JP2021045155A - ステビオール配糖体の微生物による生成 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2014年11月5日に出願された米国仮出願第62/075,644号に対
する優先権及び利益を主張するものであり、その参照によりその全体が本明細書に組み込
まれる。
テビオール配糖体を作製する方法に関する。
質的にカロリーゼロであり、一般に、食品及び飲料など、ダイエット用製品及び低カロリ
ー製品に使用されている。高甘味度甘味料は血糖反応を誘発しないため、糖尿病患者及び
炭水化物の摂取管理に関心のある人々をターゲットにした製品で使用するのに好適である
。
ompositae)科の多年生の低木Stevia rebaudiana Bert
oniの葉に見られる、化合物群である。それらは、構造的に単一塩基ステビオールを特
徴とし、C13位及びC19位において存在する炭水化物残基が異なる。ステビオール配
糖体はステビアの葉に蓄積され、総乾燥重量の約10%〜20%を構成する。乾燥重量基
準で見ると、ステビアの葉に見られる4つの主なグリコシドには典型的に、ステビオシド
(9.1%)、レバウジオシドA(3.8%)、レバウジオシドC(0.6〜1.0%)
及びズルコシドA(0.3%)が挙げられる。他の公知のステビオール配糖体には、レバ
ウジオシドB、C、D、E、F及びM、ステビオールビオシド及びルブソシドが挙げられ
る。
倍強力であると推定され、わずかな苦味または甘草の後味のあるきれいな甘味を持ってい
ると表現されている。Prakash I.et al.,Development o
f Next Generation Stevia Sweetener:Rebau
dioside M,Foods 3(1),162−175(2014)。世界の食品
産業はRebMに大きな関心を寄せている。
はあるが、これらの方法の多くは商用には好適ではなく、かつ/または持続可能ではない
。したがって、高度に精製されたステビオール配糖体組成物など、ステビオール配糖体を
含む組成物を、簡便、効率的かつ経済的に調製する方法に対するニーズが依然としてある
。さらに、RebA、RebD、RebE、RebI、RebMなどのようなグリコシル
化を複数有する生成物を含む、微量グリコシル化生成物を実質的な量で製造する方法が必
要とされている。
成物であるグリコシル化産物を含むステビオール配糖体を作製する方法を提供し、かつ、
これらの方法で使用するための酵素、コードするポリヌクレオチド、及び宿主細胞を提供
する。本発明は、RebD及びRebMのようなステビオールのグリコシル化産物を高純
度及び/または高収率で製造するための、工学的に操作した酵素及び工学的に操作した宿
主細胞を提供する。本発明はさらに、ステビオール配糖体を含有する製品、中でも、食品
、飲料、口腔ケア用品、甘味料、香味料などの作製方法を提供する。
主細胞、ならびにC13及び/またはC19に複数のグリコシル化を有するステビオール
配糖体の作製方法を提供する。ステビオール配糖体は、2、3、4、5、6、7、8また
はそれ以上のグリコシル化を有してよい。さまざまな実施形態では、グリコシル化を、C
13−O、C19−O、1−2’(ステビオールのC−13及び/またはC19位)、及
び1−3’(ステビオールのC−13及び/またはC19位)から選択する。これらのグ
リコシル化を実施するための例示的酵素は表8に掲載されており、ステビオールのC13
−Oグリコシル化(例えば、SrUGT85C2)、ステビオールのC19−Oグリコシ
ル化(例えば、SrUGT74G1)、ステビオール配糖体の1−2’グリコシル化(例
えば、SrUGT91D1、SrUGT91D2、OsUGT1−2)、及びステビオー
ル配糖体の1−3’グリコシル化(例えば、SrUGT76G1)を触媒する酵素が含ま
れている。さまざまな実施形態で使用できる多数の誘導体を本明細書に開示しており、そ
れらには、本明細書でMbUGTc13(配列番号51)、MbUGTc19(配列番号
8)、MbUGTc19−2(配列番号46)、MbUGT1−2(配列番号9)、Mb
UGT1,2−2(配列番号45)、及びMbUGT1−3(配列番号10)として識別
される酵素、及びその誘導体が含まれる。いくつかの実施形態では、本発明は、これらの
グリコシル化をステビオール基質でインビボにて行うためのUGT酵素を少なくとも2つ
、3つ、または4つ発現する宿主細胞を提供する。本発明の実施形態にしたがって製造さ
れ得るさまざまなステビオール配糖体生成物は、図28〜31及び表10に示されており
、それらには、RebM、RebD、RebE、及びRebIが含まれる。本発明実施形
態に従って、これらのステビオール配糖体を、E.coliなどの細菌宿主細胞で高収率
で生成させることができ、E.coliの増殖及び代謝に好適な温度で生成させることが
できる。
ドA(RebA)のC19における1−2’グリコシル化活性がその親UGT酵素より高
く、かつステビオールモノシドのC13において1−2’グリコシル化活性の実質的損失
がない。このような酵素により、RebDに対する高い炭素フラックスが提供され得る。
さらに、本発明は、修飾されたUGT酵素を提供し、これはレバウジオシドD(RebD
)のC19における1−3’グリコシル化活性がその親UGT酵素より高く、かつステビ
オシドのC13において1−3’グリコシル化活性の実質的損失がない。このような酵素
により、RebMに対する高い炭素フラックスが提供され得る。
経路モジュールを作製して、宿主細胞内でステビオール配糖体の生成を工学的に操作する
が、それを最適化し、バランスを調整して、主要グリコシル化産物としてのステビオール
、それに次ぐRebDまたはRebM(または他のグリコシル化産物)への炭素フラック
スを促進させることができる。
ウリジン二リン酸依存型グリコシルトランスフェラーゼという酵素(UGT)を介してス
テビオールからRebDを生成する宿主細胞を提供すること、及びその宿主細胞を、Re
bDが生成される条件下で培養することを含む。UGT酵素は、レバウジオシドA(Re
bA)のC19における1−2’グリコシル化活性が親UGT酵素に比較して高く、ステ
ビオールモノシドのC13において1−2’グリコシル化活性の実質的損失がない、修飾
されたUGT酵素を含む。ある実施形態では、レバウジオシドA(RebA)のC19に
おける1−2’グリコシル化活性は、ステビオールモノシドのC13における1−2’グ
リコシル化活性と等しいかまたはそれより優れている。
ウリジン二リン酸依存型グリコシルトランスフェラーゼ酵素(UGT)を介してステビオ
ールからRebMを産生する宿主細胞を提供すること、及びその宿主細胞をRebMが生
成される条件下で培養することを含む。UGT酵素は、(a)レバウジオシドA(Reb
A)のC19における1−2’グリコシル化活性がその親UGT酵素より高く、ステビオ
ールモノシドのC13において1−2’グリコシル化活性の実質的損失がない、修飾され
たUGT酵素;及び(b)レバウジオシドD(RebD)のC19における1−3’グリ
コシル化活性がその親UGT酵素より高く、かつステビオシドのC13において1−3’
グリコシル化活性の実質的損失がない、修飾されたUGT酵素のうち、1つ以上を含む。
ある実施形態では、レバウジオシドA(RebA)のC19における1−2’グリコシル
化活性は、ステビオールモノシドのC13における1−2’グリコシル化活性と等しいか
またはそれより優れている。あるいは、またはさらに、レバウジオシドD(RebD)の
C19における1−3’グリコシル化活性は、ステビオシドのC13における1−3’グ
リコシル化活性と等しいかまたはそれより優れている。
G)の200位にアミノ酸置換を有する酵素を含め、ステビオシド及びRebDの1−3
’グリコシル化活性を提供し、実質的な活性改善を示す、修飾されたSrUGT76G1
酵素を提供する。
プロファイル、及び反応速度を提供できる、UGT酵素の円順列変異体(ならびに、コー
ドするポリヌクレオチド)を提供する。円順列変異体は、本明細書に記載のように、ステ
ビオール配糖体を生成させるために宿主細胞に発現させることができる。したがって、さ
まざまな実施形態では、微生物の細胞は、野生型UGT酵素または親UGT酵素の円順列
変異体であるUGT酵素を少なくとも1つ発現させる。円順列変異体は、親酵素と同一の
基本的折り畳み構造(fold)を保持しているが、N末端の位置(例えば、「切断部位
」)が異なり、本来のN末端とC末端は連結されており、任意選択で連結配列により連結
されている。例えば、円順列変異体では、N末端メチオニンは、天然のN末端ではなくタ
ンパク質中の一部位に位置する。例えば、本発明は、OsUGT1−2及びSrUGT7
4G1の円順列変異体を提供し、それを、ステビオールのグリコシル化産物を生成させる
ために本明細書に記載のようにさらに修飾することができる。
をE.coli内に生成させる方法を提供する。本発明に従い、E.coli細胞は、本
明細書に記載の酵素を1つ以上含んでよい複数のUGT酵素を含み、これらは共に少なく
とも4つ、少なくとも5つ、または少なくとも6つのグリコシル化反応を連続して行う。
本明細書に開示するように、グリコシル化の基質及び低グリコシル化産物は、E.col
i細胞内に十分に蓄積して下流の反応を許容される速度で進行させ、グリコシル化産物の
ほとんど大部分が最終的に細胞外に蓄積する。ステビオール配糖体は、培地成分から精製
され得る。したがって、E.coliは、ステビオール足場のグリコシル化反応をいくつ
か必要とするステビオール配糖体の生成にとって望ましい宿主である。
、RebI、及びその他を含む)をE.coli内に生成させる方法を提供する。宿主細
胞内でステビオールを生成させることが既知の酵素の多くは植物酵素であり、それらは至
適温度が20〜24℃の範囲であることが多いが、E.coliの増殖率及び代謝は、そ
れより高温で至適である。本願開示により、24℃を上回る温度、例えば、24℃〜37
℃、または27℃〜37℃、または30℃〜37℃での酵素による生成を可能にすること
により、E.coli内にステビオール配糖体を高収率で生成させることが可能になる。
さまざまな実施形態では、本開示は、ステビオールまたはステビオール配糖体をE.co
liまたは他の微生物宿主内に生成させるための代替的または工学的に操作されたGGP
PS酵素、KS酵素、CPPS酵素、KO酵素、及びKAH酵素を提供する。
されるグリコシル化産物などのステビオール配糖体の作製方法を提供し、かつ、これらの
方法で使用するための酵素、コードするポリヌクレオチド、及び宿主細胞を提供する。本
発明は、ステビオールのグリコシル化産物を作製するための、工学的に操作した酵素及び
工学的に操作した宿主細胞を高純度及び/または高収率で提供する。本発明はさらに、R
ebMまたはRebDのようなステビオール配糖体を含有する製品、中でも、食品、飲料
、口腔ケア用品、甘味料、香味料などを作製する方法を提供する。このようなステビオー
ル配糖体含有製品を、本開示によって低コストで製造できる。
ド)を有している。RebMは、6つのグリコシル化、すなわち、(1)C13 O−グ
リコシル化、(2)C13 1−2’グリコシル化、(3)C13 1−3’グリコシル
化、(4)C19 O−グリコシル化、(5)C19 1−2’グリコシル化、及び(6
)C19 1−3’グリコシル化を含有している。ゲラニルゲラニルピロリン酸(GGP
P)からRebMへの経路を図3に例示する。IPP及びDMAPP(MEP経路または
MVA経路の生成物)から生成されるGGPPを、実施形態によっては二機能性酵素とし
て提示され得るコパリル合成酵素及びカウレン合成酵素の作用によりカウレンに変換させ
る。ステビオールは、P450酵素であるカウレンオキシダーゼ及びカウレン酸ヒドロキ
シラーゼの2酵素の作用によってカウレンから生成され、これらの酵素は、1つ以上のP
450レダクターゼ酵素により再生される。ステビオール生成後、C13位及びC19位
での一連のグリコシル化反応により、6グリコシル化(hexaglycosylate
d)RebMなど多様なステビオール配糖体生成物を生成させることができる。他のさま
ざまなグリコシル化産物が(図3に示すように)可能であり、図28〜31に例示される
ように、既知のUGTグリコシル化酵素はそれぞれ、多数の基質に対して作用することが
できる。したがって、グリコシル化産物の相対的収率は、その基質の忠実性、相対反応速
度、発現レベル、及び利用性に影響されることになる。例えば、UGT91D2及びOs
UGT1−2はどちらも、ステビオールモノシドから(C13での作用により)ステビオ
ールビオシド、ならびに、RebAから(C19での作用により)RebDを生成させる
ことができる1−2’グリコシル化酵素である。さらに、UGT76G1は、ステビオシ
ドから(C13での作用により)RebA、ならびに、RebDから(C19での作用に
より)RebMを生成させることができる1−3’グリコシル化酵素である。表8、9、
及び10は、6つのグリコシル化反応から生じ得る可能な各種ステビオール配糖体、なら
びに、各反応の酵素を示す。表1は、ステビオール配糖体の生成に使用してよい各種酵素
の一覧である。本明細書と共にアミノ酸配列も提供され、その各々は、任意選択で、細胞
内の代謝回転を抑制するために2位にアラニンの挿入または置換を含むことができる。特
定のGGPPS配列はさらに、2つのさらなる残基(VD)を配列末端に含有し、これら
の残基は何らかの有害な影響があるとは考えられておらず、ある実施形態では省略され得
る。
ebM)の生成を最大限にするために工学的に操作した酵素、コードするポリヌクレオチ
ド、及び宿主細胞を提供する。例えば、本開示は、レバウジオシドA(RebA)のC1
9における1−2’グリコシル化活性が親UGT酵素より高く、ステビオールモノシドの
C13において1−2’グリコシル化活性の実質的損失がない、修飾されたUGT酵素を
提供する。このような酵素は、RebDに対する高い炭素フラックスを提供し得る。さら
に、本開示は、レバウジオシドD(RebD)のC19における1−3’グリコシル化活
性が親UGT酵素より高く、ステビオシドのC13において1−3’グリコシル化活性の
実質的損失がない、修飾されたUGT酵素を提供する。このような酵素は、RebMに対
する高い炭素フラックスを提供し得る。理論に束縛されることは望まないが、いくつかの
態様及び実施形態では、本発明は、基質(超基質を含む)をより良く収容することができ
、それにより、RebAまたはRebDのようにさらに高度にグリコシル化されたステビ
オール基質との作用速度(例えば、基質結合及び代謝回転の速度)を高めることができる
基質結合ポケットを有する修飾UGT酵素を提供する。
御されたグリコシル化経路を提供する。例えば、いくつかの実施形態では、本発明は、微
生物の細胞でRebMを作製する方法を提供し、ここで、RebM:RebD比は約1:
1超、または約1:0.5超、または約1:0.25超、または約10:1超、または約
25:1超、または約50:1超である。いくつかの実施形態では、RebDは、Reb
M収率の約20%未満、または約10%未満、または約5%未満、または約1%未満で生
成されるか、または単離されたステビオールのグリコシル化産物中で検出不可能である。
RebDは、RebMからの分離が困難であり得ること、またはそのような分離が必要な
場合に多大な精製コストが追加され得ることから、実施形態によってはRebD量の少な
い生成物が望ましい。いくつかの実施形態では、RebMは、細胞により産生されたステ
ビオールのグリコシル化産物の少なくとも約25重量%、またはグリコシル化産物の少な
くとも約50重量%、またはグリコシル化産物の少なくとも約75重量%、またはグリコ
シル化産物の少なくとも約80重量%、またはグリコシル化産物の少なくとも約85重量
%、またはグリコシル化産物の少なくとも約90重量%、またはステビオールのグリコシ
ル化産物の少なくとも約95重量%を示す。
テビオールのC13及び/またはC19における1つ以上の1−2’グリコシル化及び/
または1つ以上の1−3’グリコシル化が関与する。用語「ステビオール配糖体(複数可
)」とは、ステビオールの配糖体を指し、これには、ステビオールモノシド、ステビオー
ルビオシド、ルブソシド、ズルコシドB、ズルコシドA、レバウジオシドB、レバウジオ
シドG、ステビオシド、レバウジオシドC、レバウジオシドF、レバウジオシドA、レバ
ウジオシドE、レバウジオシドH、レバウジオシドL、レバウジオシドK、レバウジオシ
ドJ、レバウジオシドM、レバウジオシドD、レバウジオシドN、レバウジオシドOが含
まれるが、これらに限定されない。これらのステビオール配糖体の化学的特性は公知であ
り、例えば、表10、ならびに、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるWO20
14/122227号に記載されている。
路「モジュール」の作製を介して宿主細胞内で工学的に操作され、それを、最適化及びバ
ランス調整してステビオール、それに次ぐ主要グリコシル化産物としての所望グリコシル
化産物(RebMまたはRebDなど)までの炭素フラックスを促進させることができる
。代謝回転の類似する酵素を一つのサブセット、またはモジュールにグループ化し、かつ
酵素の濃度/活性を調節して各種サブセットの代謝回転を一様にすることにより、経路の
代謝回転と資源消費量との比を最適化することができる。
経路の酵素を含む。MEP経路及びMVA経路は生物に内因性のものであってよく、これ
らの経路を、特定の律速酵素の重複コピーを提供することによって高め、かつ下流経路と
のバランスを調整してよい。IPP及びDMAPPは、(−)−カウレン生成用の基質と
して(例えば、コパリル合成酵素とカウレンシンターゼ酵素とを別々に、または二機能性
酵素により)作用し、これが第2の経路モジュールとなる。第3の経路モジュールでは、
2つのP450酵素(例えば、カウレンオキシダーゼ(KO)及びカウレン酸ヒドロキシ
ラーゼ(KAH))及び1つ以上のP450レダクターゼ酵素の作用により、(−)−カ
ウレン酸をステビオールに変換する。GGPPの生成とそのステビオールまでの変換を触
媒する例示的な酵素は表1に掲載されている。その後、ステビオールはUDP酵素モジュ
ールによりグリコシル化されて最終生成物となる。さらなるモジュールには、UDP−グ
ルコース基質の生成を増強する遺伝子が含まれる。本発明のさまざまな実施形態では、こ
れらのモジュールはそれぞれモノシストロン性オペロンまたはポリシストロン性オペロン
として存在し、それぞれがプラスミド上に存在するかまたは染色体に組み込まれている。
ある実施形態では、モジュールは、所望の最終生成物の生成が増加するよう構成されてい
る。
体を作製する方法を提供する。かかる方法は、複数のウリジン二リン酸依存型グリコシル
トランスフェラーゼ酵素(UGT)を介してステビオールからステビオール配糖体を生成
する宿主細胞を提供すること、及びその宿主細胞をステビオール配糖体が生成される条件
下で培養することを含む。UGT酵素は、(a)レバウジオシドA(RebA)のC19
における1−2’グリコシル化活性がその親UGT酵素より高く、ステビオールモノシド
のC13において1−2’グリコシル化活性の実質的損失がない、修飾されたUGT酵素
(例えば、22℃、27℃、または30℃で評価した場合);及び(b)レバウジオシド
D(RebD)のC19における1−3’グリコシル化活性がその親UGT酵素より高く
、かつステビオシドのC13において1−3’グリコシル化活性の実質的損失がない、修
飾されたUGT酵素(例えば、22℃、27℃、または30℃で評価した場合)のうち1
つ以上を含む。
ル化活性は、ステビオールモノシドのC13における1−2’グリコシル化活性と等しい
かまたはそれより優れている。あるいは、またはさらに、レバウジオシドD(RebD)
のC19における1−3’グリコシル化活性は、ステビオシドのC13における1−3’
グリコシル化活性と等しいかまたはそれより優れている。
たは1−3’グリコシル化活性を有するUGT酵素は、親酵素と比較した場合に、C13
における活性の実質的損失を示さない。例えば、修飾酵素は、親(例えば、野生型)酵素
と比較して、C13におけるその活性の少なくとも50%、またはC13におけるその活
性の少なくとも約75%、またはC13におけるその活性の少なくとも約80%、少なく
とも約90%、もしくは少なくとも約95%を保持する(例えば、22℃、27℃、また
は30℃で評価した場合)。いくつかの実施形態では、酵素は、C13において改善され
た活性を有し、例えば、C13における活性が少なくとも2倍または少なくとも3倍改善
されている。グリコシル化活性の損失または改善は、インビトロ、例えば対象基質を添加
した細胞抽出物において、または他のインビトロまたはインビボでのアッセイで決定でき
る。例えば、相対反応速度は、対象とするステビオールまたはステビオール配糖体の基質
(複数可)が生成される株で決定され得る。グリコシル化活性を定量化する例示的な評価
法は、本明細書ならびに参照により本明細書に組み込まれるWO2014/122227
号に開示されている。
コシル化活性は、これらの反応をC19にて行う酵素で十分に(例えば、酵素によるこれ
らの段階のために何ら酵素を加えることなく)機能するが、他の実施形態では、細胞はさ
らに、C13において1−2’グリコシル化及び/または1−3’グリコシル化を行うた
めの酵素を発現する。いくつかの実施形態では、たとえC19において活性損失があって
も、1−2’反応及び/または1−3’反応をC13において行うよう、第2の酵素を工
学的に操作する。
リコシル化活性を有するUGT酵素を1つのみ発現し、かつ/またはステビオシドのC1
3における1−3’グリコシル化活性を有するUGT酵素を1つのみ発現する。そのよう
な実施形態では、酵素を工学的に操作してC19における反応を高め、これにより、Re
bMなどのC19グリコシル化産物の方へ生成物を引き寄せることができ、細胞にさらに
代謝負荷を掛けることになる追加酵素を発現させなくてもすむ。
質特異性、生成物プロファイル、及び反応速度を提供できる、UGT酵素の円順列変異体
(ならびに、コードするポリヌクレオチド、及びUGT酵素の円順列変異体の作製方法)
を提供する。理論に束縛されることは望まないが、円順列変異体は、1つ以上のグリコシ
ル基を有するステビオール基質のような超基質に対し、より開かれているかまたは接近可
能なUGT結合ポケット作製の機会を提供する。このようにすることで、本発明は、グリ
コシル化が多い形態のステビオールに対するグリコシル化反応を、グリコシル化が少ない
(したがって、小さい)基質に対する反応と同様またはそれ以上の速度で進行させるよう
にできる。円順列変異体は、本明細書に記載のように、ステビオール配糖体を生成させる
ために宿主細胞に発現させることができる。したがって、さまざまな実施形態では、ステ
ビオール配糖体(例えば、RebMまたはRebD)を生成する微生物細胞は、親(例え
ば、野生型)UGT酵素の円順列変異体であるUGT酵素を少なくとも1つ発現する。
天然のN末端の位置が異なり(例えば、「切断部位」)、本来のN末端とC末端は連結さ
れ、任意選択で連結配列により連結されている。UGT酵素の例示的構造(例えば、Os
UGT1−2に基づく)は図20に示されている。UGTアラインメント及び二次構造エ
レメントは、図38に示されている。各円順列変異体について、切断部位は、変異体のN
末端アミノ酸(例えば、N末端の50または100アミノ酸)と親または野生型の配列と
のアラインメントにより、親配列(例えば、野生型配列)の対応する位置を基準にして記
載され得る。本明細書で使用する場合、所与の円順列変異体の「切断部位」とは、円順列
変異体の2位(例えば、開始Metの後)、またはタンパク質の代謝回転を抑制するため
に2位にアラニンを挿入した場合の円順列変異体の3位に位置するアミノ酸の元々の位置
を指す。UGT配列全体を比較するためのアラインメントは、図38に示されている保存
されたPSPGモチーフ周辺に固定する必要がある。PSPG(植物二次代謝産物グリコ
シルトランスフェラーゼ)モチーフは、ヌクレオチド二リン酸糖供与体分子を結合させる
役割を果たす、植物UGT内の保存されている領域である。Gachon et al.
,Plant secondary metabolism glycosyltran
sferases:the emerging functional analysi
s,Trends Plant Sci.10:542−549(2005)。UDPG
Tファミリーのこのモチーフの最も保存された残基は、WXPQXXXLXHXXXXA
FXX[H]XGXXXXXEXXXXGXPXXXXPXFXXQというパターンを示
し、そこでは、角括弧で括ったヒスチジンは二リン酸領域との重要な接触を行う。Fin
n RD,et al.Pfam:the protein families dat
abase,Nucleic Acids Res.42:D222−230(2014
)。さらに、このモチーフ周辺のアラインメントは、一クラスとしてのUGTタンパク質
にとって有益となる特性に翻訳する点変異の記載に有用である。例えば、モチーフの始め
のトリプトファン、または中間位置にある重要ヒスチジンへのアラインメント固定を使用
して、この配列に対する点変異を記載してよく、植物のGT1 UDP−グルコースグリ
コシルトランスフェラーゼにおいてはそれが普遍的となるであろう。
のUGT85C2の円順列変異体である。SrUGT85C2は本明細書では配列番号1
として提供される。いくつかの実施形態では、円順列変異体は、OsUGT1−2(配列
番号7)の円順列変異体である。いくつかの実施形態では、円順列変異体は、Stevi
a rebaudianaのUGT91D2の円順列変異体である(配列番号5)。いく
つかの実施形態では、円順列変異体は、Stevia rebaudianaのUGT7
4G1の円順列変異体である(配列番号2)。いくつかの実施形態では、円順列変異体は
、Stevia rebaudianaのUGT76G1の円順列変異体である(配列番
号3)。このようにして、UGT酵素のN末端の位置を変えることにより、新規な基質特
異性と活性プロファイルを持つ酵素を創作することができる。例えば、切断部位は、円順
列変異体のN末端(例えば、N末端の50のアミノ酸)と親または野生型の酵素とのアラ
インメントを行った場合、いくつかの実施形態ではアミノ酸150から300までの間、
またはいくつかの実施形態ではアミノ酸190と260の間、またはいくつかの実施形態
では残基190と210の間である。他の実施形態では、円順列変異体は、円順列変異体
のN末端の50のアミノ酸と親または野生型の酵素とのアラインメントを行った場合、切
断部位を、アミノ酸245と280の間(例えば、272位)、またはアミノ酸260か
ら275までの間に有する。いくつかの実施形態では、新たなN末端を、局所的な二次構
造エレメント(α−ヘリックスまたはβ−シートなど)の間に配し、かつ/または野生型
酵素のループ構造に配する。所望するN末端の位置を選択する場合、Metを開始アミノ
酸として切断部位に付加し、任意選択で、細胞の代謝回転を抑制するためにAlaを第2
位に配する。天然のN末端とC末端は連結され、任意選択で、連結配列で連結される。一
般に、連結配列は、例えば、主にまたは本質的にGly、Ser、及び/またはAlaか
らなる配列を用いて、柔軟性(例えば、可能性の高いループ構造以外の定義された二次構
造がない)が得られるよう選択される。いくつかの実施形態では、連結アミノ酸配列は約
2〜約25アミノ酸長であり、それがループを形成してよい。円順列変異体はさらに、親
または野生型の酵素の対応する位置に対し、(例えば、最もスコアの高い局所的アライン
メントに基づき)アミノ酸の置換、欠失、または挿入を1〜約30、または約1〜約20
、または1〜約10、または1〜約5含んでよい。いくつかの実施形態では、天然のN末
端Metは、その新しい位置で分子内に維持されているか、または他の実施形態では欠失
している。
れにおいて、1つのUGTのN末端ドメインは別のUGT酵素のC末端ドメインと連結さ
れている。例えば、N末端ドメイン及びC末端ドメインは、表9から選択される2つの異
なる酵素のものであり、各ドメインはさらに、親ドメイン配列と比べてアミノ酸の置換、
欠失、及び/または挿入を1〜10含んでよい。UGTは、より可変なN末端の基質結合
(糖受容体)ドメインと、より保存されたC末端のUDP−グルコース結合(糖供与体)
ドメインの2ドメインを有する。N末端ドメインで酵素の基質特異性のほとんどが決定さ
れるが、一部の特異性はC末端ドメインにより制御される。これらのドメイン各々が、そ
のタンパク質のおよそ半分ずつを作っている。
T1−2(配列番号7)、SrUGT91D2(配列番号5)、SrUGT91D1(配
列番号4)、SrUGT91D2e(配列番号6)(表9を参照されたい)またはその誘
導体である。いくつかの実施形態では、誘導体は、RebAのC19における高いグリコ
シル化活性を有する。UGT酵素は、一般に、OsUGT1−2、SrUGT91D2、
SrUGT91D1、及びSrUGT91D2eの1つ以上に対し、約50%超、約60
%超、約70%超、約80%超、約90%超、もしくは約95%超、または約96、97
、98、もしくは99%超の同一性レベルを有してよい。
センテージは、配列アラインメントにより決定され得る。そのようなアラインメントは、
当技術分野で公知のいくつかのアルゴリズム、例えば、Karlin and Alts
chulの数学アルゴリズム(Karlin&Altschul(1993) Proc
.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873−5877)、hmmalig
n(HMMERパッケージ、http://hmmer.wustl.edu/)または
CLUSTALアルゴリズム(Thompson,J.D.,Higgins,D.G.
&Gibson,T.J.(1994) Nucleic Acids Res.22,
4673−80)を用いて行うことができる。配列同一性(配列一致)のグレードは、例
えば、BLAST、BLATまたはBlastZ(またはBlastX)を使用して計算
してよい。Altschulら((1990) J.Mol.Biol.215:403
−410)のBLASTN及びBLASTPプログラムに同様のアルゴリズムが組み込ま
れている。BLASTNプログラムをスコア=100、ワード長=12で用いて、BLA
STポリヌクレオチド検索を実行することができる。
検索を実行してよい。比較を目的としてギャップありアラインメントを得るために、Al
tschul et al(1997)Nucleic Acids Res.25:3
389−3402に記載のGapped BLASTを用いる。BLAST及びGapp
ed BLASTプログラムを用いる際は、それぞれのプログラムのデフォルトのパラメ
ータを使用する。配列一致解析には、Shuffle−LAGAN(Brudno M.
,Bioinformatics 2003b,19 Suppl 1:154−162
)またはマルコフ確率場のような確立された相同性マッピング技術を補完してよい。
1−2またはその誘導体であり、これは任意選択で、RebAのC19における1−2’
グリコシル化活性を高めるアミノ酸置換、アミノ酸欠失、及び/またはアミノ酸挿入を1
つ以上含む、OsUGT1−2の円順列変異体である。例えば、1−2’グリコシル化酵
素は、OsUGT1−2(配列番号7)のアミノ酸190〜210内の位置と整列するか
またはそれに対応する切断部位を有してよく、また、いくつかの実施形態では、配列番号
7のアミノ酸194〜200内の位置、例えば、195位、196位、197位、または
199位であってよい。円順列変異体は、任意選択で、OsUGT1−2のN末端残基及
びC末端残基に対応するアミノ酸の間にリンカー配列を有してよい。リンカーは、2〜約
25アミノ酸の範囲というように長さが異なってよい。例えば、リンカーは約8〜約20
アミノ酸長であってよく、例えば、いくつかの実施形態では約17アミノ酸であってよい
。いくつかの実施形態では、円順列変異体は、いかなる連結配列も含有しない。円順列変
異体はさらに、野生型配列に、アミノ酸の置換、付加、または欠失を1〜20、または1
〜10、または1〜5含有してよい(OsUGT1−2に対する変異配列の局所的アライ
ンメントにより決定)。いくつかの実施形態では、2位にAlaの挿入または置換を行っ
て細胞内の酵素の代謝回転を抑制する。いくつかの実施形態では、諸変異が集合的にRe
bAのC19における1−2’グリコシル化活性を高める(例えば、22℃、27℃、ま
たは30℃で評価した場合)。
1−2の円順列変異体であり、切断部位がOsUGT1−2の195位、196位、19
7位、198位、または199位に対応している。MbUGT1−2と命名した例示的な
円順列変異体を本明細書に開示する。円順列変異体は、野生型酵素の14位、16位、8
9位、185位、365位、366位、395位、396位、417位、420位、42
1位、422位、424位、427位、428位、430位、431位、432位、43
4位及び/または463位に対応する位置のうち1つ以上にアミノ酸置換を有してよい。
いくつかの実施形態では、円順列変異体は、14位にアミノ酸置換を有し、このような置
換はTrpまたはTyrなどの芳香族アミノ酸であってよい。これらの実施形態または他
の実施形態では、円順列変異体は366位にアミノ酸置換を有し、置換アミノ酸は任意選
択でProである。これらの実施形態または他の実施形態では、円順列変異体は420位
にアミノ酸置換を有し、置換アミノ酸は任意選択でGluである。これらの実施形態また
は他の実施形態では、円順列変異体は421位にアミノ酸置換を有し、置換アミノ酸は任
意選択でPheである。これらの実施形態または他の実施形態では、円順列変異体は42
4位にアミノ酸置換を有し、置換アミノ酸は任意選択でAspである。これらの実施形態
または他の実施形態では、円順列変異体は427位にアミノ酸置換を有し、置換アミノ酸
は任意選択でGluである。これらの実施形態または他の実施形態では、円順列変異体は
428位にアミノ酸置換を有し、置換アミノ酸は任意選択でGluである。これらの実施
形態または他の実施形態では、円順列変異体は432位にアミノ酸置換を有し、置換アミ
ノ酸は任意選択でTyr、His、Trp、Asp、またはGluである。いくつかの実
施形態では、酵素は、アミノ酸424と427の間に2〜5個のアミノ酸の挿入、例えば
、配列Gly−Pro−Serなどを含む。いくつかの実施形態では、1−2’グリコシ
ル化活性を有するUGTは、配列番号9(MbUGT1−2)のアミノ酸配列を含むか、
または、配列番号9に対して少なくとも約50%の同一性、少なくとも約60%の同一性
、少なくとも約70%の同一性、少なくとも約80%の同一性、少なくとも約85%の同
一性、または少なくとも約90%の同一性、または少なくとも約95%の同一性、または
少なくとも96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有し、かつ、RebAのC
19またはステビオールモノシドのC13のうち1つ以上において1−2’グリコシル化
活性を有する酵素を含む。
T1−2の円順列変異体であり、切断部位がOsUGT1−2の196位に対応している
。MbUGT1,2−2と命名した例示的な円順列変異体(配列番号45)を本明細書に
開示する。円順列変異体は、野生型酵素の16位、422位、430位、及び434位の
うち1つ以上にアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、円順列変異体は16位
にアミノ酸置換を有し、このような置換は芳香族アミノ酸、例えばTrpであってよい。
これらの実施形態または他の実施形態では、円順列変異体は422位にアミノ酸置換を有
し、置換アミノ酸は任意選択でGluである。これらの実施形態または他の実施形態では
、円順列変異体は430位にアミノ酸置換を有し、置換アミノ酸は任意選択でGluであ
る。これらの実施形態または他の実施形態では、円順列変異体は434位にアミノ酸置換
を有し、置換アミノ酸は任意選択でHisである。いくつかの実施形態では、酵素は、天
然のN末端アミノ酸とC末端アミノ酸の間にいかなる連結配列も含有せず、天然のN末端
Metは任意選択で欠失させてよい。いくつかの実施形態では、1−2’グリコシル化活
性を有するUGTは、配列番号45のアミノ酸配列を含むか、または、配列番号45に対
して少なくとも約50%の同一性、少なくとも約60%の同一性、少なくとも約70%の
同一性、少なくとも約80%の同一性、少なくとも約85%の同一性、または少なくとも
約90%の同一性、または少なくとも約95%の同一性、または少なくとも96%、97
%、98%もしくは99%の同一性を有し、かつ、RebAのC19またはステビオール
モノシドのC13のうち1つ以上において1−2’グリコシル化活性を有する酵素を含む
。
76G1であるか、または、RebDのC19またはステビオシドのC13におけるグリ
コシル化活性が同一もしくは高いSrUGT76G1の誘導体である。いくつかの実施形
態では、1−3’グリコシル化活性を有するUGT酵素は、配列番号3の77位、78位
、81位、82位、93位、94位、155位、192位、200位、202位、205
位、283位、284位、379位、及び397位のうち1つ以上にアミノ酸置換を含む
SrUGT76G1誘導体である(表13を参照されたい)。いくつかの実施形態では、
誘導体はL200位(野生型酵素にしたがった番号付け)にアミノ酸置換を有し、これは
任意選択でAlaまたはGlyである。これらの実施形態では、誘導体はさらに、アミノ
酸置換を284位(例えば、Ala)及び/または379位(例えば、Gly)、及び/
または192位(例えば、Ala)に有してよい。いくつかの実施形態では、2位にAl
aの挿入または置換を行って細胞内の代謝回転を抑制する。いくつかの実施形態では、U
GT酵素は、配列番号3に対し少なくとも約80%の同一性、少なくとも約85%の同一
性、少なくとも約90%の同一性、または少なくとも約95%、96%、97%、98%
、もしくは99%の同一性を有するが、配列番号3の200位に対応するアミノ酸がAl
aまたはGlyということはない。表13に示すように、L200AまたはL200Gの
置換により、C19及びC13の両方の箇所における活性が大幅に改善される。
56位、及び282位の1つ以上における修飾、例えば、Q22G、Q22H、I25F
、I25W、T145A、T145G、T145P、H154R、L256P、L256
W、L256T、L256G、L256A、L256R、L256E、S281G及びS
282Nのうちの1つ以上が含まれる。これらの修飾は、WO2014/122227に
開示されており、参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、UGT
76G1に対するこれらのさらなる修飾は、77位、78位、81位、82位、83位、
93位、94位、155位、192位、200位、202位、205位、283位、28
4位、378位、379位、及び397位における修飾と組み合わせて、より優れた特性
を示す。
T76G1の円順列変異体であり、切断部位がSrUGT76G1のアミノ酸の170位
〜290位(例えば、190位〜210位、196位〜200位または260位〜280
位)内の位置に対応している。いくつかの実施形態では、切断部位は、野生型酵素の19
6位または264位に対応する。円順列変異体(例えば、MbUGT1−3)は、野生型
酵素の対応する位置に対し、アミノ酸の置換、欠失、及び/または挿入を1〜30、また
は1〜20、または1〜10、または1〜5有してよい。いくつかの実施形態では、1−
3’グリコシル化活性を有するUGTは、配列番号10(MbUGT1−3)のアミノ酸
配列を含むか、または、配列番号10に対し、少なくとも約50%の同一性、少なくとも
約60%の同一性、少なくとも約70%の同一性、少なくとも約80%の同一性、少なく
とも約85%の同一性、または少なくとも約90%の同一性、または少なくとも約95%
の同一性、または少なくとも96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有し、か
つRebDのC19またはステビオシドのC13における1−3’グリコシル化活性のう
ち1つ以上を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、2位にAlaの置換
または挿入を行って細胞内の代謝回転を抑制する。
テビオールモノシドに変換するUGT酵素が使用される。いくつかの実施形態では、ステ
ビオールをステビオールモノシドに変換するUGT酵素はSrUGT85C2、またはそ
の誘導体である。いくつかの実施形態では、酵素は、配列番号1に対し、アミノ酸の置換
、欠失、及び/または挿入を1〜約50、または1〜約20、または1〜約10含む。例
えば、誘導体は、配列番号1に対する少なくとも約65%の同一性、もしくは少なくとも
約70%の同一性、もしくは少なくとも約80%の同一性、または配列番号1に対する少
なくとも90%の同一性、または配列番号1に対する少なくとも95%、96%、97%
、98%、もしくは99%の同一性を有してよく、かつステビオールをステビオールモノ
シドに変換する、同一または類似の活性を(例えば、インビトロまたはインビボで)維持
してよい。例示的なアミノ酸修飾を表11に示す。いくつかの実施形態では、ステビオー
ルをステビオールモノシドに変換する酵素は、野生型酵素の215位にアミノ酸置換を有
するSrUGT85C2誘導体である。いくつかの実施形態では、野生型酵素の215位
に対応するアミノ酸は、スレオニン、セリン、グリシン、またはアラニンである(野生型
でのアミノ酸はプロリンである)。いくつかの実施形態では、前記215位のアミノ酸は
スレオニンである。これらの実施形態または他の実施形態では、SrUGT85C2誘導
体は、308位、311位、316位、349位及び/または414位のうち1つ以上に
おいて変異を有する(野生型酵素に従った番号付け。いくつかの実施形態では、308位
アミノ酸はスレオニンであり、かつ/または311位アミノ酸はグルタミンであり、かつ
/または316位アミノ酸はアラニンであり、かつ/または349位アミノ酸はグルタミ
ン酸であり、かつ/または414位アミノ酸にはグリシンである。いくつかの実施形態で
は、第2位にAlaの挿入または置換を行って細胞内の代謝回転を制限する。
テビオシドに変換するUGT酵素が使用され、この酵素は、いくつかの実施形態ではSr
UGT74G1、またはその誘導体である。いくつかの実施形態では、酵素は、配列番号
2に対し、アミノ酸の置換、欠失、及び/または挿入を1〜約50、または1〜約20、
または1〜10含む。例えば、誘導体は、配列番号2に対する少なくとも80%の同一性
、配列番号2に対する少なくとも90%の同一性、または配列番号2に対する少なくとも
95%、96%、97%、98%、もしくは99%の同一性を有してよく、かつステビオ
ールビオシドをステビオシドに(例えば、インビトロまたはインビボで)変換する、同一
または類似の活性を維持してよい。
は、SrUGT74G1の円順列変異体(例えば、MbUGTC19)である。いくつか
の実施形態では、円順列変異体は、SrUGT74G1の180位〜280位(例えば、
250位〜270位)内のアミノ酸に対応する切断部位を有する。円順列変異体は、本来
のN末端とC末端の間に1〜10個のアミノ酸でできた連結配列(例えば、GSG)を有
してよい。円順列変異体は、野生型配列の対応する位置に対し、アミノ酸の置換、欠失、
及び/または挿入を1〜30、または1〜20、または1〜10、または1〜5有してよ
い。いくつかの実施形態では、SrUGT74G1円順列変異体は、配列番号8(MbU
GTC19)または配列番号46(MbUGTC19−2)のアミノ酸配列を含むか、ま
たは、配列番号8または46に対し、少なくとも約50%の同一性、少なくとも約60%
の同一性、少なくとも約70%の同一性、少なくとも約80%の同一性、少なくとも約8
5%の同一性、または少なくとも約90%の同一性、または少なくとも約95%の同一性
、または少なくとも96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有し、かつステビ
オールビオシドをステビオシドに変換する活性を有するアミノ酸配列を含む。
ーゼ(KO)、及びカウレン酸ヒドロキシラーゼ(KAH)を含む1つ以上の経路モジュ
ールを介してステビオール基質を産生し、かかる宿主細胞はさらに、KO酵素及びKAH
酵素の1つ以上を再生するシトクロムP450レダクターゼ(CPR)を含む。いくつか
の実施形態では、KAHはStevia rebaudiana、Arabidopsi
s thaliana、Vitis vinifera、もしくはMedicago t
runculataのKAH、またはその誘導体(例えば、野生型配列に対し少なくとも
80%、または少なくとも90%、または少なくとも95%、または少なくとも97%の
配列同一性を有するもの)である。いくつかの実施形態では、KAHは、Arabido
psis thalianaのKAH(AtKAH)、またはその誘導体である。AtK
AHは、カウレン酸ヒドロキシラーゼ活性率を高めるか、そうでなければ、酵素の生産性
または発現を改善する、アミノ酸の置換、挿入、及び/または欠失を1つ以上有してよく
、例えば、E.coliで機能発現するよう工学的に操作されたN末端が含まれる。いく
つかの実施形態では、AtKAHは、表6に示す配列番号29の親配列のうち1か所以上
(例えば、2〜10か所)において、ステビオールまたはカウレン酸の生成を高めるアミ
ノ酸置換を有する。例示的な置換には、配列番号29の以下の位置に対応する置換が挙げ
られる:25位(例えば、A25L)、79位(例えば、S79T)、119位(例えば
、T119C)、137位(例えば、I137L)、142位(例えば、I142V)、
155位(例えば、R155K)、180位(例えば、M180L)、193位(例えば
、E193G)、196位(例えば、C196A)、197位(例えば、D197E)、
226位(A226E)、235位(例えば、L235Q)、238位(例えば、I23
8M)、245位(F245L、F245V)、272位(例えば、L272I)、28
5位(例えば、I285R)、287位(例えば、C287S)、325位(例えば、C
325I、C325M)、330位(例えば、F330L)、334位(例えば、D33
4E)、339位(例えば、S339T)、352位(例えば、S352E)、373位
(例えば、E373D)、397位(例えば、I397F)、470位(例えば、V47
0L)、499位(例えば、Q499V)、506位(例えば、L506M)、507位
(例えば、L507I、L507T、L507V)。いくつかの実施形態では、AtKA
H酵素は、(野生型配列に対して)331位にアミノ酸置換を有する誘導体であり、この
酵素は、いくつかの実施形態では、高温(例えば、22℃超)における酵素の生産性を改
善する。いくつかの実施形態では、331位アミノ酸はIleである。
飾または同様の修飾を行ってAtKAHなどのKAHの機能発現を達成してよい。例えば
、膜貫通領域の全部または複数の部分を、アミノ酸4個〜アミノ酸約39個、またはいく
つかの実施形態では、アミノ酸約6個〜アミノ酸約25個、またはアミノ酸約4〜約20
個、またはアミノ酸約29個、またはアミノ酸約39個というように欠失させてよい。欠
失は、膜貫通領域のN末端部分から取るのが好ましい。この欠失した部分を、約4〜約2
0個のアミノ酸残基、例えば約4〜約12個の残基(例えば、アミノ酸残基8個)の可溶
化タグで置き換える。タグは、主に疎水性アミノ酸で構築され、それらは任意選択でAl
a、Leu、Ile、Val、及びPheから選択される。機能発現の例示的配列はN末
端タグ:MALLLAVF(配列番号47)である。いくつかの実施形態では、AtKA
Hは、アミノ酸14個の欠失を有し、N末端タグ(例えば、配列番号29)が付加され、
任意選択で置換C331Iを有する(野生型酵素に基づく位置命名法)を有する。
62/208,166号に記載されており、本発明の特定の実施形態において使用される
。例えば、膜貫通ドメイン(または「N末端アンカー」)は、waaA、ypfN、yh
cB、yhbM、yhhm、zipA、ycgG、djlA、sohB、lpxK、F1
1O、motA、htpx、pgaC、ygdD、hemr、及びyclsから選択され
るE.coli遺伝子由来であり得る。これらの遺伝子を、バイオインフォマティックス
予測ならびに実験的検証により、C末端細胞質の内膜タンパク質として同定した。本発明
では、E.coliの野生型膜貫通ドメインの誘導体である、すなわち、野生型配列に対
する1つ以上の変異を有する、N末端アンカー配列を使用する場合がある。例示的な実施
形態では、膜アンカー配列は約8〜約75アミノ酸長である。例えば、膜アンカーは長さ
が約15〜約50アミノ酸、または約15〜約40アミノ酸、または約15〜約30アミ
ノ酸、または約20〜約40アミノ酸、または約20〜約30アミノ酸であってよい。
ana、Zea mays、Populus trichocarpa、Arabido
psis thaliana、Erwina tracheiphila由来またはその
誘導体(例えば、野生型配列に対し少なくとも80%、または少なくとも90%、または
少なくとも95%、または少なくとも97%の配列同一性を有するもの)である。さらに
、細胞は、Stevia rebaudiana、Streptomyces clav
uligerus、Bradyrhizobium japonicum、Zea ma
ys、Arabidopsis thaliana、Erwina tracheiph
ila由来のコパリル二リン酸合成酵素(CPPS)、またはその誘導体(例えば、野生
型配列に対し少なくとも80%、または少なくとも90%、または少なくとも95%、ま
たは少なくとも97%の配列同一性を有するもの)を発現してよい。いくつかの実施形態
では、宿主細胞は、任意選択でPhomopsis amygdali、Physcom
itrella patens、Gibberella fujikuroi酵素から選
択される、CPPSとKSとの二機能性酵素、またはその誘導体を発現する。このような
誘導体は、一般に、親配列(例えば、表1を参照されたい)に対し、少なくとも約75%
、または少なくとも約80%、または少なくとも約85%、または少なくとも約90%、
または少なくとも約95%、または少なくとも96%、97%、98%、もしくは99%
の同一性を有してよい。いくつかの実施形態では、細胞は、Erwina trache
iphilaのCPPS酵素及びKS酵素、またはその誘導体を発現する。
O)、Arabidopsis thaliana、Gibberella fujik
oroi、もしくはTrametes versicolor由来のカウレン酸化酵素、
または、その誘導体を発現し、任意選択でE.coliに機能発現させるためにN末端で
(上記及び図9に示すように)修飾される。いくつかの実施形態では、CPRは、Ste
via rebaudiana(SrCPR)、Arabidopsis thalia
na、もしくはGiberella fujikuroiの酵素、またはその誘導体であ
り、任意選択でE.coliに機能発現させるためにN末端で修飾される。
国仮出願第62/040,284号に開示されており、参照によりその全体が本明細書に
組み込まれる。例えば、SrKOは、複数の位置におけるアミノ酸修飾を1つ以上含んで
よい(配列番号22に対する、47位(例えば、L47I)、59位(例えば、Y59H
)、60位(例えば、M60K)、63位(例えば、T63A)、67位(例えば、A6
7E)、76位(例えば、K76R)、80位(例えば、T80C)、82位(例えば、
M82V)、85位(例えば、V85L、V85I)、86位(例えば、S86N)、1
00位(例えば、Q100S)、106位(例えば、N106K)、112位(例えば、
K112T)、116位(A116R)、119位(例えば、T119S)、123位(
例えば、M123T、M123Q、M123F、M123T)、127位(例えば、D1
27G)、129位(例えば、Y129F)、140位(例えば、A140R)、149
位(例えば、K149R)、150位(例えば、H150F)、171位(例えば、N1
71D)、180位(例えば、L180F)、183位(例えば、I183V)、208
位(例えば、D208E)、232位(例えば、D232E)、267位(例えば、S2
67A)、272位(例えば、H272Q)、284位(例えば、S284C)、286
位(例えば、I286L)、294位(例えば、Q294K)、299位(例えば、Q2
99E)、310位(例えば、I310T、I310V)、371位(例えば、R371
K、R371I)、375位(例えば、V375T、V375I、V375L)、378
位(例えば、I378V)、382位(例えば、H382Y)、388位(例えば、V3
88Q、V388M)、393位(例えば、H393D)、400位(例えば、L400
I)、413位(例えば、V413K、V413D)、434位(例えば、F434L)
、442位(例えば、G442A)、450位(例えば、S450A)、454位(例え
ば、L454M)、460位(例えば、G460A)、464位(例えば、M464L)
、475位(例えば、M475G)、487位(例えば、T487N)、492位(例え
ば、P492K)、及び497位(例えば、I497L)。いくつかの実施形態では、S
rKOは、N末端膜貫通ドメインのアミノ酸約20個の欠失を含み、N末端タグ配列(上
記)が付加されている。SrKOは、2位にAlaを含有して細胞内の酵素の代謝回転を
抑制してよい。
ia rebaudiana(Sr)CPR、Stevia rebaudiana(S
r)CPR1、Arabidopsis thaliana(At)CPR、Taxus
cuspidata(Tc)CPR、Artemisia annua(Aa)CPR
、Arabidopsis thaliana(At)CPR1、Arabidopsi
s thaliana(At)CPR2、Arabidopsis thaliana(
At)R2、Stevia rebaudiana(Sr)CPR2、Stevia r
ebaudiana(Sr)CPR3、またはPelargonium graveol
ens(Pg)CPRが含まれる。これらのP450のいずれも、実施形態によっては、
誘導体化して、例えば、1〜約20の変異、または約1〜約10の変異を導入することが
できる。これらのCPRタンパク質の詳細はPCT/US15/46369号に記載され
ており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
E.coliであり、酵素は染色体に組み込まれており、例えば、SrKO及びAtKA
Hの両酵素を支持する。
PS)を発現し、これは、任意選択でTaxus canadensis、Abies
grandis、Aspergillus nidulans、Stevia reba
udiana、Gibberella fujikuroi、Mus musculus
、Thalassiosira pseudonana、Streptomyces m
elanosporofaciens、Streptomyces clavulige
rus、Sulfulubus acidocaldarius、Synechococ
cus sp.(例えば、JA−3−3Ab)、Arabidopsis thalia
na、海洋細菌443、Paracoccus haeundaensis、Chlor
obium tepidum TLS、Synechocystis sp.(PCC6
803)、Thermotoga maritima HB8、Corynebacte
rium glutamicum、Thermus thermophillus HB
27、Pyrobaculum calidifontis JCM11548のゲラニ
ルゲラニルピロリン酸合成酵素、またはその誘導体である。表1を参照されたい。このよ
うな誘導体は、一般に、親配列(例えば、表1を参照されたい)に対し、少なくとも約6
0%、または少なくとも約70%、または少なくとも約75%、または少なくとも約80
%、または少なくとも約85%、または少なくとも約90%、または少なくとも約95%
、または少なくとも96%、97%、98%、もしくは99%の同一性を有してよい。い
くつかの実施形態では、GGPPSはTaxus canadensisまたはその誘導
体である。いくつかの実施形態では、Taxus GGPPSはN末端に欠失のある(例
えば、N末端のアミノ酸70〜110個、例えば約98個が欠失している)配列である。
欠失のある配列はさらに、対応する野生型配列において、アミノ酸の置換、欠失、及び/
または挿入を約1〜約10、例えば、約1〜約5含んでよい。欠失のある例示的配列を配
列番号12として本明細書に開示する。いくつかの実施形態では、GGPPSはCorn
ybacterium glutamicum由来のGGPPSまたはその誘導体であり
、それにより22℃より高温での生産性における利点が提供され得る。
iso−pentyl pyrophosphate)(IPP)及びジメチルアリルピ
ロリン酸(DMAPP)を発現する。いくつかの実施形態では、経路は、メチルエリスリ
トールリン酸(MEP)経路及び/または、メバロン酸(MVA)経路である。
P(2−C−メチル−D−エリスリトール 4−リン酸/1−デオキシ−D−キシルロー
ス 5−リン酸)経路または非メバロン酸経路またはメバロン酸非依存的経路とも呼ばれ
、グリセルアルデヒド−3−リン酸及びピルビン酸をIPP及びDMAPPに変換する経
路を指す。かかる経路には、典型的に、以下の酵素、すなわち1−デオキシ−D−キシル
ロース−5−リン酸合成酵素(Dxs)、1−デオキシ−D−キシルロース−5−リン酸
レダクトイソメラーゼ(IspC)、4−ジホスホシチジル−2−C−メチル−D−エリ
スリトール合成酵素(IspD)、4−ジホスホシチジル−2−C−メチル−D−エリス
リトールキナーゼ(IspE)、2C−メチル−D−エリスリトール−2,4−シクロ二
リン酸合成酵素(IspF)、1−ヒドロキシ−2−メチル−2−(E)−ブテニル−4
−二リン酸合成酵素(IspG)、及びイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ(IspH
)の作用が関与する。MEP経路、ならびにMEP経路を構成する遺伝子及び酵素はUS
8,512,988に記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
例えば、MEP経路を構成する遺伝子には、dxs、ispC、ispD、ispE、i
spF、ispG、ispH、idi、及びispAが挙げられる。いくつかの実施形態
では、ステビオールは、少なくとも一部はMEP経路を介した代謝フラックスにより生成
され、ここで、宿主細胞は、dxs、ispD、ispF、及び/またはidiの遺伝子
のさらなるコピーを少なくとも1つ有する。US8,512,988に開示されているよ
うに、E.coliにおけるMEP経路を介したテルペノイド生成物の効率的生成につい
ての代用マーカーとして、代謝物であるインドール量を使用できる。
路は、典型的に、以下の段階を触媒する酵素を含む:(a)2分子のアセチルCoAを縮
合させてアセトアセチルCoAにする(例えば、アセトアセチルCoAチオラーゼの作用
による);(b)アセトアセチルCoAとアセチルCoAとを縮合させてヒドロキシメチ
ルグルタリル−補酵素A(HMG−CoA)を形成させる(例えば、HMG−CoA合成
酵素(HMGS)の作用による);(c)HMG−CoAをメバロネートに変換する(例
えば、HMG−CoA還元酵素(HMGR)の作用による);(d)メバロネートをリン
酸化させてメバロン酸−5−リン酸にする(例えば、メバロン酸キナーゼ(MK)の作用
による);(e)メバロン酸−5−リン酸をメバロン酸−5−ピロリン酸(mevalo
nate 5−pyrophosphate)に変換する(例えば、ホスホメバロン酸キ
ナーゼ(PMK)の作用による);及び(f)メバロン酸−5−ピロリン酸(meval
onate 5−pyrophosphate)をイソペンテニルピロリン酸に変換する
(例えば、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ(MPD)の作用による)。MVA
経路、ならびにMEP経路を構成する遺伝子及び酵素は、US7,667,017に記載
されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
、Bacillus subtillus、またはPseudomonas putid
aから選択される細菌であってよい。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Sacch
aromyces cerevisiae、Pichia pastoris、及びYa
rrowia lipolyticaなど、サッカロミセスの一種、ピチアの一種、また
はヤロウィアの一種である。宿主細胞は、IPP及びDMAPPの生成を高めるdxs、
idi、IspD、及びIspFの重複または過剰発現を有するE.coliであってよ
い。
UDP−グルコース基質利用性を高める遺伝子修飾を1つ以上有するE.coliである
。ステビオールのグリコシル化についてUDP−グルコースの利用性を改善するため、一
連の遺伝子ノックアウトと遺伝子挿入を導入して、UDP−グルコースへの炭素フラック
スを高め、かつUDP−グルコースから離れている経路のフラックス(例えば、グリコー
ゲン合成及び炭素貯蔵)を抑制することができる。例えば、遺伝子修飾により、細胞内へ
のスクロースの移入を増加させ、それをスクロースホスホリラーゼの作用によりフルクト
ースとグルコースに分けることができる。それに続く一連のノックアウトにより、一次代
謝を改変して、炭素供給源としてフルクトースのみを使用して生物量を強制的に合成させ
、グルコースを専らUDP−グルコース生合成に向かわせるようにできる。この戦略を実
施するためのE.coli株に対する例示的修飾は表7に掲載されている。修飾について
の詳細は、PCT/EP2011/061891に記載されており、参照によりその全体
が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、1つ以上の遺伝子修飾には、Δg
alE、ΔgalT、ΔgalK、ΔgalM、ΔushA、Δagp、Δpgm、E
coli GALUの重複、及びBacillus substillus UGPA、
BaSPの発現が挙げられる。
なわち、Taxus canadensisのGGPPSまたはその誘導体、Phaeo
sphaeria sp.のPsCKまたはその誘導体、Stevia rebaudi
anaのKOまたはその誘導体、Arabidopsis thalianaのKAHま
たはその誘導体、Stevia rebaudianaのCPRまたはその誘導体(宿主
細胞が発現するCPR酵素はこれのみ)、Stevia rebaudianaのUGT
85C2またはその誘導体、Stevia rebaudianaのUGT74G1の誘
導体のStevia rebaudianaのUGT74G1、Stevia reba
udianaのUGT76G1またはその誘導体、及びMbUGT1−2またはその誘導
体を含む。これらの酵素の各種誘導体を本明細書に開示する。いくつかの実施形態では、
E.coliは、KAH−KOのポリシストロン性発現モジュールを含有し、かつ、染色
体に組み込まれているSrCPR(または誘導体)の単一コピーを含有する。いくつかの
実施形態では、E.coliを修飾して上述のようにUDP−グルコースの利用性を高め
る。いくつかの実施形態では、E.coliは、dxs、idi、ispD、及びisp
F遺伝子のさらなる1コピーを有する。いくつかの実施形態では、インビボでのさらなる
安定性を提供するため、発現タンパク質の1つ以上が2位にアラニンを含有する。
ち、Cornybacterium glutamicumのGGPPSまたはその誘導
体;Erwina tracheiphilaのCPPS及びErwina trach
eiphilaのKSまたはその両方もしくはいずれかの誘導体;Stevia reb
audianaのKOまたはその誘導体;Arabidopsis thalianaの
KAHまたはその誘導体;Stevia rebaudianaのCPRまたはその誘導
体;Stevia rebaudianaのUGT85C2もしくはMbUGTc13ま
たはその誘導体;Stevia rebaudianaのUGT74G1またはその誘導
体(またはMbUGTC19、MbUGTC19−2、もしくはその誘導体);Stev
ia rebaudianaのUGT76G1またはその誘導体(またはMbUGT1−
3の誘導体のMbUGT1−3);及びOsUGT1−2、SrUGT91D2、または
その誘導体、またはMbUGT1−2もしくはMbUGT1,1−2またはその誘導体を
含む。これらの酵素の各種誘導体を本明細書に開示する。いくつかの実施形態では、E.
coliは、KAH−KOのポリシストロン性発現モジュールを含有し、かつ染色体に組
み込まれているSrCPRの単一コピーを含有する。いくつかの実施形態では、E.co
liを修飾して上述のようにUDP−グルコースの利用性を高める。いくつかの実施形態
では、E.coliは、dxs、idi、ispD、及びispF遺伝子の1つ以上(ま
たは全部)のさらなる1コピーを有する。いくつかの実施形態では、インビボでのさらな
る安定性を提供するため、発現タンパク質の1つ以上が2位にアラニンを含有する。いく
つかの実施形態では、E.coliは、約24℃を上回る温度、例えば、約27℃以上、
または約30℃以上、または約32℃以上、または約34℃以上、または約37℃での高
いRebMまたはRebD生産性を提供する。
ば、RebMまたはRebD)を培地から回収することを含む。いくつかの実施形態では
、所望のステビオール配糖体(例えば、RebMまたはRebD)を、濃度が少なくとも
約10mg/L、または少なくとも約100mg/L、または少なくとも約200mg/
L、または少なくとも約500mg/L、または少なくとも約1g/L、または少なくと
も約10g/Lの培地で生成させる。
ることを含む。標的ステビオール配糖体は、例えば、晶出、膜による分離、遠心分離、抽
出、クロマトグラフ分離法または、そのような方法の組合せなど任意の好適な方法により
分離することができる。含有配糖体画分の異なる画分をブレンドして定義済み生成物を調
製することができる。あるいは、RebM及びRebDを、例えば、別々の培養により調
製して精製し、所定の比率でブレンドすることができる。
をE.coli内に生成させる方法を提供する。本発明に従い、E.coli細胞は、本
明細書に記載の酵素を1つ以上含み得る複数のUGT酵素を含み、それらは共同して少な
くとも4、少なくとも5、または少なくとも6(7または8を含む)の連続的なグリコシ
ル化反応を行う。本明細書に開示するように、グリコシル化の基質及び低グリコシル化産
物は、E.coli細胞内に十分に蓄積して下流の反応を許容される速度で進行させ、可
能性の高い膜輸送体の作用により、グリコシル化産物のほとんど大部分が最終的に細胞外
に蓄積する。ステビオール配糖体は、培地成分から精製され得る。したがって、いくつか
の実施形態では、方法は、増殖培地とE.coli細胞を、例えば、回分式、連続式、ま
たは半連続式バイオリアクター処理を使用して分離し、増殖培地から所望のグリコシル化
産物(例えば、RebM)を単離することを含む。
ebM、RebE、RebI及び他のグリコシル化産物)を生成させる方法を提供する。
一般に、所望のステビオール配糖体は、少なくとも2つのグリコシル化、例えば、2つ、
3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、または8つのグリコシル化を有する。いくつかの実施形
態では、ステビオール配糖体はRebMまたはRebDである。宿主細胞内でステビオー
ルを生成させることが既知の酵素の多くは植物酵素であり、それらは至適温度が20〜2
4℃の範囲であることが多いが、E.coliの増殖率及び代謝は、より高温で至適であ
る。本願開示により、24℃を上回る温度、例えば、24℃〜37℃、または27℃〜3
7℃、または30℃〜37℃での酵素産生を可能にすることで、E.coli内にステビ
オール配糖体を高収率で生成させることが可能になる。
の制約を受けることが多いが、いくつかの実施形態の本願開示では、培養を高温で維持す
ることができるため、高収率及び全体的な高生産性をもたらす。いくつかの実施形態では
、培養を約30℃以上、または約31℃以上、または約32℃以上、または約33℃以上
、または約34℃以上、または約35℃以上、または約36℃以上、または約37℃で行
う。
かかる細胞及び方法は商用スケールでの生産性があり得る。いくつかの実施形態では、培
養サイズは少なくとも約100L、少なくとも約200L、少なくとも約500L、少な
くとも約1,000L、または少なくとも約10,000Lである。一実施形態において
、培養を、回分式培養、連続式培養、または半連続式培養で行ってよい。
を提供し、かかるステビオール配糖体成分は、いくつかの実施形態ではRebMまたはR
ebDである。方法は、ステビオール配糖体を生成させる本明細書に記載の株を培養し、
ステビオール配糖体を回収して、かかるステビオール配糖体を、食品、飲料、口腔ケア製
品、甘味料、香味剤、または他の製品などの製品に組み込むことを含む。
、それらには、食品、飲料、テクスチャラント(texturant)(例えば、デンプ
ン、繊維、ゴム、脂肪及び脂肪模倣物、及び乳化剤)、医薬組成物、タバコ製品、栄養補
助組成物、口腔衛生組成物、及び化粧料組成物が含まれるが、これらに限定されない。R
ebMと組み合わせて使用できる香味の非限定的な例には、ライム、レモン、オレンジ、
果実、バナナ、ブドウ、ナシ、パイナップル、マンゴ、ビターアーモンド、コーラ、シナ
モン、砂糖、綿菓子及びバニラの各香味が挙げられる。他の食品成分の非限定的な例には
、香味、酸味料、及びアミノ酸、着色料、増量剤、化工デンプン、ゴム、調質剤、保存料
、抗酸化剤、乳化剤、安定化剤、粘稠剤及びゲル化剤が挙げられる。
、飲料、医薬組成物、化粧品、チューインガム、食卓用製品、穀類、乳製品、練り歯磨き
及び他の口腔用組成物などに高甘味度天然甘味料として組み込まれ得る。
まな生理活性物質または機能性成分と併用することができる。機能性成分は、一般に、カ
ロテノイド、食物繊維、脂肪酸誘導体、サポニン、抗酸化剤、栄養補助食品、フラボノイ
ド、イソチオシアネート、フェノール、植物のステロール及びスタノール(フィトステロ
ール及びフィトスタノール);ポリオール;プレバイオティクス、プロバイオティクス;
フィトエストロゲン;大豆タンパク質;硫化物/チオール;アミノ酸;タンパク質;ビタ
ミン;及びミネラルなどのカテゴリーに分類される。機能性成分を、心血管、コレステロ
ール減少、及び抗炎症など、それらの健康上の利益に基づいて分類してもよい。
性が改善されたゼロカロリー、低カロリーまたは糖尿病用の飲料及び食品を製造するため
に高甘味度甘味料として利用してよい。また、砂糖を使用できない飲み物、食物、医薬品
、及び他製品に使用してよい。さらに、高度に精製された目的ステビオール配糖体(複数
可)、特にRebMは、人の食用に作られた飲み物、食物、及び他製品用だけではなく、
動物用の食餌及び飼料にも、味特性が改善された甘味料として使用することができる。
例には、ウォッカ、ワイン、ビール、蒸留酒、及び日本酒等のようなアルコール飲料、天
然ジュース、清涼飲料水、炭酸入りソフトドリンク、ダイエット飲み物、ゼロカロリー飲
み物、低カロリーの飲み物及び食品、ヨーグルト飲み物、インスタントジュース、インス
タントコーヒー、粉末タイプのインスタント飲料、缶詰製品、シロップ、発酵大豆ペース
ト、醤油、酢、ドレッシング、マヨネーズ、ケチャップ、カレー、スープ、インスタント
ブイヨン、粉末醤油、粉末酢、ビスケット各種、米菓、クラッカー、パン、チョコレート
、キャラメル、キャンディ、チューインガム、ゼリー、プリン、保存加工した果物及び野
菜、新鮮なクリーム、ジャム、マーマレード、フラワーペースト、粉乳、牛乳、アイスク
リーム、シャーベット、瓶詰めした野菜及び果物、豆の水煮缶詰、甘味ソースで煮た肉及
び食物、農産物野菜食品、魚介類、ハム、ソーセージ、魚肉ハム、魚肉ソーセージ、魚の
すり身、魚肉揚げ物製品、魚介類の乾物、冷凍食料品、保存加工海藻、保存加工肉、タバ
コ、医薬品、他多数が挙げられるが、これに限定されるものではない。原則として、その
用途は無限であり得る。
、混合、混練、溶解、酢漬(pickling)、透過、浸出、散布、霧化、注入及び他
の方法のような従来の方法を使用してよい。
udianaの天然成分である。ステビオール配糖体であるレバウジオシドM(RebM
)(図1)は、その味プロファイルにより他のステビオール配糖体の味プロファイルに対
して著しい改善をもたらし、現在使用されているレバウジオシドAのようなステビオール
配糖体に代わる理想的候補ではあるが、その期待に応えられていないのは、ステビア植物
に少量しかないことにある(<0.01%)。ステビオールは、RebMのようなステビ
オール配糖体の化学的コア構造を形成するジテルペノイドである(1)。
例えば、E.coli)及び真核細胞(例えば、酵母)の両方で工学的操作が行われてい
る(2、3)。E.coliのMEP経路は、酵母のMVA−経路より化学量論的に優れ
ており、副生成物の蓄積が少ない(4、5)。新しい代謝工学的方法である多変量モジュ
ラーメタボリックエンジニアリング(MMME)、及びテルペノイドの前駆体を過剰生成
できるプラットフォームE.coli株が記載されている(4、6)。MMMEでは、代
謝ネットワークを明確なモジュールの集合体として再定義することにより、規制及び経路
による障害を評価し排除することが容易になる(7)。代謝回転の類似する酵素を一つの
サブセット、またはモジュールにグループ化し、その後、濃度/活性を調節して各種サブ
セットの代謝回転を一様にすることにより、経路の代謝回転と資源消費量との比を最大に
することができる。
るカウレンを生合成させるために、MMME経路工学をE coliに応用した。次に、
下流の、CYP450介在性の酸化反応を工学的に操作して、ジテルペノイドを足場とす
るステビオールをE.coliで生合成させることができることを実証した。さらに、E
.coliにおいてステビオールをステビオール配糖体に変換する糖鎖付加化学を工学的
に操作して、糖鎖を付加した天然由来物質を作製する技術基盤を開発した。またさらに、
E.coliを工学的に操作して、高いステビオール配糖体生成量を支持する、改善され
た量のUDP−グルコースを作製した。この研究により、再生可能な資源による微生物系
においてRebM(及び本明細書に記載する他のステビオール配糖体)を得るための、経
済的で、商業的に実行可能な供給源が提供される。
ステビオール配糖体はジテルペノイド誘導体であり、その生合成初期経路では、共通の
中間体をジベレリン酸生合成と共有している(8)。全体の直線経路は、4部分、すなわ
ち(1)グルコース由来の中心炭素代謝物から開始前駆体であるIPPとDMAPPとを
形成させる部分、(2)最初に貢献する中間体であるカウレンを生成させる部分、(3)
主要中間体であるステビオールを生合成させる部分、(4)各種のステビオール配糖体を
形成させる部分にモジュール化される。さらなるモジュール(5)を独立して工学的に操
作し、ステビオールのグリコシル化に必要な第2の基質であるUDP−グルコースの増量
生成を支持する。5つのモジュールを図2に示す。
生合成経路、つまりメバロン酸(MVA)経路またはメチルエリスリトールリン酸(ME
P)経路(9)から生じ得る。ステビオール・ジテルペノイド生合成の第1段階は、IP
P及びDMAPPのゲラニルゲラニル二リン酸(GGPP)への変換である。GGPPは
すべてのジテルペノイド分子に対する4サブユニット前駆体である。次に、プロトン化で
開始されるGGPPからコパリル二リン酸(CPP)への環化をCPP合成酵素(CPP
S)により触媒させる。その後、カウレン合成酵素(KS)で触媒されるイオン化依存性
の環化により、CPPからカウレンが生成される。これらの酵素は、ステビアの野生型生
合成経路から同定され明らかにされている。このほかには、GGPPをカウレンに変換す
ることが基部植物(Physcomitrella patens)及び真菌種(例えば
、Gibberella fujikuroi及びPhaeosphaeria sp.
)から明らかになっている、二機能性酵素がある(10、11)。その後、カウレンを、
P450モノオキシゲナーゼであるカウレンオキシダーゼ(KO)によって3段階反応で
カウレン酸に酸化させる。完全長のKO cDNAを酵母に発現させ、それによりカウレ
ンがカウレン酸に変換され得ることが示された(12)。経路の次の段階は、カウレン酸
13−ヒドロキシラーゼ(KAH)によるカウレン酸の水酸化である。シトクロムP45
0であるKAHを酵母に発現させ、それによりカウレン酸がステビオールに変換された(
13)。
ス部分がステビオールのコアに結合される。これらの活性に関与するグリコシルトランス
フェラーゼ酵素(EC2.4.1.17)は、UDP−グルコースのグルコース成分の疎
水性低分子(この場合はステビオール分子)への移動を触媒する(14)。O−グリコシ
ル化は、ステビオールのC13位及びC19位で生じ(図1)、その後、これらの両O−
グリコシルにおける1−2’グリコシル化及び1−3’グリコシル化により合計6つのグ
リコシル化がもたらされる。グリコシル化の順序は、さまざまな中間生成物によってC1
3またはC19のグリコシル化、ならびに、1−2’または1−3’グリコシル化に与え
られる順序に変化が生じ、極めて複雑になり得る(図3)。中間生成物のプールがSte
via rebaudianaに蓄積すると仮定した場合、RebM生成経路で可能性が
高いのは、ステビオール>ステビオールモノシド>ステビオールビオシド>ステビオシド
>レバウジオシドA>レバウジオシドD>レバウジオシドMである。ただし、これは、微
生物の生合成系における代替経路を除外するものではない(図3)。
生合成経路の工学的操作を介してIPP及びDMAPPの経路を変更するための、上流イ
ソプレノイド経路の工学技術を進歩させることは、好都合な微生物系バイオプロセスで精
製された高品質のステビオール配糖体を、持続可能に管理製造するための基盤となる。植
物を用いる現在の製造及び精製のスキームにはコスト削減という重要な課題がある。植物
経路を微生物宿主に再構築して使用する本明細書に記載の微生物経路は、現在の方法を改
善し、天然では存在量が非常に少ないステビオール配糖体を優れた品質で生成させる優れ
た機会を提供する。
イド前駆体である。カウレンの生合成は、テルペノイドの汎用的な前駆体IPP及びDM
APPから3段階で構成される。IPP及びDMAPPからの3段階反応は、酵素GPP
S、CPS及びKSまたは二機能性CPPS/KS酵素により触媒される。カウレンまで
の全体的経路は2つのモジュールにグループ化される(図2)。異なる生物に由来するい
くつかの酵素で、IPP及びDMAPPからGGPPへの変換(15〜18)及びGGP
Pからカウレン(9〜12、18)への変換及びカウレンからステビオールへの変換(1
2、19〜24)が明らかになっている(表1)。ステビアなどの高等植物では、GGP
Pからカウレンへの生合成は、コパリルピロリン酸合成酵素(CPPS)及びカウレン合
成酵素(KS)と呼ばれる酵素が仲介する2段階反応として行われる。基部植物(Phy
scomitrella patens)及び真菌(例えば、Gibberella f
ujikuroi及びPhaeosphaeria sp.)種では、GGPPからカウ
レンへの生合成は、これらの生物で明らかになっている二機能性酵素により行われる。同
様に、複数の酵素がクローニングされ、IPP及びDMAPPを変換してGGPPにする
ことが明らかになっている。したがって、カウレン生合成の工学的操作へ向けた第1段階
は酵素の選択である。カウレンの生合成について試験するために異なる種に由来する酵素
を選択した(表1)。タキサジエン生合成についてMMMEで最適化した研究から、Tc
GPPSの動態は、タキサジエンの約1g/Lでの製造を支持できるものであり、したが
って他のジテルペンの製造も支持できることがわかった。最良のカウレン合成酵素オーソ
ログを同定するため、上流の候補酵素としてTcGPPSを選択した。次いで、上流経路
を工学的に操作した株で経路を試験するため、KS−CPS−GGPPS(KCG)また
は二機能性PsCK−GGPPS(CKG)を含んでいるオペロンを選択した。下流カウ
レン経路の発現を調節するため、KS−CPPS−GGPPS(KCG)及びCK−GG
PPS(CKG)オペロンを、コピー数及びプロモーター強度をさまざまに変えてプラス
ミド系にクローニングした(p5Trc、p10Trc、p20Trc及びp5T7)。
さらに、カウレンの各オペロンの1コピーを、発現レベルがさまざまに異なる上流経路と
共に、強度がさまざまに異なるプロモーター下でE.coli染色体に組み込んだ。
ざまに変えて株を選択した。これらの株を、小規模(2mL)Hungateチューブ発
酵に供し、表現型の特性及びカウレン生産性の特徴付けを行った。図4に示すように、複
雑な非線形のカウレン蓄積が観察された。興味深いことに、植物種由来のKS(SrCP
PS、SrKS及びPpCK)は同様のプロファイルを示したが(図4A、B)、真菌酵
素で構築した経路(GfCK及びPsCK)では、非常に類似したパターンの生成物蓄積
が示された(図4C、D)。興味深いことに、真菌酵素を組み込んでいる経路の低コピー
発現は、植物酵素経路より比較的高い生産性を示した。生成物力価の最大値(約140m
g/L)は、植物酵素のみを用いた構成体によるものである(図4A、すなわち、Ste
via rebaudiana遺伝子を用いて上流をTrcプロモーター下、下流をプラ
スミドp20Trcに構築した株)。しかし、完全に染色体に組み込んだ真菌経路の酵素
(PsCK)(図4D、すなわち、上流にTrc、下流にT7−PsCKGを有する株)
では約100mg/Lのカウレンが生成された。これら2株の下流成分の発現を比較する
と、同一強度の上流経路Ch1TrcMEP下で、Ch1T7PsCKG経路はp20T
rcSrKCG(35a.u.)より23倍低い(1.5a.u.)(4)。多段階/マ
ルチモジュール経路の性能の主要駆動力は、フラックスにおける至適バランスである。今
回の下流発現を非常に低くした、Ch1TrcMEP及びCh1T7PsCKGで構築し
た株において、我々は、最高100mg/Lのカウレン生成を達成した。これにより、P
sCK酵素はバランスのとれた経路発現下で高フラックスを支持できることが実証された
。さらに、本研究から、異なる経路バランス下のジテルペン生成物プロファイルが複雑な
非線形挙動であることについての洞察も与えられた(図5、6、及び表2)。このような
、フラックス調節がさまざまに異なる場合の、経路による生成物選択性に関する複雑な挙
動は、多変量モジュールによる経路最適化の力を明確に示している。至適バランス下では
、株は、生成物プロファイルで高い選択性を示し得る(図6D、株47)。さらに、多変
量モジュールによる検索で、最良の変異型カウレン酵素(PsCK)を選択し、さらに高
生産性の株を人工的に作り出すことができた。この至適株(すなわち、株47)をバイオ
リアクターシステムで増殖させた際、我々は、培地または工程の改善を最小限に抑えつつ
、カウレンを1.6g/L生成できる株を作製することができた(図7)。MMMEは、
経路のさらなる最適化へ向けた洞察も与えるとともに、同様の手法を使用してGGPPS
酵素の最良の変異型(表1)を同定する一助となる。その上、タキサジエン生成株に対す
る経路操作で観察されたように、カウレン生成もまた、抑制分子インドールの生成と逆相
関を示した(図8)。
与している(図3)。P450は、数千の天然由来物質の代謝経路に関与する重要な酸化
酵素である(25)。最近まで、科学コミュニティーでは、野生型の真核生物宿主(例え
ば、植物または酵母)に比べると、E.coliなど細菌宿主は、こうした重要な天然物
化学反応の実施には理想的な系ではないと考えられていた。しかし、E.coliにおい
てタキソールの生化学を最適化する間に、P450酵素の生化学、具体的にはE.col
iにおけるP450酵素の使用に関する生化学に関与する構造と機能との機構的関係につ
いて理解が深まった。N末端膜領域の操作と、CYP450酵素及びその補因子のP45
0レダクターゼ(CPR)の各酵素の至適組み合わせの構築とを至適に行うことは、機能
発現にとって重要である。CYP450酵素を機能発現させ、タキサジエン、バレンセン
、リモネンまたはカウレンなどの複雑な天然テルペノイドの天然由来物質をインビボで酸
化させるために、いくつかの酵素/経路最適化技術が開発された。
ゼ(KAH)ならびにCYP450レダクターゼ(CPR)の異なる2種のCYP450
酵素に仲介される。候補となるいくつかの遺伝子/酵素を同定し、ステビオール生合成に
おける酸化及び水酸化反応のためのP450酵素として注釈を付した(表1)。カルボキ
シル化及びヒドロキシル化のための酵素であるKO及びKAHを機能発現させるには、タ
ンパク質の再設計及び工学操作が必要である。我々は、E.coliにおいて改善された
機能発現をさせるためのSrKO酵素を再設計しクローニングすることから開始した。バ
イオインフォマティクス解析を徹底的に行った後、N末端に欠失及び修飾のあるKO酵素
をいくつか構築した(図9A)。SrKOと補因子シトロクロム(cytrochrom
e)P450レダクターゼ酵素(SrCPR)とを、融合タンパク質(「リンカー」構成
体)として、またはポリシストロン性モジュール(「オペロン」構成体)としてpET4
5d発現ベクターに組み込んだ構成体(図9B)を創作した。E.coli内のこれらの
構成体でのタンパク質生成及び相対的溶解度をSDS−PAGEを使用して評価した(図
9C)。
n vivo機能活性を試験した。これらの構成体を形質転換してカウレン生成株3、9
及び11とし(表2)、カウレンからカウレン酸への変換を試験した(表3)。設計した
キメラ酵素は機能的に活性であったが、酵素の反応性が不完全であったためカウレノ−ル
及びカウレナールが生成された。N末端に欠失のある各種KO構成体すべてのうち、KO
の39AAを欠失させた構成体が、4及び20アミノ酸を欠失させた構成体より機能的に
活性であった。さらに、オペロンとして発現させたSrKO及びSrCPRは、SrKO
及びSrCPRから構築した融合酵素と同様の活性を示した。この当初の研究に続いて、
我々はSrKO酵素を3遺伝子のKAH−KO−CPRモジュールの一部としてさらに最
適化し(下記を参照されたい)、この構成体のうち、至適SrKO構成体はN末端からア
ミノ酸残基20個を欠失させており、カウレンからカウレン酸に完全に変換された(下記
を参照されたい)。
レン酸への変換に重要であることがわかった。高量の基質(カウレン)プールが利用可能
な場合(株9)、カウレンは酸化経路で約60mg/Lの酸素化カウレン化合物に変換さ
れた。Arabidopsis thalianaのKO酵素の酵素活性に関するこれま
でのインビトロ研究から、この酵素で、カウレンのアルコール誘導体、ジオール誘導体、
及びアルデヒド誘導体が生成されることが実証された(12)。同様の生成物多様性はタ
キソールP450酵素でも見られるが、その場合、経路全体のバランスの再調整によって
生成物プロファイルが変化し、水酸化されたタキサンのみが生成された。これを受け、K
OのP450モジュールと上流モジュールとのバランスを再調整するため、株操作研究を
開始した。モジュールバランスを再調整するため、KO経路を、染色体に組み込んだカウ
レン高生成株(株47)に導入し、活性及び生産性について試験した(図10)。異なる
生物由来のオーソロガスなKO酵素の設計、合成及び試験も行い(表1)最良の変異型酵
素を同定した。カウレン経路の場合と同様に、多変量での経路最適化を実施し、フラック
スのバランスをさまざまに変えて最良の変異型酵素の同定、及びそれらの非線形生成物プ
ロファイルと生成物分布の確認を行った(図11)。その後、野生型バックグラウンドの
点変異体コレクションの設計及び検証を行ってSrKO活性を改善した(表4)。
み、酵素KAHによりカウレン酸のC13位炭素で水酸化が起こりステビオールが得られ
ることを検証した(図1及び2)。SrKO及びSrCPRのポリシストロン性発現につ
いての研究から、この酵素が独立成分として発現し、機能活性を維持し得ることがわかっ
た。KO及びKAH両酵素が、SrCPR酵素単一を用いた場合も機能的に活性であるか
どうかを測定した。プラスミド数を制限し、KO及びKAHの発現バランスを調整するた
めに、SrCPRの単一コピーをカウレン操作株の染色体に組み込んだ。KO及びKAH
を、p5Trcプラスミド下のポリシストロン性発現として構築した。全株(表5)を4
日間発酵させ酢酸エチルで抽出しGC−MS分析を行ったところ、検出可能レベルのステ
ビオールが検出された。
を同定し、その際、操作した各種バージョンのKO及びKAHの両候補をCPR補因子酵
素を有するポリシストロン性オペロンでインビボ発現させることを手段とした(図12)
。AtKAH酵素を点変異の活動(campaign)でさらに増強させた。合理的な方
法を使用してAtKAH配列の単一点変異コレクションを設計し、カウレン酸からステビ
オールへの変換を改善するために野生型酵素の安定性、溶解度、または活性を高めること
を目標とした。野生型AtKAHに対する点変異及び対応する倍率変化の改善を表6にま
とめ、図13に表示している。その後、これらの点変異のいくつかをAtKAH酵素で組
み換え、カウレン酸をステビオールに完全に変換することができる組換え酵素を同定した
(図14)。至適なSrKO及びSrCPRを有するオペロンで発現させると、カウレン
からステビオールへの完全変換が示され(図15)、このことは、経路成分を慎重にバラ
ンス調整することの重要性をさらに強調している。
複数のグリコシル化を支持するため、利用可能なUDP−グルコース量を増加させようと
するバックグラウンドE.coli株に一連の修飾を導入した。UDP−グルコースへの
炭素フラックスを増加させること、及び低分子グリコシル化(すなわち、グリコーゲン合
成及び炭素貯蔵)に従っていない、UDP−グルコースから離れている経路のフラックス
を抑制することを目的として、一連の遺伝子ノックアウト及び遺伝子挿入を行った。かか
る設計により、スクロースを細胞内へ移入させること、及び移入させたスクロースを、ス
クロースホスホリラーゼの作用によりフルクトースとグルコースに分けることが可能にな
る。炭素供給源としてスクロースを使用して細胞増殖が行われている場合、その後の一連
のノックアウトにより一次代謝が改変され、炭素供給源としてフルクトースのみを使用し
て生物量が合成されるよう強制し、グルコースがUDP−グルコース生合成だけに向かっ
て集められる。ただし、炭素供給源としてグリセロールまたはグルコースで増殖させたい
ずれの場合でも、細胞には依然として増殖能があり、かつUDP−グルコース利用性が改
善されている。この戦略を実現する、E.coli株に施用される特定の修飾は表7に掲
載されている。これらの修飾で低分子のグリコシル化が増強されたか否かを試験して測定
したところ、カフェ酸(培地に添加)のインビボでのグリコシル化の増強が操作株により
示され、実際に増強させることが実証された(図16)。
UGTの組立て体を使用してUDP−グルコースでグリコシル化させた(表8及び9)。
これらの化学反応には、(1)ステビオールのC13におけるO−グリコシル化、(2)
ステビオールのC19におけるO−グリコシル化、(3)C13 O−グルコースまたは
C19 O−グルコースにおける1−2’−グリコシル化、及び(4)C13 O−グル
コースまたはC19 O−グルコースにおける1−3’−グリコシル化(上記反応すべて
を含む例については図1を参照されたい)が含まれる。C13の酸素及び/またはC19
の酸素の一方または双方が一旦グリコシル化されたら、さらなるグリコシル化を1−2’
または1−3’を加えてO−グルコースに付加できる。以下に記載するように、これらの
UGTは、基本的にはそれらのドメインのシャッフリングにより修飾されており、目的の
点変異でさらに増強され、所望の最終生成物であるRebMまでのフラックスを増強させ
る。MMME法を用いて4種のUGTを可能なあらゆる組み合わせに迅速に組み合わせ、
ステビオール生成株をバックグラウンドにして得られた構成体をインビボでスクリーニン
グした(図17)。最適なポリシストロン性配置に組み立てた改善UGTと他の4つのモ
ジュールとを単一E.coli株に組み合わせた。我々は、その株を培養し、レバウジオ
シドMをもたらすステビオール配糖体のインビボ生成を実証した(図18)。かかる株は
合計5.7mg/Lのステビオール配糖体を生成でき、それには100μg/LのReb
Mが含まれている。可能なあらゆる構成体を作製し、それらを、プロモーター強度をさま
ざまに変えてプラスミドで発現させるかまたは染色体に組み込んで発現させることにより
、RebD:RebM比が1:1から0:1(残ったRebDなし)に至るまでの範囲で
あるステビオール配糖体生成物プロファイルを得た。
させるために、E.coliに2つのシトクロムP450モノオキシゲナーゼを機能的に
発現させたのは今回が初めてである。その上、カウレンをステビオールに変換するために
、1個のCPR酵素が両P450酵素(KO及びKAH)の補因子として作用した。これ
は、E.coli系でのP450介在性酸化反応の工学操作における、もう1つの重要な
躍進である。さらに、我々の知る限り、4つのUGTを単一E.coli株に組み合わせ
、それが、テルペノイドのコア分子を順次6回グリコシル化させてレバウジオシドMを単
独のステビオール配糖体中間生成物として生成する能力があることを実証したのは今回が
初めてである。これは、UGTの工学的操作、及び希少なステビオール配糖体を持続可能
に生成するための基盤確立における大きな前進である。
酵素に対して作用する自然選択では、十分な安定性及び生物学的機能の活性について選
択しようとする。このプロセスで、酵素は特定の進化経路へ送られるが、これは産業用途
に求められる安定性と活性の獲得に容易に適合しないことがある。一例として、特定の一
基質に特化した酵素は、特化していなかった酵素よりも新しい基質の人工操作で問題が多
くなりがちである。したがって、ドメインの接続を交換して酵素を「振り混ぜる」ことに
より、タンパク質の折り畳みは同一であるが、折り返しの相互作用と折り込まれている相
互作用とが新規である、新たに選択及び進化の対象となるであろう酵素が創作される可能
性がある。言い換えれば、アミノ酸変異を何ら導入することなく、単純に配列をシャッフ
リングし、酵素をその本来の進化経路から移動させることによって、タンパク質の折り畳
みから進化空間の別のポイントへと「飛ぶ」ことができる可能性がある。
の基質結合(糖受容体)ドメインと、より保存されたC末端のUDP−グルコース結合(
糖供与体)ドメインという2つのドメインがある。N末端ドメインで酵素の基質特異性の
ほとんどが決定されるが、一部の特異性はC末端ドメインにより制御される。これらのド
メイン各々がそのタンパク質のおよそ半分ずつを作っている。この2ドメイン構造を考え
たとき、我々は、タンパク質を半分に切断して新たなN末端とC末端を作り、本来のN末
端とC末端とを共に結合させれば(例えば、円「順列変異法(permutizatio
n)」)、酵素が「シャッフル」され、また(得られる酵素は、選択という圧力から生じ
たものではないと考えらえることから)人工的に活性を改善する新たな機会が作られるで
あろうという仮説を立てた。
のグリコシル化活性を有する公知のUGTとの相同モデルを作製する(図19);(ii
)その相同モデルを使用して、N末端残基とC末端残基の間の距離を推定する;(iii
)既存のN末端とC末端とを連結するさまざまな長さのリンカーを設計する;(iv)新
たなN末端及びC末端となる酵素内の位置を選択する;(v)得られる配列を合成する;
(vi)インビボ及びインビトロで発現させ、親活性を保持するあらゆるシャッフル酵素
を同定する;(vii)シャッフル酵素の新しい相同モデルから情報を得て、合理的操作
法によって各設計を変更する;(viii)所望の活性改善が達成されるまで工程vii
を繰り返す。リンカーを作製する場合(工程iii)、N末端残基及びC末端残基の同定
を行い、各末端に最も近いが、相同モデルの構造に基づきタンパク質の残りの部分と直接
相互作用すると予測されるものを同定する(図20)。新たなN末端とC末端用に切断部
位を選ぶ場合(工程iv)(図21)、二次構造エレメント間のループ領域を選ぶが、か
かるループ領域は、ドメイン構造を維持しており、可能な限り配列の中間に近く、また、
溶媒露出していて活性部位から離れているものを選ぶ。
て設計、合成し、かつ組み込みを行った(親酵素はそれぞれ、SrUGT85C2、Sr
UGT74G1、OsUGT1−2(Q0DPB7_ORYSJ)(28)、及びSrU
GT76G1である)。4活性はいずれも円順列変異体で機能した。一例として、データ
は、第1回目の円順列変異体操作で得た新規な酵素MbUGT1−2を示し、親酵素Os
UGT1−2と同等の活性を示している(図22)。シャッフル酵素に対して行った次の
改良では本来の親配列より活性が増強された酵素が生成され、このシャッフリング法が改
善された酵素を生成することについての可能性を示している(図23)。これらの改良は
、シャッフル酵素の新規なN末端とC末端を形成している位置と特定残基に対する、より
微細なスケールでの修飾、ならびに親のN末端とC末端を連結するリンカーの長さとアミ
ノ酸配列を改良することに焦点を当てる。
たらされ(図24及び25)、酵素配列をシャッフリングすることによって有意に改善す
る機会がかかる方法により作られたことが確認された。しかしながら、MbUGT1−2
に改善された活性を付与したこれらの点変異を親OsUGT1−2バックグラウンドで試
験したところ、中性であるかまたは活性に悪影響があることがわかった(図26)。新規
酵素と親配列の間には点変異の移動可能性がないことから、円順列変異法(circul
ar permutization)は、UGT酵素を改善する機会を得るための有益か
つ普遍的な方法であることが確認された。
円順列変異法(circular permutization)によって生じた酵素
のシャッフリングと同じように、N末端の低分子糖受容体である結合ドメインまたはC末
端の糖供与体である結合ドメインを、既知のUGT同士で交換することによって、グリコ
シルトランスフェラーゼ酵素をシャッフルする代替的方法を創作した。例えば、SrUG
T85C2のN末端ドメインとSrUGT76G1のC末端ドメインとで構成されるキメ
ラ酵素を創作した(図27)。このアプローチの背後にある根拠は、UGT酵素のドメイ
ンをシャッフリングするという概念にあるが、今回に限り特別に、各UGT間でドメイン
をシャッフリングするというニュアンスを加えた。その意図するところは、エネルギー全
体像において親酵素が占めているポイントから離れて、新たに最適な酵素立体配置へ向け
たさらなる進化が可能な、新規な配列の非最適化酵素を生成株に作製することにある。こ
こでも、この酵素はそれ自体が自然選択を受けた結果生じたものではないため、このキメ
ラ法で生じたシャッフル酵素は、高い進化可能性/点変異から良好な利益を受ける大きな
可能性(すなわち、より高い活性)を有していなければならない。さらに、この方法を使
用して、折り畳み及び/または安定性が増強されたキメラタンパク質を作製することがで
きる。
候補UGTを同定する、(2)2つのUGT同士でキメラを作製するための乗換え位置(
crossover position)を選択する(すなわち、2つの配列をつなぎ合
わせるポイントを選択する)、(3)C末端ドメイン(ヌクレオチド−炭水化物の結合ド
メイン、例えば、UDP−グルコース結合ドメイン)を、構造上の考察に基づき、低分子
基質またはN末端低分子結合ドメインとの相互作用が改善されるよう変異させる、(4)
キメラ構成体を創作して活性について試験する、という各工程を使用する。この方法は、
潜在的なあらゆるUGTの機能的性能を改善するために一般化及び適用することができる
。UGTのドメイン構造が保存されていれば、2つのUGTのいずれに由来するドメイン
でも組み合わせ可能と考えられる。
ゼ酵素修飾
ステビア植物から明らかになっている、十分量で生じるステビオール配糖体は約20種
のみであるが、生合成により生成され得る、グリコシル化パターンの異なった考えられる
ステビオール配糖体がさらにいくつかある。表10及び図29、30、31及び32には
、本項に記載するステビオール配糖体として可能性の高い、既知のステビオール配糖体が
まとめられており、それらは符号SG#で略称されている。これらのグリコシドには天然
に存在するものもあれば、本明細書に記載の4つのグリコシル化反応(すなわち、C13
−O−グリコシル化、C19−O−グリコシル化、1,2’−グリコシル化、及び1,3
’−グリコシル化)を触媒するUGTを使用して生合成が可能なものもある。
/またはC19−グルコピラノシルステビオール(SG2)からルブソシド(SG5)、
及び/またはSG4からSG10、及び/またはSG7からSG11、及び/またはSG
13からSG17、及び/またはSG19からSG29、及び/またはSG23からSG
31への変換を改善するために、野生型酵素の安定性、溶解度、または活性を高めること
を目的として、SrUGT85C2配列(C13−O−グリコシル化活性を有する)にお
ける単一点変異、二重点変異、及び三重点変異のコレクションを設計した。野生型SrU
GT85C2に対する点変異及び対応する倍率変化改善を表11にまとめ、図32及び3
3に表示している。
(SG2)、及び/またはステビオールモノシド(SG1)からルブソシド(SG5)、
及び/またはステビオールビオシド(SG3)からステビオシド(SG8)、及び/また
はSG6からレバウジオシドG(SG9)、及び/またはレバウジオシドB(SG12)
からレバウジオシドA(SG16)、及び/またはSG18からSG28、及び/または
SG22からSG30への変換を改善するために、野生型酵素の安定性、溶解度、または
活性を高めることを目的とした、SrUGT74G1配列(C19−O−グリコシル化活
性を有する)における単一点変異、二重点変異、及び三重点変異のコレクションを設計し
た。
ド(SG3)、及び/またはC19−グルコピラノシルステビオール(SG2)からSG
4、及び/またはルブソシド(SG5)からステビオシド(SG8)、及び/またはルブ
ソシド(SG5)からSG10、及び/またはルブソシド(SG5)からレバウジオシド
E(SG14)、及び/またはSG6からレバウジオシドB(SG12)、及び/または
SG7からSG13、及び/または及び/またはステビオシド(SG8)からレバウジオ
シドE(SG14)、及び/またはSG10からレバウジオシドE(SG14)、及び/
またはレバウジオシドG(SG9)からレバウジオシドA(SG16)、及び/またはレ
バウジオシドG(SG9)からSG21、及び/またはSG11からSG17、及び/ま
たはSG11からSG20、及び/またはレバウジオシドB(SG12)からSG22、
及び/またはSG13からSG23、及び/またはSG15からレバウジオシドI(SG
26)、及び/またはSG15からSG27、及び/またはレバウジオシドA(SG16
)からレバウジオシドD(SG24)、及び/またはレバウジオシドA(SG16)から
SG30、及び/またはSG17からSG25、及び/またはSG17からSG31、及
び/またはSG20からSG25、及び/またはSG21からレバウジオシドD(SG2
4)、及び/またはレバウジオシドD(SG24)からSG37、及び/またはSG25
からSG39、及び/またはレバウジオシドI(SG26)からレバウジオシドM(SG
32)、及び/またはレバウジオシドI(SG26)からSG38、及び/またはSG2
7からレバウジオシドM(SG32)、及び/またはSG27からSG40、及び/また
はSG28からSG33、及び/またはSG29からSG35、及び/またはSG30か
らSG37、及び/またはSG31からSG39、及び/またはレバウジオシドM(SG
32)からSG43、及び/またはレバウジオシドM(SG32)からSG44、及び/
またはSG34からSG41、及び/またはSG36からSG42、及び/またはSG3
8からSG43、及び/またはSG40からSG44、及び/またはSG41からSG4
7、及び/またはSG42からSG48、及び/またはSG43からSG46、及び/ま
たはSG44からSG46への変換を改善するために、野生型酵素の安定性、溶解度、ま
たは活性を高めることを目的として、MbUGT1−2配列(1−2’グリコシル化活性
を有する)における単一点変異、二重点変異、及び三重点変異のコレクションを設計した
。野生型MbUGT1−2に対する点変異及び対応する倍率変化改善を表12にまとめ、
代表的反応を図24及び25に示す。
はC19−グルコピラノシルステビオール(SG2)からSG7、及び/またはステビオ
ールビオシド(SG3)からレバウジオシドB(SG12)、及び/またはSG4からS
G13、及び/またはルブソシド(SG5)からレバウジオシドG(SG9)、及び/ま
たはルブソシド(SG5)からSG11、及び/またはルブソシド(SG5)からSG1
5、及び/またはステビオシド(SG8)からレバウジオシドA(SG16)、及び/ま
たはステビオシド(SG8)からSG20、及び/またはレバウジオシドG(SG9)か
らSG15、及び/またはSG10からSG17、及び/またはSG10からSG21、
及び/またはSG11からSG15、及び/またはレバウジオシドB(SG12)からS
G18、及び/またはSG13からSG19、及び/またはレバウジオシドE(SG14
)からレバウジオシドD(SG24)、及び/またはレバウジオシドE(SG14)から
SG25、及び/またはレバウジオシドE(SG14)からレバウジオシドM(SG32
)、及び/またはレバウジオシドA(SG16)からレバウジオシドI(SG26)、及
び/またはレバウジオシドA(SG16)からSG28、及び/またはSG17からSG
27、及び/またはSG17からSG29、及び/またはSG20からレバウジオシドI
(SG26)、及び/またはSG21からSG27、及び/またはレバウジオシドD(S
G24)からレバウジオシドM(SG32)、及び/またはレバウジオシドD(SG24
)からSG33、及び/またはSG25からレバウジオシドM(SG32)、及び/また
はSG25からSG35、及び/またはレバウジオシドI(SG26)からSG34、及
び/またはSG27からSG36、及び/またはSG28からSG34、及び/またはS
G29からSG36、及び/またはSG30からSG38、及び/またはSG31からS
G40、及び/またはレバウジオシドM(SG32)からSG41、及び/またはレバウ
ジオシドM(SG32)からSG42、及び/またはSG33からSG41、及び/また
はSG35からSG42、及び/またはSG37からSG43、及び/またはSG39か
らSG44、及び/またはSG41からSG45、及び/またはSG42からSG45、
及び/またはSG43からSG48、及び/またはSG44からSG47への変換を改善
するために、野生型酵素の安定性、溶解度、または活性を高めることを目的として、Sr
UGT76G1配列(1−3’グリコシル化活性を有する)における単一点変異、二重点
変異、三重点変異、または四重点変異のコレクションを設計した。野生型SrUGT76
G1に対する点変異及び対応する倍率変化改善を表13にまとめ、代表的反応を図35及
び36に示す。
22℃を上回る温度での最適下限を決定するためカウレンモジュールにおける酵素の性
能を測定した。先の実施例に使用したGGPPS(ゲラニルゲラニル二リン酸)シンター
ゼ酵素及び二機能性コパリル二リン酸(CPP)/カウレンシンターゼ酵素の代替的酵素
のクラスターを同定した。特に、E.coliにおいて細菌酵素のほうが植物酵素及び真
菌酵素より良好に機能する場合があることから、細菌供給源に由来する代替的酵素を検討
した。可能な場合は好熱性細菌由来の酵素を検討した。CPP合成酵素及びカウレン合成
酵素の活性については、根圏細菌がその共生ライフスタイルからカウレン生成性であるこ
とが多いため、根圏細菌の遺伝子を同定した。
いて改善された性能を示し、それらには海洋細菌443、Synechoccus sp
.、Thermotoga maritima、Cornybacterium glu
tamicum、及びPyrobaculum calidifontisが含まれる。
cheiphila(Et)のCPPS及びEtKSが、高温における改善された活性を
示した。
した。かかる株は、FAB46−MEP、T7−PsCKS−AnGGPPS、T7−A
tKAH−SrKO−SrCPR、T7−MbUGT1,3−MbUGT1,2−MbU
GTc13−MbUGTc19を含んでいるpBAC単一コピー染色体を有するE.co
li K12であった。図41に示すように、RebMの力価は55.5mg/L、ステ
ビオール配糖体総力価は58.3mg/Lであったが、これは、RebM94.4%に等
しい。RebM:RebD比は64.5:1(単位:グラム)であった。
の大部分が細胞から排泄されている。図42は、細胞内及び細胞外の物質を合わせて、細
胞の内側と外側とで蓄積生成物のパーセンテージを比べている。これは、ほとんどが細胞
内の蓄積を示し、ステビオール配糖体の収率が実質的に少なかった当初の研究と対照的で
あった。当初の研究では力価が低かったために、蓄積された生成物プールでは、細胞の外
へ生成物をポンピングするのに必要な能動輸送機序に不十分だったことが考えられる。実
際、力価の上昇に伴い、細胞の外側に蓄積した生成物の割合が大きくなり、これは、推定
上のポンプ活性の閾濃度を一旦超えると、残りの生成物が運び出されることを示している
。中間生成物プールが輸送体のKb以下に維持されれば、炭素が外部に失われることなく
、C−フラックスを最終生成物まで効果的に押し出させることができるため(例えば、ス
テビオール配糖体中間体が一旦ポンピングで出されると、そこからさらにグリコシル化さ
れてRebMなど所望の生成物になることができない)、これらのデータは、株の工学的
操作の観点及びE.coliにおける商用生産の点で非常に有望である。
A、Bは、34℃でのステビオールモノシドの生成を示す。図43Cは、選択した変異体
の22℃、30℃、及び34℃でのステビオールモノシド生成を示す。いくつかの変異は
、34℃で高いステビオールモノシド生成を示し、変異P215Tが生成量が最も多かっ
た。
は、ステビオールから13C−c19−Glu−ステビオールへの変換(図44A)及び
ステビオールビオシドから13Cステビオシドへの変換(図44B)を示す。
グした。図45に示すように、C331Iでは実質的な熱安定性が得られた。C331I
はt14バックグラウンドで作製されたものである。
、ならびにステビオールモノシドから13cステビオールビオシドへの変換(図46B)
について30℃及び34℃でスクリーニングを行った。これらの試験から、残基196に
おいて切断して新たなN末端を創出し、S16W、H422E、R430E、R434H
に変異が導入された円順列変異体が得られた(MbUGT1,2−2)。これらの試験で
は、これらの酵素を生成する細胞に列記した温度で4時間のタンパク質生成を誘導して抽
出し、一晩インビトロでアッセイを行った。基質濃度は1mMである。
種モジュール構成体間の30℃でのカウレン生成を示し、図48は、各種モジュール構成
体間の34℃でのカウレン生成を示す。30℃では、バックグラウンドT7MEPのCh
1.T7−PsCK−AnGGPPSが最も高いカウレン力価(約15mg/L)を与え
た。34℃では、バックグラウンドT7MEPのCh1.T7−PsCK−AnGGPP
Sが最も高いカウレン力価(約2mg/L)を示した。
。条件は、R培地+グルコース、96ディープウェルプレート、30℃または34℃にて
3日間という条件であった。株のバックグラウンドはp5Trc−(8RP)t14At
KAH−O−(8RP)t20SrKO−O−FLSrCPRであった。図49は、At
KAH点変異のライブラリー全体を通した30℃でのステビオールの生成を示す。図50
は、AtKAH点変異のライブラリー全体を通した34℃でのステビオールの生成を示す
。各種点変異は、30または34℃におけるステビオールの高力価に示されるように、野
生型の熱耐性を改善している。
℃、33℃、及び37℃で活性について試験した。図51(A)、(B)は、MbUGT
1_2円順列変異体の30℃、34℃、及び37℃での活性を示す。パネル(A)は、R
ebAからRebDへの変換を示し、パネル(B)は、ステビオールモノシドから13C
ステビオールビオシドへの変換を示す。いずれも、円順列変異体の発現を誘導し、その後
、4時間のインキュベーションを行った。示されているように、EUGT11は30℃以
上で誘導するとその活性を失った。対照的に、誘導円順列変異体は30℃で最も活性が高
いようである。MbUGT1_2 196Lは、両基質で最も高い活性を保持している。
ノシドに変換するUGT85C2変異体の活性を示す。発現を誘導し、その後、4時間の
インキュベーションを行った。示されているように、85C2−WT及び各誘導は、34
℃及び37℃で同程度の活性を保持しており、30℃での最も高い活性を維持している。
るUGT76G1変異体の活性を示す。発現を誘導し、その後、4時間のインキュベーシ
ョンを行った。76G1−L200Aは、高温で誘導してアッセイを行った場合に特に活
性であり、タンパク質量の多さによる可能性がある。
オシドに変換するUGT74G1円順列変異体の活性を示す。74G1−WTは、37C
で誘導してアッセイを行った場合でもステビオールビオシドに対する活性を保持している
。円順列変異体74G1−259M及び74G1−259Lは、高温における有意な活性
低下を示している。
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UGT配列
>SrUGT85C2 gi|37993661|gb|AAR06916.1|UDP
−グリコシルトランスフェラーゼ85C2[Stevia rebaudiana]
(配列番号1)
MDAMATTEKKPHVIFIPFPAQSHIKAMLKLAQLLHHKGLQ
ITFVNTDFIHNQFLESSGPHCLDGAPGFRFETIPDGVSHS
PEASIPIRESLLRSIETNFLDRFIDLVTKLPDPPTCIISD
GFLSVFTIDAAKKLGIPVMMYWTLAACGFMGFYHIHSLIE
KGFAPLKDASYLTNGYLDTVIDWVPGMEGIRLKDFPLDWS
TDLNDKVLMFTTEAPQRSHKVSHHIFHTFDELEPSIIKTL
SLRYNHIYTIGPLQLLLDQIPEEKKQTGITSLHGYSLVKE
EPECFQWLQSKEPNSVVYVNFGSTTVMSLEDMTEFGWGLA
NSNHYFLWIIRSNLVIGENAVLPPELEEHIKKRGFIASWC
SQEKVLKHPSVGGFLTHCGWGSTIESLSAGVPMICWPYSW
DQLTNCRYICKEWEVGLEMGTKVKRDEVKRLVQELMGEGG
HKMRNKAKDWKEKARIAIAPNGSSSLNIDKMVKEITVLAR
N
>SrUGT74G1 gi|37993669|gb|AAR06920.1|UDP
−グリコシルトランスフェラーゼ74G1[Stevia rebaudiana]
(配列番号2)
MAEQQKIKKSPHVLLIPFPLQGHINPFIQFGKRLISKGVK
TTLVTTIHTLNSTLNHSNTTTTSIEIQAISDGCDEGGFMS
AGESYLETFKQVGSKSLADLIKKLQSEGTTIDAIIYDSMT
EWVLDVAIEFGIDGGSFFTQACVVNSLYYHVHKGLISLPL
GETVSVPGFPVLQRWETPLILQNHEQIQSPWSQMLFGQFA
NIDQARWVFTNSFYKLEEEVIEWTRKIWNLKVIGPTLPSM
YLDKRLDDDKDNGFNLYKANHHECMNWLDDKPKESVVYVA
FGSLVKHGPEQVEEITRALIDSDVNFLWVIKHKEEGKLPE
NLSEVIKTGKGLIVAWCKQLDVLAHESVGCFVTHCGFNST
LEAISLGVPVVAMPQFSDQTTNAKLLDEILGVGVRVKADE
NGIVRRGNLASCIKMIMEEERGVIIRKNAVKWKDLAKVAV
HEGGSSDNDIVEFVSELIKA
>SrUGT76G1 gi|37993653|gb|AAR06912.1|UDP
−グリコシルトランスフェラーゼ76G1[Stevia rebaudiana]
(配列番号3)
MENKTETTVRRRRRIILFPVPFQGHINPILQLANVLYSKG
FSITIFHTNFNKPKTSNYPHFTFRFILDNDPQDERISNLP
THGPLAGMRIPIINEHGADELRRELELLMLASEEDEEVSC
LITDALWYFAQSVADSLNLRRLVLMTSSLFNFHAHVSLPQ
FDELGYLDPDDKTRLEEQASGFPMLKVKDIKSAYSNWQIL
KEILGKMIKQTKASSGVIWNSFKELEESELETVIREIPAP
SFLIPLPKHLTASSSSLLDHDRTVFQWLDQQPPSSVLYVS
FGSTSEVDEKDFLEIARGLVDSKQSFLWVVRPGFVKGSTW
VEPLPDGFLGERGRIVKWVPQQEVLAHGAIGAFWTHSGWN
STLESVCEGVPMIFSDFGLDQPLNARYMSDVLKVGVYLEN
GWERGEIANAIRRVMVDEEGEYIRQNARVLKQKADVSLMK
GGSSYESLESLVSYISSL
>SrUGT91D1
(配列番号4)
MYNVTYHQNSKAMATSDSIVDDRKQLHVATFPWLAFGHIL
PFLQLSKLIAEKGHKVSFLSTTRNIQRLSSHISPLINVVQ
LTLPRVQELPEDAEATTDVHPEDIQYLKKAVDGLQPEVTR
FLEQHSPDWIIYDFTHYWLPSIAASLGISRAYFCVITPWT
IAYLAPSSDAMINDSDGRTTVEDLTTPPKWFPFPTKVCWR
KHDLARMEPYEAPGISDGYRMGMVFKGSDCLLFKCYHEFG
TQWLPLLETLHQVPVVPVGLLPPEIPGDEKDETWVSIKKW
LDGKQKGSVVYVALGSEALVSQTEVVELALGLELSGLPFV
WAYRKPKGPAKSDSVELPDGFVERTRDRGLVWTSWAPQLR
ILSHESVCGFLTHCGSGSIVEGLMFGHPLIMLPIFCDQPL
NARLLEDKQVGIEIPRNEEDGCLTKESVARSLRSVVVENE
GEIYKANARALSKIYNDTKVEKEYVSQFVDYLEKNARAVA
IDHES
>SrUGT91D2
(配列番号5)
MATSDSIVDDRKQLHVATFPWLAFGHILPYLQLSKLIAEK
GHKVSFLSTTRNIQRLSSHISPLINVVQLTLPRVQELPED
AEATTDVHPEDIPYLKKASDGLQPEVTRFLEQHSPDWIIY
DYTHYWLPSIAASLGISRAHFSVTTPWAIAYMGPSADAMI
NGSDGRTTVEDLTTPPKWFPFPTKVCWRKHDLARLVPYKA
PGISDGYRMGLVLKGSDCLLSKCYHEFGTQWLPLLETLHQ
VPVVPVGLLPPEVPGDEKDETWVSIKKWLDGKQKGSVVYV
ALGSEVLVSQTEVVELALGLELSGLPFVWAYRKPKGPAKS
DSVELPDGFVERTRDRGLVWTSWAPQLRILSHESVCGFLT
HCGSGSIVEGLMFGHPLIMLPIFGDQPLNARLLEDKQVGI
EIPRNEEDGCLTKESVARSLRSVVVEKEGEIYKANARELS
KIYNDTKVEKEYVSQFVDYLEKNTRAVAIDHES
>SrUGT91D2e
(配列番号6)
MATSDSIVDDRKQLHVATFPWLAFGHILPYLQLSKLIAEK
GHKVSFLSTTRNIQRLSSHISPLINVVQLTLPRVQELPED
AEATTDVHPEDIPYLKKASDGLQPEVTRFLEQHSPDWIIY
DYTHYWLPSIAASLGISRAHFSVTTPWAIAYMGPSADAMI
NGSDGRTTVEDLTTPPKWFPFPTKVCWRKHDLARLVPYKA
PGISDGYRMGLVLKGSDCLLSKCYHEFGTQWLPLLETLHQ
VPVVPVGLLPPEIPGDEKDETWVSIKKWLDGKQKGSVVYV
ALGSEVLVSQTEVVELALGLELSGLPFVWAYRKPKGPAKS
DSVELPDGFVERTRDRGLVWTSWAPQLRILSHESVCGFLT
HCGSGSIVEGLMFGHPLIMLPIFGDQPLNARLLEDKQVGI
EIPRNEEDGCLTKESVARSLRSVVVEKEGEIYKANARELS
KIYNDTKVEKEYVSQFVDYLEKNARAVAIDHES
>OsUGT1−2(Q0DPB7_ORYSJ)
配列番号7
MDSGYSSSYAAAAGMHVVICPWLAFGHLLPCLDLAQRLAS
RGHRVSFVSTPRNISRLPPVRPALAPLVAFVALPLPRVEG
LPDGAESTNDVPHDRPDMVELHRRAFDGLAAPFSEFLGTA
CADWVIVDVFHHWAAAAALEHKVPCAMMLLGSAHMIASIA
DRRLERAETESPAAAGQGRPAAAPTFEVARMKLIRTKGSS
GMSLAERFSLTLSRSSLVVGRSCVEFEPETVPLLSTLRGK
PITFLGLMPPLHEGRREDGEDATVRWLDAQPAKSVVYVAL
GSEVPLGVEKVHELALGLELAGTRFLWALRKPTGVSDADL
LPAGFEERTRGRGVVATRWVPQMSILAHAAVGAFLTHCGW
NSTIEGLMFGHPLIMLPIFGDQGPNARLIEAKNAGLQVAR
NDGDGSFDREGVAAAIRAVAVEEESSKVFQAKAKKLQEIV
ADMACHERYIDGFIQQLRSYKD
UGTの変異体及び円順列変異体
>MbUGTC19
(配列番号8)
MAECMNWLDDKPKESVVYVAFGSLVKHGPEQVEEITRALI
DSDVNFLWVIKHKEEGKLPENLSEVIKTGKGLIVAWCKQL
DVLAHESVGCFVTHCGFNSTLEAISLGVPVVAMPQFSDQT
TNAKLLDEILGVGVRVKADENGIVRRGNLASCIKMIMEEE
RGVIIRKNAVKWKDLAKVAVHEGGSSDNDIVEFVSELIKA
GSGEQQKIKKSPHVLLIPFPLQGHINPFIQFGKRLISKGV
KTTLVTTIHTLNSTLNHSNTTTTSIEIQAISDGCDEGGFM
SAGESYLETFKQVGSKSLADLIKKLQSEGTTIDAIIYDSM
TEWVLDVAIEFGIDGGSFFTQACVVNSLYYHVHKGLISLP
LGETVSVPGFPVLQRWETPLILQNHEQIQSPWSQMLFGQF
ANIDQARWVFTNSFYKLEEEVIEWTRKIWNLKVIGPTLPS
MYLDKRLDDDKDNGFNLYKANHH
>MbUGT1−2
(配列番号9)
MAGSSGMSLAERFSLTLSRSSLVVGRSCVEFEPETVPLLS
TLRGKPITFLGLMPPLHEGRREDGEDATVRWLDAQPAKSV
VYVALGSEVPLGVEKVHELALGLELAGTRFLWALRKPTGV
SDADLLPAGFEERTRGRGVVATRWVPQMSILAHAAVGAFL
THCGWNSTIEGLMFGHPLIMLPIFGDQGPNARLIEAKNAG
LQVARNDGDGSFDREGVAAAIRAVAVEEESSKVFQAKAKK
LQEIVADMACHERYIDGFIQQLRSYKDDSGYSSSYAAAAG
MHVVICPWLAFGHLLPCLDLAQRLASRGHRVSFVSTPRNI
SRLPPVRPALAPLVAFVALPLPRVEGLPDGAESTNDVPHD
RPDMVELHRRAFDGLAAPFSEFLGTACADWVIVDVFHHWA
AAAALEHKVPCAMMLLGSAHMIASIADRRLERAETESPAA
AGQGRPAAAPTFEVARMKLIRTK
>MbUGT1−3
(配列番号10)
MANWQILKEILGKMIKQTKASSGVIWNSFKELEESELETV
IREIPAPSFLIPLPKHLTASSSSLLDHDRTVFQWLDQQPP
SSVLYVSFGSTSEVDEKDFLEIARGLVDSKQSFLWVVRPG
FVKGSTWVEPLPDGFLGERGRIVKWVPQQEVLAHGAIGAF
WTHSGWNSTLESVCEGVPMIFSDFGLDQPLNARYMSDVLK
VGVYLENGWERGEIANAIRRVMVDEEGEYIRQNARVLKQK
ADVSLMKGGSSYESLESLVSYISSLENKTETTVRRRRRII
LFPVPFQGHINPILQLANVLYSKGFSITIFHTNFNKPKTS
NYPHFTFRFILDNDPQDERISNLPTHGPLAGMRIPIINEH
GADELRRELELLMLASEEDEEVSCLITDALWYFAQSVADS
LNLRRLVLMTSSLFNFHAHVSLPQFDELGYLDPDDKTRLE
EQASGFPMLKVKDIKSAYS
>MbUGT1,2−2
(配列番号45)
MATKGSSGMSLAERFWLTLSRSSLVVGRSCVEFEPETVPL
LSTLRGKPITFLGLMPPLHEGRREDGEDATVRWLDAQPAK
SVVYVALGSEVPLGVEKVHELALGLELAGTRFLWALRKPT
GVSDADLLPAGFEERTRGRGVVATRWVPQMSILAHAAVGA
FLTHCGWNSTIEGLMFGHPLIMLPIFGDQGPNARLIEAKN
AGLQVARNDGDGSFDREGVAAAIRAVAVEEESSKVFQAKA
KKLQEIVADMACHERYIDGFIQQLRSYKDDSGYSSSYAAA
AGMHVVICPWLAFGHLLPCLDLAQRLASRGHRVSFVSTPR
NISRLPPVRPALAPLVAFVALPLPRVEGLPDGAESTNDVP
HDRPDMVELHRRAFDGLAAPFSEFLGTACADWVIVDVFHH
WAAAAALEHKVPCAMMLLGSAEMIASIADERLEHAETESP
AAAGQGRPAAAPTFEVARMKLIR
>MbUGTC19−2
(配列番号46)
MANHHECMNWLDDKPKESVVYVAFGSLVKHGPEQVEEITR
ALIDSDVNFLWVIKHKEEGKLPENLSEVIKTGKGLIVAWC
KQLDVLAHESVGCFVTHCGFNSTLEAISLGVPVVAMPQFS
DQTTNAKLLDEILGVGVRVKADENGIVRRGNLASCIKMIM
EEERGVIIRKNAVKWKDLAKVAVHEGGSSDNDIVEFVSEL
IKAGSGEQQKIKKSPHVLLIPFPLQGHINPFIQFGKRLIS
KGVKTTLVTTIHTLNSTLNHSNTTTTSIEIQAISDGCDEG
GFMSAGESYLETFKQVGSKSLADLIKKLQSEGTTIDAIIY
DSMTEWVLDVAIEFGIDGGSFFTQACVVNSLYYHVHKGLI
SLPLGETVSVPGFPVLQRWETPLILQNHEQIQSPWSQMLF
GQFANIDQARWVFTNSFYKLEEEVIEWTRKIWNLKVIGPT
LPSMYLDKRLDDDKDNGFNLYKA
>MbUGTC13
(配列番号51)
MADAMATTEKKPHVIFIPFPAQSHIKAMLKLAQLLHHKGL
QITFVNTDFIHNQFLESSGPHCLDGAPGFRFETIPDGVSH
SPEASIPIRESLLRSIETNFLDRFIDLVTKLPDPPTCIIS
DGFLSVFTIDAAKKLGIPVMMYWTLAACGFMGFYHIHSLI
EKGFAPLKDASYLTNGYLDTVIDWVPGMEGIRLKDFPLDW
STDLNDKVLMFTTEATQRSHKVSHHIFHTFDELEPSIIKT
LSLRYNHIYTIGPLQLLLDQIPEEKKQTGITSLHGYSLVK
EEPECFQWLQSKEPNSVVYVNFGSTTVMSLEDMTEFGWGL
ANSNHYFLWIIRSNLVIGENAVLPPELEEHIKKRGFIASW
CSQEKVLKHPSVGGFLTHCGWGSTIESLSAGVPMICWPYS
WDQLTNCRYICKEWEVGLEMGTKVKRDEVKRLVQELMGEG
GHKMRNKAKDWKEKARIAIAPNGSSSLNIDKMVKEITVLA
RN
ステビオール生合成の酵素
>TcGGPPS
(配列番号11)
MYTAMAAGTQSLQLRTVASYQECNSMRSCFKLTPFKSFHG
VNFNVPSLGAANCEIMGHLKLGSLPYKQCSVSSKSTKTMA
QLVDLAETEKAEGKDIEFDFNEYMKSKAVAVDAALDKAIP
LEYPEKIHESMRYSLLAGGKRVRPALCIAACELVGGSQDL
AMPTACAMEMIHTMSLIHDDLPCMDNDDFRRGKPTNHKVF
GEDTAVLAGDALLSFAFEHIAVATSKTVPSDRTLRVISEL
GKTIGSQGLVGGQVVDITSEGDANVDLKTLEWIHIHKTAV
LLECSVVSGGILGGATEDEIARIRRYARCVGLLFQVVDDI
LDVTKSSEELGKTAGKDLLTDKATYPKLMGLEKAKEFAAE
LATRAKEELSSFDQIKAAPLLGLADYIAFRQN
>TcGGPPS 98位で切断し角括弧で括った変異を有する
(配列番号12)
MADFNEYMKSKAVAVDAALDKAIPLEYPEKIHESMRYSLL
AGGKRVRPALCIAACELVGGSQDLAMPTACAMEMIHTMSL
IHDDLPCMDNDDFRRGKPTNHKVFGEDTAVLAGDALLSFA
FEHIAVATSKTVPSDRTLRVI[C]ELGKTIGSQGLVGGQV
VDITSEGDANVDLKTLEWIHIHKTAVLLECSVVSGGILG[
D]ATEDEIARIRRYARCVGLLFQVVDDILDVTKSSEELGK
TAGKDLLTDKATYPKLMGLEKAKEFAAELATRAKEELSSF
DQIK[V]APLLGLADYIAFRQN
>AgGGPPS gi|17352451|gb|AAL17614.2|AF425
235_1 ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素[Abies grandis]
(配列番号13)
MAYSGMATSYHGLHFMNIATQECNLKRLSIPSRRFHGVSP
SLWASNGFQGHLKRELSANSFLVSSSRYSNTIAKFTNLPE
KVKEKVIEFDFKEYLRSKAMAVNEALDRAVPLRYPERIHE
AMRYSLLAGGKRVRPVLCISACELVGGTEEVAMPTACAME
MIHTMSLIHDDLPCMDNDDFRRGKPTNHKVFGEGTAILAG
DALLSFAFEHIAVSTSKSVGTDRILRVVSELGRTIGSQGL
VGGQVADITSEGDASVDLDTLEWIHIHKTAVLLECSVMCG
AIISGASDNEIERIQRYARSVGLLFQVVDDILDVTKSSKE
LGKTAGKDLISDKATYPKLMGLEKAKQFASDLLIRAKEDL
SCFDPMKAAPLLGLADYIAFRQN
>AnGGPPS gi|259486923|tpe|CBF85177.1| TP
A:保存された仮定上のタンパク質[Aspergillus nidulans FG
SC A4}
(配列番号14)
MSPPLDSALEPLSEYKETAFPRTEKDPSQYKEHDLVTPEK
EIQTGYFSPRGSHSSHGSHDSSASSNISLDDARMSDVNNS
PNVFHDDPDTIDEKLSMYWKAANETVIREPYDYIAGIPGK
EIRRKLLEAFNHWYKVDEQSCQAIATTVGMAHNASLLIDD
IQDSSKLRRGVPCAHEVFGIAQTINSANYVYFLAQNQLFR
LRSWPQAISVFNEEMVNLHRGQGMELFWRDNLLPPSMDDY
LQMIANKTGGLFRMIVRLLQTSSRQVIDVEQLVDVLGLYF
QILDDYKNIREEKMAAQKGFFEDLTEGKFSFPICHAIGEG
AKNRTALLHMLRLKTDDMKIKQEAVCILDNAGSLDYTREV
LYGLDRKARSLLREFKTPNPFMEALLDAMLSSLQACH
>SmGGPPS gi|260653869|dbj|BAI44337.1| ゲラ
ニルゲラニル二リン酸合成酵素[Streptomyces melanosporof
aciens]
配列番号15)
MTTPTLSPGRLDADTVRKSVDVVLEDFLTAKAHTTPQHHL
PYLSGLLKDFLSGGKRIRPLLCVTGWQAVGGGEDTEPVFR
VAACLEMFHAFALIHDDVMDDSDTRRGRPTIHRTLAALCA
TDRRPEQIERFGVSGAVLLGDLALTWSDELLHSAGLTPVQ
FDAVLPLLSEMRTEVMLGQYLDLQATGELTDDVEATLTVN
RYKTAKYTIERPLHVGAAIAGAGPEAMEAFTAYALPLGEA
FQLRDDLLGVYGDPESTGKSQLDDLRAGKNTTLIALALRG
SDSTQAARLRSLIGNPLLDERDAATIQEIFAATTARDAVE
QMIDDRRTQALRALDDAPFTADAVNALKQIARLATVRNS
>MbGGPPS[海洋細菌443]
(配列番号36)
MAENGLLDCEQYLEEAMAEHATAQCPPLLAQALNYAVFPG
GARVRPKICKAVALANNSSDVGLANAAASAIELLHCASLV
HDDLPCFDDATQRRGKPSVHAKFGERIAVLTGDALIVAAF
QTLATHAIHAVRTERVPLVTAIVARGVGAPHGICAGQAWE
CERSVDLSRYHRAKTGALFVAATCAGAAAAGVDPGPWVNL
GASIGEAYQVADDIKDAISDPETLGKPTGIDVKLDRPSAV
RELGLDGAVTRLKQCLEAGLDSMPACAGQDLLQKIVRAQA
SRFVPEKIAQVAAVD
>PhGGPPS[Paracoccus haeundaensis]
(配列番号37)
MARRDVNPIHATLLQTRLEEIAQGFGAVSQPLGAAMSHGA
LSSGRRFRGMLMLLAAEASGGVCDTIVDAACAVEMVHAAS
LIFDDLPCMDDAGLRRGRPATHVAHGESRAVLGGIALITE
AMALLAGARGASGTVRAQLVRILSRSLGPQGLCAGQDLDL
HAAKNGAGVEQEQDLKTGVLFIAGLEMLAVIKEFDAEEQT
QMIDFGRQLGRVFQSYDDLLDVVGDQAALGKDTGRDAAAP
GPRRGLLAVSDLQNVSRHYEASRAQLDAMLRSKRLQAPEI
AALLERVLPYAARAVD
>CtGGPPS[Clorobium tepidum TLS]
(配列番号38)
MASSPITQAQVESKYRQYHAKINEALAACFPKEKPATLYD
PARYILEGKGKRIRPFLTLLAAEAVSGKSDNALGVALGIE
VLHNFTLMHDDIMDQADLRHGRPTVHKQWNVNAAILSGDM
MIAYAYELALKAISSRHAEIIHIFNDANITICEGQALDME
LEQRKDVTIADYLDMISKKTGRLISAALEAGGVAGDGTPE
QIAALVTFGEKIGRAFQIQDDYLDIMAGDGKSGKVPGGDV
INGKKTWLLLRSLELAEGADRELLQSIFDNNGTSPDNVPA
VKAIFEKCGVLNETRAKINEDTEAALAALDALPFEEGRGY
LRGFANILMKRDFVD
>SsGGPPS[Synechoccus sp.JA−3−3Ab]
(配列番号39)
MAVAQTFNLDTYLSQRQQQVEEALSAALVPAYPERIYEAM
RYSLLAGGKRLRPILCLAACELAGGSVEQAMPTACALEMI
HTMSLIHDDLPAMDNDDFRRGKPTNHKVFGEDIAILAGDA
LLAYAFEHIASQTRGVPPQLVLQVIARIGHAVAATGLVGG
QVVDLESEGKAISLETLEYIHSHKTGALLEASVVSGGILA
GADEELLARLSHYARDIGLAFQIVDDILDVTATSEQLGKT
AGKDQAAAKATYPSLLGLEASRQKAEELIQSAKEALRPYG
SQAEPLLALADFITRRQHVD
>SsGGPPS2[Synechocystis sp.PCC6803]
(配列番号40)
MAVAQQTRTDFDLAQYLQVKKGVVEAALDSSLAIARPEKI
YEAMRYSLLAGGKRLRPILCITACELCGGDEALALPTACA
LEMIHTMSLIHDDLPSMDNDDFRRGKPTNHKVYGEDIAIL
AGDGLLAYAFEYVVTHTPQADPQALLQVIARLGRTVGAAG
LVGGQVLDLESEGRTDITPETLTFIHTHKTGALLEASVLT
GAILAGATGEQQQRLARYAQNIGLAFQVVDDILDITATQE
ELGKTAGKDVKAQKATYPSLLGLEASRAQAQSLIDQAIVA
LEPFGPSAEPLQAIAEYIVARKYVD
>TmGGPPS[Thermotoga maritima HB8]
(配列番号41)
MAKKEKVEERIREILRPGWDLLTEEAMLYSATVGGKRIRP
LLVLTLGEDLGVEEEKLLDVAVAVELFHTASLIHDDLPPI
DNADFRRGKPSCHRTYGEDIALLAGDGLFFLAFSQISKIG
NSKIFEEFSETAYKLLLGEAMDVEFERRKMEVSQEMVERM
YAFKTGALFAFCFSAPFILKGKDHTKMKLLGEKFGVAFQI
YDDLKDILGSFEKVGKDLGKDTEKVTLVKKVGIQKAREMA
DKYYEEVLKGIESEGLFRTLFLLKELKQMVEERVD
>CgGGPPS[Corynebacterium glutamicum]
(配列番号42)
MAKDVSLSSFDAHDLDLDKFPEVVRDRLTQFLDAQELTIA
DIGAPVTDAVAHLRSFVLNGGKRIRPLYAWAGFLAAQGHK
NSSEKLESVLDAAASLEFIQACALIHDDIIDSSDTRRGAP
TVHRAVEADHRANNFEGDPEHFGVSVSILAGDMALVWAED
MLQDSGLSAEALARTRDAWRGMRTEVIGGQLLDIYLESHA
NESVELADSVNRFKTAAYTIARPLHLGASIAGGSPQLIDA
LLHYGHDIGIAFQLRDDLLGVFGDPAITGKPAGDDIREGK
RTVLLALALQRADKQSPEAATAIRAGVGKVTSPEDIAVIT
EHIRATGAEEEVEQRISQLTESGLAHLDDVDIPDEVRAQL
RALAIRSTERRMVD
>TtGGPPS[Thermus thermophillus HB27]
(配列番号43)
MAVPAPEAIRQALQERLLARLDHPDPLYRDLLQDYPRRGG
KMLRGLLTVYSALAHGAPLEAGLEAATALELFQNWVLVHD
DIEDGSEERRGRPALHRLHPMPLALNAGDAMHAEMWGLLA
EGLARGLFPPEVLLEFHEVVRRTAYGQHLDLLWTLGGTFD
LRPEDYFRMVAHKAAYYTAVAPLRLGALLAGKTPPAAYEE
GGLRLGTAFQIVDDVLNLEGGEAYGKERAGDLYEGKRTLI
LLRFLEEAPPEERARALALLALPREAKPEAEVGWLLERLL
ASRALAWAKAEAKRLQAEGLALLEAAFQDLPGKEALDHLR
GLLAALVERRAVD
>PcGGPPS[Pyrobaculum calidifontis JCM115
48]
(配列番号44)
MADVVSRLHQKYGAEVEKALVRYLSIGLAEDFREAVLYQV
KTGGKRLRPLLTLAAAEAVSGQWRPALPAAAIVELIHNYS
LIYDDIIDRGDVRRGLPTVRKAFGDNAAILVGIWYREAIE
EAVLDTPKPTLFAKEVAEVIKAIDEGERLDILFEAAGRSD
PYFVQARWREVTLDDYIKMVSLKTGALIAAAAKWGVLSVS
DDRGLAEAAWNFGMAAGVAFQIIDDVLDIYGDPKKFGKEI
GKDIKEHKRGNAVVAVALSHLGEGERRRLLEILAREVVEE
ADVREAVALLDSVGAREEALRLAARYREEAERHLAKIPNN
GTLKELLDFIVAREY
>SrCPPS[Stevia rebaudiana]
(配列番号16)
MKTGFISPATVFHHRISPATTFRHHLSPATTNSTGIVALR
DINFRCKAVSKEYSDLLQKDEASFTKWDDDKVKDHLDTNK
NLYPNDEIKEFVESVKAMFGSMNDGEINVSAYDTAWVALV
QDVDGSGSPQFPSSLEWIANNQLSDGSWGDHLLFSAHDRI
INTLACVIALTSWNVHPSKCEKGLNFLRENICKLEDENAE
HMPIGFEVTFPSLIDIAKKLNIEVPEDTPALKEIYARRDI
KLTKIPMEVLHKVPTTLLHSLEGMPDLEWEKLLKLQCKDG
SFLFSPSSTAFALMQTKDEKCLQYLTNIVTKFNGGVPNVY
PVDLFEHIWVVDRLQRLGIARYFKSEIKDCVEYINKYWTK
NGICWARNTHVQDIDDTAMGFRVLRAHGYDVTPDVFRQFE
KDGKFVCFAGQSTQAVTGMFNVYRASQMLFPGERILEDAK
KFSYNYLKEKQSTNELLDKWIIAKDLPGEVGYALDIPWYA
SLPRLETRYYLEQYGGEDDVWIGKTLYRMGYVSNNTYLEM
AKLDYNNYVAVLQLEWYTIQQWYVDIGIEKFESDNIKSVL
VSYYLAAASIFEPERSKERIAWAKTTILVDKITSIFDSSQ
SSKEDITAFIDKFRNKSSSKKHSINGEPWHEVMVALKKTL
HGFALDALMTHSQDIHPQLHQAWEMWLTKLQDGVDVTAEL
MVQMINMTAGRWVSKELLTHPQYQRLSTVTNSVCHDITKL
HNFKENSTTVDSKVQELVQLVFSDTPDDLDQDMKQTFLTV
MKTFYYKAWCDPNTINDHISKVFEIVI
>SrKS[Stevia rebaudiana]
(配列番号17)
MNLSLCIASPLLTKSNRPAALSAIHTASTSHGGQTNPTNL
IIDTTKERIQKQFKNVEISVSSYDTAWVAMVPSPNSPKSP
CFPECLNWLINNQLNDGSWGLVNHTHNHNHPLLKDSLSST
LACIVALKRWNVGEDQINKGLSFIESNLASATEKSQPSPI
GFDIIFPGLLEYAKNLDINLLSKQTDFSLMLHKRELEQKR
CHSNEMDGYLAYISEGLGNLYDWNMVKKYQMKNGSVFNSP
SATAAAFINHQNPGCLNYLNSLLDKFGNAVPTVYPHDLFI
RLSMVDTIERLGISHHFRVEIKNVLDETYRCWVERDEQIF
MDVVTCALAFRLLRINGYEVSPDPLAEITNELALKDEYAA
LETYHASHILYQEDLSSGKQILKSADFLKEIISTDSNRLS
KLIHKEVENALKFPINTGLERINTRRNIQLYNVDNTRILK
TTYHSSNISNTDYLRLAVEDFYTCQSIYREELKGLERWVV
ENKLDQLKFARQKTAYCYFSVAATLSSPELSDARISWAKN
GILTTVVDDFFDIGGTIDELTNLIQCVEKWNVDVDKDCCS
EHVRILFLALKDAICWIGDEAFKWQARDVTSHVIQTWLEL
MNSMLREAIWTRDAYVPTLNEYMENAYVSFALGPIVKPAI
YFVGPKLSEEIVESSEYHNLFKLMSTQGRLLNDIHSFKRE
FKEGKLNAVALHLSNGESGKVEEEVVEEMMMMIKNKRKEL
MKLIFEENGSIVPRACKDAFWNMCHVLNFFYANDDGFTGN
TILDTVKDIIYNPLVLVNENEEQR
>GfCPPS/KS[Gibberella fujikuroi]
(配列番号18)
MPGKIENGTPKDLKTGNDFVSAAKSLLDRAFKSHHSYYGL
CSTSCQVYDTAWVAMIPKTRDNVKQWLFPECFHYLLKTQA
ADGSWGSLPTTQTAGILDTASAVLALLCHAQEPLQILDVS
PDEMGLRIEHGVTSLKRQLAVWNDVEDTNHIGVEFIIPAL
LSMLEKELDVPSFEFPCRSILERMHGEKLGHFDLEQVYGK
PSSLLHSLEAFLGKLDFDRLSHHLYHGSMMASPSSTAAYL
IGATKWDDEAEDYLRHVMRNGAGHGNGGISGTFPTTHFEC
SWIIATLLKVGFTLKQIDGDGLRGLSTILLEALRDENGVI
GFAPRTADVDDTAKALLALSLVNQPVSPDIMIKVFEGKDH
FTTFGSERDPSLTSNLHVLLSLLKQSNLSQYHPQILKTTL
FTCRWWWGSDHCVKDKWNLSHLYPTMLLVEAFTEVLHLID
GGELSSLFDESFKCKIGLSIFQAVLRIILTQDNDGSWRGY
REQTCYAILALVQARHVCFFTHMVDRLQSCVDRGFSWLKS
CSFHSQDLTWTSKTAYEVGFVAEAYKLAALQSASLEVPAA
TIGHSVTSAVPSSDLEKYMRLVRKTALFSPLDEWGLMASI
IESSFFVPLLQAQRVEIYPRDNIKVDEDKYLSIIPFTWVG
CNNRSRTFASNRWLYDMMYLSLLGYQTDEYMEAVAGPVFG
DVSLLHQTIDKVIDNTMGNLARANGTVHSGNGHQHESPNI
GQVEDTLTRFTNSVLNHKDVLNSSSSDQDTLRREFRTFMH
AHITQIEDNSRFSKQASSDAFSSPEQSYFQWVNSTGGSHV
ACAYSFAFSNCLMSANLLQGKDAFPSGTQKYLISSVMRHA
TNMCRMYNDFGSIARDNAERNVNSIHFPEFTLCNGTSQNL
DERKERLLKIATYEQGYLDRALEALERQSRDDAGDRAGSK
DMRKLKIVKLFCDVTDLYDQLYVIKDLSSSMK
>PpCPPS/KS[Physcomitrella patens]
(配列番号19)
MASSTLIQNRSCGVTSSMSSFQIFRGQPLRFPGTRTPAAV
QCLKKRRCLRPTESVLESSPGSGSYRIVTGPSGINPSSNG
HLQEGSLTHRLPIPMEKSIDNFQSTLYVSDIWSETLQRTE
CLLQVTENVQMNEWIEEIRMYFRNMTLGEISMSPYDTAWV
ARVPALDGSHGPQFHRSLQWIIDNQLPDGDWGEPSLFLGY
DRVCNTLACVIALKTWGVGAQNVERGIQFLQSNIYKMEED
DANHMPIGFEIVFPAMMEDAKALGLDLPYDATILQQISAE
REKKMKKIPMAMVYKYPTTLLHSLEGLHREVDWNKLLQLQ
SENGSFLYSPASTACALMYTKDVKCFDYLNQLLIKFDHAC
PNVYPVDLFERLWMVDRLQRLGISRYFEREIRDCLQYVYR
YWKDCGIGWASNSSVQDVDDTAMAFRLLRTHGFDVKEDCF
RQFFKDGEFFCFAGQSSQAVTGMFNLSRASQTLFPGESLL
KKARTFSRNFLRTKHENNECFDKWIITKDLAGEVEYNLTF
PWYASLPRLEHRTYLDQYGIDDIWIGKSLYKMPAVTNEVF
LKLAKADFNMCQALHKKELEQVIKWNASCQFRDLEFARQK
SVECYFAGAATMFEPEMVQARLVWARCCVLTTVLDDYFDH
GTPVEELRVFVQAVRTWNPELINGLPEQAKILFMGLYKTV
NTIAEEAFMAQKRDVHHHLKHYWDKLITSALKEAEWAESG
YVPTFDEYMEVAEISVALEPIVCSTLFFAGHRLDEDVLDS
YDYHLVMHLVNRVGRILNDIQGMKREASQGKISSVQIYME
EHPSVPSEAMAIAHLQELVDNSMQQLTYEVLRFTAVPKSC
KRIHLNMAKIMHAFYKDTDGFSSLTAMTGFVKKVLFEPVP
E
>PsCPPS/KS[Phaeosphaeria sp.]
(配列番号20)
MFAKFDMLEEEARALVRKVGNAVDPIYGFSTTSCQIYDTA
WAAMISKEEHGDKVWLFPESFKYLLEKQGEDGSWERHPRS
KTVGVLNTAAACLALLRHVKNPLQLQDIAAQDIELRIQRG
LRSLEEQLIAWDDVLDTNHIGVEMIVPALLDYLQAEDENV
DFEFESHSLLMQMYKEKMARFSPESLYRARPSSALHNLEA
LIGKLDFDKVGHHLYNGSMMASPSSTAAFLMHASPWSHEA
EAYLRHVFEAGTGKGSGGFPGTYPTTYFELNWVLSTLMKS
GFTLSDLECDELSSIANTIAEGFECDHGVIGFAPRAVDVD
DTAKGLLTLTLLGMDEGVSPAPMIAMFEAKDHFLTFLGER
DPSFTSNCHVLLSLLHRTDLLQYLPQIRKTTTFLCEAWWA
CDGQIKDKWHLSHLYPTMLMVQAFAEILLKSAEGEPLHDA
FDAATLSRVSICVFQACLRTLLAQSQDGSWHGQPEASCYA
VLTLAESGRLVLLQALQPQIAAAMEKAADVMQAGRWSCSD
HDCDWTSKTAYRVDLVAAAYRLAAMKASSNLTFTVDDNVS
KRSNGFQQLVGRTDLFSGVPAWELQASFLESALFVPLLRN
HRLDVFDRDDIKVSKDHYLDMIPFTWVGCNNRSRTYVSTS
FLFDMMIISMLGYQIDEFFEAEAAPAFAQCIGQLHQVVDK
VVDEVIDEVVDKVVGKVVGKVVGKVVDERVDSPTHEAIAI
CNIEASLRRFVDHVLHHQHVLHASQQEQDILWRELRAFLH
AHVVQMADNSTLAPPGRTFFDWVRTTAADHVACAYSFAFA
CCITSATIGQGQSMFATVNELYLVQAAARHMTTMCRMCND
IGSVDRDFIEANINSVHFPEFSTLSLVADKKKALARLAAY
EKSCLTHTLDQFENEVLQSPRVSSAASGDFRTRKVAVVRF
FADVTDFYDQLYILRDLSSSLKHVGT
>EtCPPS[Erwina tracheiphila]
(配列番号32)
MAHALAENILTELNTLLSDMDDGGYVGPSVYDTAQLLRFH
PNPPDRAGIYRWLIKQQHEDGGWGSPDFPLHRQVPTVAAI
LALHEAQPQPEGAAAALAAAAVYLAQERDLYADTIPDDAP
IGAELILPQLCRQAAALFPHLAYPRYGALYEAEAARLGKV
ESLTAVPSGHPLLHSWESWGRSSTEVTPDVFGSIGISPSA
TAVWLGRACAENPACLPEHATRYLHNASRATGVGIDGVVP
NVWPIDVFEPCWSLYSLHLAGLFSHPGLSTVVQNIATNIQ
AILTPLGLGPALSFASDADDTAIAAAVVQLSGHSLTCYPL
HQFEKGDLFVTFPGERNPSLSTTIHAVHALSLLGTTAPDA
RAYIENSKSADGVWKNEKWHASWLYPTSHAVAALAHGMPS
WRDNDVLYKILEAQHLSGGWGAGAAPTQEETAYALFALHV
MNDRVNAPLREKLVSAVARAREWLLVRYQSNQLPITPLWI
GKELYCPQRVVRVTELTGLWLALNWNPSHSDVSDTRTETP
GERI
>EtKS[Erwina tracheiphila]
(配列番号33)
MATSHDDACQQVKVWGETLFGFLDEHAVEAVRGGQFILRH
IRPELAAISARTGRDPDDEARELAFYQEMALLFWIDDCHD
RGVMSPDDYAVVEGILVGRMPDAPTPSVGCSFLRHRLAQL
ASHKHDYSQLLADTQAYSTALRNGKRLASDPDRWSYSEHL
RNGVDSIGYQNVFGCLSLLWGLDMPRWRTEPAFQNALSFL
CAIGRLQNDLHGLANDRTLGEADNLAVQLERRYPTLDAVE
FLQTEITGYERMLRPLLETANFDPVWVRLMETMLTVSDQY
YATSTLRYRIDDTATTAPSCDTRHASGAVTGSGNETE
>SfCPPS[Sinorhizobium fredii]
(配列番号34)
MANALSEQILFELRHLLSEMSDGGSVGPSVYDTARALQFG
GNVTGRQDAYAWLLAQQQADGGWGSADFPLFRHAPTWAAL
LALQRADPLPGAADAVQAATRFLERQADPYAHAVPEDAPI
GAELILPQLCGEAASLLGGVAFPRHPALLPLRQACLVKLG
AVATLPSGHPLLHSWEAWGTWPTAACPDDDGSIGISPAAT
AAWRAHAVTQGSTPQVGRADAYLQAASRATRSGIEGVVPN
VWPINVFEPCWSLYTLHLAGLFAHPALDEAVRVIVAQLDA
RLGVRGLGPALHFAADADDTAVALCVLRLAGRDPAVDALR
HFEIGELFVTFPGERNASVSTNIHALHALRLLGKPAAGTS
AYVEANRNPHGLWDNEKWHVSWLYPTAHAVAALAQGKPQW
RDERALAALLQAQRDDGGWGAGRASTFEETAYALFALHVM
DGSEEPTGRRRIAQAVARALEWMLARHAAPALPQMPLWIG
KELYCPIRVVRVAELAGLWLALRWGPRVPAEGAGAAP
>SfKS[Sinorhizobium fredii]
(配列番号35)
MAIPTERGLQQVLEWGRSLTGFADEHAAEAVRGGQYILQR
IHPSLRDTSARTGRDPQDETLIVAFYRELALLFWLDDCND
LDLIAPEQLAAVEQALGQGVPCALPGFEGCAVLRASLAAL
AYDRRDYAQLLDDTRCYCAALRAGHAQAAGAAERWSYAEY
LHNGIDSIAYANVFCCLSLLWGLDMATLRARPAFRQVLRL
ISAIGRLQNDLHGRDKDRSAGEADNAAILLLERYPAMPVV
EFLNDELAGHTRMLHRVMAEERFPAPWGPLIEAMAAIRAH
YYQTSTSRYRSDAAGGGQHAPA
>SrKO AAQ63464.1|ent−カウレンオキシダーゼCYP701A5[
Stevia rebaudiana]
(配列番号21)
MDAVTGLLTVPATAITIGGTAVALAVALIFWYLKSYTSAR
RSQSNHLPRVPEVPGVPLLGNLLQLKEKKPYMTFTRWAAT
YGPIYSIKTGATSMVVVSSNEIAKEALVTRFQSISTRNLS
KALKVLTADKTMVAMSDYDDYHKTVKRHILTAVLGPNAQK
KHRIHRDIMMDNISTQLHEFVKNNPEQEEVDLRKIFQSEL
FGLAMRQALGKDVESLYVEDLKITMNRDEIFQVLVVDPMM
GAIDVDWRDFFPYLKWVPNKKFENTIQQMYIRREAVMKSL
IKEHKKRIASGEKLNSYIDYLLSEAQTLTDQQLLMSLWEP
IIESSDTTMVTTEWAMYELAKNPKLQDRLYRDIKSVCGSE
KITEEHLSQLPYITAIFHETLRRHSPVPIIPLRHVHEDTV
LGGYHVPAGTELAVNIYGCNMDKNVWENPEEWNPERFMKE
NETIDFQKTMAFGGGKRVCAGSLQALLTASIGIGRMVQEF
EWKLKDMTQEEVNTIGLTTQMLRPLRAIIKPRI
>t20−8RPSrKO
(配列番号22)
MALLLAVFAVALAVALIFWYLKSYTSARRSQSNHLPRVPE
VPGVPLLGNLLQLKEKKPYMTFTRWAATYGPIYSIKTGAT
SMVVVSSNEIAKEALVTRFQSISTRNLSKALKVLTADKTM
VAMSDYDDYHKTVKRHILTAVLGPNAQKKHRIHRDIMMDN
ISTQLHEFVKNNPEQEEVDLRKIFQSELFGLAMRQALGKD
VESLYVEDLKITMNRDEIFQVLVVDPMMGAIDVDWRDFFP
YLKWVPNKKFENTIQQMYIRREAVMKSLIKEHKKRIASGE
KLNSYIDYLLSEAQTLTDQQLLMSLWEPIIESSDTTMVTT
EWAMYELAKNPKLQDRLYRDIKSVCGSEKITEEHLSQLPY
ITAIFHETLRRHSPVPIIPLRHVHEDTVLGGYHVPAGTEL
AVNIYGCNMDKNVWENPEEWNPERFMKENETIDFQKTMAF
GGGKRVCAGSLQALLTASIGIGRMVQEFEWKLKDMTQEEV
NTIGLTTQMLRPLRAIIKPRI
>AtKO[Arabidopsis thaliana]
(配列番号23)
MAFFSMISILLGFVISSFIFIFFFKKLLSFSRKNMSEVST
LPSVPVVPGFPVIGNLLQLKEKKPHKTFTRWSEIYGPIYS
IKMGSSSLIVLNSTETAKEAMVTRFSSISTRKLSNALTVL
TCDKSMVATSDYDDFHKLVKRCLLNGLLGANAQKRKRHYR
DALIENVSSKLHAHARDHPQEPVNFRAIFEHELFGVALKQ
AFGKDVESIYVKELGVTLSKDEIFKVLVHDMMEGAIDVDW
RDFFPYLKWIPNKSFEARIQQKHKRRLAVMNALIQDRLKQ
NGSESDDDCYLNFLMSEAKTLTKEQIAILVWETIIETADT
TLVTTEWAIYELAKHPSVQDRLCKEIQNVCGGEKFKEEQL
SQVPYLNGVFHETLRKYSPAPLVPIRYAHEDTQIGGYHVP
AGSEIAINIYGCNMDKKRWERPEDWWPERFLDDGKYETSD
LHKTMAFGAGKRVCAGALQASLMAGIAIGRLVQEFEWKLR
DGEEENVDTYGLTSQKLYPLMAIINPRRS
>PpKO[Physcomitrella patens]
(配列番号24)
MAKHLATQLLQQWNEALKTMPPGFRTAGKILVWEELASNK
VLITIALAWVLLFVARTCLRNKKRLPPAIPGGLPVLGNLL
QLTEKKPHRTFTAWSKEHGPIFTIKVGSVPQAVVNNSEIA
KEVLVTKFASISKRQMPMALRVLTRDKTMVAMSDYGEEHR
MLKKLVMTNLLGPTTQNKNRSLRDDALIGMIEGVLAELKA
SPTSPKVVNVRDYVQRSLFPFALQQVFGYIPDQVEVLELG
TCVSTWDMFDALVVAPLSAVINVDWRDFFPALRWIPNRSV
EDLVRTVDFKRNSIMKALIRAQRMRLANLKEPPRCYADIA
LTEATHLTEKQLEMSLWEPIIESADTTLVTSEWAMYEIAK
NPDCQDRLYREIVSVAGTERMVTEDDLPNMPYLGAIIKET
LRKYTPVPLIPSRFVEEDITLGGYDIPKGYQILVNLFAIA
NDPAVWSNPEKWDPERMLANKKVDMGFRDFSLMPFGAGKR
MCAGITQAMFIIPMNVAALVQHCEWRLSPQEISNINNKIE
DVVYLTTHKLSPLSCEATPRISHRLP
>SrKAH1 gi|189418962|gb|ACD93722.1|ent−カ
ウレン酸13−ヒドロキシラーゼ[Stevia rebaudiana]
(配列番号25)
MIQVLTPILLFLIFFVFWKVYKHQKTKINLPPGSFGWPFL
GETLALLRAGWDSEPERFVRERIKKHGSPLVFKTSLFGDR
FAVLCGPAGNKFLFCNENKLVASWWPVPVRKLFGKSLLTI
RGDEAKWMRKMLLSYLGPDAFATHYAVTMDVVTRRHIDVH
WRGKEEVNVFQTVKLYAFELACRLFMNLDDPNHIAKLGSL
FNIFLKGIIELPIDVPGTRFYSSKKAAAAIRIELKKLIKA
RKLELKEGKASSSQDLLSHLLTSPDENGMFLTEEEIVDNI
LLLLFAGHDTSALSITLLMKTLGEHSDVYDKVLKEQLEIS
KTKEAWESLKWEDIQKMKYSWSVICEVMRLNPPVIGTYRE
ALVDIDYAGYTIPKGWKLHWSAVSTQRDEANFEDVTRFDP
SRFEGAGPTPFTFVPFGGGPRMCLGKEFARLEVLAFLHNI
VTNFKWDLLIPDEKIEYDPMATPAKGLPIRLHPHQV
>SrKAH2 特許US20080064063によるent−カウレン酸13−ヒド
ロキシラーゼ[Stevia rebaudiana]
(配列番号26)
MGLFPLEDSYALVFEGLAITLALYYLLSFIYKTSKKTCTP
PKASGEHPITGHLNLLSGSSGLPHLALASLADRCGPIFTI
RLGIRRVLVVSNWEIAKEIFTTHDLIVSNRPKYLAAKILG
FNYVSFSFAPYGPYWVGIRKIIATKLMSSSRLQKLQFVRV
FELENSMKSIRESWKEKKDEEGKVLVEMKKWFWELNMNIV
LRTVAGKQYTGTVDDADAKRISELFREWFHYTGRFVVGDA
FPFLGWLDLGGYKKTMELVASRLDSMVSKWLDEHRKKQAN
DDKKEDMDFMDIMISMTEANSPLEGYGTDTIIKTTCMTLI
VSGVDTTSIVLTWALSLLLNNRDTLKKAQEELDMCVGKGR
QVNESDLVNLIYLEAVLKEALRLYPAAFLGGPRAFLEDCT
VAGYRIPKGTCLLINMWKLHRDPNIWSDPCEFKPERFLTP
NQKDVDVIGMDFELIPFGAGRRYCPGTRLALQMLHIVLAT
LLQNFEMSTPNDAPVDMTASVGMTNAKASPLEVLLSPRVK
WS
>AtKAH gi|332005993|gb|AED93376.1|シトクロムP
450、ファミリー714、サブファミリーA、ポリペプチド2[Arabidopsi
s thaliana]
(配列番号27)
MESLVVHTVNAIWCIVIVGIFSVGYHVYGRAVVEQWRMRR
SLKLQGVKGPPPSIFNGNVSEMQRIQSEAKHCSGDNIISH
DYSSSLFPHFDHWRKQYGRIYTYSTGLKQHLYINHPEMVK
ELSQTNTLNLGRITHITKRLNPILGNGIITSNGPHWAHQR
RIIAYEFTHDKIKGMVGLMVESAMPMLNKWEEMVKRGGEM
GCDIRVDEDLKDVSADVIAKACFGSSFSKGKAIFSMIRDL
LTAITKRSVLFRFNGFTDMVFGSKKHGDVDIDALEMELES
SIWETVKEREIECKDTHKKDLMQLILEGAMRSCDGNLWDK
SAYRRFVVDNCKSIYFAGHDSTAVSVSWCLMLLALNPSWQ
VKIRDEILSSCKNGIPDAESIPNLKTVTMVIQETMRLYPP
APIVGREASKDIRLGDLVVPKGVCIWTLIPALHRDPEIWG
PDANDFKPERFSEGISKACKYPQSYIPFGLGPRTCVGKNF
GMMEVKVLVSLIVSKFSFTLSPTYQHSPSHKLLVEPQHGV
VIRVV
>t26−8RPAtKAH
(配列番号28)
MALLLAVFVYGRAVVEQWRMRRSLKLQGVKGPPPSIFNGN
VSEMQRIQSEAKHCSGDNIISHDYSSSLFPHFDHWRKQYG
RIYTYSTGLKQHLYINHPEMVKELSQTNTLNLGRITHITK
RLNPILGNGIITSNGPHWAHQRRIIAYEFTHDKIKGMVGL
MVESAMPMLNKWEEMVKRGGEMGCDIRVDEDLKDVSADVI
AKACFGSSFSKGKAIFSMIRDLLTAITKRSVLFRFNGFTD
MVFGSKKHGDVDIDALEMELESSIWETVKEREIECKDTHK
KDLMQLILEGAMRSCDGNLWDKSAYRRFVVDNCKSIYFAG
HDSTAVSVSWCLMLLALNPSWQVKIRDEILSSCKNGIPDA
ESIPNLKTVTMVIQETMRLYPPAPIVGREASKDIRLGDLV
VPKGVCIWTLIPALHRDPEIWGPDANDFKPERFSEGISKA
CKYPQSYIPFGLGPRTCVGKNFGMMEVKVLVSLIVSKFSF
TLSPTYQHSPSHKLLVEPQHGVVIRVV
>t14−8RPAtKAH
(配列番号29)
MALLLAVFIVIVGIFSVGYHVYGRAVVEQWRMRRSLKLQG
VKGPPPSIFNGNVSEMQRIQSEAKHCSGDNIISHDYSSSL
FPHFDHWRKQYGRIYTYSTGLKQHLYINHPEMVKELSQTN
TLNLGRITHITKRLNPILGNGIITSNGPHWAHQRRIIAYE
FTHDKIKGMVGLMVESAMPMLNKWEEMVKRGGEMGCDIRV
DEDLKDVSADVIAKACFGSSFSKGKAIFSMIRDLLTAITK
RSVLFRFNGFTDMVFGSKKHGDVDIDALEMELESSIWETV
KEREIECKDTHKKDLMQLILEGAMRSCDGNLWDKSAYRRF
VVDNCKSIYFAGHDSTAVSVSWCLMLLALNPSWQVKIRDE
ILSSCKNGIPDAESIPNLKTVTMVIQETMRLYPPAPIVGR
EASKDIRLGDLVVPKGVCIWTLIPALHRDPEIWGPDANDF
KPERFSEGISKACKYPQSYIPFGLGPRTCVGKNFGMMEVK
VLVSLIVSKFSFTLSPTYQHSPSHKLLVEPQHGVVIRVV
>SrCPR ABB88839.2|NADPHシトクロムP450レダクターゼ[S
tevia rebaudiana]
(配列番号30)
MQSDSVKVSPFDLVSAAMNGKAMEKLNASESEDPTTLPAL
KMLVENRELLTLFTTSFAVLIGCLVFLMWRRSSSKKLVQD
PVPQVIVVKKKEKESEVDDGKKKVSIFYGTQTGTAEGFAK
ALVEEAKVRYEKTSFKVIDLDDYAADDDEYEEKLKKESLA
FFFLATYGDGEPTDNAANFYKWFTEGDDKGEWLKKLQYGV
FGLGNRQYEHFNKIAIVVDDKLTEMGAKRLVPVGLGDDDQ
CIEDDFTAWKELVWPELDQLLRDEDDTSVTTPYTAAVLEY
RVVYHDKPADSYAEDQTHTNGHVVHDAQHPSRSNVAFKKE
LHTSQSDRSCTHLEFDISHTGLSYETGDHVGVYSENLSEV
VDEALKLLGLSPDTYFSVHADKEDGTPIGGASLPPPFPPC
TLRDALTRYADVLSSPKKVALLALAAHASDPSEADRLKFL
ASPAGKDEYAQWIVANQRSLLEVMQSFPSAKPPLGVFFAA
VAPRLQPRYYSISSSPKMSPNRIHVTCALVYETTPAGRIH
RGLCSTWMKNAVPLTESPDCSQASIFVRTSNFRLPVDPKV
PVIMIGPGTGLAPFRGFLQERLALKESGTELGSSIFFFGC
RNRKVDFIYEDELNNFVETGALSELIVAFSREGTAKEYVQ
HKMSQKASDIWKLLSEGAYLYVCGDAKGMAKDVHRTLHTI
VQEQGSLDSSKAELYVKNLQMSGRYLRDVW
>AtCPR[Arabidopsis thaliana]
(配列番号31)
MTSALYASDLFKQLKSIMGTDSLSDDVVLVIATTSLALVA
GFVVLLWKKTTADRSGELKPLMIPKSLMAKDEDDDLDLGS
GKTRVSIFFGTQTGTAEGFAKALSEEIKARYEKAAVKVID
LDDYAADDDQYEEKLKKETLAFFCVATYGDGEPTDNAARF
SKWFTEENERDIKLQQLAYGVFALGNRQYEHFNKIGIVLD
EELCKKGAKRLIEVGLGDDDQSIEDDFNAWKESLWSELDK
LLKDEDDKSVATPYTAVIPEYRVVTHDPRFTTQKSMESNV
ANGNTTIDIHHPCRVDVAVQKELHTHESDRSCIHLEFDIS
RTGITYETGDHVGVYAENHVEIVEEAGKLLGHSLDLVFSI
HADKEDGSPLESAVPPPFPGPCTLGTGLARYADLLNPPRK
SALVALAAYATEPSEAEKLKHLTSPDGKDEYSQWIVASQR
SLLEVMAAFPSAKPPLGVFFAAIAPRLQPRYYSISSCQDW
APSRVHVTSALVYGPTPTGRIHKGVCSTWMKNAVPAEKSH
ECSGAPIFIRASNFKLPSNPSTPIVMVGPGTGLAPFRGFL
QERMALKEDGEELGSSLLFFGCRNRQMDFIYEDELNNFVD
QGVISELIMAFSREGAQKEYVQHKMMEKAAQVWDLIKEEG
YLYVCGDAKGMARDVHRTLHTIVQEQEGVSSSEAEAIVKK
LQTEGRYLRDVW
Claims (80)
- レバウジオシドM(RebM)またはレバウジオシドD(RebD)を作製する方法で
あって、
複数のウリジン二リン酸依存型グリコシルトランスフェラーゼ酵素(UGT)を介してス
テビオールからRebMまたはRebDを生成する宿主細胞を提供すること、ただし、該
UGT酵素は、
(a)レバウジオシドA(RebA)のC19における1−2’グリコシル化活性がその
親UGT酵素より高く、ステビオールモノシドのC13において1−2’グリコシル化活
性の実質的損失がない、修飾されたUGT酵素、及び
(b)レバウジオシドD(RebD)のC19における1−3’グリコシル化活性がその
親UGT酵素より高く、かつステビオシドのC13において1−3’グリコシル化活性の
実質的損失がない、修飾されたUGT酵素
のうち1つ以上を含んでおり、かつ
前記宿主細胞を前記RebMが生成される条件下で培養すること
を含む前記方法。 - (a)レバウジオシドA(RebA)のC19における1−2’グリコシル化活性が、
ステビオールモノシドのC13における1−2’グリコシル化活性と等しいかまたはそれ
より優れており、かつ/または
(b)レバウジオシドD(RebD)のC19における1−3’グリコシル化活性が、ス
テビオシドのC13における1−3’グリコシル化活性と等しいかまたはそれより優れて
いる、請求項1に記載の方法。 - 前記細胞は、ステビオールモノシドのC13における1−2’グリコシル化活性を有す
るUGT酵素を1つのみ発現し、かつ/またはステビオシドのC13における1−3’グ
リコシル化活性を有するUGT酵素を1つのみ発現する、請求項1または2に記載の方法
。 - 少なくとも1つのUGT酵素は、親UGT酵素の円順列変異体である、請求項1〜3の
いずれか一項に記載の方法。 - 前記円順列変異体は、切断部位を、野生型酵素の150位と300位に対応する各アミ
ノ酸の間、任意選択で170位と280位のアミノ酸の間、任意選択で190位と210
位の残基の間に有する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。 - 1−2’グリコシル化活性を有する前記UGT酵素は、OsUGT1−2もしくはSr
UGT91D2、またはSrUGT91D1、または、RebAのC19における高いグ
リコシル化活性を有するその誘導体である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。 - 1−2’グリコシル化活性を有する前記UGT酵素は、OsUGT1−2またはその誘
導体であり、かつ、任意選択で、RebAのC19における1−2’グリコシル化活性を
高めるアミノ酸置換、アミノ酸欠失、及び/またはアミノ酸挿入を1つ以上含む、OsU
GT1−2の円順列変異体である、請求項6に記載の方法。 - 1−2’グリコシル化活性を有する前記UGT酵素は、配列番号7の190〜210内
のある位置に対応する切断部位を有し、任意選択で配列番号7のN末端残基及びC末端残
基に対応するアミノ酸の間にリンカー配列を有するOsUGT1−2の円順列変異体であ
り、前記リンカーが任意選択で2〜25アミノ酸長である、請求項7に記載の方法。 - 前記リンカーは8〜20アミノ酸長であり、任意選択で17アミノ酸長である、請求項
8に記載の方法。 - 前記切断部位は、配列番号7の196位、197位、198位、または199位に対応
する、請求項6または7に記載の方法。 - 1−2’グリコシル化活性を有する前記UGT酵素は、SrUGT91D2またはその
誘導体であり、任意選択で、RebAのC19のグリコシル化活性を高めるアミノ酸置換
、アミノ酸挿入、及び/またはアミノ酸欠失を1つ以上含む円順列変異体である、請求項
1〜10のいずれか一項に記載の方法。 - 1−2’グリコシル化活性を有する前記UGT酵素は、MbUGT1,2−2(配列番
号45)またはその誘導体である、請求項10に記載の方法。 - 1−3’グリコシル化活性を有する前記UGT酵素は、SrUGT76G1、または、
RebDのC19において高いグリコシル化活性を有するその誘導体である、請求項1〜
12のいずれか一項に記載の方法。 - 1−3’グリコシル化活性を有する前記UGT酵素は、SrUGT76G1の誘導体で
あり、任意選択で、RebDのC19のグリコシル化活性を高めるアミノ酸置換、アミノ
酸挿入、及び/またはアミノ酸欠失を1つ以上含む円順列変異体である、請求項13に記
載の方法。 - 1−3’グリコシル化活性を有する前記UGT酵素は、200位、284位及び/また
は379位のうち1つ以上の位置におけるアミノ酸置換を含むSrUGT76G1の誘導
体であり、それらは任意選択でL200A、L200G、T284G及び/またはL37
9Gであり、ここで、アミノ酸の位置が配列番号3にしたがい番号付けされている、請求
項14に記載の方法。 - 前記SrUGT76G1は、配列番号3の190位〜290位内のある残基に対応する
切断部位を有する円順列変異体である、請求項14または15に記載の方法。 - 前記円順列変異体は、配列番号3の213位、239位、255位、261位、または
263位に対応する切断部位を有する、請求項16に記載の方法。 - 前記円順列変異体は、配列番号3の263位に対応する切断部位を有し、任意選択で、
配列番号3のN末端残基及びC末端残基に対応するアミノ酸の間にリンカー配列を有し、
該リンカーが任意選択で2〜25アミノ酸長である、請求項17に記載の方法。 - 前記リンカーは8〜20アミノ酸長である、請求項18に記載の方法。
- 前記宿主細胞は、ステビオールをステビオールモノシドに変換するUGT酵素をさらに
含む、請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法。 - ステビオールをステビオールモノシドに変換する前記UGT酵素は、SrUGT85C
2、またはその誘導体である、請求項20に記載の方法。 - ステビオールをステビオールモノシドに変換する前記UGT酵素は、野生型配列にした
がい番号付けされている変異P215T、S308T、D311Q、G316A、H34
9E、E414G、及びG420Dのうち1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、または
7つを含むSrUGT85C2誘導体である、請求項21に記載の方法。 - ステビオールをステビオールモノシドに変換する前記酵素は、SrUGT85C2の円
順列変異体である、請求項21に記載の方法。 - 前記宿主細胞は、ステビオールビオシドをステビオシドに変換するUGT酵素をさらに
含む、請求項1〜23のいずれか一項に記載の方法。 - 前記ステビオールビオシドをステビオシドに変換するUGT酵素は、SrUGT74G
1、またはその誘導体である、請求項24に記載の方法。 - 前記酵素はSrUGT74G1の円順列変異体でステビオールビオシドをステビオシド
に変換する、請求項25に記載の方法。 - 前記SrUGT74G1の円順列変異体は、野生型酵素の258位、259位、260
位、261位、または262位に対応する切断部位を有する、請求項26に記載の方法。 - 前記宿主細胞は、カウレン合成酵素(KS)、カウレンオキシダーゼ(KO)、及びカ
ウレン酸ヒドロキシラーゼ(KAH)を含む酵素経路を介してステビオール基質を産生し
、かつ、前記KO酵素及びKAH酵素の1つ以上を再生するシトクロムP450レダクタ
ーゼ酵素(CPR)をさらに含む、請求項1〜27のいずれか一項に記載の方法。 - 前記宿主細胞はE.coliである、請求項28に記載の方法。
- 前記KAHは、Stevia rebaudiana、Arabidopsis th
aliana、Vitis vinifera、もしくはMedicago trunc
ulataのKAH、またはその誘導体である、請求項28に記載の方法。 - 前記KAHは、Arabidopsis thalianaのKAH(AtKAH)、
またはその誘導体である、請求項30に記載の方法。 - 前記AtKAHは、カウレン酸ヒドロキシラーゼ活性の速度を高めるアミノ酸置換、ア
ミノ酸挿入、及び/またはアミノ酸欠失を1つ以上有し、かつ/または、E.coliで
機能発現するよう工学的に操作されたN末端を有する、請求項31に記載の方法。 - 前記AtKAHは、配列番号29の25位、79位、119位、137位、142位、
155位、180位、193位、196位、197位、226位、331位、235位、
238位、245位、272位、285位、287位、325位、330位、334位、
339位、352位、373位、397位、470位、499位、506位、及び507
位、に対応する位置のうち1つ以上の位置にアミノ酸置換を有し、それらは任意選択でA
25L、S79T、T119C、I137L、I142V、R155K、M180L、E
193G、C196A、D197E、A226E、L235Q、I238M、F245L
、F245V、L272I、I285R、C287S、C325I、C325M、F33
0L、C331I、D334E、S339T、S352E、E373D、I397F、V
470L、Q499V、L506M、L507I、L507T、及びL507Vのうちの
1つ以上である、請求項32に記載の方法。 - 前記AtKAHは、野生型配列の331位に対応する位置でのアミノ酸置換を含み、こ
こで、前記置換は任意選択でC331Iである、33に記載の方法。 - 前記KSは、任意選択でStevia rebaudiana、Zea mays、P
opulus trichocarpa、もしくはArabidopsis thali
ana、またはその誘導体に由来するKSである、請求項28〜34のいずれか一項に記
載の方法。 - 前記細胞は、Stevia rebaudiana、Erwina tracheip
hila、Sinorhizobium fredii、Streptomyces c
lavuligerus、Bradyrhizobium japonicum、Zea
mays、Arabidopsis thalianaに由来するコパリル二リン酸合
成酵素(CPPS)、またはその誘導体を発現する、請求項28〜35のいずれか一項に
記載の方法。 - 前記宿主細胞は、任意選択でPhomopsis amygdali、Physcom
itrella patens、Gibberella fujikuroi、 Pha
eosphaeria sp.、またはその誘導体から選択されるCPPSとKSとの二
機能性酵素を発現する、請求項28〜35に記載の方法。 - 前記宿主細胞は、Stevia rebaudiana、Arabidopsis t
haliana、Physcomitrella patens、Gibberella
fujikoroi、もしくはTrametes versicolor、または、そ
の誘導体に由来するカウレン酸化酵素を発現し、該酵素は任意選択でE.coliに機能
発現させるためにN末端で修飾される、請求項28〜37のいずれか一項に記載の方法。 - 前記CPRは、Stevia rebaudiana、Arabidopsis th
aliana、もしくはGiberella fujikuroiの酵素、または、その
誘導体であり、かつ任意選択で、E.coliに機能発現させるためにN末端で修飾され
る、請求項28〜38のいずれか一項に記載の方法。 - 前記宿主細胞は、ゲラニルゲラニルピロリン酸合成酵素(GGPPS)を発現し、該酵
素は任意選択でTaxus canadensis、Abies grandis、As
pergillus nidulans、Stevia rebaudiana、Gib
berella fujikuroi、海洋細菌443、Paracoccus hae
undaensis、Chlorobium tepidum、Mus musculu
s、Thalassiosira pseudonana、Streptomyces
melanosporofaciens、Streptomyces clavulig
erus、Sulfulubus acidocaldarius、Synechoco
ccus sp.、Synechocystis sp.、Arabidopsis t
haliana、Thermotogo maritime、Corynebacter
ium glutamicum、Thermus thermophillus、Pyr
obaculum calidifontis、またはその誘導体である、請求項1〜3
9のいずれか一項に記載の方法。 - 前記宿主細胞は、イソペンチルピロリン酸(iso−pentyl pyrophos
phate)(IPP)及びジメチルアリルピロリン酸(DMAPP)を生成する経路を
発現する、請求項1〜40のいずれか一項に記載の方法。 - 前記経路は、メチルエリスリトールリン酸(MEP)経路及び/またはメバロネート(
MVA)経路である、請求項41に記載の方法。 - 前記宿主細胞は、原核細胞または真核細胞である、請求項41または42に記載の方法
。 - 前記宿主細胞は、E.coli、Bacillus subtillus、またはPs
eudomonas putidaである、請求項43に記載の方法。 - 前記宿主細胞は、Saccharomyces cerevisiae、Pichia
pastoris、及びYarrowia lipolyticaを含む、サッカロミ
セスの種、ピチアの種、またはヤロウィアの種である、請求項43に記載の方法。 - 前記宿主細胞は、dxs、idi、IspD、及びIspFの重複または過剰発現を有
するE.coliである、請求項44に記載の方法。 - 前記E.coliは、UDP−グルコースの生成を高める遺伝子修飾を1つ以上有する
、請求項44に記載の方法。 - 1つ以上の前記遺伝子修飾に、ΔgalE、ΔgalT、ΔgalK、ΔgalM、Δ
ushA、Δagp、Δpgm、E coliのGALUの重複、Bacillus s
ubtillusのUGPAの発現、Bifidobacterium adolesc
entisのSPLの発現が含まれる、請求項47に記載の方法。 - 前記宿主細胞は、異種発現させた遺伝子である、
Taxus canadensisのGGPSまたはその誘導体、
Phaeosphaeria sp.のPsCK(またはその誘導体、
Stevia rebaudianaのKOまたはその誘導体、
Arabidopsis thalianaのKAHまたはその誘導体、
Stevia rebaudianaのCPRまたはその誘導体、
Stevia rebaudianaのUGT85C2またはその誘導体、
Stevia rebaudianaのUGT74G1もしくはその誘導体、またはMb
UGTC19もしくはその誘導体、
Stevia rebaudianaのUGT76G1もしくはその誘導体、またはMb
UGT1−3もしくはその誘導体、及び
Stevia rebaudianaのUGT91D2、またはOsUGT1−2、また
はMbUGT1−2またはその誘導体
を含む、請求項1〜48のいずれか一項に記載の方法。 - 前記宿主細胞は、異種発現させた遺伝子である、
Corynebacterium glutamicumのGGPSまたはその誘導体、
Erwina tracheiphilaのCPPSまたはその誘導体、
Erwina tracheiphilaのKSまたはその誘導体、
Stevia rebaudianaのKOまたはその誘導体、
Arabidopsis thalianaのKAHまたはその誘導体、
Stevia rebaudianaのCPRまたはその誘導体、
Stevia rebaudianaのUGT85C2またはその誘導体、
Stevia rebaudianaのUGT74G1もしくはその誘導体、またはMb
UGTC19もしくはその誘導体、またはMbUGTC19−2もしくはその誘導体、
Stevia rebaudianaのUGT76G1もしくはその誘導体、またはMb
UGT1−3もしくはその誘導体、及び
Stevia rebaudianaのUGT91D2、またはOsUGT1−2、また
はMbUGT1,2−2またはその誘導体
を含む、請求項1〜48のいずれか一項に記載の方法。 - 前記KAHは、置換C331Iを有するAtKAH誘導体である、請求項50に記載の
方法。 - 前記UGT85C2は、置換P215Tを有する誘導体である、請求項50または51
に記載の方法。 - 前記宿主細胞は、22℃〜37℃、任意選択で27℃〜37℃で細胞培養されたE.c
oli宿主細胞である、請求項50〜52のいずれか一項に記載の方法。 - 培地からRebMを回収することをさらに含む、請求項1〜53のいずれか一項に記載
の方法。 - RebMを、濃度が少なくとも約10mg/Lの培地で生成させる、請求項54に記載
の方法。 - RebMとRebDとの比が1:1〜1:0である、請求項55に記載の方法。
- RebDを、RebM収率の約20%未満で生成させる、請求項56に記載の方法。
- RebMが、前記ステビオールのグリコシル化産物の少なくとも約25重量%を占める
、請求項56に記載の方法。 - 請求項1〜58のいずれか一項に記載の方法にしたがってRebMを生成し、RebM
を製品に組み込むことを含む、RebMを含む製品を製造する方法。 - 配列番号9と少なくとも60%同一なアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
- 配列番号10と少なくとも60%同一なアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
- 配列番号8と少なくとも60%同一なアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
- 配列番号45と少なくとも60%同一なアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
- 配列番号46と少なくとも60%同一なアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
- 331に対応する位置で置換を含み、任意選択でC331Iである、Arabodop
isis thalianaのKAH。 - 215位、308位、311位、316位、349位、414位及び420位のうち1
つ以上の位置における置換を含む、Stevia rebaudianaのUGT85C
2。 - 前記置換に、P215T、S308T、D311Q、G316A、H349E、E41
4G、及びG420Dのうち1つ以上が含まれる、請求項66に記載のStevia r
ebaudianaのUGT85C2。 - 野生型UGT酵素の円順列変異体であるアミノ酸配列を含み、任意選択で、野生型の対
応する位置に対するアミノ酸置換、アミノ酸欠失、及び/またはアミノ酸挿入を1〜50
含み得るアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。 - 配列番号29の25位、79位、119位、137位、142位、155位、180位
、193位、196位、197位、226位、235位、238位、245位、272位
、285位、287位、325位、330位、331位、334位、339位、352位
、373位、397位、470位、499位、506位、及び507位に対応する位置の
うち1つ以上の位置におけるアミノ酸置換を有し、それらは任意選択でA25L、S79
T、T119C、I137L、I142V、R155K、M180L、E193G、C1
96A、D197E、A226E、L235Q、I238M、F245L、F245V、
L272I、I285R、C287S、C325I、C325M、F330L、C331
I、D334E、S339T、S352E、E373D、I397F、V470L、Q4
99V、L506M、L507I、L507T、及びL507Vのうち1つ以上である、
カウレン酸ヒドロキシラーゼ(KAH)ポリペプチド。 - 請求項60〜69のいずれか一項に記載の酵素をコードする、ポリヌクレオチド。
- 請求項70に記載のポリヌクレオチドを発現している、宿主細胞。
- カウレン酸を生成する宿主細胞に請求項65または69に記載のKAHを発現させるこ
とを含む、ステビオールを作製する方法。 - 複数のグリコシル化を有するステビオール配糖体を作製する方法であって、
IPP及びDMAPPからステビオールを生成するための組換え経路と、前記ステビオー
ルから前記ステビオール配糖体を生成する少なくとも2つのUGT酵素とを発現している
E.coli宿主細胞を22〜37℃で培養すること
を含む、前記方法。 - 前記ステビオール配糖体は、少なくとも50mg/L、または少なくとも100mg/
Lの量で培養で生成され、かつ、任意選択でRebDまたはRebMである、請求項73
に記載の方法。 - 前記E.coliを、少なくとも約24℃、または少なくとも約27℃、または少なく
とも約30℃、または少なくとも約34℃、または約37℃の温度で培養する、請求項7
4に記載の方法。 - 少なくとも1つのUGT酵素は野生型酵素の円順列変異体である、請求項73〜75の
いずれか一項に記載の方法。 - 前記E.coliは、表1に掲載される酵素を1つ以上、またはその誘導体を発現する
、請求項75に記載の方法。 - 前記E.coliは、
Corynebacterium glutamicumのGGPSまたはその誘導体、
Erwina tracheiphilaのCPPSまたはその誘導体、
Erwina tracheiphilaのKSまたはその誘導体、
Stevia rebaudianaのKOまたはその誘導体、
Arabidopsis thalianaのKAHまたはその誘導体、
Stevia rebaudianaのCPRまたはその誘導体、
Stevia rebaudianaのUGT85C2またはその誘導体、
Stevia rebaudianaのUGT74G1もしくはその誘導体、またはMb
UGTC19もしくはその誘導体、またはMbUGTC19−2もしくはその誘導体、
Stevia rebaudianaのUGT76G1もしくはその誘導体、またはMb
UGT1−3もしくはその誘導体、及び
Stevia rebaudianaのUGT91D2、またはOsUGT1−2、また
はMbUGT1,2−2またはその誘導体
のうち1つ以上を発現する、請求項75に記載の方法。 - 前記KAHは、置換C331Iを有するAtKAH誘導体である、請求項78に記載の
方法。 - 前記UGT85C2は、置換P215Tを有する誘導体である、請求項78に記載の方
法。
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