CN101407816B

CN101407816B - Udp-葡萄糖醛酸转移酶及编码该酶的多核苷酸

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Publication number: CN101407816B
Application number: CN2008101692589A
Authority: CN
Inventors: 小野荣一郎; 野口秋雄; 福井祐子; 水谷正子
Original assignee: Suntory Holdings Ltd
Current assignee: Suntory Holdings Ltd
Priority date: 2007-10-12
Filing date: 2008-10-10
Publication date: 2012-10-10
Anticipated expiration: 2028-10-10
Also published as: CO6210706A2; BRPI0818531A2; TW200920844A; US8628938B2; JP4927774B2; US20100323402A1; TWI363799B; CN101407816A; CA2702035C; CA2702035A1; ECSP10010082A; WO2009047992A1; AU2008310396A1; JP2009106265A; EP2199388B1; RU2010119028A; KR20100081981A; EP2199388A1; EP2199388A4

Abstract

本发明提供底物特异性广泛的新型UDP—葡萄糖醛酸转移酶。本发明提供新型UDP—葡萄糖醛酸转移酶及编码该酶的多核苷酸(例如，多核苷酸，其含有选自由序列号：4所表示的碱基序列的第1位～第1359位的碱基序列、序列号：10所表示的碱基序列的第1位～第1365位的碱基序列、序列号：12所表示的碱基序列的第1位～第1371位的碱基序列及序列号：22所表示的碱基序列的第1位～第1371位的碱基序列所组成的组中的1个碱基序列所组成的多核苷酸；或多核苷酸，其含有编码具有选自由序列号：5、11、13及23所组成的组中的1个氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸)等。

Description

UDP-葡萄糖醛酸转移酶及编码该酶的多核苷酸

技术领域

本发明涉及UDP—葡萄糖醛酸转移酶、编码该酶的多核苷酸、含有该多核苷酸的载体、转化体等。

背景技术

以食用经验丰富的类黄酮、木脂素为代表的多酚类植物的次生代谢产物，由于具有以抗氧化性为代表的功能性，从而从很早以前就作为功能性材料受到注目，且已作为保健食品进行销售。例如，槲皮素(类黄酮)、OTPP(类黄酮)、芝麻素(木脂素)等均是保健食品的代表性材料。

对植物细胞中类黄酮的生物合成途径的研究从很早以前就已开始，且对分离催化代谢途径的生物合成酶及编码该酶的基因以及对其分子结构的理解也在深入。

另一方面，对植物次生代谢产物被摄入体内(in vivo)后，以何种形态代谢、是否体现功能这方面的认识还很缺乏。

已知一般植物的次生代谢产物的糖苷化不管糖的种类(葡萄糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖等)，均由属于被称作UDP—糖转移酶(UGT：UDP-glycosyltransferase)的超家族的酶催化。且在芝麻素的研究例中显示出，次生代谢产物在体内经过儿茶酚而作为葡萄糖醛酸结合物而存在，所以，认为此葡萄糖醛酸结合物担负植物次生代谢产物在体内功能表达的一部分。

已证实作为哺乳类中的槲皮素代谢物，存在有4种单葡萄糖醛酸(monoglucuronide)(Q-3-GlcA、Q-7-GlcA、Q-3′-GlcA、Q-4′-GlcA)(非专利文献1：Day，AJ et al.Free Radic.Res.35，941-952，2001；非专利文献2：Moon，JH.et al.Free Radical Biology&Medicine30，1274-1285，2001；非专利文献3：O′Leary，KA.et al.Biochemical Pharmacology65，479-491，2003；非专利文献4：van der Woude，H.et al.Chem Res Toxicol.17，1520-1530，2004)，但要了解它们在生物体内的功能，则需要获得充分量的化合物以测定其活性。但是，至今为止底物特异性广泛的适合的UDP—葡萄糖醛酸转移酶还不为人所知，且化学合成结合位置特异的反应生成物在现实中还不可能。

已知唇形科黄芩(Scutellaria baicalensis)的根被称为黄芩，蓄积了抗氧化性高的黄酮的7位葡萄糖醛酸结合物，在食品药品划分上被分类为医药品(非专利文献5：Gao，Z.et al.Biochemica et Biophysica Acta1472，643—650.1999)。到目前为止，从唇形科黄芩中，作为黄酮的7位葡萄糖醛酸转移酶的Sb7GAT已被纯化，但本酶只对黄酮7位羟基的邻位上具有羟基等取代基的黄酮(黄芩黄素、高黄芩素等)具有活性，而对于作为主要的黄酮的芹菜素、毛地黄黄酮、还有作为黄酮醇的槲皮素不具有活性(非专利文献6：Nagashima S.etal.，Phytochemistry53，533—538，2000.)。此外，对应此Sb7GAT的基因虽已在美国基因数据库(GenBank)中注册(注册号No.AB042277)，但其功能还未得到证实。

另外，已知在具有食用经验的唇形科紫苏(Perilla frutescens一种红叶品种)中，蓄积了与黄芩相比更多种的黄酮7位葡萄糖醛酸结合物(非专利文献7：Yamazaki，M.et al.Phytochemistry62，987—998.2003)。

非专利文献1：Day，AJ et al.Free Radic.Res.35，941-952，2001

非专利文献2：Moon，JH.et al.Free Radical Biology&Medicine30，1274-1285，2001

非专利文献3：O′Leary，KA.et al.Biochemical Pharmacology65，479-491，2003

非专利文献4：van der Woude，H.et al.Chem Res Toxicol.17，1520-1530，2004

非专利文献5：Gao，Z.et al.Biochemica et Biophysica Acta1472，643—650，1999

非专利文献6：Nagashima S.et al.，Phytochemistry53，533—538，2000.

非专利文献7：Yamazaki，M.et al.Phytochemistry62，987—998，2003

发明内容

此种状况下，希望鉴定出底物特异性广泛的新型UDP—葡萄糖醛酸转移酶及编码该酶的基因。

本发明鉴于上述状况，提供如下述所示的UDP—葡萄糖醛酸转移酶、编码该酶的多核苷酸、以及含有该多核苷酸的载体及转化体等。

(1)多核苷酸，其是以下(a)～(f)中任一项所述的多核苷酸：

(a)多核苷酸，其含有，选自由序列号：4所表示的碱基序列的第1位～第1359位的碱基序列、序列号：10所表示的碱基序列的第1位～第1365位的碱基序列、序列号：12所表示的碱基序列的第1位～第1371位的碱基序列以及序列号：22所表示的碱基序列的第1位～第1371位的碱基序列所组成的组中的1个碱基序列所组成的多核苷酸；

(b)多核苷酸，其含有编码蛋白质的多核苷酸，该蛋白质具有选自由序列号：5、11、13及23所组成的组中的1个氨基酸序列；

(c)多核苷酸，其含有编码蛋白质的多核苷酸，该蛋白质由选自由序列号：5、11、13及23所组成的组中的1个氨基酸序列中1～15个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列所组成并且具有UDP—葡萄糖醛酸转移酶活性；

(d)多核苷酸，其含有编码蛋白质的多核苷酸，该蛋白质具有与选自由序列号：5、11、13及23所组成的组中的1个氨基酸序列有80％以上同源性的氨基酸序列，并且具有UDP—葡萄糖醛酸转移酶活性；

(e)多核苷酸，其含有，与选自由序列号：4所表示的碱基序列的第1位～第1359位的碱基序列、序列号：10所表示的碱基序列的第1位～第1365位的碱基序列、序列号：12所表示的碱基序列的第1位～第1371位的碱基序列及序列号：22所表示的碱基序列的第1位～第1371位的碱基序列所组成的组中的1个碱基序列的互补碱基序列所组成的多核苷酸在严谨条件下杂交并且编码具有UDP—葡萄糖醛酸转移酶活性的蛋白质的多核苷酸；或

(f)多核苷酸，其含有，与由编码选自由序列号：5、11、13及23所组成的组中的1个氨基酸序列所组成的蛋白质的多核苷酸碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交并且编码具有UDP—葡萄糖醛酸转移酶活性的蛋白质的多核苷酸。

(2)上述(1)中所述的多核苷酸，其是以下(g)～(j)中的任一项：

(g)多核苷酸，其含有编码蛋白质的多核苷酸，该蛋白质由选自由序列号：5、11、13及23所组成的组中的1个氨基酸序列中10个以下(0～10个)的氨基酸发生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列所组成，并且具有UDP—葡萄糖醛酸转移酶活性；

(h)多核苷酸，其含有编码蛋白质的多核苷酸，该蛋白质具有与选自由序列号：5、11、13及23所组成的组中的1个氨基酸序列有90％以上同源性的氨基酸序列，并且具有UDP—葡萄糖醛酸转移酶活性；

(i)多核苷酸，其含有，与选自由序列号：4所表示的碱基序列的第1位～第1359位的碱基序列、序列号：10所表示的碱基序列的第1位～第1365位的碱基序列、序列号：12所表示的碱基序列的第1位～第1371位的碱基序列、及序列号：22所表示的碱基序列的第1位～第1371位的碱基序列所组成的组中的1个碱基序列的互补碱基序列所组成的多核苷酸在高严谨条件下杂交并且编码具有UDP—葡萄糖醛酸转移酶活性的蛋白质的多核苷酸；或

(j)多核苷酸，其含有，与由编码选自由序列号：5、11、13及23所组成的组中的1个氨基酸序列所组成的蛋白质的多核苷酸碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在高严谨条件下杂交并且编码具有UDP—葡萄糖醛酸转移酶活性的蛋白质的多核苷酸。

(3)上述(1)中所述的多核苷酸，其含有由序列号：4所表示的碱基序列的第1位～第1359位的碱基序列所组成的多核苷酸。

(4)上述(1)中所述的多核苷酸，其含有由序列号：10所表示的碱基序列的第1位～第1365位的碱基序列所组成的多核苷酸。

(5)上述(1)中所述的多核苷酸，其含有由序列号：12所表示的碱基序列的第1位～第1371位的碱基序列所组成的多核苷酸。

(6)上述(1)中所述的多核苷酸，其含有由序列号：22所表示的碱基序列的第1位～第1371位的碱基序列所组成的多核苷酸。

(7)上述(1)中所述的多核苷酸，其含有编码由序列号：5的氨基酸序列所组成的蛋白质的多核苷酸。

(8)上述(1)中所述的多核苷酸，其含有编码由序列号：11的氨基酸序列所组成的蛋白质的多核苷酸。

(9)上述(1)中所述的多核苷酸，其含有编码由序列号：13的氨基酸序列所组成的蛋白质的多核苷酸。

(10)上述(1)中所述的多核苷酸，其含有编码由序列号：23的氨基酸序列所组成的蛋白质的多核苷酸。

(11)上述(1)～(10)中任一项所述的多核苷酸，其是DNA。

(12)蛋白质，其由上述(1)～(11)中任一项所述的多核苷酸编码。

(13)载体，其含有上述(1)～(11)中任一项所述的多核苷酸。

(14)转化体，其中，导入了上述(1)～(11)中任一项所述的多核苷酸。

(15)转化体，其中，导入了上述(13)中所述的载体。

(16)上述(12)中的蛋白质的制方法，其中，使用上述(14)或(15)中所述的转化体。

(17)葡萄糖醛酸结合物的制造方法，其中，以上述(12)中所述的蛋白质为催化剂，由UDP—葡萄糖醛酸和类黄酮生成葡萄糖醛酸结合物。

本发明的多核苷酸，例如，通过导入转化体而有助于新型UDP—葡萄糖醛酸转移酶的制造。本发明优选方式的UDP—葡萄糖醛酸转移酶，底物特异性广泛，具有葡萄糖醛酸化多种糖受体底物的活性。

附图说明

图1表示来自金鱼草的AmUGTcg10、来自屋久岛光紫黄芩(Scutellarialaeteviolacea var.yakusimensis)的SlUGT、及来自紫苏的PfUGT50以及来自黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi.)的Sb7GAT的氨基酸序列的比对。

图2是表示分析PfUGT50的糖受体底物的底物特异性的结果的图。

图3是表示分析SlUGT的糖受体底物的底物特异性的结果的图。

图4是表示分析AmUGTcg10的糖受体底物的底物特异性的结果的图。

图5是表示分析SiUGT23的糖受体底物的底物特异性的结果的图。

图6是表示对SlUGT与SC1的反应液中生成物的LC-MS分析结果的图。图中的箭头表示生成物。

图7是表示SC1与SlUGT1的反应生成物的MS分析结果的图。

图8是表示槲皮素与SlUGT1的反应生成物的LC分析结果的图。

具体实施方式

以下详细说明本发明的UDP—葡萄糖醛酸转移酶、编码该酶的多核苷酸、含有该多核苷酸的载体、转化体等。

1.本发明的多核苷酸

首先，本发明提供，(a)多核苷酸，其含有选自由序列号：4所表示的碱基序列的第1位～第1359位的碱基序列、序列号：10所表示的碱基序列的第1位～第1365位的碱基序列、序列号：12所表示的碱基序列的第1位～第1371位的碱基序列以及序列号：22所表示的碱基序列的第1位～第1371位的碱基序列所组成的组中的1个碱基序列所组成的多核苷酸(具体地说为DNA，以下，也将这些单称为“DNA”)；及(b)多核苷酸，其含有编码蛋白质的多核苷酸，该蛋白质具有选自由序列号：5、11、13及23所组成的组中的1个氨基酸序列。本发明中作为对象的DNA，不限于编码上述的UDP—葡萄糖醛酸转移酶的DNA，还包含编码与此蛋白质功能相同的蛋白质的其他DNA。功能相同的蛋白质，例如，可例举为(c)蛋白质，其由选自由序列号：5、11、13及23所组成的组中的1个氨基酸序列中1～15个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列所组成并且具有UDP—葡萄糖醛酸转移酶活性。此种蛋白质，可例举为蛋白质，其由选自由序列号：5、11、13及23所组成的组中的1个氨基酸序列中例如，1～15个、1～14个、1～13个、1～12个、1～11个、1～10个、1～9个、1～8个、1～7个、1～6个(1～数个)、1～5个、1～4个、1～3个、1～2个、1个的氨基酸残基发生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列所组成并且具有UDP—葡萄糖醛酸转移酶活性。上述氨基酸残基缺失、取代、插入及/或附加的数量，一般越小越优选。并且此种蛋白质，可例举为蛋白质，其具有与选自由序列号：5、11、13及23所组成的组中的1个氨基酸序列有约80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上同源性的氨基酸序列，并且具有UDP—葡萄糖醛酸转移酶活性。上述同源性的数値一般越大越好。

在此处，“UDP—葡萄糖醛酸转移酶活性”，是指催化下述反应的活性，即，葡萄糖醛酸化类黄酮、茋及木脂素等的羟基(例如将黄酮的7位的羟基葡萄糖醛酸化)生成葡萄糖醛酸结合物的反应。

UDP—葡萄糖醛酸转移酶活性，例如，可通过使UDP—葡萄糖醛酸与糖受体底物(例如，黄酮)在作为评价对象的酶的存在下反应，用HPLC等分析得到的反应物来进行测定(更具体地，参照后述实施例中的记载)。

此外，本发明还包含，(e)多核苷酸，其含有，与选自由序列号：4所表示的碱基序列的第1位～第1359位的碱基序列、序列号：10所表示的碱基序列的第1位～第1365位的碱基序列、序列号：12所表示的碱基序列的第1位～第1371位的碱基序列及序列号：22所表示的碱基序列的第1位～第1371位的碱基序列所组成的组中的1个碱基序列的互补碱基序列所组成的多核苷酸在严谨条件下杂交并且编码具有UDP—葡萄糖醛酸转移酶活性的蛋白质的多核苷酸；以及(f)多核苷酸，其含有，与由编码选自由序列号：5、11、13及23所组成的组中的1个氨基酸序列所组成的蛋白质的多核苷酸碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交并且编码具有UDP—葡萄糖醛酸转移酶活性的蛋白质的多核苷酸。

本说明书中，“多核苷酸”是指DNA或RNA。

本说明书中，“在严谨条件下杂交的多核苷酸”是指，例如，以选自由序列号：4所表示的碱基序列的第1位～第1359位的碱基序列、序列号：10所表示的碱基序列的第1位～第1365位的碱基序列、序列号：12所表示的碱基序列的第1位～第1371位的碱基序列及序列号：22所表示的碱基序列的第1位～第1371位的碱基序列所组成的组中的1个碱基序列的互补碱基序列所组成的多核苷酸、或编码选自由序列号：5、11、13及23所组成的组中的1个氨基酸序列的多核苷酸碱基序列的互补碱基序列所组成的多核苷酸的全部或一部分为探针，通过使用菌落杂交法、噬菌斑杂交法或Southern杂交法等所得到的多核苷酸。杂交的方法，例如可使用“Sambrook&Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual Vol.3，Cold SpringHarbor，Laboratory Press2001”、“Ausubel，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons1987-1997”等中所记载的方法。

本说明书中所述的“严谨条件”，可为低严谨条件、中严谨条件及高严谨条件中的任一种。“低严谨条件”，例如，为5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、32℃的条件。“中严谨条件”，例如，为5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、42℃的条件。“高严谨条件”，例如，为5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、50℃的条件。在上述条件中，越提高温度，越能期待高效地获得具有高同源性的DNA。但影响杂交严谨性的因素还可为温度、探针浓度、探针长度、离子强度、时间、盐浓度等多种因素，本领域技术人员通过适当选择这些因素，可实现同样的严谨条件。

并且杂交中使用市售的试剂盒时，例如，可使用Alkphos Direct LabellingReagents(Amersham Pharmacia公司制)。此时，根据试剂盒中附带的说明方案，与标记后的探针保温过夜后，将膜在55℃的条件下用含有0.1％(w/v)SDS的1次洗涤缓冲液洗涤，之后可检测杂交后的DNA。

除上述以外，可杂交的多核苷酸，通过FASTA、BLAST等同源性搜索软件，使用默认参数计算时，可例举为，与选自由序列号：4所表示的碱基序列的第1位～第1359位的碱基序列、序列号：10所表示的碱基序列的第1位～第1365位的碱基序列、序列号：12所表示的碱基序列的第1位～第1371位的碱基序列以及序列号：22所表示的碱基序列的第1位～第1371位的碱基序列所组成的组中的1个碱基序列、或与编码选自由序列号：5、11、13及23所组成的组中的1个氨基酸序列的DNA有约60％以上、约70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、或99.9％以上同源性的DNA。

并且氨基酸序列、碱基序列的同源性，可使用根据Karlin及Altschul的BLAST算法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，872264-2268，1990；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：5873，1993)决定。开发了基于BLAST算法的被称为BLASTN、BLASTX的程序(Altschul SF，et al：J.Mol.Biol.215：403，1990)。使用BLASTN分析碱基序列时，参数例如为score＝100、wordlength＝12。并且使用BLASTX分析氨基酸序列时，参数例如为score＝50、wordlength＝3。使用BLAST和Gapped BLAST程序时，使用各程序的默认参数。

上述本发明的多核苷酸，可通过公知的基因工程的方法或公知的合成方法获得。

2.本发明的蛋白质

本发明还在其他的实施方式中，提供由上述多核苷酸(a)～(f)中任一个编码的蛋白质。本发明的优选蛋白质，是蛋白质，其由选自由序列号：5、11、13及23所组成的组中的1个氨基酸序列中1～15个的氨基酸发生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列所组成并且具有UDP—葡萄糖醛酸转移酶活性。此种蛋白质，可例举为，由选自由序列号：5、11、13及23所组成的组中的1个氨基酸序列中的如上述数量的氨基酸残基发生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列所组成并且具有UDP—葡萄糖醛酸转移酶活性。并且此种蛋白质，可例举为蛋白质，其具有与选自由序列号：5、11、13及23所组成的组中的1个氨基酸序列有如上所述的同源性的氨基酸序列并且具有UDP—葡萄糖醛酸转移酶活性。此种蛋白质，可使用“Sambrook &Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual Vol.3，Cold Spring Harbor，Laboratory Press2001”、“Ausubel，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons1987—1997”、“Nuc.Acids.Res.，10，6487(1982)”、“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，6409(1982)”、“Gene，34，315(1985)”、“Nuc.Acids.Res.，13，4431(1985)”、“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，488(1985)”等中所述的定点诱变法获得。

本发明的蛋白质氨基酸序列中1个以上的氨基酸残基发生缺失、取代、插入及/或附加，是指在同一序列中任意的、并且1个或多个氨基酸序列的位置上有1个或多个氨基酸残基发生缺失、取代、插入及/或附加之意，缺失、取代、插入及附加中的2种以上也可同时发生。

以下，举例表示可相互取代的氨基酸残基。同一组中包含的氨基酸残基可相互取代。A组：亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2—氨基丁酸、蛋氨酸、o—甲基丝氨酸(o—methylserine)、叔丁基甘氨酸(t—butyl glycine)、叔丁基丙氨酸(t—butyl alanine)、环己基丙氨酸(cyclohexyl alanine)；B组：天冬氨酸、谷氨酸、异天冬氨酸、异谷氨酸(isoglutamic acid)、2—氨基己二酸、2—氨基辛二酸(2—aminosuberic acid)；C组：天冬酰胺、谷氨酰胺；D组：赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2，4—二氨基丁酸、2，3—二氨基丙酸；E组：脯氨酸、3—羟基脯氨酸、4—羟基脯氨酸；F组：丝氨酸、苏氨酸、高丝氨酸；G组：苯丙氨酸、酪氨酸。

本发明的蛋白质可通过Fmoc法(9-芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基法)等的化学合成法制造。也可利用Advanced Chem Tech公司制、珀金埃尔默(Perkin Elmer)公司制、Pharmacia公司制、Protein TechnologyInstruments公司制、Synthecell-Vega公司制、PerSeptive公司制、岛津制作所制等的肽合成仪进行化学合成。

在此，本发明的蛋白质是UDP—葡萄糖醛酸转移酶。“UDP—葡萄糖醛酸转移酶”，催化下述反应，即，以UDP—葡萄糖醛酸作为糖供体将葡萄糖醛酸残基转移到糖受体底物生成葡萄糖醛酸结合物和UDP的反应。本发明中，糖受体底物例如为类黄酮、茋、及木脂素。

类黄酮中，包含黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、异黄酮、黄酮C糖苷、噢哢、及儿茶素等。其中，黄酮，例如可例举为黄芩黄素、高黄芩素、芹菜素、毛地黄黄酮、五羟黄酮、洋芫荽黄素及金圣草黄素。黄酮醇，例如可例举为槲皮素、杨梅黄素及山奈黄素。二氢黄酮，例如可例举为柑桔素。异黄酮，例如可例举为染料木素、大豆黄素及刺芒柄花素。黄酮C糖苷，例如可例举为牡荆葡基黄酮、异牡荆葡基黄酮及荭草素。噢哢，例如可例举为金鱼草素。儿茶素，例如可例举为儿茶素及表没食子儿茶素没食子酸酯。

茋中包含白藜芦醇(Resveratrol)及其糖苷云杉新苷(piceid)等。

木脂素中包含(+)-松脂醇((+)-Pinoresinol)、(+)-胡椒醇((+)-Piperitol)、(+)-芝麻素酚((+)-Sesaminol)、(+)-开环异落叶松树脂酚((+)-Secoisolariciresinol)、(+)-芝麻素儿茶酚1((+)-Sesamim catecol1)(SC1)、(+)-芝麻素儿茶酚2((+)-Sesamim catecol2)(SC2)、(+)-表芝麻素儿茶酚2((+)-Episesamim catecol2)(EC2)及罗汉松脂酚(matairesinol)等。

并且，例如，具有序列号：5的氨基酸序列的UDP—葡萄糖醛酸转移酶(PfUGT50)，当糖受体底物为黄芩黄素、芹菜素、高黄芩素、毛地黄黄酮、五羟黄酮、洋芫荽黄素、金圣草黄素、槲皮素、杨梅黄素、山奈黄素、柑桔素及金鱼草素等的类黄酮时、为白藜芦醇等的茋时以及为SC1等的木脂素时具有活性，特别是为黄芩黄素、芹菜素、高黄芩素、毛地黄黄酮、五羟黄酮、洋芫荽黄素、金圣草黄素、槲皮素及金鱼草素时，与其他糖受体底物相比具有强活性。

具有序列号：11的氨基酸序列的UDP—葡萄糖醛酸转移酶(SlUGT)，当糖受体底物为黄芩黄素、芹菜素、高黄芩素、毛地黄黄酮、五羟黄酮、洋芫荽黄素、金圣草黄素、槲皮素、山奈黄素、柑桔素、染料木素、大豆黄素、刺芒柄花素、及杨梅黄素等的类黄酮时、为七叶亭等的香豆素时、为白藜芦醇等的茋时、以及为SC1、SC2及EC2等的木脂素时具有活性，特别是为黄芩黄素及芹菜素时，与其他糖受体底物相比具有强活性。

具有序列号：13的氨基酸序列的UDP—葡萄糖醛酸转移酶(AmUGTcg10)，当糖受体底物为黄芩黄素、芹菜素、高黄芩素、毛地黄黄酮、五羟黄酮、洋芫荽黄素、金圣草黄素、槲皮素、山奈黄素、柑桔素及金鱼草素等的类黄酮时、以及为白藜芦醇等的茋时具有活性，特别是为黄芩黄素、芹菜素、高黄芩素、毛地黄黄酮、五羟黄酮、洋芫荽黄素、金圣草黄素、山奈黄素及柑桔素等的类黄酮时，与其他的糖受体底物相比具有强活性。

具有序列号：23的氨基酸序列的UDP—葡萄糖醛酸转移酶(SiUGT23)，当糖受体底物为黄芩黄素、芹菜素、高黄芩素、毛地黄黄酮、五羟黄酮、洋芫荽黄素、金圣草黄素、异牡荆葡基黄酮、槲皮素、山奈黄素、柑桔素、金鱼草素、刺芒柄花素等的类黄酮时、为七叶亭等的香豆素时、为白藜芦醇等的茋时、以及为SC1等的木脂素时具有活性，特别是为黄芩黄素、高黄芩素、毛地黄黄酮、五羟黄酮、山奈黄素及金鱼草素等的类黄酮时，与其他的糖受体底物相比具有强活性。

3.载体及导入该载体的转化体

本发明还在其他的实施方式中，提供含有本发明的多核苷酸的表达载体。本发明的表达载体含有上述(a)～(f)中的任一个多核苷酸。优选本发明的表达载体含有(g)～(j)的任一个多核苷酸。进一步优选本发明的表达载体含有如下多核苷酸，其含有，选自由序列号：4所表示的碱基序列的第1位～第1359位的碱基序列组成的多核苷酸、序列号：10所表示的碱基序列的第1位～第1365位的碱基序列组成的多核苷酸、序列号：12所表示的碱基序列的第1位～第1371位的碱基序列组成的多核苷酸以及序列号：22所表示的碱基序列的第1位～第1371位的碱基序列组成的多核苷酸所组成的组中的1个多核苷酸，或选自由编码序列号：5的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸、编码序列号：11的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸、编码序列号：13的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸：23的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸所组成的组中的1个多核苷酸。

本发明的载体，通常如下构成，其含有(i)在宿主细胞内可转录的启动子；(ii)与该启动子结合的、上述(a)～(j)中任一项所述的多核苷酸；及(iii)与RNA分子的转录终止及多聚腺苷化有关的在宿主细胞内起作用的信号作为构成因子的表达盒。如此构建的载体被导入宿主细胞。表达载体的制备方法，可例举为使用质粒、噬菌体或粘粒等的方法，但无特别限定。

载体的具体种类无特别限定，可适当选择在宿主细胞中可表达的载体。即对应宿主细胞的种类，为确实地使本发明的多核苷酸表达，可选择适合的启动子序列，将其与本发明的多核苷酸整合进各种质粒等中的载体作为表达载体使用。

本发明的表达载体，依赖于应导入的宿主的种类，含有表达调控区(例如，启动子、终止子及/或复制起点等)。作为细菌用表达载体的启动子，使用常用的启动子(例如，trc启动子、tac启动子、lac启动子等)，酵母用启动子，例如可例举为3—磷酸甘油醛脱氢酶启动子、PH05启动子等，丝状菌用启动子例如可例举为淀粉酶、trpC等。并且动物细胞宿主用启动子可例举为病毒性启动子(例如，SV40早期启动子、SV40晚期启动子等)。

表达载体优选含有至少1个选择标记。此种标记可使用营养缺陷型标记(ura5、niaD)、抗药性标记(hygromycine、Zeocin)、氨基糖苷类抗生素抗性基因(ジエネチシン耐性遺伝子)(G418r)、铜抗性基因(CUP1)(Marinet al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，3371984)、浅蓝菌素抗性基因(fas2m，PDR4)(分别为猪腰淳嗣等，生化学，64，660，1992；Hussain et al.，gene，101，149，1991)(猪腰淳嗣ら，生化学，64，660，1992；Hussain et al.，gene，101，149，1991)等。

并且本发明提供导入了上述(a)～(j)中任一项所述的多核苷酸的转化体。

转化体的制备方法(生产方法)无特别限定，例如，可为将上述重组载体导入宿主转化的方法。在此使用的宿主细胞无特别限定，可优选使用以往公知的各种细胞。具体地说，例如，可例举为大肠杆菌(Escherichia coli)等的细菌、酵母(酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae、裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、线虫(Caenorhabditis elegans)、非洲爪蟾(Xenopus laevis)的卵母细胞等。用于上述宿主细胞的适合的培养基及条件为本领域所公知。并且作为转化对象的生物也无特别限定，可为上述宿主细胞中例举的各种微生物、植物或动物。

宿主细胞的转化方法可利用一般使用的公知的方法。例如，可用电穿孔法(Mackenxie D.A.et al.Appl.Environ.Microbiol.，66，4655-4661，2000)、粒子轰击法(particle delivery)(日本特开2005—287403《脂质生产菌的育种方法》中记载的方法)、原生质球法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75p1929(1978)]、醋酸锂法[J.Bacteriology，153，p163(1983)]、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75p1989(1978)、Methods in yeast genetics，2000Edition:A Cold SpringHarbor Laboratory Course Manual等中记载的方法实施，但不限于此。

4.本发明的蛋白质的制造方法

本发明还在其他的实施方式中，提供使用上述转化体的本发明的蛋白质的制造方法。

具体地说，可通过从上述转化体的培养物中分离·纯化本发明的蛋白质，来获得本发明的蛋白质。在此，培养物是指培养液、培养菌体或培养细胞、或者培养菌体或培养细胞的破碎物的任一种。本发明的蛋白质的分离·纯化，可根据通常的方法进行。

具体地说，本发明的蛋白质在培养菌体内或培养细胞内积累时，可在培养后，用通常的方法(例如，超音波、溶菌酶、冷冻溶解等)破碎菌体或细胞后，通过通常的方法(例如，离心分离、过滤等)得到本发明的蛋白质的粗提液。本发明的蛋白质在培养液中积累时，可在培养终止后，通过通常的方法(例如，离心分离、过滤等)将菌体或细胞与培养上清分离，来获得含有本发明的蛋白质的培养上清。

如此得到的提取液或培养上清中所含有的本发明的蛋白质的纯化，可根据通常的分离·纯化方法进行。分离·纯化方法，例如，可单独或适当组合使用硫酸铵沉淀、凝胶过滤色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法、反相高效液相色谱法、透析法、超滤法等。

5.葡萄糖醛酸结合物的制造方法

本发明还进一步提供使用本发明的蛋白质制造葡萄糖醛酸结合物的方法。本发明的蛋白质因催化将葡萄糖醛酸从UDP—葡萄糖醛酸转移到糖受体底物(例如，类黄酮、茋或木脂素)的反应，所以，通过使用本发明的蛋白质，以糖受体底物及UDP—葡萄糖醛酸为原料，可制造葡萄糖醛酸结合物。糖受体底物优选类黄酮。

例如，配制含有1mM的糖受体底物、2mM的UDP—葡萄糖醛酸、50mM的磷酸钙缓冲液(pH7.5)及20μM的本发明的蛋白质的溶液，通过在30℃下反应30分钟，可制造葡萄糖醛酸结合物。葡萄糖醛酸结合物可通过公知的方法从此溶液中分离·纯化。具体地说，例如，可单独或适当组合使用硫酸铵沉淀、凝胶过滤色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法、反相高效液相色谱法、透析法、超滤法等。

如此得到的葡萄糖醛酸结合物，作为用于测定在生物体内的功能的试剂、抗氧化剂等行之有效(Gao，Z.，Huang，K.，Yang，X.，and Xu，H.(1999)Biochimica et Biophysica Acta1472，643—650.)。

通过以下的实施例进一步详细说明本发明，但本发明不限于实施例。

实施例1

1.实施例1的概要

本实施例进行了如下尝试，从唇形科屋久岛光紫黄芩中通过PCR克隆Sb7GAT同源基因(SlUGT)，以此基因为探针，从来自积累了类黄酮的7位葡萄糖醛酸结合物的唇形科紫苏叶的cDNA文库中分离类黄酮的7位葡萄糖醛酸转移酶。

筛选的结果，鉴定了来自紫苏的糖苷化酶(PfUGT)中对于黄酮的7位羟基具有转移葡萄糖醛酸的活性的PfUGT50。此PfUGT50不仅对于黄芩黄素、高黄芩素、芹菜素、毛地黄黄酮等的黄酮类，对作为黄酮醇的槲皮素也具有葡萄糖醛酸转移活性。因此，可通过使用PfUGT50，将含有黄酮的多种类黄酮的7位在试管内(in vitro)进行葡萄糖醛酸化。

并且作为筛选探针分离的来自屋久岛光紫黄芩的SlUGT，对多种类黄酮也具有葡萄糖醛酸转移活性。此外，对于玄参科金鱼草，还探讨了与PfUGT50及SlUGT同源性高的UGT(UDP—葡萄糖醛酸转移酶)，鉴定了作为来自金鱼草的UGT的AmUGTcg10。大肠杆菌表达的AmUGTcg10蛋白质对于芹菜素、槲皮素、柑桔素具有葡萄糖醛酸转移活性。因此，可表明结构类似的上述紫苏PfUGT50、光紫黄芩SlUGT及金鱼草AmUGTcg10是具有类黄酮的7位葡萄糖醛酸转移活性的酶。

2.紫苏cDNA文库中的糖苷化酶基因的分离

(1)探针的制备

本实施例中使用的分子生物学的方法，只要无其他详细叙述，均按照Molecular Cloning(Sambrook等、Cold Spring Harbour Laboratory Press，2001)中记载的方法。

使用RNeasy Plant迷你试剂盒(QIAGEN)，从屋久岛光紫黄芩的根中提取总RNA后，将用于RT-PCR的第一链合成系统[SuperScript^TM First-StrandSynthesis System for RT-PCR(Invitrogen公司)]按照制造商推荐的条件使用，由1μg总RNA合成cDNA。根据黄芩的Sb7GAT的序列(GenBank注册号No.AB042277)设计引物—Fw(序列号：1)和引物—Rv(序列号：2)，使用该引物以屋久岛光紫黄芩cDNA为模板进行PCR。

序列号：1：SlUGT—Fw：5’—AAACATATGGCGGTGCTGGCGAAGTTC—3’(下线为NdeI位点)

序列号：2：SlUGT—Rv：5’—TTTTGATCATTAATCCCGAGTGGCGTGAAG—3’(下线为BclI位点)

具体地说，PCR反应液(50μl)的组成为：屋久岛光紫黄芩(Scutellarialaeteviolacea v.yakus imensis)cDNA1μl、1×Taq缓冲液(buffer)(TaKaRa)、0.2mM dNTPs、引物(序列号：1及2)各0.4pmol/μl、rTaq聚合酶(polymerase)2.5U。PCR反应为94℃、反应3分钟后，进行30个循环的94℃1分钟、53℃1分钟、72℃2分钟的反应来进行扩增。

将扩增的片段插入到pCR—TOPOII载体(Invitrogen)的多克隆位点，使用插入片段的碱基序列DNA Sequencer model3100(Applied Biosystems)，使用合成寡核苷酸引物通过引物步查法确定碱基序列。用所得到的碱基序列的CLUSTAL—W程序(MACVECTOR7.2.2软件、Accerly公司)分析的结果，可证实得到了与黄芩有高同源性的屋久岛光紫黄芩UGT的部分序列(序列号：3)。将此来自屋久岛光紫黄芩的UGT作为SlUGT部分序列用作筛选探针的模板。

将非放射性同位素DIG—核酸检测系统(Roche公司)按照制造者推荐的PCR条件使用，在通过RT—PCR得到的片段(fragment)中导入DIG标记。具体地说，PCR反应液(50μl)的组成为：各cDNA1μl、1×Taq缓冲液(buffer)(TaKaRa)、0.2mM dNTPs、引物(序列号：1及2)各0.4pmol/μl、rTaq聚合酶(polymerase)2.5U。PCR反应在94℃、反应5分钟后，进行30个循环的94℃1分钟、53℃1分钟、78℃2分钟的反应的扩增。通过琼脂糖电泳证明SlUGT片段已被标记，将此DIG标记化片段(fragment)作为杂交用探针用于以下的实验。

(2)杂交

将非放射性同位素DIG—核酸检测系统(Roche公司)按照制造者推荐的条件使用，将来自紫苏(品种：赤缩缅紫苏)的叶的cDNA文库(Yonekura—Sakakibara，K.et al.，Plant Cell Physiol.41，495—502.2000)使用前述SlUGT探针进行筛选。

使用杂交缓冲液[5×SSC、30％甲酰胺、50mM磷酸钠缓冲液(PH7.0)、1％SDS、2％封闭试剂(Roche)、0.1％十二烷基肌氨酸、80g/ml鲑鱼精子DNA)，40℃下进行1小时预杂交后，添加变性探针，保温过夜。将膜在含有1％SDS的4×SSC洗涤液中58℃下洗涤30分钟。筛选约1×10⁶pfu的噬菌斑，得到约300个阳性克隆。

(3)基因鉴定

将阳性克隆通过二次筛选形成单噬斑，使用M13RV及M13M4(—20)的引物对，扩增插入物片段，确定插入部分的DNA序列。使用基于所得到的DNA序列而得到的推测氨基酸序列通过Blastx的数据库检索，其结果，得到与SlUGT及Sb7GAT有高同源性的紫苏UGT(PfUGT50)(序列号：4、5)。

将所得到的全长PfUGT50与SlUGT及Sb7GAT用CLUSTAL-W程序(MACVECTOR7.2.2软件、Accerly公司)分析的结果，有力地证明了SlUGT及Sb7GAT均是5’端区域欠缺的不完整ORF(Open Reading Frame)。因此，将Gene Racer kit(Invitrogen公司)用制造商推荐的方法进行cDNA末端快速扩增(Rapid Amplification of cDNA End)(以下称RACE)，扩增了SlUGT的5’及3’端区域。RACE中，使用如下所示的各SlUGT基因的特异性引物对(序列号：6～9)。

序列号：6：GR—SlUGT—Rv：5’—TGG GAG GCA AAC CAG GGA TCTCGA CAA

序列号：7：SlUGT—nest—Rv：5’—AAT CAT CCA AAT CTT TAA GGT

序列号：8：GR—SlUGT—Fw：5’—AGA AGG GGT GTG TTC TCC GCTGAG CAA

序列号：9：SlUGT—nest—Fw：5’—GAA CAG CGG TCA CAG ATT TCT

对于各扩增产物，使用合成寡核苷酸引物通过引物步查法确定碱基序列，得到包含全长ORF的SlUGT基因及氨基酸序列(序列号：10、11)。

文献报道了不仅在紫苏及屋久岛光紫黄芩中，在玄参科金鱼草(Antirrhinum majus)中也有作为黄酮的一种的芹菜素7位葡萄糖醛酸结合物(Harbome，J.B.Phytochemistry2，327—334.1963)。因以前分离的用序列号：12及13表示的功能未知的金鱼草糖苷化酶AmUGTcg10与本实施例中分离的PfUGT50及SlUGT有高的同源性，所以，AmUGTcg10也作为酶分析用的候补基因(Ono，E.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA103，11075—11080.2006)。

上述得到的来自金鱼草的AmUGTcg10、来自屋久岛光紫黄芩的SlUGT及来自紫苏的PfUGT50的比对如图1所示。并且图1中一同记入了来自黄芩的Sb7GAT。

3.紫苏叶中类黄酮的提取和纯化

(1)高黄芩素7-葡萄糖醛酸(Scutellarein7—glucuronide)的纯化

将200片、144.4g青紫苏的叶(爱知产·丰桥温室联合)在液氮中粉碎，在1.5L的50％CH₃CN、0.1％HCOOH中浸渍过夜，硅藻土过滤。减压浓缩滤液，将浓缩液装入600ml的CHP—20P中，用水、10，20，30，40，50％CH₃CN/H₂O各300mlx2进行阶段梯度洗脱，将确认了多酚类的洗脱的10％—2～50％—1的各组分进行浓缩、冷冻干燥，用HPLC分析。收量为10％—2(12.1mg)、20％—1(52.5mg)、20％—2(122.4mg)、30％—1(227.5mg)、30％—2(262.8mg)、40％—1(632.4mg)、40％—2(192.0mg)、50％—1(113.2mg)，40％—1高纯度含有迷迭香酸(rosmarinic acid)，其它均是含有黄酮的组分。将30％—2组分用下述制备型HPLC纯化，得到16mg高黄芩素7-葡萄糖醛酸。

制备型HPLC条件

色谱柱：Develosil C—30—UG5，20mm x250mm，

流动相：A—0.1％TFA，B—0.05％TFA/90％CH₃CN，

流速：6ml/min.

梯度：B20→B60％(100min)，B60％iso(20min)

检测：A280nm

(2)高黄芩素7-葡萄糖醛酸的水解和苷元的纯化

将上述(1)中得到的高黄芩素7-葡萄糖醛酸中的3mg溶解于100μL的DMSO中，用15ml的离心管(Falcon tube)分为两份。在各试管中加入10ml的H₂O和2.5ml的0.2M醋酸钠缓冲液(pH5.0)及0.8mlβ—莆萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶(β—Glucronidase/Arylsulfatase)(EC3.2.1.31/EC3.1.6.1、RocheDiagnostics GmbH制)溶液，37℃下保温2小时。将反应终止液装入Sep—Pak—C18(20cc)中，在水、20ml之后，用20ml10％EtOH除去盐类、蛋白类，用40ml80％CH₃CN+0.05％TFA洗脱、浓缩、冷冻干燥生成的苷元。将此组分用下述制备型HPLC纯化，得到0.4mg的高黄芩素(苷元)。

制备型HPLC条件

色谱柱：Develosil C—30—UG5，20mmx250mm，

流动相：A—0.1％TFA，B—0.05％TFA/90％CH₃CN，

流速：6ml/min.

梯度：B15→B70％(60min)，B70％iso(10min)

检测：A330nm

4.重组紫苏糖苷化酶的表达和活性测定

(1)表达载体构建

将上述相互间同源性高的、含有来自紫苏的PfUGT50、来自屋久岛光紫黄芩的S1UGT及来自金鱼草的AmUGTcg10的3种糖苷化酶的全长ORF的cDNA分别通过基因特异性引物对(PfUGT50，序列号：14—15；S1UGT，序列号：16—17；AmUGTcg10，序列号：18—19)扩增。模板分别使用由紫苏叶、屋久岛光紫黄芩根、金鱼草花瓣中提取的总RNA合成的cDNA。

序列号：14：PfUGT50—fw：5’—AAACATATGGAAGGCGTCATACTTC—3’(下线为NdeI位点)

序列号：15：PfUGT50—rv：5’—TTTTGATCATTAATCACGAGTTACGGAATC—3’(下线为BclI位点)

序列号：16：SlUGT—fw：5’—AAACATATGGAGGACACGATTGTTATC—3’(下线为NdeI位点)

序列号：17：S1UGT—rv：5’—TTCATATGTCAATCCCTCGTGGCCAGAAG—3’(下线为NdeI位点)

序列号：18：AmUGTcg10—fw：5’—AAACATATGGAGGACACTATCGTTCTC—3’(下线为NdeI位点)

序列号：19：AmUGTcg10—rv：5’—TTGGATCCTTAAGAAACCACCATATCAAC—3’(下线为BamHI位点)

PCR反应(KOD—Plus—，TOYOBO)用94℃，2min；[94℃，15sec；50℃，30sec；68℃，1.5min]×35循环(cycles)进行。将经扩增的DNA片段亚克隆到pCR—Blunt II—TOPO载体(Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit，invitrogen)，通过ABI3100Avant(Applied Biosystems)进行碱基序列的确认。对于PfUGT50，通过转化所得到的plus株得到非甲基化质粒。所得到的质粒，PfUGT50用NdeI和BclI、S1UGT用NdeI、AmUGTcg10用NdeI和BamHI分别酶切，将产生的约1.5kb的DNA片段与PfUGT50和AmUGTcg10用NdeI和BamHI酶切、S1UGT用NdeI酶切的pET—15连接。

(2)重组大肠杆菌的培养和蛋白质的纯化

使用上述4—(1)中得到的各个质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)株。将所得到的转化体在4ml含有50μg/ml的氨苄青霉素的LB培养基(10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母膏，1g/l NaCl)中37℃下振荡培养过夜。将达到静止期的4ml培养液接种到同样组成的80ml培养基中，37℃下振荡培养。菌体浊度(OD₆₀₀)约达到0.5时，添加使最终浓度为0.4mM的IPTG(异丙基-β-D硫代半乳糖苷)，22℃下振荡培养20小时。以下的所有操作均在4℃下进行。将培养后的转化体用离心分离(7,000×g，15min)集菌，添加缓冲液S(BufferS)[20mM磷酸钠缓冲液(pH7.4)，20mM咪唑(imidazole)，0.5M NaCl，14mMβ—巯基乙醇]2ml/gcell，悬浮。然后进行超音波破碎(15sec×8次)，离心分离(15,000×g，10min)。在所得到的上清中添加使最终浓度为0.12％(w/v)的聚乙烯亚胺、悬浮，静置30min。进行离心分离(15,000×g，10min)，将上清作为粗酶液回收。将粗酶液用在由缓冲液S(Buffer S)平衡的HisSpinTrap(GE Healthcare)中，进行离心(70×g，30sec)。用缓冲液S(BufferS)600μl洗涤后，用含有100、200、500mM咪唑(imidazole)的缓冲液S(Buffer S)各600μl，将与色谱柱结合的蛋白质进行阶段梯度洗脱。将各洗脱组分使用离心超滤管(Microcon)YM—30(Amicon)置换为含有14mMβ—巯基乙醇的20mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)。SDS—PAGE分析的结果，因在100mM及200mM咪唑(imidazole)洗脱组分中确认有目的大小的蛋白质，所以，将上述组分混合用于分析。这些组分中不单是目的蛋白质。

(3)酶反应和HPLC分析条件

标准的反应条件如下所示。配制50μl反应液[2mM UDP—葡萄糖醛酸，100μM糖受体底物，50mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)，酶溶液]，通过添加酶溶液开始反应，30℃下反应30分钟。通过添加50μl含有0.5％TFA的CH₃CN终止反应，用HPLC分析。HPLC条件如下所示。色谱柱，Develosil C30—UG—5(4.6×150mm)；洗脱液A，0.1％TFA/H₂O；洗脱液B，0.08％TFA/90％CH₃CN；洗脱条件A(除噢哢、儿茶素、香豆素、苯丙素以外)，0min/5％B→18min/100％B液→18.1min/5％B→25min/5％B；洗脱条件B(噢哢、儿茶素、香豆素、苯丙素)，0min/5％B→20min/50％B液→20.5min/5％B→25min/5％B；流速，1ml/min；检测波长：280，350nm。以下表示各种鉴定的方法及结果。

糖受体底物特异性分析

根据上述方法，分析针对各种糖受体底物的特异性(图2～4)。

图2表示PfUGT50糖受体底物的底物特异性的分析结果。图2表示对于高黄芩素(Scutellarein)的活性为100％时对各底物的相对活性。分析的结果，PfUGT50对高黄芩素具有最大活性，与糖苷以外的黄酮充分反应[黄芩黄素(Baicalein)(对高黄芩素的相对活性，73％)、芹菜素(Apigenin)(44％)、毛地黄黄酮(Luteolin)(41％)、五羟黄酮(Tricetin)(87.9％)、洋芫荽黄素(Diosmetin)(62％)、金圣草黄素(Chrysoeriol)(18％)]。并且对黄酮醇[槲皮素(Quercetin)(26％)、杨梅黄素(Myricetin)(9％)、山奈黄素(Kaempferol)(3％)]，二氢黄酮[柑桔素(Naringenin)(3％)]及噢哢[金鱼草素(Aureusidin)(40％)]也具有活性。但对黄酮C糖苷[牡荆葡基黄酮(Vitexin)、异牡荆葡基黄酮(Isovitexin)、荭草素(Orientin)]、异黄酮[染料木黄酮(Genistein)、大豆素(Daidzein)、刺芒柄花素(Formononetin)]、儿茶素[儿茶素(Catechin)、表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallo catechin gallate)]、香豆素[(七叶亭(Esculetin)]及苯丙素[松柏醇(Coniferyl alcohol)]无活性。此外，在HPLC中，高黄芩素、黄芩黄素、芹菜素、槲皮素与其反应生成物的各自7位葡萄糖醛酸化物的保留时间一致。

图3表示分析SlUGT糖受体底物的底物特异性的结果。图3表示对高黄芩素的活性为100％时对各底物的相对活性。分析的结果，SlUGT对高黄芩素具有最大的活性，对除黄芩黄素(对高黄芩素的相对活性，63％)以外的黄酮的反应性低[芹菜素(3％)、毛地黄黄酮(0.6％)、五羟黄酮(1.1％)、洋芫荽黄素(0.3％)、金圣草黄素(0.02％)]。并且对黄酮醇[槲皮素(1％)、山奈黄素(14％)]、二氢黄酮[柑桔素(Naringenin)(6％)]、异黄酮[染料木黄酮(1％)、大豆素(0.3％)、刺芒柄花素(0.08％)]、香豆素[(七叶亭(Esculetin)(0.3％)]的活性也低，对黄酮C糖苷(牡荆葡基黄酮、异牡荆葡基黄酮、荭草素)、噢哢(金鱼草素)、儿茶素(儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯)及苯丙素[松柏醇(Coniferyl alcohol)]无活性。也就是说，说明SlUGT的活性中类黄酮7位的邻位修饰很重要。并且在HPLC中，高黄芩素、黄芩黄素、芹菜素与其反应生成物的各自7位葡萄糖醛酸化物的保留时间一致。另一方面，检测出槲皮素中多个反应生成物，其中之一与7位葡萄糖醛酸化物的保留时间一致。

图4表示分析AmUGTcg10糖受体底物的底物特异性的结果。图4表示对高黄芩素的活性为100％时对各底物的相对活性。分析的结果，AmUGTcg10对高黄芩素具有最大活性，与除糖苷以外的黄酮也反应[黄芩黄素(对高黄芩素的相对活性，22％)、芹菜素(40％)、毛地黄黄酮(34％)、五羟黄酮(23.8％)、洋芫荽黄素(26％)、金圣草黄素(18％)]。并且对黄酮醇[槲皮素(4％)、山奈黄素(28％)]，二氢黄酮[柑桔素(15％)]及噢哢[金鱼草素(2％)]也具有活性。但是，对黄酮C糖苷(牡荆葡基黄酮、异牡荆葡基黄酮、荭草素)、异黄酮(染料木黄酮、大豆素、刺芒柄花素)、儿茶素(儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯)、香豆素[(七叶亭(Esculetin)]及苯丙素[松柏醇(Coniferyl alcohol)]无活性。并且在HPLC中，高黄芩素、黄芩黄素、芹菜素、槲皮素与其反应生成物的各自7位葡萄糖醛酸化物的保留时间一致。

以上结果表明，PfUGT50和AmUGTcg10对黄酮等的类黄酮具有低特异性，SlUGT具有高特异性。并且来自紫苏的的PfUGT50具有特别低的特异性，即是底物特异性广泛的酶。

糖供体底物特异性分析

将芹菜素作为糖受体底物使用，对各种UDP活性化糖供体分析特异性。其结果，PfUGT50，SlUGT及AmUGTcg10只对UDP—葡萄糖醛酸具有活性，而对UDP—葡萄糖，UDP—半乳糖无活性。

以上结果表明，上述酶是对黄酮特异性高的7位葡萄糖醛酸转移酶(黄酮7—O—葡萄糖醛酸转移酶)。

pH及温度特性分析

温度稳定性如下分析。酶溶液在15～55℃、処理1小时后，4℃下冷却。使用冷却后的样品，在标准的反应条件下计算残存活性。pH稳定性如下分析。在酶溶液中添加缓冲液(pH4，4.5，5，醋酸盐—NaOH；pH5.5，6，6.5，7，7.5，NaH₂PO₄—NaOH；pH8，8.5，9，Tris—HCl)到最终浓度为167mM，4℃下处理1小时后，添加磷酸钾缓冲液(pH7.5)到最终浓度为500mM。使用処理后的样品，计算在标准反应条件下的残存活性。反应温度依赖性，在反应温度设定在10～55℃的标准反应条件下进行反应、分析。反应pH依赖性，在代替磷酸钾缓冲液(pH7.5)使用缓冲液(pH4，4.5，5，醋酸盐—NaOH；pH5.5，6，6.5，7，7.5，NaH₂PO₄—NaOH；pH8，8.5，9，Tris—HCl)的标准反应条件下进行反应、分析。以上的分析结果表明，PfUGT50在pH7～9的范围内稳定，其催化活性在pH7～8的范围内最大，在酸性区域内基本不具有活性。并且在30℃以下稳定(1小时，pH7.5)，30分钟内的活性测定中反应最适温度为30℃。SlUGT在pH4.5～8的范围内稳定，其催化活性在pH7～8的范围内最大，在酸性区域内基本不具有活性。此外，本酶在40℃以下稳定(1小时，pH7.5)，30分钟内的活性测定中反应最适温度为35℃。AmUGTcg10在pH7.5～9.5范围内稳定，其催化剂活性在pH8.5～9.5的范围内为最大，在酸性区域内基本不具有活性。另外，本酶在30℃以下稳定(1小时，pH7.5)，30分钟内的活性测定中反应最适温度为45℃。这些性质与已知的植物次生代谢相关的GT类似。

5.结果

如上所述，鉴定了结构上类似的来自唇形科紫苏的PfUGT50、来自唇形科屋久岛光紫黄芩的S1UGT及来自玄参科金鱼草的AmUGTcg10。PfUGT50及AmUGTcg10糖苷化酶与黄芩Sb7GAT相比，糖受体底物特异性广泛，具有黄酮、黄酮醇、噢哢等多种类黄酮的7位葡萄糖醛酸转移活性。另一方面，SlUGT具有与Sb7GAT类似的底物特异性。通过使用上述糖苷化酶，可廉价地使类黄酮的7位进行葡萄糖醛酸结合反应。

因此，可使槲皮素7—葡萄糖醛酸甙(glucronide)等生物体内存在的葡萄糖醛酸结合物在体外(in vitro)大量生成，并评价生理活性。

实施例2

1.实施例2的概要

本实施例中，鉴定了唇形目胡麻科芝麻(Sesamum indicum)中与光紫黄芩SlUGT及金鱼草AmUGTcg12同源性高的SiUGT23，证实了其大肠杆菌表达蛋白对高黄芩素及毛地黄黄酮具有葡萄糖醛酸转移活性。

2.SiUGT23基因的鉴定

着眼于光紫黄芩及金鱼草的类黄酮7位葡萄糖醛酸转移酶基因(UGT基因)的序列保守性，测定与这些基因同源性高的基因，其结果，在唇形目胡麻科芝麻中，也发现了具有与上述UGT基因有高同源性的芝麻UGT基因SiUGT23。因从芝麻cDNA文库内中分离的SiUGT23不具有全长序列，所以，使用下述序列号：20及21的引物，通过前述实施例1的2(3)中所述RACE法确定了SiUGT23的全长序列(序列号：22及23)。

序列号：20：GR—SiUGT23—Rv

5′—GGCCAAACGCGCCGGAGCTGATGTAGA—3′

序列号：21：SiUGT23-nest-Rv

5′-AGTGGGTATATTCAAGCCTGT-3′

3.来自芝麻的SiUGT23的表达和活性测定

将包含来自芝麻的SiUGT23的全长ORF的cDNA通过基因特异性引物对(序列号：24及25)扩增。模板使用由从芝麻种子中提取的总RNA合成的cDNA。与前述实施例1的紫苏、光紫黄芩及金鱼草的UGT同样整合到大肠杆菌表达载体，通过同样的方法使重组SiUGT23蛋白质表达，测定酶活性。

序列号：24：SiUGT23—fw：5′—CACCATATGGAAGACACCGTTGTCCTCTA—3′(下线为NdeI位点)

序列号：25：SiUGT23—rv：5′—GGATCCTAACATCACTCAAACCCGAGTCA—3′(下线为BamHI位点)

图5表示分析SiUGT23的糖受体底物的底物特异性的结果。图5表示对高黄芩素的活性为100％时对各底物的相对活性。分析的结果，SiUGT23对高黄芩素具有最大的活性，与以下的黄酮也发生反应[黄芩黄素(对高黄芩素的相对活性(以下同样)24％)、芹菜素(7％)、毛地黄黄酮(29％)、五羟黄酮(14.0％)、洋芫荽黄素(4％)、金圣草黄素(6％)、异牡荆葡基黄酮(0.3％))。并且对黄酮醇[槲皮素(4％)、山奈黄素(18％)]、二氢黄酮[柑桔素(2％)]、噢哢[金鱼草素(13％)]、香豆素[七叶亭(0.03％)]及以下的异黄酮[刺芒柄花素(0.03％)]也具有活性。但对异牡荆葡基黄酮以外的黄酮C糖苷(牡荆葡基黄酮、荭草素)、刺芒柄花素以外的异黄酮(染料木黄酮、大豆素)、儿茶素(儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯)及苯丙素[咖啡酸(Caffeic acid)]无活性。此外，HPLC中，高黄芩素、黄芩黄素、芹菜素、槲皮素与其反应生成物的各自7位葡萄糖醛酸化物的保留时间一致。

由以上结果可知，芝麻SiUGT23与紫苏PfGT50及金鱼草AmUGTcg10同样，是对黄酮等类黄酮具有低特异性的类黄酮7位葡萄糖醛酸转移酶。

实施例3

使用紫苏PfUGT50、屋久岛光紫黄芩S1UGT、金鱼草AmUGTcg10重组蛋白质及芝麻的SiUGT23重组蛋白质，探讨对于植物性多酚的茋及木脂素的葡萄糖醛酸转移活性。茋的底物使用白藜芦醇(Resveratrol)，木脂素的底物使用(+)-松脂醇(Pinoresinol)、(+)-胡椒醇(Piperitol)、(+)-芝麻素酚(Sesaminol)、(+)-开环异落叶松树脂酚(Secoisolariciresinol)、(+)-芝麻素儿茶酚1(Sesamim catecol1)(SC1)，(+)-芝麻素儿茶酚2(Sesamim catecol2)(SC2)，及(+)-异芝麻素儿茶酚2(Episesamim catecol2)(EC2)(Nakai M，et al.(2003)J Agric Food Chem.51，1666-1670.)，用与上述同样的条件进行酶反应。

HPLC分析的结果，在紫苏PfUGT50、屋久岛光紫黄芩S1UGT、金鱼草AmUGTcg10及芝麻的SiUGT23的全部反应液中均得到了生成物(参照图2—5)。此外，对于木脂素类，以SC1及SC2为底物时，得到了新型生成物。将得到最多生成物的SlUGT和SC1的反应进行LC-MS分析的结果，可表明SC1在R.T.＝12.8分钟时洗脱，反应生成物在R.T.＝10.8分钟洗脱(图6)、其为m/z＝517.1328[M-H]^-(C25H25O12、calcd.517.1346、err.-2.5ppm)的SC1单葡萄糖醛酸甙(图7)。LC—MS的条件如下所示。

色谱柱：Develosil C30-UG3，3mmx150mm

流动相：A:H₂O，B:CH₃CN，C:2.5％HCOOH，0.2ml/min.

梯度：B20％→B70％(10分钟)、B70％(5分钟)、C4％

检测：A280nm

MS条件：Q-TOF-Premier(Micromass、Manchester、UK制)

V模式，阴性(negative)，毛细管电压(Capillary)：2.3KV，锥空电压(cone)：45V

以上结果可表明，通过使用紫苏PfUGT50、屋久岛光紫黄芩SlUGT、金鱼草AmUGTcg10及芝麻的SiUGT23，不仅可生产多种类黄酮的葡萄糖醛酸甙，还可生产茋及木脂素的葡萄糖醛酸甙。

实施例4

来自屋久岛光紫黄芩的SlUGT提供了在与槲皮素(QU)反应时其7位葡萄糖醛酸以外的多个生成物(图8)。

这些是来自芝麻的SiUGT23、来自金鱼草的AmUGTcg10、及来自紫苏的PfUGT50中不存在的特征性生成物。LC-MS分析的结果，检测出保留时间在7～9分钟之间时向槲皮素转移了两个葡萄糖醛酸的m/z＝653.1009[M-H]^-(C27H25O19，calcd.653.0990，err.2.9ppm)的槲皮素二葡萄糖醛酸甙。检测出3种保留时间在9～11分钟之间时向槲皮素转移了一个葡萄糖醛酸的m/z＝477.06[M-H]^-的槲皮素单葡萄糖醛酸甙。因为R.T.＝10.12分钟时的成分与将紫苏的GAT的反应生成物纯化、进行结构分析的产物一致，所以，可知其是槲皮素7-O-葡萄糖醛酸甙。并且R.T.＝10.34分钟时的成分与将葡萄叶的主要黄酮醇纯化、进行结构分析的产物一致，所以，可知其是槲皮素3-O-葡萄糖醛酸甙。[Hmamouch，M.et al.(1996)Am J Enol Vitic.，47，186-192]为主要反应生成物的R.T.＝11.3分钟的成分，用反相HPLC纯化、用NMR进行结构分析的结果，证明其是槲皮素′-O-葡萄糖醛酸甙。表明主要的3个谱峰分别是槲皮素的7位、3位、3′位的单葡萄糖醛酸甙。

LC—MS的条件如下所示。

色谱柱：YMC-pack polymer C18，2mm x150mm，6μm

流动相：A:H₂O，B:CH₃CN，C:2.5％HCOOH，0.2ml/min.

梯度：B10％→B50％(10分钟)、B50％(5分钟)、C4％

检测：A350nm

MS条件：Q-TOF-Premier(Micromass、Manchester、UK制)

V模式，阴性(negative)，毛细管电压(Capillary)：3.0KV，锥空电压(cone)：30V

以上结果表明，通过使用屋久岛光紫黄芩SlUGT，可由槲皮素得到多种槲皮素葡萄糖醛酸甙。

本发明的UDP—葡萄糖醛酸转移酶的底物特异性广泛，有助于各种葡萄糖醛酸结合物的制造。制造出的葡萄糖醛酸结合物，例如，作为用于测定其在生物体内的功能的试剂、抗氧化剂等行之有效。

序列表(SEQUENCE LISTING)

<110>三得利株式会社(SUNTORY LIMITED)

<120>UDP—葡萄糖醛酸转移酶及编码该酶的多核苷酸

(UDP-glucuronosyltransferase and polynucleotide encoding the same)

<130>PIF082713C

<150>JP2007-267050

<151>2007-10-12

<150>JP2008-067185

<151>2008-03-17

<160>25

<170>PatentIn version3.4

<210>1

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223>合成DNA(synthetic DNA)

<400>1

<210>2

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223>合成DNA(synthetic DNA)

<400>2

<210>3

<211>1326

<212>DNA

<213>屋久岛光紫黄芩(Scutellaria laeteviolacea v.yakusimensis)

<400>3

<210>4

<211>1490

<212>DNA

<213>紫苏(Perilla frutescens)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1362)

<400>4

<210>5

<211>453

<212>PRT

<213>紫苏(Perilla frutescens)

<400>5

<210>6

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223>合成DNA(synthetic DNA)

<400>6

<210>7

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223>合成DNA(synthetic DNA)

<400>7

<210>8

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223>合成DNA(synthetic DNA)

<400>8

<210>9

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223>合成DNA(synthetic DNA)

<400>9

<210>10

<211>1446

<212>DNA

<213>屋久岛光紫黄芩(Scutellaria laeteviolaceav.yakusimensis)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1368)

<400>10

<210>11

<211>455

<212>PRT

<213>屋久岛光紫黄芩(Scutellarialaeteviolacea v.yakusimensis)

<400>11

<210>12

<211>1374

<212>DNA

<213>金鱼草(Antirrhinum majus)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1374)

<400>12

<210>13

<211>457

<212>PRT

<213>金鱼草(Antirrhinum majus)

<400>13

<210>14

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223>合成DNA(synthetic DNA)

<400>14

<210>15

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223>合成DNA(synthetic DNA)

<400>15

<210>16

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223>合成DNA(synthetic DNA)

<400>16

<210>17

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223>合成DNA(synthetic DNA)

<400>17

<210>18

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223>合成DNA(synthetic DNA)

<400>18

<210>19

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223>合成DNA(synthetic DNA)

<400>19

<210>20

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223>合成DNA(synthetic DNA)

<400>20

<210>21

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223>合成DNA(synthetic DNA)

<400>21

<210>22

<211>1433

<212>DNA

<213>芝麻(Sesamum indicum)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1374)

<400>22

<210>23

<211>457

<212>PRT

<213>芝麻(Sesamum indicum)

<400>23

<210>24

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223>合成DNA(synthetic DNA)

<400>24

<210>25

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223>合成DNA(synthetic DNA)

<400>25

Claims

1.多核苷酸，其是由序列号：4所表示的碱基序列的第1位～第1359位的碱基序列组成的多核苷酸。

2.多核苷酸，其是由序列号：4所表示的碱基序列组成的多核苷酸。

3.多核苷酸，其是编码由序列号：5的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸。

4.如权利要求1～3中任一项所述的多核苷酸，其是DNA。

5.蛋白质，其由权利要求1～4中任一项所述的多核苷酸编码。

6.载体，其含有权利要求1～4中任一项所述的多核苷酸。

7.转化体，其中，导入了权利要求1～4中任一项所述的多核苷酸。

8.转化体，其中，导入了权利要求6中所述的载体。

9.蛋白质的制造方法，该蛋白质为权利要求5中所述的蛋白质，其中，使用权利要求7或8中所述的转化体。

10.葡萄糖醛酸结合物的制造方法，其中，以权利要求5中所述的蛋白质为催化剂，由UDP-葡萄糖醛酸和类黄酮生成葡萄糖醛酸结合物。