KR101179238B1

KR101179238B1 - 신규한 케르세틴 3-0-4＂-디옥시-4＂-포르아미도-ｌ-아라비노스 화합물 및 그 합성방법

Info

Publication number: KR101179238B1
Application number: KR1020100061012A
Authority: KR
Inventors: 안중훈; 정나리; 김봉규
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2010-06-28
Filing date: 2010-06-28
Publication date: 2012-09-03
Also published as: KR20120000655A

Abstract

본 발명은 신규한 케르세틴 3-0-4"-디옥시-4"-포르아미도-L-아라비노스 화합물 및 그 합성방법에 관한 것으로 더욱 상세하게는 식물에서 클로닝한 당 전이효소를 대장균에서 발현시켜 Quercetin에서 신규한 물질인 quercetin 3-O-4"-deoxy-4"-foramido-L-arabinose를 합성하는 방법에 관한 것이다.

Description

신규한 케르세틴 3-0-4＂-디옥시-4＂-포르아미도-Ｌ-아라비노스 화합물 및 그 합성방법{Novel Quercetin 3-O-4＂-deoxy-4＂-foramido-L-arabinose and Method for preparing the same}

본 발명은 신규한 케르세틴 3-0-4"-디옥시-4"-포르아미도-Ｌ-아라비노스 화합물 및 그 합성방법에 관한 것으로 더욱 상세하게는 식물에서 클로닝한 당 전이효소를 대장균에서 발현시켜 Quercetin에서 신규한 물질인 quercetin 3-O-4"-deoxy-4"-foramido-L-arabinose (이하, 'Quercetin 3-O-Ara4FN'라고도 함)을 합성하는 방법에 관한 것이다.

최근, 활성 산소나 자유 라디칼에 의한 산화 스트레스가 생활습관병을 시작으로 하는 다양한 질병의 원인으로 되는 것이 알려지고 있다. 산소는 살아가기 위한 에너지를 생산하기 위하여 필수 분자인 한편, 과잉의 산소가 매우 반응성이 높은 활성 산소로 변화하여 생체에 손해를 주고 있는 것도 사실이다. 활성 산소로서는 수퍼옥사이드 음이온(superoxide anion) 라디칼(?O2-), 과산화수소(H2O2), OH 라디칼(?OH) 및 여기분자종인 일중항산소(single oxygen) 등이 있다. 생물은 원래 이들 활성 산소에 의한 산화 장해를 방지하는 능력을 가지고 있으며, 비타민 E 또는 항산화효소가 이를 맡고 있다. 그러나 나이를 드는 것 등의 요인에 의하여 산화 장해를 막는 능력이 저하하거나, 또는 과격한 운동이나 스트레스 부하 등의 요인에 의하여 방어 능력 이상의 활성 산소가 발생하는 경우에는 소거되지 않은 활성 산소가 표적 분자를 산화하고, 그 결과 생체 성분은 장해를 받아 노화가 일어나게 된다.

따라서, 활성 산소 또는 자유 라디칼을 소거하는 항산화물질을 효율적으로 섭취하고, 산화 스트레스로부터 방어하는 것이 다양한 질병의 예방 또는 치료의 관점에서 매우 중요한 것으로 생각되고 있다. 특히, 식품로부터 산화적 장해에 대한 방어기능성분을 적극적으로 섭취함으로써, 보다 효율적으로 이러한 장해를 제어, 소거할 수 있는 것으로 생각되기 때문에, 항산화작용을 갖는 다양한 식품 성분에 주목이 집중되고 있다.

플라보노이드(flavonoid)는 일상적으로 섭취하는 식품 중에 다종다양한 형태로 포함되어 있으며, 강한 항산화활성을 갖는 것으로 알려져 있다. 그러나 그 항산화활성은 생체외에서는 유효하지만, 경구흡수성이 낮기 때문에 생체 내에서는 활성 산소나 자유 라디칼을 소거하기에는 충분하지 않다. 따라서, 플라보노이드(헤스페리딘(hesperidine), 디오스민(diosmin), 나린진(naringin), 네오헤스페리딘 (neohesperidine))에 당을 결합시킴으로써 흡수성을 높이는 방법이 제안되고 있다(일본국 특허공개공보 제2000-78956호 참조). 또한, 메밀에 포함되는 루틴(rutin)에 당전이하여 얻어진 α-글리코실 루틴(α-glycosyl rutin)이 루틴과 비교하여 그 흡수성이 향상하는 것이 보고되어 있다(일본국 특허공개공보 제2004-59522호 및 Shimoi K. et al., J Agric Food Chem., 51,2785-2789, 2003 참조).

루틴의 아글리콘(aglycone)인 케르세틴(Quercetin: 3,3′,4′,5,7-펜타하이드록시플라본(3,3′,4′,5,7-pentahydroxyflavone))은 강력한 항산화활성(Middlton EJ. et al., Pharmacol Rev., 52, 673-751, 2000 참조)외에, 혈소판의 응집 억제 및 접착 억제 작용, 혈관 확장 작용, 항암 작용 등 다양한 생리기능을 갖는 것이 알려져 있다. 이 케르세틴에 대해서도, 양파에 많이 함유된 케르세틴 배당체(케르세틴-4′-β-D-글루코사이드(Quercetin-4′-β-D-glucoside), 케르세틴-3,4′-β-D-글루코사이드(Quercetin-3,4′-β-D-glucoside)) 쪽이 흡수성이 우수한 것으로 보고되어 있다(Hollman PC et al., Arch Toxicol Suppl., 20, 237-248, 1998). 또한,유사하게 케르세틴의 3위치에 글루코오스가 β결합한 이소케르시트린(케르세틴-3-β-D-글루코사이드(Quercetin-3-β-D-glucoside))은 케르세틴이나 루틴보다도 흡수성이 높은 것으로 보고되어 있다(Morand C et al., Free Raf Res., 33, 667-676, 2000).

이와 같이 이소케르시트린은 케르세틴이나 루틴보다 흡수성이 우수한 성분이지만, 물에 난용성이므로 식품이나 음료 등의 수계(水系) 조성물에 대하여 이용이 제한된다고 하는 문제를 가지고 있다. 따라서, 이러한 문제점을 해소하는 방법으로서 당전이 효소를 이용하여 기질의 글루코오스 잔기를 이소케르시트린의 글루코오스 잔기 부위에 전이시켜 α-글리코실 이소케르시트린(α-glycosyl isoquercitrin)을 제조하는 방법이 제안되어 있다(일본국 특허공개공보 평1-213293호 참조).

본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 신규한 케르시틴 유도체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 케르시틴 유도체 생산에 필요한 효소를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 케르시틴 유도체 생산에 필요한 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 케르시틴 유도체를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 케르시틴 유도체의 용도를 제공하는 것이다

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1의 화합물을 제공한다.

[화학식 1]

또한 본 발명은 상기 본 발명의 화합물 및 그의 염을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 화합물 및 그의 염을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 화합물을 생산하는 당 전이 효소를 제공한다.

본 발명의 당 전이 효소는 서열번호 1로 표시되는 아미노산서열을 가진 것을 특징으로 한다. 또, 서열번호 1의 아미노산서열에 대해서, 이들 아미노산서열을 가진 단백질이 표시하는 당 전이 효소 활성이 손상되지 않는 범위 내에서, 1 이상의 아미노산의 결실, 치환 및 부가의 적어도 1종의 변이가 도입된 변이 당 전이 효소도 본 발명에 관한 당 전이 효소에 포함된다.

또, 본 발명에는 서열번호 1의 아미노산서열을 가진 당 전이 효소를 코딩하는 당 전이 효소 유전자가 포함되고, 그 유전자서열로서는 서열번호 2로 표시되는 것을 들 수 있다. 또, 이들 서열번호 1의 염기서열을 변이시켜서 얻게 되는 상기한 변이 당 전이 효소를 코딩하는 변이 당 전이 효소 유전자도 본 발명에 관한 당 전이 효소 유전자에 포함된다.

또, 본 발명에는, 상기 당 전이 효소 유전자를 함유하는 재조합벡터, 상기 재조합벡터에 의해서 형질전환된 형질전환체가 포함된다. 또한, 본 발명에는, 이 형질전환체를 배양하여, 얻게되는 배양물로부터 당 전이 효소를 분리하는 것을 특징으로 하는 당 전이 효소의 제조방법이 포함된다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명의 당 전이 효소 유전자는 애기장대부터 분리된 것이다. 먼저, 당 전이 효소 유전자를 가진 애기장대로부터 염색체 DNA를 취득한다. 다음에, 설계한 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 하고, 애기장대의 염색체 DNA를 주형으로 해서 폴리머라제 연쇄반응(PCR)을 행하여, 당 전이 효소 유전자를 부분적으로 증폭한다. 이와 같이 해서 얻게 된 PCR 증폭 단편은 애기장대의 당 전이 효소 유전자에 100% 가까운 상동성을 가진 단편으로서, 콜로니하이브리디제이션을 행할 때의 프로브로서 높은 S/N비를 기대할 수 있는 동시에, 하이브리디제이션의 스트린전시 (stringency)제어를 용이하게 한다. 상기의 PCR 증폭 단편을 적당한 시약을 사용해서 표지하고, 상기 염색체 DNA라이브러리에 대해서 콜로니 하이브리디제이션을 행하여, 당 전이 효소 유전자를 선발한다 (Current Protocols in Molecular Biology, 1권, 603페이지, 1994년).

상기의 방법에 의해 선발된 대장균으로부터 알칼리법(Current Protocols in Molecular Biology, 1권, 161페이지, 1994년)을 사용해서 플라스미드를 회수함으로써, 당 전이 효소 유전자를 함유하는 DNA단편을 얻을 수 있다. 또한, 상기 방법에 의해 염기서열을 결정한 후에는, 상기 염기서열을 가진 DNA단편의 제한효소에 의한 분해에 의해 조제한 DNA단편을 프로브로 해서 하이브리다이즈함으로써 본 발명의 전체 유전자를 얻는 것이 가능하다. 서열번호 2에는 본 발명의 당 전이 효소 유전자의 염기서열을 서열번호 1에는 상기 유전자가 코딩하는 아미노산서열을 표시한다.

본 발명의 형질전환된 미생물은, 본 발명의 재조합벡터를, 상기 재조합벡터를 제작할 때에 사용한 발현벡터에 적합한 숙주 속에 도입함으로써 얻게 된다. 예를 들면 대장균 등의 세균을 숙주로서 사용하는 경우는, 본 발명에 관한 재조합벡터는, 그 자신이 숙주속에서 자율복제 가능한 동시에, 프로모터, 당 전이 효소 유전자를 함유하는 DNA 및 전사종결서열 등의 발현에 필요한 구성을 가진 것임이 바람직하다. 본 발명에 사용된 발현벡터로서는 pGEX를 사용하였으나 상기의 요건을 만족하는 발현벡터이면 어느 것이나 사용가능하다.

본 발명에 관한 당 전이 효소의 제조는, 이것을 코딩하는 유전자를 가진 재조합벡터에 의해 숙주를 형질전환해서 얻은 형질전환체를 배양하고, 배양물(배양균체 또는 배양상청액)속에 유전자 산물인 당 전이 효소를 생성 축적시켜, 배양물로부터 효소를 취득함으로써 행하여진다.

당 전이 효소의 취득 및 정제는, 얻게 되는 배양물중으로부터, 균체 또는 상청액을 원심 회수하여, 균체파쇄, 친화성크로마토그래피, 양이온 또는 음이온교환크로마토그래피 등을 단독으로 또는 조합함으로써 행할 수 있다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 당 전이 효소를 이용하여 케르세틴으로부터 본 발명의 화합물을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 당 전이 효소는 반드시 정제할 필요는 없고, 본 발명의 목적이 달성될 수 있는 한 조(粗)정제물이어도 좋다. 또한, 당 전이 효소를 고정화하여, 이를 뱃치(batch)식 또는 연속식으로 처리하여 케르시트린과 반응시켜도 좋다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 당 전이 효소를 포함하는 본 발명의 화합물 제조용 조성물을 제공한다.

본 발명은 상기 본 발명의 화합물을 유효 성분으로 하는 항산화제 및 항산화 기능(활성산소 소거 기능)을 가지게 되는 조성물을 제공한다.

상기 생체내 항산화제로서는 그 형태를 특히 제한하는 것은 아니며, 예를 들어, 분말 형태, 과립 형태, 정제 형태, 캡슐 형태 등의 고체 형태; 액체 형태, 현탁액 등의 용액 형태; 또는 페이스트 형태 등의 반고체 형태 등의 경구 투여에 적합한 임의의 형태로 조제할 수 있다.

상기 항산화제에 배합되는 본 발명의 화합물의 비율은 특히 제한되지 않으며, 0.01~100중량%의 범위에서 적절하게 선택할 수 있다. 또한, 상기 항산화제의 사용량으로서는 생체내에서 항산화 효과를 나타내는 한 특히 제한되지 않으나, 체중 60㎏의 성인의 경우, 1회 투여 당 항산화제 중에 본 발명의 화합물을 1㎎~30g의 비율로 포함하는 범위에서 적절하게 선택할 수 있다.

항산화제는 본 발명의 화합물에 추가적으로 희석제, 담체 또는 첨가제 등의 성분을 배합하여 임의의 제제화 처리를 행하여, 제제로서 조제할 수 있다. 여기서, 희석제 또는 담체로서는 본 발명의 효과를 저해하지 않으면, 특히 제한되지 않으나, 예를 들어 수크로오스, 글루코오스, 과당, 말토오스, 트레할로스, 유당,올리고당, 덱스트린, 덱스트란, 사이클로덱스트린, 전분, 물엿, 이성화 액당 등의 당류; 에탄올, 프로필렌글리콜, 글리세린 등의 알코올류; 소르비톨, 만니톨, 에리스리톨, 락티톨, 자일리톨, 말티톨, 환원 팔라티노스(palatinose), 환원 전분 분해물 등의 당알코올류; 트리아세틴 등의 용제; 아라비아검, 카라기난, 크산탄검, 구아검, 젤란검 등의 다당류; 또는 물을 들 수 있다. 또한, 첨가제로서는 킬레이트제 등의 보조제, 향료, 향신료 추출물, 방부제 등을 들 수 있다.

사용상의 편리 등에서 이들 희석제, 담체 또는 첨가제를 이용하여 상기 제제를 조제하는 경우는 본 발명의 화합물이 제제 100중량% 중에 0.01~100중량%, 바람직하게는 0.1~50중량%의 비율로 포함되도록 조제하는 것이 바람직하다.

항산화 기능(활성산소 소거 기능)을 가지게 되는 식품으로서는, 본 발명의 화합물 그 자체 또는 본 발명의 화합물에 상기 희석제, 담체 또는 첨가제 등을 첨가 배합하여 조제되는 제제(예를 들어, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 액제, 드링크제 등) 등의 예를 들어, 보조식품(supplement) 및 일반적인 식품에 상기 본 발명의 화합물을 1성분으로 하여 배합하여 그 식품에 생체에 대한 항산화 기능(활성산소 소거기능)을 부가하여 되는 기능성 식품(특정 건강 기능 식품)을 들 수 있다. 또한, 이들 식품에는 상기 본 발명의 화합물을 함유하고, 생체 항산화작용(활성산소 소거작용)을 가지는 것을 특징으로 하는 것으로서, 생체에서 산화반응 또는 그에 의해 발생하는 장해를 예방 또는 억제하기 위하여 이용된다는 표시를 부가하여 되는 식품이 포함된다.

항산화 기능(활성산소 소거기능)을 가지는 식품의 경우, 상기 식품에 배합되는 본 발명의 화합물의 비율은 그 기능을 가지는 한 특히 제한되지 않으나, 통상 0.001~100중량% 범위에서 적절하게 선택할 수 있다.

본 발명의 화합물의 대상으로 하는 식품으로서는 제한은 없으나, 아이스크림, 아이스밀크, 락티스(lactice), 샤베트, 빙과 등의 냉과류; 유음료, 유산균 음료, 청량음료(과즙이 함유된 것을 포함한다), 탄산음료, 과즙음료, 야채음료, 야채?과실 음료, 스포츠음료, 분말음료 등의 음료류; 리큐르 등의 알코올음료; 커피음료, 홍차음료 등의 차음료류; 콘소메 스프, 포타지 스프 등의 스프류; 카스타드 푸딩, 밀크 푸딩, 과즙 함유 푸딩 등의 푸딩류, 젤리, 바발로아(babaloa) 및 요구르트 등의 디저트류; 츄잉검이나 풍선검 등의 검류(스틱검, 당코팅된 검볼); 마블 쵸콜렛 등의 코팅된 쵸콜렛 외에 딸기 쵸콜렛, 블루베리 쵸콜렛 및 멜론 쵸콜렛 등의 풍미를 부가한 쵸콜렛 등의 쵸콜렛류; 경질 사탕(hard candy)(봉봉, 버터볼, 마블 등을 포함), 연질 사탕(soft candy)(캬라멜, 누가(nougat), 구미캔디(gummy candy), 마쉬멜로우(marshmallow) 등을 포함), 드로프(drop), 태피(taffy) 등의 캬라멜류; 하드 비스켓, 쿠키, 오카키(okaki, 쌀 크래커), 전병(sembei, 쌀 크래커) 등의 구운 과자류; 절임류, 김치, 세퍼레이트 드레싱, 오일 프리 드레싱, 케첩, 딥, 소스 등의 소스류; 딸기잼, 블루베리잼, 마말레이드, 사과잼, 살구잼, 설탕조림과일(preserves) 등의 잼류; 적포도주 등의 과실주; 시럽에 조린 체리, 살구, 사과, 딸기, 배 등의 가공용 과실; 햄, 소시지, 로스트 포크 등의 육류 가공품; 어육햄, 어육소시지, 어육 필레(fillet), 어묵; 치즈 등의 낙농 제품류; 우동, 냉국수, 소면, 메밀국수, 중국식 메밀국수, 스파게티, 마카로니, 쌀국수(bifun), 당면 및 만두국 등의 면류; 이외 각종 부식 등의 다양한 가공 식품을 들 수 있다.

또한, 본 발명의 식품의 섭취량으로서는 섭취하여 체내에서 항산화 효과를 나타내는 한 특히 제한되지는 않으나, 예를 들어 체중 60㎏의 성인의 경우, 1회 섭취 식품 중에 본 발명의 화합물을 1㎎~30g의 비율로 포함하는 범위에서 적절하게 선택할 수 있다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명자들은 당 전이효소를 이용하여 quercetin 3-O-4"-deoxy-4"-foramido-L-arabinose을 생산할 수 있는 새로운 시스템을 개발하였다. 이 목적을 달성하기 위하여 애기장대에서 클로닝한 당 전이효소의 유전자 염기서열을 제공하고, 이의 클로닝 방법과 생산방법을 제공한다.

본 발명자들은 애기장대의 게놈 서열에서 당전이유전자를 분리하였다. . 분리된 유전자를 유전자 재조합법에 의해 변형된 pGEX 대장균 발현 벡터 시스템을 이용하였다. 새로 재조합된 유전자는 대장균에 도입하였다. 이렇게 만들어진 대장균을 이용하여 Quercetin을 기질로 새로운 물질인 quercetin 3-O-4"-deoxy-4"-foramido-L-arabinose을 생산하는 것을 확인하였다.

본 발명을 통해서 알 수 있는 바와 같이 본 발명의 당전이 효소를 이용하여 케르세틴으로부터 신규한 화합물인 quercetin 3-O-4"-deoxy-4"-foramido-L-arabinose을 생산하는 것을 확인하였다.

도 1은 본 발명의 화합물을 제조하는 반응식을 나타낸 그림.
도 2는 Quercetin을 기질로 생물전환을 실시한 결과 본 발명의 화합물이 생성된 것을 확인한 그림.
도 3은 대장균에서 arnA유전자를 deletion시킨 mutant에 AtUGT78D3를 형질전환하여 대장균에서는 quercetin 3-O-4"-deoxy-4"-foramido-L-arabinose가 생성되지 않음을 확인한 그림. 그림에서 WT는 BL21 DE3 균주에 AtUGT78D3를 과발현 시킨것과, O/E는 ugd, anrA, arnB, AtUGT78D3의 과발현 시킨 BL21 DE3 균주를 이용한 생물전환 효율을 의미한다.
도 4는 AtUGT78D3유전자를 발현시키기 위한 벡터의 개열지도를 나타낸다.

이하, 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.

실시예 1 : AtUGT78D3 유전자의 분리

애기장대에서 분리한 total RNA를 이용하여 oligo dT를 시발물질(primer)로 하여 역전사를 실시하였다. 이 역전사체를 주형으로 애기장대의 게놈에서 얻은 염기 서열을 바탕으로 만든 프라이머는 이용하여 PCR(polymerase Chain Reaction)을 실시하였다. 이 때 사용된 염기 서열은 다음과 같다.

AtUGT78D3

포워드 프라이머(서열번호 3): 5'-ATGGCCAAACCCTCGCAGCC-3'

리버스 프라이머(서열번호 4): 5'-AACTCGAGTTATCCAAAGTTCACAACTT-3'

PCR은 Taq 폴리머라제(Taq DNA polymerase)를 위의 역전사체와 프라이머들은 혼합하여 94℃, 60sec. 55℃, 60sec, 72℃, 90sec의 사이클을 40회 반복하여 약 1.5kbp 에 해당되는 AtUGT78D3 유전자를 증폭하였다, 증폭된 DNA는 대장균 클로닝 벡터인 pGETM-easy에 옮겨 염기서열을 결정하였다.

실시예 2 : AtUGT78D3 유전자를 발현시키기 위한 벡터 제작

실시예 1에서 클로닝한 당전이효소를 발현시키기 위하여 대장균 발현벡터인 pGEX 에 옮겼다. 이를 클로닝하기 위하여 Eco RI과 Not I 제한효소 사이트를 삽입하여 만든 AtUGT78D3 당 전이효소 유전자의 프라이머와 pfu taq polymerase를 이용하여 PCR를 수행한후 Eco RI과 Not I로 절단한 후 pGEX 벡터(amersham pharmacia biotech. USA)에 클로닝하였다. 이를 이용하여 Quercetin을 기질로 사용하였을 때 새로운 산물을 만들어내는지의 유무를 확인하였다. 발현벡터에 대한 개열지도는 도 4에 기재하였다.

실시예 3 : AtUGT78D3 의 발현 및 생물전환방법을 이용한 새로운 물질 생산

AtUGT78D3 과발현 벡터는 BL21 DE3(Invitrogen, USA)로 형질전환하였다. 형질전환을 위한competent cell은 37℃에서 OD 600nm에서 0.5까지 키운 다음 얼음에 30분 이상 방치한다. 세포는 4℃ 원심분리기를 이용하여 회수하여 10ml 0.1M CaCl₂ 용액으로 씻어준다. 다시 원심분리기를 이용하여 세포를 회수한 후 최종적으로 0.1M CaCl₂ 3ml 용액에 현탁하여 형질전환에 이용한다.

AtUGT78D3를 가지고 있는 형질전환된 대장균 BL21은 50 ㎍/ml 엠피실린을 첨가하여 LB배지에 seed culture하였다. 밤샘 배양한 seed culture대장균은 새로운 LB배지에 접종하였다. 대장균은 흡광도 600 nm에서 0.8 까지 되게 배양한다. 배양된 대장균에 IPTG를 0.1mM로 첨가해 주고, 18℃에서 18시간 동안 단백질을 발현시켰다. 배양된 대장균은 원심분리를 하여 상등액을 버리고, 회수된 대장균은 50 ㎍/ml 엠피실린과 2% glucose 가 첨가된 M9 배지에 흡광도 600에서 3이 되게 맞추어 주었다. 여기에 최종 농도가 100uM이 되게 기질을 첨가해주고 25℃에서 20시간 동안 진탕 배양하였다. 상등액은 에칠아세테이트를 이용하여 추출한다. 추출된 반응물은 speed vac을 이용하여 건조시켰다. 반응물은 다시 DMSO에 녹여 HPLC분석에 이용하였다.

AtUGT78D3가 형질전환된 대장균을 이용하여 Quercetin을 기질로 생물전환을 실시 한 결과 새로운 반응물이 생성되었다 (도 2).

또한 하기와 같은 결과를 통해서 이의 분자량은 461-Da로 나타났고, NMR 실험 결과 생성물의 구조는 quercetin 3-O-4"-deoxy-4"-foramido-L-arabinose으로 밝혀졌다

21개의 피크가 ¹³C-NMR 스펙트럼에서 관찰되었다. 케르세틴은 생물전환(biotransformation)을 위한 기질이기 때문에, 16개의 피크는 케르세틴의 기존의 피크와 일치하였다: 148.9 (C2), 134.2 (C3), 177.6 (C4), 161.3 (C5), 98.9 (C6), 164.0 (C7), 93.7 (C8), 156.4 (C9), 103.9 (C10), 122.1 (C1'), 115.5 (C2'), 145.2 (C3'), 115.7 (C5'), 120.8 (C6'). C4'의 피크는 147 ppm에서 발견되어야 하지만, 그 피크가 관찰되지 않았다. 21 개의 피크 중에서, 세 피크가 60 및 70 ppm 사이에서 관찰되었고, 따라서 그 피크들을 당류(saccharide) 부위에 의하여 야기된 피크로 할당하였다. 44.6, 101.3, 및 164.6 ppm에서 3 이상의 피크들은 슈가 부위에 해당할 것으로 예측되므로, 대사체(metabolite)에 포함된 슈가가 변형된 것으로 간주되었다. Breazeale 등은 4-deoxy-4-amido-L-arabinoside의 NMR 데이터를 보고하였다(J. Biol . Chem . 280 , pp. 14154-14167, 2005). 공개된 4-formamido-4-deoxy-arabinoside의 ¹³C NMR 데이터는 생물전환 산물의 슈가 부위와 일치하므로, 그것의 구조를 4"-formamido-4"-deoxy-L-arabinosyl quercetin이라고 정하였다. MS 데이터는 그 대사체의 분자량이 461 Da인 것을 보여준다. 4-formamido-4-deoxy-arabinoside 및 케르세틴의 질량의 합이 479이다. 두 화합물이 결합할 때 1몰의 물이 제거되므로 그 대사체의 이론적인 분자량은 461이다. 4-formamido-4-deoxy-arabinoside가 세 개의 하이드록시 기를 포함하므로, 그들 중 하나가 케르세틴과 연결될 수 있다. 결론적으로 그 대사체는 quercetin 3-O- 4"-formamido-4"-deoxy-L-arabinoside로 결정되었다.

AtUGT78D3는 glycosyltransferase의 일종으로 sugar-donor와 sugar-acceptor를 필요로 한다. 본 발명에서 sugar-acceptor는 quercetin이었고 sugar-donor는 생성물의 구조로 미루어 볼 때 UDP-4"-deoxy-4"-formamido-L-arabinose일 것으로 생각하였다. 대장균내에서 UDP-4"-deoxy-4"-foramido-L-arabinose를 만드는 대사 경로를 확인 한 결과 arnA라는 유전자가 UDP-glucose로부터 UDP-4"-deoxy-4"-foramido-L-arabinose를 만드는 첫 번째 단계의 유전자임을 알 수 있었다. 대장균에서 arnA유전자를 deletion시킨 mutant에 AtUGT78D3를 형질전환하여 대장균에서는 quercetin 3-O-4"-deoxy-4"-foramido-L-arabinose가 생성되지 않음을 확인하였다 (도 3).

실시예 4:

대장균에서 UDP-ara4FN의 함을 증가시키기 위해 이 물질의 생합성에 관련하는 세 개의 유전자 ugd(Genebank Accession No.YP_003035874), araA(Genebank Accession No. NP_416758.1), arnB(Genebank Accession No. NP_416756.5)와 더불어 AtUGT78D3를 대장균에서 동시에 발현시킨 후 quercetin을 넣고 10시간 반응 한 후 반응물을 분석한 결과 AtUGT78D3만을 발현한 것보다 quercetin 3-O-4"-deoxy-4"-foramido-L-arabinose의 함량이 약 1.9배정도 증가함을 알 수 있었다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

하기 화학식 1의 화합물

[화학식 1]
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제 1항의 화합물 및 그의 염을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물.
제 1항의 화합물을 생산하는 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 가지는 당 전이 효소.
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제 4항의 당 전이 효소를 코딩하는 서열번호 2에 기재된 염기 서열을 가지는 유전자.
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제 4항의 당 전이 효소를 포함하는 제1항의 화합물 제조용 조성물.