KR20110110178A - 플라보노이드 3위 글루쿠론산 전이 효소 및 그것을 코드하는 폴리뉴클레오티드 - Google Patents

플라보노이드 3위 글루쿠론산 전이 효소 및 그것을 코드하는 폴리뉴클레오티드 Download PDF

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유코 후쿠이
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산토리 홀딩스 가부시키가이샤
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Abstract

플라보노이드, 특히 플라보놀의 3위에 글루쿠론산을 전이할 수 있는 효소(F3GAT), 상기 효소를 코드하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터 및 상기 벡터를 이용하여 얻어지는 형질 전환체 등을 제공한다. 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는, 서열 번호 3으로 표시되는 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 또는 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 것이다.

Description

플라보노이드 3위 글루쿠론산 전이 효소 및 그것을 코드하는 폴리뉴클레오티드{FLAVONOID-3-GLUCURONYLTRANSFERASE AND POLYNUCLEOTIDE ENCODING SAME}
본 발명은, 플라보노이드 3위 글루쿠론산 전이 효소, 상기 효소를 코드하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터 및 상기 벡터를 이용하여 얻어지는 형질 전환체 등에 관한 것이다.
플라보노이드나 리그난으로 대표되는 식물 2차 대사 산물은 건강 식품으로서 이용되는 경우가 많지만, 이들은 체내에서 UGT라고 불리는 당전이 효소(배당체화 효소)에 의해 글루쿠론산 포합화된다. 일반적으로 글루쿠론산 포합체는 뇨로서 배출되기 때문에 그 기능성에 관해서는 지금까지 연구의 대상이 되지 않았지만, 최근에 몰핀글루쿠론산 포합체나 플라보노이드의 글루쿠론산 포합체의 생물 활성이 알려지고 있다(비특허 문헌 1, 2 참조).
와인 원료인 포도과 포도(Vitis vinifera)는 세계적으로 주요 농작물이며, 레드와인은 심장병 리스크의 경감이나 항비만 효과 등의 유용한 기능성이 알려져 있지만, 최근 항비만 효과나 연명 효과의 주요한 기능 성분으로서 스틸벤의 일종인 레스베라트롤이나, 프렌치 패러독스의 요인이 되는 주요 성분으로서 프로시아니딘이 확인되었기 때문에 기능성 식품으로서 주목받고 있다(비특허 문헌 3∼9 참조).
포도잎에는, 플라보노이드의 일종인 플라보놀 배당체로서, 케르세틴 3위 글루코스 배당체 및 케르세틴 3위 글루쿠론산 배당체가 축적되어 있는 것이 보고되어 있다(비특허 문헌 10 참조). 또 최근, 포도 과실 및 와인에서도 각종 플라보놀 배당체의 축적이 보고되어 있다(비특허 문헌 11). 특히 케르세틴의 3위 글루쿠론산 배당체는 미켈리아닌이라고 불리고, 항우울제로서 이용되고 있는 세인트존스와트의 약리종 성분의 하나로서 알려져 있고, 경구 투여에 의해 장관을 통해 흡수되어 중추 신경계에 도달하는 것이 나타나 있지만, 케르세틴 3위 람노오스 배당체에는 그 활성이 없다(비특허 문헌 12 참조). 또한, 케르세틴의 3위 글루쿠론산 배당체는, LDL 분해 저해 효과(비특허 문헌 13, 14 참조)나, H2O2에 의한 세포내 산화 스트레스의 경감 효과(비특허 문헌 15 참조)나, 안지오텐신에 의한 혈관 비대의 억제 효과(심장병 예방)(비특허 문헌 16 참조) 등이 알려져 있다.
이러한 점에서, 플라보노이드, 특히 플라보놀의 3위에 글루쿠론산을 전이하는 효소는, 기능성 플라보노이드를 만들어내기에 유용하다고 생각되지만, 지금까지 플라보노이드의 3위의 배당체화 효소로는, 글루코스, 갈락토오스, 아라비노스 및 람노오스를 당공여체로서 전이하는 것만이 알려져 있고, 글루쿠론산을 당공여체로서 전이하는 효소 및 그것을 코드하는 유전자는 알려져 있지 않다(비특허 문헌 17∼20 참조).
그런데, 최근 이탈리아 및 프랑스의 합동 콘소시엄에 의해, 포도(피노누아(Pinot Noir) 품종)의 게놈 서열이 해독되어, 240개나 되는 배당체화 효소(UGT) 유전자가 확인되었다(비특허 문헌 21, 22 참조).
그러나, 유전자 서열 정보로부터 당전이 효소 유전자인 것이 추정되더라도, 그것으로부터 기질인 당의 종류나 수용체가 되는 물질을 유추하는 것은 용이하지 않고, 더구나, 전술한 바와 같이 후보 유전자의 수도 240개로 매우 많기 때문에, 이들 UGT 유전자 중에서 지금까지 다른 생물에서도 보고가 없는 플라보노이드 3위 글루쿠론산 전이 효소(Flavonoid 3-O-glucuronic acid transferase; F3GAT)를 확인하는 것은 매우 어려웠다.
비특허 문헌 1 : Kroemer, H. K. and Klotz, U. Clin. Pharmacokinet., vol. 23, p. 292-310, 1992 비특허 문헌 2 : Zhang, L. et al., Eur. J. Pharm. Sci., vol. 31, p. 221-231, 2007 비특허 문헌 3 : Renaud, S. and De Lorgeril, M., Lancet, vol. 339, p. 1523-1526, 1992 비특허 문헌 4 : Gehm, B. D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 94, p. 14138-14143, 1997 비특허 문헌 5 : Corder, R. et al., Nature, vol. 414, p. 863-864, 2001 비특허 문헌 6 : Lamming, D. W. et al. Mol. Microbiol., vol. 53, p. 1003-1009, 2004 비특허 문헌 7 : Corder, R. et al., Nature, vol. 444, p. 566, 2006 비특허 문헌 8 : Baur, J. A. and Sinclair, D. A., Nature Rev. Drug Discovery, vol. 5, p. 493-506, 2006 비특허 문헌 9 : Baur, J. A. et al., Nature, vol. 444, p. 337-342, 2006 비특허 문헌 10 : Hmamouchi, M. et al., Am. J. Enol. Vitic., vol. 47, p. 186-192, 1996 비특허 문헌 11 : Castillo-Munoz, N. et al., J. Agric. Food. Chem., vol. 55, p. 992-1002, 2007 비특허 문헌 12 : Juergenliemk, G. et al., Plant Med., vol. 69, p. 1013-1017, 2003 비특허 문헌 13 : Terao, J. et al, Free Radical Res., vol. 35, p. 925-931, 2001 비특허 문헌 14 : Shirai, M. et al., J. Agric. Food Chem., vol. 49, p. 5602-5608, 2001 비특허 문헌 15 : Shirai, M. et al., Biosci. Biotechnol. Biocham., vol. 66, p. 1015-1021, 2002 비특허 문헌 16 : Yoshimizu, M. et al., Biochem. Biophys. Res. Commu., vol. 293, p. 1458-1465, 2002 비특허 문헌 17 : Ford, C. M. et al., J. Biol. Chem., vol. 273, p. 9224-9233, 1998 비특허 문헌 18 : Miller, K. D. et al., J. Biol. Chem., vol. 274, p. 34011-34019, 1999 비특허 문헌 19 : Yonekura-Sakakibara, K. et al., J. Biol. Chem., vol. 282, p. 14932-14941, 2007 비특허 문헌 20 : Yonekura-Sakakibara, K. et al., Plant Cell, vol. 20, p. 2160-2176, 2008 비특허 문헌 21 : The French-Italian Public Consortium for Grapevine Genome Characterization, Nature, vol. 449, p. 463-468, 2007 비특허 문헌 22 : Velasco, T. et al., PLoS ONE, vol. 12, e1326, p. 1-18, 2007
따라서, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 플라보노이드, 특히 플라보놀의 3위에 글루쿠론산을 전이할 수 있는 효소, 상기 효소를 코드하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터 및 상기 벡터를 이용하여 얻어지는 형질 전환체 등을 제공하는 것에 있다.
본 발명자는, 상기 과제를 해결하기 위해 예의 검토를 했다. 그 결과, 본 발명자는, 플라보노이드 UGT의 유전자 서열 구조와 당수용체인 기질에 대한 위치 특이성 사이에 상관이 있는 것에 착안하여, 플라보노이드 3위에 당을 전이하는 효소 유전자와 상동성이 높은 포도 유래 UGT 유전자를 게놈 서열 정보로부터 추출함으로써, 6종의 후보 포도 유래 UGT 유전자(Vitis vinifera UDP-sugar: glycosyltransferase; VvGT)를 얻었다. 그 6종의 VvGT 중의 1종(VvGT5)이, 플라보노이드의 3위에 UDP-글루쿠론산 의존적으로 글루쿠론산을 전이하는 활성을 갖는 효소, 즉 플라보노이드 3위 글루쿠론산 전이 효소(Flavonoid 3-O-glucuronic acid transferase; F3GAT)를 코드하는 유전자인 것을 발견하여, 본 발명을 완성했다.
즉, 본 발명은 이하와 같다.
(1) 이하의 (a)∼(f) 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드:
(a) 서열 번호 3으로 표시되는 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드;
(b) 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드;
(c) 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열에서 1∼15개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, UDP-글루쿠론산 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드;
(d) 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열에 대하여, 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 가지며, UDP-글루쿠론산 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드;
(e) 서열 번호 3으로 표시되는 염기 서열과 상보적인 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에서 혼성화하고, UDP-글루쿠론산 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드; 또는
(f) 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드의 염기 서열과 상보적인 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에서 혼성화하고, UDP-글루쿠론산 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드.
상기 (1)의 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어, 이하의 (g)∼(j) 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다.
(g) 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열에서 10개 이하의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, UDP-글루쿠론산 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드;
(h) 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열에 대하여, 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 가지며, UDP-글루쿠론산 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드;
(i) 서열 번호 3으로 표시되는 염기 서열과 상보적인 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드와 고 엄격한 조건하에서 혼성화하고, UDP-글루쿠론산 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드; 또는
(j) 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드의 염기 서열과 상보적인 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드와 고 엄격한 조건하에서 혼성화하고, UDP-글루쿠론산 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드.
또, 상기 (1)의 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어, 상기 (c)∼(j)에 기재된 폴리뉴클레오티드가, 각각 이하의 (c')∼(j')에 기재된 폴리뉴클레오티드인 것을 들 수 있다.
(c') 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열에서 제140번째 아미노산을 제외한 1∼15개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, UDP-글루쿠론산 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드;
(d') 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열에 대하여, 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열이며 상기 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열 중의 제140번째 아미노산에 대응하는 아미노산이 아르기닌인 아미노산 서열을 가지며, UDP-글루쿠론산 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드;
(e') 서열 번호 3으로 표시되는 염기 서열과 상보적인 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드이며 상기 서열 번호 3으로 표시되는 염기 서열 중의 제418∼420번째 염기에 대응하는 염기가 아르기닌을 코드하는 염기인 폴리뉴클레오티드이고, UDP-글루쿠론산 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드;
(f') 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드의 염기 서열과 상보적인 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드이며 상기 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드의 염기 서열 중의 제418∼420번째 염기에 대응하는 염기가 아르기닌을 코드하는 염기인 폴리뉴클레오티드이고, UDP-글루쿠론산 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드;
(g') 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열에서 제140번째 아미노산을 제외한 10개 이하의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, UDP-글루쿠론산 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드;
(h') 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열에 대하여, 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열이며 상기 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열 중의 제140번째 아미노산에 대응하는 아미노산이 아르기닌인 아미노산 서열을 가지며, UDP-글루쿠론산 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드;
(i') 서열 번호 3으로 표시되는 염기 서열과 상보적인 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드와 고 엄격한 조건하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드이며 상기 서열 번호 3으로 표시되는 염기 서열 중의 제418∼420번째 염기에 대응하는 염기가 아르기닌을 코드하는 염기인 폴리뉴클레오티드이고, UDP-글루쿠론산 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드; 또는
(j') 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드의 염기 서열과 상보적인 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드와 고 엄격한 조건하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드이며 상기 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드의 염기 서열 중의 제418∼420번째 염기에 대응하는 염기가 아르기닌을 코드하는 염기인 폴리뉴클레오티드이고, UDP-글루쿠론산 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드.
상기 (1)의 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어, 상기 UDP-글루쿠론산 전이 효소 활성이 플라보노이드 3위 글루쿠론산 전이 효소 활성인 것을 들 수 있다.
상기 (1)의 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어, 서열 번호 3으로 표시되는 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 또는 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 것을 들 수 있다.
상기 (1)의 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 DNA인 것을 들 수 있다.
(2) 상기 (1)의 폴리뉴클레오티드에 코드되는 단백질.
(3) 상기 (1)의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터.
(4) 상기 (1)의 폴리뉴클레오티드가 도입된 형질 전환체.
(5) 상기 (3)의 벡터가 도입된 형질 전환체.
(6) 상기 (4) 또는 (5)의 형질 전환체를 이용하는 상기 (2)의 단백질의 제조 방법.
(7) 상기 (2)의 단백질을 촉매로 하여, UDP-글루쿠론산과 당수용체 기질로부터 글루쿠론산 포합체를 생성하는 글루쿠론산 포합체의 제조 방법.
상기 (7)의 방법은, 예를 들어 당수용체 기질이 플라보노이드인 방법을 들 수 있다.
일반적으로, 플라보노이드는 체내에서, 그 대부분이 3위 또는 7위가 글루쿠론산 포합화되어 있고, 그 구조의 차이에서 상이한 기능성 및 유용성이 예측되고 있다. 그러나, 인간 또는 동물로부터 이러한 글루쿠론산 포합화된 대사물을 분리 및 정제하여 얻는 것은, 경제성 및 시간적 비용상 적합하지 않은 것이었다.
본 발명에 의하면, in vitro로, 또는 숙주 세포에 본 발명의 유전자를 도입함으로써, 플라보노이드의 3위에 글루쿠론산을 전이하는 것이 가능해져, 미켈리아닌을 비롯한 유용 플라보노이드 글루쿠로나이드를 상기와 같은 천연 자원에 의존하지 않고 용이하게 생산시킬 수 있는, 당전이 효소(배당체화 효소)를 제공할 수 있다. 또, 본 발명에 의하면, 상기 효소를 코드하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터 및 상기 벡터를 이용하여 얻어지는 형질 전환체, 그리고 상기 효소를 이용한 글루쿠론산 포합체의 제조 방법 등을 제공할 수도 있다.
도 1은 포도 유래 플라보노이드 배당체화 효소 호모로그 유전자의 계통 해석의 결과를 나타낸 도면이다. Neighbor-Joining(NJ)법에 의한 8종의 포도 UGT(VvGT)를 포함하는 플라보노이드 UGT 유전자의 클러스터 I의 분자 계통수이다. 아웃 그룹(Out group)은, 미국 포도 Vitis labrusca(콩코드종)의 레스베라트롤의 글루코스 전이 효소 유전자(VlRSgt)이다.
도 2는 포도 유래 배당체화 효소 호모로그 유전자의 염색체 맵핑의 결과를 나타낸 도면이다. VvGT1 호모로그 유전자는, LG11 염색체와 LG6 염색체 상에 탠덤형으로 좌위하고 있다.
도 3은 대장균 발현 VvGT5 단백질의 정제(SDS-PAGE)의 결과를 나타낸 도면이다. 500 mM 이미다졸에 의한 용출 분획에 보이는 밴드(도면 중의 화살표)는, His 태그 융합 VvGT5 단백질이다. 「M」은 분자 사이즈마커, 「조」는 조효소액, 「소」는 그대로의 액, 「세」는 세정후의 액을 나타낸다.
도 4는 VvGT5의 효소 활성 측정의 결과를 나타낸 도면이다. 구체적으로는, 360 nm에서 모니터한 HPLC 차트이다. 상단의 차트는, 케르세틴과 VvGT5의 반응액에 관한 것, 중단의 차트는, 표품의 케르세틴 3-글루쿠로나이드에 관한 것, 하단의 차트는, 표품의 케르세틴에 관한 것이다. 상단의 차트에 나타낸 화살표는, 반응 생성물의 피크를 나타낸다.
도 5는 VvGT5의 지적 pH 분석에 이용한 버퍼계를 나타낸 도표이다.
도 6은 VvGT5의 반응 pH 의존성의 결과를 나타낸 도면이다. 종축은, 가장 활성이 높은 것을 100%로 했을 때의 상대 활성(%)을 나타낸다.
도 7은 VvGT5의 반응 온도 의존성의 결과를 나타낸 도면이다. 종축은, 가장 활성이 높은 것을 100%로 했을 때의 상대 활성(%)을 나타낸다.
도 8은 VvGT5의 당수용체 선택성의 결과를 나타낸 도표이다. 「n. d.」는 검출 한계 이하를 나타낸다.
도 9는 케르세틴 3-글루쿠로나이드의 NMR의 결과를 나타낸 도면이다. 구조식의 중앙 하부의 굵은 선으로 나타낸 결합 부분은, HMBC(Hetero-nuclear Multiple-Bond Connectivity) 측정에 의해 결합이 확인된 부분이다.
도 10은 정량 RT-PCR에 의한 기관별 VvGT 유전자 발현 해석의 결과를 나타낸 도면이다. 구체적으로는, 피노누아 품종(좌측)과 카베르네 쇼비뇽 품종(우측)에서의 VvGT의 유전자 발현 해석을 한 결과이다. 양 품종 모두, 상단의 그래프는 VvGT1 유전자에 관한, 중단의 그래프는 VvGT5 유전자에 관한, 하단의 그래프는 VvGT6에 관한 해석 결과이다. 모든 그래프에서, 내부 표준 유전자(VvUBQ)에서 표준화한 상대 발현량을 나타내고 있다.
도 11은 플라보노이드 LC 분석의 결과를 나타낸 도면이다. 「Q3GA」는 케르세틴 3-글루쿠로나이드를 나타내고, 「Q3Glc」는 케르세틴 3-글루코시드를 나타낸다.
도 12는 MS 분석의 결과를 나타낸 도면이다. 「Q3GA」는 케르세틴 3-글루쿠로나이드를 나타내고, 「Q3Glc」는 케르세틴 3-글루코시드를 나타낸다.
도 13은 아미노산 서열 비교(Formatted Alignments)의 결과를 나타낸 도면이다. VvGT5의 140번째 아르기닌 잔기(R)의 위치를 굵은 테두리로 둘러싸서 나타내고 있다. At3GlcT, Ph3GlcT 및 VvGT1은, 각각 순서대로 애기장대, 페튜니아 및 포도의 플라보노이드 3위 글루코스 전이 효소를 나타낸다.
도 14는 VvGT5 변이체(VvGT5 R140W)의 당공여체 선택성의 결과를 나타낸 도면(하측의 그래프)이다(효소 반응 조건(상측의 표)). 그래프의 종축은, 야생형 VvGT5(WT) 및 그 변이체(R140W)의 각각에 관해, 가장 활성이 높았던 UDP-글루쿠론산 및 UDP-글루코스를 100%로 했을 때의 상대 활성(Relative activity (%))이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다. 본 발명의 범위는 이들 설명에 구속되지는 않고, 이하의 예시 이외에 관해서도, 본 발명의 취지를 손상하지 않는 범위에서 적절하게 변경하여 실시할 수 있다. 본 명세서는, 본원 우선권 주장의 기초가 되는 일본 특허 출원 제2009-011065호 명세서(2009년 1월 21일 출원)의 전체를 포함한다. 또, 본 명세서에서 인용된 모든 간행물, 예를 들어 선행 기술 문헌 및 공개 공보, 특허 공보 그 밖의 특허 문헌은, 참조로서 본 명세서에 삽입된다.
1. 본 발명의 폴리뉴클레오티드
먼저, 본 발명은, (a) 서열 번호 3의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드(구체적으로는, DNA, 이하, 이들을 단순히 「DNA」라고도 칭함); 및 (b) 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명에서 대상으로 하는 DNA는, 상기 글루쿠론산 전이 효소를 코드하는 DNA에 한정되지 않고, 이 단백질과 기능적으로 동등한 단백질을 코드하는 다른 DNA를 포함한다.
기능적으로 동등한 단백질로는, 예를 들어, (c) 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열에서 1∼15개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, UDP-글루쿠론산 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 들 수 있다. 이러한 단백질로는, 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열에서, 예를 들어, 1∼15개, 1∼14개, 1∼13개, 1∼12개, 1∼11개, 1∼10개, 1∼9개, 1∼8개, 1∼7개, 1∼6개(1∼여러개), 1∼5개, 1∼4개, 1∼3개, 1∼2개, 1개의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, UDP-글루쿠론산 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 들 수 있다. 상기 아미노산 잔기의 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가의 수는, 일반적으로는 작을수록 바람직하다. 본 발명에서는, 상기 (c)의 기능적으로 동등한 단백질은, 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열 중의 제140번째 아미노산 잔기(아르기닌)에 대응하는 아미노산 잔기가 마찬가지로 아르기닌인 아미노산 서열로 이루어진 것이 바람직하다. 즉, 상기 아미노산 잔기의 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가는, 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열 중의 제140번째 아미노산 이외의 아미노산에 관해 이루어진 것이 바람직하다. 이 바람직한 양태는, 상기 (g)의 폴리뉴클레오티드에서도 동일하다.
또, 기능적으로 동등한 단백질로는, 예를 들어, (d) 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열에 대하여, 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 가지며, UDP-글루쿠론산 전이 효소 활성을 갖는 단백질도 들 수 있다. 이러한 단백질로는, 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열에 대하여, 약 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.1% 이상, 99.2% 이상, 99.3% 이상, 99.4% 이상, 99.5% 이상, 99.6% 이상, 99.7% 이상, 99.8% 이상, 99.9% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 가지며, UDP-글루쿠론산 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 들 수 있다. 상기 상동성의 수치는 일반적으로 클수록 바람직하다. 또한 본 발명에서는, 상기 (d)의 기능적으로 동등한 단백질은, 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열 중의 제140번째 아미노산 잔기(아르기닌)에 대응하는 아미노산 잔기가 마찬가지로 아르기닌인 아미노산 서열로 이루어진 것이 바람직하다. 이 바람직한 양태는, 상기 (h)의 폴리뉴클레오티드에서도 동일하다.
여기서, 본 발명에서 말하는 「UDP-글루쿠론산 전이 효소 활성」이란, 당수용체 기질이 되는 플라보노이드의 3위의 수산기에, 당공여체의 UDP-글루쿠론산 의존적으로 글루쿠론산을 전이하여, 글루쿠론산 포합체를 생성하는 반응을 촉매하는 활성하는 활성을 갖는 효소, 즉 플라보노이드 3위 글루쿠론산 전이 효소(Flavonoid 3-O-glucuronic acid transferase; F3GAT) 활성을 의미한다.
UDP-글루쿠론산 전이 효소 활성은, 예를 들어, UDP-글루쿠론산과 당수용체 기질인 플라보노이드(예를 들어, 플라본, 플라보놀 등)를 평가 대상이 되는 효소의 존재하에서 반응시켜, 얻어지는 반응물을 HPLC 등으로 분석함으로써 측정할 수 있다(보다 구체적으로는, 후술하는 실시예의 기재를 참조).
또, 본 발명은, (e) 서열 번호 3의 염기 서열과 상보적인 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에서 혼성화하고, UDP-글루쿠론산 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드도 포함한다. 본 발명에서는, 상기 (e)의 폴리뉴클레오티드는, 서열 번호 3으로 표시되는 염기 서열 중의 제418∼420번째 염기(AGG)에 대응하는 염기가 동일한 「AGG」이거나 또는 동일한 염기가 아니더라도 「CGU」, 「CGC」, 「CGA」, 「CGG」 및 「AGA」 중 어느 하나인 폴리뉴클레오티드를 함유하는 것이 바람직하다. 여기서, 상기 제418∼420번째 염기(AGG)란, 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열 중의 제140번째 아미노산 잔기(아르기닌)를 코드하는 염기(코돈)이다. 이 바람직한 양태는, 상기 (i)의 폴리뉴클레오티드에서도 동일하다.
또한, 본 발명은, (f) 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드의 염기 서열과 상보적인 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에서 혼성화하고, UDP-글루쿠론산 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드도 포함한다. 또한 본 발명에서는, 상기 (f)의 폴리뉴클레오티드는, 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드의 염기 서열 중의 제418∼420번째 염기에 대응하는 염기가 동일한 염기이거나 또는 동일한 염기가 아니더라도 「CGU」, 「CGC」, 「CGA」, 「CGG」, 「AGA」 및 「AGG」 중 어느 하나인 폴리뉴클레오티드를 함유하는 것이 바람직하다. 여기서, 상기 제418∼420번째 염기란, 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열 중의 제140번째 아미노산 잔기(아르기닌)를 코드하는 염기(코돈)이다. 이 바람직한 양태는, 상기 (j)의 폴리뉴클레오티드에서도 동일하다.
본 명세서 중 「폴리뉴클레오티드」란, DNA 또는 RNA를 의미한다. 바람직하게는 DNA이다.
본 명세서 중 「엄격한 조건하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드」란, 예를 들어, 서열 번호 3의 염기 서열과 상보적인 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 또는 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드의 염기 서열과 상보적인 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의, 전부 또는 일부를 프로브로 하여, 콜로니 혼성화법, 플라크 혼성화법 또는 서던 혼성화법 등을 이용함으로써 얻어지는 폴리뉴클레오티드를 말한다. 혼성화의 방법으로는, 예를 들어 "Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor, Laboratory Press 2001", "Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997" 등에 기재되어 있는 방법을 이용할 수 있다.
본 명세서 중 「엄격한 조건」이란, 저 엄격한 조건, 중간의 엄격한 조건 및 고 엄격한 조건의 어느 것이어도 좋다. 「저 엄격한 조건」은, 예를 들어, 5×SSC, 5×덴하르트 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아미드, 32℃의 조건이다. 또, 「중간의 엄격한 조건」은, 예를 들어, 5×SSC, 5×덴하르트 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아미드, 42℃의 조건이다. 「고 엄격한 조건」은, 예를 들어, 5×SSC, 5×덴하르트 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아미드, 50℃의 조건이다. 이러한 조건에서, 온도를 높일수록 높은 상동성을 갖는 DNA가 효율적으로 얻어지는 것을 기대할 수 있다. 단, 혼성화의 엄격함에 영향을 미치는 요소로는 온도, 프로브 농도, 프로브의 길이, 이온 강도, 시간, 염농도 등 복수의 요소를 생각할 수 있고, 당업자라면 이들 요소를 적절하게 선택함으로써 동일한 엄격함을 실현하는 것이 가능하다.
또한 혼성화에 시판하는 키트를 이용하는 경우는, 예를 들어 Alkphos Direct Labelling Reagents(아마샴파마시아사 제조)를 이용할 수 있다. 이 경우는, 키트에 첨부된 프로토콜에 따라서, 표지한 프로브와의 인큐베이션을 하룻밤 행한 후, 멤브레인을 55℃의 조건하에서 0.1% (w/v) SDS를 포함하는 1차 세정 버퍼로 세정한 후, 혼성화한 DNA를 검출할 수 있다.
상기 이외에 혼성화 가능한 폴리뉴클레오티드로는, FASTA, BLAST 등의 상동성 검색 소프트웨어에 의해, 디폴트의 파라미터를 이용하여 계산했을 때, 서열 번호 3의 염기 서열의 DNA 또는 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 코드하는 DNA와, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 71% 이상, 72% 이상, 73% 이상, 74% 이상, 75% 이상, 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 79% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.1% 이상, 99.2% 이상, 99.3% 이상, 99.4% 이상, 99.5% 이상, 99.6% 이상, 99.7% 이상, 99.8% 이상 또는 99.9% 이상의 상동성을 갖는 DNA를 들 수 있다.
또한 아미노산 서열이나 염기 서열의 상동성은, Karlin 및 Altschul에 의한 알고리즘 BLAST(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 87, p. 2264-2268, 1990; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 90, p. 5873, 1993)을 이용하여 결정할 수 있다. BLAST의 알고리즘에 기초한 BLASTN나 BLASTX라고 불리는 프로그램이 개발되어 있다(Altschul SF, et al., J. Mol. Biol., vol. 215, p. 403, 1990). BLASTN을 이용하여 염기 서열을 해석하는 경우는, 파라미터는, 예를 들어 score=100, word length=12로 한다. 또, BLASTX를 이용하여 아미노산 서열을 해석하는 경우는, 파라미터는, 예를 들어 score=50, word length=3으로 한다. BLAST와 Gapped BLAST 프로그램을 이용하는 경우는, 각 프로그램의 디폴트 파라미터를 이용한다.
상기 본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 공지의 유전자 공학적 방법 또는 공지의 합성 방법으로 취득하는 것이 가능하다.
2. 본 발명의 단백질
본 발명은, 또 다른 실시형태에서, 상기 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 코드되는 단백질도 제공한다. 본 발명의 한 양태의 단백질은, 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질이다. 본 발명의 다른 양태의 단백질은, 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질이다.
본 발명의 또 다른 양태의 단백질은, 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열에서 1∼15개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, UDP-글루쿠론산 전이 효소 활성을 갖는 단백질이다. 이러한 단백질로는, 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열과 상기와 같은 상동성을 갖는 아미노산 서열을 가지며, UDP-글루쿠론산 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 들 수 있는 이러한 단백질은, "Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor, Laboratory Press 2001", "Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997", "Nuc. Acids. Res., vol. 10, p. 6487, 1982", "Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 79, p. 6409, 1982", "Gene, vol. 34, p. 315, 1985", "Nuc. Acids. Res., vol. 13, p. 4431, 1985", "Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 82, p. 488, 1985" 등에 기재된 부위 특이적 변이 도입법을 이용하여 취득할 수 있다. 상기 또 다른 양태의 단백질로는, 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열 중의 제140번째 아미노산 잔기(아르기닌)에 대응하는 아미노산 잔기가 마찬가지로 아르기닌인 아미노산 서열로 이루어진 것이 바람직하다. 즉, 상기 아미노산 잔기의 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가는, 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열 중의 제140번째 아미노산 이외의 아미노산에 관해 이루어진 것이 바람직하다.
본 발명의 단백질의 아미노산 서열에서 1 이상(예를 들어 1∼15개, 바람직하게는 10개 이하)의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가되었다는 것은, 동일 서열 중의 임의로, 1 또는 복수의 아미노산 서열 중의 위치에서, 1 또는 복수의 아미노산 잔기의 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가가 있는 것을 의미하며, 결실, 치환, 삽입 및 부가 중 2종 이상이 동시에 생겨도 좋다.
이하에, 서로 치환 가능한 아미노산 잔기의 예를 나타낸다. 동일군에 포함되는 아미노산 잔기는 서로 치환 가능하다. A군 : 류신, 이소류신, 노르류신, 발린, 노르발린, 알라닌, 2-아미노부탄산, 메티오닌, o-메틸세린, t-부틸글리신, t-부틸알라닌, 시클로헥실알라닌; B군 : 아스파라긴산, 글루타민산, 이소아스파라긴산, 이소글루타민산, 2-아미노아디프산, 2-아미노수베르산; C군 : 아스파라긴, 글루타민; D군 : 리신, 아르기닌, 오르니틴, 2,4-디아미노부탄산, 2,3-디아미노프로피온산; E군 : 프롤린, 3-히드록시프롤린, 4-히드록시프롤린; F군 : 세린, 트레오닌, 호모세린; G군 : 페닐알라닌, 티로신.
또, 본 발명의 단백질은, Fmoc법(플루오레닐메틸옥시카르보닐법), tBoc법(t-부틸옥시카르보닐법) 등의 화학 합성법으로서도 제조할 수 있다. 또, Advanced ChemTech사 제조, Perkin Elmer사 제조, Pharmacia사 제조, Protein technology Instrument사 제조, Synthecell-Vega사 제조, Perceptive사 제조, 시마즈 제작소 등의 펩티드 합성기를 이용하여 화학 합성할 수도 있다.
여기서, 본 발명의 단백질은, 플라보노이드 3위 글루쿠론산 전이 효소이다. 「글루쿠론산 전이 효소」란, 당공여체로부터 당수용체 기질에 글루쿠론산 잔기를 전이하여, 글루쿠론산 포합체를 생성하는 반응을 촉매한다. 본 발명에서, 당수용체 기질은 플라보노이드이고, 당공여체는 UDP-글루쿠론산이다. 본 발명의 한 양태의 단백질은, UDP-글루쿠론산으로부터, 당수용체 기질인 플라보노이드(예를 들어, 플라보놀, 플라본)의 3위의 수산기에 글루쿠론산 잔기를 전이하여, 글루쿠론산 포합체와 UDP를 생성하는 반응을 촉매한다.
당수용체 기질의 플라보노이드로는, 플라본, 플라보놀, 플라바논, 이소플라본, 플라본 C 배당체, 오론 및 카테킨 등을 바람직하게 들 수 있다. 그 중, 플라본으로는, 예를 들어, 바이칼레인, 스쿠텔라레인, 아피게닌, 루테올린, 트리세틴, 디오스메틴 및 크리소에리올을 들 수 있다. 플라보놀로는, 예를 들어, 케르세틴, 미리세틴, 라리시트린, 이소람네틴, 시린게틴 및 켐페롤을 들 수 있다. 플라바논으로는, 예를 들어 나린게닌을 들 수 있다. 이소플라본으로는, 예를 들어, 제니스테인, 다이제인 및 포르모노네틴을 들 수 있다. 플라본 C 배당체로는, 예를 들어, 비텍신, 이소비텍신 및 오리엔틴을 들 수 있다. 오론으로는, 예를 들어 오레우시딘을 들 수 있다. 카테킨으로는, 예를 들어, 카테킨 및 에피갈로카테킨갈레트를 들 수 있다. 본 발명에서, 당수용체 기질의 플라보노이드로는, 전술한 것 중에서도, 플라본 및 플라보놀이 보다 바람직하고, 더욱 바람직하게는 플라보놀이고, 특히 바람직하게는 케르세틴, 켄페롤 및 미리세틴이다.
3. 벡터 및 이것을 도입한 형질 전환체
본 발명은 또한, 다른 실시형태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터를 제공한다. 본 발명의 발현 벡터는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 상기 (a)∼(j) 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드)를 함유한다. 바람직하게는, 본 발명의 발현 벡터는, 상기 (g)∼(j) 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드를 함유한다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 발현 벡터는, 서열 번호 3의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 또는 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드를 함유한다.
본 발명의 벡터는, 통상 (i) 숙주 세포 내에서 전사 가능한 프로모터; (ii) 상기 프로모터에 결합한 본 발명의 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 상기 (a)∼(j) 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드); 및 (iii) RNA 분자의 전사 종결 및 폴리아데닐화에 관한 것이며, 숙주 세포 내에서 기능하는 시그널을 구성 요소로서 포함하는 발현 카세트를 포함하도록 구성된다. 이와 같이 구축되는 벡터는 숙주 세포에 도입된다. 발현 벡터의 제작 방법으로는, 플라스미드, 파지 또는 코스미드 등을 이용하는 방법을 들 수 있지만 특별히 한정되지 않는다.
벡터의 구체적인 종류는 특별히 한정되지 않고, 숙주 세포 중에서 발현 가능한 벡터가 적절하게 선택될 수 있다. 즉, 숙주 세포의 종류에 따라서, 확실하게 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 발현시키기 위해 적절한 프로모터 서열을 선택하여, 이것과 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 각종 플라스미드 등에 삽입한 벡터를 발현 벡터로서 이용하면 된다.
본 발명의 발현 벡터는, 도입되어야 할 숙주의 종류에 의존하여, 발현 제어 영역(예를 들어, 프로모터, 터미네이터 및/또는 복제 기점 등)을 함유한다. 세균용 발현 벡터의 프로모터로는, 관용적인 프로모터(예를 들어, trc 프로모터, tac 프로모터, lac 프로모터 등)가 사용되고, 효모용 프로모터로는, 예를 들어, 글리세르알데히드 3 인산디히드로게나아제 프로모터, PH05 프로모터 등을 들 수 있고, 사상균용 프로모터로는, 예를 들어, 아밀라아제, trpC 등을 들 수 있다. 또 동물 세포 숙주용 프로모터로는, 바이러스성 프로모터(예를 들어, SV40 초기 프로모터, SV40 후기 프로모터 등)를 들 수 있다.
발현 벡터는, 하나 이상의 선택 마커를 포함하는 것이 바람직하다. 이러한 마커로는, 영양 요구성 마커(ura5, niaD), 약제 내성 마커(하이그로마이신, 제오신, 제네티신), 구리 내성 유전자(CUP1)(Marin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 81, p. 337, 1984), 세룰레닌 내성 유전자(fas2miri, PDR4)(각각 이노코시 쥰지 등, 생화학, vol. 64, p. 660, 1992; Hussain et al., Gene, vol. 101, p. 149, 1991) 등을 이용할 수 있다.
또, 본 발명은, 본 발명의 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 상기 (a)∼(j) 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드)가 도입된 형질 전환체를 제공한다.
형질 전환체의 제작 방법(생산 방법)은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 전술한 재조합 벡터를 숙주에 도입하여 형질 전환하는 방법을 들 수 있다. 여기서 이용되는 숙주 세포는, 특별히 한정되지 않고, 종래 공지의 각종 세포를 바람직하게 이용할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들어, 대장균(Escherichia coli) 등의 세균, 효모(출아 효모 Saccharomyces cerevisiae, 분열 효모 Schizosaccharomyces pombe), 선충(Caenorhabditis elegans), 아프리카 발톱개구리(Xenopus laevis)의 난모 세포 등을 들 수 있다. 상기 숙주 세포를 위한 적절한 배양 배지 및 조건은 당분야에서 주지되어 있다. 또, 형질 전환의 대상이 되는 생물도 특별히 한정되지 않고, 상기 숙주 세포에서 예시한 각종 미생물, 식물 또는 동물을 들 수 있다.
숙주 세포의 형질 전환 방법으로는 일반적으로 이용되는 공지의 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 일렉트로포레이션법(Mackenxie D. A. et al., Appl. Environ. Microbiol., vol. 66, p. 4655-4661, 2000), 파티클 딜리버리법(일본 특허 공개 제2005-287403 「지질 생산균의 육종 방법」에 기재된 방법), 스페로플라스트법(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 75, p. 1929, 1978), 아세트산리튬법(J. Bacteriology, vol. 153, p. 163, 1983), Methods in yeast genetics, 2000 Edition : A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual 등에 기재된 방법)으로 실시할 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 양태에서, 형질 전환체는 식물 형질 전환체일 수 있다. 본 실시형태에 따른 식물 형질 전환체는, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를, 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 코드되는 폴리펩티드가 발현될 수 있도록 식물 중에 도입함으로써 취득된다.
재조합 발현 벡터를 이용하는 경우, 식물체의 형질 전환에 이용되는 재조합 발현 벡터는, 상기 식물 내에서 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 것이 가능한 벡터라면 특별히 한정되지 않는다. 이러한 벡터로는, 예를 들어, 식물 세포 내에서 폴리뉴클레오티드를 구성적으로 발현시키는 프로모터(예를 들어, 컬리플라워 모자이크 바이러스의 35S 프로모터)를 갖는 벡터 또는 외적인 자극에 의해 유도성으로 활성화되는 프로모터를 갖는 벡터를 들 수 있다.
본 발명에서 형질 전환의 대상이 되는 식물은, 식물체 전체, 식물 기관(예를 들어 잎, 꽃잎, 줄기, 뿌리, 종자 등), 식물 조직(예를 들어 표피, 사부(師部), 유조직(柔組織), 목부(木部), 유관속(維管束), 책상 조직(柵狀組織), 해면상 조직 등) 또는 식물 배양 세포, 또는 여러가지 형태의 식물 세포(예를 들어 현탁 배양 세포), 프로토플라스트, 잎의 절편, 칼루스 등을 모두 의미한다. 형질 전환에 이용되는 식물로는, 특별히 한정되지 않고, 단자옆 식물망 또는 쌍자엽 식물망에 속하는 식물의 어느 것이어도 좋다.
식물로의 유전자의 도입에는, 당업자에게 공지인 형질 전환 방법(예를 들어, 아그로박테리움법, 유전자총, PEG법, 일렉트로포레이션법 등)이 이용된다. 예를 들어, 아그로박테리움을 통한 방법과 직접 식물 세포에 도입하는 방법이 주지되어 있다. 아그로박테리움법을 이용하는 경우는, 구축한 식물용 발현 벡터를 적당한 아그로박테리움(예를 들어, 아그로박테리움ㆍ투메파키엔스(Agrobacterium tumefaciens))에 도입하고, 이 주를 리프 디스크법(우치미야 히로후미 저, 식물 유전자 조작 매뉴얼(1990) 27∼31 페이지, 고단샤 사이엔티픽, 도쿄) 등에 따라서 무균 배양엽편에 감염시켜, 형질 전환 식물을 얻을 수 있다. 또, Nagel 등의 방법(Micribiol. Lett., 67, 325 (1990))이 이용될 수 있다. 이 방법은, 우선, 예를 들어 발현 벡터를 아그로박테리움에 도입하고, 이어서, 형질 전환된 아그로박테리움을 PlantMolecular Biology Manual(S.B.Gelvin 등, Academic Press Publishers)에 기재된 방법으로 식물 세포 또는 식물 조직에 도입하는 방법이다. 여기서, 「식물 조직」이란, 식물 세포의 배양에 의해 얻어지는 칼루스를 포함한다. 아그로박테리움법을 이용하여 형질 전환을 행하는 경우에는, 바이너리 벡터(pBI121 또는 pPZP202 등)를 사용할 수 있다.
또, 유전자를 직접 식물 세포 또는 식물 조직에 도입하는 방법으로는, 일렉트로포레이션법, 유전자총법이 알려져 있다. 유전자총을 이용하는 경우는, 식물체, 식물 기관, 식물 조직 자체를 그대로 사용해도 좋고, 절편을 조제한 후에 사용해도 좋고, 프로토플라스트를 조제하여 사용해도 좋다. 이와 같이 조제한 시료를 유전자 도입 장치(예를 들어 PDS-1000(BIO-RAD사) 등)를 이용하여 처리할 수 있다. 처리 조건은 식물 또는 시료에 따라 다르지만, 통상은 450∼2000 psi 정도의 압력, 4∼12 cm 정도의 거리에서 행한다.
유전자가 도입된 세포 또는 식물 조직은, 우선 하이그로마이신 내성 등의 약제 내성에서 선택되고, 이어서 정법에 의해 식물체에 재생된다. 형질 전환 세포로부터 식물체의 재생은, 식물 세포의 종류에 따라서 당업자에 공지인 방법으로 행하는 것이 가능하다.
식물 배양 세포를 숙주로서 이용하는 경우는, 형질 전환은, 재조합 벡터를 유전자총, 일렉트로포레이션법 등으로 배양 세포에 도입한다. 형질 전환의 결과 얻어지는 칼루스나 슈트, 모상근 등은, 그대로 세포 배양, 조직 배양 또는 기관 배양에 이용하는 것이 가능하고, 또 종래 알려져 있는 식물 조직 배양법을 이용하여, 적당한 농도의 식물 호르몬(옥신, 사이토카이닌, 지베렐린, 아브시신산, 에틸렌, 브라시놀라이드 등)의 투여 등에 의해 식물체에 재생시킬 수 있다.
유전자가 식물에 도입되었는지의 여부의 확인은, PCR법, 서던 혼성화법, 노던 혼성화법 등으로 행할 수 있다. 예를 들어, 형질 전환 식물로부터 DNA를 조제하고, DNA 특이적 프라이머를 설계하여 PCR을 행한다. PCR은, 상기 플라스미드를 조제하기 위해 사용한 조건과 동일한 조건으로 행할 수 있다. 그 후에는, 증폭 산물에 관해 아가로스겔 전기 영동, 폴리아크릴아미드겔 전기 영동 또는 모세관 전기 영동 등을 행하여, 브롬화 에티듐, SYBR Green액 등에 의해 염색하고, 그리고 증폭 산물을 1개의 밴드로서 검출함으로써, 형질 전환된 것을 확인할 수 있다. 또, 미리 형광 색소 등에 의해 표지한 프라이머를 이용하여 PCR을 행하여, 증폭 산물을 검출할 수도 있다. 또한, 마이크로플레이트 등의 고상에 증폭 산물을 결합시켜, 형광 또는 효소 반응 등에 의해 증폭 산물을 확인하는 방법도 채용할 수 있다.
본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드가 게놈 내에 삽입된 형질 전환 식물체가 일단 취득되면, 상기 식물체의 유성 생식 또는 무성 생식에 의해 자손을 얻을 수 있다. 또, 상기 식물체 또는 그의 자손, 또는 이들의 클론으로부터, 예를 들어, 종자, 과실, 절수(切穗), 괴경, 괴근, 주(株), 칼루스, 프로토플라스트 등을 얻어, 이들을 기초로 상기 식물체를 양산할 수 있다. 따라서, 본 발명에는, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드가 발현 가능하게 도입된 식물체, 또는 상기 식물체와 동일한 성질을 갖는 상기 식물체의 자손, 또는 이들 유래의 조직도 포함된다.
또, 여러가지 식물에 대한 형질 전환 방법이 이미 보고되어 있다. 본 발명에 따른 형질 전환체 식물로는, 예를 들어, 포도, 참깨, 벼, 담배, 대맥, 밀, 유채씨, 감자, 토마토, 포플라, 바나나, 유칼리, 고구마, 대두, 알팔파, 루핀, 옥수수, 컬리플라워, 장미, 국화, 카네이션, 금어초, 시클라멘, 난, 리샨샤스, 프리지어, 거베라, 글라디오러스, 안개꽃, 칼랑코에, 백합, 페랄고늄, 제라늄, 페튜니아, 토레니아, 튤립, 개나리, 애기장대 및 벌노랑이 등을 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.
본 발명의 한 양태에 의하면, 형질 전환 식물체는 기능성 식품 재료용 식물체이다.
4. 본 발명의 단백질의 제조 방법
본 발명은 또한, 다른 실시형태에서, 상기 형질 전환체를 이용하는 본 발명의 단백질의 제조 방법을 제공한다.
구체적으로는, 상기 형질 전환체의 배양물로부터, 본 발명의 단백질을 분리ㆍ정제함으로써, 본 발명의 단백질을 얻을 수 있다. 여기서, 배양물이란, 배양액, 배양 균체 또는 배양 세포, 또는 배양 균체 또는 배양 세포의 파쇄물을 모두 의미한다. 본 발명의 단백질의 분리ㆍ정제는, 통상의 방법에 따라서 행할 수 있다.
구체적으로는, 본 발명의 단백질이 배양 균체 내 또는 배양 세포 내에 축적되는 경우에는, 배양후, 통상의 방법(예를 들어, 초음파, 리소자임, 동결 융해 등)으로 균체 또는 세포를 파쇄한 후, 통상의 방법(예를 들어, 원심 분리, 여과 등)으로 본 발명의 단백질의 조추출액을 얻을 수 있다. 본 발명의 단백질이 배양액 중에 축적되는 경우에는, 배양 종료후, 통상의 방법(예를 들어, 원심 분리, 여과 등)으로 균체 또는 세포와 배양 상청을 분리함으로써, 본 발명의 단백질을 포함하는 배양 상청을 얻을 수 있다.
이와 같이 하여 얻어진 추출액 또는 배양 상청 중에 포함되는 본 발명의 단백질의 정제는, 통상의 분리ㆍ정제 방법에 따라서 행할 수 있다. 분리ㆍ정제 방법으로는, 예를 들어, 황산암모늄 침전, 겔여과 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피, 역상 고속 액체 크로마토그래피, 투석법 및 초여과법 등을, 단독으로 또는 적절하게 조합하여 이용할 수 있다.
5. 글루쿠론산 포합체의 제조 방법
또한, 본 발명은, 본 발명의 단백질을 이용하여 글루쿠론산 포합체를 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명의 단백질은, 당수용체 기질로서의 플라보노이드에, 당공여체로서의 UDP-글루쿠론산으로부터 글루쿠론산을 전이하는(상세하게는, 플라보노이드의 3위의 수산기에 전이한다) 반응을 촉매하기 때문에, 본 발명의 단백질을 이용함으로써, 당수용체 기질 및 당공여체를 원료로서, 글루쿠론산 포합체를 제조할 수 있다. 당수용체 기질로는, 플라보노이드 중에서도, 플라본 및 플라보놀이 바람직하고, 보다 바람직하게는 플라보놀, 특히 바람직하게는 케르세틴, 켄페롤 및 미리세틴이다.
예를 들어, 1 mM의 당수용체 기질, 2 mM의 당공여체, 50 mM의 인산칼슘 버퍼(pH 7.5) 및 20 μM의 본 발명의 단백질을 포함하는 용액을 조제하여, 30℃에서 30 분간 반응시킴으로써, 글루쿠론산 포합체를 제조할 수 있다. 이 용액으로부터, 글루쿠론산 포합체는, 공지의 방법으로 분리ㆍ정제할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들어, 황산암모늄 침전, 겔여과 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피, 역상 고속 액체 크로마토그래피, 투석법 및 초여과법 등을, 단독으로 또는 적절하게 조합하여 이용할 수 있다.
이와 같이 하여 얻어지는 글루쿠론산 포합체는, 기능성 식품의 재료, 그 생체 내에서의 기능을 조사하기 위한 시약, 또는 항산화제 등으로서 유용하다(Gao, Z., Huang, K., Yang, X., and Xu, H., Biochimica et Biophysica Acta, vol. 1472, p. 643-650, 1999).
이하에, 실시예를 들어 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들에 한정되지 않는다.
실시예 1
유전자 클로닝
본 실시예에서 이용하는 분자생물학적 방법은, 다른 곳에서 언급하지 않는 한 Molecular Cloning(Sambrookra, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 2001)에 기재된 방법에 따랐다.
포도 유래 플라보노이드 3위 글루코스 전이 효소 유전자인 VvGT1(Offen, W. et al., EMBO J., vol. 25, p. 1396-1405, 2006)의 완전 길이 서열을 기초로, Istituto Agrario San Michele all'Adige(IASMA)가 제공하는 포도 게놈 데이터베이스(http://genomics.research.iasma.it/iasma/)에 대하여 Blast 호몰로지 검색을 했다. 그 결과, 상동성이 높은 7종의 후보 UGT 유전자를 발견했다(도 1). 이들은 MEGA4 프로그램(Tamura, K. et al., Mol. Biol. Evol., vol. 24, p. 1596-1599, 2007)을 이용한 NJ 계통수 해석에 의해 플라보노이드 3위 UGT의 클러스터인 Cluster I에 속하는 것을 확인했다(도 1). 또한, 후보 유전자 서열을 염색체 물리 지도와 대조함으로써, 염색체 상의 신터니를 밝혔다(도 2). VvGT3, VvGT5 및 VvGT6은, 11번 염색체 상에 동일한 전사 방향으로 좌위하고 있고, 이들간에는 플라보놀술포트랜스퍼라아제 유사 유전자가 공통적으로 발견되었다(Varin, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 89, p. 1286-1290, 1992). VvGT5 및 VvGT6은, 특히 상동성이 높아, 유전자 중복에 의해 생긴 파랄로그라고 생각되었다. 또, 6번 염색체에는 동일한 전사 방향으로 좌위한 VvGT2 및 VvGT4가 발견되었다. 그 하류에 동일한 전사 방향으로 VvGT2 및 VvGT4의 셋트의 카피가 발견되어, 각각 순서대로 VvGT2-유사 및 VvGT4-유사로 명명했다. 한편, 기지의 VvGT1은 16번 염색체에 좌위했다.
다음으로, 이들 VvGT 유전자를 클론화하기 위해 포도잎 유래 cDNA를 하기 방법으로 조제하고, 그것을 주형으로 PCR에 의한 증폭을 행했다. 포도(Vitis vinifera, 품종 : Cabernet Sauvignon)의 잎 0.1 g으로부터 FruitMate for RNA purification 및 Fast Pure RNA kit(TaKaRa Bio사)를 이용하여, 제조업자가 장려하는 방법에 따라서 총 RNA를 추출하고, SuperScript First-Strand Synthesis System for RT-PCR(Invitrogen사)을 제조업자가 장려하는 조건에 따라서 사용하여, 총 RNA 1 ㎍으로부터 cDNA를 합성했다.
VvGT5 유전자를 예로, cDNA 클로닝 및 발현 벡터 구축 순서를 하기에 나타낸다. 역전사에 의해 얻어진 cDNA를 주형으로, 게놈 서열 정보(GenBank 액세션 번호 : CAN74919)를 기초로 디자인한 하기 VvGT5 유전자 특이적 프라이머(서열 번호 1 및 2)를 이용하여, PCR에 의한 VvGT5의 단리를 시도했다.
구체적으로는, PCR 반응액(50 ㎕)은, 포도잎 유래 cDNA 1 ㎕, 1×ExTaq buffer(TaKaRaBio), 0.2 mM dNTPs, 프라이머(서열 번호 1 및 2) 각 0.4 pmol/㎕, ExTaq polymerase 2.5unit으로 이루어진다. PCR 반응은, 94℃에서 3 분간 반응시킨 후, 94℃에서 1 분간, 50℃에서 1 분간, 72℃에서 2 분간의 반응을 1 사이클로 하여, 총 35 사이클의 증폭 반응을 행했다.
CACC-NdeI-VvGT5-Fw :
5'-CAC CCA TAT GAC TAC CAC CGC CAG CTC CAT-3'(서열 번호 1)
BgIII-VvGT5-RV :
5'-AGA TCT CTA CTT ATT GGT GTC CAA AGG TA-3'(서열 번호 2)
PCR 반응액을 0.8% 아가로스겔 전기 영동에 의해 분리한 결과, 약 1.4 kb의 사이즈의 증폭 단편을 얻었다. 이 증폭 단편을 pENTR-Directional-TOPO 벡터(Invitrogen사)에 서브 클로닝하고, 삽입 단편의 염기 서열을, DNA Sequencer model 3100(Applied Biosystems사)을 사용하여, 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하는 프라이머 워킹법으로 염기 서열을 결정하여, 삽입된 cDNA가 VvGT5인 것을 확인했다(서열 번호 3 및 4). 또 이 서열은, 데이터베이스에 등록되어 있는 피노누아 품종 유래의 서열(GenBank 액세션 번호 : CAN74919)과 아미노산 서열 레벨에서 99%의 서열 동일성을 나타냈다. 이 차이는 포도 품종간에서의 다형이라고 생각되었다.
VvGT5의 cDNA 서열 :
Figure pct00001
VvGT5의 아미노산 서열 :
Figure pct00002
Figure pct00003
프라이머 내의 NdeI 및 BgIII의 제한 효소 부위를 이용하여 약 1.4 kb의 VvGT5 단편을 잘라내고, 대장균 발현 벡터인 pET15b의 NdeI 및 BamHI 사이트로 연결하여, VvGT5의 대장균 발현 벡터를 얻었다. 대장균 벡터 구축시에는, 본 벡터의 NdeI 사이트 상류에 있는 His 태그와 VvGT5의 오픈리딩 프레임을 맞추도록 하여, His 태그와 융합한 키메라 VvGT5 단백질이 발현되도록 설계했다.
실시예 2
효소 기능 해석
본 효소의 생화학적인 기능을 밝히기 위해, 본 효소를 대장균에서 발현시켰다.
상기에서 얻어진 플라스미드를 이용하여 정법에 따라서 대장균 BL21(DE3)주를 형질 전환했다. 얻어진 형질 전환체를, 50 ㎍/㎖의 암피실린을 포함하는 LB 배지(10 g/ℓ typtone pepton, 5 g/ℓ yeast extract, 1 g/ℓ NaCl) 4 ㎖, 37℃에서 하룻밤 진탕 배양했다. 정지기에 도달한 배양액 4 ㎖를 동일한 조성의 배지 80 ㎖에 접종하여, 37℃에서 진탕 배양했다. 균체 탁도(OD600)가 대략 0.5에 도달한 시점에서 최종 농도 0.5 mM의 IPTG를 첨가하여, 18℃에서 20 시간 진탕 배양했다.
이하의 모든 조작은 4℃에서 행했다. 배양한 형질 전환체를 원심 분리(5,000×g, 10 분)로 집균하고, Buffer S[20 mM HEPES 버퍼(pH 7.5), 20 mM 이미다졸, 14 mM β-머캅토에탄올] 1 ㎖/g cell을 첨가하여 현탁했다. 계속해서, 초음파 파쇄(15 초간×8 회)를 행하여, 원심 분리(15,000×g, 15 분간)했다. 얻어진 상청을 조효소액으로서 회수했다. 이 중에서 His 태그를 갖는 VvGT5 발현 단백질을 정제하기 위해, 조효소액을 Buffer S로 평형화한 His SpinTrap(GE Healthcare)에 부하하여 원심(70×g, 30 초간)했다. Buffer로 세정후, 100 및 500 mM 이미다졸을 포함하는 Buffer S 각 5 ㎖로 컬럼에 결합한 단백질을 단계적으로 용출했다. 각 용출 분획을 Microcon YM-30(Amicon)을 이용하여, 20 mM HEPES 버퍼(pH 7.5) 및 14 mM β-머캅토에탄올에 버퍼 치환했다(투석 배율 1000배).
SDS-PAGE 해석의 결과, 500 mM 이미다졸 용출 분획에서, VvGT5의 추정 분자량 49.68 kDa 부근에 단백질을 확인했기 때문에, 이 분획을 효소 해석에 이용했다(도 3).
표준 효소 반응 조건은 이하와 같다. 반응액(1 mM 당공여체, 200 μM 당수용체 기질, 20 mM HEPES 버퍼(pH 7.5), 정제 효소 약 2 ㎍) 50 ㎕를 조제하고, 효소 용액을 첨가함으로써 반응을 시작하여, 30℃에서 하룻밤 반응시켰다. 20% 인산을 5 ㎕ 첨가함으로써 반응을 정지시키고, 역상 HPLC로 분석했다.
역상 HPLC 시스템은 이하의 기기로 구성된다. Pump A로서 MODEL305(Gilson사), Pump B로서 MODEL302(Gilson사), Sample Injector로서 MODEL231(Gilson사), Dilutor로서 401(Gilson사), DYNAMIC MIXER로서 811B(Gilson사), Pressure Module(RAININ), DEGASSER로서 DGU-12A(시마즈제작소), 검출기로서 SPD-M20A DIODE ARRAY DETECTOR(시마즈제작소)를 이용했다.
플라보놀류의 HPLC 조건은 이하와 같다. 컬럼은, J'sphere ODS-M80(4.6×150 mm, YMC)을 실온에서 이용하고, 이동상 A(0.2% 포름산/10% CH3CN)와 이동상 B(0.2% 포름산/90% CH3CN)를 이용했다. 용리 조건은 B10%로 3 분간의 평형화를 하고, 10 분간의 직선 농도 구배(B10%→B40%), 그리고 10 분간의 직선 농도 구배(B40%→B90%)후, 1 분간 B90%로 유지했다. 그 후 다시 B10%로 되돌려 10 분간 평형화했다. 유속은 0.7 ㎖/분으로 행했다. 검출은, SPD-M20A DIODE ARRAY DETECTOR를 이용하여 360 nm에서 행했다. 본 조건에서 표준품의 케르세틴, 케르세틴 3-글루쿠로나이드, 켄페롤 및 이소람네틴은, 각각 순서대로 유지 시간 약 17.8 분, 11.8 분, 20.1 분 및 20.4 분에 용출된다. 케르세틴 3-글루쿠로나이드는, 포도잎으로부터 후술하는 참고예 1에 기재된 방법으로 조제한 것을 사용했다.
케르세틴을 당수용체, UDP-글루쿠론산을 당공여체로 한 효소 반응액의 HPLC 분석의 결과, 케르세틴 3-글루쿠로나이드와 유지 시간이 일치하는 유지 시간 약 11.8 분에 새로운 생성물이 확인되었다(도 4). 이것에 의해 VvGT5 유전자가 플라보노이드의 3위에 글루쿠론산을 전이하는 활성을 갖는 F3GAT를 코드하는 것이 나타났다.
다음으로, 본 효소의 지적 pH를 구했다. 도 5에 나타낸 바와 같이 pH 3부터 pH 10.5까지의 각종 버퍼를 조제하여, 당수용체로서 100 μM 케르세틴, 당공여체로서 1 mM UDP-글루쿠론산, 50 mM 버퍼, 14 mM 2-머캅토에탄올 및 상기 정제 VvGT5 효소 50 ng를 30℃에서 5 분간 반응시켰다. 케르세틴을 첨가함으로써 반응을 시작하고, 등량의 0.1% TFA를 포함하는 40% 아세토니트릴 용액을 첨가함으로써 반응을 정지했다. 반응 정지 용액을 원심 분리(15000 rpm, 2 분간, 4℃)함으로써 얻어진 상청 100 ㎕를 HPLC 분석에 이용하여, 각 버퍼 조건에서의 생성물량을 비교했다. 그 결과, 중성 내지 염기성 영역에서 강한 효소 활성이 보이고, 그 최적 pH는 9.1이었다(도 6).
다음으로, 본 효소의 지적 온도를 구했다. 당수용체로서 100 μM 케르세틴, 당공여체로서 1 mM UDP-글루쿠론산, 50 mM Glycine-NaOH(pH 9.5) 버퍼, 14 mM 2-머캅토에탄올 및 상기 정제 VvGT5 효소 50 ng를, 10, 20, 30, 35, 40, 45, 50 및 60℃에서 각각 15 분간 반응시켰다. 케르세틴을 첨가함으로써 반응을 시작하고, 등량의 0.1% TFA를 포함하는 40% 아세토니트릴 용액을 첨가함으로써 반응을 정지했다. 반응 정지 용액을 원심 분리(15000 rpm, 2 분간, 4℃)함으로써 얻어진 상청 100 ㎕를 HPLC 분석에 이용하여, 각 온도 조건에서의 생성물량을 비교했다. 그 결과, 최적 반응 온도는 45℃였다(도 7).
다음으로, 본 효소의 당수용체 특이성에 관해 검토했다. 도 8에 나타낸 각 당수용체 100 μM, 당공여체로서 1 mM UDP-글루쿠론산, 50 mM Glycine-NaOH(pH 9.5) 버퍼, 14 mM 2-머캅토에탄올 및 상기 정제 VvGT5 효소 50 ng를, 30℃에서 15 분간 반응시켰다. 당수용체를 첨가함으로써 반응을 시작하고, 등량의 0.1% TFA를 포함하는 40% 아세토니트릴 용액을 첨가함으로써 반응을 정지했다. 반응 정지 용액을 원심 분리(15000 rpm, 2 분, 4℃)함으로써 얻어진 상청 100 ㎕를 HPLC 분석에 이용하여, 각 당수용체에서의 생성물량을 비교했다.
안토시아닌류에 관해서는 상기 HPLC 시스템을 이용하여, 하기의 조건으로 분석을 했다. 또, 안토시안 분석용 HPLC 조건은 이하와 같다. 컬럼은 Asahipak ODP-50 4E(4.6×250 mm, 쇼와덴꼬)를 실온에서 이용하고, 이동상 A(0.5% TFA/H2O)와 이동상 B(0.5% TFA/50% CH3CN)를 이용했다. 용리 조건은 B30%에 의한 3 분간의 평형화후에, 15 분간의 직선 농도 구배(B30%→B65%), 그리고 1 분간의 직선 농도 구배(B65%→B100%)후, 다시 5 분간 B100%로 유지했다. 그 후 다시 B30%로 되돌려 10 분간 평형화했다. 유속은 0.7 ㎖/분으로 행했다. 검출은 520 nm에서 행했다. 본 조건에서 표준품의 페라고니딘, 시아니딘 및 델피니딘은, 각각 순서대로, 유지 시간 약 25.7 분, 23.9 분 및 20.8 분에 용출된다.
분석의 결과, VvGT5는 플라보놀에 특이적인 것이 명확해졌다. 그 중에서도 케르세틴에 대하여 가장 높은 활성을 갖고 있고(도 8), 이것은 포도잎에 축적되어 있는 주(主) 플라보놀 글루쿠로나이드가 케르세틴 3-글루쿠로나이드인 것과 일치한다. 또한 통상법에 따라서, 본 효소의 속도론 해석을 행한 결과, 케르세틴, 켄페롤 및 이소람네틴에 대한 기질 특이성(Km)은, 각각 순서대로, 5.60±1.76 μM, 10.8±0.4 μM 및 7.92±0.32 μM이고, 촉매 활성(kcat)은, 각각 순서대로, 7.16±0.37 s-1, 6.05±0.05 s-1 및 0.413±0.03 s- 1였다. 이와 같이, 속도론 파라미터로부터도 VvGT5가 케르세틴에 대하여 가장 높은 활성을 갖고 있는 것이 확인되었다.
다음으로, 본 효소의 당공여체 특이성에 관해 검토했다. 각 당수용체로서 100 μM 케르세틴, 1 mM 각 당공여체(UDP-글루쿠론산, UDP-글루코스 또는 UDP-갈락토오스; 모두 SIGMA로부터 구입), 50 mM Glycine-NaOH(pH 9.5) 버퍼, 14 mM 2-머캅토에탄올 및 상기 정제 VvGT5 효소 50 ng를, 30℃에서 15 분간 반응시켰다. 당수용체를 첨가함으로써 반응을 시작하고, 등량의 0.1% TFA를 포함하는 40% 아세토니트릴 용액을 첨가함으로써 반응을 정지했다. 반응 정지 용액을 원심 분리(15000 rpm, 2 분, 4℃)함으로써 얻어진 상청 100 ㎕를 HPLC 분석에 이용하여, 각 당공여체에서의 생성물량을 비교했다. 그 결과, UDP-글루쿠론산을 기질로 한 경우에만 생성물이 얻어지고, UDP-글루쿠론산에 대한 기질 특이성(Km)은 17.7±2.9였다. 이러한 점에서, VvGT5는 UDP-글루쿠론산에 대하여 특이적이고, UDP-글루쿠론산 의존적 플라보놀 3위 글루쿠론산 전이 효소(F3GAT)인 것이 분명해졌다.
〔참고예 1〕
<포도로부터의 플라보노이드의 추출과 정제>
포도잎(카베르네 쇼비뇽 품종) 164 g을 액체 질소 중에서 분쇄하고, 1.5 L의 60% CH3CN 및 0.05% HCOOH에 하룻밤 침지하여 세라이트 여과했다. 여과액을 체적이 1/3 정도가 될 때까지 감압 농축하고, 농축액을 600 ㎖의 CHP-20P에 부하하여, 600 ㎖의 물로 세정후, 20, 30, 40% CH3CN/H2O 각 300 ㎖×2로 스텝와이즈 용출을 행했다. 20%-2분획으로부터 폴리페놀류의 용출이 확인되었다. 20%-2로부터 40%-1까지의 각 분획에 관해 농축 및 동결 건조를 행하여 HPLC로 분석했다. 수량은 20%-2(568.6 ㎎), 30%-1(345.8 ㎎), 30%-2(787.0 ㎎), 40%-1(181.2 ㎎)였다.
플라보놀 배당체가 고순도로 포함되어 있던 30%-1 분획 및 30%-2 분획을, 하기의 2단계의 분취 HPLC 조건으로 정제했다.
<분취 HPLC 조건 1>
컬럼 : Develosil ODS-HG-15/30, φ50 mm×500 mm
이동상 : A-0.05% TFA, B-0.05% TFA/90% CH3CN
유속 : 32 ㎖/분
구배 : B10iso(15 분간), B15→B40%(100 분간), B40%iso(30 분간)
검출 : A350nm
용출 시간 103∼104 분 부근에 플라보놀 배당체가 확인되고, 이 분획에 관해 농축 및 동결 건조를 행하여 29.3 ㎎을 얻었다.
다음으로, 이 분획에 관해 하기 분취 HPLC 조건 2로 재분리를 행했다.
<분취 HPLC 조건 2>
컬럼 : YMC-Pack Polymer C18, φ20 mm×300 mm
이동상 : A-0.05% TFA, B-0.05% TFA/90% CH3CN
유속 : 6 ㎖/분
구배 : B30iso(20 분간), B30→B50%(60 분간), B50% iso(10 분간)
검출 : A350nm
본 조건하에서 31.01 분과 34.03 분에 용출되는 플라보놀 배당체의 흡수를 갖는 피크 A와 피크 B가 확인되고, 각각 피크의 분획에 관해 농축 및 동결 건조를 행하여, 피크 A의 분획으로부터 6.5 ㎎, 피크 B의 분획으로부터 16.1 ㎎을 얻었다. 피크 A는, 표품의 케르세틴 3-글루코시드와 유지 시간이 일치했다. 한편, 피크 B에 관해서는, 이하와 같이 NMR에 의한 구조 결정을 행했다.
<질량 분석(MS) 및 NMR에 의한 각 피크의 확인 등>
MS는, Q-TOF Premier(Micromass사 제조, UK)에서 이온원에 Z 스프레이 이온 소스를 붙인 ESI를 이용하여, 네거티브, V 모드로 측정했다. Collision energy : 45 eV, Ionspray voltage : 3 KV, 록스프레이에 의한 질량 보정을 행하고, 레퍼런스로는 로이신엔케팔린(m/z 554.2777 [M-H]-)을 이용했다. 그 결과, 피크 B는, m/z 477.0664 [M-H]-의 분자 이온이 부여되고, 분자식 C21H17O13(err. : -1.0 ppm)였다. 또, 동일한 조건으로 측정한 피크 A는, m/z 463.0878 [M-H]-의 분자 이온이 부여되고, 분자식 C21H19O11(err. : 0.2 ppm)이고, 전술한 바와 같이 표품의 케르세틴 3-글루코시드와 일치했다는 점에서, 케르세틴 3-글루코시드로 확인되었다.
피크 B의 NMR은, (CD3)2SO (DMSO-d6)에 용해하고, DMSO-d6의 1H의 2.50 ppm과 13C의 잔존 피크 δ39.43를 내부 표준으로 했다. 측정 항목은, 1H NMR, 13C NMR, 1H {13C} -HSQC, 1H {13C} -HMBC, TOCSY 및 DQF-COSY를 DMX-500 spectrometer(BRUKER BIOSPIN, Germany)로 측정했다.
상기 MS 및 NMR의 결과, 피크 B는 케르세틴의 글루쿠로나이드고, 1H {13C} -HMBC에서 글루쿠로나이드의 1위의 프로톤으로부터의 케르세틴의 3위(δ132.95)의 탄소로의 피크가 확인되었기 때문에, 글루쿠론산은 3위에 결합하고 있는 것이 밝혀져, 이 화합물은 케르세틴 3-O-글루쿠로나이드인 것이 확인되었다(도 9; 도 9 중의 굵은 선은 HMBC를 나타낸다). 따라서, 이 화합물을 케르세틴 3-O-글루쿠로나이드의 표품으로서 이용했다.
실시예 3
유전자 발현 해석
VvGT5의 기능 영역을 확인하기 위해, "Noguchi, A. et al., Plant J., vol. 54, p. 415-427, 2008"에 기재된 방법과 동일한 방법으로, VvGT5 유전자의 포도 기관별 유전자 발현 패턴을 7500 Real Time PCR System(Applied Biosystems)을 이용한 SYBR-Green 정량 RT-PCR에 의해 해석했다.
포도는, 피노누아 품종 및 카베르네 쇼비뇽 품종의 각 기관(잎, 엽병, 종자, 과실, 과피)으로부터, 실시예 1과 동일한 방법으로 토탈 RNA를 추출하고, 그 중 0.5 ㎍을 Random Hexamer 프라이머로 역전사(RT) 반응함으로써 각 기관의 cDNA를 얻어, 이것을 PCR의 주형으로 했다.
정량 PCR에 이용하는 유전자 특이적 프라이머는, Primer Express 3.0 프로그램(Applied Biosystems)을 이용하여 이하의 8종을 디자인했다. VvGT5 특이적 프라이머로서 서열 번호 5 및 6에 표시되는 것을 이용했다. 비교 대조로서의 안토시아닌 3위 글루코스 전이 효소인 VvGT1 및 VvGT5 호모로그인 VvGT6에 관해서도, 각각 특이적 프라이머를 설계하여 해석에 이용했다(VvGT1 특이적 프라이머 : 서열 번호 7 및 8, VvGT6 특이적 프라이머 : 서열 번호 9 및 10). 내부 표준 유전자로서, 포도의 유비키틴 신장 효소(GenBank 액세션 번호 : CAO48597)를 채용하고, 하기 유전자 특이적 프라이머(서열 번호 11 및 12)를 이용하여 증폭시켰다. 각 VvGT 유전자의 발현량을 내부 표준 유전자의 발현량으로 표준화하고, ΔΔCt법(Applied Biosystems)으로 상대 발현량을 얻었다.
Figure pct00004
Figure pct00005
그 결과, VvGT5 유전자는, 그 생성물이 축적되는 잎에서 현저하게 발현하고 있는 것이 확인되었다(도 10). 한편, VvGT1 유전자에 관해서는, 과피에서 특이적으로 발현하고 있고, 공지 문헌(Ford, C. M., et al., J. Biol. Chem., vol. 273, p. 9224-9233, 1998)에 기재된 결과와 일치했다. 흥미롭게도, VvGT5 유전자는 과피에서도 강한 발현이 확인되었다. VvGT6 유전자에 관해서는, VvGT5 유전자와 유사한 유전자 발현 패턴을 나타내고, 이들 유전자가 게놈 상에서 가까운 위치에 좌위하는 것이 양 유전자의 협조적인 유전자 발현 패턴에 영향을 미친다고 추측되었다(도 2).
실시예 4
포도 및 와인의 플라보노이드 분석
실시예 3의 VvGT5의 유전자 발현 패턴으로부터, 과피에서도 플라보놀 3-글루쿠로나이드가 축적되어 있을 가능성이 나타났기 때문에, 과피 플라보노이드의 분석을 행했다.
포도 3품종(피노누아, 카베르네 쇼비뇽 및 시라)의 과피와, 비교 대조로서 피노누아 및 카베르네 쇼비뇽의 잎을 이용하여, 각 샘플의 생중량 0.8 g을 동결 건조했다. 건조체를 스패튤라로 파쇄하고, 8 ㎖의 0.1% 포름산을 포함하는 50% 아세토니트릴 용액을 첨가하여, 실온에서 30 분간 초음파 처리를 행함으로써 플라보노이드류를 추출했다. 초음파 처리액을 원심 분리(3000 rpm, 10 분간, 4℃)하여 얻어진 상청을 필터 여과(마일렉스 LH, 포어사이즈 0.45 ㎛, 밀리포어(주) 제조)하여, HPLC 분석에 이용했다.
HPLC 분석 조건은, 컬럼은 YMC-PAK-Polymer C18(4.6 mm×250 mm, YMC)을 컬럼 오븐 40℃에서 이용하고, 이동상 A(0.1% TFA/H2O)와 이동상 B(0.1% TFA/90% CH3CN)를 이용했다. 용리 조건은 15 분간의 직선 농도 구배(B20%→B60%)후, 다시 10 분간 B60%로 유지했다. 그 후 다시, B20%로 되돌려 10 분간 평형화했다. 유속은 0.8 ㎖/분으로 행했다. 검출은, SPD-M10A Photodiode Array detector(시마즈제작소)를 이용하여 350 nm에서 행했다. 본 조건하에서 표준품의 케르세틴 3-글루쿠로나이드(Q3GA) 및 케르세틴 3-글루코시드(Q3Glc)는, 각각 순서대로, 유지 시간 약 10.89 분, 11.21 분에 용출된다. LC 분석의 결과, 각 포도 품종의 과피에서 Q3GA의 축적이 확인되었다(도 11). 샘플간에 함량의 차이가 확인되었지만, 이것은 과피의 성숙 정도의 차이와 품종간 차이를 반영하고 있는 것이라고 생각되었다.
또한, MS 분석에서도 포도 과피에서 Q3GA가 확인되었다(도 12).
LC-MS 분석 조건은, YMC-pak Polymer-C18(3.0 mm×150 mm, YMC)을 이용하고, 이동상은, A액으로서 0.1% 포름산을 포함하는 물을, B액으로서 0.1% 포름산을 포함하는 100% 아세토니트릴을 이용했다. 20 분간의 직선 농도 구배(B액 10%→70%(15 분간)를 이용하여 용출하고, 그 후 B액 70%으로 5 분간의 이소크라틱 용출을 행했다(유속 : 0.2 ㎖/분, 컬럼 오븐 : 40℃).
검출은, 포토다이오드 어레이 검출기(SPD-M10A, 시마즈제작소)로 230∼500 nm의 데이터를 수집하여, A350 nm의 크로마토그램을 측정했다. 또, PDA 검출기후에 Q-TOF Premier(Micromass사 제조, UK) 검출기를 접속하고, 이하의 조건으로 생성물의 분자량을 측정했다. MS의 측정 조건은, 네거티브, V 모드로 행했다(이온화 : ESI, Lock spray reference : 로이신엔케팔린, Capillary : 2.6 kV, Cone : 35 V, collision energy : 5 eV).
이 조건하에, Q3Glc는 R.T.12.32 분에 용출하고, 463.09[M-H]-의 분자 이온을 부여하여 -3GlcA는 R.T.12.41 분에 용출하고, 477.07[M-H]-의 분자 이온을 부여했다. 매스크로마토그램에 의해, 잎 및 과피의 Q3GA의 피크를 확인할 수 있었다.
다음으로, 포도를 원재료로 하는 식품 중에서의 Q3GA에 관해 탐색했다.
레드와인(보졸레 2007년, 가메이 품종), 레드와인(부르고뉴 2006년, 피노누아 품종) 및 레즌(건포도, 중국산 백포도)에 관해 검토했다.
와인에 관해서는, 10 ㎖에 물을 등량 첨가한 용액을 SEP-PAK 1cc 카트리지(Waters사)에 흡착시켜 10 ㎖의 물로 세정후, 1 ㎖의 90% 아세토니트릴에 의해 용출하여 10배 농축 샘플을 얻었다.
레즌에 관해서는, 10 g을 액체 질소로 동결하여 유발로 분쇄하고, 20 ㎖의 50% 아세토니트릴로 추출했다. 추출액 15 ㎖에 85 ㎖의 물을 첨가하고, SEP-PAK 20cc 카트리지(Waters사)에 흡착시켜 100 ㎖의 물로 세정후, 2 ㎖의 90% 아세토니트릴에 의해 용출하여 LC-MS 샘플액을 얻었다.
LC-MS의 조건은, YMC-Pack Polymer C18 컬럼(YMC, 2.0 mm×150 mm, 6 ㎛)을 이용하고, 이동상은, A액으로서 0.1% 포름산을 포함하는 물을, B액으로서 0.1% 포름산을 포함하는 90% 아세토니트릴을 이용했다. 15 분간의 직선 농도 구배(A액 80%:B액 20%→A액 40%:B액 60%)를 이용하여 용출하고, 그 후, A액 40%:B액 60이고, 5 분간의 이소크라틱 용출을 행했다(유속 : 0.2 ㎖/분간).
검출은, 포토다이오드 어레이 검출기(SPD-M10A, 시마즈제작소)로 230∼500 nm의 데이터를 수집했다. 또, PDA 검출기후에 TOF-MS 검출기(LCMS-IT-TOF, 시마즈제작소)를 접속하여, 분자량을 측정했다. MS의 측정 조건은 네거티브 및 포지티브의 양 모드로, 측정 분자량 범위는 100∼1000 Da, 인터펜스 전압은 각각 4.5 kV 및 -3.5 kV에서 행했다.
이 조건하에서, 표품인 Q3Glc 및 Q3GA는 8.5 분 부근에 용출되었다. 상기 3 식품 샘플에 관해 8.5 분 부근을 탐색한 결과, 모든 샘플에서 네거티브 모드로 Q3GA와 일치하는 m/z 477.04 [M-H]-의 분자 이온을 검출했다. 또 동시에, 네거티브 모드로 Q3Glc와 일치하는 m/z 463.06 [M-H]-의 분자 이온을 검출했다.
이와 같이 VvGT5의 유전자 발현 패턴에서 나타낸 바와 같이, 포도 과피 및 그것이 포함되는 식품(와인 및 레즌)에서 케르세틴 3-글루쿠로나이드가 존재하는 것이 확인되었다. 따라서, VvGT5는 주로 포도의 잎과 과피에서 발현하고, 플라보놀의 3위를 글루쿠론산화하고 있는 것이 나타났다.
실시예 5
VvGT5 의 당공여체 선택성에 관한 점변이체 해석
실시예 2에서 나타낸 바와 같이, VvGT5는 UDP-글루쿠론산을 특이적으로 이용하는 것이 밝혀졌지만, 이 당공여체 선택성을 결정하는 아미노산 잔기를 명확하게 하기 위해, Clustal-W에 의한 아미노산 서열의 멀티플 얼라이먼트를 행했다(도 13). 그 결과, VvGT5와 상동성이 높은 포도의 안토시아닌 3위 글루코스 전이 효소인 VvGT1이나 애기장대 및 페튜니아의 플라보노이드 3위 글루코스 전이 효소인 At3GlcT(UGT78D2; GenBank 액세션 번호 : AAM91139) 및 Ph3GlcT(GenBank 액세션 번호 : BAA89008)에서 높게 보존되어 있는 N말단으로부터 140 아미노산 부근에 존재하는 트립토판(W)이, VvGT5에서는 아르기닌(R)으로 치환되었다. 이들 아미노산 잔기의 C말단측에 인접하는 트레오닌(T)은, VvGT1의 결정 구조 해석으로부터 당공여체인 UDP-글루코스와 상호 작용하는 것이 알려져 있기 때문에(Offen, W. et al., EMBO J., vol. 25, p. 1396-1405, 2006), VvGT5에 특이적으로 발견된 아르기닌 잔기(서열 번호 4의 아미노산 서열의 제140번째 아미노산 잔기)는 그 당공여체인 UDP-글루쿠론산과 어떠한 상호 작용을 하는 것이 나타났다.
이 독특한 아르기닌 잔기의 당공여체 선택성에서의 기능을 밝히기 위해, VvGT5의 140번째 아르기닌 잔기를 트립토판 잔기로 치환한 VvGT5-R140W 변이체(「R140W」의 표기는, 제140번째 아르기닌(R) 잔기가 트립토판(W) 잔기로 치환된 변이인 것을 나타낸다)를, Quick Change II Site-Directed Mutagenesis 키트(Stratagene사)를 이용하여 상기 키트의 장려 방법에 따라서, 전술한 야생형 VvGT5가 삽입된 pET15b 벡터를 주형으로 하고, 하기 합성 올리고 프라이머(서열 번호 13 및 14)를 이용하여 제작했다.
PCR 조건은, 96℃에서 30초간의 열편성후, 96℃에서 30초간→58℃에서 1 분간→68℃에서 7 분간을 1사이클로 하는 반응을 16 사이클 행했다. PCR 용액에 제한 효소 Dpn I를 첨가하여, 37℃에서 1시간 처리한 후, 반응액 10 ㎕분을 대장균(Mach주)에 형질 전환했다. 얻어진 플라스미드를 회수하여, 시퀀싱에 의해 목적으로 하는 변이 도입을 확인했다.
Figure pct00006
제작된 VvGT5-R140W 변이체는, 실시예 2와 동일한 방법으로 대장균 BL21주에 형질 전환하고, 1 mM IPTG를 첨가후, 18℃에서 20시간 배양하고, His 태그 융합 VvGT5-R140W 단백질로서 조제했다. 실시예 2와 동일한 방법으로, 그 당공여체 선택성에 관해 검토했다. 그 결과, VvGT5-R140W 변이체는 UDP-글루쿠론산을 기질로 하지 않고, 대신 UDP-글루코스를 주요 당공여체로 했다(도 14).
이런 점에서, VvGT5의 140번째 아르기닌 잔기는, UDP-글루쿠론산의 인식에 필수적인 역할을 하고 있는 것이 나타났다. 이런 점에서, 아르기닌 잔기의 특징적인 측쇄인 구아니듐기와, 글루쿠론산의 특징적인 관능기인 카르복실산과의 전기적인 상호 작용이 UDP-글루쿠론산을 인식하기 위해 중요하다는 것이 추측되고, 아마도 UDP-글루쿠론산을 특이적인 당공여체로 하는 UGT 효소에는 VvGT5의 R140과 같은 아르기닌 잔기가 포함되어 있다고 생각되었다.
이상과 같이, 포도로부터 플라보노이드의 3위에 글루쿠론산을 전이하는 신규 활성을 갖는 UGT 효소(VvF3GAT)를 단리할 수 있다. 또, 그 UDP-글루쿠론산에 대한 특이성을 결정하고 있는 아미노산 잔기에 관해서도 동정할 수 있다. 본 발명을 이용함으로써, 인위적으로 플라보노이드의 3위를 글루쿠론산화하는 것이 가능해지므로, 새로운 기능성 식품 소재의 개발이나 유용 화합물을 생산할 수 있는 식물의 개발에 공헌할 수 있다. 따라서, 본 발명은, 농업, 식품 산업, 의약품 산업 및 이들의 관련 산업에 걸친 광범위한 이용이 가능하다는 점에서 매우 유용한 것이다.
[서열표 프리텍스트]
서열 번호 1 : 합성 DNA
서열 번호 2 : 합성 DNA
서열 번호 5 : 합성 DNA
서열 번호 6 : 합성 DNA
서열 번호 7 : 합성 DNA
서열 번호 8 : 합성 DNA
서열 번호 9 : 합성 DNA
서열 번호 10 : 합성 DNA
서열 번호 11 : 합성 DNA
서열 번호 12 : 합성 DNA
서열 번호 13 : 합성 DNA
서열 번호 14 : 합성 DNA
SEQUENCE LISTING <110> Suntory Holdings Limited <120> Flavonoid 3-O-glucuronic acid transferase and polynucleotide encoding the same <130> PCT09-0067 <150> JP 2009-011065 <151> 2009-01-21 <160> 14 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 1 cacccatatg actaccaccg ccagctccat 30 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 2 agatctctac ttattggtgt ccaaaggta 29 <210> 3 <211> 1380 <212> DNA <213> Vitis vinifera <220> <221> CDS <222> (1)..(1380) <400> 3 atg act acc acc gcc agc tcc atg gac agg cat gtt gca gta tta ggg 48 Met Thr Thr Thr Ala Ser Ser Met Asp Arg His Val Ala Val Leu Gly 1 5 10 15 ttc ccc acc cat aca gct acc ctc tta aaa ctc ctg cgc aga cta gca 96 Phe Pro Thr His Thr Ala Thr Leu Leu Lys Leu Leu Arg Arg Leu Ala 20 25 30 tct gcc gca ccc acc acc atc ttc tcc ttc ttc aac act ccc aag gcc 144 Ser Ala Ala Pro Thr Thr Ile Phe Ser Phe Phe Asn Thr Pro Lys Ala 35 40 45 aac agc tcc atc tcc tct gct caa agt ccc cac ggt att cac aat cta 192 Asn Ser Ser Ile Ser Ser Ala Gln Ser Pro His Gly Ile His Asn Leu 50 55 60 aga gtt tat gat gta gca gac ggc gtg cca gag gac ctt gtg ctt tca 240 Arg Val Tyr Asp Val Ala Asp Gly Val Pro Glu Asp Leu Val Leu Ser 65 70 75 80 gca aac ccc ctg gca cgc atc gag atg ttc ttg aag gcg acg cct ggg 288 Ala Asn Pro Leu Ala Arg Ile Glu Met Phe Leu Lys Ala Thr Pro Gly 85 90 95 aac ttt cgt gat gct ttg gaa gtg gct gag aag gac att gga agg aag 336 Asn Phe Arg Asp Ala Leu Glu Val Ala Glu Lys Asp Ile Gly Arg Lys 100 105 110 ata agt tgc ctg gtg agt gat gtc ttt ttg tgg ttc act gct gat atg 384 Ile Ser Cys Leu Val Ser Asp Val Phe Leu Trp Phe Thr Ala Asp Met 115 120 125 gct gag gaa atg ggg gtt ccg tgg gtg gca att agg act gct gcg ctt 432 Ala Glu Glu Met Gly Val Pro Trp Val Ala Ile Arg Thr Ala Ala Leu 130 135 140 tac tca ctc tcc gtc cac att tat act gat gct atc cgg gaa gca gtg 480 Tyr Ser Leu Ser Val His Ile Tyr Thr Asp Ala Ile Arg Glu Ala Val 145 150 155 160 gga gtt gcg ggg cag gtg caa gac caa acc ctt gat ttc atc cca gga 528 Gly Val Ala Gly Gln Val Gln Asp Gln Thr Leu Asp Phe Ile Pro Gly 165 170 175 ttc tca gca ata aag gtt gaa gac cta cct gaa gga atg gtt ttc ggg 576 Phe Ser Ala Ile Lys Val Glu Asp Leu Pro Glu Gly Met Val Phe Gly 180 185 190 gac aca gaa tct ccc ttc gca tgc atg ttg cat aaa atg ggg ctc atg 624 Asp Thr Glu Ser Pro Phe Ala Cys Met Leu His Lys Met Gly Leu Met 195 200 205 ctg cca cga gca acc att gtt gcc aca aat tcc ttt gaa gaa cta gag 672 Leu Pro Arg Ala Thr Ile Val Ala Thr Asn Ser Phe Glu Glu Leu Glu 210 215 220 ccg acc att gtc aca aat gat ctc aag tcc aag ctc caa aaa gtt ctt 720 Pro Thr Ile Val Thr Asn Asp Leu Lys Ser Lys Leu Gln Lys Val Leu 225 230 235 240 act gtt ggt cct ttt gac cta tct tca cca cca ccg ctg ata ttg gac 768 Thr Val Gly Pro Phe Asp Leu Ser Ser Pro Pro Pro Leu Ile Leu Asp 245 250 255 gcc agt ggc tgc ctg cca tgg ttg gac aat aaa aaa gaa gcg tca gtg 816 Ala Ser Gly Cys Leu Pro Trp Leu Asp Asn Lys Lys Glu Ala Ser Val 260 265 270 gca tat gtt agt ttt gga agc ata gca aca cca cca ccc aac gag att 864 Ala Tyr Val Ser Phe Gly Ser Ile Ala Thr Pro Pro Pro Asn Glu Ile 275 280 285 gta gca ttg gca gaa gcc cta gaa gca act ggg ata ccg ttt ctt tgg 912 Val Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Thr Gly Ile Pro Phe Leu Trp 290 295 300 tct ctt agg gag cat gca atg aac aat tta cca aaa gga ttt cta gag 960 Ser Leu Arg Glu His Ala Met Asn Asn Leu Pro Lys Gly Phe Leu Glu 305 310 315 320 agg acg acc gct cat gga aaa gta gtt tcg tgg gca ccc cag cct cag 1008 Arg Thr Thr Ala His Gly Lys Val Val Ser Trp Ala Pro Gln Pro Gln 325 330 335 gtc tta gca cat gcc tca gtt gca gtg ttt att act cat agc ggt tgg 1056 Val Leu Ala His Ala Ser Val Ala Val Phe Ile Thr His Ser Gly Trp 340 345 350 aac tcg gtg act gag agt ata gtt ggt ggt gtg ccc atg atc tgc agg 1104 Asn Ser Val Thr Glu Ser Ile Val Gly Gly Val Pro Met Ile Cys Arg 355 360 365 cca ttc ttt gga gat caa cgt ctt aac agg cgg atg gta cag gat gta 1152 Pro Phe Phe Gly Asp Gln Arg Leu Asn Arg Arg Met Val Gln Asp Val 370 375 380 tgg ggg att ggt ata gga gtt gag gga ggg atc ctc aca aaa agg gga 1200 Trp Gly Ile Gly Ile Gly Val Glu Gly Gly Ile Leu Thr Lys Arg Gly 385 390 395 400 gta atg agt gct ttg gga cta att ttg tcc cat gaa ggg aag aaa atg 1248 Val Met Ser Ala Leu Gly Leu Ile Leu Ser His Glu Gly Lys Lys Met 405 410 415 aga gag aaa att ggg gtc cta aaa gag ctt gct aga agg gct gtt gaa 1296 Arg Glu Lys Ile Gly Val Leu Lys Glu Leu Ala Arg Arg Ala Val Glu 420 425 430 cca aac ggg agc tca act caa aat tta ggt cat ttg ttg gag gta atc 1344 Pro Asn Gly Ser Ser Thr Gln Asn Leu Gly His Leu Leu Glu Val Ile 435 440 445 aca aca tct aag tta cct ttg gac acc aat aag tag 1380 Thr Thr Ser Lys Leu Pro Leu Asp Thr Asn Lys 450 455 <210> 4 <211> 459 <212> PRT <213> Vitis vinifera <400> 4 Met Thr Thr Thr Ala Ser Ser Met Asp Arg His Val Ala Val Leu Gly 1 5 10 15 Phe Pro Thr His Thr Ala Thr Leu Leu Lys Leu Leu Arg Arg Leu Ala 20 25 30 Ser Ala Ala Pro Thr Thr Ile Phe Ser Phe Phe Asn Thr Pro Lys Ala 35 40 45 Asn Ser Ser Ile Ser Ser Ala Gln Ser Pro His Gly Ile His Asn Leu 50 55 60 Arg Val Tyr Asp Val Ala Asp Gly Val Pro Glu Asp Leu Val Leu Ser 65 70 75 80 Ala Asn Pro Leu Ala Arg Ile Glu Met Phe Leu Lys Ala Thr Pro Gly 85 90 95 Asn Phe Arg Asp Ala Leu Glu Val Ala Glu Lys Asp Ile Gly Arg Lys 100 105 110 Ile Ser Cys Leu Val Ser Asp Val Phe Leu Trp Phe Thr Ala Asp Met 115 120 125 Ala Glu Glu Met Gly Val Pro Trp Val Ala Ile Arg Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Tyr Ser Leu Ser Val His Ile Tyr Thr Asp Ala Ile Arg Glu Ala Val 145 150 155 160 Gly Val Ala Gly Gln Val Gln Asp Gln Thr Leu Asp Phe Ile Pro Gly 165 170 175 Phe Ser Ala Ile Lys Val Glu Asp Leu Pro Glu Gly Met Val Phe Gly 180 185 190 Asp Thr Glu Ser Pro Phe Ala Cys Met Leu His Lys Met Gly Leu Met 195 200 205 Leu Pro Arg Ala Thr Ile Val Ala Thr Asn Ser Phe Glu Glu Leu Glu 210 215 220 Pro Thr Ile Val Thr Asn Asp Leu Lys Ser Lys Leu Gln Lys Val Leu 225 230 235 240 Thr Val Gly Pro Phe Asp Leu Ser Ser Pro Pro Pro Leu Ile Leu Asp 245 250 255 Ala Ser Gly Cys Leu Pro Trp Leu Asp Asn Lys Lys Glu Ala Ser Val 260 265 270 Ala Tyr Val Ser Phe Gly Ser Ile Ala Thr Pro Pro Pro Asn Glu Ile 275 280 285 Val Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Thr Gly Ile Pro Phe Leu Trp 290 295 300 Ser Leu Arg Glu His Ala Met Asn Asn Leu Pro Lys Gly Phe Leu Glu 305 310 315 320 Arg Thr Thr Ala His Gly Lys Val Val Ser Trp Ala Pro Gln Pro Gln 325 330 335 Val Leu Ala His Ala Ser Val Ala Val Phe Ile Thr His Ser Gly Trp 340 345 350 Asn Ser Val Thr Glu Ser Ile Val Gly Gly Val Pro Met Ile Cys Arg 355 360 365 Pro Phe Phe Gly Asp Gln Arg Leu Asn Arg Arg Met Val Gln Asp Val 370 375 380 Trp Gly Ile Gly Ile Gly Val Glu Gly Gly Ile Leu Thr Lys Arg Gly 385 390 395 400 Val Met Ser Ala Leu Gly Leu Ile Leu Ser His Glu Gly Lys Lys Met 405 410 415 Arg Glu Lys Ile Gly Val Leu Lys Glu Leu Ala Arg Arg Ala Val Glu 420 425 430 Pro Asn Gly Ser Ser Thr Gln Asn Leu Gly His Leu Leu Glu Val Ile 435 440 445 Thr Thr Ser Lys Leu Pro Leu Asp Thr Asn Lys 450 455 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 5 gctccatctc ctctgctcaa a 21 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 6 gaaagcacaa ggtcctct 18 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 7 cccaccgccg gttatacc 18 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 8 cgaccgaggt gggttttct 19 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 9 ggttccctgg ttggcaattt 20 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 10 gcacccgccc cacaacctt 19 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 11 tccaggacaa ggaagggatt c 21 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 12 gccatcctca agctgctttc 20 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 13 gggtggcaat ttggactgct g 21 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 14 cagcagtcca aattgcaccc 20

Claims (14)

  1. 이하의 (a)∼(f) 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드:
    (a) 서열 번호 3으로 표시되는 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드;
    (b) 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드;
    (c) 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열에서 1∼15개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, UDP-글루쿠론산 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드;
    (d) 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열에 대하여, 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 가지며, UDP-글루쿠론산 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드;
    (e) 서열 번호 3으로 표시되는 염기 서열과 상보적인 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에서 혼성화하고, UDP-글루쿠론산 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드; 또는
    (f) 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드의 염기 서열과 상보적인 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에서 혼성화하고, UDP-글루쿠론산 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드.
  2. 제1항에 있어서, 이하의 (g)∼(j) 중 어느 하나인 폴리뉴클레오티드:
    (g) 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열에서 10개 이하의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, UDP-글루쿠론산 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드;
    (h) 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열에 대하여, 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 가지며, UDP-글루쿠론산 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드;
    (i) 서열 번호 3으로 표시되는 염기 서열과 상보적인 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드와 고 엄격한 조건하에서 혼성화하고, UDP-글루쿠론산 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드; 또는
    (j) 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드의 염기 서열과 상보적인 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드와 고 엄격한 조건하에서 혼성화하고, UDP-글루쿠론산 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 (c)∼(j)에 기재된 폴리뉴클레오티드가, 각각 이하의 (c')∼(j')에 기재된 폴리뉴클레오티드인 폴리뉴클레오티드:
    (c') 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열에서 제140번째 아미노산을 제외한 1∼15개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, UDP-글루쿠론산 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드;
    (d') 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열에 대하여, 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열이며 상기 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열 중의 제140번째 아미노산에 대응하는 아미노산이 아르기닌인 아미노산 서열을 가지며, UDP-글루쿠론산 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드;
    (e') 서열 번호 3으로 표시되는 염기 서열과 상보적인 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드이며 상기 서열 번호 3으로 표시되는 염기 서열 중의 제418∼420번째 염기에 대응하는 염기가 아르기닌을 코드하는 염기인 폴리뉴클레오티드이고, UDP-글루쿠론산 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드;
    (f') 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드의 염기 서열과 상보적인 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드이며 상기 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드의 염기 서열 중의 제418∼420번째 염기에 대응하는 염기가 아르기닌을 코드하는 염기인 폴리뉴클레오티드이고, UDP-글루쿠론산 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드;
    (g') 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열에서 제140번째 아미노산을 제외한 10개 이하의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, UDP-글루쿠론산 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드;
    (h') 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열에 대하여, 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열이며 상기 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열 중의 제140번째 아미노산에 대응하는 아미노산이 아르기닌인 아미노산 서열을 가지며, UDP-글루쿠론산 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드;
    (i') 서열 번호 3으로 표시되는 염기 서열과 상보적인 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드와 고 엄격한 조건하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드이며 상기 서열 번호 3으로 표시되는 염기 서열 중의 제418∼420번째 염기에 대응하는 염기가 아르기닌을 코드하는 염기인 폴리뉴클레오티드이고, UDP-글루쿠론산 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드; 또는
    (j') 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드의 염기 서열과 상보적인 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드와 고 엄격한 조건하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드이며 상기 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드의 염기 서열 중의 제418∼420번째 염기에 대응하는 염기가 아르기닌을 코드하는 염기인 폴리뉴클레오티드이고, UDP-글루쿠론산 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, UDP-글루쿠론산 전이 효소 활성이 플라보노이드 3위 글루쿠론산 전이 효소 활성인 폴리뉴클레오티드.
  5. 제1항에 있어서, 서열 번호 3으로 표시되는 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드.
  6. 제1항에 있어서, 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, DNA인 폴리뉴클레오티드.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드에 코드되는 단백질.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터.
  10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드가 도입된 형질 전환체.
  11. 제9항에 기재된 벡터가 도입된 형질 전환체.
  12. 제10항 또는 제11항에 기재된 형질 전환체를 이용하는, 제8항에 기재된 단백질의 제조 방법.
  13. 제8항에 기재된 단백질을 촉매로 하여, UDP-글루쿠론산과 당수용체 기질로부터 글루쿠론산 포합체를 생성하는, 글루쿠론산 포합체의 제조 방법.
  14. 제13항에 있어서, 당수용체 기질이 플라보노이드인 방법.
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