KR102378988B1 - 무칼로리 감미제 - Google Patents

Abstract

레바우디오시드 D2로 지칭되는 스테비올 글리코시드가 개시되어 있다. 레바우디오시드 D2는 아글리콘 스테비올에 연결된 5개의 β-D-글루코실 단위를 갖는다. 레바우디오시드 D2를 제조하는 방법, UDP-글리코실트랜스퍼라제 융합 효소, 및 레바우디오시드 D 및 레바우디오시드 E를 제조하는 방법이 또한 개시되어 있다.

Description

무칼로리 감미제 {A NON-CALORIC SWEETENER}

관련 출원의 상호-참조

본 개시내용은 발명의 명칭 "무칼로리 감미제 (A Non-Caloric Sweetener)"의 PCT 출원이다. 본 출원은 2014년 5월 5일에 출원된 미국 특허 출원 번호 14/269,435에 대한 우선권을 주장하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

서열 목록 제출에 대한 지원에서의 진술

서열 목록의 서면 사본, 및 크기가 32,670 바이트 (마이크로소프트 윈도우즈(MICROSOFT WINDOWS)® 익스플로러(EXPLORER)에서 측정하였을 때)인 "32559-11_ST25.txt"라는 명칭의 파일을 포함하는 서열 목록의 컴퓨터 해독가능 형태를 의거 제출하는 바, 본원에 참조로 포함된다. 이와 같은 서열 목록은 서열식별번호(SEQ ID NO): 1-6으로 이루어진다.

본 개시내용은 일반적으로 천연 감미제에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 개시내용은 무칼로리 감미제, 및 무칼로리 감미제를 합성하는 방법에 관한 것이다.

스테비올 글리코시드는 스테비아 레바우디아나(Stevia rebaudiana) 잎으로부터 단리되는 천연 생성물이다. 스테비올 글리코시드는 고강도 저칼로리 감미제로 광범위하게 사용되고 있는데, 수크로스에 비해 상당히 더 달다. 천연 발생 스테비올 글리코시드는 동일한 기본 스테비올 구조를 공유하지만, C13 및 C19 위치에서의 탄수화물 잔기의 내용물 (예컨대 글루코스, 람노스 및 크실로스 잔기)에 있어서 서로 다르다. 알려져 있는 구조를 갖는 스테비올 글리코시드에는 스테비올, 스테비오시드, 레바우디오시드 A, 레바우디오시드 B, 레바우디오시드 C, 레바우디오시드 D, 레바우디오시드 E, 레바우디오시드 F 및 둘코시드 A가 포함된다 (예컨대 표 1 참조).

<표 1> 스테비올 글리코시드.

건조 중량 기준으로, 스테비오시드, 레바우디오시드 A, 레바우디오시드 C 및 둘코시드 A는 각각 잎 내 스테비올 글리코시드 총 중량의 9.1, 3.8, 0.6 및 0.3%를 차지하는 반면, 다른 스테비올 글루코시드는 훨씬 더 적은 양으로 존재한다. 스테비아 레바우디아나 식물로부터의 추출물이 상업적으로 입수가능한데, 전형적으로 스테비오시드 및 레바우디오시드 A를 주요 화합물로 함유하고 있다. 다른 스테비올 글리코시드는 전형적으로 스테비아 추출물 중에 부차 성분으로 존재한다. 예를 들어, 상업적 제제에서의 레바우디오시드 A의 양은 총 스테비올 글리코시드 함량의 약 20% 내지 90% 초과까지 가변적일 수 있는 반면, 총 스테비올 글리코시드 중 레바우디오시드 B의 양은 약 1-2%일 수 있으며, 레바우디오시드 C의 양은 약 7-15%일 수 있고, 레바우디오시드 D의 양은 약 2%일 수 있다.

스테비올 글리코시드는 분자 구조에서 뿐만 아니라, 그의 맛 특성에서도 서로 다르다. 예를 들어, 상이한 스테비올 글리코시드는 상이한 단맛 정도 및 뒷맛을 갖는다. 예를 들어, 스테비오시드는 수크로스에 비해 100-150배 더 달지만, 쓴 뒷맛을 갖는다. 예를 들어, 레바우디오시드 A 및 레바우디오시드 E는 수크로스에 비해 250-450배 더 달며, 스테비오시드에 비해 더 적은 뒷맛을 갖는다. 레바우디오시드 C는 수크로스에 비해 40-60배 더 달다. 둘코시드 A는 수크로스에 비해 약 30배 더 달다.

대부분의 스테비올 글리코시드는 전형적으로 우리딘 5'-디포스포글루코스 (UDP-글루코스)를 당 모이어티의 공여체로 사용하는 UDP-글리코실트랜스퍼라제 (UGT)에 의해 촉매되는 스테비올의 몇 가지 글리코실화 반응에 의해 형성된다. 식물의 UGT는 글루코스 잔기를 UDP-글루코스로부터 스테비올로 전달하는 매우 다양한 군의 효소로 구성된다. 예를 들어, 스테비오시드 C-13-O-글루코스의 C-3'의 글리코실화는 레바우디오시드 A를 산출하며; 스테비오시드 19-O-글루코스의 C-2'의 글리코실화는 레바우디오시드 E를 산출한다. 레바우디오시드 A (C-19-O-글루코스에서) 또는 레바우디오시드 E (C-13-O-글루코스에서)의 추가의 글리코실화는 레바우디오시드 D를 산출한다 (도 1).

고도-당 식품 및 음료의 소비와 연계된 많은 질환에 대한 인식으로 인하여, 대안적인 감미제가 점점 더 큰 관심을 받고 있다. 인공 감미제가 가용하기는 하지만, 둘신, 소듐 시클라메이트 및 사카린과 같은 많은 인공 감미제가 그의 안전성에 대한 우려로 인하여 일부 국가에서 금지되거나 제한되고 있다. 이에 따라, 천연 기원의 무칼로리 감미제가 점점 더 인기를 끌고 있다. 스테비아 감미제 사용 확산의 주요 장애 중 하나는 그의 바람직하지 않은 맛 속성이다. 따라서, 단맛 효과와 향미 프로파일의 최고의 조합을 제공하는 대안적인 감미제 및 그의 제조 방법을 개발할 필요성이 존재한다.

본 개시내용은 일반적으로 천연 감미제에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 개시내용은 무칼로리 감미제, 및 무칼로리 감미제를 합성하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 무칼로리 감미제를 제조하는 데에 사용될 수 있는 효소에 관한 것이다.

스테비올 글리코시드 - 합성 레바우디오시드 D2. 한 측면에서, 본 개시내용은 하기 화학 구조로 이루어진 합성 레바우디오시드 (레바우디오시드 D2)에 관한 것이다:

레바우디오시드 E로부터 레바우디오시드 D2를 제조하는 방법. 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 레바우디오시드 E로부터 레바우디오시드 D2를 합성하는 방법에 관한 것이다. 방법은 레바우디오시드 E; 수크로스, 우리딘 디포스페이트 (UDP) 및 우리딘 디포스페이트-글루코스 (UDP-글루코스)로 이루어진 군으로부터 선택되는 기질; 및 우리딘 디포스포 글리코실트랜스퍼라제, 및 수크로스 신타제 도메인에 커플링된 우리딘 디포스포 글리코실트랜스퍼라제 도메인을 포함하는 UDP-글리코실트랜스퍼라제 융합 효소로 이루어진 군으로부터 선택되는 우리딘 디포스포 글리코실트랜스퍼라제 (UDP-글리코실트랜스퍼라제)를 포함하는 반응 혼합물을 제조하는 것; 및 레바우디오시드 D2를 생성하기에 충분한 시간 동안 반응 혼합물을 인큐베이션하는 것을 포함하며, 여기서 글루코스는 레바우디오시드 E에 공유 결합되어 레바우디오시드 D2를 생성한다.

스테비오시드로부터 레바우디오시드 E 및 레바우디오시드 D2를 제조하는 방법. 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 스테비오시드로부터 레바우디오시드 E 및 레바우디오시드 D2를 합성하는 방법에 관한 것이다. 방법은 스테비오시드; 수크로스, 우리딘 디포스페이트 (UDP) 및 우리딘 디포스페이트-글루코스 (UDP-글루코스)로 이루어진 군으로부터 선택되는 기질; 및 우리딘 디포스포 글리코실트랜스퍼라제, 및 수크로스 신타제 도메인에 커플링된 우리딘 디포스포 글리코실트랜스퍼라제 도메인을 포함하는 UDP-글리코실트랜스퍼라제 융합 효소로 이루어진 군으로부터 선택되는 우리딘 디포스포 글리코실트랜스퍼라제 (UDP-글리코실트랜스퍼라제)를 포함하는 반응 혼합물을 제조하는 것; 및 레바우디오시드 E 및 레바우디오시드 D2를 생성하기에 충분한 시간 동안 반응 혼합물을 인큐베이션하는 것을 포함하며, 여기서 글루코스는 스테비오시드에 공유 결합되어 레바우디오시드 E 중간체를 생성하고, 여기서 글루코스는 레바우디오시드 E 중간체에 공유 결합되어 레바우디오시드 D2를 생성한다.

UDP - 글리코실트랜스퍼라제 융합 효소 (" EUS"). 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 UDP-글리코실트랜스퍼라제 융합 효소 (본원에서는 "EUS"로 지칭됨)에 관한 것이다. UDP-글리코실트랜스퍼라제 융합 효소는 수크로스 신타제 도메인에 커플링된 우리딘 디포스포 글리코실트랜스퍼라제 도메인을 포함한다. UDP-글리코실트랜스퍼라제 융합 효소는 1,2-β 글리코시드 연결 및 1,6-β 글리코시드 연결 효소 활성은 물론, 수크로스 신타제 활성을 나타낸다.

레바우디오시드 A로부터 레바우디오시드 D를 제조하는 방법. 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 레바우디오시드 A로부터 레바우디오시드 D를 합성하는 방법에 관한 것이다. 방법은 레바우디오시드 A; 수크로스, 우리딘 디포스페이트 (UDP) 및 우리딘 디포스페이트-글루코스 (UDP-글루코스)로 이루어진 군으로부터 선택되는 기질; 및 우리딘 디포스포 글리코실트랜스퍼라제, 및 수크로스 신타제 도메인에 커플링된 우리딘 디포스포 글리코실트랜스퍼라제 도메인을 포함하는 UDP-글리코실트랜스퍼라제 융합 효소 (EUS)로 이루어진 군으로부터 선택되는 UDP-글리코실트랜스퍼라제를 포함하는 반응 혼합물을 제조하는 것; 및 레바우디오시드 D를 생성하기에 충분한 시간 동안 반응 혼합물을 인큐베이션하는 것을 포함하며, 여기서 글루코스는 레바우디오시드 A에 공유 결합되어 레바우디오시드 D를 생성한다.

또 다른 측면에서, 본 개시내용은 음료 제품 및 소비재 제품으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 감미량의 레바우디오시드 D2를 포함하는 경구 소비재 제품에 관한 것이다.

또 다른 측면에서, 본 개시내용은 감미량의 레바우디오시드 D2를 포함하는 음료 제품에 관한 것이다. 레바우디오시드 D2는 약 5 ppm 내지 약 100 ppm의 농도로 음료 제품 내에 존재한다. 일부 실시양태에서, 예컨대 100 ppm 미만인 저농도의 레바우디오시드 D2는 10,000 내지 30,000 ppm의 농도를 갖는 수크로스 용액과 동등한 단맛을 갖는다.

또 다른 측면에서, 본 개시내용은 감미량의 레바우디오시드 D2를 포함하는 소비재 제품에 관한 것이다. 레바우디오시드 D2는 약 5 ppm 내지 약 100 ppm의 농도로 소비재 제품 내에 존재한다. 일부 실시양태에서, 예컨대 100 ppm 미만인 저농도의 레바우디오시드 D2는 10,000 내지 30,000 ppm의 농도를 갖는 수크로스 용액과 동등한 단맛을 갖는다.

또 다른 측면에서, 본 개시내용은 하기 화학 구조로 이루어진 감미제에 관한 것이다:

선행 실시양태 중 어느 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서는, 유일한 감미제인 레바우디오시드 D2, 및 생성물이 약 1% 내지 약 4% (w/v-%) 수크로스 용액과 동등한 단맛 강도를 갖는다. 선행 실시양태 중 어느 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서는, 경구 소비재 제품이 추가의 감미제를 추가로 포함하며, 약 1% 내지 약 10% (w/v-%) 수크로스 용액과 동등한 단맛 강도를 갖는다. 선행 실시양태 중 어느 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 생성물 중 모든 감미 성분은 고강도 감미제이다. 선행 실시양태 중 어느 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 생성물 중 모든 감미 성분은 천연 고강도 감미제이다. 선행 실시양태 중 어느 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 추가의 감미제는 스테비아 추출물, 스테비올 글리코시드, 스테비오시드, 레바우디오시드 A, 레바우디오시드 B, 레바우디오시드 C, 레바우디오시드 D, 레바우디오시드 E, 레바우디오시드 F, 둘코시드 A, 루부소시드, 스테비올비오시드, 수크로스, 고도 프럭토스 옥수수 시럽, 프럭토스, 글루코스, 크실로스, 아라비노스, 람노스, 에리트리톨, 크실리톨, 만니톨, 소르비톨, 이노시톨, AceK, 아스파르탐, 네오탐, 수크랄로스, 사카린, 나린진 디히드로칼콘 (NarDHC), 네오헤스페리딘 디히드로칼콘 (NDHC), 루부소시드, 모그로시드 IV, 시아메노시드 I, 모그로시드 V, 모나틴, 타우마틴, 모넬린, 브라제인, L-알라닌, 글리신, 로 한 구오(Lo Han Guo), 헤르난둘신, 필로둘신, 트릴롭테인 및 이들의 조합으로부터 선택되는 1종 이상의 감미제를 함유한다. 선행 실시양태 중 어느 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 음료 제품 및 소비재 제품은 탄수화물, 폴리올, 아미노산 또는 그의 염, 폴리-아미노산 또는 그의 염, 당 산 또는 그의 염, 뉴클레오티드, 유기 산, 무기 산, 유기 염, 유기 산 염, 유기 염기 염, 무기 염, 쓴맛 화합물, 향미제, 향미 성분, 수렴성 화합물, 단백질, 단백질 가수분해물, 계면활성제, 유화제, 플라보노이드, 알콜, 중합체 및 이들의 조합으로부터 선택되는 1종 이상의 첨가제를 추가로 포함한다. 선행 실시양태 중 어느 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 레바우디오시드 D2는 제품에 그것이 첨가되기 전에, 중량 기준 약 50% 내지 약 100%의 순도를 갖는다. 선행 실시양태 중 어느 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 제품 내 레바우디오시드 D2는 레바우디오시드 D2 다형체 또는 무정형 레바우디오시드 D2이다. 선행 실시양태 중 어느 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 제품 내 레바우디오시드 D2는 레바우디오시드 D2 입체이성질체이다.

본 개시내용의 다른 측면은 정제된 레바우디오시드 D2를 제품에, 또는 음료 제품 및 소비재 제품을 제조하기 위한 성분에 포함시킴으로써, 여기서 레바우디오시드 D2는 약 5 ppm 내지 약 100 ppm의 농도로 제품 내에 존재하는 것인, 음료 제품 및 소비재 제품을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 다른 측면은 약 5 ppm 내지 약 100 ppm의 정제된 레바우디오시드 D2를 음료 제품 및 소비재 제품에 첨가함으로써, 여기서 첨가되는 레바우디오시드 D2는 정제된 레바우디오시드 D2가 결핍되어 있는 상응하는 음료 제품 및 소비재 제품에 비해 음료 제품 및 소비재 제품의 단맛을 강화하는 것인, 음료 제품 및 소비재 제품의 단맛을 강화하는 방법에 관한 것이다.

선행 실시양태 중 어느 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서는, 레바우디오시드 D2가 유일한 감미제이며, 제품이 약 1% 내지 약 4% (w/v-%) 수크로스 용액과 동등한 단맛 강도를 갖는다. 선행 실시양태 중 어느 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 방법은 추가의 감미제를 첨가하는 것을 포함하며, 여기서 제품은 약 1% 내지 약 10% (w/v-%) 수크로스 용액과 동등한 단맛 강도를 갖는다.

본 개시내용의 다른 측면은 a) 1종 이상의 감미제를 함유하는 음료 제품 또는 소비재 제품을 제공하는 것; 및 b) 음료 제품 또는 소비재 제품에 약 5 ppm 내지 약 100 ppm의 정제된 레바우디오시드 D2를 첨가하는 것에 의해 감미화된 음료 제품 또는 감미화된 소비재 제품를 제조하는 방법에 관한 것이다: .

선행 실시양태 중 어느 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 방법은 음료 제품 또는 소비재 제품에 1종 이상의 첨가제를 첨가하는 것을 추가로 포함한다. 선행 실시양태 중 어느 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 경구 소비재 제품은 1종 이상의 첨가제를 추가로 함유한다. 선행 실시양태 중 어느 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 1종 이상의 첨가제는 탄수화물, 폴리올, 아미노산 또는 그의 염, 폴리-아미노산 또는 그의 염, 당 산 또는 그의 염, 뉴클레오티드, 유기 산, 무기 산, 유기 염, 유기 산 염, 유기 염기 염, 무기 염, 쓴맛 화합물, 향미제, 향미 성분, 수렴성 화합물, 단백질, 단백질 가수분해물, 계면활성제, 유화제, 플라보노이드, 알콜, 중합체 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 선행 실시양태 중 어느 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 제품 내 모든 감미 성분은 고강도 감미제이다. 선행 실시양태 중 어느 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 제품 내 모든 감미 성분은 천연 고강도 감미제이다. 선행 실시양태 중 어느 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 감미제는 스테비아 추출물, 스테비올 글리코시드, 스테비오시드, 레바우디오시드 A, 레바우디오시드 B, 레바우디오시드 C, 레바우디오시드 D, 레바우디오시드 E, 레바우디오시드 F, 둘코시드 A, 루부소시드, 스테비올비오시드, 수크로스, 고도 프럭토스 옥수수 시럽, 프럭토스, 글루코스, 크실로스, 아라비노스, 람노스, 에리트리톨, 크실리톨, 만니톨, 소르비톨, 이노시톨, AceK, 아스파르탐, 네오탐, 수크랄로스, 사카린, 나린진 디히드로칼콘 (NarDHC), 네오헤스페리딘 디히드로칼콘 (NDHC), 루부소시드, 모그로시드 IV, 시아메노시드 I, 모그로시드 V, 모나틴, 타우마틴, 모넬린, 브라제인, L-알라닌, 글리신, 로 한 구오, 헤르난둘신, 필로둘신, 트릴롭테인 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 선행 실시양태 중 어느 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 레바우디오시드 D2는 제품에 그것이 첨가되기 전에, 중량 기준 약 50% 내지 약 100%의 순도를 갖는다. 선행 실시양태 중 어느 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 제품 내 레바우디오시드 D2는 레바우디오시드 D2 다형체 또는 무정형 레바우디오시드 D2이다.

하기의 해당 상세한 설명을 고려하면, 본 개시내용이 더 잘 이해될 것이며, 상기에서 제시된 것들이 아닌 다른 특징, 측면 및 장점이 분명해지게 될 것이다. 이와 같은 상세한 설명은 하기 도면을 참조하는 바, 여기서:
도 1a-1c는 스테비오시드로부터의 스테비올 글리코시드 생합성의 경로를 설명하는 개략도이다.
도 2a 및 2b는 실시예 1에서 논의되는 바와 같은, 정제된 재조합 UDP-글리코실트랜스퍼라제 효소 (EUGT11) 및 정제된 재조합 UDP-글리코실트랜스퍼라제 융합 효소 (EUS)의 SDS-PAGE 분석을 나타낸다.
도 3A-3G는 실시예 2에서 논의되는 바와 같은, 스테비오시드 ("Ste"), 레바우디오시드 A ("Reb A") 및 레바우디오시드 D ("Reb D") 표준 (도 3A); 14시간에 EUS에 의해 효소적으로 생성된 레바우디오시드 D (도 3B); 14시간에 EUGT11에 의해 효소적으로 생성된 레바우디오시드 D (도 3C); 14시간에 UGT-SUS (EUGT11-AtSUS1) 커플링 시스템에 의해 효소적으로 생성된 레바우디오시드 D (도 3D); 24시간에 EUS에 의해 효소적으로 생성된 레바우디오시드 D (도 3); 24시간에 EUGT11에 의해 효소적으로 생성된 레바우디오시드 D (도 3F); 및 24시간에 UGT-SUS (EUGT11-AtSUS1) 커플링 시스템에 의해 효소적으로 생성된 레바우디오시드 D (도 3G)의 HPLC 체류 시간을 나타내는 그래프이다.
도 4A-4G는 실시예 3에서 논의되는 바와 같은, 스테비오시드 ("Ste"), 레바우디오시드 A ("Reb A") 및 레바우디오시드 D ("Reb D") 표준 (도 4A); 14시간에 EUS에 의해 효소적으로 생성된 레바우디오시드 D2 ("Reb D2") (도 4B); 14시간에 EUGT11에 의해 효소적으로 생성된 레바우디오시드 E ("Reb E") (도 4C); 14시간에 UGT-SUS (EUGT11-AtSUS1) 커플링 시스템에 의해 효소적으로 생성된 레바우디오시드 D2 (도 4D); 24시간에 EUS에 의해 효소적으로 생성된 레바우디오시드 D2 ("Reb D2") (도 4E); 24시간에 EUGT11에 의해 효소적으로 생성된 레바우디오시드 E ("Reb E") (도 4F); 및 24시간에 UGT-SUS (EUGT11-AtSUS1) 커플링 시스템에 의해 효소적으로 생성된 레바우디오시드 D2 (도 4G)의 HPLC 체류 시간을 나타내는 그래프이다.
도 5A-5J는 실시예 4에서 논의되는 바와 같은, 레바우디오시드 D ("Reb-D") 표준 (도 5A); 레바우디오시드 E ("Reb-E") 표준 (도 5B); 12시간에 EUGT11에 의해 효소적으로 생성된 레바우디오시드 D2 ("Reb D2") (도 5C); 12시간에서의 UGT-SUS (EUGT11-SUS1) 커플링 시스템 (도 5D) 및 12시간에서의 EUS (도 5E); 12시간에 UGT76G1-AtSUS1 커플링 시스템에 의해 효소적으로 생성된 레바우디오시드 D ("Reb D") (도 5F); 24시간에 EUGT11에 의해 효소적으로 생성된 레바우디오시드 D2 (도 5G); 24시간에 UGT-SUS (EUGT11-SUS1) 커플링 시스템에 의해 효소적으로 생성된 레바우디오시드 D2 (도 5H); 24시간에 EUS에 의해 효소적으로 생성된 레바우디오시드 D2 (도 5I); 및 24시간에 UGT76G1-AtSUS1 커플링 시스템에 의해 효소적으로 생성된 레바우디오시드 D (도 5J)의 HPLC 체류 시간을 나타내는 그래프이다.
도 6a-6b는 실시예 5에서 논의되는 바와 같은 레바우디오시드 D2 및 레바우디오시드 E의 화학적 구조를 나타낸다.
도 7은 실시예 5에서 논의되는 바와 같은 핵심 TOCSY 및 HMBC 상관관계를 예시하는 레바우디오시드 D2의 화학적 구조이다.
도 8a-8c는 실시예 5에서 논의되는 바와 같은 레바우디오시드 D2, 레바우디오시드 E 및 레바우디오시드 D의 화학적 구조를 나타낸다.
본 개시내용이 다양한 변형 및 대안적인 형태의 여지가 있기는 하지만, 그의 구체적인 실시양태를 예로서 도면에 나타낸 바, 본원의 하기에서 상세하게 기술된다. 그러나, 구체적인 실시양태에 대한 설명이 첨부되는 청구범위에 의해 정의되는 바와 같은 본 개시내용의 기술사상 및 영역 내에 속하는 모든 변형, 등가물 및 대안을 포괄하는 본 개시내용을 제한하고자 하는 것은 아님이 이해되어야 한다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시내용이 속하는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 기술되는 것들과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 개시내용의 실시 또는 시험에 사용될 수도 있기는 하지만, 바람직한 물질 및 방법을 하기한다.

"상보성"이라는 용어는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같은 그의 일반적이고도 통상적인 의미에 따라 사용되는 것으로, 비제한적으로 서로 혼성화될 수 있는 뉴클레오티드 염기 사이의 관계를 기술하는 데에 사용된다. 예를 들어, DNA와 관련하여, 아데노신은 티민에 대하여 상보성이며, 시토신은 구아닌에 대하여 상보성이다. 따라서, 대상 기술은 첨부된 서열 목록에 기록되어 있는 바와 같은 완전한 서열에 대하여 상보성인 단리된 핵산 단편은 물론, 실질적으로 유사한 핵산 서열도 포함한다.

"핵산" 및 "뉴클레오티드"라는 용어는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같은 그 각각의 일반적이고도 통상적인 의미에 따라 사용되는 것으로, 비제한적으로 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드, 및 단일- 또는 이중-가닥 형태 중 어느 하나인 이들의 중합체를 지칭하는 데에 사용된다. 구체적으로 제한되지 않는 한, 상기 용어는 천연 뉴클레오티드의 알려져 있는 유사체를 포함하며 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 가지고 천연-발생 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 핵산을 포괄한다. 달리 표시되지 않는 한, 특정 핵산 서열은 명시적으로 표시된 서열 뿐만 아니라, 그의 보존성 변형 또는 축중성 변이체 (예컨대 축중성 코돈 치환) 및 상보성 서열도 암묵적으로 포괄한다.

"단리된"이라는 용어는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같은 그의 일반적이고도 통상적인 의미에 따라 사용되는 것으로, 단리된 핵산 또는 단리된 폴리펩티드라는 맥락으로 사용되는 경우, 비제한적으로 인간의 손에 의해 그의 천연 환경으로부터 유출 분리되어 있으며 그에 따라 천연 생성물이 아닌 핵산 또는 폴리펩티드를 지칭하는 데에 사용된다. 단리된 핵산 또는 폴리펩티드는 정제된 형태로 존재할 수 있거나, 또는 예를 들어 트랜스제닉 숙주 세포에서와 같은 비-천연 환경 중에 존재할 수 있다.

본원에서 사용될 때의 "인큐베이션하는 것" 및 "인큐베이션"이라는 용어는 2종 이상의 화학적 또는 생물학적 내용물 (예컨대 화합물 및 효소)을 혼합하고, 스테비올 글리코시드 조성물을 생성하는 데에 바람직한 조건하에서 그것들이 상호작용하도록 하는 과정을 지칭한다.

"축중성 변이체"라는 용어는 하나 이상의 축중성 코돈 치환만큼 참조 핵산 서열과 상이한 잔기 서열을 갖는 핵산 서열을 지칭한다. 축중성 코돈 치환은 하나 이상의 선택된 (또는 전체) 코돈의 제3 위치가 혼합 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성하는 것에 의해 달성될 수 있다. 핵산 서열과 그의 모든 축중성 변이체는 동일한 아미노산 또는 폴리펩티드를 발현하게 된다.

"폴리펩티드", "단백질" 및 "펩티드"라는 용어는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같은 그 각각의 일반적이고도 통상적인 의미에 따라 사용되는데; 상기 3종의 용어는 때로는 호환가능하게 사용되며, 비제한적으로 해당 크기 또는 기능에 관계없이 아미노산 또는 아미노산 유사체의 중합체를 지칭하는 데에 사용된다. "단백질"이 종종 상대적으로 대형인 폴리펩티드와 관련하여 사용되고 "펩티드"가 종종 소형 폴리펩티드와 관련하여 사용되기는 하지만, 관련 기술분야에서의 이들 용어의 용도는 중복적이며 가변적이다. 본원에서 사용될 때의 "폴리펩티드"라는 용어는 달리 언급되지 않는 한 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질을 지칭한다. "단백질", "폴리펩티드" 및 "펩티드"라는 용어는 본원에서 폴리뉴클레오티드 생성물을 언급할 때 호환가능하게 사용된다. 따라서, 대표적인 폴리펩티드에는 폴리뉴클레오티드 생성물, 천연 발생 단백질, 상동체, 오르토로그, 파라로그, 단편, 및 전기의 다른 등가물, 변이체 및 유사체가 포함된다.

참조 폴리펩티드와 관련하여 사용될 때의 "폴리펩티드 단편" 및 "단편"이라는 용어는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 일반적이고도 통상적인 의미에 따라 사용되는데; 비제한적으로 참조 폴리펩티드 자체에 비해 아미노산 잔기가 결실되어 있으나 보통 나머지 아미노산 서열이 참조 폴리펩티드에서의 상응하는 위치와 동일한 폴리펩티드를 지칭하는 데에 사용된다. 그와 같은 결실은 참조 폴리펩티드의 아미노-말단 또는 카르복시-말단에서, 아니면 둘 다에서 발생할 수 있다.

폴리펩티드 또는 단백질의 "기능적 단편"이라는 용어는 전체 길이 폴리펩티드 또는 단백질의 일부이며 전체 길이 폴리펩티드 또는 단백질과 실질적으로 동일한 생물학적 활성을 가지거나 실질적으로 동일한 기능을 수행하는 (예컨대 동일한 효소 반응을 수행하는) 펩티드 단편을 지칭한다.

호환가능하게 사용되는 "변이체 폴리펩티드", "변형된 아미노산 서열" 또는 "변형된 폴리펩티드"라는 용어는 하나 이상의 아미노산만큼, 예컨대 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 및/또는 첨가만큼 참조 폴리펩티드와 상이한 아미노산 서열을 지칭한다. 한 측면에서, 변이체는 참조 폴리펩티드의 능력 중 일부 또는 전부를 유지하는 "기능적 변이체"이다.

"기능적 변이체"라는 용어에는 보존성으로 치환된 변이체 또한 포함된다. "보존성으로 치환된 변이체"라는 용어는 하나 이상의 보존성 아미노산 치환만큼 참조 펩티드와 상이하며 참조 펩티드의 활성 중 일부 또는 전부를 유지하는 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 지칭한다. "보존성 아미노산 치환"은 기능적으로 유사한 잔기에 의한 아미노산 잔기의 치환이다. 보존성 치환의 예에는 이소류신, 발린, 류신 또는 메티오닌과 같은 1개의 비-극성 (소수성) 잔기의 또 다른 것을 대신한 치환; 아르기닌과 리신 사이, 글루타민과 아스파라긴 사이, 트레오닌과 세린 사이와 같은, 1개의 하전 또는 극성 (친수성) 잔기의 또 다른 것을 대신한 치환; 리신 또는 아르기닌과 같은 1개의 염기성 잔기의 또 다른 것을 대신한 치환; 또는 아스파르트산 또는 글루탐산과 같은 1개의 산성 잔기의 또 다른 것을 대신한 치환; 또는 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판과 같은 1개의 방향족 잔기의 또 다른 것을 대신한 치환이 포함된다. 이와 같은 치환은 단백질 또는 폴리펩티드의 겉보기 분자량 또는 등전점에 대하여 적은 효과를 가지거나 효과가 없을 것으로 예상된다. "보존성으로 치환된 변이체"라는 구에는 생성 펩티드가 본원에서 기술되는 바와 같은 참조 펩티드의 활성 중 일부 또는 전부를 유지한다는 전제하에, 화학적으로 유도체화된 잔기에 의해 잔기가 대체된 펩티드도 포함된다.

대상 기술의 폴리펩티드와 연계된 "변이체"라는 용어에는 또한 참조 폴리펩티드의 아미노산 서열과 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% , 및 심지어 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 기능적으로 활성인 폴리펩티드가 포함된다.

모든 해당 문법 형태 및 철자법 변이에 있어서의 "상동성"이라는 용어는 상과에 속하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 및 상이한 종에 속하는 상동성 폴리뉴클레오티드 또는 단백질을 포함하여, "공통의 진화 기원"을 보유하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 사이의 관계를 지칭한다 (문헌 [Reeck et al., Cell 50:667, 1987]). 그와 같은 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드들은 퍼센트 동일성 면에서인지, 또는 보존되는 위치에서의 특성 아미노산 또는 모티프의 존재 면에서인지에 관계없이, 그들의 서열 유사성에 의해 반영되는 바와 같은 서열 상동성을 갖는다. 예를 들어, 2종의 상동성 폴리펩티드는 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 및 심지어 100% 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다.

대상 기술의 변이체 폴리펩티드 서열과 관련한 "퍼센트 (%) 아미노산 서열 동일성"은 서열을 정렬하고 필요에 따라 간극을 도입함으로써 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성한 후의, 그리고 어떠한 보존성 치환도 서열 동일성의 일부로 간주하지 않는, 참조 폴리펩티드 (예를 들어 서열식별번호: 6과 같은 것)의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 중 아미노산 잔기의 백분율을 지칭한다.

퍼센트 아미노산 서열 동일성을 측정할 목적의 정렬은 관련 기술분야의 기술에 속하는 다양한 방식으로, 예를 들어 블라스트(BLAST), 블라스트-2, 얼라인(ALIGN), 얼라인-2 또는 메갈라인(Megalign) (디엔에이스타(DNASTAR)) 소프트웨어와 같은 공공에서 가용한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자라면, 비교되는 서열의 전체-길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데에 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 정렬을 측정하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 예를 들어, % 아미노산 서열 동일성은 서열 비교 프로그램 NCBI-블라스트2를 사용하여 측정될 수 있다. NCBI-블라스트2 서열 비교 프로그램은 ncbi.nlm.nih.gov에서 다운로드할 수 있다. NCBI 블라스트2는 몇 가지 탐색 파라미터를 사용하는데, 예를 들어 언마스크 예스, 스트랜드=전체, 예상 빈도 10, 최소 저복잡도 길이=15/5, 다중-경로 e-값=0.01, 다중-경로에 대한 상수=25, 최종 간극 정렬에 대한 드롭오프=25 및 점수화 매트릭스=블로섬(BLOSUM)62를 포함하여, 모든 해당 탐색 파라미터가 디폴트 값으로 설정된다. NCBI-블라스트2가 아미노산 서열 비교에 사용되는 상황에서, 주어진 아미노산 서열 B에 대한, B와의, 또는 B 대비 주어진 아미노산 서열 A의 % 아미노산 서열 동일성 (대안적으로는, 주어진 아미노산 서열 B에 대한, B와의, 또는 B 대비 특정 % 아미노산 서열 동일성을 가지거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로 표현될 수 있음)은 하기와 같이 계산된다: 100 곱하기 분율 X/Y로서, 여기서 X는 해당 프로그램의 A와 B의 정렬에서 서열 정렬 프로그램 NCBI-블라스트2에 의해 동일한 짝으로 점수화되는 아미노산 산기의 수이며, Y는 B의 총 아미노산 잔기 수임. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, B에 대한 A의 % 아미노산 서열 동일성이 A에 대한 B의 % 아미노산 서열 동일성과 동일하지 않게 된다는 것은 알고 있을 것이다.

이와 같은 취지에서, 아미노산 서열 "유사성"을 측정하기 위한 기술이 관련 기술분야에 잘 알려져 있다. 일반적으로, "유사성"은 적절한 위치에서의 2종 이상 폴리펩티드의 직접적인 아미노산 대 아미노산 비교를 지칭하는 것으로, 여기서 아미노산은 동일하거나, 전하 또는 소수성과 같은 유사한 화학적 및/또는 물리적 특성을 보유한다. 이후 비교되는 폴리펩티드 서열 사이에 소위 "퍼센트 유사성"이 측정될 수 있다. 핵산 및 아미노산 서열 동일성을 측정하기 위한 기술에 대해서는 역시 관련 기술분야에 잘 알려져 있는데, 해당 유전자에 대하여 mRNA의 뉴클레오티드 서열을 측정하는 것 (보통 cDNA 중간체를 통함), 및 거기에 코딩되어 있는 아미노산 서열을 측정한 후 그것을 제2의 아미노산 서열과 비교하는 것이 포함된다. 일반적으로, "동일성"은 각각 2종 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 직접적인 뉴클레오티드 대 뉴클레오티드 또는 아미노산 대 아미노산 상응성을 지칭한다. 2종 이상의 폴리뉴클레오티드 서열은 그들의 "퍼센트 동일성"을 측정하는 것에 의해 비교될 수 있으며, 2종 이상의 아미노산 서열도 마찬가지일 수 있다. 위스콘신 서열 분석 패키지(Wisconsin Sequence Analysis Package), 버전 8 (위스콘신 매디슨 소재 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group)으로부터 구입가능)에서 구입가능한 프로그램, 예를 들어 GAP 프로그램은 각각 2종 폴리뉴클레오티드 사이의 동일성, 및 2종 폴리펩티드 서열 사이의 동일성 및 유사성 둘 다를 계산할 수 있다. 서열 사이의 동일성 또는 유사성을 계산하기 위한 다른 프로그램에 대해서는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 알려져 있다.

참조 위치에 "에 상응하는" 아미노산 위치는 아미노산 서열을 정렬하는 것에 의해 식별될 때 참조 서열과 함께 정렬되는 위치를 지칭한다. 그와 같은 정렬은 수동으로, 또는 클러스탈(Clustal)W2, 블라스트2 등과 같은 잘 알려져 있는 서열 정렬 프로그램을 사용하여 수행될 수 있다.

달리 구체화되지 않는 한, 2종 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 퍼센트 동일성은 2종 서열 중 더 짧은 것의 전체 길이에 걸친 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 백분율을 지칭한다.

"코딩 서열"은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같은 그의 일반적이고도 통상적인 의미에 따라 사용되는 것으로, 비제한적으로 특정 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열을 지칭하는 데에 사용된다.

"적합한 조절 서열"은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같은 그의 일반적이고도 통상적인 의미에 따라 사용되는 것으로, 비제한적으로 코딩 서열의 상류 (5' 비-코딩 서열), 내 또는 하류 (3' 비-코딩 서열)에 위치하며 전사, RNA 프로세싱 또는 안정성, 또는 연관되어 있는 코딩 서열의 번역에 영향을 주는 뉴클레오티드 서열을 지칭하는 데에 사용된다. 조절 서열에는 프로모터, 번역 리더 서열, 인트론 및 폴리아데닐화 인식 서열이 포함될 수 있다.

"프로모터"는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같은 그의 일반적이고도 통상적인 의미에 따라 사용되는 것으로, 비제한적으로 코딩 서열 또는 기능적 RNA의 발현을 조절할 수 있는 DNA 서열을 지칭하는 데에 사용된다. 일반적으로, 코딩 서열은 프로모터 서열에 대하여 3'에 위치한다. 프로모터는 그 전체가 천연 유전자로부터 유래할 수 있거나, 또는 천연에서 발견되는 서로 다른 프로모터로부터 유래하는 서로 다른 요소로 구성될 수 있거나, 또는 심지어 합성 DNA 분절을 포함할 수 있다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자라면, 상이한 프로모터가 상이한 세포 유형에서, 또는 상이한 발생 단계에서, 또는 상이한 환경 조건에 반응하여 유전자의 발현을 유도할 수 있다는 것을 알고 있다. 대부분의 세포 유형에서 대부분의 시점에 유전자가 발현되는 것을 야기하는 프로모터는 통상적으로 "구성적 프로모터"로 지칭된다. 대부분의 경우에서 조절 서열의 정확한 경계가 완전히 한정되어 있지 않기 때문에, 상이한 길이의 DNA 단편이 동일한 프로모터 활성을 가질 수 있다는 것 또한 알려져 있다.

"작용가능하게 연결된"이라는 용어는 하나의 기능이 다른 것에 의해 영향을 받도록 하는 단일 핵산 단편 상에서의 핵산 서열의 연관성을 지칭한다. 예를 들어, 프로모터는 그것이 해당 코딩 서열의 발현에 영향을 줄 수 있는 (즉 그 코딩 서열이 프로모터의 전사 조절하에 있는) 경우에 코딩 서열과 작용가능하게 연결된다. 코딩 서열은 센스 또는 안티센스 방향으로 조절 서열에 작용가능하게 연결될 수 있다.

본원에서 사용될 때의 "발현"이라는 용어는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같은 그의 일반적이고도 통상적인 의미에 따라 사용되는 것으로, 비제한적으로 대상 기술의 핵산 단편으로부터 유래하는 센스 (mRNA) 또는 안티센스 RNA의 전사 및 안정한 축적을 지칭하는 데에 사용된다. "과다발현"은 정상 또는 비-형질전환 생물체에서의 생성 수준을 초과하는 트랜스제닉 또는 재조합 생물체에서의 유전자 생성물의 생성을 지칭한다.

"형질전환"은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같은 그의 일반적이고도 통상적인 의미에 따라 사용되는 것으로, 비제한적으로 표적 세포에의 폴리뉴클레오티드의 전달을 지칭하는 데에 사용된다. 전달되는 폴리뉴클레오티드는 표적 세포의 게놈 또는 염색체 DNA에 통합됨으로써, 유전학적으로 안정한 유전을 초래할 수 있거나, 또는 숙주 염색체와 무관하게 그것이 복제될 수 있다. 형질전환된 핵산 단편을 포함하는 숙주 생물체는 "트랜스제닉" 또는 "재조합" 또는 "형질전환된" 생물체로 지칭된다.

숙주 세포와 연계되어 본원에서 사용될 때, "형질전환된", "트랜스제닉" 및 "재조합"라는 용어는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같은 그들의 일반적이고도 통상적인 의미에 따라 사용되는 것으로, 비제한적으로 이종 핵산 분자가 도입되어 있는 식물 또는 미생물 세포와 같은 숙주 생물체의 세포를 지칭하는 데에 사용된다. 핵산 분자는 숙주 세포의 게놈에 안정하게 통합될 수 있거나, 또는 염색체외 분자로서 핵산 분자가 존재할 수 있다. 그와 같은 염색체외 분자는 자가-복제될 수 있다. 형질전환된 세포, 조직 또는 대상체는 형질전환 과정의 최종 산물 뿐만 아니라, 그의 트랜스제닉 자손도 포괄하는 것으로 이해된다.

폴리뉴클레오티드와 연계되어 본원에서 사용될 때, "재조합", "이종" 및 "외인성"이라는 용어는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같은 그들의 일반적이고도 통상적인 의미에 따라 사용되는 것으로, 비제한적으로 특정 숙주 세포에 대하여 외래성인 공급원으로부터 기원하거나, 또는 동일 공급원으로부터 유래하는 경우 그의 원래 형태로부터 변형된 폴리뉴클레오티드 (예컨대 DNA 서열 또는 유전자)를 지칭하는 데에 사용된다. 따라서, 숙주 세포 중 이종 유전자에는 특정 숙주 세포에 대하여 내인성이나 예를 들어 위치-지정 돌연변이유발 또는 다른 재조합 기술의 사용을 통하여 변형된 유전자가 포함된다. 상기 용어에는 천연 발생 DNA 서열의 비-천연적으로 발생하는 다수 사본도 포함된다. 따라서, 상기 용어는 세포에 대하여 외래성 또는 이종성이거나, 또는 세포에 대하여 동종이거나 일반적으로는 요소가 발견되지 않은 숙주 세포 내 위치 또는 형태로 존재하는 DNA 분절을 지칭한다.

마찬가지로, 폴리펩티드 또는 아미노산 서열과 연계되어 본원에서 사용될 때, "재조합", "이종" 및 "외인성"이라는 용어는 특정 숙주 세포에 대하여 외래성인 공급원으로부터 기원하거나, 또는 동일 공급원으로부터 유래하는 경우 그의 원래 형태로부터 변형된 폴리펩티드 또는 아미노산 서열을 의미한다. 예컨대, 재조합 DNA 분절이 숙주 세포에서 발현되어 재조합 폴리펩티드를 생성할 수 있다.

"플라스미드", "벡터" 및 "카세트"라는 용어는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같은 그들의 일반적이고도 통상적인 의미에 따라 사용되는 것으로, 비제한적으로 종종 유전자를 보유하며 세포 중추 대사의 일부가 아니고 보통 원형의 이중-가닥 DNA 분자 형태인 염색체외 요소를 지칭하는 데에 사용된다. 그와 같은 요소는 수많은 뉴클레오티드 서열이 고유 구성으로 연결 또는 재조합되어 있으며 적절한 3' 비번역 서열과 함께 프로모터 단편 및 선택된 유전자 생성물의 DNA 서열을 세포에 도입할 수 있는, 임의 공급원 유래의 단일- 또는 이중-가닥 DNA 또는 RNA의 선형이거나 원형인 자가 복제 서열, 게놈 통합 서열, 파지 또는 뉴클레오티드 서열일 수 있다. "형질전환 카세트"는 외래 유전자를 포함하며 특정 숙주 세포의 형질전환을 촉진하는 외래 유전자 이외의 요소를 갖는 특정 벡터를 지칭한다. "발현 카세트"는 외래 유전자를 포함하며 외래 숙주에서의 그 유전자의 발현을 강화하는 외래 유전자 이외의 요소를 갖는 특정 벡터를 지칭한다.

본원에서 사용되는 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 관련 기술분야에 잘 알려져 있는 것으로, 예를 들어 그 각각의 전체가 그것이 이와 일치하는 정도까지 의거 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, N.Y., 1989] (이하 "문헌 [Maniatis]"); 및 [Silhavy, T.J., Bennan, M.L. and Enquist, L.W. Experiments with Gene Fusions; Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, N.Y., 1984]; 및 [Ausubel, F.M. et al., In Current Protocols in Molecular Biology, published by Greene Publishing and Wiley-Interscience, 1987]에 기술되어 있다.

본원에서 사용될 때, "합성인" 또는 "유기적으로 합성된" 또는 "화학적으로 합성된" 또는 "유기적으로 합성하는 것" 또는 "화학적으로 합성하는 것" 또는 "유기 합성" 또는 "화학 합성"은 일련의 화학 반응을 통하여 화합물을 제조하는 것을 지칭하는 데에 사용되는데; 예를 들어 천연 공급원으로부터 화합물을 추출하는 것이 여기에 포함되는 것은 아니다.

본원에서 사용될 때의 "경구 소비재 제품"이라는 용어는 입으로 들어가며 차후 그로부터 배출되는 물질, 및 마시거나, 먹거나, 삼키거나 또는 달리 섭취하는 물질을 포함하여, 사람 또는 동물의 입과 접촉되며; 일반적으로 허용가능한 범위의 농도로 사용될 때 인간 또는 동물 소비에 안전한 임의의 음료, 식품 제품, 식이 보충물, 기능식품, 제약 조성물, 치과 위생 조성물 및 화장품 제품을 지칭한다.

본원에서 사용될 때의 "식품 제품"이라는 용어는 과실, 야채, 주스, 고기 제품 예컨대 햄, 베이컨 및 소시지; 계란 제품, 과실 농축물, 젤라틴 및 젤라틴-유사 제품 예컨대 잼, 젤리, 보존식품 등; 유제품 예컨대 아이스크림, 발효 크림, 요구르트 및 셔벗; 아이싱, 당밀을 포함한 시럽; 옥수수, 밀, 호밀, 대두, 귀리, 쌀 및 보리 제품, 시리얼 제품, 견과류 고기 및 견과류 제품, 케이크, 쿠키, 과자류 예컨대 캔디, 검, 과실향 드로프스, 그리고 초콜릿, 츄잉검, 민트, 크림, 아이싱, 아이스크림, 파이 및 빵을 지칭한다. "식품 제품"은 또한 향신료 예컨대 허브, 양념 및 조미료, 향미 강화제, 예컨대 모노소듐 글루타메이트를 지칭한다. "식품 제품"은 또한 조제 포장 제품, 예컨대 식이용 감미제, 액체 감미제, 탁상용 향미제, 물과의 재구성시 비-탄산 음료를 제공하는 과립화된 향미 혼합물, 인스턴트 푸딩 혼합물, 인스턴트 커피 및 차, 커피 표백제, 맥아유 혼합물, 애완동물용 식품, 가축용 식품, 담배, 그리고 제빵 적용분야용 재료, 예컨대 빵, 쿠키, 케이크, 팬케이크, 도넛 등의 제조를 위한 분말화된 제빵 혼합물도 포함하여 지칭한다. "식품 제품"은 또한 수크로스를 적게 함유하거나 그것이 없는 다이어트 또는 저칼로리 식품 및 음료를 지칭한다.

본원에서 사용될 때, "입체이성질체"라는 용어는 공간에서의 해당 원자의 방향에 있어서만 서로 다른 개별 분자의 모든 이성질체에 대한 일반적인 용어이다. "입체이성질체"에는 거울상이성질체, 및 서로 거울상이 아닌 하나를 초과하는 키랄 중심을 갖는 화합물의 이성질체 (부분입체이성질체)가 포함된다.

본원에서 사용될 때, "무정형 레바우디오시드 D2"라는 용어는 레바우디오시드 D2의 비-결정질 고체 형태를 지칭한다.

본원에서 사용될 때, "단맛 강도"라는 용어는 개체 예컨대 인간에 의해 관찰 또는 경험되었을 때의 단 감각의 상대적인 강도, 또는 맛측정기 예를 들어 브릭스(Brix) 스케일에서 검출된 단맛의 정도 또는 양을 지칭한다.

본원에서 사용될 때, "단맛을 강화하는 것"이라는 용어는 레바우디오시드 D2를 함유하지 않는 상응하는 경구 소비재 제품과 비교하였을 때, 본 개시내용 음료 제품 또는 소비재 제품의 1종 이상 단맛 특징의 감각적 인지를 그의 특성 또는 품질은 변화시키지 않으면서 증가, 증대, 강화, 강조, 확대 및/또는 증진시키는 데에 있어서의 레바우디오시드 D2의 효과를 지칭한다.

본원에서 사용될 때, "이상한 맛(들)"이라는 용어는 본 개시내용의 음료 제품 또는 소비재 제품에서 특징적으로 또는 보통은 발견되지 않는 맛의 양 또는 정도를 지칭한다. 예를 들어, 이상한 맛은 소비자에게 바람직하지 않은 감미화된 소비재의 맛, 예컨대 쓴맛, 감초-유사 맛, 금속성 맛, 혐오스러운 맛, 수렴성의 맛, 지연된 단맛 개시, 오래가는 단 뒷맛 등이다.

본원에서 사용될 때, "w/v-%"라는 용어는 해당 화합물을 함유하는 본 개시내용 액체 경구 소비재 제품 100 ml마다의 당과 같은 화합물의 중량 (그램 단위)을 지칭한다. 본원에서 사용될 때, "w/w-%"라는 용어는 해당 화합물을 함유하는 본 개시내용 경구 소비재 제품 매 그램마다의 당과 같은 화합물의 중량 (그램 단위)을 지칭한다.

본원에서 사용될 때, "ppm"이라는 용어는 중량 기준 백만당 부(들), 예를 들어 해당 화합물을 함유하는 본 개시내용 경구 소비재 제품 킬로그램당 레바우디오시드 D2와 같은 화합물의 중량 (밀리그램 단위) (즉 mg/kg), 또는 해당 화합물을 함유하는 본 개시내용 경구 소비재 제품 리터당 레바우디오시드 D2와 같은 화합물의 중량 (밀리그램 단위) (즉 mg/L); 또는 부피를 기준으로 예를 들어 해당 화합물을 함유하는 본 개시내용 경구 소비재 제품 리터당 레바우디오시드 D2와 같은 화합물의 부피 (밀리리터 단위) (즉 ml/L)를 지칭한다.

본 개시내용에 따라, 무칼로리 감미제 및 무칼로리 감미제를 합성하는 방법이 개시된다. 또한, 본 개시내용에 따라, 무칼로리 감미제를 제조하기 위한 효소 및 효소의 사용 방법이 개시된다.

합성 무칼로리 감미제 : 합성 레바우디오시드 D2

한 측면에서, 본 개시내용은 합성 무칼로리 감미제에 관한 것이다. 합성 무칼로리 감미제는 합성 레바우디오시드-유형 스테비올 글리코시드로서, "레바우디오시드 D2"라는 명칭이 부여되었다. 하기 화학 구조 I에 도시되어 있는 바와 같이, 레바우디오시드 D2 ("Reb D2")는 스테비올 글리코시드인 레바우디오시드 D의 5개 글리코시드 잔기와 유사한 5개의 글리코시드 잔기를 갖는 스테비올 글리코시드이다.

<화학식 I>

레바우디오시드 D2는 C₅₀H₈₀O₂₈의 분자식 및 13-[(2-O-β-D-글루코피라노실-6-O-β-D-글루코피라노실-6-D-글루코피라노실)옥시]엔트-카우르-16-엔-19-산-(2-O-β-D-글루코피라노실-β-D-글루코피라노실) 에스테르의 IUPAC 명칭을 갖는다.

레바우디오시드 D2, 레바우디오시드 E 및 레바우디오시드 D의 화학 구조에 도시되어 있는 바와 같이, 레바우디오시드 D2 및 레바우디오시드 D는 구조 중 아글리콘 스테비올에 연결된 5개의 β-D-글루코실 단위를 갖는 반면, 레바우디오시드 E는 4개의 D-글리코시드 잔기를 포함한다 (예컨대 표 1 및 도 8 참조). 합성 레바우디오시드 D2는 스테비올 C19 위치의 2개 글리코시드 잔기 및 C13 위치의 3개 글리코시드 잔기를 포함한다. 비교하면, 레바우디오시드 D 역시 아글리콘 스테비올 C19 위치의 2개 글리코시드 잔기 및 C13 위치에 3개 글리코시드 잔기로서; 5개의 글리코시드 잔기를 포함한다. 레바우디오시드 D2의 제5 글리코시드 잔기 ("당 V")는 1,6 β 글리코시드 연결에 의해 Reb E의 C13 O-글루코스 C-6'에 위치하는 반면, 레바우디오시드 D의 제5 글리코시드 잔기 ("당 V")는 1,3 β 글리코시드 연결에 의해 Reb E의 C13 O-글루코스 C-3'에 위치한다 (도 8 참조). 그러나, 레바우디오시드 E는 C19 위치의 2개 글리코시드 잔기 및 C13 위치의 2개 글리코시드 잔기를 포함한다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니나, 5개 글리코시드 잔기 (레바우디오시드 D) 및 4개 글리코시드 잔기 (레바우디오시드 A 및 레바우디오시드 E)를 갖는 스테비올 글리코시드가 더 적은 글리코시드 잔기를 갖는 스테비올 글리코시드 (스테비오시드 및 루부소시드)에 비해 상당히 더 우수한 맛 품질을 갖는 것으로 여겨진다.

레바우디오시드 D2를 제조하는 방법

또 다른 측면에서, 본 개시내용은 레바우디오시드 E로부터 레바우디오시드 D2를 합성하는 방법에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 방법은 레바우디오시드 E; 수크로스, 우리딘 디포스페이트 (UDP) 및 우리딘 디포스페이트-글루코스 (UDP-글루코스)로 이루어진 군으로부터 선택되는 기질; 및 우리딘 디포스포 글리코실트랜스퍼라제, 및 수크로스 신타제 도메인에 커플링된 우리딘-디포스포 (UDP) 글리코실트랜스퍼라제 도메인을 포함하는 UDP-글리코실트랜스퍼라제 융합 효소 (EUS)로부터 선택되는 UDP-글리코실트랜스퍼라제를 포함하는 반응 혼합물을 제조하는 것; 및 레바우디오시드 D2를 생성하기에 충분한 시간 동안 반응 혼합물을 인큐베이션하는 것을 포함하며, 여기서 글루코스는 레바우디오시드 E에 공유 결합되어 레바우디오시드 D2를 생성한다.

특히 적합한 우리딘 디포스포 (UDP) 글리코실트랜스퍼라제는 예를 들어 EUGT11 (WO 2013022989호에 기술되어 있는 바와 같음)일 수 있다. EUGT11은 1,2-19-O-글루코스 및 1,2-13-O-글루코스 글리코실화 활성을 갖는 우리딘 5'-디포스페이트-의존성 글리코실 트랜스퍼라제 ("UGT")이다. EUGT11은 스테비오시드의 레바우디오시드 E로의, 그리고 레바우디오시드 A의 레바우디오시드 D로의 생성을 촉매하는 것으로 알려져 있다. 그러나 놀랍고도 예상밖으로, 우리딘 디포스포 (UDP) 글리코실트랜스퍼라제가 시험관 내에서 레바우디오시드 E를 레바우디오시드 D2로 전환하는 데에 사용될 수 있다는 것이 발견되었다.

적합한 우리딘 디포스포 글리코실트랜스퍼라제는 예를 들어 오리자 사티바(Oryza sativa) 우리딘 디포스포 글리코실트랜스퍼라제 EUGT11일 수 있다. 특히 적합한 우리딘 디포스포 글리코실트랜스퍼라제는 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 갖는다.

방법은 우리딘 디포스포 (UDP) 글리코실트랜스퍼라제를 함유하는 반응 혼합물에 수크로스 신타제를 첨가하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 우리딘 디포스포 글리코실트랜스퍼라제를 포함하는 반응 혼합물에의 수크로스 신타제의 첨가는 "UGT-SUS 커플링 시스템"을 생성한다. UGT-SUS 커플링 시스템에서는, UDP 및 수크로스로부터 UDP-글루코스가 재생될 수 있는데, 이는 반응 혼합물에의 추가 UDP-글루코스의 첨가를 생략하는 것, 또는 반응 혼합물에 UDP를 사용하는 것을 가능케 한다.

적합한 수크로스 신타제 도메인은 예를 들어 아라비돕시스(Arabidopsis) 수크로스 신타제 1; 아라비돕시스 수크로스 신타제 3 및 비그나 라디아테(Vigna radiate) 수크로스 신타제일 수 있다. 특히 적합한 수크로스 신타제 도메인은 예를 들어 아라비돕시스 수크로스 신타제 1일 수 있다. 특히 적합한 아라비돕시스 수크로스 신타제 1은 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 수크로스 신타제 1 (AtSUS1)이다. 특히 적합한 수크로스 신타제 1은 예를 들어 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 수크로스 신타제 1일 수 있다.

또 다른 실시양태에서는, UDP-글리코실트랜스퍼라제가 수크로스 신타제 도메인에 커플링된 우리딘 디포스포 글리코실트랜스퍼라제 도메인을 포함하는 UDP-글리코실트랜스퍼라제 융합 효소 (본원에서는 "EUS"로도 지칭됨)일 수 있다. UDP-글리코실트랜스퍼라제 융합 효소에 대해서는 하기에서 더 상세하게 기술된다.

반응에서, UDP-글리코실트랜스퍼라제 (예를 들어 EUGT11 및 EUS)는 1,6-13 O 글루코스 글리코실화 활성을 가지는데, 한 실시양태에서는 레바우디오시드 E로 글루코스 분자를 전달하여 레바우디오시드 D2를 형성할 수 있다. UDP-글리코실트랜스퍼라제 (예를 들어 EUGT11 및 EUS)는 또한 1,2-19 O-글루코스 및 1,2-13-O-글루코스 글리코실화 활성을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, UDP-글리코실트랜스퍼라제는 스테비오시드로 글루코스 분자를 전달하여 레바우디오시드 E를 형성할 수 있으며, 또한 레바우디오시드 A로 글루코스 분자를 전달하여 레바우디오시드 D를 형성할 수 있다. 또한, EUS 융합 효소는 수크로스 신타제 활성을 가지며, 이에 따라 UDP 및 수크로스로부터 UDP-글루코스를 재생시킬 수 있다.

특히 적합한 실시양태는 UGT-SUS 커플링 시스템을 사용하여 레바우디오시드 E로부터 레바우디오시드 D2를 제조하는 방법에 관한 것이다. 방법은 레바우디오시드 E; 수크로스; 우리딘 디포스페이트 (UDP); 우리딘 디포스포 글리코실트랜스퍼라제; 및 수크로스 신타제를 포함하는 반응 혼합물을 제조하는 것; 및 레바우디오시드 D2를 생성하기에 충분한 시간 동안 반응 혼합물을 인큐베이션하는 것을 포함하며, 여기서 글루코스는 레바우디오시드 E에 공유 결합되어 레바우디오시드 D2를 생성한다.

이와 같은 실시양태의 방법에서 사용하기에 적합한 UDP 글리코실트랜스퍼라제는 상기한 바와 같다. 이와 같은 실시양태의 방법에서 사용하기에 적합한 수크로스 신타제는 상기한 바와 같다.

또 다른 특히 적합한 실시양태는 수크로스 신타제 도메인에 커플링된 우리딘 디포스포 글리코실트랜스퍼라제 도메인을 포함하는 UDP-글리코실트랜스퍼라제 융합 효소를 사용하여 레바우디오시드 E로부터 레바우디오시드 D2를 제조하는 방법에 관한 것이다. 방법은 레바우디오시드 E; 수크로스; 우리딘 디포스페이트 (UDP); 및 수크로스 신타제 도메인에 커플링된 우리딘 디포스포 글리코실트랜스퍼라제 도메인을 포함하는 UDP-글리코실트랜스퍼라제 융합 효소를 포함하는 반응 혼합물을 제조하는 것; 및 레바우디오시드 D2를 생성하기에 충분한 시간 동안 반응 혼합물을 인큐베이션하는 것을 포함하며, 여기서 글루코스는 레바우디오시드 E에 공유 결합되어 레바우디오시드 D2를 생성한다.

특히 적합한 UDP-글리코실트랜스퍼라제 융합 효소에 대해서는 하기에서 더 상세하게 기술된다.

또 다른 측면에서, 본 개시내용은 스테비오시드로부터 레바우디오시드 D2를 합성하는 방법에 관한 것이다. 스테비오시드로부터 레바우디오시드 D2를 합성하는 방법은 스테비오시드; 수크로스, 우리딘 디포스페이트 (UDP) 및 우리딘 디포스페이트-글루코스 (UDP-글루코스)로 이루어진 군으로부터 선택되는 기질; 및 우리딘 디포스포 글리코실트랜스퍼라제, 및 수크로스 신타제 도메인에 커플링된 우리딘 디포스포 글리코실트랜스퍼라제 도메인을 포함하는 UDP-글리코실트랜스퍼라제 융합 효소로 이루어진 군으로부터 선택되는 UDP-글리코실트랜스퍼라제를 포함하는 반응 혼합물을 제조하는 것; 및 레바우디오시드 D2를 생성하기에 충분한 시간 동안 반응 혼합물을 인큐베이션하는 것을 포함하며, 여기서 글루코스는 스테비오시드에 공유 결합되어 레바우디오시드 E 중간체를 생성하고, 여기서 글루코스는 레바우디오시드 E 중간체에 공유 결합되어 레바우디오시드 D2를 생성한다.

먼저, 이와 같은 실시양태의 방법에서 사용하기 위한 UDP 글리코실트랜스퍼라제는 상기한 바와 같다. 상기한 바와 같이, 방법은 우리딘 디포스포 글리코실트랜스퍼라제를 함유하는 반응 혼합물에 수크로스 신타제를 첨가함으로써 UGT-SUS 커플링 시스템을 생성하는 것을 추가로 포함할 수 있다.

특히 적합한 실시양태는 UGT-SUS 커플링 시스템을 사용하여 스테비오시드로부터 레바우디오시드 D2를 제조하는 방법에 관한 것이다. 방법은 스테비오시드; 수크로스; 우리딘 디포스페이트 (UDP); 우리딘 디포스포 글리코실트랜스퍼라제; 및 수크로스 신타제를 포함하는 반응 혼합물을 제조하는 것; 및 레바우디오시드 D2를 생성하기에 충분한 시간 동안 반응 혼합물을 인큐베이션하는 것을 포함하며, 여기서 글루코스는 스테비오시드에 공유 결합되어 레바우디오시드 E 중간체를 생성하고, 여기서 글루코스는 레바우디오시드 E 중간체에 공유 결합되어 레바우디오시드 D2를 생성한다.

이와 같은 실시양태의 방법에서 사용하기에 적합한 UDP 글리코실트랜스퍼라제는 상기한 바와 같다. 이와 같은 실시양태의 방법에서 사용하기에 적합한 수크로스 신타제는 상기한 바와 같다.

또 다른 특히 적합한 실시양태는 수크로스 신타제 도메인에 커플링된 우리딘 디포스포 글리코실트랜스퍼라제 도메인을 포함하는 UDP-글리코실트랜스퍼라제 융합 효소을 사용하느여 스테비오시드로부터 레바우디오시드 D2를 제조하는 방법에 관한 것이다. 방법은 스테비오시드; 수크로스; 우리딘 디포스페이트 (UDP)로 이루어진 군으로부터 선택되는 기질; 및 수크로스 신타제 도메인에 커플링된 우리딘 디포스포 글리코실트랜스퍼라제 도메인을 포함하는 UDP-글리코실트랜스퍼라제 융합 효소를 포함하는 반응 혼합물을 제조하는 것; 및 레바우디오시드 D2를 생성하기에 충분한 시간 동안 반응 혼합물을 인큐베이션하는 것을 포함하며, 여기서 글루코스는 스테비오시드에 공유 결합되어 레바우디오시드 E 중간체를 생성하고, 여기서 글루코스는 레바우디오시드 E 중간체에 공유 결합되어 레바우디오시드 D2를 생성한다.

특히 적합한 UDP-글리코실트랜스퍼라제 융합 효소에 대해서는 하기에서 더 상세하게 기술된다.

UDP - 글리코실트랜스퍼라제 융합 효소

또 다른 측면에서, 본 개시내용은 UDP-글리코실트랜스퍼라제 융합 효소 (본원에서는 "EUS"로도 지칭됨)에 관한 것이다. 구체적으로, UDP-글리코실트랜스퍼라제 융합 효소는 수크로스 신타제 도메인에 커플링된 우리딘 디포스포 글리코실트랜스퍼라제 도메인을 포함한다. EUS 융합 효소는 1,2-19 O-글루코스 글리코실화 활성을 갖는다. 놀랍고도 예상밖으로, EUS 융합 효소는 레바우디오시드 E로 글루코스 분자를 전달하여 레바우디오시드 D2를 형성할 수 있는 1,6-13 O-글루코스 글리코실화 활성도 갖는다. 또한, EUS 융합 효소는 수크로스 신타제 활성을 가지며, 이에 따라 UDP 및 수크로스로부터 UDP-글루코스를 재생시킬 수 있다.

UDP-글리코실트랜스퍼라제 융합 효소는 서열식별번호: 5에 제시되어 있는 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 및 심지어 100% 동일한 폴리펩티드 서열을 가질 수 있다. 적합하게는, UDP-글리코실트랜스퍼라제 융합 효소의 아미노산 서열은 서열식별번호: 5에 대하여 적어도 80%의 동일성을 갖는다. 더욱 적합하게는, UDP-글리코실트랜스퍼라제 융합 효소의 아미노산 서열은 서열식별번호: 5에 제시되어 있는 아미노산 서열에 대하여 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 및 심지어 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는다.

또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본원에서 기술되는 UDP-글리코실트랜스퍼라제 융합 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 단리된 핵산에 관한 것이다. 예를 들어, 단리된 핵산은 서열식별번호: 6에 제시되어 있는 핵산 서열에 대하여 적어도 70%, 적어도 적어도 75%, 적어도 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 및 심지어 100%의 서열 상동성을 갖는 핵산 서열을 갖는 UDP-글리코실트랜스퍼라제 융합 효소의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 적합하게는, 단리된 핵산은 서열식별번호: 5에 제시되어 있는 아미노산 서열에 대하여 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 UDP-글리코실트랜스퍼라제 융합 효소의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 더욱 적합하게는, 단리된 핵산은 서열식별번호: 5에 제시되어 있는 아미노산 서열에 대하여 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 및 심지어 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 UDP-글리코실트랜스퍼라제 융합 효소의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 예컨대 단리된 핵산은 서열식별번호: 5의 기능적 단편, 서열식별번호: 5의 기능적 변이체, 또는 예를 들어 서열식별번호: 5에 대하여 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 및 심지어 100%의 서열 동일성을 갖는 다른 상동성 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 알려져 있는 바와 같이, UDP-글리코실트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산 서열은 예를 들어 세균 및 효모와 같은 적합한 숙주 생물체에서의 발현을 위하여 코돈 최적화될 수 있다.

적합한 우리딘 디포스포 글리코실트랜스퍼라제 도메인은 오리자 사티바 우리딘 디포스포 글리코실트랜스퍼라제 EUGT11 (진뱅크(GenBank) 수탁 번호 AC133334)일 수 있다. 특히 적합한 우리딘 디포스포 글리코실트랜스퍼라제 EUGT11은 예를 들어 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 우리딘 디포스포 글리코실트랜스퍼라제 EUGT11 도메인일 수 있다.

적합한 수크로스 신타제 도메인은 예를 들어 아라비돕시스 수크로스 신타제 1; 아라비돕시스 수크로스 신타제 3 및 비그나 라디아테 수크로스 신타제일 수 있다. 특히 적합한 수크로스 신타제 도메인은 예를 들어 아라비돕시스 수크로스 신타제 1일 수 있다. 특히 적합한 아라비돕시스 수크로스 신타제 1은 아라비돕시스 탈리아나 수크로스 신타제 1 (AtSUS1)이다. 특히 적합한 수크로스 신타제 1 도메인은 예를 들어 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 수크로스 신타제 1일 수 있다.

수크로스 신타제는 NDP 및 수크로스를 생성하는 NDP-글루코스와 D-프럭토스 사이의 화학 반응을 촉매한다. 수크로스 신타제는 글리코실트랜스퍼라제이다. 이와 같은 효소 클래스의 계통명은 NDP-글루코스:D-프럭토스 2-알파-D-글루코실트랜스퍼라제이다. 일반적으로 사용되는 다른 명칭으로는 UDP 글루코스-프럭토스 글루코실트랜스퍼라제, 수크로스 신타제, 수크로스-UDP 글루코실트랜스퍼라제, 수크로스-우리딘 디포스페이트 글루코실트랜스퍼라제 및 우리딘 디포스포글루코스-프럭토스 글루코실트랜스퍼라제가 포함된다.

레바우디오시드 D를 제조하는 방법

또 다른 측면에서, 본 개시내용은 레바우디오시드 D를 합성하는 방법에 관한 것이다. 방법은 레바우디오시드 A; 수크로스, 우리딘 디포스페이트 (UDP) 및 우리딘 디포스페이트-글루코스 (UDP-글루코스)로 이루어진 군으로부터 선택되는 기질; 및 우리딘 디포스포 글리코실트랜스퍼라제, 및 수크로스 신타제 도메인에 커플링된 우리딘 디포스포 글리코실트랜스퍼라제 도메인을 포함하는 UDP-글리코실트랜스퍼라제 융합 효소 (EUS)로 이루어진 군으로부터 선택되는 UDP-글리코실트랜스퍼라제를 포함하는 반응 혼합물을 제조하는 것; 및 레바우디오시드 D를 생성하기에 충분한 시간 동안 반응 혼합물을 인큐베이션하는 것을 포함하며, 여기서 글루코스는 레바우디오시드 A에 공유 결합되어 레바우디오시드 D를 생성한다.

UDP-글리코실트랜스퍼라제가 우리딘 디포스포 글리코실트랜스퍼라제인 실시양태에서, 적합한 우리딘 디포스포 글리코실트랜스퍼라제는 오리자 사티바 우리딘 디포스포 글리코실트랜스퍼라제 EUGT11 (진뱅크 수탁 번호 AC133334)일 수 있다. 특히 적합한 우리딘 디포스포 글리코실트랜스퍼라제는 예를 들어 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 우리딘 디포스포 글리코실트랜스퍼라제일 수 있다.

UDP-글리코실트랜스퍼라제가 우리딘 디포스포 글리코실트랜스퍼라제인 실시양태에서, 방법은 반응 혼합물에 수크로스 신타제를 첨가하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 수크로스 신타제는 예를 들어 아라비돕시스 수크로스 신타제 1; 아라비돕시스 수크로스 신타제 3 및 비그나 라디아테 수크로스 신타제일 수 있다. 특히 적합한 수크로스 신타제는 예를 들어 아라비돕시스 수크로스 신타제 1일 수 있다. 특히 적합한 아라비돕시스 수크로스 신타제 1은 아라비돕시스 탈리아나 수크로스 신타제 1 (AtSUS1)이다. 특히 적합한 수크로스 신타제 1은 예를 들어 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 수크로스 신타제 1일 수 있다.

UDP-글리코실트랜스퍼라제가 상기한 바와 같이 수크로스 신타제 도메인에 커플링된 우리딘 디포스포 글리코실트랜스퍼라제 도메인을 포함하는 UDP-글리코실트랜스퍼라제 융합 효소 (EUS)인 실시양태에서, 적합한 우리딘 디포스포 글리코실트랜스퍼라제 도메인은 오리자 사티바 우리딘 디포스포 글리코실트랜스퍼라제 EUGT11 (진뱅크 수탁 번호 AC133334)일 수 있다. 특히 적합한 우리딘 디포스포 글리코실트랜스퍼라제 도메인은 예를 들어 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 우리딘 디포스포 글리코실트랜스퍼라제 도메인일 수 있다. 특히 적합한 수크로스 신타제 1 도메인은 예를 들어 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 특히 적합한 UDP-글리코실트랜스퍼라제 융합 효소 (EUS)는 예를 들어 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 가질 수 있다.

특히 적합한 실시양태는 UGT-SUS 커플링 시스템을 사용하여 레바우디오시드 D를 합성하는 방법에 관한 것이다. 방법은 레바우디오시드 A; 수크로스; 우리딘 디포스페이트 (UDP); UDP-글리코실트랜스퍼라제; 및 수크로스 신타제를 포함하는 반응 혼합물을 제조하는 것; 및 레바우디오시드 D를 생성하기에 충분한 시간 동안 반응 혼합물을 인큐베이션하는 것을 포함하며, 여기서 글루코스는 레바우디오시드 A에 공유 결합되어 레바우디오시드 D를 생성한다.

이와 같은 실시양태의 방법에서 사용하기에 적합한 UDP 글리코실트랜스퍼라제는 상기한 바와 같다. 이와 같은 실시양태의 방법에서 사용하기에 적합한 수크로스 신타제는 상기한 바와 같다.

특히 적합한 실시양태는 UDP-글리코실트랜스퍼라제 융합 효소를 사용하여 레바우디오시드 D를 합성하는 방법에 관한 것이다. 방법은 레바우디오시드 A; 수크로스; 우리딘 디포스페이트 (UDP); 및 수크로스 신타제 도메인에 커플링된 우리딘 디포스포 글리코실트랜스퍼라제 도메인을 포함하는 UDP-글리코실트랜스퍼라제 융합 효소 (EUS)를 포함하는 반응 혼합물을 제조하는 것; 및 레바우디오시드 D를 생성하기에 충분한 시간 동안 반응 혼합물을 인큐베이션하는 것을 포함하며, 여기서 글루코스는 레바우디오시드 A에 공유 결합되어 레바우디오시드 D를 생성한다.

특히 적합한 UDP-글리코실트랜스퍼라제 융합 효소에 대해서는 상기에 더 상세하게 기술되어 있다.

경구 소비재 제품

또 다른 측면에서, 본 개시내용은 음료 제품 및 소비재 제품으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 감미량의 레바우디오시드 D2를 포함하는 경구 소비재 제품에 관한 것이다.

경구 소비재 제품은 약 1% (w/v-%) 내지 약 4% (w/v-%) 수크로스 용액과 동등한 단맛 강도를 가질 수 있다.

경구 소비재 제품은 약 5 ppm 내지 약 100 ppm의 레바우디오시드 D2를 포함할 수 있다.

레바우디오시드 D2는 경구 소비재 제품 내 유일한 감미제일 수 있다.

경구 소비재 제품은 또한 적어도 1종의 추가의 감미제를 포함할 수 있다. 적어도 1종의 추가의 감미제는 예를 들어 천연 고강도 감미제일 수 있다. 추가의 감미제는 스테비아 추출물, 스테비올 글리코시드, 스테비오시드, 레바우디오시드 A, 레바우디오시드 B, 레바우디오시드 C, 레바우디오시드 D, 레바우디오시드 E, 레바우디오시드 F, 둘코시드 A, 루부소시드, 스테비올비오시드, 수크로스, 고도 프럭토스 옥수수 시럽, 프럭토스, 글루코스, 크실로스, 아라비노스, 람노스, 에리트리톨, 크실리톨, 만니톨, 소르비톨, 이노시톨, AceK, 아스파르탐, 네오탐, 수크랄로스, 사카린, 나린진 디히드로칼콘 (NarDHC), 네오헤스페리딘 디히드로칼콘 (NDHC), 루부소시드, 모그로시드 IV, 시아메노시드 I, 모그로시드 V, 모나틴, 타우마틴, 모넬린, 브라제인, L-알라닌, 글리신, 로 한 구오, 헤르난둘신, 필로둘신, 트릴롭테인 및 이들의 조합으로부터 선택될 수 있다.

경구 소비재 제품은 또한 적어도 1종의 첨가제를 포함할 수 있다. 첨가제는 예를 들어 탄수화물, 폴리올, 아미노산 또는 그의 염, 폴리아미노산 또는 그의 염, 당 산 또는 그의 염, 뉴클레오티드, 유기 산, 무기 산, 유기 염, 유기 산 염, 유기 염기 염, 무기 염, 쓴맛 화합물, 향미제, 향미 성분, 수렴성 화합물, 단백질, 단백질 가수분해물, 계면활성제, 유화제, 플라보노이드, 알콜, 중합체 및 이들의 조합일 수 있다.

한 측면에서, 본 개시내용은 감미량의 레바우디오시드 D2를 포함하는 음료 제품에 관한 것이다.

음료 제품은 예를 들어 탄산 음료 제품 및 비-탄산 음료 제품일 수 있다. 음료 제품은 또한 예를 들어 청량 음료, 파운틴 음료, 냉동 음료; 즉석 음용 음료; 냉동 즉석 음용 음료, 커피, 차, 낙농 음료, 분말화 청량 음료, 액체 농축물, 착향수, 강화수, 과실 주스, 과실 주스 착향 음료, 스포츠 음료 및 에너지 음료일 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용의 음료 제품은 예를 들어 산미제, 과실 주스 및/또는 야채 주스, 펄프 등, 향미제, 착색제, 보존제, 비타민, 무기질, 전해질, 에리트리톨, 타가토스, 글리세린 및 이산화탄소와 같은 1종 이상의 음료 성분을 포함할 수 있다. 이와 같은 음료 제품은 음료 농축물, 및 탄산 즉석 음용 음료와 같은 임의의 적합한 형태로 제공될 수 있다.

특정 실시양태에서, 본 개시내용의 음료 제품은 수많은 상이한 구체적 조성 또는 구성 중 어느 것을 가질 수 있다. 본 개시내용 음료 제품의 조성은 제품의 예정 시장 부문, 그의 원하는 영양 특징, 항미 프로파일 등과 같은 인자에 따라 어느 정도까지 가변적일 수 있다. 예를 들어 특정 실시양태에서는, 일반적으로 특정 음료 제품의 조성에 추가의 성분을 첨가하는 것이 선택사항일 수 있다. 예를 들어, 추가의 (즉 더 많은 및/또는 다른) 감미제가 첨가될 수 있으며, 향미제, 전해질, 비타민, 과실 주스 또는 다른 과실 제품, 풍미제, 차단제 등, 향미 강화제, 및/또는 탄산화제가 전형적으로 맛, 식감, 영양 특징 등을 변화시키기 위하여 임의의 해당 조성에 첨가될 수 있다. 실시양태에서, 음료 제품은 물, 약 5 ppm 내지 약 100 ppm의 레바우디오시드 D2, 산미제 및 향미제를 함유하는 콜라 음료일 수 있다. 대표적인 향미제는 예를 들어 콜라 향미제, 감귤 향미제 및 양념 향미제일 수 있다. 일부 실시양태에서는, 거품발생을 위하여 이산화탄소 형태의 탄산화제가 첨가될 수 있다. 다른 실시양태에서는, 다른 성분, 제조 기술, 원하는 저장 수명 등에 따라 보존제가 첨가될 수 있다. 특정 실시양태에서는, 카페인이 첨가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 음료 제품은 특징적으로 탄산수, 감미제, 콜라 견과류 추출물 및/또는 다른 향미제, 캐러멜 착색제, 1종 이상의 산, 및 임의적으로 다른 성분을 함유하는 콜라-향미의 탄산 음료일 수 있다.

음료 제품 내에 존재하는 레바우디오시드 D2의 적합한 양은 예를 들어 약 5 ppm 내지 약 100 ppm일 수 있다. 일부 실시양태에서는, 예를 들어 100 ppm 미만인 저농도의 레바우디오시드 D2가 10,000 ppm 내지 30,000 ppm의 농도를 갖는 수크로스 용액과 동등한 단맛을 갖는다. 최종 농도는 약 5 ppm 내지 약 100 ppm, 약 5 ppm 내지 약 95 ppm, 약 5 ppm 내지 약 90 ppm, 약 5 ppm 내지 약 85 ppm, 약 5 ppm 내지 약 80 ppm, 약 5 ppm 내지 약 75 ppm, 약 5 ppm 내지 약 70 ppm, 약 5 ppm 내지 약 65 ppm, 약 5 ppm 내지 약 60 ppm, 약 5 ppm 내지 약 55 ppm, 약 5 ppm 내지 약 50 ppm, 약 5 ppm 내지 약 45 ppm, 약 5 ppm 내지 약 40 ppm, 약 5 ppm 내지 약 35 ppm, 약 5 ppm 내지 약 30 ppm, 약 5 ppm 내지 약 25 ppm, 약 5 ppm 내지 약 20 ppm, 약 5 ppm 내지 약 15 ppm 또는 약 5 ppm 내지 약 10 ppm의 범위이다. 대안적으로, 레바우디오시드 D2는 약 5 ppm 내지 약 100 ppm, 약 10 ppm 내지 약 100 ppm, 약 15 ppm 내지 약 100 ppm, 약 20 ppm 내지 약 100 ppm, 약 25 ppm 내지 약 100 ppm, 약 30 ppm 내지 약 100 ppm, 약 35 ppm 내지 약 100 ppm, 약 40 ppm 내지 약 100 ppm, 약 45 ppm 내지 약 100 ppm, 약 50 ppm 내지 약 100 ppm, 약 55 ppm 내지 약 100 ppm, 약 60 ppm 내지 약 100 ppm, 약 65 ppm 내지 약 100 ppm, 약 70 ppm 내지 약 100 ppm, 약 75 ppm 내지 약 100 ppm, 약 80 ppm 내지 약 100 ppm, 약 85 ppm 내지 약 100 ppm, 약 90 ppm 내지 약 100 ppm 또는 약 95 ppm 내지 약 100 ppm 범위인 최종 농도로 본 개시내용의 음료 제품 내에 존재할 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 개시내용은 감미량의 레바우디오시드 D2를 포함하는 소비재에 관한 것이다. 소비재는 예를 들어 식품 제품, 기능식품, 약제, 식이 보충물, 치과 위생 조성물, 식용 겔 조성물, 화장품 제품 및 탁상용 향미제일 수 있다.

본원에서 사용될 때, "식이 보충물(들)"은 식이를 보충하도록 예정된 화합물을 지칭하는 것으로, 식이에서 생략될 수 있거나 충분한 양으로 소비되지 않을 수 있는 비타민, 무기질, 섬유, 지방산, 아미노산 등과 같은 영양소를 제공한다. 관련 기술분야에 알려져 있는 어떠한 적합한 식이 보충물도 사용될 수 있다. 적합한 식이 보충물의 예는 예를 들어 영양소, 비타민, 무기질, 섬유, 지방산, 허브, 식물성 약품, 아미노산 및 대사물일 수 있다.

본원에서 사용될 때, "기능식품(들)"은 질환 또는 장애 (예컨대 피로, 불면증, 노화 효과, 기억 상실, 기분 장애, 심혈관 질환 및 높은 혈중 콜레스테롤 농도, 당뇨병, 골다공증, 염증, 자가면역 장애 등)의 예방 및/또는 치료를 포함한 의약적 또는 건강상의 이익을 제공할 수 있는 임의의 식품 또는 식품 일부를 포함하는 화합물을 지칭한다. 관련 기술분야에 알려져 있는 어떠한 적합한 기능식품도 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 기능식품은 식품 및 음료에 대한 보충물로서, 그리고 캡슐 또는 정제와 같은 고체 제제, 또는 용액 또는 현탁액과 같은 액체 제제일 수 있는 장내 또는 비경구 적용을 위한 제약 제제로서 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, 식이 보충물 및 기능식품은 보호용 수성콜로이드 (예컨대 검, 단백질, 변형된 전분), 결합제, 필름-형성제, 캡슐화 작용제/재료, 벽/셸 재료, 매트릭스 화합물, 코팅, 유화제, 표면 활성 작용제, 가용화제 (오일, 지방, 왁스, 레시틴 등), 흡착제, 담체, 충전제, 보조-화합물, 분산제, 습윤제, 가공 조제 (용매), 유동제, 맛-차단제, 증량제, 젤리화제, 겔-형성제, 항산화제 및 항미생물제를 추가로 함유할 수 있다.

본원에서 사용될 때, "겔"은 입자 네트워크가 액체 매체의 부피에 걸쳐 연장되는 콜로이드 시스템을 지칭한다. 겔이 주로 액체로 구성되며 그에 따라 액체와 유사한 밀도를 나타내기는 하지만, 겔은 액체 매체에 걸쳐 연장되는 입자 네트워크로 인하여 고체의 구조적 일관성을 갖는다. 이와 같은 이유로, 겔은 일반적으로 고체인 젤리-유사 물질인 것으로 보인다. 겔은 수많은 적용분야에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 겔은 식품, 페인트 및 접착제에 사용될 수 있다. 섭취될 수 있는 겔은 "식용 겔 조성물"로 지칭된다. 식용 겔 조성물은 전형적으로 스낵으로, 후식으로, 주식의 일부로, 또는 주식과 함께 섭취된다. 적합한 식용 겔 조성물의 예는 예를 들어 겔 후식, 푸딩, 잼, 젤리, 페이스트, 트라이플, 아스픽, 마시멜로, 검질 캔디 등일 수 있다. 일부 실시양태에서, 식용 겔 혼합물은 일반적으로 유체가 첨가되어 식용 겔 조성물을 형성할 수 있는 분말형 또는 과립형 고체이다. 적합한 유체의 예는 예를 들어 물, 낙농 유체, 낙농 유사물 유체, 주스, 알콜, 알콜성 음료 및 이들의 조합일 수 있다. 적합한 낙농 유체의 예는 예를 들어 우유, 배양 우유, 크림, 유장 및 이들의 혼합물일 수 있다. 적합한 낙농 유사물 유체의 예는 예를 들어 두유 및 비-낙농 커피 표백제일 수 있다.

본원에서 사용될 때, "겔화 성분"이라는 용어는 액체 매체 내에서 콜로이드 시스템을 형성할 수 있는 임의의 물질을 지칭한다. 적합한 겔화 성분의 예는 예를 들어 젤라틴, 알기네이트, 카라기난, 검, 펙틴, 곤약, 아가, 식품 산, 레닛, 전분, 전분 유도체 및 이들의 조합일 수 있다. 예를 들어 사용되는 구체적인 겔화 성분, 사용되는 구체적인 유체 기재 및 원하는 겔의 특성과 같은 수많은 인자에 따라 식용 겔 혼합물 또는 식용 겔 조성물에 사용되는 겔화 성분의 양이 상당히 가변적일 수 있다는 것은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다.

본 개시내용의 겔 혼합물 및 겔 조성물은 관련 기술분야에 알려져 있는 어떠한 적합한 방법에 의해서도 제조될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 식용 겔 혼합물 및 식용 겔 조성물은 레바우디오시드 D2 및 겔화제에 더하여 다른 성분을 사용하여 제조될 수 있다. 다른 적합한 성분의 예는 예를 들어 식품 산, 식품 산의 염, 완충 시스템, 증량제, 금속이온봉쇄제, 가교-결합제, 1종 이상의 향미, 1종 이상의 색상 및 이들의 조합일 수 있다.

관련 기술분야에 알려져 있는 어떠한 적합한 제약 조성물도 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 제약 조성물은 약 5 ppm 내지 약 100 ppm의 레바우디오시드 D2, 및 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 제약 조성물은 생물학적 효과를 제공하는 1종 이상의 활성 작용제를 함유하는 제약용 약물을 제제화하는 데에 사용될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 제약 조성물은 생물학적 효과를 제공하는 1종 이상의 활성 작용제를 함유할 수 있다. 적합한 활성 작용제에 대해서는 관련 기술분야에 잘 알려져 있다 (예컨대 문헌 [The Physician's Desk Reference]). 이와 같은 조성물은 관련 기술분야에 잘 알려져 있는 절차에 따라, 예를 들어 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., USA]에 기술되어 있는 바와 같이 제조될 수 있다.

레바우디오시드 D2는 관련 기술분야에 알려져 있는 임의의 적합한 치과 및 경구 위생 조성물과 함께 사용될 수 있다. 적합한 치과 및 경구 위생 조성물의 예는 예를 들어 치약, 치아 연마제, 치과용 치실, 구강세척제, 구강세정제, 치분, 구강 스프레이, 구강 리프레셔, 플라크 세정제, 치과용 통증 경감제 등일 수 있다.

소비재 중에 존재하는 레바우디오시드 D2의 적합한 양은 예를 들어 백만당 약 5 부 (ppm) 내지 백만당 약 100 부 (ppm)일 수 있다. 일부 실시양태에서는, 예를 들어 100 ppm 미만인 저농도의 레바우디오시드 D2가 10,000 ppm 내지 30,000 ppm의 농도를 갖는 수크로스 용액과 동등한 단맛을 갖는다. 최종 농도는 약 5 ppm 내지 약 100 ppm, 약 5 ppm 내지 약 95 ppm, 약 5 ppm 내지 약 90 ppm, 약 5 ppm 내지 약 85 ppm, 약 5 ppm 내지 약 80 ppm, 약 5 ppm 내지 약 75 ppm, 약 5 ppm 내지 약 70 ppm, 약 5 ppm 내지 약 65 ppm, 약 5 ppm 내지 약 60 ppm, 약 5 ppm 내지 약 55 ppm, 약 5 ppm 내지 약 50 ppm, 약 5 ppm 내지 약 45 ppm, 약 5 ppm 내지 약 40 ppm, 약 5 ppm 내지 약 35 ppm, 약 5 ppm 내지 약 30 ppm, 약 5 ppm 내지 약 25 ppm, 약 5 ppm 내지 약 20 ppm, 약 5 ppm 내지 약 15 ppm 또는 약 5 ppm 내지 약 10 ppm의 범위이다. 대안적으로, 레바우디오시드 D2는 약 5 ppm 내지 약 100 ppm, 약 10 ppm 내지 약 100 ppm, 약 15 ppm 내지 약 100 ppm, 약 20 ppm 내지 약 100 ppm, 약 25 ppm 내지 약 100 ppm, 약 30 ppm 내지 약 100 ppm, 약 35 ppm 내지 약 100 ppm, 약 40 ppm 내지 약 100 ppm, 약 45 ppm 내지 약 100 ppm, 약 50 ppm 내지 약 100 ppm, 약 55 ppm 내지 약 100 ppm, 약 60 ppm 내지 약 100 ppm, 약 65 ppm 내지 약 100 ppm, 약 70 ppm 내지 약 100 ppm, 약 75 ppm 내지 약 100 ppm, 약 80 ppm 내지 약 100 ppm, 약 85 ppm 내지 약 100 ppm, 약 90 ppm 내지 약 100 ppm 또는 약 95 ppm 내지 약 100 ppm 범위인 최종 농도로 본 개시내용의 소비재 제품 내에 존재할 수 있다.

특정 실시양태에서는, 약 5 ppm 내지 약 100 ppm의 레바우디오시드 D2가 식품 제품 조성물 중에 존재한다. 본원에서 사용될 때, "식품 제품 조성물(들)"은 반드시 그러한 것은 아니나 영양가를 가질 수 있으며 인간 및 동물에 의한 소비용으로 예정되는 임의의 고체 또는 액체 섭취가능 물질을 지칭한다.

적합한 식품 제품 조성물의 예는 예를 들어 과자류 조성물, 예컨대 캔디, 민트, 과실향 드로프스, 코코아 제품, 초콜릿 등; 향신료, 예컨대 케첩, 겨자, 마요네즈 등; 츄잉검; 시리얼 조성물; 제빵 상품, 예컨대 빵, 케이크, 파이, 쿠키 등; 낙농 제품, 예컨대 우유, 치즈, 크림, 아이스크림, 발효 크림, 요구르트, 셔벗 등; 탁상용 감미제 조성물; 수프; 스튜; 간편 식품; 고기, 예컨대 햄, 베이컨, 소시지, 육포 등; 젤라틴 및 젤라틴-유사 제품 예컨대 잼, 젤리, 보존식품 등; 과실; 야채; 계란 제품; 아이싱; 당밀을 포함한 시럽; 스낵; 견과류 고기 및 견과류 제품; 및 동물 사료일 수 있다.

식품 제품 조성물은 또한 허브, 양념 및 조미료, 천연 및 합성 향미, 및 향미 강화제, 예컨대 모노소듐 글루타메이트일 수 있다. 일부 실시양태에서, 식품 제품 조성물은 예를 들어 조제 포장 제품, 예컨대 식이용 감미제, 액체 감미제, 과립화된 향미 혼합물, 애완동물용 식품, 가축용 사료, 담배, 및 제빵 적용분야용 재료, 예컨대 빵, 쿠키, 케이크, 팬케이크, 도넛 등의 제조를 위한 분말화된 제빵 혼합물일 수 있다. 다른 실시양태에서, 식품 제품 조성물은 또한 수크로스를 적게 함유하거나 함유하지 않는 다이어트 및 저칼로리 식품 및 음료일 수 있다.

선행 실시양태 중 어느 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 레바우디오시드 D2는 유일한 감미제이며, 제품은 약 1% 내지 약 4% (w/v-%) 수크로스 용액과 동등한 단맛 강도를 갖는다. 선행 실시양태 중 어느 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서는, 소비재 제품 및 음료 제품이 추가의 감미제를 추가로 포함할 수 있으며, 약 1% 내지 약 10% (w/v-%) 수크로스 용액과 동등한 단맛 강도를 갖는다. 선행 실시양태 중 어느 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 제품 내 모든 감미 성분은 고강도 감미제이다. 선행 실시양태 중 어느 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 제품 내 모든 감미 성분은 천연 고강도 감미제일 수 있다. 선행 실시양태 중 어느 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 추가의 감미제는 스테비아 추출물, 스테비올 글리코시드, 스테비오시드, 레바우디오시드 A, 레바우디오시드 B, 레바우디오시드 C, 레바우디오시드 D, 레바우디오시드 F, 둘코시드 A, 루부소시드, 스테비올비오시드, 수크로스, 고도 프럭토스 옥수수 시럽, 프럭토스, 글루코스, 크실로스, 아라비노스, 람노스, 에리트리톨, 크실리톨, 만니톨, 소르비톨, 이노시톨, AceK, 아스파르탐, 네오탐, 수크랄로스, 사카린, 나린진 디히드로칼콘 (NarDHC), 네오헤스페리딘 디히드로칼콘 (NDHC), 루부소시드, 모그로시드 IV, 시아메노시드 I, 모그로시드 V, 모나틴, 타우마틴, 모넬린, 브라제인, L-알라닌, 글리신, 로 한 구오, 헤르난둘신, 필로둘신, 트릴롭테인 및 이들의 조합으로부터 선택되는 1종 이상의 감미제를 함유한다. 선행 실시양태 중 어느 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 소비재 제품 및 음료 제품은 탄수화물, 폴리올, 아미노산 또는 그의 염, 폴리-아미노산 또는 그의 염, 당 산 또는 그의 염, 뉴클레오티드, 유기 산, 무기 산, 유기 염, 유기 산 염, 유기 염기 염, 무기 염, 쓴맛 화합물, 향미제, 향미 성분, 수렴성 화합물, 단백질, 단백질 가수분해물, 계면활성제, 유화제, 플라보노이드, 알콜, 중합체 및 이들의 조합으로부터 선택되는 1종 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 선행 실시양태 중 어느 것과 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 레바우디오시드 D2는 제품에 그것이 첨가되기 전에, 중량 기준 약 50% 내지 약 100%의 순도를 갖는다.

감미제

또 다른 측면에서, 본 개시내용은 하기 화학 구조로 이루어진 감미제에 관한 것이다:

감미제는 충전제, 증량제 및 케이킹방지제 중 적어도 1종을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 충전제, 증량제 및 케이킹방지제에 대해서는 관련 기술분야에 알려져 있다.

특정 실시양태에서, 레바우디오시드 D2 감미제는 소비재 제품 및 음료 제품을 감미화하고/거나 그의 단맛을 강화하기에 충분한 최종 농도로 포함 및/또는 첨가될 수 있다. 레바우디오시드 D2의 "최종 농도"는 최종 소비재 제품 및 음료 제품 내에 존재하는 (즉 모든 성분 및/또는 화합물이 첨가되어 소비재 제품 및 음료 제품이 생성되고 난 후의) 레바우디오시드 D2의 농도를 지칭한다. 따라서, 특정 실시양태에서, 레바우디오시드 D2는 소비재 제품 및 음료 제품을 제조하는 데에 사용되는 화합물 또는 성분에 포함 및/또는 첨가된다. 레바우디오시드 D2는 단일 화합물 또는 성분으로, 또는 다수 화합물 및 성분 중에 존재할 수 있다. 다른 실시양태에서, 레바우디오시드 D2는 소비재 제품 및 음료 제품에 포함 및/또는 첨가된다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 레바우디오시드 D2는 약 5 ppm 내지 약 100 ppm, 약 5 ppm 내지 약 95 ppm, 약 5 ppm 내지 약 90 ppm, 약 5 ppm 내지 약 85 ppm, 약 5 ppm 내지 약 80 ppm, 약 5 ppm 내지 약 75 ppm, 약 5 ppm 내지 약 70 ppm, 약 5 ppm 내지 약 65 ppm, 약 5 ppm 내지 약 60 ppm, 약 5 ppm 내지 약 55 ppm, 약 5 ppm 내지 약 50 ppm, 약 5 ppm 내지 약 45 ppm, 약 5 ppm 내지 약 40 ppm, 약 5 ppm 내지 약 35 ppm, 약 5 ppm 내지 약 30 ppm, 약 5 ppm 내지 약 25 ppm, 약 5 ppm 내지 약 20 ppm, 약 5 ppm 내지 약 15 ppm 또는 약 5 ppm 내지 약 10 ppm의 범위인 최종 농도로 포함 및/또는 첨가된다. 대안적으로, 레바우디오시드 D2는 약 5 ppm 내지 약 100 ppm, 약 10 ppm 내지 약 100 ppm, 약 15 ppm 내지 약 100 ppm, 약 20 ppm 내지 약 100 ppm, 약 25 ppm 내지 약 100 ppm, 약 30 ppm 내지 약 100 ppm, 약 35 ppm 내지 약 100 ppm, 약 40 ppm 내지 약 100 ppm, 약 45 ppm 내지 약 100 ppm, 약 50 ppm 내지 약 100 ppm, 약 55 ppm 내지 약 100 ppm, 약 60 ppm 내지 약 100 ppm, 약 65 ppm 내지 약 100 ppm, 약 70 ppm 내지 약 100 ppm, 약 75 ppm 내지 약 100 ppm, 약 80 ppm 내지 약 100 ppm, 약 85 ppm 내지 약 100 ppm, 약 90 ppm 내지 약 100 ppm 또는 약 95 ppm 내지 약 100 ppm의 범위인 최종 농도로 포함 및/또는 첨가된다. 예를 들어, 레바우디오시드 D2는 해당 값 사이의 모든 범위를 포함하여, 약 5 ppm, 약 10 ppm, 약 15 ppm, 약 20 ppm, 약 25 ppm, 약 30 ppm, 약 35 ppm, 약 40 ppm, 약 45 ppm, 약 50 ppm, 약 55 ppm, 약 60 ppm, 약 65 ppm, 약 70 ppm, 약 75 ppm, 약 80 ppm, 약 85 ppm, 약 90 ppm, 약 95 ppm 또는 약 100 ppm의 최종 농도로 포함 및/또는 첨가될 수 있다.

특정 실시양태에서는, 레바우디오시드 D2가 소비재 제품 및 음료 제품에 포함 및/또는 첨가되는 유일한 감미제이다. 그와 같은 실시양태에서, 소비재 제품 및 음료 제품은 약 1% 내지 약 4% (w/v-%) 수크로스 용액, 약 1% 내지 약 3% (w/v-%) 수크로스 용액 또는 약 1% 내지 약 2% (w/v-%) 수크로스 용액과 동등한 단맛 강도를 갖는다. 대안적으로, 소비재 제품 및 음료 제품은 약 1% 내지 약 4% (w/v-%) 수크로스 용액, 약 2% 내지 약 4% (w/v-%) 수크로스 용액, 약 3% 내지 약 4% (w/v-%) 수크로스 용액 또는 약 4%와 동등한 단맛 강도를 갖는다. 예를 들어, 소비재 제품 및 음료 제품은 해당 값 사이의 모든 범위를 포함하여, 약 1%, 약 2%, 약 3% 또는 약 4% (w/v-%) 수크로스 용액과 동등한 단맛 강도를 가질 수 있다.

본 개시내용의 소비재 제품 및 음료 제품은 바람직한 단맛 강도, 영양 특징, 맛 프로파일, 식감 또는 다른 감각적인 인자를 달성하기에 충분한 비로 본 개시내용의 레바우디오시드 D2와 1종 이상 감미제의 혼합물을 포함할 수 있다.

하기의 비-제한적인 실시예를 고려하면, 본 개시내용이 더 완전하게 이해될 것이다.

실시예

실시예 1

본 실시예에서는, 모든 후보 UGT 유전자의 전체-길이 DNA 단편을 합성하였다.

구체적으로, cDNA를 이. 콜라이(E. coli) 발현용으로 코돈 최적화하였다 (진스크립트(Genscript), 뉴저지주 피스카타웨이 소재). 합성된 DNA는 세균 발현 벡터 pETite N-His SUMO Kan 벡터 (루시젠(Lucigen))에 클로닝하였다. UDP-글리코실트랜스퍼라제 융합 효소 (EUS)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 6 참조)의 경우, 오리자 사티바 우리딘 디포스포 글리코실트랜스퍼라제 (EUGT11) 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 2 참조)과 에이. 탈리아나 수크로스 신타제 1 (AtSUS1) 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 4 참조) 사이에 인 프레임으로 GSG-링커 (뉴클레오티드 서열 ggttctggt에 의해 코딩됨)를 삽입하였다. 표 2에 단백질 및 서열 식별자 번호를 요약하였다.

<표 2> 서열 식별 번호

각 발현 구성체를 이. 콜라이 BL21 (DE3)으로 형질전환시키고, 이후 그것을 50 μg/mL의 카나마이신을 함유하는 LB 배지에서 0.8-1.0의 OD₆₀₀에 도달할 때까지 37℃로 성장시켰다. 1 mM의 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드 (IPTG)의 첨가에 의해 단백질 발현을 유도한 후, 배양물을 16℃에서 22시간 동안 추가 성장시켰다. 원심분리 (3,000 x g; 10분; 4℃)에 의해 세포를 수확하였다. 세포 펠렛을 수집하여, 즉시 사용하거나 -80℃로 저장하였다.

세포 펠렛을 용해 완충제 (50 mM 칼륨 포스페이트 완충제, pH 7.2, 25 μg/ml 리소자임, 5 μg/ml DNase I, 20 mM 이미다졸, 500 mM NaCl, 10% 글리세롤, 및 0.4% 트리톤(TRITON) X-100) 중에 재-현탁하였다. 4℃에서의 초음파처리에 의해 세포를 붕괴시키고, 원심분리 (18,000 x g; 30분)에 의해 세포 잔사를 정화하였다. 상청액을 평형화된 (평형화 완충제: 50 mM 칼륨 포스페이트 완충제, pH 7.2, 20 mM 이미다졸, 500 mM NaCl, 10% 글리세롤) Ni-NTA (키아젠(Qiagen)) 친화성 컬럼에 적재하였다. 단백질 샘플의 적재 후, 평형화된 완충제를 사용하여 컬럼을 세척함으로써 비결합 오염물 단백질을 제거하였다. 250 mM 이미다졸을 함유하는 평형화 완충제에 의해 His-태그화된 UGT 재조합 폴리펩티드를 용리하였다. 정제 후, 재조합 EUGT11 단백질 (도 2a에 화살표로 표시되어 있는 62kD 밴드) 및 EUS 융합 효소 (도 2b에 화살표로 표시되어 있는 155kD 밴드)를 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 분자량 표준은 각 SDS-겔 영상의 좌측에 표시하였다.

실시예 2

본 실시예에서는, 레바우디오시드 A를 스테비올 글리코시드 기질로 사용하여 재조합 EUGT11 단백질 및 재조합 EUS 융합 효소를 1,2-19 O-글루코스 글리코실화 활성에 대하여 검정하였다.

200 μL 시험관내 반응 시스템에서 재조합 폴리펩티드 (10 μg)를 시험하였다. 반응 시스템은 50 mM의 칼륨 포스페이트 완충제, pH 7.2, 3 mM MgCl₂, 1 mg/ml의 스테비올 글리코시드 기질, 및 1 mM의 UDP-글루코스를 함유하였다. 30℃에서 반응을 수행하고, 200 μL의 1-부탄올을 첨가하는 것에 의해 종료하였다. 200 μL의 1-부탄올을 사용하여 샘플을 3회 추출하였다. 혼합수집 분획을 건조하고, 고-성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 분석을 위하여 70 μL의 80% 메탄올에 용해시켰다. 레바우디오시드 A (순도 99%)를 기질로 사용하였다. 레바우디오시드 A는 블루 캘리포니아(Blue California) (캘리포니아주 란초 산타 마르가리타 소재)로부터 구입하였다. 시험관내 반응을 14시간 및 24시간 동안 수행하였다. 도 3A는 비교를 위한 레바우디오시드 D ("Reb D"로 표지)의 피크를 나타낸다.

UGT 촉매된 글리코실화 반응을 수크로스 신타제 (예컨대 AtSUS1)에 의해 촉매되는 UDP-글루코스 생성 반응과 커플링시켰다 (본원에서는 "UGT-SUS 커플링 시스템"으로 지칭됨). 구체적으로, 아라비돕시스 탈리아나 수크로스 신타제 1 (AtSUS1) 서열 (문헌 [Bieniawska et al., Plant J. 2007, 49: 810-828])을 합성하여, 세균 발현 벡터에 삽입하였다. 재조합 AtSUS1 단백질을 발현시킨 후, 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다. AtSUS1 단백질을 EUGT11 단백질에 첨가함으로써, 본원에서 EUGT11-AtSUS1 커플링 시스템으로 지칭되는 시험관내 반응 혼합물을 형성하였다. 생성되는 UGT-SUS (예컨대 EUGT11-AtSUS1) 커플링 시스템에서는, 수크로스 및 UDP로부터 UDP-글루코스가 생성됨으로써, 추가 UDP-글루코스의 첨가가 생략되었다.

사원 펌프, 온도 조절 컬럼 구획, 자동 샘플러 및 UV 흡광도 검출기를 포함하는 디오넥스(Dionex) UPLC 얼티메이트(ultimate) 3000 시스템 (캘리포니아주 서니베일 소재)을 사용하여 HPLC 분석을 수행하였다. 스테비올 글리코시드의 특성화에는 가드 컬럼이 구비된 페노메넥스 루나(Phenomenex Luna) NH2, 150 x 3.0 mm, 3 ㎛ (100A)를 사용하였다. HPLC 분석에서의 등용매 용리에는 수중 72% 아세토니트릴을 사용하였다.

도 3에 나타낸 바와 같이, EUS 및 EUGT11은 모든 반응 조건에서 당 모이어티를 레바우디오시드 A로 전달하여 레바우디오시드 D를 생성하였다. 14시간 및 24시간의 인큐베이션 시간으로 EUS 융합 효소 (도 3B 및 3E) 및 UGT-SUS (즉 EUGT11-AtSUS1) 커플링 반응 시스템 (도 5D 및 5G)에 의해 레바우디오시드 A를 완전히 레바우디오시드 D로 전환시켰다. 그러나, EUGT11 효소 단독에 의한 14시간 (도 3C) 및 24시간 (도 3F)에서는 레바우디오시드 A가 부분적으로만 레바우디오시드 D로 전환되었다. 또한, 동일한 양의 EUS 분자는 EUGT11에 비해 더 높은 효소 활성을 가짐으로써, 14시간 (도 3B) 및 24시간 (도 3E)의 인큐베이션 시간에서 모든 레바우디오시드 A를 레바우디오시드 D로 전환시켰다. 이러한 결과는 UGT-SUS (즉 EUGT11-AtSUS1) 커플링 시스템의 반응이 EUS 융합 효소를 사용하여 달성될 수 있었음을 입증하고 있다. 또한, 이러한 결과는 EUGT11이 레바우디오시드 A로부터 레바우디오시드 D를 생성하는 1,2-19 O-글루코스 글리코실화 활성을 나타낸다는 것 (도 3C 및 3F), 그리고 AtSUS1이 UGT-SUS 커플링 시스템 중 EUGT11에 의한 전환 효율을 강화한다는 것 (도 3B, 3D, 3E 및 3G)을 입증하고 있다. 도 3A는 비교를 위한 스테비오시드 ("Ste"로 표지), 레바우디오시드 A ("Reb A"로 표지) 및 레바우디오시드 D ("Reb D"로 표지)의 피크를 보여준다.

실시예 3

본 실시예에서는, 실시예 2에서 기술된 바와 같이, 14시간 및 24시간의 인큐베이션 시간으로 스테비오시드를 스테비올 글리코시드 기질로 사용하여 EUGT11 및 EUS를 1,2-19 O-글루코스 글리코실화 활성에 대하여 검정하였다.

상기 실시예 2에서 논의된 바와 같은 EUGT11에 의한 레바우디오시드 A의 레바우디오시드 D로의 전환에 더하여, EUGT11은 스테비오시드를 레바우디오시드 E (도 4에 "Reb E"로 표지)로 전환시키기도 하였다. 놀랍게도, 모든 반응에서 EUGT11 및 EUS 둘 다에 의해 약 7.28분의 HPLC 체류 시간을 갖는 예상치 못한 화합물 레바우디오시드 D2 (도 4에 "Reb D2"로 표지)가 생성되었다. UGT-SUS 커플링 시스템을 생성하기 위하여 EUGT11 반응 혼합물에 AtSUS1이 첨가된 경우 (도 4D 및 4G) 및 EUS가 사용된 경우 (도 4B 및 4E)에는, 더 많은 레바우디오시드 D2가 생성되었다. 레바우디오시드 D2 생성의 증가에 따라, 생성된 레바우디오시드 E (도 4C 및 4F에 "Reb E"로 표지)는 레바우디오시드 D2의 생성 동안 소비되었다. 이러한 결과는 EUGT11이 레바우디오시드 E로부터 레바우디오시드 (레바우디오시드 D2)를 생성하는 반응을 촉매할 수 있다는 것을 나타낸다. 도 4A는 비교를 위한 스테비오시드 ("Ste"로 표지), 레바우디오시드 A ("Reb A"로 표지) 및 레바우디오시드 D ("Reb D"로 표지)의 피크를 보여준다.

실시예 4

본 실시예에서는, 시험관 내에서의 레바우디오시드 E의 레바우디오시드 D2로의 전환을 확인하기 위하여, 실시예 2에서 기술된 바와 같이 레바우디오시드 E를 스테비올 글리코시드 기질로 사용하여 EUGT11 및 EUS를 검정하였다.

비교를 위하여, 또 다른 UGT (UGT76G1)의 효소 활성도 검정하였다. 스테비아 유래의 UGT76G1은 당 잔기를 스테비오시드 C13 O-글루코스의 C-3'로 전달하여 레바우디오시드 A를 형성하는 효소로 확인되어 있다. 도 5F 및 5J에 나타낸 바와 같이, UGT-SUS 커플링 시스템에 UGT76G1이 사용된 경우, 당 잔기가 레바우디오시드 E의 C13 O-글루코스 C-3'로 전달됨으로써, 레바우디오시드 D가 형성되었다. 도 5A 및 5B는 비교를 위한 정제된 레바우디오시드 D ("Reb D") 및 레바우디오시드 E ("Reb-E")를 보여준다.

상기 실시예 3에서 논의되고 도 5C 및 5G에 나타낸 바와 같이, EUGT11 단독은 하나의 글루코스 분자를 레바우디오시드 E로 전달하여 레바우디오시드 D 및 E와 구별되는 (각각 도 5A 및 도 5B에서의 피크를 비교한다) 레바우디오시드 (이하 "레바우디오시드 D2"로 지칭되며, 도 5C 및 5G에서 "Reb D2"로 표지됨)를 형성할 수 있었다. UGT-SUS 커플링 시스템 (도 5D 및 5H) 및 EUS (도 5E 및 5I)에서의 EUGT11은 레바우디오시드 E로부터의 레바우디오시드 D2로의 전환을 강화하였다.

이러한 결과는 EUGT11이 관련 스테비올 글리코시드를 생성하는 1,2-19 O-글루코스 글리코실화 활성을 갖는 UGT라는 것을 입증하였다. EUGT11은 기질로서의 스테비오시드로부터 Reb-E를 생성하고 기질로서의 Reb A로부터 Reb D를 생성하는 반응을 촉매할 수 있다. 놀랍게도, 기질로서 스테비오시드를 사용한 시험관내 반응에서 예상치 못한 화합물 (Reb D2)이 합성되었다. 추가의 실험으로서, Reb D2가 Reb E로부터 바로 합성되었음이 확인되었다. Reb D2의 구조에 따르면, 시험관내 반응에서, EUGT11은 Reb-E의 C13 O-글루코스 C-6'에 D-글루코스를 전달하여 1,6-β-글리코시드 연결을 생성하였다.

실시예 5

본 실시예에서는, 확대된 시험관내 반응으로부터 레바우디오시드 (레바우디오시드 D2)를 정제하고, 액체 크로마토그래피/질량 분광측정법 (LC/MS) 및 핵 자기 공명 (NMR) 분석용으로 조제하였다.

확대된 시험관내 반응으로부터 레바우디오시드 (레바우디오시드 D2)를 정제하였다. 시험관내 반응은 HPLC 분석에 의해 모니터링하였다. 원하는 시점에, Reb D2 화합물을 컬럼에 의해 정제한 후, 진공 건조에 의해 농축하였다. 정제된 Reb D2는 95%의 순도를 갖는 백색의 분말이었다. 수집된 Reb D2 화합물을 고해상도 질량 스펙트럼 (HRMS) 분석에 사용하였다. 그의 해상도가 30k로 설정된 LTQ 오비트랩 디스커버리(Orbitrap Discovery) HRMS 기기를 사용하여 HRMS 데이터를 생성하고, 양이온 전기분무 모드로 m/z 150으로부터 1500까지 데이터를 스캐닝하였다. 바늘 전압은 4 kV로 설정하였으며; 다른 소스 조건은 시스 기체 = 25, 옥스 기체 = 0, 스윕 기체 = 5 (모든 기체는 임의의 단위도 유동함), 모세관 전압 = 30 V, 모세관 온도 = 300℃ 및 튜브 렌즈 전압 = 75이었다. 샘플을 2:2:1 아세토니트릴:메탄올:물 (주입 용리액과 동일)과 희석한 후, 50 마이크로리터의 샘플을 주사하였다. 핵 자기 공명 (NMR) 스펙트럼은 브루커 어밴스(Bruker Avance) DRX 500 MHz 기기 또는 바리안 이노바(Varian INOVA) 600 MHz 기기를 사용하고 표준 펄스 시퀀스를 사용하여 수득하였다. 피리딘-d5 (C₅D₅N으로도 알려져 있음)에서 1D (¹H 및 ¹³C) 및 2D (TOCSY, HMQC 및 HMBC) NMR 스펙트럼을 수행하였다.

Reb D2의 분자식은 각각 m/z 1146.5169 및 1151.4721에서 [M+ NH4]⁺ 및 [M+ Na]⁺에 상응하는 부가물 이온을 나타낸 해당 양성 고해상도 질량 스펙트럼 (HRMS)을 바탕으로, C₅₀H₈₀O₂₈로 추론되었는데; 이와 같은 조성은 ¹³C NMR 스펙트럼 데이터에 의해서도 뒷받침되었다. Reb D2의 ¹H NMR 스펙트럼 데이터는 스테비아 속으로부터 단리되는 엔트-카우란 디테르페노이드의 특징인 δ 1.10 및 1.44에서의 2개 메틸 단일선, 고리외 이중 결합의 δ 5.09 및 5.72에서의 단일선으로서의 2개의 올레핀계 양성자, δ 0.74-2.80 사이에서의 9개의 sp3 메틸렌 및 2개의 sp3 메틴 양성자의 존재를 나타내었다.

엔트-카우란 디테르페노이드의 기본 골격은 TOCSY 연구에 의해 뒷받침되었는데, 하기의 핵심 상관관계를 나타내었다: H-1/H-2; H-2/H-3; H-5/H-6; H-6/H-7; H-9/H-11; H-11/H-12. Reb D2의 ¹H NMR 스펙트럼 역시 δ 5.04, 5.10, 5.21, 5.48 및 6.30에서 공명하는 아노머 양성자의 존재를 나타냄으로써, 그의 구조에서의 5개 당 단위를 암시하였다. 5% H₂SO₄를 사용한 Reb D2의 산 가수분해는 TLC에 의한 실제 샘플과의 직접 비교에 의해 확인된 D-글루코스를 산출하였다. δ 5.04 (d, J=7.5 Hz), 5.10 (d, J=7.4 Hz), 5.21 (d, J=7.9 Hz), 5.48 (d, J=7.9 Hz) 및 6.30 (d, J=7.9 Hz)에서의 글루코스 모이어티의 5개 아노머 양성자에 대하여 관찰된 커다란 커플링 상수는 다른 스테비올 글리코시드에 대하여 보고된 바와 같은 그의 β-배향을 암시하였다. Reb D2의 ¹H 및 ¹³C NMR 값을 TOCSY, HMQC 및 HMBC 데이터를 바탕으로 할당하고, 표 3에 요약하였다.

<표 3> Reb D2 및 Reb E의 ¹H 및 ¹³C NMR 값

방대한 1D (¹H 및 ¹³C), 2D NMR (TOCSY, HMQC 및 HMBC) 및 고해상도 질량 스펙트럼 (HRMS) 데이터를 바탕으로, Reb D2의 구조를 확인하고, 레바우디오시드 E의 구조와 비교하였다 (도 6 참조).

Reb D2의 NMR 스펙트럼 데이터 및 가수분해 실험 결과를 바탕으로, 아글리콘 스테비올에 연결된 그의 구조 내에는 5개의 β-D-글루코실 단위가 존재하는 것으로 결론이 지어졌다. Reb D2의 레바우디오시드 E와의 ¹H 및 ¹³C NMR 값의 정밀 비교 (표 2 참조)는 추가의 β-D-글루코실 단위의 할당을 제외한 에테르 연결의 형태인 C13의 2-O-β-D-글루코비오실 단위, 및 에스테르 연결의 형태인 C19 위치의 또 다른 2-O-β-D-글루코비오실 단위를 갖는 스테비올 아글리콘 모이어티의 존재를 암시하였다. 또한, 당 모이어티의 5개 옥시메틴 탄소 중 1개가 δ 69.8의 다운필드에서 출현한다는 것을 보여준 Reb D2의 ¹³C NMR 스펙트럼 데이터는 이 위치에서의 추가의 β-D-글루코실 단위의 배치를 암시하였다. Reb D2 및 Reb E에서의 2개 당 I 및 IV에 있어서의 동일한 양성자 및 탄소 스펙트럼 데이터는 당 II 또는 당 III 중 어느 하나의 6-위치에서의 추가의 β-D-글루코실 단위의 배치를 암시하였다. β-D-글루코실 모이어티의 당 II의 6-위치에서의 ¹H 및 ¹³C 화학 이동 둘 다의 다운필드 이동은 추가의 β-D-글루코실 단위가 이 위치에 결합되어 있음을 암시하였다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 핵심 TOCSY 및 HMBC 상관관계에 의해 추가로 상기 구조가 뒷받침되었다.

NMR 및 질량 스펙트럼 데이터는 물론 가수분해 연구의 결과를 바탕으로, 레바우디오시드 E의 효소 전환에 의해 생성되는 Reb D2의 구조는 13-[(2-O-β-D-글루코피라노실-6-O-β-D-글루코피라노실-β-D-글루코피라노실)옥시]엔트-카우르-16-엔-19-산-(2-O-β-D-글루코피라노실-β-D-글루코피라노실) 에스테르로 추론되었다.

13-[(2-O-β-D-글루코피라노실-6-O-β-D-글루코피라노실-β-D-글루코피라노실)옥시]엔트-카우르-16-엔-19-산-(2-O-β-D-글루코피라노실-β-D-글루코피라노실) 에스테르 (Reb D2). 백색 분말; ¹H-NMR (600 MHz, C₅D₅N, δ ppm) 및 ¹³C-NMR (150 MHz, C₅D₅N, δ ppm) 분광법 데이터는 표 2 참조; HRMS (M+NH₄)⁺ m/z 1146.5169 (C₅₀H₈₄O₂₈N의 계산치: 1146.5180), (M+Na)⁺ m/z 1151.4721 (C₅₀H₈₀O₂₈Na의 계산치: 1151.4734).

MeOH (10 ml) 중 Reb D2 (5 mg)의 용액에, 3 ml의 5% H₂SO₄를 첨가하고, 혼합물을 24시간 동안 환류시켰다. 다음에, 반응 혼합물을 포화 소듐 카르보네이트로 중화하고, 에틸 아세테이트 (EtOAc) (2 x 25 ml)로 추출함으로써, 당을 함유하는 수성 분획 및 아글리콘 부분을 함유하는 EtOAc 분획을 생성하였다. 수성 상을 농축하고, TLC 시스템 EtOAc/n-부탄올/물 (2:7:1) 및 CH₂Cl₂/MeOH/물 (10:6:1)을 사용하여 표준 당과 비교하였는데; 당은 D-글루코스로 확인되었다.

Reb D2의 구조는 방대한 1D (¹H 및 ¹³C) 및 2D NMR (TOCSY, HMQC 및 HMBC)은 물론 고해상도 질량 스펙트럼 데이터 및 가수분해 연구를 바탕으로 13-[(2-O-β-D-글루코피라노실-6-O-β-D-글루코피라노실-β-D-글루코피라노실)옥시]엔트-카우르-16-엔-19-산-(2-O-β-D-글루코피라노실-β-D-글루코피라노실) 에스테르로 확인되었다.

실시예 6

본 실시예에서는, 레바우디오시드 (레바우디오시드 D2)의 구조를 Reb-E 및 Reb-D와 비교하였다.

스테비올 글리코시드 데이터베이스에 따르면, Reb-D만이 아글리콘 스테비올 C19 위치의 2개 글리코시드 잔기 및 C13 위치의 3개 글리코시드 잔기로서 아글리콘 스테비올에 연결된 그의 구조 내에 5개의 β-D-글루코실 단위를 포함한다. 스테비아 유래의 UGT76G1은 당 잔기를 Reb E C13 O-글루코스의 C-3'로 전달하여 레바우디오시드 D를 형성하는 효소로 확인되어 있다 (도 5F 및 5J 참조). Reb D2는 레바우디오시드 D와 비교하였을 때 상이한 구조로 역시 5개의 D-글리코시드 잔기를 포함하는 스테비올 글리코시드이다 (도 8 참조). 레바우디오시드 D2의 제5 글리코시드 잔기 ("당 V")는 1,6 β 글리코시드 연결에 의해 Reb E C-13-O 글루코스의 C-6'에 위치하는 반면, 레바우디오시드 D의 제5 글리코시드 잔기 ("당 V")는 1,3 β 글리코시드 연결에 의해 Reb E C13 O-글루코스의 C-3'에 위치한다 (도 8 참조). 본원에서 기술되는 바와 같이, EUGT11 및 EUG 둘 다는 시험관 내에서 Reb E를 바로 Reb D2로 전환시킬 수 있다.

실시예 7

본 실시예에서는, Reb D2에 대하여 맛 시험을 수행하였다.

수크로스를 대조로 사용하여 Reb D2의 감각 평가를 수행하였다. 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)로부터 수크로스 샘플을 구매하여 실온에서 병에 담긴 물 중 1.0%, 3.0% 및 6.0% 수크로스 (w/v)인 3종의 상이한 농도로 대조 샘플을 제조하였다. 1000 mL의 병에 담긴 물에 상응하는 질량을 첨가하는 것에 의해, 감각 평가를 위한 300 및 600 ppm의 스테비올 글리코시드 Reb D2를 제조하였다. 혼합물을 실온에서 교반한 다음, 지원자 9명의 패널에 의해 1.0%, 3.0% 및 6.0%인 몇 가지 대조 수크로스 샘플에 대비하여 스테비올 글리코시드 샘플을 평가하였다.

맹검 결과는 Reb D2의 2종의 상이한 농도 (300 및 600 ppm)에서 9명 지원자 대부분 사이에 일관되는 결과를 나타내었는데; 전체 % 단맛 당량 (SE) 평균이 각각 약 2.4 및 5.4이었다. 결과는 레바우디오시드 D2가 수크로스에 비해 약 80-90배 더 달다는 것을 나타낸다.

실시예 8

본 실시예에서는, Reb D2의 용해도를 Reb D와 비교하였다.

Reb D2 및 Reb D를 물에 첨가하여, 0.25 mM, 0.5 mM, 1 mM, 1.5 mM, 2 mM, 5 mM 및 10 mM의 Reb D2 및 Reb D를 포함하는 용액을 제조하였다. Reb D2 분말은 즉시 물에 완전히 용해되었으나, 0.25 mM Reb D만이 전체적으로 물에 용해되었다. 또한, 30℃로 72시간 동안 가열하였을 때, 0.5 mM, 1 mM, 1.5 mM, 2 mM, 5 mM 및 10 mM 농도의 Reb D 용액은 용해되지 않았다.

이러한 결과는 Reb D2가 Reb D에 비해 물에서 더 높은 용해도를 갖는다는 것을 입증하고 있다.

상기로 볼 때, 본 개시내용의 몇 가지 장점이 달성되었으며, 다른 유리한 결과가 도출되었음을 알 수 있다. 본 개시내용의 영역에서 벗어나지 않고도 상기 방법 및 시스템에서 다양한 변화가 이루어질 수 있으므로, 상기 상세한 설명에 포함되며 첨부 도면에 나타나 있는 모든 것들은 제한하는 의미가 아니라 예시적인 것으로 해석되어야 하는 것으로 하고자 한다.

본 개시내용의 요소 또는 그의 다양한 버전, 실시양태(들) 또는 측면을 소개할 때, 단수 용어 및 "상기"는 하나 이상의 요소가 존재함을 의미하고자 하는 것이다. "포함하는", "포함되는" 및 "갖는"이라는 용어는 포괄적인 것으로 의도되는 것으로, 열거된 요소가 아닌 다른 추가의 요소가 존재할 수 있음을 의미한다.

SEQUENCE LISTING <110> Conagen, Inc. Mao, Guohong Chaturvedula, Venkata Sai Prakash Yu, Oliver <120> A NON-CALORIC SWEETENER <130> P237740EP <140> PCT/US2015/029163 <141> 2015-04-05 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 462 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 Met Asp Ser Gly Tyr Ser Ser Ser Tyr Ala Ala Ala Ala Gly Met His 1 5 10 15 Val Val Ile Cys Pro Trp Leu Ala Phe Gly His Leu Leu Pro Cys Leu 20 25 30 Asp Leu Ala Gln Arg Leu Ala Ser Arg Gly His Arg Val Ser Phe Val 35 40 45 Ser Thr Pro Arg Asn Ile Ser Arg Leu Pro Pro Val Arg Pro Ala Leu 50 55 60 Ala Pro Leu Val Ala Phe Val Ala Leu Pro Leu Pro Arg Val Glu Gly 65 70 75 80 Leu Pro Asp Gly Ala Glu Ser Thr Asn Asp Val Pro His Asp Arg Pro 85 90 95 Asp Met Val Glu Leu His Arg Arg Ala Phe Asp Gly Leu Ala Ala Pro 100 105 110 Phe Ser Glu Phe Leu Gly Thr Ala Cys Ala Asp Trp Val Ile Val Asp 115 120 125 Val Phe His His Trp Ala Ala Ala Ala Ala Leu Glu His Lys Val Pro 130 135 140 Cys Ala Met Met Leu Leu Gly Ser Ala His Met Ile Ala Ser Ile Ala 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Arg Ile Glu Glu Lys Tyr Thr 1205 1210 1215 Trp Gln Ile Tyr Ser Gln Arg Leu Leu Thr Leu Thr Gly Val Tyr 1220 1225 1230 Gly Phe Trp Lys His Val Ser Asn Leu Asp Arg Leu Glu Ala Arg 1235 1240 1245 Arg Tyr Leu Glu Met Phe Tyr Ala Leu Lys Tyr Arg Pro Leu Ala 1250 1255 1260 Gln Ala Val Pro Leu Ala Gln Asp Asp 1265 1270 <210> 6 <211> 3819 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 6 atggattcgg gttactcttc ctcctatgcg gcggctgcgg gtatgcacgt tgttatctgt 60 ccgtggctgg cttttggtca cctgctgccg tgcctggatc tggcacagcg tctggcttca 120 cgcggccatc gtgtcagctt cgtgtctacc ccgcgcaata tttcgcgtct gccgccggtt 180 cgtccggcac tggctccgct ggttgcattt gtcgctctgc cgctgccgcg cgtggaaggt 240 ctgccggatg gtgcggaaag taccaacgac gtgccgcatg atcgcccgga catggttgaa 300 ctgcaccgtc gtgcattcga tggtctggca gcaccgtttt ccgaatttct gggtacggcg 360 tgcgccgatt gggtgatcgt tgacgtcttt catcactggg cggcggcggc ggcgctggaa 420 cataaagttc cgtgtgcaat gatgctgctg ggctcagctc acatgattgc gtcgatcgca 480 gaccgtcgcc tggaacgtgc agaaaccgaa 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ttcagcaact gcgctcctac 1380 aaagacggtt ctggtgcaaa cgctgaacgt atgataacgc gcgtccacag ccaacgtgag 1440 cgtttgaacg aaacgcttgt ttctgagaga aacgaagtcc ttgccttgct ttccagggtt 1500 gaagccaaag gtaaaggtat tttacaacaa aaccagatca ttgctgaatt cgaagctttg 1560 cctgaacaaa cccggaagaa acttgaaggt ggtcctttct ttgaccttct caaatccact 1620 caggaagcaa ttgtgttgcc accatgggtt gctctagctg tgaggccaag gcctggtgtt 1680 tgggaatact tacgagtcaa tctccatgct cttgtcgttg aagaactcca acctgctgag 1740 tttcttcatt tcaaggaaga actcgttgat ggagttaaga atggtaattt cactcttgag 1800 cttgatttcg agccattcaa tgcgtctatc cctcgtccaa cactccacaa atacattgga 1860 aatggtgttg acttccttaa ccgtcattta tcggctaagc tcttccatga caaggagagt 1920 ttgcttccat tgcttaagtt ccttcgtctt cacagccacc agggcaagaa cctgatgttg 1980 agcgagaaga ttcagaacct caacactctg caacacacct tgaggaaagc agaagagtat 2040 ctagcagagc ttaagtccga aacactgtat gaagagtttg aggccaagtt tgaggagatt 2100 ggtcttgaga ggggatgggg agacaatgca gagcgtgtcc ttgacatgat acgtcttctt 2160 ttggaccttc ttgaggcgcc tgatccttgc actcttgaga cttttcttgg aagagtacca 2220 atggtgttca acgttgtgat cctctctcca catggttact ttgctcagga caatgttctt 2280 ggttaccctg acactggtgg acaggttgtt tacattcttg atcaagttcg tgctctggag 2340 atagagatgc ttcaacgtat taagcaacaa ggactcaaca ttaaaccaag gattctcatt 2400 ctaactcgac ttctacctga tgcggtagga actacatgcg gtgaacgtct cgagagagtt 2460 tatgattctg agtactgtga tattcttcgt gtgcccttca gaacagagaa gggtattgtt 2520 cgcaaatgga tctcaaggtt cgaagtctgg ccatatctag agacttacac cgaggatgct 2580 gcggttgagc tatcgaaaga attgaatggc aagcctgacc ttatcattgg taactacagt 2640 gatggaaatc ttgttgcttc tttattggct cacaaacttg gtgtcactca gtgtaccatt 2700 gctcatgctc ttgagaaaac aaagtacccg gattctgata tctactggaa gaagcttgac 2760 gacaagtacc atttctcatg ccagttcact gcggatattt tcgcaatgaa ccacactgat 2820 ttcatcatca ctagtacttt ccaagaaatt gctggaagca aagaaactgt tgggcagtat 2880 gaaagccaca cagcctttac tcttcccgga ttgtatcgag ttgttcacgg gattgatgtg 2940 tttgatccca agttcaacat tgtctctcct ggtgctgata tgagcatcta cttcccttac 3000 acagaggaga agcgtagatt gactaagttc cactctgaga tcgaggagct cctctacagc 3060 gatgttgaga acaaagagca cttatgtgtg ctcaaggaca agaagaagcc gattctcttc 3120 acaatggcta ggcttgatcg tgtcaagaac ttgtcaggtc ttgttgagtg gtacgggaag 3180 aacacccgct tgcgtgagct agctaacttg gttgttgttg gaggagacag gaggaaagag 3240 tcaaaggaca atgaagagaa agcagagatg aagaaaatgt atgatctcat tgaggaatac 3300 aagctaaacg gtcagttcag gtggatctcc tctcagatgg accgggtaag gaacggtgag 3360 ctgtaccggt acatctgtga caccaagggt gcttttgtcc aacctgcatt atatgaagcc 3420 tttgggttaa ctgttgtgga ggctatgact tgtggtttac cgactttcgc cacttgcaaa 3480 ggtggtccag ctgagatcat tgtgcacggt aaatcgggtt tccacattga cccttaccat 3540 ggtgatcagg ctgctgatac tcttgctgat ttcttcacca agtgtaagga ggatccatct 3600 cactgggatg agatctcaaa aggagggctt cagaggattg aggagaaata cacttggcaa 3660 atctattcac agaggctctt gacattgact ggtgtgtatg gattctggaa gcatgtctcg 3720 aaccttgacc gtcttgaggc tcgccgttac cttgaaatgt tctatgcatt gaagtatcgc 3780 ccattggctc aggctgttcc tcttgcacaa gatgattga 3819

Claims (103)

1. 하기 화학식 I의 합성 레바우디오시드.
   [화학식 I]
   

   
2. (I) (a) 레바우디오시드 E;
   (b) 수크로스, 우리딘 디포스페이트 (UDP) 및 우리딘 디포스페이트-글루코스 (UDP-글루코스)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 기질; 및
   (c) (i) UDP-글리코실트랜스퍼라제,
   (ii) 반응 혼합물에 개별적으로 첨가되는 UDP-글리코실트랜스퍼라제 및 수크로스 신타제, 및
   (iii) 수크로스 신타제 도메인에 커플링된 UDP-글리코실트랜스퍼라제 도메인을 포함하는 UDP-글리코실트랜스퍼라제 융합 효소
   중 1종
   을 포함하는 반응 혼합물을 제조하는 것;
   (II) 원하는 레바우디오시드를 생성하도록 반응 혼합물을 인큐베이션하며, 여기서 글루코스는 레바우디오시드 E에 공유 결합되어 화학식 I의 레바우디오시드를 생성하는 것; 및
   (III) 감미제로서 사용하기 위한 화학식 I의 레바우디오시드를 수득하는 것
   을 포함하는, 감미제로서 사용하기 위한 제1항에 청구된 바와 같은 레바우디오시드를 제조하는 방법.
3. (I) (a) 스테비오시드;
   (b) 수크로스, 우리딘 디포스페이트 (UDP) 및 우리딘 디포스페이트-글루코스 (UDP-글루코스)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 기질; 및
   (c) (i) UDP-글리코실트랜스퍼라제,
   (ii) 반응 혼합물에 개별적으로 첨가되는 UDP-글리코실트랜스퍼라제 및 수크로스 신타제, 및
   (iii) 수크로스 신타제 도메인에 커플링된 UDP-글리코실트랜스퍼라제 도메인을 포함하는 UDP-글리코실트랜스퍼라제 융합 효소
   중 1종
   을 포함하는 반응 혼합물을 제조하는 것;
   (II) 원하는 레바우디오시드를 생성하도록 반응 혼합물을 인큐베이션하며, 여기서 글루코스는 스테비오시드에 공유 결합되어 레바우디오시드 E 중간체를 생성하고, 여기서 글루코스는 레바우디오시드 E 중간체에 공유 결합되어 화학식 I의 레바우디오시드를 생성하는 것; 및
   (III) 감미제로서 사용하기 위한 화학식 I의 레바우디오시드를 수득하는 것
   을 포함하는, 감미제로서 사용하기 위한 제1항에 청구된 바와 같은 레바우디오시드를 제조하는 방법.
4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 UDP-글리코실트랜스퍼라제 또는 UDP-글리코실트랜스퍼라제 도메인이 오리자 사티바(Oryza sativa) UDP-글리코실트랜스퍼라제 EUGT11을 포함하는 것인 방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 오리자 사티바 UDP-글리코실트랜스퍼라제 EUGT11이 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 것인 방법.
6. 제2항 또는 제3항에 있어서, 수크로스 신타제 또는 수크로스 신타제 도메인이 아라비돕시스(Arabidopsis) 수크로스 신타제 1; 아라비돕시스 수크로스 신타제 3 및 비그나 라디아테(Vigna radiate) 수크로스 신타제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
7. 제6항에 있어서, 수크로스 신타제가 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 수크로스 신타제 1인 방법.
8. 제2항 또는 제3항에 있어서, 수크로스 신타제 도메인에 커플링된 UDP-글리코실트랜스퍼라제 도메인을 포함하는 UDP-글리코실트랜스퍼라제 융합 효소가 사용되는 것인 방법.
9. 제8항에 있어서, UDP-글리코실트랜스퍼라제 융합 효소가 서열식별번호: 5에 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
10. 제8항에 있어서, 수크로스 신타제 도메인이 서열식별번호: 3의 아미노산 서열로 이루어진 아라비돕시스 탈리아나 수크로스 I 도메인인 방법.
11. 제10항에 있어서, UDP-글리코실트랜스퍼라제 융합 효소가 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 갖는 것인 방법.
12. 음료 제품 또는 다른 소비재 제품으로부터 선택된, 감미량의 제1항에 청구된 바와 같은 화학식 I의 레바우디오시드를 포함하는 경구 소비재 제품.
13. 제12항에 있어서, 5 ppm 내지 100 ppm의 상기 레바우디오시드를 포함하는 경구 소비재 제품.
14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 화학식 I의 레바우디오시드가 유일한 감미제인 경구 소비재 제품.
15. 제12항에 있어서, 1% (w/v-%) 내지 4% (w/v-%) 수크로스 용액과 동등한 단맛 강도를 갖는 경구 소비재 제품.
16. 제12항에 있어서, 적어도 1종의 추가의 감미제를 추가로 포함하는 경구 소비재 제품.
17. 제16항에 있어서, 적어도 1종의 추가의 감미제가 스테비아 추출물, 스테비올 글리코시드, 스테비오시드, 레바우디오시드 A, 레바우디오시드 B, 레바우디오시드 C, 레바우디오시드 D, 레바우디오시드 E, 레바우디오시드 F, 둘코시드 A, 루부소시드, 스테비올비오시드, 수크로스, 고도 프럭토스 옥수수 시럽, 프럭토스, 글루코스, 크실로스, 아라비노스, 람노스, 에리트리톨, 크실리톨, 만니톨, 소르비톨, 이노시톨, AceK, 아스파르탐, 네오탐, 수크랄로스, 사카린, 나린진 디히드로칼콘 (NarDHC), 네오헤스페리딘 디히드로칼콘 (NDHC), 루부소시드, 모그로시드 IV, 시아메노시드 I, 모그로시드 V, 모나틴, 타우마틴, 모넬린, 브라제인, L-알라닌, 글리신, 로 한 구오(Lo Han Guo), 헤르난둘신, 필로둘신, 트릴롭테인 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 경구 소비재 제품.
18. 제12항에 있어서, 탄수화물, 폴리올, 아미노산 또는 그의 염, 폴리아미노산 또는 그의 염, 당 산 또는 그의 염, 뉴클레오티드, 유기 산, 무기 산, 유기 염, 유기 산 염, 유기 염기 염, 무기 염, 쓴맛 화합물, 향미제, 향미 성분, 수렴성 화합물, 단백질, 단백질 가수분해물, 계면활성제, 유화제, 플라보노이드, 알콜, 중합체 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 첨가제를 추가로 포함하는 경구 소비재 제품.
19. 제12항에 있어서, 식품 제품, 기능식품, 약제, 식이 보충물, 치과 위생 조성물, 식용 겔 조성물, 화장품 제품 및 탁상용 향미제로 이루어진 군으로부터 선택되는 경구 소비재 제품.
20. 제12항에 있어서, 청량 음료, 파운틴 음료, 냉동 음료; 즉석 음용 음료; 냉동 즉석 음용 음료, 커피, 차, 낙농 음료, 분말화 청량 음료, 액체 농축물, 착향수, 강화수, 과실 주스, 과실 주스 착향 음료, 스포츠 음료 및 에너지 음료로 이루어진 군으로부터 선택되는 경구 소비재 제품.
21. 제1항에 청구된 바와 같은 화학식 I의 레바우디오시드, 및 충전제, 증량제 및 케이킹방지제 중 적어도 1종을 포함하는 감미제 조성물.
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