내고, 특히, 바이칼레인, 아피제닌, 스쿠텔라레인, 루테올린, 트리세틴, 디오스메틴, 크리소에리올, 케르세틴, 및 아우레우시딘일 때에 다른 당수용체 기질과 비교하여 강한 활성을 나타낸다.

서열 번호 11의 아미노산 서열을 갖는 UDP-글루쿠론산 전이 효소(SlUGT)는, 당수용체 기질이, 바이칼레인, 아피제닌, 스쿠텔라레인, 루테올린, 트리세틴, 디오스메틴, 크리소에리올, 케르세틴, 캠페롤, 나린제닌, 제니스테인, 다이드제인, 포르모노네틴, 및 미리세틴 등의 플라보노이드, 에스큘레틴(에스쿨레틴) 등의 쿠마린일 때, 레스베라트롤 등의 스틸벤일 때, 및 SC1, SC2, 및 EC2 등의 리그난일 때에 활성을 나타내고, 특히, 바이칼레인 및 아피제닌일 때에 다른 당수용체 기질과 비교하여 강한 활성을 나타낸다.

서열 번호 13의 아미노산 서열을 갖는 UDP-글루쿠론산 전이 효소(AmUGTcg10)는, 당수용체 기질이, 바이칼레인, 아피제닌, 스쿠텔라레인, 루테올린, 트리세틴, 디오스메틴, 크리소에리올, 케르세틴, 캠페롤, 나린제닌, 및 아우레우시딘 등의 플라보노이드일 때, 및 레스베라트롤 등의 스틸벤일 때에 활성을 나타내고, 특히, 바이칼레인, 아피제닌, 스쿠텔라레인, 루테올린, 트리세틴, 디오스메틴, 크리소에리올, 캠페롤, 및 나린제닌 등의 플라보노이드일 때에 다른 당수용체 기질과 비교하여 강한 활성을 나타낸다.

서열 번호 23의 아미노산 서열을 갖는 UDP-글루쿠론산 전이 효소(SiUGT23)는, 당수용체 기질이, 바이칼레인, 아피제닌, 스쿠텔라레인, 루테올린, 트리세틴, 디오스메틴, 크리소에리올, 이소비텍신, 케르세틴, 캠페롤, 나린제닌, 아우레우시딘, 포르모노네틴 등의 플라보노이드일 때, 에스큘레틴 등의 쿠마린일 때, 레스베라트롤 등의 스틸벤일 때, 및 SC1 등의 리그난일 때에 활성을 나타내고, 특히, 바이칼레인, 스쿠텔라레인, 루테올린, 트리세틴, 캠페롤, 및 아우레우시딘 등의 플라보노이드일 때에 다른 당수용체 기질과 비교하여 강한 활성을 나타낸다.

3. 벡터 및 이것을 도입한 형질 전환체

본 발명은 또한, 다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터를 제공한다. 본 발명의 발현 벡터는, 상기 (a)∼(f) 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드를 함유한다. 바람직하게는, 본 발명의 발현 벡터는, (g)∼(j) 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드를 함유한다. 더 바람직하게는, 본 발명의 발현 벡터는, 서열 번호 4로 표시되는 염기 서열의 제1번째∼제1359번째의 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 10으로 표시되는 염기 서열의 제1번째∼제1365번째의 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 12로 표시되는 염기 서열의 제1번째∼제1371번째의 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 및 서열 번호 22로 표시되는 염기 서열의 제1번째∼제1371번째의 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 군에서 선택되는 하나의 폴리뉴클레오티드, 또는, 서열 번호 5의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 11의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 13의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열 번호 23의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 군에서 선택되는 하나의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드를 함유한다.

본 발명의 벡터는, 통상, (ⅰ) 숙주 세포 내에서 전사 가능한 프로모터; (ⅱ) 이 프로모터에 결합된, 상기 (a)∼(j) 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드; 및 (ⅲ) RNA 분자의 전사 종결 및 폴리아데닐화에 관하여, 숙주 세포 내에서 기능하는 시그널을 구성 요소로서 포함하는 발현 카세트를 포함하도록 구성된다. 이와 같이 구축되는 벡터는, 숙주 세포에 도입된다. 발현 벡터의 제작 방법으로서는, 플라스미드, 파지, 또는 코스미드 등을 이용하는 방법을 들 수 있으나 특별히 한정되지 않는다.

벡터의 구체적인 종류는 특별히 한정되지 않고, 숙주 세포 내에서 발현 가능한 벡터가 적절하게 선택될 수 있다. 즉, 숙주 세포의 종류에 따라, 확실하게 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 발현시키기 위해서 적절하게 프로모터 서열을 선택하고, 이것과 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 각종 플라스미드 등에 편입시킨 벡터를 발현 벡터로서 이용하면 된다.

본 발명의 발현 벡터는, 도입되어야 할 숙주의 종류에 의존하여, 발현 제어 영역(예컨대, 프로모터, 터미네이터, 및/또는 복제 기점 등)을 함유한다. 세균용 발현 벡터의 프로모터로서는, 관용적인 프로모터(예컨대, trc 프로모터, tac 프로모터, lac 프로모터 등)가 사용되고, 효모용 프로모터로서는, 예컨대, 글리세르알데히드 3인산 데히드로게나아제 프로모터, PH05 프로모터 등을 들 수 있으며, 사상균용 프로모터로서는, 예컨대, 아밀라아제, trpC 등을 들 수 있다. 또한 동물 세포 숙주용 프로모터로서는, 바이러스성 프로모터(예컨대, SV40 초기 프로모터, SV40 후기 프로모터 등)를 들 수 있다.

발현 벡터는, 적어도 하나의 선택 마커를 포함하는 것이 바람직하다. 이러한 마커로서는, 영양 요구성 마커(ura5, niaD), 약제 내성 마커(hygromy cine, 제오신), 제네티신 내성 유전자(G418r), 구리 내성 유전자(CUP1)(Marin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 337, 1984), 세룰레닌 내성 유전자(fas2m, PDR4)(각각 이노코시 쥰지 등, 생화학, 64, 660, 1992; Hussain et al., gene, 101, 149, 1991) 등이 이용 가능하다.

또한, 본 발명은, 상기 (a)∼(j) 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드가 도입된 형질 전환체를 제공한다.

형질 전환체의 제작 방법(생산 방법)은 특별히 한정되지 않으나, 예컨대, 상술한 재조합 벡터를 숙주에 도입하여 형질 전환하는 방법을 들 수 있다. 여기서 이용되는 숙주 세포는, 특별히 한정되는 것은 아니며, 종래 공지되어 있는 각종 세포를 적합하게 이용할 수 있다. 구체적으로는, 예컨대, 대장균(Escherichia coli) 등의 세균, 효모(출아 효모 Saccharomyces cerevisiae, 분열 효모 Schizosaccharomyces pombe), 선충(Caenorhabditis elegans), 아프리카 발톱 개구리(Xenopus laevis)의 난모 세포 등을 들 수 있다. 상기한 숙주 세포를 위한 적절한 배양 배지 및 조건은 당분야에서 주지이다. 또한, 형질 전환의 대상이 되는 생물도 특별히 한정되는 것은 아니며, 상기 숙주 세포로 예시한 각종 미생물, 식물 또는 동물을 들 수 있다.

숙주 세포의 형질 전환 방법으로서는 일반적으로 이용되는 공지되어 있는 방법을 이용할 수 있다. 예컨대, 전기천공법(Mackenxie D. A. et al. Appl. Environ. Microbiol., 66, 4655-4661, 2000), 입자 전달법(일본 특허 공개 제2005-287403 「지질 생산균의 육종 방법」에 기재된 방법), 스페로플라스트법(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, p1929(1978)), 아세트산리튬법(J. Bacteriology, 153, p163(1983)), 문헌 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, p1929(1978) 및 문헌 Methods in yeast genetics, 2000 Edition: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual 등에 기재된 방법으로 실시할 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다.

4. 본 발명의 단백질의 제조 방법

본 발명은 또한, 다른 실시형태에 있어서, 상기한 형질 전환체를 이용하는 본 발명의 단백질의 제조 방법을 제공한다.

구체적으로는, 상기 형질 전환체의 배양물로부터, 본 발명의 단백질을 분리·정제함으로써, 본 발명의 단백질을 얻을 수 있다. 여기서, 배양물이란, 배양액, 배양 균체 또는 배양 세포, 또는 배양 균체 또는 배양 세포의 파쇄물을 모두 의미한다. 본 발명의 단백질의 분리·정제는, 통상의 방법에 따라 행할 수 있다.

구체적으로는, 본 발명의 단백질이 배양 균체 내 또는 배양 세포 내에 축적되는 경우에는, 배양 후, 통상적인 방법(예컨대, 초음파, 리소자임, 동결 융해 등)으로 균체 또는 세포를 파쇄한 후, 통상적인 방법(예컨대, 원심 분리, 여과 등)에 의해 본 발명의 단백질의 조추출액(粗抽出液)을 얻을 수 있다. 본 발명의 단백질이 배양액 중에 축적되는 경우에는, 배양 종료 후, 통상적인 방법(예컨대, 원심 분리, 여과 등)에 의해 균체 또는 세포와 배양 상청을 분리함으로써, 본 발명의 단백질을 포함하는 배양 상청을 얻을 수 있다.

이렇게 하여 얻어진 추출액 또는 배양 상청 중에 포함되는 본 발명의 단백질의 정제는, 통상의 분리·정제 방법에 따라 행할 수 있다. 분리·정제 방법으로서는, 예컨대, 황산암모늄 침전, 겔 여과 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피, 역상 고속 액체 크로마토그래피, 투석법, 한외 여과법 등을 단독으로, 또는 적절하게 조합하여 이용할 수 있다.

5. 글루쿠론산 포합체의 제조 방법

또한, 본 발명은, 본 발명의 단백질을 이용하여 글루쿠론산 포합체를 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명의 단백질은, 당수용체 기질(예컨대, 플라보노이드, 스틸벤, 또는 리그난)에 UDP-글루쿠론산으로부터 글루쿠론산을 전이하는 반응을 촉매하기 때문에, 본 발명의 단백질을 이용함으로써, 당수용체 기질 및 UDP-글루쿠론산을 원료로 하여, 글루쿠론산 포합체를 제조할 수 있다. 당수용체 기질은, 바람직하게는, 플라보노이드이다.

예컨대, 1 mM의 당수용체 기질, 2 mM의 UDP-글루쿠론산, 50 mM의 인산칼슘 버퍼(pH7.5), 및 20 μM의 본 발명의 단백질을 포함하는 용액을 조제하고, 30℃에서 30분간 반응시킴으로써, 글루쿠론산 포합체를 제조할 수 있다. 이 용액으로부터, 글루쿠론산 포합체는, 공지되어 있는 방법에 의해 분리·정제할 수 있다. 구체적으로는, 예컨대, 황산암모늄 침전, 겔 여과 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피, 역상 고속 액체 크로마토그래피, 투석법, 한외 여과법 등을 단독으로, 또는 적절하게 조합하여 이용할 수 있다.

이렇게 하여 얻어지는 글루쿠론산 포합체는, 그 생체 내에서의 기능을 조사하기 위한 시약이나, 항산화제 등으로서 유용하다(Gao, Z., Huang, K., Yang, X., and Xu, H. (1999) Biochimica et Biophysica Acta 1472, 643-650).

본 발명은, 이하의 실시예에 의해 더 상세히 설명되지만, 이들에 한정되어서는 안 된다.

실시예 1

1. 실시예 1의 개요

본 실시예에서는, 꿀풀과 야쿠시마 골무꽃으로부터 PCR에 의해 Sb7GAT 호모로그 유전자(SlUGT)를 클로닝하고, 이 유전자를 프로브로 하여 플라보노이드의 7위치 글루쿠론산 포합체를 축적하는 꿀풀과 차조기의 잎 유래 cDNA 라이브러리로부터 플라보노이드의 7위치 글루쿠론산 전이 효소의 단리를 시도하였다.

스크리닝의 결과, 차조기 유래 글리코시드화 효소(PfUGT) 중에 플라본의 7위치의 수산기에 대하여 글루쿠론산을 전이하는 활성을 갖는 PfUGT50을 동정(同定)하였다. 이 PfUGT50은 바이칼레인, 스쿠텔라레인, 아피제닌, 루테올린 등의 플라본류뿐만 아니라, 플라보놀인 케르세틴에 대해서도 글루쿠론산 전이 활성을 갖고 있었다. 따라서, PfUGT50을 이용함으로써 플라본을 포함하는 다양한 플라보노이드의 7위치를 시험관 내(in vitro)에서 글루쿠론산화할 수 있게 된다.

또한 스크리닝 프로브로서 단리한 야쿠시마 골무꽃 유래의 SlUGT에 대해서도 다양한 플라보노이드에 대하여 글루쿠론산 전이 활성을 나타내었다. 또한, 현삼과 금어초에 대해서도, PfUGT50 및 SlUGT와 상동성이 높은 UGT(UDP- glucuronosyltransferase)를 탐색하고, 금어초 유래의 UGT인 AmUGTcg10을 동정하였다. 대장균 발현시킨 AmUGTcg10 단백질은 아피제닌, 케르세틴, 나린제닌에 대하여 글루쿠론산 전이 활성을 나타내었다. 따라서 구조적으로 유사한 상기한 차조기 PfUGT50, 골무꽃 SlUGT 및 금어초 AmUGTcg10은 플라보노이드의 7위치 글루쿠론산 전이 활성을 갖는 효소인 것이 나타났다.

2. 차조기 cDNA 라이브러리로부터의 글리코시드화 효소 유전자의 단리

(1) 프로브의 조정

본 실시예에 있어서 이용하는 분자 생물학적 수법은, 다른 곳에서 상세히 기술하지 않는 한, Molecular Cloning(Sambrook 등, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 2001)에 기재된 방법에 따랐다.

RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)를 사용하여, 야쿠시마 골무꽃의 뿌리로부터 총 RNA를 추출한 후, SuperScript^TM First-Strand Synthesis System for RT-PCR(Invitrogen사)을 제조업자가 장려하는 조건에 따라 사용하여, 총 RNA 1 ㎍으로부터 cDNA를 합성하였다. 황금화의 Sb7GAT의 서열(GenBank 수탁 No. AB042277)을 기초로 프라이머-Fw(서열 번호 1)와 프라이머-Rv(서열 번호 2)를 설계하고, 이것을 이용하여 야쿠시마 골무꽃 cDNA를 주형으로 PCR을 행하였다.

서열 번호 1: SlUGT-Fw: 5'-AAACATATGGCGGTGCTGGCGAAGTTC-3'(밑줄은 NdeI 사이트)

서열 번호 2: SlUGT-Rv: 5'-TTTTGATCATTAATCCCGAGTGGCGTGAAG-3'(밑줄은 BclI 사이트)

구체적으로는 PCR 반응액(50 ㎕)은, 야쿠시마 골무꽃(Scutellaria laeteviolacea v. yakusimensis) cDNA 1 ㎕, 1×Taq 버퍼(TaKaRa), 0.2 mM dNTPs, 프라이머(서열 번호 1 및 2) 각 0.4 pmol/㎕, rTaq 폴리머라제 2.5 U로 이루어진다. PCR 반응은 94℃에서 3분간 반응시킨 후, 94℃에서 1분간, 53℃에서 1분간, 72℃에서 2분간의 반응을 30사이클의 증폭으로 행하였다.

증폭한 단편을 pCR-TOPOII 벡터(Invitrogen)의 멀티 클로닝 사이트에 삽입하고, 삽입 단편의 염기 서열은 DNA Sequencer model 3100(Applied Biosystems)을 사용하여, 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하는 프라이머 워킹법(primer walking method)에 의해 염기 서열을 결정하였다. 얻어진 염기 서열을 CLUSTAL-W 프로그램(MACVECTOR 7.2.2 소프트웨어, Accerly사)으로 해석한 결과, 황금화와 높은 상동성을 갖는 야쿠시마 골무꽃 UGT의 부분 서열이 얻어진 것이 확인되었다(서열 번호 3). 이 야쿠시마 골무꽃 유래 UGT를 SlUGT 부분 서열로 하여 스크리닝 프로브의 주형으로 하였다.

비방사성 동위 원소 DIG-핵산 검출 시스템(로슈사)을, 제조자가 장려하는 PCR 조건에 따라 사용하여, RT-PCR에 의해 얻어진 프래그먼트에 DIG 표지를 도입하였다. 구체적으로는 PCR 반응액(50 ㎕)은, 각 cDNA 1 ㎕, 1×Taq 버퍼(TaKaRa), 0.2 mM dNTPs, 프라이머(서열 번호 1 및 2) 각 0.4 pmol/㎕, rTaq 폴리머라제 2.5 U로 이루어진다. PCR 반응은 94℃에서 5분간 반응시킨 후, 94℃에서 1분간, 53℃에서 1분간, 72℃에서 2분간의 반응을 30사이클의 증폭으로 행하였다. 아가로오스 전기 영동에 의해 SlUGT 단편이 라벨 표지되어 있는 것을 확인하고, 이 DIG 표지화 프래그먼트를, 하이브리드화용 프로브로서 이하의 실험에 이용하였다.

(2) 하이브리드화

비방사성 동위 원소 DIG-핵산 검출 시스템(로슈사)을 제조자가 장려하는 방법에 따라 사용하고, 차조기(품종: 적축면 차조기)의 잎 유래 cDNA 라이브러리(Yonekura-Sakakibara, K. et al., Plant Cell Physiol. 41, 495-502. 2000)를, 전술한 SlUGT 프로브를 이용하여 스크리닝하였다.

하이브리드화 완충액(5×SSC, 30% 포름아미드, 50 mM 인산나트륨 완충액(pH7.0), 1% SDS, 2% 블로킹 시약(로슈사), 0.1% 라우로일 사르코신(lauroyl sarcosine), 80 g/㎖ 연어 정자 DNA)을 이용하여 40℃에서 1시간 프리하이브리드화를 행한 후, 변성한 프로브를 첨가하고, 또한 하룻밤 인큐베이트하였다. 멤브레인을, 1% SDS를 포함하는 4×SSC 세정액 중에서 58℃에서 30분간 세정하였다. 약 1×10⁶ pfu의 플라크를 스크리닝하여, 약 300개의 양성 클론을 얻었다.

(3) 유전자 동정

양성 클론을 2차 스크리닝에 의해 싱글 플라크화하고, M13RV 및 M13M4(-20)의 프라이머쌍을 이용하여, 삽입물 단편을 증폭하며, 삽입 부분의 DNA 서열을 결정하였다. 얻어진 DNA 서열에 기초하여 얻은 추정의 아미노산 서열을 이용하여 Blast x에 의한 데이터베이스 검색한 결과, SlUGT 및 Sb7GAT와 높은 상동성을 나타내는 차조기 UGT(PfUGT50)를 얻었다(서열 번호 4, 5).

얻어진 완전 길이의 PfUGT50과 SlUGT 및 Sb7GAT를 CLUSTAL-W 프로그램(MACVECTOR 7.2.2 소프트웨어, Accerly사)으로 해석한 결과, SlUGT 및 Sb7GAT는 모두 5' 영역이 결손되어 있는 불완전 ORF(Open Reading Frame)인 것이 강하게 시사되었다. 그래서, Gene Racer kit(Invitrogen사)를 제조업자가 장려하는 방법에 따라 Rapid Amplification of cDNA End(이하, RACE)를 행하여, SlUGT의 5' 및 3' 영역을 증폭하였다. RACE에는 이하에 나타내는 각 SlUGT 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 이용하였다(서열 번호 6∼9).

서열 번호 6: GR-SlUGT-Rv: 5'-TGG GAG GCA AAC CAG GGA TCT CGA CAA

서열 번호 7: SlUGT-nest-Rv: 5'-AAT CAT CCA AAT CTT TAA GGT

서열 번호 8: GR-SlUGT-Fw: 5'-AGA AGG GGT GTG TTC TCC GCT GAG CAA

서열 번호 9: SlUGT-nest-Fw: 5'-GAA CAG CGG TCA CAG ATT TCT

각 증폭 산물에 대해서, 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하는 프라이머 워킹법에 의해 염기 서열을 결정하고, 완전 길이 ORF를 포함하는 SlUGT 유전자 및 아미노산 서열을 얻었다(서열 번호 10, 11).

차조기 및 야쿠시마 골무꽃에 더하여, 현삼과 금어초(Antirrhinum majus)에 있어서도 플라본의 일종인 아피제닌 7위치 글루쿠론산 포합체가 보고되어 있다(Harborne, J. B. Phytochemistry 2, 327-334. 1963). 이전에 단리하고 있던 서열 번호 12 및 13으로 표시되는 기능 미지의 금어초 글리코시드화 효소, AmUGTcg10이 본 실시예에서 단리한 PfUGT50 및 SlUGT와 높은 상동성을 나타내기 때문에, AmUGTcg10도 효소 해석의 후보 유전자로 하였다(Ono, E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103, 11075-11080. 2006).

상기에서 취득한 금어초 유래 AmUGTcg10, 야쿠시마 골무꽃 유래 SlUGT, 및 차조기 유래 PfUGT50의 얼라이먼트를 도 1에 도시한다. 또한, 도 1에는, 황금화 유래의 Sb7GAT를 병기하였다.

3. 차조기 잎으로부터의 플라보노이드의 추출과 정제

(1) 스쿠텔라레인 7-글루쿠로나이드의 정제

청차조기의 잎(아이치산·도요하시 온실 연합) 200장, 144.4 g을 액체 질소 중에서 분쇄하고, 1.5 ℓ의 50% CH₃CN, 0.1% HCOOH에 하룻밤 침지하고 셀라이트 여과하였다. 여과액을 감압 농축하고, 농축액을 600 ㎖의 CHP-20P에 부하하며, 물, 10, 20, 30, 40, 50% CH₃CN/H₂O 각 300 ㎖×2로 스텝 와이즈 용출을 행하고, 폴리페놀류의 용출이 보여진 10%-2로부터 50%-1까지의 각 분획을 농축, 동결 건조하며 HPLC로 분석하였다. 수량은 10%-2(12.1 ㎎), 20%-1(52.5 ㎎), 20%-2(122.4 ㎎), 30%-1(227.5 ㎎), 30%-2(262.8 ㎎), 40%-1(632.4 ㎎), 40%-2(192.0 ㎎), 50%-1(113.2 ㎎)이고 40%-1은 로즈마린산(rosmarinic acid)이 고순도로 포함되어 있으며, 다른 것은 모두 플라본을 포함하는 분획이었다. 30%-2 분획을 하기의 분취 HPLC로 정제하여 스쿠텔라레인 7-글루쿠로나이드 16 ㎎이 얻어졌다.

분취 HPLC 조건

칼럼: Develosil C-30-UG5, 20 ㎜×250 ㎜,

이동상: A-0.1% TFA, B-0.05% TFA/90% CH₃CN,

유속: 6 ㎖/분.

그레이디언트: B 20→B 60%(100 분), B 60% 이소(20 분)

검출: A 280 ㎚

(2) 스쿠텔라레인 7-글루쿠로나이드의 가수분해와 아글리콘의 정제

상기 (1)에서 얻어진 스쿠텔라레인 7-글루쿠로나이드 중 3 ㎎을 100 ㎕의 DMSO에 용해하고, 15 ㎖의 팔콘 튜브에 이분하였다. 각 튜브에 10 ㎖의 H₂O와 0.2 M의 아세트산Na 완충액(pH5.0) 2.5 ㎖ 및 β-글루쿠로니다제/아릴설파타제(Glucronidase/Arylsulfatase)(EC3.2.1.31/EC3.1.6.1, Roche Diagnostics GmbH 제조) 용액 0.8 ㎖를 더하여 37℃에서 2시간 인큐베이트하였다. 반응 종료액을 Sep-Pak-C18(20 cc)에 부하하고, 물 20 ㎖ 후, 10% EtOH, 20 ㎖로 염류, 단백류를 제거하며, 80% CH₃CN+0.05% TFA 40 ㎖로 생성한 아글리콘을 용출하고, 농축, 동결 건조하였다. 이 분획을 하기의 분취 HPLC로 정제하여, 0.4 ㎎의 스쿠텔라레인(아글리콘)을 얻었다.

분취 HPLC 조건

칼럼: Develosil C-30-UG5, 20 ㎜×250 ㎜,

이동상: A-0.1% TFA, B-0.05% TFA/90% CH₃CN,

유속: 6 ㎖/분.

그레이디언트: B 15→B 70%(60 분), B 70% 이소(10 분)

검출: A 330 ㎚

4. 재조합 차조기 글리코시드화 효소의 발현과 활성 측정

(1) 발현 벡터 구축

상기한 상호 상동성이 높은, 차조기 유래 PfUGT50, 야쿠시마 골무꽃 유래 SlUGT, 및 금어초 유래 AmUGTcg10의 3종의 글리코시드화 효소의 완전 길이 ORF를 포함하는 cDNA를, 각각의 유전자 특이적인 프라이머 세트(PfUGT50, 서열 번호 14-15; SlUGT, 서열 번호 16-17; AmUGTcg10, 서열 번호 18-19)에 의해 증폭하였다. 주형에는 각각 차조기 잎, 야쿠시마 골무꽃 뿌리, 금어초 꽃잎으로부터 추출한 전체RNA를 이용하여 합성한 cDNA를 이용하였다.

서열 번호 14: PfUGT50-fw: 5'-AAACATATGGAAGGCGTCATACTTC-3'(밑줄은 NdeI 사이트)

서열 번호 15: PfUGT50-rv: 5'-TTTTGATCATTAATCACGAGTTACGGAATC-3'(밑줄은 BclI 사이트)

서열 번호 16: SlUGT-fw: 5'-AAACATATGGAGGACACGATTGTTATC-3'(밑줄은 NdeI 사이트)

서열 번호 17: SlUGT-rv: 5'-TTCATATGTCAATCCCTCGTGGCCAGAAG-3'(밑줄은 NdeI 사이트)

서열 번호 18: AmUGTcg10-fw: 5'-AAACATATGGAGGACACTATCGTTCTC-3'(밑줄은 NdeI 사이트)

서열 번호 19: AmUGTcg10-rv: 5'-TTGGATCCTTAAGAAACCACCATATCAAC-3'(밑줄은 BamHI 사이트)

PCR 반응(KOD -Plus-, TOYOBO)은 94℃, 2 분; [94℃, 15 sec; 50℃, 30 sec; 68℃, 1.5 분]×35 사이클로 행하였다. 증폭된 DNA 단편을 pCR-Blunt II-TOPO vector(Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, invitrogen)에 서브 클로닝하고, ABI3100Avant(Applied Biosystems)에 의해 염기 서열을 확인하였다. PfUGT50에 대해서는 얻어진 플라스주를 형질 전환함으로써 비메틸화 플라스미드를 얻었다. 얻어진 플라스미드는 PfUGT50에서는 NdeI와 BclI, SlUGT에서는 NdeI,, AmUGTcg10에서는 NdeI와 BamHI로 각각 소화하고, 발생한 약 1.5 kb의 DNA 단편을 PfUGT50과 AmUGTcg10에서는 NdeI와 BamHI, SlUGT에서는 NdeI로 소화한 pET-15에 연결하였다.

(2) 재조합 대장균의 배양과 단백의 정제

상기 4-(1)에서 얻어진 각각의 플라스미드를 이용하여 대장균 BL21(DE3)주를 형질 전환하였다. 얻어진 형질 전환체를, 50 ㎍/㎖의 암피실린을 포함하는 LB 배지(10 g/ℓ 트립톤, 5 g/ℓ 효모 추출물, 1 g/ℓ NaCl) 4 ㎖에, 37℃에서 하룻밤 진탕 배양하였다. 정지기(靜止期)에 도달한 배양액 4 ㎖를 동일 조성의 배지 80 ㎖에 접종하고, 37℃에서 진탕 배양하였다. 균체 탁도(OD₆₀₀)가 대략 0.5에 도달한 시점에서 최종 농도 0.4 mM의 IPTG(이소프로필-β-티오갈락토피라노시드)를 첨가하고, 22℃에서 20시간 진탕 배양하였다. 이하의 모든 조작은 4℃에서 행하였다. 배양한 형질 전환체를 원심 분리(7,000×g, 15 분)로 집균(集菌)하고, 버퍼 S[20 mM/인산나트륨 버퍼(pH 7.4), 20 mM 이미다졸, 0.5 M NaCl, 14 mM β-메르캅토에탄올] 2 ㎖/g-세포를 첨가하여, 현탁하였다. 계속해서 초음파 파쇄(15 sec×8회)를 행하고, 원심 분리(15,000×g, 10 분)하였다. 얻어진 상청에 최종 농도 0.12%(w/v) 폴리에틸렌이민을 첨가하여 현탁하고, 30 분 정치(靜置)하였다. 원심 분리(15,000×g, 10 분)를 행하고, 상청을 조효소액(粗酵素液)으로서 회수하였다. 조효소액을 버퍼 S로 평형화한 His SpinTrap(GE Healthcare)에 어플라이하고, 원심(70×g, 30 sec)하였다. 버퍼 S 600 ㎕로 세정한 후, 100, 200, 500 mM 이미다졸을 포함하는 버퍼 S 각 600 ㎕로 칼럼에 결합한 단백질을 단계적으로 용출하였다. 각 용출 분획을 Microcon YM-30(Amicon)을 이용하여 14 mM β-메르캅토에탄올을 포함하는 20 mM 인산칼륨 버퍼(pH7.5)로 버퍼 치환하였다. SDS-PAGE 해석의 결과, 100 mM 및 200 mM 이미다졸 용출 분획에 목적 사이즈의 단백질을 확인했기 때문에, 이들 분획을 혼합하여 해석에 이용하였다. 또, 이들 분획에서는 목적하는 단일 단백질이 아니었다.

(3) 효소 반응과 HPLC 분석 조건

표준적인 반응 조건은 이하와 같다. 반응액(2 mM UDP-글루쿠론산, 100 μM 당수용체 기질, 50 mM 인산칼륨 버퍼(pH7.5), 효소 용액) 50 ㎕를 조제하고, 효소 용액을 첨가함으로써 반응을 개시시키며, 30℃, 30분간 반응시켰다. CH₃CN 중 0.5% TFA 50 ㎕를 첨가함으로써 반응을 정지시키고, HPLC로 분석하였다. HPLC 조건은 이하와 같다. 칼럼: Develosil C30-UG-5(4.6×150 ㎜); 용리액 A: 0.1% TFA/H₂O; 용리액 B: 0.08% TFA/90% CH₃CN; 용리 조건 A(올론, 카테킨, 쿠마린, 페닐프로파노이드 이외): 0 분/5% B→18 분/100% B액→18.1 분/5% B→25 분/5% B; 용리 조건 B(올론, 카테킨, 쿠마린, 페닐프로파노이드): 0 분/5% B→20 분/50% B액→20.5 분/5% B→25 분/5% B; 유속: 1 ㎖/분; 검출 파장: 280, 350 ㎚. 이하에 각 특징규명 방법 및 결과를 나타낸다.

당수용체 기질 특이성 해석

상기한 방법에 따라, 각종 당수용체 기질에 대한 특이성을 해석하였다(도 2∼도 4).

도 2는, PfUGT50의 당수용체 기질의 기질 특이성의 해석 결과를 도시하는 도면이다. 도 2에서는, 스쿠텔라레인에 대한 활성을 100%로 했을 때의 각 기질에 대한 상대 활성을 나타내었다. 해석 결과, PfUGT50은 스쿠텔라레인에 대하여 최대 활성을 나타내고, 글리코시드 이외의 플라본에 잘 반응하였다(바이칼레인(스쿠텔라레인에 대한 상대 활성, 73%), 아피제닌(44%), 루테올린(41%), 트리세틴(87.9%), 디오스메틴(62%), 크리소에리올(18%)). 또한 플라보놀(케르세틴(26%), 미리세틴(9%), 캠프페롤(3%)), 플라바논(나린제닌(3%)) 및 올론(아우레우시딘(40%))에 대해서도 활성을 나타내었다. 그러나, 플라본 C 배당체(비테신, 이소비테신, 오리엔틴), 이소플라본(제니스테인, 다이드제인, 포르모노네틴), 카테킨(카테킨, 에피갈로카테킨 갈레이트), 쿠마린(에스쿠레틴) 및 페닐프로파노이드(코니페릴 알콜)에 대해서는 활성을 나타내지 않았다. 또한, HPLC에 있어서 스쿠텔라레인, 바이칼레인, 아피제닌, 케르세틴은 그 반응 생성물이 각각의 7위치 글루쿠로노실(glucuronosyl)화물의 유지 시간과 일치하였다.

도 3은, SlUGT의 당수용체 기질의 기질 특이성을 해석한 결과를 도시하는 도면이다. 도 3에서는, 스쿠텔라레인에 대한 활성을 100%로 했을 때의 각 기질에 대한 상대 활성을 나타내었다. 해석 결과, SlUGT는 스쿠텔라레인에 대하여 최대 활성을 나타내고, 바이칼레인(스쿠텔라레인에 대한 상대 활성, 63%) 이외의 플라본에 대한 반응성은 낮았다(아피제닌(3%), 루테올린(0.6%), 트리세틴(1.1%), 디오스메틴(0.3%), 크리소에리올(0.02%)). 또한 플라보놀(케르세틴(1%), 캠프페롤(14%)), 플라바논(나린제닌(6%)), 이소플라본(제니스테인(1%), 다이드제인(0.3%), 포르모노네틴(0.08%)), 쿠마린(에스쿨레틴(0.3%))에 대한 활성도 낮고, 플라본 C 배당체(비테신, 이소비테신, 오리엔틴), 올론(아우레우시딘), 카테킨(카테킨, 에피갈로카테킨 갈레이트) 및 페닐프로파노이드(코니페릴 알콜)에 대해서는 활성을 나타내지 않았다. 즉, SlUGT의 활성에는 플라보노이드의 7위치의 오르토 위치의 수식이 중요한 것이 시사되었다. 또한, HPLC에 있어서 스쿠텔라레인, 바이칼레인, 아피제닌은 그 반응 생성물이 각각의 7위치 글루쿠로노실화물의 유지 시간과 일치하였다. 한편, 케르세틴에서는 복수의 반응 생성물이 검출되고, 그 하나는 7위치 글루쿠로노실화물의 유지 시간과 일치하였다.

도 4는, AmUGTcg10의 당수용체 기질의 기질 특이성을 해석한 결과를 도시하는 도면이다. 도 4에서는, 스쿠텔라레인에 대한 활성을 100%로 했을 때의 각 기질에 대한 상대 활성을 나타내었다. 해석 결과, AmUGTcg10은 스쿠텔라레인에 대하여 최대 활성을 나타내고, 배당체 이외의 플라본에도 반응하였다(바이칼레인(스쿠텔라레인에 대한 상대 활성, 22%), 아피제닌(40%), 루테올린(34%), 트리세틴(23.8%), 디오스메틴(26%), 크리소에리올(18%)). 또한 플라보놀(케르세틴(4%), 캠프페롤(28%)), 플라바논(나린제닌(15%)) 및 올론(아우레우시딘(2%))에 대해서도 활성을 나타내었다. 그러나, 플라본 C 배당체(비테신, 이소비테신, 오리엔틴), 이소플라본(제니스테인, 다이드제인, 포르모노네틴), 카테킨(카테킨, 에피갈로카테킨 갈레이트), 쿠마린(에스쿨레틴) 및 페닐프로파노이드(코니페릴 알콜)에 대해서는 활성을 나타내지 않았다. 또한, HPLC에서 스쿠텔라레인, 바이칼레인, 아피제닌, 케르세틴은 그 반응 생성물이 각각의 7위치 글루쿠로노실화물의 유지 시간과 일치하였다.

이상의 결과로부터 플라본 등의 플라보노이드에 대하여 PfUGT50과 AmUGTcg10은 낮은 특이성을 나타내는 데 비하여, SlUGT는 높은 특이성을 나타내는 것이 분명해졌다. 그리고, 차조기 유래의 PfUGT50이, 특히 낮은 특이성을 나타내는 것, 즉, 기질 특이성이 넓은 효소인 것을 알 수 있었다.

당공여체 기질 특이성 해석

아피제닌을 당수용체 기질로서 이용하여, 각종 UDP 활성화 당공여체에 대한 특이성을 해석하였다. 그 결과, PfUGT50, SlUGT 및 AmUGTcg10은 UDP-글루쿠론산에 대해서만 활성을 나타내고, UDP-글루코오스, UDP-갈락토오스에 대해서는 활성을 나타내지 않았다.

이상의 결과로부터 이들 효소는 플라본에 특이성이 높은 7위치 글루쿠론산 전이 효소(플라본 7-O-글루쿠로노실 트랜스퍼라아제)라고 고찰하였다.

pH 및 온도 특성 해석

온도 안정성은 이하와 같이 하여 해석하였다. 효소 용액을 15℃∼55℃에서 1시간 처리한 후, 4℃로 냉각하였다. 냉각 후의 샘플을 이용하여, 표준적인 반응 조건에서 잔존 활성을 산출하였다. pH 안정성은 이하와 같이 하여 해석하였다. 효소 용액에 최종 농도 167 mM 완충액(pH4, 4.5, 5, 아세테이트-NaOH; pH5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, NaH₂PO₄-NaOH; pH8, 8.5, 9, Tris-HCl)을 첨가하고, 4℃에서 1시간 처리한 후, 최종 농도 500 mM 인산칼륨 버퍼(pH7.5)를 첨가하였다. 처리 후의 샘플을 이용하여, 표준적인 반응 조건에서 잔존 활성을 산출하였다. 반응 온도 의존성은 반응 온도를 10℃∼55℃로 한 표준적인 반응 조건에서 반응을 행하여 해석하였다. 반응 pH 의존성은 인산칼륨 버퍼(pH7.5) 대신에 완충액(pH4, 4.5, 5, 아세테이트-NaOH; pH5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, NaH₂PO₄-NaOH; pH8, 8.5, 9, Tris-HCl)을 이용한 표준적인 반응 조건에서 반응을 행하여 해석하였다. 이상의 해석의 결과, PfUGT50은 pH7∼9의 범위에서 안정적이고, 그 촉매 활성은 pH7∼8의 범위에서 최대이며, 산성 영역에서는 그다지 활성을 나타내지 않았다. 또한, 30℃ 이하에서 안정적이고(1시간, pH7.5), 30분간의 활성 측정에서 반응 최적 온도는 30℃였다. SlUGT는 pH4.5∼8의 범위에서 안정적이고, 그 촉매 활성은 pH7∼8의 범위에서 최대이며, 산성 영역에서는 그다지 활성을 나타내지 않았다. 또한, 본 효소는 40℃ 이하에서 안정적이고(1시간, pH 7.5), 30분간의 활성 측정에서 반응 최적 온도는 35℃였다. AmUGTcg10은 pH7.5∼9.5의 범위에서 안정적이고, 그 촉매 활성은 pH8.5∼9.5의 범위에서 최대이며, 산성 영역에서는 그다지 활성을 나타내지 않았다. 또한, 본 효소는 30℃ 이하에서 안정적이고(1시간, pH7.5), 30분간의 활성 측정에서 반응 최적 온도는 45℃였다. 이들 성질은 기지의 식물 2차 대사에 관계되는 GT와 유사하였다.

5. 결과

상기한 바와 같이, 구조적으로 유사한 꿀풀과 차조기 유래 PfUGT50, 꿀풀과 야쿠시마 골무꽃 유래 SlUGT 및 현삼과 금어초 유래 AmUGTcg10을 동정하였다. PfUGT50 및 AmUGTcg10 글리코시드화 효소는 황금화 Sb7GAT와 비교하여 당수용체 기질 특이성이 넓고, 플라본, 플라보놀, 올론 등의 다양한 플라보노이드의 7위치 글루쿠론산 전이 활성을 갖고 있었다. 한편, SlUGT는 Sb7GAT와 유사한 기질 특이성을 나타내었다. 이들 글리코시드화 효소를 이용함으로써 저렴하게 플라보노이드의 7위치를 글루쿠론산 포합화할 수 있게 된다.

이 때문에, 케르세틴 7-글루크로나이드 등의 생체 내에 존재하는 글루쿠론산 포합체를 시험관 내에서 대량으로 생성하여, 생리 활성을 평가하는 것이 가능하다.

실시예 2

1. 실시예 2의 개요

본 실시예에서는, 꿀풀목 참깨과 참깨(Lamiales Pedaliaceae Sesamum indicum)로부터 골무꽃 SlUGT 및 금어초 AmUGTcg12와 상동성이 높은 SiUGT23을 동정하고, 그 대장균 발현 단백질에 스쿠텔라레인 및 루테올린에 대하여 글루쿠론산 전이 활성을 갖고 있는 것을 확인하였다.

2. SiUGT23 유전자의 동정

골무꽃 및 금어초의 플라보노이드 7위치 글루쿠론산 전이 효소 유전자(UGT 유전자)의 서열 보존성에 주목하여 이들 유전자와 상동성이 높은 유전자를 조사한 결과, 꿀풀목 참깨과 참깨에 있어서도, 이들 UGT 유전자와 높은 상동성을 나타내는 참깨 UGT 유전자, SiUGT23이 있는 것을 발견하였다. 참깨 cDNA 라이브러리 내로부터 단리된 SiUGT23은 완전 길이 서열을 갖고 있지 않았기 때문에, 하기 서열 번호 20 및 21의 프라이머를 이용하여 상기 실시예 1의 2(3)에서 기술한 RACE법에 의해 SiUGT23의 완전 길이 서열을 결정하였다(서열 번호 22 및 23).

서열 번호 20: GR-SiUGT23-Rv

5'-GGCCAAACGCGCCGGAGCTGATGTAGA-3'

서열 번호 21: SiUGT23-nest-Rv

5'-AGTGGGTATATTCAAGCCTGT-3'

3. 참깨 유래 SiUGT23의 발현과 활성 측정

참깨 유래 SiUGT23의 완전 길이 ORF를 포함하는 cDNA를, 유전자 특이적인 프라이머 세트(서열 번호 24 및 25)에 의해 증폭하였다. 주형에는 참깨 종자로부터 추출한 총 RNA를 이용하여 합성한 cDNA를 이용하였다. 상기 실시예 1의 차조기, 골무꽃, 및 금어초의 UGT와 마찬가지로 대장균 발현 벡터에 편입시키고, 동일한 방법에 의해 재조합 SiUGT23 단백질을 발현시켜, 효소 활성을 측정하였다.

서열 번호 24: SiUGT23-fw: 5'-CACCATATGGAAGACACCGTTGTCCTCTA-3'(밑줄은 NdeI 사이트)

서열 번호 25: SiUGT23-rv: 5'-GGATCCTAACATCACTCAAACCCGAGTCA-3'(밑줄은 BamHI 사이트)

도 5는, SiUGT23의 당수용체 기질의 기질 특이성을 해석한 결과를 도시하는 도면이다. 도 5에서는, 스쿠텔라레인에 대한 활성을 100%로 했을 때의 각 기질에 대한 상대 활성을 나타내었다. 해석 결과, SiUGT23은 스쿠텔라레인에 대하여 최대 활성을 나타내고, 이하의 플라본에도 반응하였다(바이칼레인(스쿠텔라레인에 대한 상대 활성(이하 동일), 24%), 아피제닌(7%), 루테올린(29%), 트리세틴(14.0%), 디오스메틴(4%), 크리소에리올(6%), 이소비테신(0.3%)). 또한 플라보놀(케르세틴(4%), 캠프페롤(18%)), 플라바논(나린제닌(2%)), 올론(아우레우시딘(13%)), 쿠마린(에스쿨레틴(0.03%)) 및 이하의 이소플라본(포르모노네틴(0.03%))에 대해서도 활성을 나타내었다. 그러나, 이소비테신 이외의 플라본 C 배당체(비테신, 오리엔틴), 포르모노네틴 이외의 이소플라본(제니스테인, 다이드제인), 카테킨(카테킨, 에피갈로카테킨 갈레이트) 및 페닐프로파노이드(Caffeic acid)에 대해서는 활성을 나타내지 않았다. 또한, HPLC에 있어서 스쿠텔라레인, 바이칼레인, 아피제닌, 케르세틴은 그 반응 생성물이 각각의 7위치 글루쿠로노실화물의 유지 시간과 일치하였다.

이상의 결과로부터 참깨 SiUGT23은 차조기 PfGT50 및 금어초 AmUGTcg10과 마찬가지로 플라본 등의 플라보노이드에 대하여 낮은 특이성을 나타내는 플라보노이드 7위치 글루쿠론산 전이 효소인 것이 나타났다.

실시예 3

차조기 PfUGT50, 야쿠시마 골무꽃 SlUGT, 금어초 AmUGTcg10 재조합 단백질 및 참깨의 SiUGT23 재조합 단백질을 이용하여 식물성 폴리페놀인 스틸벤 및 리그난에 대한 글루쿠론산 전이 활성에 대해서 검토하였다. 스틸벤의 기질로서는 레스페라트롤, 리그난의 기질에는 (+)-피노레시놀, (+)-피페리톨, (+)-세사미놀, (+)-세코이소라리시레시놀, (+)-세사민 카테콜 1(SC1), (+)-세사민 카테콜 2(SC2) 및 (+)-에피세사민 카테콜 2(EC2)를 이용하여(Nakai M, et al. (2003) J Agric Food Chem. 51, 1666-1670.), 전술과 동일한 조건에서 효소 반응을 행하였다.

HPLC 분석의 결과, 차조기 PfUGT50, 야쿠시마 골무꽃 SlUGT, 금어초 AmUGTcg10 및 참깨의 SiUGT23과의 반응액 모두에서 생성물이 얻어졌다(도 2-도 5 참조). 또한, 리그난류에 대해서는, SC1 및 SC2를 기질로 했을 때에, 새롭게 생성물이 얻어졌다. 가장 생성물이 많이 얻어진 SlUGT와 SC1과의 반응을 LC-MS 분석한 결과, SC1은 R.T.=12.8분에 용출되고, 반응 생성물은 R.T.=10.8분(도 6), m/z=517.1328[M-H]^-(C25H25O12, calcd. 517.1346, err. -2.5 ppm)의 SC1 모노글루쿠로나이드인 것이 확인되었다(도 7). LC-MS의 조건은 하기와 같다.

칼럼: Develosil C30-UG3, 3 ㎜×150 ㎜

이동상: A; H₂O, B; CH₃CN, C; 2.5% HCOOH, 0.2 ㎖/분.

그레이디언트: B 20%→B 70%(10분), B 70%(5분), C 4%

검출: A 280 ㎚

MS 조건: Q-TOF-Premier(Micromass, Manchester, UK 제조)

V모드, 음ㅅㅇ, 캐필러리 전압: 2.3 KV, 콘 전압: 45 V

이상의 결과로부터, 차조기 PfUGT50, 야쿠시마 골무꽃 SlUGT, 금어초 AmUGTcg10 및 참깨의 SiUGT23을 이용함으로써 다양한 플라보노이드에 더하여, 스틸벤 및 리그난의 글루쿠로나이드를 생산할 수 있는 것을 확인하였다.

실시예 4

야쿠시마 골무꽃 유래 SlUGT는 케르세틴(QU)과 반응시켰을 때에 그 7위치 글루쿠론산 이외에 복수의 생성물을 제공하였다(도 8).

이들은 참깨 유래 SiUGT23, 금어초 유래 AmUGTcg10, 및 차조기 유래 PfUGT50에서는 보여지지 않은 특징적인 생성물이다. LC-MS 분석의 결과, 유지 시간 7분∼9분 사이에는 케르세틴에 대하여 2개의 글루쿠론산이 전이했다고 생각되는 m/z=653.1009[M-H]^-(C27H25O19, calcd. 653.0990, err. 2.9 ppm)를 나타내는 케르세틴디글루쿠로나이드가 검출되었다. 유지 시간 9분∼11분 사이에는 케르세틴에 대하여 글루쿠론산이 하나 전이했다고 생각되는 m/z=477.06[M-H]^-의 케르세틴모노글루쿠로나이드가 3종류 검출되었다. R.T.=10.12분의 성분은 차조기의 GAT에 의한 반응 생성물을 정제하여 구조 해석한 것과 일치했기 때문에, 케르세틴 7-O-글루쿠로나이드인 것을 알 수 있었다. 또한 R.T.=10.34분의 성분은 포도 잎의 주(主)플라보놀을 정제하여 구조 해석한 것과 일치했기 때문에, 케르세틴 3-O-글루크로나이드인 것을 알 수 있었다(Hmamouch, M. et al. (1996) Am J Enol Vitic., 47, 186-192). 주반응 생성물인 R.T.=11.3분의 성분은 역상 HPLC로 정제하여 NMR로 구조 해석한 결과, 케르세틴 3'-O-글루크로나이드인 것이 분명해졌다. 주요한 3개의 피크는 각각 케르세틴의 7위치, 3위치, 3'위치의 모노글루쿠로나이드인 것이 확인되었다.

LC-MS의 조건은 하기와 같다.

칼럼: YMC-pack polymer C18, 2 ㎜×150 ㎜, 6 ㎛

이동상: A; H₂O, B; CH₃CN, C; 2.5% HCOOH, 0.2 ㎖/분.

그레이디언트: B 10%→B 50%(10분), B 50%(5분), C 4%

검출: A 350 ㎚

MS 조건: Q-TOF-Premier(Micromass, Manchester, UK 제조)

V모드, 음성, 캐필러리 전압: 3.0 KV, 콘 전압: 30 V

이상의 결과로부터, 야쿠시마 골무꽃 SlUGT를 이용함으로써, 케르세틴으로부터 다양한 케르세틴글루쿠로나이드가 얻어지는 것이 나타났다.

[산업상의 이용가능성]

본 발명의 UDP-글루쿠론산 전이 효소는, 기질 특이성이 넓어, 여러 가지 글루쿠론산 포합체의 제조에 유용하다. 제조한 글루쿠론산 포합체는, 예컨대, 그 생체 내에서의 기능을 조사하기 위한 시약이나, 항산화제 등으로서 유용하다.

SEQUENCE LISTING <110> SUNTORY LIMITED <120> UDP- glucuronosyltransferase and polynucleotide encoding the same <130> PCT08-0058 <150> JP 2007-267050 <151> 2007-10-12 <150> JP 2008-067185 <151> 2008-03-17 <160> 25 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 1 aaacatatgg cggtgctggc gaagttc 27 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 2 ttttgatcat taatcccgag tggcgtgaag 30 <210> 3 <211> 1326 <212> DNA <213> Scutellaria laeteviolacea v. yakusimensis <400> 3 atggcggtgc tggcgaagtt catcagcaag aaccacccct ccgtccccat catcattatc 60 agcaacgccc cggaatccgc cgccgcctcc gtggcggcca tcccttccat ctcctaccac 120 cgccttcccc tcccggagat ccctcccgac atgacaacag accgcgtgga gctcttcttc 180 gagctccctc gtctcagcaa ccctaacctc ctcactgctc tgcaacagat ctcccagaag 240 acaagaatca gagctgttat cctcgatttc ttctgcaacg cggcttttga ggttccgacc 300 agcctcaata tacccaccta ctactacttc agcgccggaa ctccaaccgc catcctcacc 360 ttgtacttcg aaaccatcga tgagaccatc cctgttgacc ttcaagacct caatgactat 420 gtcgacatcc ctggtttgcc gccgattcac tgcctcgata tccccgtggc tttgtcaccg 480 cgtaagagtc ttgtttacaa gagctccgtc gacatttcga agaacctgcg cagatcggca 540 ggcatcctcg ttaatggctt cgatgcactc gagtttagag ccataggaag ccatagtcaa 600 cggcctatgc atttcaaagg cccaactcct ccggtttact tcatcgggcc attggtcgga 660 gatgtcgaca ctaaggccgg cagcgaggag catgagtgtc tgagatggct tgatacacag 720 ccaagtaaga gtgtcgtctt cctttgtttt gggagaaggg gtgtcttctc tgctaagcag 780 ctgaaggaga cggcggcggc gttggagaac agtggccaca ggtttctctg gtcagtgaga 840 aacccaccgg agttgaagaa ggcgacgggg tccgatgagc cggacctgga tgagctgctg 900 cccgagggct tcctggagag aaccaaggat cggggtttcg tgataaagtc gtgggctcca 960 cagaaggagg tgctggctca cgactcggta ggtggattcg tgactcactg tgggcggagc 1020 tccgtgtctg aaggggtgtg gttcggagtg ccgatgatcg ggtggccggt ggacgcggag 1080 ctgaggttga atcgggcggt gatggtggat gatctgcagg tggcgctgcc gctggaggag 1140 gaggcgggtg ggttcgtgac ggcggctgag ttggagaaac gagttagaga gttgatggag 1200 acgaaggcgg ggaaggcggt gaggcaacga gtcaccgaac tgaaactctc cgccagggcg 1260 gcggtggcgg agaatggatc ctcgctaaat gatttgaaaa aatttcttca cgccactcgg 1320 gattaa 1326 <210> 4 <211> 1490 <212> DNA <213> Perilla frutescens <220> <221> CDS <222> (1)..(1362) <400> 4 atg gaa ggc gtc ata ctt ctt tac tca tcg gct gag cac ttg aac tcc 48 Met Glu Gly Val Ile Leu Leu Tyr Ser Ser Ala Glu His Leu Asn Ser 1 5 10 15 atg tta ttg ctc gcc acc ttc atc gcc aaa cac cat ccc tcc atc ccc 96 Met Leu Leu Leu Ala Thr Phe Ile Ala Lys His His Pro Ser Ile Pro 20 25 30 atc aca atc ctt agc tcc gcc gac tac tca gcc gcc gcc tcc gtc tcc 144 Ile Thr Ile Leu Ser Ser Ala Asp Tyr Ser Ala Ala Ala Ser Val Ser 35 40 45 acc ttg cct tcc att act tat cgc cgc ctc ccg ccc gtc gcg ata ccc 192 Thr Leu Pro Ser Ile Thr Tyr Arg Arg Leu Pro Pro Val Ala Ile Pro 50 55 60 cct gac tca ata aag aac ccg gtc gaa gcc ttc ttc gaa atc cct cgt 240 Pro Asp Ser Ile Lys Asn Pro Val Glu Ala Phe Phe Glu Ile Pro Arg 65 70 75 80 ctc caa aac cca aac ctt cgc gtc gcc ctc gaa gaa atc tcc cag aaa 288 Leu Gln Asn Pro Asn Leu Arg Val Ala Leu Glu Glu Ile Ser Gln Lys 85 90 95 aca aga atc aga gca ttt gtg att gat ttc ttc tgc aat tcc gca ttt 336 Thr Arg Ile Arg Ala Phe Val Ile Asp Phe Phe Cys Asn Ser Ala Phe 100 105 110 gaa gtc tcg acc agc ctc agc ata ccc act tac ttc tac gtc agc acc 384 Glu Val Ser Thr Ser Leu Ser Ile Pro Thr Tyr Phe Tyr Val Ser Thr 115 120 125 ggt tcc gcc ggc gtc tgc atc ttc ctc tat ttc ccc acc acc gat gag 432 Gly Ser Ala Gly Val Cys Ile Phe Leu Tyr Phe Pro Thr Thr Asp Glu 130 135 140 acc gtt gct aca gac atc gga gac ttg cgt gat ttt ctt gaa ttc cct 480 Thr Val Ala Thr Asp Ile Gly Asp Leu Arg Asp Phe Leu Glu Phe Pro 145 150 155 160 ggc tcc ccc att atc cac tca tcg gat ttg cca caa ctt aca ttt ttc 528 Gly Ser Pro Ile Ile His Ser Ser Asp Leu Pro Gln Leu Thr Phe Phe 165 170 175 cgg cgg agt aat gtt ttc aag cac atg ttg gac act tcc aaa aac atg 576 Arg Arg Ser Asn Val Phe Lys His Met Leu Asp Thr Ser Lys Asn Met 180 185 190 cag aaa tct tct ggg atc ctc aca aat gga ttc gac gct atg gag ttc 624 Gln Lys Ser Ser Gly Ile Leu Thr Asn Gly Phe Asp Ala Met Glu Phe 195 200 205 aga gct aag gaa gct cta act aac ggc ctc tgc gtt ccc aac gga ccc 672 Arg Ala Lys Glu Ala Leu Thr Asn Gly Leu Cys Val Pro Asn Gly Pro 210 215 220 act ccg ccg gtt tac tta gtt ggg cca cta gtt gcc gga agc aac gct 720 Thr Pro Pro Val Tyr Leu Val Gly Pro Leu Val Ala Gly Ser Asn Ala 225 230 235 240 aaa aaa gac cac gag tgc ctg ctg tgg ctg gac aga cag cca agt aaa 768 Lys Lys Asp His Glu Cys Leu Leu Trp Leu Asp Arg Gln Pro Ser Lys 245 250 255 agc gtg gtt ttc ctt tgt ttc ggc aga agg ggt ttg ttt tcc ggc aag 816 Ser Val Val Phe Leu Cys Phe Gly Arg Arg Gly Leu Phe Ser Gly Lys 260 265 270 cag ttg aga gag atg gcg gtt gct cta gag aga agt ggc tac aga ttt 864 Gln Leu Arg Glu Met Ala Val Ala Leu Glu Arg Ser Gly Tyr Arg Phe 275 280 285 ctg tgg tcg gtg cgg aat ccg ccg gaa aat cgt tcg ccg gcg gaa gac 912 Leu Trp Ser Val Arg Asn Pro Pro Glu Asn Arg Ser Pro Ala Glu Asp 290 295 300 cct gat ttg gac gag ctt ttg cct gag ggt ttt ctg gag aga act aaa 960 Pro Asp Leu Asp Glu Leu Leu Pro Glu Gly Phe Leu Glu Arg Thr Lys 305 310 315 320 gat ata ggg ttt gtg gtg aag tcg tgg gcg cct cag aag gag gtg ctg 1008 Asp Ile Gly Phe Val Val Lys Ser Trp Ala Pro Gln Lys Glu Val Leu 325 330 335 agt cat gac gcg gtg gcc ggc ttc gtg act cac tgt ggg agg agc tcg 1056 Ser His Asp Ala Val Ala Gly Phe Val Thr His Cys Gly Arg Ser Ser 340 345 350 att ctg gaa gcg ctg gtg aat ggg aaa ccg atg atc ggt tgg cca atg 1104 Ile Leu Glu Ala Leu Val Asn Gly Lys Pro Met Ile Gly Trp Pro Met 355 360 365 tac gcg gag cag agg atg aac aag gta ttc atg gtg gac gaa atg aag 1152 Tyr Ala Glu Gln Arg Met Asn Lys Val Phe Met Val Asp Glu Met Lys 370 375 380 gta gcg ctg ccc ttg gag gag gag gag gat ggg ttc gtg acg gcg gtc 1200 Val Ala Leu Pro Leu Glu Glu Glu Glu Asp Gly Phe Val Thr Ala Val 385 390 395 400 gag ttg gag aag cgg ctg aga cag ttg atg gag tcc aag aca ggg aga 1248 Glu Leu Glu Lys Arg Leu Arg Gln Leu Met Glu Ser Lys Thr Gly Arg 405 410 415 gat gtt cgc cac cgt gtt gcc gaa atg aaa gcc gct gcc acg gcg gcg 1296 Asp Val Arg His Arg Val Ala Glu Met Lys Ala Ala Ala Thr Ala Ala 420 425 430 atg gga gag aat ggt tcg gcg gtg gtt gct ttg cgg aag ttc att gat 1344 Met Gly Glu Asn Gly Ser Ala Val Val Ala Leu Arg Lys Phe Ile Asp 435 440 445 tcc gta act cgt gat taa aggattttac atatgtcgct tattaattaa 1392 Ser Val Thr Arg Asp 450 tatagtatgt aacttagttg ttatttcggg aaatctaccc aagtcattga gttcaataat 1452 caaatcttcc tatgggctat gccaaattaa aaataaaa 1490 <210> 5 <211> 453 <212> PRT <213> Perilla frutescens <400> 5 Met Glu Gly Val Ile Leu Leu Tyr Ser Ser Ala Glu His Leu Asn Ser 1 5 10 15 Met Leu Leu Leu Ala Thr Phe Ile Ala Lys His His Pro Ser Ile Pro 20 25 30 Ile Thr Ile Leu Ser Ser Ala Asp Tyr Ser Ala Ala Ala Ser Val Ser 35 40 45 Thr Leu Pro Ser Ile Thr Tyr Arg Arg Leu Pro Pro Val Ala Ile Pro 50 55 60 Pro Asp Ser Ile Lys Asn Pro Val Glu Ala Phe Phe Glu Ile Pro Arg 65 70 75 80 Leu Gln Asn Pro Asn Leu Arg Val Ala Leu Glu Glu Ile Ser Gln Lys 85 90 95 Thr Arg Ile Arg Ala Phe Val Ile Asp Phe Phe Cys Asn Ser Ala Phe 100 105 110 Glu Val Ser Thr Ser Leu Ser Ile Pro Thr Tyr Phe Tyr Val Ser Thr 115 120 125 Gly Ser Ala Gly Val Cys Ile Phe Leu Tyr Phe Pro Thr Thr Asp Glu 130 135 140 Thr Val Ala Thr Asp Ile Gly Asp Leu Arg Asp Phe Leu Glu Phe Pro 145 150 155 160 Gly Ser Pro Ile Ile His Ser Ser Asp Leu Pro Gln Leu Thr Phe Phe 165 170 175 Arg Arg Ser Asn Val Phe Lys His Met Leu Asp Thr Ser Lys Asn Met 180 185 190 Gln Lys Ser Ser Gly Ile Leu Thr Asn Gly Phe Asp Ala Met Glu Phe 195 200 205 Arg Ala Lys Glu Ala Leu Thr Asn Gly Leu Cys Val Pro Asn Gly Pro 210 215 220 Thr Pro Pro Val Tyr Leu Val Gly Pro Leu Val Ala Gly Ser Asn Ala 225 230 235 240 Lys Lys Asp His Glu Cys Leu Leu Trp Leu Asp Arg Gln Pro Ser Lys 245 250 255 Ser Val Val Phe Leu Cys Phe Gly Arg Arg Gly Leu Phe Ser Gly Lys 260 265 270 Gln Leu Arg Glu Met Ala Val Ala Leu Glu Arg Ser Gly Tyr Arg Phe 275 280 285 Leu Trp Ser Val Arg Asn Pro Pro Glu Asn Arg Ser Pro Ala Glu Asp 290 295 300 Pro Asp Leu Asp Glu Leu Leu Pro Glu Gly Phe Leu Glu Arg Thr Lys 305 310 315 320 Asp Ile Gly Phe Val Val Lys Ser Trp Ala Pro Gln Lys Glu Val Leu 325 330 335 Ser His Asp Ala Val Ala Gly Phe Val Thr His Cys Gly Arg Ser Ser 340 345 350 Ile Leu Glu Ala Leu Val Asn Gly Lys Pro Met Ile Gly Trp Pro Met 355 360 365 Tyr Ala Glu Gln Arg Met Asn Lys Val Phe Met Val Asp Glu Met Lys 370 375 380 Val Ala Leu Pro Leu Glu Glu Glu Glu Asp Gly Phe Val Thr Ala Val 385 390 395 400 Glu Leu Glu Lys Arg Leu Arg Gln Leu Met Glu Ser Lys Thr Gly Arg 405 410 415 Asp Val Arg His Arg Val Ala Glu Met Lys Ala Ala Ala Thr Ala Ala 420 425 430 Met Gly Glu Asn Gly Ser Ala Val Val Ala Leu Arg Lys Phe Ile Asp 435 440 445 Ser Val Thr Arg Asp 450 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 6 tgggaggcaa accagggatc tcgacaa 27 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 7 aatcatccaa atctttaagg t 21 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 8 agaaggggtg tgttctccgc tgagcaa 27 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 9 gaacagcggt cacagatttc t 21 <210> 10 <211> 1446 <212> DNA <213> Scutellaria laeteviolacea v. yakusimensis <220> <221> CDS <222> (1)..(1368) <400> 10 atg gag gac acg att gtt atc tac acc acg ccg gag cac ctg aac acc 48 Met Glu Asp Thr Ile Val Ile Tyr Thr Thr Pro Glu His Leu Asn Thr 1 5 10 15 atg gcg gtg ctc gcc aag ttc atc agc aaa cac cac ccc tcc gtc ccc 96 Met Ala Val Leu Ala Lys Phe Ile Ser Lys His His Pro Ser Val Pro 20 25 30 atc ata ctc atc agc acc gcc gcc gaa tca gcc gcc gcc tcc atc gcc 144 Ile Ile Leu Ile Ser Thr Ala Ala Glu Ser Ala Ala Ala Ser Ile Ala 35 40 45 gcc gtc ccc tcc atc acc tac cac cgc ctc ccc ctc ccc gag atc cct 192 Ala Val Pro Ser Ile Thr Tyr His Arg Leu Pro Leu Pro Glu Ile Pro 50 55 60 ccc agc ctg aca aag gac cgc gtg gag ctc ttc ttc gag ctc cct cgt 240 Pro Ser Leu Thr Lys Asp Arg Val Glu Leu Phe Phe Glu Leu Pro Arg 65 70 75 80 ctc agc aac cct 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Antirrhinum majus <400> 13 Met Glu Asp Thr Ile Val Leu Tyr Ala Ser Ala Glu His Leu Asn Ser 1 5 10 15 Met Leu Leu Leu Gly Lys Leu Ile Asn Lys His His Pro Thr Ile Ser 20 25 30 Val Ala Ile Ile Ser Thr Ala Pro Asn Ala Ala Ala Ser Ser Val Ala 35 40 45 Asp Val Ala Ala Ile Ser Tyr Gln Gln Leu Lys Pro Ala Thr Leu Pro 50 55 60 Ser Asp Leu Thr Lys Asn Pro Ile Glu Leu Phe Phe Glu Ile Pro Arg 65 70 75 80 Leu His Asn Pro Asn Leu Leu Glu Ala Leu Glu Glu Leu Ser Leu Lys 85 90 95 Ser Lys Val Arg Ala Phe Val Ile Asp Phe Phe Cys Asn Pro Ala Phe 100 105 110 Glu Val Ser Thr Ser Leu Asn Ile Pro Thr Tyr Phe Tyr Val Ser Ser 115 120 125 Gly Ala Phe Gly Leu Cys Gly Phe Leu His Phe Pro Thr Ile Asp Glu 130 135 140 Thr Val Glu Lys Asp Ile Gly Glu Leu Asn Asp Ile Leu Glu Ile Pro 145 150 155 160 Gly Cys Pro Pro Val Leu Ser Ser Asp Phe Pro Lys Gly Met Phe Phe 165 170 175 Arg Lys Ser Asn Thr Tyr Lys His Phe Leu Asp Thr Ala Lys Asn Met 180 185 190 Arg Arg Ala Lys Gly Ile Val Val Asn Ala Phe Asp Ala Met Glu Phe 195 200 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Asp Glu Leu Leu Pro Lys Gly Phe Leu 305 310 315 320 Glu Arg Thr Lys Asp Arg Gly Phe Ile Ile Lys Ser Trp Ala Pro Gln 325 330 335 Thr Glu Val Leu Ser His Asp Ser Val Gly Gly Phe Val Thr His Cys 340 345 350 Gly Arg Ser Ser Ile Leu Glu Ala Val Ser Leu Gly Val Pro Met Ile 355 360 365 Gly Trp Pro Leu Tyr Ala Glu Gln Arg Met Asn Arg Val Phe Met Val 370 375 380 Glu Glu Met Lys Val Ala Leu Pro Leu Glu Glu Thr Ala Asp Gly Leu 385 390 395 400 Val Thr Ala Val Glu Leu Glu Lys Arg Val Arg Gln Leu Met Asp Ser 405 410 415 Gln Thr Gly Arg Ala Val Arg His Arg Val Thr Glu Leu Lys Ser Ser 420 425 430 Ala Ala Ala Ala Val Arg Lys Asn Gly Ser Ser Leu Val Ala Leu Gln 435 440 445 Asn Phe Ile Ala Ser Val Thr Arg Val 450 455 <210> 24 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 24 caccatatgg aagacaccgt tgtcctcta 29 <210> 25 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 25 ggatcctaac atcactcaaa cccgagtca 29

Claims

이하의 (a)∼(f) 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드:
(a) 서열 번호 4로 표시되는 염기 서열의 제1번째∼제1359번째의 염기 서열, 서열 번호 10으로 표시되는 염기 서열의 제1번째∼제1365번째의 염기 서열, 서열 번호 12로 표시되는 염기 서열의 제1번째∼제1371번째의 염기 서열, 및 서열 번호 22로 표시되는 염기 서열의 제1번째∼제1371번째의 염기 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 하나의 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드;
(b) 서열 번호 5, 11, 13 및 23으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드;
(c) 서열 번호 5, 11, 13 및 23으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나의 아미노산 서열에 있어서 1개∼15개의 아미노산이 결실(缺失), 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 UDP-글루쿠론산 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드;
(d) 서열 번호 5, 11, 13 및 23으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나의 아미노산 서열에 대하여, 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 가지며, 또한 UDP-글루쿠론산 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드;
(e) 서열 번호 4로 표시되는 염기 서열의 제1번째∼제1359번째의 염기 서열, 서열 번호 10으로 표시되는 염기 서열의 제1번째∼제1365번째의 염기 서열, 서열 번호 12로 표시되는 염기 서열의 제1번째∼제1371번째의 염기 서열, 및 서열 번호 22로 표시되는 염기 서열의 제1번째∼제1371번째의 염기 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 하나의 염기 서열과 상보적인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 엄격(stringent)한 조건하에서 하이브리드화하고, 또한 UDP-글루쿠론산 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드; 또는
(f) 서열 번호 5, 11, 13 및 23으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기 서열과 상보적인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에서 하이브리드화하고, 또한 UDP-글루쿠론산 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드.
제1항에 있어서, 이하의 (g)∼(j) 중 어느 하나인 폴리뉴클레오티드:
(g) 서열 번호 5, 11, 13 및 23으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나의 아미노산 서열에 있어서 10개 이하의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 UDP-글루쿠론산 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드;
(h) 서열 번호 5, 11, 13 및 23으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나의 아미노산 서열에 대하여, 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 가지며, 또한 UDP-글루쿠론산 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드;
(i) 서열 번호 4로 표시되는 염기 서열의 제1번째∼제1359번째의 염기 서열, 서열 번호 10으로 표시되는 염기 서열의 제1번째∼제1365번째의 염기 서열, 서열 번호 12로 표시되는 염기 서열의 제1번째∼제1371번째의 염기 서열, 및 서열 번호 22로 표시되는 염기 서열의 제1번째∼제1371번째의 염기 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 하나의 염기 서열과 상보적인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 고엄격 조건하에서 하이브리드화하고, 또한 UDP-글루쿠론산 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드; 또는
(j) 서열 번호 5, 11, 13 및 23으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기 서열과 상보적인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 고엄격 조건하에서 하이브리드화하고, 또한 UDP-글루쿠론산 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드.
제1항에 있어서, 서열 번호 4로 표시되는 염기 서열의 제1번째∼제1359번째의 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드.
제1항에 있어서, 서열 번호 10으로 표시되는 염기 서열의 제1번째∼제1365번째의 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드.
제1항에 있어서, 서열 번호 12로 표시되는 염기 서열의 제1번째∼제1371번째의 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드.
제1항에 있어서, 서열 번호 22로 표시되는 염기 서열의 제1번째∼제1371번째의 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드.
제1항에 있어서, 서열 번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드.
제1항에 있어서, 서열 번호 11로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드.
제1항에 있어서, 서열 번호 13으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드.
제1항에 있어서, 서열 번호 23으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, DNA인 폴리뉴클레오티드.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 단백질.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드가 도입된 형질 전환체.
제13항에 기재된 벡터가 도입된 형질 전환체.
제14항 또는 제15항에 기재된 형질 전환체를 이용하는 것인 제12항의 단백질의 제조 방법.
제12항에 기재된 단백질을 촉매로 하여, UDP-글루쿠론산과 플라보노이드로부터 글루쿠론산 포합체를 생성하는 것인 글루쿠론산 포합체의 제조 방법.