CN102428181B - 双并四氢呋喃类木脂体4位特异性葡萄糖基转移酶及编码该酶的多核苷酸 - Google Patents

Abstract

本发明提供编码双并四氢呋喃型木脂体4位特异性葡萄糖基转移酶的多核苷酸等。所述多核苷酸含有：包含序列号3或5表示的碱基序列的多核苷酸或编码包含序列号4或6表示的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸。

Description

双并四氢呋喃类木脂体4位特异性葡萄糖基转移酶及编码该酶的多核苷酸

技术领域

本发明涉及来自连翘(レンギヨウ)的双并四氢呋喃型木脂体4位特异性葡萄糖基转移酶(フロフラン型リグナン4位グルコ一ス転移酵素)、编码该酶的多核苷酸、含有该多核苷酸的载体以及使用该载体得到的转化体等。

背景技术

木脂体作为植物次级代谢产物中的一种在植物界中广泛分布(非专利文献1：Umezawa，T.(2003)Phytochem.Rev.2，371-390)，其中具有有用的生物活性的木脂体已被用作药品或健康食品。例如，已知在胡麻科(pedaliaceae)芝麻(sesamum indicum)中含有的主要的双并四氢呋喃型木脂体具有抗氧化性、改善脂质代谢、保护肝功能等功效，并且已在市售(非专利文献2：Nakai，M.et al.(2003)J.Agri.Food Chem.51，1666-1670；非专利文献3：Tsuruoka，T.et al.(2005)Biosci.Biotech.Biochem.69，179-188；非专利文献4：Sirato-Yasumoto，S.et al.(2001)J.Agri.Food Chem.49，2647-2651)。另一方面，在小檗科盾叶鬼臼(美洲八角莲)的根中含有的作为芳基四氢萘内酯型(アリルテトラリンラクトン型)的抗肿瘤性木脂体的鬼臼毒素，因为其具有细胞分裂抑制活性，所以已被用作治癌剂及用于新型治癌剂的开发(非专利文献5：Ayres，D.C.和Loike，J.D.(1990)Lignans：Chemical Biological andClinical Properties.Cambridge Univ.Press，Cambridge，U.K.)。此外，认为大多数木脂体在摄取后，在体内代谢为具有类似雌性荷尔蒙活性的肠内酯，因此木脂体成为近年来引起关注的次级代谢产物(非专利文献6：Heinonen，S.etal.(2001)J.Agric.Food Chem.49，3178-3186)。

木犀科(oleaceae)连翘(连翘属(forsythia))是多年生木本植物，因其顽强而易于栽培，因开鲜艳的黄花故多被用作庭院灌木。另一方面，已知在连翘的叶子、种子以及花瓣中蓄积了丰富的具有抗氧化或抗炎症活性的木脂体类，在亚洲(特别是中国和日本)将其叶子作为茶饮用。(非专利文献7：Guo，H.et al.(2007)Rapid Communications in Mass Spectrometry 21，715-729；非专利文献8：Chang，M-J.et al.(2008)Biosci.Biotech.Biochem.72，2750-2755)。与芝麻或亚麻等一年生草本植物不同，连翘不需要每年播种及育苗，可数年连续从叶子中获取功能性木脂体，因此认为连翘是有用的次级代谢产物的分子育种目标。

在木犀科连翘中木脂体的生物合成，通过由结构式(I’)(参照图1A；以下其它结构式也相同)的单木质醇进行氧化聚合生成结构式(Ia)的双并四氢呋喃型木脂体而开始(非专利文献9：Davin，L.B.and Lewis，N.G.(2003)Phytochem.Rev.2，257-288；非专利文献10：Suzuki，S.and Umezawa，T.(2007)J.Wood.Sci.53，273-284)。结构式(Ia)的木脂体，经过结构式(IV)及结构式(V)的木脂体(非专利文献11：Dinkova-Kostova，A.et al.(1996)J.Biol.Chem.271，29473-29482；非专利文献12：Nakatsubo，T.et al.(2008)J.Biol.Chem.283，15550-1557；非专利文献13：Min，T.et al.(2003)J.Biol.Chem.278，50714-50723；非专利文献14：Gang，D.et al.(1999)J.Biol.Chem.274，7516-7527)，转化为结构式(VI)的木脂体(非专利文献15：Xia，Z-Q.et al(2001)J.Biol.Chem.276，12614-12623；非专利文献16：Youn，B.et al(2005)J.Biol.Chem.280，12917-12926)。其后在转化为结构式(VII)的木脂体糖苷之前，需要进一步经过多个酶反应。这些在连翘中的一系列木脂体生物合成体系中，仅确认出几种酶活性，目前仍未分离出负责各反应的催化酶、或编码这些酶的基因。虽然在连翘中含有的所有木脂体均以糖苷的形式稳定存在，但仅检测出向结构式(VII)的木脂体的7位转移糖的活性(非专利文献17：Berim，A.etal.(2008)Phytochemistry 69，374-381)，还未鉴定出其它的木脂体糖基转移酶。另一方面，在芝麻中虽然大部分木脂体也以糖苷的形式存在，但仅鉴定出对于结构式(III)表示的木脂体的糖基转移酶UGT71A9。该酶对结构式(III)的化合物的2位以外的位置或对其它木脂体化合物无活性。对于除此之外的木脂体的糖基转移酶仍然不明确(非专利文献18：Ono，E.et al.(2006)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103，10116-10121；非专利文献19：Noguchi，A.，et al.(2008)Plant J.54，415-427)。

通常情况下，植物中的糖基转移酶的位置选择性高，在相同或类似化合物的相同位置进行反应的糖基转移酶之间的氨基酸序列在不同的种间保守，因此，可利用序列的同源性分离该酶。但是，即使为相同的或类似的化合物，在不同位置添加糖的糖基转移酶的氨基酸序列的同源性低，极难于以在其它位置反应的糖基转移酶的序列信息为基础分离该酶。因此，即使是相同的木脂体化合物，也极难于以在上述结构式(III)化合物的2位添加糖的来自芝麻的UGT71A9的信息为基础，类推在其它木脂体化合物、例如结构式(Ia)等的双并四氢呋喃型木脂体的4位及/或4′位上添加糖的糖基转移酶的结构并将其分离。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Umezawa，T.(2003)Phytochem.Rev.2，371-390；

非专利文献2：Nakai，M.et al.(2003)J.Agri.Food Chem.51，1666-1670；

非专利文献3：Tsuruoka，T.et al.(2005)Biosci.Biotech.Biochem.69，179-188；

非专利文献4：Sirato-Yasumoto，S.et al.(2001)J.Agri.Food Chem.49，2647-2651；

非专利文献5：Ayres，D.C.and Loike，J.D.(1990)Lignans：ChemicalBiological and Clinical Properties.Cambridge Univ.Press，Cambridge，U.K.；

非专利文献6：Heinonen，S.et al.(2001)J.Agric.Food Chem.49，3178-3186；

非专利文献7：Guo，H.et al.(2007)Rapid Communications in MassSpectrometry 21，715-729；

非专利文献8：Chang，M-J.et al.(2008)Biosci.Biotech.Biochem.72，2750-2755；

非专利文献9：Davin，L.B.and Lewis，N.G.(2003)Phytochem.Rev.2，257-288；

非专利文献10：Suzuki，S.and Umezawa，T.(2007)J.Wood.Sci.53，273-284；

非专利文献11：Dinkova-Kostova，A.et al.(1996)J.Biol.Chem.271，29473-29482；

非专利文献12：Nakatsubo，T.et al.(2008)J.Biol.Chem.283，15550-1557；

非专利文献13：Min，T.et al.(2003)J.Biol.Chem.278，50714-50723；

非专利文献14：Gang，D.et al.(1999)J.Biol.Chem.274，7516-7527；

非专利文献15：Xia，Z-Q.et al(2001)J.Biol.Chem.276，12614-12623；

非专利文献16：Youn，B.et al(2005)J.Biol.Chem.280，12917-12926；

非专利文献17：Berim，A.et al.(2008)Phytochemistry 69，374-381；

非专利文献18：Ono，E.et al.(2006)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103，10116-10121；

非专利文献19：Noguchi，A.，et al.(2008)Plant J.54，415-427；

发明内容

本发明要解决的技术问题

在这种状况下，期望分离并鉴定出在双并四氢呋喃型木脂体的4位及/或4′位上添加糖的糖基转移酶。

解决技术问题的技术手段

本发明是考虑到上述状况而做出的发明，提供以下所示的多核苷酸(编码双并四氢呋喃型木脂体4位特异性葡萄糖基转移酶的多核苷酸)、蛋白质(双并四氢呋喃型木脂体4位特异性葡萄糖基转移酶)、含有该多核苷酸的载体以及导入了该载体的转化体等。

(1)一种多核苷酸，其特征在于，为以下(a)～(f)中任一项所述的多核苷酸：

(a)一种多核苷酸，其含有由序列号3或5表示的碱基序列组成的多核苷酸；

(b)一种多核苷酸，其含有编码由序列号4或6表示的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸；

(c)一种多核苷酸，其含有编码由序列号4或6表示的氨基酸序列中1～15个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或添加后的氨基酸序列组成、且具有针对木脂体的葡萄糖基转移酶活性的蛋白质的多核苷酸；

(d)一种多核苷酸，其含有编码具有与序列号4或6表示的氨基酸序列有80％以上同源性的氨基酸序列、且具有针对木脂体的葡萄糖基转移酶活性的蛋白质的多核苷酸；

(e)一种多核苷酸，其含有与序列号3或5表示的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交、且编码具有针对木脂体的葡萄糖基转移酶活性的蛋白质的多核苷酸；或者

(f)一种多核苷酸，其含有与编码序列号4或6表示的氨基酸序列所组成的蛋白质的多核苷酸的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交、且编码具有针对木脂体的葡萄糖基转移酶活性的蛋白质的多核苷酸。

(2)根据上述(1)所述的多核苷酸，其特征在于，为以下(g)至(j)中任一项：

(g)一种多核苷酸，其含有编码由序列号4或6表示的氨基酸序列中10个以下的氨基酸发生缺失、取代、插入及/或添加后的氨基酸序列组成、且具有针对木脂体的葡萄糖基转移酶活性的蛋白质的多核苷酸；

(h)一种多核苷酸，其含有编码具有与序列号4或6表示的氨基酸序列有90％以上同源性的氨基酸序列、且具有针对木脂体的葡萄糖基转移酶活性的蛋白质的多核苷酸；

(i)一种多核苷酸，其含有与序列号3或5表示的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在高严谨条件下杂交、且编码具有针对木脂体的葡萄糖基转移酶活性的蛋白质的多核苷酸；或者

(j)一种多核苷酸，其含有与编码序列号4或6表示的氨基酸序列所组成的蛋白质的多核苷酸的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在高严谨条件下杂交、且编码具有针对木脂体的葡萄糖基转移酶活性的蛋白质的多核苷酸。

在上述(1)及(2)的多核苷酸中，对木脂体的葡萄糖基转移活性，包括例如对双并四氢呋喃型木脂体的葡萄糖基转移酶活性，更加具体地说，对双并四氢呋喃型木脂体的4位及/或4′位的羟基的葡萄糖基转移酶活性。在此，所述双并四氢呋喃型木脂体包括，例如下述结构式(Ia)、(Ib)或(Ic)所表示的木脂体。

作为上述(1)的多核苷酸包括，例如由序列号3或5表示的碱基序列组成的多核苷酸、编码由序列号4或6表示的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸。

上述(1)及(2)的多核苷酸包括，例如是DNA的那些。

(3)一种蛋白质，其特征在于，其由上述(1)或(2)所述的多核苷酸编码。

(4)一种载体，其特征在于，其含有上述(1)或(2)所述的多核苷酸。

(5)一种转化体，其特征在于，其中导入了上述(1)或(2)所述的多核苷酸。

(6)一种转化体，其特征在于，其中导入了上述(4)所述的载体。

(7)上述(3)的蛋白质的制造方法，其特征在于，其使用上述(5)或(6)所述的转化体。

(8)一种制造葡萄糖糖苷的方法，其特征在于，该方法以上述(3)的所述蛋白质为催化剂，由UDP-葡萄糖和糖基受体底物生成葡萄糖糖苷。

在上述(8)所述的方法中，所述糖基受体底物包括，例如双并四氢呋喃型木脂体，在此，所述双并四氢呋喃型木脂体包括，例如上述结构式(Ia)、(Ib)或(Ic)所表示的木脂体。

发明效果

根据本发明，可提供可将葡萄糖转移到双并四氢呋喃型木脂体的4位及/或4′位上的糖基转移酶。此外，根据本发明，还可提供编码该酶的多核苷酸、含有该多核苷酸的载体、及使用该载体得到的转化体以及使用该酶制备葡萄糖糖苷的方法等。

根据本发明，通过在体外或者在宿主细胞内导入本发明的基因，可将葡萄糖转移到双并四氢呋喃型木脂体的4位及/或4′位上，并且可更加简便地生产可对新型功能性食品原料的开发、次级代谢产物的分子育种等作出贡献的有用的木脂体糖苷，从这点上看本发明极为有用。

附图说明

图1A显示连翘及芝麻的木脂体生物合成途径(代谢途径)。“DIR”表示参与由结构式(I’)的单木质醇生成结构式(Ia)的木脂体的反应的蛋白质，“PLR”表示催化由结构式(Ia)的木脂体生成结构式(IV)及结构式(V)的木脂体的反应的酶，“SIRD”表示催化由结构式(V)的木脂体生成结构式(VI)的木脂体的反应的酶，“CYP81Q”表示催化由结构式(Ia)的木脂体生成结构式(Ig)及结构式(II)的木脂体的反应的酶。此外，对于本文中记载的结构式(I’)的单木质醇以及结构式(Ia)、(Ig)及(II)至(VII)的木脂体，可参照图1A中的结构式。

图1B显示与结构式(Ia)的木脂体相同的各种双并四氢呋喃型木脂体的结构。此外，对于本说明书中记载的结构式(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)、(If)、(Ig)及(Ih)的木脂体，可参照图1B中的结构式(对于结构式(Ig)的木脂体，也可参照如上所述的图1A中的结构式。)。

图2显示实施例3中的SDS-PAGE(200mM咪唑洗脱液)的结果。箭头表示在约50KDa的大小检测出的作为大肠杆菌表达的来自连翘的葡萄糖基转移酶(RengUGT)蛋白质的双并四氢呋喃型木脂体4位特异性葡萄糖基转移酶(克隆13：RengUGT13，克隆14：RengUGT14)。

图3显示实施例3中的HPLC分析结果。显示酶反应液在A280nm处的HPLC分析图表。从上开始依次表示空载体与结构式(Ia)的木脂体的反应结果(pET15b)、RengUGT13与结构式(Ia)的木脂体的反应结果(Reng13/pET15b)、RengUGT14与结构式(Ia)的木脂体的反应结果(Reng14/pET15b)。带有*号的峰表示新检测出的生成物的峰。

图4表示实施例3中的LC-MS分析结果。上段表示将一分子葡萄糖转移到结构式(Ia)的木脂体的4位上的单葡萄糖苷的结构。下段表示在负极模式下的酶生成物的MS谱。

图5显示实施例4中的RT-PCR分析结果。显示了来自连翘各器官的基因表达模式，从上开始依次表示RengUGT13、RengUGT14及连翘rRNA的基因表达结果。右侧的数字(例如“×35”)表示PCR的反应循环次数。

具体实施方式

以下对本发明进行详细说明。本发明的范围并不限于这些说明，除以下例示以外，在不偏离本发明的主旨的范围内可对本发明实施适当变更。此外，本说明书包含作为主张本申请优先权的基础的日本特愿2009-120637号说明书(2009年5月19日申请)的全部内容。此外，在本文中引用的全部公开出版物例如现有技术文献、以及公开的专利申请、专利公报及其它专利文献，均通过引用完整并入本发明中。

本发明人通过从连翘中筛选葡萄糖基转移酶(UGT：UDP-葡萄糖基转移酶)类基因，得到6种连翘UGT(RengUGT)候选基因，从这些基因的大肠杆菌表达蛋白质中，分离并鉴定出作为具有新型转移葡萄糖活性的糖基转移酶的RengUGT13及RengUGT14，该新型转移葡萄糖活性将葡萄糖特异性地转移到由结构式(Ia)、(Ib)及(Ic)表示的双并四氢呋喃型木脂体的4位及/或4′位上。

1.本发明的多核苷酸

首先，本发明提供：(a)一种多核苷酸，其含有由序列号3或5的碱基序列组成的多核苷酸(具体为DNA，以下也将这些简称为“DNA”)；及(b)一种多核苷酸，其含有编码具有序列号4或6表示的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸。在本发明中作为对象的DNA，并不限于编码上述双并四氢呋喃型木脂体4位特异性葡萄糖基转移酶(例如RengUGT13及RengUGT14)的DNA，还包括编码与该蛋白质具有同等功能的蛋白质的其它DNA。

所述具有同等功能的蛋白质是，例如(c)由序列号4或6表示的氨基酸序列中1～15个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或添加后的氨基酸序列组成、且具有针对木脂体的葡萄糖基转移酶活性的蛋白质。这样的蛋白质包括，例如由序列号4或6表示的氨基酸序列中，例如1～15个、1～14个、1～13个、1～12个、1～11个、1～10个、1～9个、1～8个、1～7个、1～6个(1～数个)、1～5个、1～4个、1～3个、1～2个、1个氨基酸残基发生缺失、取代、插入及/或添加后的氨基酸序列组成、且具有针对木脂体的葡萄糖基转移酶活性的蛋白质。上述氨基酸残基的缺失、取代、插入及/或添加的数量，通常来说越小越好。

此外，所述具有同等功能的蛋白质还包括，例如(d)具有与序列号4或6表示的氨基酸序列有80％以上同源性的氨基酸序列、且具有针对木脂体的葡萄糖基转移酶活性的蛋白质。这样蛋白质包括具有与序列号4或6表示的氨基酸序列有约80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上同源性的氨基酸序列、且具有针对木脂体的葡萄糖基转移酶活性的蛋白质。上述同源性的数值通常来说越大越好。

在此，本文中使用的术语“针对木脂体的葡萄糖基转移酶活性”，是指具有如下活性的酶活性，即催化依赖于作为糖基供体的UDP-葡萄糖将葡萄糖转移到作为糖基受体底物的双并四氢呋喃型木脂体上，生成葡萄糖苷的反应的活性。例如，是指催化依赖于UDP-葡萄糖将葡萄糖转移到双并四氢呋喃型木脂体的4位及/或4′位的羟基上，生成葡萄糖苷的反应的双并四氢呋喃型木脂体4位特异性葡萄糖基转移酶(furofuran lignan4-O-glucosyltransferase；例如RengUGT 13及RengUGT 14)活性。此外，在本文中，术语“双并四氢呋喃型木脂体4位特异性葡萄糖基转移酶”表示的酶，如上所述是可将葡萄糖转移到4位及/或4′位的羟基上的酶，但并不限定于仅将葡萄糖转移到4位的羟基上的酶。在此，双并四氢呋喃型木脂体的4位及4′位，意味着按照IUPAC命名法而定义的4位及4′位。

对木脂体的葡萄糖基转移酶活性，例如可通过如下方法测定，即：使UDP-葡萄糖与作为糖基受体底物的双并四氢呋喃型木脂体(例如结构式(Ia)、(Ib)及(Ic)表示的木脂体等)在待测酶的存在下反应，通过用HPLC等对得到的反应物进行分析来测定(对于更加具体的说明，参照下述实施例的记载)。

此外，本发明还包含(e)一种多核苷酸，其含有与序列号3或5的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交、且编码具有针对木脂体的葡萄糖基转移酶活性的蛋白质的多核苷酸。

进而，本发明还包含(f)一种多核苷酸，其含有与编码序列号4或6表示的氨基酸序列所组成的蛋白质的多核苷酸的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交、且编码具有针对木脂体的葡萄糖基转移酶活性的蛋白质的多核苷酸。

在本文中，术语“多核苷酸”是指DNA或RNA，优选为DNA。

在本文中，术语“在严谨条件下杂交的多核苷酸”是指，例如以由序列号3或5的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸、或由编码序列号4或6表示的氨基酸序列的多核苷酸的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸的全部或一部分作为探针，通过使用菌落杂交法、噬斑杂交法或Southern杂交法等所得到的多核苷酸。可使用的杂交法包括，例如“Sambrook & Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual Vol.3，Cold Spring Harbor，LaboratoryPress 2001”、“Ausubel，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley &Sons 1987-1997”等中记载的方法。

本文中所使用的术语“严谨条件”，可以为低严谨条件、中严谨条件及高严谨条件中的任一种。“低严谨条件”，例如为5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、32℃的条件。此外，“中严谨条件”，例如为5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、42℃的条件。“高严谨条件”，例如为5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、50℃的条件。在上述条件中，温度越高，越能期待高效获得具有较高同源性的DNA。但是，作为影响杂交的严谨性的因素，认为有温度、探针浓度、探针长度、离子强度、时间、盐浓度等多种因素，本领域技术人员通过适当选择这些因素可实现同样的严谨性。

此外，在杂交中可使用市售的试剂盒，例如可使用Alkphos DirectLabelling Reagents(Amersham Pharmacia公司制)。此时，根据试剂盒中附带的说明方案，与标记后的探针保温过夜后，在55℃的条件下用含有0.1％(w/v)SDS的1次洗涤缓冲液洗涤膜后，可检测出杂交后的DNA。

作为上述以外的可杂交的多核苷酸包括，采用FASTA、BLAST等同源性检索软件，使用默认参数计算时，与序列号3的碱基序列的DNA或编码序列号4表示的氨基酸序列的DNA有约60％以上、约70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上或99.9％以上同源性的DNA。

此外，氨基酸序列、碱基序列的同源性，可使用Karlin及Altschul的BLAST算法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.87，p.2264-2268，1990；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.90，p.5873，1993)来确定。已开发出了基于BLAST算法的被称为BLASTN、BLASTX的程序(Altschul SF，et al.，J.Mol.Biol.，vol.215，p.403，1990)。使用BLASTN分析碱基序列时，参数例如为score＝100、wordlength＝12。此外，使用BLASTX分析氨基酸序列时，参数例如为score＝50、wordlength＝3。使用BLAST和Gapped BLAST程序时，使用各程序的默认参数。

上述本发明的多核苷酸，可通过公知的基因工程学方法或公知的合成方法获得。

2.本发明的蛋白质

本发明进而在其他实施方式中，还提供由上述本发明的多核苷酸编码的蛋白质。本发明的一种实施方式的蛋白质为由序列号4或6表示的氨基酸序列组成的蛋白质。本发明的另一种实施方式的蛋白质为具有序列号4或6表示的氨基酸序列的蛋白质。

进而本发明的另一种实施方式的蛋白质为：由序列号4或6表示的氨基酸序列中1～15个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或添加后的氨基酸序列组成、且具有针对木脂体的葡萄糖基转移酶活性的蛋白质。这种蛋白质包括，具有与序列号4或6表示的氨基酸序列有上述同源性的氨基酸序列、且具有针对木脂体的葡萄糖基转移酶活性的蛋白质。这种蛋白质，可使用“Sambrook& Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual Vol.3，Cold SpringHarbor，Laboratory Press 2001”、“Ausubel，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons 1987-1997”、“Nuc.Acids.Res.，vol.10，p.6487，1982”、“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.79，p.6409，1982”、“Gene，vol.34，p.315，1985”、“Nuc.Acids.Res.，vol.13，p.4431，1985”、“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.82，p.488，1985”等中记载的定点诱变法而获得。

本发明的在蛋白质的氨基酸序列中1个以上(例如1～15个，优选为10个以下)的氨基酸残基发生了缺失、取代、插入及/或添加，意味着在同一氨基酸序列中的任意且1个以上位置上，1个或多个氨基酸残基发生了缺失、取代、插入及/或添加，缺失、取代、插入及添加中的2种以上可同时发生。

以下表示可互相取代的氨基酸残基的例子，同一组中包含的氨基酸残基可互相取代。A组：亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、o-甲基丝氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、环己丙氨酸；B组：天冬氨酸、谷氨酸、异天冬氨酸、异谷氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸；C组：天冬酰胺、谷氨酰胺；D组：赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2，4-二氨基丁酸、2，3-二氨基丙酸；E组：脯氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸；F组：丝氨酸、苏氨酸、高丝氨酸；G组：苯丙氨酸、酪氨酸。

此外，本发明的蛋白质也可以通过Fmoc法(9-芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基法)等化学合成法制造，此外，也可以利用Advanced ChemTech公司(アドバンスドケムテツク公司)、珀金埃尔默公司(パ一キンエルマ一公司)、安玛西亚(フアルマシア公司)公司、Protein Technology Instrument公司(プロテインテクノロジ一インストウルメント公司)、Synthecell-Vega公司(シンセセル—ベガ公司)、PerSeptive公司(パ一セプテイブ公司)、岛津制作所等制造的肽合成仪进行化学合成。

在此，本发明的蛋白质为双并四氢呋喃型木脂体4位特异性葡萄糖基转移酶。所谓的“葡萄糖基转移酶”，催化从糖基供体上将葡萄糖残基转移到糖基受体底物上，生成葡萄糖糖苷的反应。在本发明中，糖基受体底物为双并四氢呋喃型木脂体，糖供体为UDP-葡萄糖。本发明的一种实施方式的蛋白质，催化从UDP-葡萄糖上将葡萄糖残基转移到作为糖基受体底物的双并四氢呋喃型木脂体(例如结构式(Ia)、(Ib)及(Ic)的木脂体等)的4位及/或4′位的羟基上，生成葡萄糖苷和UDP的反应。

作为糖基受体底物的双并四氢呋喃型木脂体包括，例如结构式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)、(If)、(Ig)及(Ih)的木脂体等，其中，优选为结构式(Ia)、(Ib)及(Ic)的木脂体，更优选为结构式(Ia)及(Ic)的木脂体，最优选为结构式(Ia)的木脂体。

3.载体及导入该载体的转化体

本发明在其他实施方式中还提供含有本发明的多核苷酸的表达载体。本发明的表达载体含有本发明的多核苷酸(例如上述(a)～(j)中的任一多核苷酸)。优选地，本发明的表达载体含有上述(g)～(j)中的任一项所述的多核苷酸。更优选地，本发明的表达载体含有如下多核苷酸，即由序列号3或5的碱基序列组成的多核苷酸，或编码由序列号4或6表示的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸。

本发明的载体通常以包含表达盒的形式构建，该表达盒包含的结构要素为：(i)在宿主细胞内可转录的启动子；(ii)与该启动子连接的本发明的多核苷酸(例如上述(a)～(j)中的任一项所述的多核苷酸)；以及(iii)在宿主细胞内发挥与RNA分子的转录终止及多聚腺苷化相关作用的信号。这样构建的载体可导入宿主细胞内。作为表达载体的构建方法包括，使用质粒、噬菌体或粘粒等的方法，但无特别限定。

载体的具体种类无特别限定，可适当选择可在宿主细胞中表达的载体。即根据宿主细胞的种类，选择用于使本发明的多核苷酸确切表达的适当的启动子序列，使其与本发明的多核苷酸整合进各种质粒等中而获得载体，可将该形成的载体作为表达载体使用。

本发明的表达载体依赖于待导入的宿主的种类而含有表达调控区(例如启动子、终止子及/或复制起点等)。作为细菌用表达载体的启动子，可使用常用的启动子(例如trc启动子、tac启动子、lac启动子等)，作为酵母用启动子，可使用例如甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子、PH05启动子等，作为丝状真菌用启动子，可使用例如淀粉酶、trpC等。此外，作为动物细胞宿主用启动子，可使用病毒性启动子(例如SV40早期启动子、SV40晚期启动子等)。

作为表达载体，优选含有至少1个选择性标记。作为这种标记，可利用营养缺陷型标记(ura5、niaD)、抗药性标记(潮霉素(hygromycine)、博莱霉素、遗传霉素(ジエネチシン)抗性基因(G418r)、铜抗性基因(CUP1)(Marinet al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.81，p.337，1984)、浅蓝菌素抗性基因(fas2m，PDR4)(分别为猪腰淳嗣等，生物化学，vol.64，p.660，1992；Hussainet al.，Gene，vol.101，p.149，1991)等。

此外，本发明提供导入了本发明的多核苷酸(例如上述(a)～(j)中的任一项所述的多核苷酸)的转化体。

转化体的制作方法(生产方法)无特别限定，例如将上述重组载体导入宿主内进行转化的方法。在此使用的宿主细胞无特别限定，可使用以往公知的各种细胞。具体来说，例如大肠杆菌(Escherichia coli)等细菌、酵母(芽殖酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe))、线虫(秀丽隐杆线虫，Caenorhabditis elegans)、非洲爪蟾(Xenopuslaevis)的卵母细胞等。用于上述宿主细胞的适当的培养基及条件在该领域是公知的。此外，对于作为转化对象的生物也无特别限定，可例举在上述宿主细胞中例示的各种微生物、植物或动物。

作为宿主细胞的转化方法，可利用通常使用的公知的方法。例如可利用电穿孔法(Mackenxie D.A.et al.，Appl.Environ.Microbiol.，vol.66，p.4655-4661，2000)、粒子轰击法(日本特开2005-287403“脂质生产菌的育种方法”中记载的方法)、原生质球法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.75，p.1929，1978)、乙酸锂法(J.Bacteriology，vol.153，p.163，1983)、Methods in yeastgenetics，2000 Edition：A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual等中记载的方法实施，但并不限于这些方法。

在本发明的另一种实施方式中，转化体可以为植物转化体。本实施方式涉及的植物转化体可通过如下方式获得，即将含有本发明涉及的多核苷酸的重组载体导入植物中，使由该多核苷酸编码的多肽能够表达。

使用重组表达载体时，在植物体的转化中使用的重组表达载体，只要为可使本发明涉及的多核苷酸在该植物内表达的载体，无特别限定。作为这种载体，例如可例举具有可使多核苷酸在植物细胞内组成型表达的启动子(例如花椰菜花叶病毒35S启动子)的载体、或具有通过外部刺激被诱导活化的启动子的载体。

在本发明中作为转化对象的植物，可以为植物体全株、植物器官(例如叶子、花瓣、茎、根、种子等)、植物组织(例如表皮、韧皮部、薄壁组织、木质部、维管束、栅状组织、海绵状组织等)或植物培养细胞、或者各种形态的植物细胞(例如悬浮培养细胞)、原生质体、叶子切片、愈伤组织等中的任一种。作为转化中使用的植物，无特别限定，可以为属于单子叶植物纲或双子叶植物纲的植物中的任一种。

向植物中导入基因时，使用本领域技术人员公知的转化方法(例如土壤杆菌法、基因枪、PEG法、电穿孔法等)。例如公知有土壤杆菌介导法和直接导入植物细胞中的方法。使用土壤杆菌法时，可将构建的植物用表达载体导入适当的土壤杆菌(例如根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens))中，按照叶盘法(内宫博文著，植物基因操作指南(1990)27～31页、讲谈社科学、东京)等使该菌株转染无菌培养叶盘，得到转化植物。此外，可使用Nagel等的方法(Micribiol.Lett.，67，325(1990))。该方法为首先例如将表达载体导入土壤杆菌中，接着采用Plant Molecular Biology Manual(S.B.Gelvin等、Academic Press Publishers)中记载的方法将转化的土壤杆菌导入植物细胞或植物组织中的方法。在此，“植物组织”包括通过培养植物细胞而得到的愈伤组织。使用土壤杆菌法进行转化时，可使用双元载体(pBI121或pPZP202等)。

此外，作为将基因直接导入植物细胞或植物组织的方法，已知有电穿孔法、基因枪法。使用基因枪时，可直接使用植物体全株、植物器官、植物组织本身，也可制备成切片后使用，也可制备成原生质体后使用。可使用基因导入装置(例如PDS-1000(BIO-RAD公司)等)处理这样制备的试样。处理条件根据植物或试样而不同，但通常在450～2000psi左右的压力、4～12cm左右的距离的条件下进行。

导入了基因的细胞或植物组织，首先利用潮霉素抗性等抗药性选择，接着通过常规方法再生为植物体。从转化细胞到植物体的再生，可根据植物细胞的种类，利用本领域技术人员公知的方法进行。

将植物培养细胞作为宿主使用时，转化是利用基因枪、电穿孔法等将重组载体导入培养细胞中。转化的结果，得到的愈伤组织、新芽、须根等可直接用于细胞培养、组织培养或器官培养。此外，还可使用以往已知的植物组织培养法，通过投入适当浓度的植物激素(茁长素、细胞分裂素、赤霉素、脱落酸、乙烯、油菜素内酯等)，可再生为植物体。

确认基因是否导入于植物中，可利用PCR法、Southern杂交法、Northern杂交法等进行。例如，从转化植物中制备DNA，设计DNA特异性引物后进行PCR。PCR可用与制备上述质粒而使用的条件相同的条件进行。然后，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳或者毛细管电泳等，用溴化乙锭、SYBR Green液等合适的染料染色，于是通过检测扩增产物形成的1个条带，可确认已发生转化。此外，使用预先用荧光染料等标记物标记的引物进行PCR，也可检测出扩增产物。进而，也可采用使扩增产物结合在微孔板等固相上，通过荧光或酶反应等来确认扩增产物的方法。

一旦取得在基因组内整合了本发明涉及的多核苷酸的转化植物体，则可通过该植物体的有性生殖或无性生殖获得后代。此外，可从该植物体或其后代、或者其克隆体中，得到例如种子、果实、切穗、块茎、块根、植株、愈伤组织、原生质体等，以这些为基础实现该植物体的量产。因此，本发明中包含可表达地导入了本发明涉及的多核苷酸的植物体、或者与该植物体具有相同性质的该植物体的后代、或来自该植物体或后代的组织。

此外，已报道了对各种植物的转化方法。作为本发明涉及的转化体植物，例如可例举连翘、芝麻、稻子、烟草、大麦、小麦、油菜、马铃薯、番茄、白杨、香蕉、桉树、番薯、大豆、苜蓿、羽扇豆、玉米、花椰菜、蔷薇、菊花、康乃馨、金鱼草、仙客来、兰花、洋桔梗、香雪兰、非洲菊、唐菖蒲、霞草、长寿花、百合、天竺葵(ペラルゴニウム)、老鹳草(ゼラニウム)、矮牵牛、蓝猪耳、郁金香、拟南芥、葡萄及百脉根等，但并不限于这些。

4.本发明的蛋白质的制造方法

在另一种实施方式中，本发明还提供一种使用上述转化体制备本发明蛋白质的方法。

具体来说，通过从上述转化体的培养物中分离纯化本发明的蛋白质，可得到本发明的蛋白质。在此，培养物意味着培养液、培养菌体或培养细胞、或培养菌体或培养细胞的破碎物中的任一种。本发明的蛋白质的分离纯化可按照通常的方法进行。

具体来说，本发明的蛋白质在培养菌体内或培养细胞内蓄积时，在培养后，采用通常规的方法(例如超声波、溶菌酶、冻融等)将菌体或细胞破碎后，再通过通常规的方法(例如离心分离、过滤等)，可得到本发明蛋白质的粗提取液。本发明的蛋白质在培养液中蓄积时，在培养结束后，通过通常的方法(例如离心分离、过滤等)将菌体或细胞与培养上清分离，可得到含有本发明蛋白质的培养上清。

通过这样得到的提取液或培养上清中含有的本发明蛋白质的纯化，可按照通常的分离纯化方法进行。作为分离纯化方法，例如可单独使用或组合使用硫酸铵沉淀、凝胶过滤色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法、反相高效液相色谱法、透析法及超滤法等。

5.葡萄糖苷的制造方法

进而，本发明提供使用本发明的蛋白质制造葡萄糖苷的方法。

本发明的蛋白质，催化从作为糖基供体的UDP-葡萄糖上将葡萄糖转移到作为糖基受体底物的双并四氢呋喃型木脂体上的反应(详细地说，是将葡萄糖转移到双并四氢呋喃型木脂体的4位及/或4′位的羟基上的反应。)。因此，通过使用本发明的蛋白质，将糖基受体底物及糖基供体作为原料，可制造葡萄糖苷。糖基受体底物包括结构式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)、(If)、(Ig)及(Ih)的各种双并四氢呋喃型木脂体等，优选结构式(Ia)、(Ib)及(Ic)的木脂体，更加优选结构式(Ia)及(Ic)的木脂体，最优选结构式(Ia)的木脂体。

例如，制备含有1mM的糖基受体底物、2mM的糖基供体、50mM的磷酸钙缓冲液(pH7.5)及20μM的本发明蛋白质的溶液，通过在30℃反应30分钟，可制造葡萄糖苷。可采用公知的方法从该溶液中分离纯化葡萄糖苷。具体来说，例如可单独使用或组合使用硫酸铵沉淀法、凝胶过滤色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法、反相高效液相色谱法、透析法及超滤法等。

以下参照实施例对本发明进行更加具体地说明，但本发明并不限于这些实施例。

实施例1

基因克隆

在本实施例中使用的分子生物学方法，只要没有其它详细说明，均按照Molecular Cloning(Sambrookra，Cold Spring Harbour Laboratory Press，2001)中记载的方法。

使用RNeasy Plant Mini试剂盒(QIAGEN)从木犀科连翘(Forsythiakoreana)的叶子中提取总RNA，接着通过Oligotex-dT mRNA纯化试剂盒(TaKaRaBio)分离得到PolyA(+)RNA。使用4μg该PolyA(+)RNA，使用λZAPII定向cDNA文库合成试剂盒(Stratagen公司)，根据该公司推荐的方法构建cDNA文库。

对于约50万pfu的上述cDNA文库，将拟南芥UGT71C1基因(GenBank登录号：NM 12852)作为筛选探针，通过噬菌斑杂交进行筛选。探针使用非放射性同位素DIG-核酸检测系统(罗氏(Roche)公司)，按照制造商推荐的条件通过PCR标记。此时，PCR反应液(50μl)的组成为：含有作为模板的来自拟南芥根的cDNA、1×Taq buffer(TakaRaBio)、0.2mM dNTPs、基因特异性引物(序列号1、2)各0.2pmol/μl、rTaq聚合酶1.25U。PCR反应是在94℃反应5分钟后，进行共计30个循环的94℃1分钟、52℃1分钟、72℃2分钟的反应，最后在72℃处理5分钟。对于PCR产物，将用Mini QuickSpin柱(Roche)除去引物及未反应的dNTP后的产物作为探针使用。

AtUGT71C1-Fw：

5’-ATGGGGAAGCAAGAAGATGCAGAG-3’(序列号1)

AtUGT71C1-Rv：

5’-CTACTTACTTATAGAAACGCCGT-3’(序列号2)

文库的筛选及阳性克隆的检测，使用非放射性同位素DIG-核酸检测系统(Roche Diagnostics)，按照制造商推荐的方法进行。杂交是在含有30％甲酰胺的5×SSC中在37℃进行一夜，膜的洗涤使用4×SSC、1％SDS，在55℃进行20分钟。筛选约40万个噬菌斑而得到的阳性克隆，使用DNA Sequencermodel 3100(Applied Biosystems)，通过使用合成寡核苷酸引物的引物步移法得到cDNA序列。通过用Blastx程序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)对得到的cDNA序列进行同源性分析，得到连翘UGT类基因(RengUGT)。

对于序列号3及4所示的克隆13(RengUGT13)和序列号5及6所示的克隆14(RengUGT14)，在氨基酸水平上显示相互有90％的序列同一性，通过Blastx分析，显示与探针中使用的拟南芥的UGT71C1有约40％同一性、与芝麻的UGT71A9(结构式(III)的木脂体的2位的糖转移酶)有约56％的序列同一性，由于无法推定明确的功能，所以使其在大肠杆菌中表达进行功能分析。

RengUGT13的cDNA序列：

ATGGCAGAAACAAAGAAATCAGAGCTTGTTTTCATTCCTGTTCCAGGTG

TAGGTCACTTGATATCAACTATTGAGATGGCTGAGCTTCTCACTGATAGA

GATGAACGCCTCTCGATCACAGTCATCATCATGAAGTTGCCAATGGAGT

CAAAAACCGATTTCTATTCCCGAAAATCCAATTCGCGTATACGTTTCATA

GAATTTTCTCTCAACCAGCCCATTACACCCAACAACTTTGTCACTCATTT

CATCGAAAGCCACAAGGATCCTATAAGAGATGCTGTCACGAAAATAGTT

CGTGATGAGTCCAACTCGATCAGACTTGCTGGATTCGTTATTGATATGTT

TTGTACTACTATGATTGACGTAGCCAATGAGTTTGGTGTCCCGACTTATG

TTTTCTTTACAACTACTGCTGCACTGCTTGGGTTCACCTTCTATTTGCAG

AGTCGCAGCGATGAACAGAAGTTGGATGTGACAGAATACAAGAACTCT

AATGCTGAGTTATTGATTCCCACGTACATAAATCCAGTTCCTGCTAACGT

ATTTCCTTCGAGATTCTTTGATAAGGATGGTTTGGCTATGTTCCTCGGTA

TGGCAAGAAGGTTTAGAGAGACCAAGGGAATTATGATTAACACCTTCTT

GGATTTAGAAGCTCATGCAATGAAGTCCCTCTCAGATGATCATACAATC

CCACCGGTCTACTCAATAGGCCCAATAATTCATGTTACGGCTGAAAATG

ATGACGACAACAAAGATTATGACGAGATCATCAAGTGGCTTCACGAAC

AACCTGTTTCTTCTGTTGTTTTTCTTTGCTTTGGAAGTATGGGATTTTTT

GATGATGAACAGGTTAAAGAGATTGCGGTTGCACTTGAAAAGAGTGGC

CACCGGTTCTTGTGGTCATTGAGAAAGCCTCCTCCCAAAGACAGGTTC

GAGTATCCATCAGACTACGAAAATCTTGAAGAAATTTTGCCAGAAGGG

TTCTTGCAACGTACTGCAGGAATCGGGAAGGTGATTGGATGGGCTCCA

CAAGTGGCCGTCTTATCTCACCACTCGGTGGGAGGCTTTGTGTCGCATT

GTGGTTGGAATTCGACACTGGAAAGTGTCTGGTGTGGAGTGCCAATAG

CAGCATGGCCAATGTATGCTGAGCAGCAGACTAATGCCTTCGAGTTGGT

GAAGGACTTGGGAATTGCTGTGGAGATTAAGATGGACTATAGGAGGGG

CAGTGATGTGATTGTGAAGGCTGAAGAAATTGAGAAGGGAATCAGGCA

CCTAATGGAGCCTGATAGTGAAATGAGGAATAAGATGAAACAGATGAA

AAACAAGAGTAGATTGGCTTTGATGGAAGGTGGCTCTTCCTACGATTTC

TTGAGACATTTCATCGATAACATTCCAATGACGGAT(序列号3)

RengUGT13的氨基酸序列：

MAETKKSELVFIPVPGVGHLISTIEMAELLTDRDERLSITVIIMKLPMESKT

DFYSRKSNSRIRFIEFSLNQPITPNNFVTHFIESHKDPIRDAVTKIVRDESNSI

RLAGFVIDMFCTTMIDVANEFGVPTYVFFTTTAALLGFTFYLQSRSDEQKL

DVTEYKNSNAELLIPTYINPVPANVFPSRFFDKDGLAMFLGMARRFRETK

GIMINTFLDLEAHAMKSLSDDHTIPPVYSIGPIIHVTAENDDDNKDYDEIIK

WLHEQPVSSVVFLCFGSMGFFDDEQVKEIAVALEKSGHRFLWSLRKPPPK

DRFEYPSDYENLEEILPEGFLQRTAGIGKVIGWAPQVAVLSHHSVGGFVSH

CGWNSTLESVWCGVPIAAWPMYAEQQTNAFELVKDLGIAVEIKMDYRRG

SDVIVKAEEIEKGIRHLMEPDSEMRNKMKQMKNKSRLALMEGGSSYDFL

RHFIDNIPMTD(序列号4)

RengUGT14的cDNA序列：

ATGGCAGAAACAAAGAAATCAGAGCTTGTTTTCATTCCTGCACCAGGA

ATAGGTCACTTGATATCAACTATTGAGTTGGCTAAGCTTCTCACTGATAG

AGATGAGCACCTCTCGATCACAGTCCTCATCTTGAAGTTGCCAATGGAG

TCGAAAACCGATTCCTATTCCCAAAAATCCAATTCGCGTATACGTTTCAT

AGAATTATCTCTCAATCAACCTATTACACCCAACAACTTTGTCACTGATT

TCATCGAAGGCCACAAGGATCCTATAAGAGATGCTGTCACGAAAATAGT

TCGTGATGAGTCCAACTCTATTAGACTTGCTGGATTCGTTATTGATATGT

TTTGTACTACTATGATTGATGTAGCCAATGAGTTTGGTGTCCCGACGTAT

GTTTTCTTTACAACTACTGCTGCAATGCTTGGGTTCATCTTCTATTTGCA

GAGTCGCGGCGATGAACAGAAGTTGGATGTGACTGAGTACAAGAACTC

AAATACTAAGTTATTGATTCCCACGTACATAAATCCGGTTCCTGCTAATG

TATTTCCTTCTAAATTATTTGATAAGGATAGTTTGGCTCCATTCGTCAGTA

TGGCAAGAAGGTTTAGAGAGACCAAGGGAATTTTGATTAACACCTTCT

TGGATTTAGAAGCTTATGCATTGAAGTCCCTCTCTGATGATCATACAATC

CCACCGGTCTACTCAATAGGCCCGATACTTCATGTTAAGGTTGAAAATG

ATGACAAAAAGAAAGATTATGACGAGATCATCAATTGGCTTCACGAAC

AACCTGTTTCGTCTGTTGTTTTTCTTTGCTTTGGAAGTTTGGGTTGTTTT

GATGTCGAACAGGTTAAAGAGATTGCGGTTGCACTTGAAAAGAGTGGC

CACCGGTTCTTGTGGTCATTGAGAAAGCCTCCTCCCAAAGACTTCGAG

CATCCATCAGACTACGAAAATTTTGAAGAAGTATTGCCAGAAGGGTTCT

TGCAACGTACAGCAGGAATCGGGAAGGTGATTGGATGGGCGCCACAAG

TGGCCGTCTTATCTCACCATTCGGTGGGAGGCTTTGTGTCGCATTGTGG

TTGGAATTCGACGCTGGAAAGTGTCTGGTGTGGAGTGCCAATAGCGGC

ATGGCCAATGTATGCCGAACAGCAGACTAATGCCTTTGAGTTGGTGAAG

GACTTGGGAATTGCTGTGGAGATTAAGATGGACTATAGGAAGGGCAGT

GATGTGATTGTGAAGGCTGAAGAAATTGAGAAGGGAATCAAGCACCTA

ATGGAGCCTGATAGTGAAATGAGGAATAAGATGAAACAGATGAAAAGC

AAGAGTAGATTGGCTTTGATGGAAGGTGGCTCTTCTTACAATTTCTTGA

GGCGTTTCATCGATAACATTCCAATGACGGAT(序列号5)

RengUGT14的氨基酸序列：

MAETKKSELVFIPAPGIGHLISTIELAKLLTDRDEHLSITVLILKLPMESKTD

SYSQKSNSRIRFIELSLNQPITPNNFVTDFIEGHKDPIRDAVTKIVRDESNSIR

LAGFVIDMFCTTMIDVANEFGVPTYVFFTTTAAMLGFIFYLQSRGDEQKL

DVTEYKNSNTKLLIPTYINPVPANVFPSKLFDKDSLAPFVSMARRFRETKG

ILINTFLDLEAYALKSLSDDHTIPPVYSIGPILHVKVENDDKKKDYDEIINW

LHEQPVSSVVFLCFGSLGCFDVEQVKEIAVALEKSGHRFLWSLRKPPPKDF

EHPSDYENFEEVLPEGFLQRTAGIGKVIGWAPQVAVLSHHSVGGFVSHCG

WNSTLESVWCGVPIAAWPMYAEQQTNAFELVKDLGIAVEIKMDYRKGSD

VIVKAEEIEKGIKHLMEPDSEMRNKMKQMKSKSRLALMEGGSSYNFLRR

FIDNIPMTD(序列号6)

实施例2

表达载体构建

使用附加了下述限制性内切酶位点的引物(序列号7、8)，通过PCR法扩增RengUGT13及RengUGT14的全长ORF。

该引物组具有可扩增两个RengUGT克隆的共同的序列。此外，引物中的带有下划线的碱基序列为附加在引物上的限制性内切酶识别序列。

CACC-NdeI-RengUGT-Fw：

5’-CACCCATATGGCAGAAACAAAGAAATCAGA-3’(序列号7)

BglII-RengUGT-Rv：

5’-AGATCTTTAATCCGTCATTGGAATGTTAT-3’(序列号8)

PCR反应液(50μl)的组成为：含有1μl模板DNA(二次筛选后的噬菌体溶液)、1×ExTaq缓冲液(TaKaRaBio)、0.2mM dNTPs、引物各0.4pmol/μl、2.5U ExTaq聚合酶。PCR反应是：在94℃反应3分钟后，进行共计30个循环的94℃1分钟、50℃1分钟、72℃2分钟的反应的扩增。对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，用溴化乙锭染色的结果，得到根据各模板DNA推定的约1.4kb大小的扩增条带。

采用制造商推荐的方法将这些PCR产物亚克隆到pENTR-TOPODirectional载体(Invitrogen)上。使用DNA Sequencer model 3100(AppliedBiosystems)，通过使用合成寡核苷酸引物的引物步移法对克隆进行测序，来确认插入片段内无PCR引起的突变。

利用附加在引物上的NdeI及BglII的限制性内切酶位点，切出约1.4kb的RengUGT13及RengUGT14片段，连接到作为大肠杆菌表达载体的pET15b(Novagen公司)的NdeI及BamHI位点，得到本酶基因的大肠杆菌表达载体。设计位于本载体NdeI位点上游的His-Tag与两个RengUGT基因的开放阅读框匹配，用于表达两个RengUGT与His-Tag融合的嵌合蛋白质。

实施例3

酶功能分析

为了明确两个酶的生物化学功能，使所述酶在大肠杆菌中表达。使用上述得到的两个RengUGT大肠杆菌表达用质粒，按照常规方法转化大肠杆菌BL21(DE3)株。将得到的转化体在4ml含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基(10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母提取物，1g/l NaCl)中在37℃振荡培养一夜。将细胞达到静止期的4ml培养液接种于具有相同组成的80ml培养基中，在37℃振荡培养。当菌体浊度(OD600)达到约0.5时，添加最终浓度为0.5mM的IPTG，在18℃振荡培养20小时。

以下所有操作均在4℃进行。通过离心分离(5,000×g，10min)收集培养的转化体，添加1ml的Buffer S[20mM HEPES缓冲液(pH 7.5)、20mM咪唑、14mM β-巯基乙醇]/g细胞，形成悬浮液。接着进行超声波破碎(15sec×8次)，进行离心分离(15,000×g，15min)。将得到的上清作为粗酶液回收。将粗酶液上载于用Buffer S平衡后的His SpinTrap(GE Healthcare)上，进行离心(70×g，30sec)。用Buffer洗涤后，用含有100mM及500mM的咪唑的Buffer S各5ml，将结合在柱上的蛋白质阶段性洗脱。使用MicroconYM-30(Amicon)，用含有14mM β-巯基乙醇的20mM HEPES缓冲液(pH 7.5)对各洗脱级分进行缓冲液置换(透析倍率1000倍)。

SDS-PAGE分析的结果，在200mM咪唑洗脱级分中确认有在两个RengUGT的推定分子量约50KDa附近的蛋白质，将该级分用于酶分析(图2)。

标准的酶反应条件如下所述。用蒸馏水将反应液(1mM UDP-葡萄糖，100μM糖基受体底物，100mM磷酸钙缓冲液(pH 7.5)，25μl纯化酶溶液)调至50μl，在30℃反应1小时。通过添加50μl的含有0.1％三氟乙酸(TFA)的100％乙腈使反应终止，之后用反相HPLC进行分析。

LC为：使用Lc-2010c(岛津制作所)，流动相使用A液：0.1％TFA、B液：0.1％TFA、90％乙腈，色谱柱使用Develosil-C30-UG5(野村化学，4.6mm×150mm)，在40℃下进行。将色谱柱平衡后，以流速1ml/分钟、B5％→B100％的直线浓度梯度洗脱20分钟，用B100％洗脱5分钟。检测通过测定280nm处的吸收来进行。利用SPD-10AV(岛津制作所)，从测定220nm至330nm的光谱的分析中，探索具有木脂体所特有的2个最大吸收(230nm及280nm)的物质。在该条件下，在约11.6分钟检测出结构式(Ia)的木脂体，在约12.2分钟检测出结构式(Ib)的木脂体，在约13.8分钟检测出结构式(Ic)的木脂体，在约9.8分钟检测出结构式(V)的木脂体。

对于结构式(Ia)的木脂体和RengUGT13或RengUGT14的反应液，在上述条件下进行HPLC分析，结果，新检测出在约8.7分钟洗脱的峰(图3；*符号)。由于该峰依赖于作为糖基供体的UDP-葡萄糖，表明该峰为在结构式(Ia)的木脂体上添加了葡萄糖的木脂体糖苷的峰。

接着将该峰进行分级，在下述条件下进行MS分析。

LC-MS为：采用LCMS-IT-TOF系统(岛津制作所)，使用DevelosilC30-UG-3柱(野村化学株式会社、3.0mm×150mm)，流动相中使用含0.1％甲酸的水作为A液，使用含0.1％甲酸的100％乙腈作为B液。以直线浓度梯度(B液5％→100％)洗脱20分钟，然后用B液100％进行5分钟的等度洗脱(流速：0.2ml/分钟、柱温箱：40℃)。检测采用光电二极管矩阵检测器(SPD-M10A、岛津制作所)，收集230～500nm的数据，测定A280nm的色谱图。MS的测定条件为在负极模式下进行(离子化：ESI、界面电压：-3.5kV)。

推测在该条件下，该峰为在产生519.16391[M-H]-的分子离子的结构式(Ia)的木脂体的4位上添加了1个葡萄糖的单葡萄糖苷(图4)。由此表明，RengUGT13及RengUGT14为具有将一分子葡萄糖转移到结构式(Ia)的木脂体上的活性的酶。

因为在大肠杆菌中RengUGT14重组蛋白质的表达量高(图2)，所以使用本酶来评价糖基受体选择性。对于结构式(Ia)的木脂体的活性为100时，对于作为相同的双并四氢呋喃型木脂体的结构式(Ib)的木脂体的转糖基活性为112，对于结构式(Ic)的木脂体的转糖基活性为128，显示出高的转糖基活性。另一方面，对于作为非双并四氢呋喃型木脂体的结构式(V)的木脂体几乎未显示活性。由以上结果表明，RengUGT14为双并四氢呋喃型木脂体4位特异性糖基转移酶。

实施例4

基因表达分析

为了鉴定RengUGT13及RengUGT14基因的功能区域，采用与“Ono，E.，etal.(2006)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103，10116-10121”中记载的方法相同的方法，通过RT-PCR来分析连翘各器官中的基因表达模式。

采用与实施例1相同的方法，从连翘的各器官(叶子、幼蕾、花瓣及培养细胞(来自愈伤组织))中提取总RNA，取其中0.5μg，通过用Random Oligo-dT引物进行逆转录(RT)反应，得到来自各器官的cDNA，将此作为PCR的模板。

将用于RT-PCR的基因特异性引物(序列号9～12)设计成能够区别RengUGT13及RengUGT14基因。采用连翘的核糖体RNA(连翘rRNA；GenBank登录号：AF534808)作为内标基因，使用以下的基因特异性引物(序列号13、14)扩增。

<RengUGT13基因用引物>

Reng13-RT-FW2：

5’-TAGCGGATCAACCAACTAAAC-3’(序列号9)

Reng13-RT-RV：

5’-TCTTGCCATACCGAGGAACAT-3’(序列号10)

<RengUGT14基因用引物>

Reng 14-RT-FW2：

5’-TAGCAGATCAACCCAGTAAAT-3’(序列号11)

Reng14-RT-RV：

5’-TCTTGCCATACTGACGAATGG-3’(序列号12)

<连翘rRNA用引物>

FsrRNA-Fw：

5’-TAAAACGACTCTCGGCAACGGA-3’(序列号13)

FsrRNA-Rv：

5’-ATCCCGCCTGACCTGGGGTCGCT-3’(序列号14)

PCR反应液(50μl)的组成为：含有1μl模板cDNA、1×ExTaq缓冲液(TaKaRaBio)、0.2mM dNTPs、引物各0.4pmol/μl、2.5U ExTaq聚合酶。PCR反应是：在94℃反应3分钟后，进行共计20～35个循环的94℃1分钟、50℃1分钟、72℃2分钟的反应的扩增，对各基因设定基因表达不饱和的条件。

PCR产物用1％琼脂糖进行电泳，通过溴化乙锭染色来检测(图5)。其结果，RengUGT13及RengUGT14基因在叶子中表达最高，并确认在花蕾及花瓣中也有表达。但是，因为在培养细胞中RengUGT14基因特异性表达，所以认为本酶在培养细胞中负责将糖转移到木脂体上。

由以上结果表明，RengUGT13及RengUGT14为结构、功能及表达区域类似的酶。

工业适用性

已鉴定了将葡萄糖转移到双并四氢呋喃型木脂体的4位及/或4′位上的酶基因。通过使用本酶，可在试管内人工将葡萄糖特异性地转移到双并四氢呋喃型木脂体的4位及/或4′位上，因此本酶可对新型功能性食品原料的开发、次级代谢产物的分子育种做出贡献。

因此，本发明可在农业、食品产业、药品产业以及这些产业的相关产业广泛利用，从这点来看，极为有用。

序列表(自由文本格式)

序列号1：合成DNA

序列号2：合成DNA

序列号7：合成DNA

序列号8：合成DNA

序列号9：合成DNA

序列号10：合成DNA

序列号11：合成DNA

序列号12：合成DNA

序列号13：合成DNA

序列号14：合成DNA

Claims (11)

1.一种多核苷酸，其特征在于，其编码由序列号4或6表示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸由序列号3或5表示的碱基序列组成。

3.根据权利要求1或2所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸为DNA。

4.一种蛋白质，其特征在于，所述蛋白质由权利要求1-3中任一项所述的多核苷酸编码。

5.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求1-3中任一项所述的多核苷酸。

6.一种转化体，其特征在于，其中导入了权利要求1-3中任一项所述的多核苷酸。

7.一种转化体，其特征在于，其中导入了权利要求5所述的载体。

8.一种制造权利要求4所述的蛋白质的方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求6或7所述的转化体。

9.一种制造葡萄糖糖苷的方法，其特征在于，所述方法包括以权利要求4所述的蛋白质为催化剂，由UDP-葡萄糖和糖基受体底物生成葡萄糖苷。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述糖基受体底物为双并四氢呋喃型木脂体。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述双并四氢呋喃型木脂体为下述结构式(Ia)、(Ib)或(Ic)所表示的木脂体：

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