WO2018056388A1 - セサミノールまたはセサミノール配糖体の生産方法 - Google Patents

セサミノールまたはセサミノール配糖体の生産方法 Download PDF

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WO2018056388A1
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sesaminol
glucoside bond
glycoside
amino acid
bond
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PCT/JP2017/034197
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美佐 落合
栄一郎 小埜
Original Assignee
サントリーホールディングス株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing sesaminol or sesaminol glycoside.
  • Sesame (Sesamum indicum) is an annual plant of the sesame genus Sesame. Sesame is the oldest cultivated oil plant with a history of about 6000 years and has been cultivated all over the world. Sesame has been a valuable food since ancient times and has been known as a healthy food.
  • sesame seeds, oils obtained from sesame seeds, and sesame seed extracts are used. About 50% of the components contained in sesame seeds are lipids, and the main components are triglycerides mainly composed of oleic acid and linoleic acid.
  • sesame lignan is included as a characteristic component in sesame seeds.
  • Lignan is a plant secondary metabolite and is a compound in which two molecules of a phenylpropanoid compound having a C 6 C 3 skeleton are polymerized (8,8′-bonded) mainly through their 8-8 ′ positions. . Lignans are thought to contribute to biological defense mechanisms in plants. Lignans contained in sesame are called sesame lignans, and include sesamin, sesaminol, sesamolin, pinoresinol, and sesamolinol (Non-patent Document 1). Sesamin, one of the sesame lignans, has a variety of physiological activities, and a method for separating and purifying it from sesame seeds or squeezed sesame seeds has already been put to practical use.
  • sesame lignans are known to exist in plants as glycosides.
  • sesaminol has a high antioxidant activity.
  • Sesaminol is present in sesame seeds as a sesaminol glycoside, which includes sesaminol 2′-O- ⁇ -D-glucopyranoside (sesaminol monoglucoside, SMG), sesaminol 2′-.
  • O- ⁇ -D-glucopyranosyl (1-2) -O- ⁇ -D-glucopyranoside sesaminol (1-2) diglucoside, SDG (1,2)
  • sesaminol 2′-O- ⁇ -D-glucopyranosyl (1-6) -O- ⁇ -D-glucopyranoside sesaminol (1-6) diglucoside, SDG (1,6)
  • sesaminol 2′-O- ⁇ -D-glucopyranosyl (1-2)- And O-(- ⁇ -D-glucopyranosyl (1-2)) ⁇ -D-glucopyranoside sesaminol triglucoside, STG).
  • Sesaminol is also produced by acid-catalyzed reaction from sesamolin in the purification process of sesame oil. Sesaminol has a strong antioxidant activity, and a physiological activity favorable to health has been reported (Non-patent Document 2). The physiological activity of sesaminol is exhibited by aglycone from which the sugar moiety has been removed.
  • sesame squeeze produced during the production of sesame oil contains sesaminol glycosides but is not effectively utilized. If sesaminol glycoside can be hydrolyzed to obtain sesaminol, which is an aglycon, it is possible to produce sesaminol using cheap sesame squeezed rice cake as a raw material.
  • a method for obtaining sesaminol from a sesaminol glycoside there are a method using a microorganism belonging to the genus Aspergillus (Patent Document 1) and a fermentation method using a mixed culture of Bacillus and Enterococcus (Patent Document 2). Has been developed.
  • Non-Patent Literature 3 a method using ⁇ -glucosidase derived from a strain KB0549 belonging to the genus Paenibacillus. This enzyme cleaves ⁇ -1,2- and ⁇ -1,6-glucoside bonds and sesaminol-glucose ⁇ -glucoside bonds of sesaminol glycosides.
  • STG is used as a substrate, ⁇ -1,2-glucoside bonds are preferentially hydrolyzed compared to ⁇ -1,6-glucoside bonds.
  • AOBGL11p a glycoside hydrolase derived from Aspergillus, hydrolyzes sesaminol triglucoside to produce sesaminol and sesaminol glycosides.
  • the inventors have found that the present invention has activity and have completed the present invention.
  • the present invention is as follows. (1) By reacting a protein selected from the group consisting of the following (a) to (c) with a substrate sesaminol glycoside having at least one glucoside bond, at least one of the substrate sesaminol glycosides A method for producing a produced sesaminol or a produced sesaminol glycoside, comprising a step of hydrolyzing a glucoside bond.
  • a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;
  • B a substrate sesaminol glycoside consisting of an amino acid sequence in which 1 to 83 amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having at least one glucoside bond
  • C The activity of hydrolyzing the glucoside bond of the substrate sesaminol glycoside having an amino acid sequence having a sequence identity of 90% or more with respect to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having at least one glucoside bond
  • the substrate sesaminol glycoside is sesaminol 2′-O- ⁇ -D-glucopyranoside (sesaminol monoglucoside, SMG), sesaminol 2′-O- ⁇ -D-glucopyranosyl (1) -2) -O- ⁇ -D-glucopyranoside (sesaminol (1-2) digluc
  • the at least one glucoside bond is a glucoside bond between glucose and aglycone bonded to the 2 ′ position of sesaminol, a ⁇ -1,6-glucoside bond of gentiobiose bonded to the 2 ′ position of sesaminol, sesaminol Selected from the group consisting of a ⁇ -1,2 bond of sophorose bonded to the 2 ′ position, or a ⁇ -1,6-glucoside bond or a ⁇ -1,2 bond of a branched trisaccharide bonded to the 2 ′ position to sesaminol.
  • the method according to any one of (1) to (4) above, which is any one of the above.
  • a method for producing a produced sesaminol or a produced sesaminol glycoside comprising a step of hydrolyzing at least one glucoside bond of the substrate sesaminol glycoside by contacting with the nor glycoside.
  • a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1;
  • B a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;
  • C a substrate sesaminol glycoside consisting of an amino acid sequence in which 1 to 83 amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having at least one glucoside bond
  • D Activity of hydrolyzing the glucoside bond of the substrate sesaminol glycoside having an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with respect to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having at least one glucoside bond
  • the substrate sesaminol glycoside is sesaminol 2′-O- ⁇ -D-glucopyranoside (sesaminol monoglucoside, SMG), sesaminol 2′-O- ⁇ -D-glucopyranosyl (1-2) -O- ⁇ -D-glucopyranoside (sesaminol (1-2) diglucoside, SDG (1,2)), sesaminol 2'-O- ⁇ -D-glucopyranosyl (1-6) -O- ⁇ -D- Glucopyranoside (sesaminol (1-6) diglucoside, SDG (1,6)), and sesaminol 2′-O- ⁇ -D-glucopyranosyl (1-2) -O — (- ⁇ -D-glucopyranosyl (1
  • the produced sesaminol or the produced sesaminol glycoside is any one or more selected from the group consisting of SDG (1,6), SDG (1,2) and sesaminol (6) ) To (9).
  • the at least one glucoside bond is a glucoside bond between glucose and aglycone bonded to the 2 ′ position of sesaminol, a ⁇ -1,6-glucoside bond of gentiobiose bonded to the 2 ′ position of sesaminol, sesaminol Selected from the group consisting of a ⁇ -1,2 bond of sophorose bonded to the 2 ′ position, or a ⁇ -1,6-glucoside bond or a ⁇ -1,2 bond of a branched trisaccharide bonded to the 2 ′ position to sesaminol.
  • a method for producing produced sesaminol or produced sesaminol glycoside comprising culturing a non-human transformant introduced with a polynucleotide selected from the group consisting of the following (a) to (e): .
  • a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1;
  • B a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;
  • C a substrate sesaminol glycoside consisting of an amino acid sequence in which 1 to 83 amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having at least one glucoside bond
  • D Activity of hydrolyzing the glucoside bond of the substrate sesaminol glycoside having an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with respect to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having at least one glucoside bond
  • the at least one glucoside bond is a glucoside bond between glucose and aglycone bound to sesaminol 2′-position, a ⁇ -1,6-glucoside bond of gentiobiose bound to sesaminol 2′-position, sesaminol Selected from the group consisting of a ⁇ -1,2 bond of sophorose bonded to the 2 ′ position, or a ⁇ -1,6-glucoside bond or a ⁇ -1,2 bond of a branched trisaccharide bonded to the 2 ′ position to sesaminol.
  • the method according to any one of (12) to (14) above, which is any one of the above.
  • the method of the present invention provides a new method for producing sesaminol and sesaminol glycosides.
  • various sesaminol glycosides can be produced by selecting reaction conditions.
  • the amount of sesaminol and / or sesaminol glycosides produced can be increased by selecting reaction conditions such as enzyme concentration.
  • the amount of SDG (1, 2) generated can be selectively increased.
  • B Optimum pH of AOBGL11p using pNP- ⁇ -Glc as a substrate.
  • D pH stability of AOBGL11p using pNP- ⁇ -Glc as a substrate. It is a figure of the comparison of the genomic DNA sequence of AOBGL11 and cDNA sequence.
  • sesaminol glycoside as a substrate is sometimes referred to as “substrate sesaminol glycoside”
  • sesaminol glycoside as a product is sometimes referred to as “produced sesaminol glycoside”.
  • both are sometimes collectively referred to as “sesaminol glycosides”.
  • AOBGL11p is a glycoside hydrolase family 3 (GH3) ⁇ -glucosidase
  • the cDNA sequence is shown in SEQ ID NO: 1
  • the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 2
  • the genomic DNA sequence is shown in SEQ ID NO: 3.
  • the present invention relates to a protein selected from the group consisting of the following (a) to (c) (hereinafter referred to as “protein of the present invention”), sesaminol
  • a protein selected from the group consisting of the following (a) to (c) (hereinafter referred to as “protein of the present invention”), sesaminol
  • a method for producing sesaminol and / or sesaminol glycosides which comprises a step of reacting saccharides to hydrolyze at least one glucoside bond.
  • A a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 consists of an amino acid sequence in which 1 to 83 amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added, and at least one glucoside bond of sesaminol glycoside is hydrolyzed.
  • a protein having an activity of degrading (C) a protein having an amino acid sequence having a sequence identity of 90% or more with respect to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having an activity to hydrolyze at least one glucoside bond of sesaminol glycoside
  • the protein described in the above (b) or (c) is typically a variant of a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, for example, “Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 4, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2012, Ausubel, Current, Protocols, in Molecular Biology, John Wiley, Sons, 1987-1997, Nuc. Acids, Res., 10, 6487 (1982), Proc. Natl. Acad Sci. USA, 79, 6409 (1982) ”,“ Gene, 34, 315) (1985) ”,“ Nuc. Acids. Res., 13, 4431 (1985) ”,“ Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 82, 488 (1985) ”and the like, which can be obtained artificially using the site-directed mutagenesis method described in the above.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 consists of an amino acid sequence in which 1 to 83 amino acids are deleted, substituted, inserted, and / or added, and hydrolyzes at least one glucoside bond of sesaminol glycoside.
  • a sesaminol glycoside comprising an amino acid sequence in which 1 to 4, 1 to 4, 1 to 3, 1 to 2, or 1 amino acid residue is deleted, substituted, inserted and / or added.
  • a protein having an activity of hydrolyzing at least one glucoside bond In
  • Such a protein includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% 99% or more, 99.1% or more, 99.2% or more, 99.3% or more, 99.4% or more, 99.5% or more, 99.6% or more, 99.7% or more, 99.
  • examples thereof include a protein having an amino acid sequence having a sequence identity of 8% or more, or 99.9% or more and having an activity of hydrolyzing at least one glucoside bond of sesaminol glycoside. In general, the larger the sequence identity value, the better.
  • At least one glucoside bond of sesaminol glycoside means sesaminol glycoside, which is a glycoside obtained by binding sugar to sesaminol, between sesaminol, which is an aglycon, and a side chain. It means a glucoside bond and a glucoside bond in the side chain.
  • the activity of hydrolyzing the glucoside bond of the substrate sesaminol glycoside having at least one glucoside bond is an aglycon in the sesaminol glycoside, which is a glycoside having a saccharide bound to sesaminol.
  • glucoside bond between sesaminol and the side chain and the glucoside bond in the side chain.
  • glucosidic bonds in the side chain include ⁇ -1,6-glucoside bond of gentiobiose bonded to the 2 ′ position of sesaminol, ⁇ -1,2-glucoside bond of sophorose bonded to the 2 ′ position of sesaminol, sesame
  • examples thereof include a ⁇ -1,2-glucoside bond of a branched trisaccharide bonded to the 2 ′ position of the diol and / or a ⁇ -1,6-glucoside bond of a branched trisaccharide bonded to the 2 ′ position of the sesaminol.
  • all glucosidic bonds are hydrolyzed to produce sesaminol from sesaminol glycosides.
  • the ⁇ -1,6-glucoside bond of the branched trisaccharide attached to the 2 ′ position of sesaminol is preferentially hydrolyzed. In this way, the produced sesaminol glycosides in which only some sugars are cleaved or sesaminols in which all sugars are cleaved are produced.
  • the activity of hydrolyzing the glucoside bond of the substrate sesaminol glycoside having at least one glucoside bond has the protein of the present invention and, for example, the group consisting of STG, SDG (1,2), SDG (1,6), SMG
  • the reaction product sesaminol and / or sesaminol glycoside
  • the present invention provides a method for producing sesaminol comprising the step of cleaving all glucoside bonds of sesaminol glycoside.
  • the present invention provides specific linkages of sesaminol glycosides, such as glucoside linkages between glucose and aglycone attached to the 2 position of sesaminol, ⁇ of gentiobiose attached to the 2 position of sesaminol.
  • a method for producing sesaminol and / or sesaminol glycoside which comprises a step of cleaving a ⁇ -1,2 bond.
  • the ⁇ -1,6-bond is hydrolyzed in preference to the ⁇ -1,2-bond.
  • amino acid residues that can be substituted with each other are shown below. Amino acid residues contained in the same group can be substituted for each other.
  • Group A leucine, isoleucine, norleucine, valine, norvaline, alanine, 2-aminobutanoic acid, methionine, o-methylserine, t-butylglycine, t-butylalanine, cyclohexylalanine;
  • Group B aspartic acid, glutamic acid, isoaspartic acid, isoglutamic acid, 2-aminoadipic acid, 2-aminosuberic acid;
  • Group C asparagine, glutamine;
  • Group D lysine, arginine, ornithine, 2,4-diaminobutanoic acid, 2,3-diaminopropionic acid;
  • Group E proline, 3-hydroxyproline, 4-hydroxyproline;
  • Group F serine, threonine, homoserine;
  • Group G phenylalanine, tyrosine.
  • the protein of the present invention can be obtained by, for example, expressing a polynucleotide encoding the same (see “polynucleotide of the present invention” described later) in an appropriate host cell.
  • the Fmoc method fluorenylmethyl
  • the Fmoc method can also be produced by chemical synthesis methods such as the oxycarbonyl method) and the tBoc method (t-butyloxycarbonyl method).
  • AAPPPec LLC Perkin Elmer Inc. Manufactured by Protein Technologies Inc. Chemical synthesis can also be carried out using a peptide synthesizer such as manufactured by PerSeptive Biosystems, Applied Biosystems, or SHIMADZU CORPORATION.
  • sesaminol glycoside is a glycoside in which a sugar is bound to sesaminol.
  • sesaminol and sesaminol glycosides are represented by the following general formula (I). Sesaminol 2′-position is shown in the formula.
  • the “branched trisaccharide” refers to those constituting a trisaccharide among those added to the R 1 moiety in the following general formula (I).
  • sesaminol glycosides include, but are not limited to, SMG, SDG (1, 2), SDG (1, 6), and STG.
  • the enzyme of the present invention uses a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and / or a protein consisting of a variant thereof.
  • sesaminol glycosides can be utilized as a substrate.
  • examples of the sesaminol glycoside are as described above.
  • the reaction conditions can be adjusted by adjusting the amount of enzyme added to the reaction, adding an organic solvent to the reaction solution, or adjusting the reaction temperature.
  • SGS which is the most abundant sesaminol glycoside in sesame oil pomace, is used as a substrate to produce rare sesaminol glycosides such as SDG (1,2) and SDG (1,6). Is also possible.
  • the enzyme amount, substrate / enzyme ratio, temperature, pH, presence / absence of solvent, reaction time, etc. of the reaction using sesaminol glycoside as a substrate can be adjusted as appropriate by those skilled in the art. It is possible to control the degree of degradation to what extent the sugar bound to the glucoside is cut.
  • At least one glucoside bond of sesaminol glycoside is hydrolyzed.
  • the enzyme of the present invention When the enzyme of the present invention is used, sesaminol glycoside and / or sesaminol are produced.
  • the enzyme of the present invention can preferentially cleave a specific bond in a sesaminol glycoside molecule, and thus, for example, SDG (1, 2) can be obtained.
  • “preferentially cleaving a specific bond in a sesaminol glycoside molecule” is to selectively hydrolyze a specific glucoside bond of a sesaminol glycoside.
  • SDG (1,2) when STG is used as a substrate, SDG (1,2) is produced in which the ⁇ -1,6 bond of the branched trisaccharide bonded to the Sesaminol 2 ′ position of STG is preferentially hydrolyzed.
  • the “specific bond in the sesaminol glycoside molecule” include a ⁇ -1,6 bond of a branched trisaccharide bonded to the 2 ′ position of sesaminol.
  • sesaminol glycoside as a starting material is obtained from sesame seeds or sesame oil squeezed rice cake with an appropriate solvent (aqueous solvent such as water or alcohol, ether and Extraction with an organic solvent such as acetone), ethyl acetate and other organic solvents: water gradient, high performance liquid chromatography (HPLC), ultra high performance liquid chromatography (Ultra (High) Liquid chromatography LC: LC) It can be obtained by extracting and purifying by a known method such as). Alternatively, commercially available sesaminol glycosides may be used.
  • an appropriate solvent aqueous solvent such as water or alcohol, ether and Extraction with an organic solvent such as acetone
  • ethyl acetate and other organic solvents water gradient, high performance liquid chromatography (HPLC), ultra high performance liquid chromatography (Ultra (High) Liquid chromatography LC: LC
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • the method for producing sesaminol and / or sesaminol glycoside according to the present invention reacts the protein of the present invention with sesaminol glycoside to hydrolyze at least one glucoside bond of sesaminol glycoside.
  • the method of the present invention may further comprise a step of purifying the sesaminol and / or sesaminol glycoside of the present invention produced in the above step.
  • the sesaminol and / or sesaminol glycoside of the present invention is extracted with an appropriate solvent (an aqueous solvent such as water, or an organic solvent such as alcohol, ether, or acetone), ethyl acetate or other organic solvent: water gradient.
  • an appropriate solvent an aqueous solvent such as water, or an organic solvent such as alcohol, ether, or acetone
  • ethyl acetate or other organic solvent water gradient.
  • it can be purified by a known method such as high performance liquid chromatography (High Performance Liquid Chromatography
  • the method for producing sesaminol glycoside and / or sesaminol according to the present invention can be carried out under a condition in which an organic solvent is added to a reaction solution containing a substrate.
  • the organic solvent can be in the range of 1% to 20% with respect to the total amount of the reaction solution, preferably 5% to 15%, 6 to 12%, more preferably 8%.
  • the organic solvent may be generally available, preferably mixed with water in an arbitrary ratio, and acetonitrile or the like can be used.
  • the organic solvent may be added in advance to the reaction solution, or may be added in the middle of the reaction.
  • polynucleotide means DNA or RNA.
  • Examples of the polynucleotide encoding the protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 include a polynucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 consists of an amino acid sequence in which 1 to 83 amino acids are deleted, substituted, inserted, and / or added, and hydrolyzes at least one glucoside bond of sesaminol glycoside.
  • Examples of the “protein having activity” include those described above.
  • a protein having an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with respect to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having an activity of hydrolyzing at least one glucoside bond of sesaminol glycoside The above are mentioned.
  • a polynucleotide that hybridizes under highly stringent conditions encodes a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • high stringent conditions means, for example, 5 ⁇ SSC, 5 ⁇ Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 50 ° C., or 0.2 ⁇ SSC, 0.1% SDS, The conditions are 60 ° C., 0.2 ⁇ SSC, 0.1% SDS, 62 ° C., or 0.2 ⁇ SSC, 0.1% SDS, 65 ° C., but are not limited thereto. Under these conditions, it can be expected that DNA having high sequence identity can be efficiently obtained as the temperature is increased.
  • factors affecting the stringency of hybridization include multiple factors such as temperature, probe concentration, probe length, ionic strength, time, and salt concentration, and those skilled in the art can select these factors as appropriate. By doing so, it is possible to achieve the same stringency.
  • Alkphos Direct Labeling and Detection System (GE Healthcare) can be used, for example.
  • the membrane was subjected to a primary wash containing 0.1% (w / v) SDS at 55-60 ° C. After washing with a buffer, the hybridized DNA can be detected.
  • a probe based on a base sequence complementary to the base sequence of SEQ ID NO: 1 or a base sequence complementary to the base sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 commercially available
  • DIG digoxigenin
  • a reagent for example, PCR labeling mix (Roche Diagnostics)
  • hybridization is performed using a DIG nucleic acid detection kit (Roche Diagnostics). Can be detected.
  • hybridizable polynucleotide encodes the DNA of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, when calculated by the BLAST homology search software using the default parameters.
  • sequence identity of amino acid sequences and nucleotide sequences is determined by the algorithm BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) by Carlin and Arthur (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264-2268, 1990; Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993).
  • BLAST Basic Local Alignment Search Tool
  • Carlin and Arthur Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264-2268, 1990; Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993.
  • BLAST Basic Local Alignment Search Tool
  • the above-described polynucleotide of the present invention can be obtained by a known genetic engineering technique or a known synthesis technique.
  • the polynucleotide of the present invention may further include a polynucleotide consisting of a base sequence encoding a secretory signal peptide.
  • a polynucleotide consisting of a base sequence encoding a secretory signal peptide is included at the 5 'end of the polynucleotide of the present invention.
  • the polynucleotide from the secretory signal peptide and the base sequence encoding it is the same as described above.
  • the polynucleotide of the present invention is preferably introduced into a host while being inserted into an appropriate expression vector.
  • Suitable expression vectors are usually (I) a promoter capable of transcription in a host cell; (Ii) a polynucleotide of the present invention linked to the promoter; and (iii) an expression cassette comprising, as a component, a signal that functions in a host cell for transcription termination and polyadenylation of an RNA molecule. .
  • the method for producing the expression vector includes, but is not limited to, a method using a plasmid, phage, cosmid or the like.
  • the specific type of the vector is not particularly limited, and a vector that can be expressed in the host cell can be appropriately selected. That is, according to the type of the host cell, a promoter sequence is appropriately selected in order to reliably express the polynucleotide of the present invention, and a vector in which this and the polynucleotide of the present invention are incorporated into various plasmids or the like is used as an expression vector. Good.
  • the expression vector of the present invention contains an expression control region (for example, a promoter, a terminator and / or a replication origin) depending on the type of host to be introduced.
  • an expression control region for example, a promoter, a terminator and / or a replication origin
  • Conventional promoters eg, trc promoter, tac promoter, lac promoter, etc.
  • yeast promoters include glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase promoter, PH05 promoter, etc.
  • Examples of the promoter for filamentous fungi include amylase and trpC.
  • promoters for expressing a target gene in plant cells include the cauliflower mosaic virus 35S RNA promoter, the rd29A gene promoter, the rbcS promoter, and the enhancer sequence of the cauliflower mosaic virus 35S RNA promoter derived from Agrobacterium. And the mac-1 promoter added to the 5 'side of the mannopine synthase promoter sequence.
  • animal cell host promoters include viral promoters (eg, SV40 early promoter, SV40 late promoter, etc.).
  • MMTV mouse mammary tumor virus
  • the expression vector preferably contains at least one selectable marker.
  • markers include auxotrophic markers (ura5, niaD), drug resistance markers (hygromycin, zeocin), geneticin resistance gene (G418r), copper resistance gene (CUP1) (Marin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 81, p. 337, ⁇ ⁇ 1984), cerulenin resistance gene (fas2m, PDR4) (respectively, Koshiwa ⁇ ⁇ et al., Biochemistry, vol. 64, p. 660, 1992; Hussain et al. , Gene, vol. 101, p. 149, 1991) can be used.
  • the production method (production method) of the transformant of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include a method of transforming by introducing an expression vector containing the polynucleotide of the present invention into a host.
  • cells or organisms to be transformed various conventionally known cells or organisms can be suitably used.
  • cells to be transformed include bacteria such as Escherichia coli, yeast (budding yeast Saccharomyces cerevisiae, fission yeast Schizosaccharomyces pombe), filamentous fungi (gonococcus Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae), plant cells, and humans. Excluding animal cells and the like.
  • the organism to be transformed is not particularly limited, and examples thereof include various microorganisms exemplified in the host cell, animals other than plants or animals.
  • the transformant is preferably a filamentous fungus, a yeast or a plant.
  • a host used for transformation one that produces any of sesaminol glycosides can be used.
  • Genes necessary for the production of at least one sesaminol glycoside not only in plants that originally produce at least one sesaminol glycoside, such as sesame, but also in cells or organisms that do not naturally produce sesaminol glycosides Those introduced with can be used as a host. Examples of the “gene necessary for production of sesaminol glycoside” include genes having sesaminol glycoside synthesis activity described in JP-A-2006-129728.
  • a host cell transformation method As a host cell transformation method, a commonly known method can be used. For example, electroporation method (Mackenxie, D. A. et al., Appl. Environ. Microbiol., Vol. 66, p. 4655-4661, ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ 2000), particle delivery method (JP 2005-287403 “Lipid-producing bacteria” ), Spheroplast method (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.75, p. 1929, 1978), lithium acetate method (J. Bacteriology, vol. 153, p. 163, 1983), Methods inyeast genetics, 2000 Edition: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual)), but is not limited thereto.
  • electroporation method Mackenxie, D. A. et al., Appl. Environ. Microbiol., Vol. 66, p. 4655-4661, ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ 2000
  • particle delivery method JP
  • sesaminol glycoside and / or sesaminol of the present invention using an enzyme agent derived from a non-human transformed cell
  • the protein of the present invention is expressed in a host cell, and the cell is disrupted. Protein can be obtained.
  • the sesaminol glycoside and / or sesaminol of the present invention can also be produced.
  • sesaminol can be produced by contacting an enzyme agent derived from the transformed cell of the present invention with a sesaminol glycoside having at least one glucoside bond. It has been confirmed in the Examples that the protein of the present invention shows the same activity when expressed in yeast as when expressed in Aspergillus.
  • Enzyme agent derived from transformed cells is not limited as long as it is prepared using transformed cells and contains the protein of the present invention.
  • transformed cells themselves pulverized products of transformed cells themselves, The culture supernatant of the transformed cell itself, and purified products thereof.
  • the present invention provides an enzyme agent derived from a non-human transformed cell into which a polynucleotide selected from the group consisting of the following (a) to (e) is introduced into a host cell, and at least one glucoside bond:
  • a method for producing sesaminol and / or sesaminol glycoside which comprises a step of hydrolyzing at least one glucoside bond by contacting with sesaminol glycoside having the formula: (A) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1; (B) a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; (C)
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 consists of an amino acid sequence in which 1 to 83 amino acids are deleted, substituted, inserted, and / or added, and hydrolyzes at least one glucoside bond of sesaminol glycoside.
  • a polynucleotide encoding a protein having an activity of degrading (D) a protein protein having an amino acid sequence having a sequence identity of 90% or more with respect to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having an activity to hydrolyze at least one glucoside bond of sesaminol glycoside The encoding polynucleotide; (E) a polynucleotide that hybridizes under high stringency conditions with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, and at least one of sesaminol glycosides Polynucleotide encoding protein having activity of hydrolyzing glucoside bond
  • the polynucleotide selected from the group consisting of (a) to (e) above is the polynucleotide of the present invention and is the same as described above.
  • Contact means that an enzyme agent derived from the transformed cell of the present invention and a sesaminol glycoside having at least one glucoside bond are present in the same reaction system or culture system, for example, Adding a sesaminol glycoside having at least one glucoside bond to a container containing an enzyme agent derived from the transformed cell of the present invention; and an enzyme agent derived from the transformed cell of the present invention and at least one glucoside bond. Mixing with the sesaminol glycoside having, and adding the enzyme agent derived from the transformed cell of the present invention to the container containing the sesaminol glycoside having at least one glucoside bond.
  • the yeast or koji mold transformed with the polynucleotide of the present invention expresses more of the protein of the present invention than the wild type.
  • the expressed protein of the present invention reacts with sesaminol glycosides produced in yeast or gonococcus, and sesaminol and / or sesaminol glycosides are preferably contained in the yeast or gonococcal cells or in the culture medium. Is produced in the culture medium.
  • the plant to be transformed in the present invention is the whole plant, plant organ (eg, leaf, petal, stem, root, seed, etc.), plant tissue (eg, epidermis, phloem) , Soft tissue, xylem, vascular bundle, palisade tissue, spongy tissue, etc.) or plant culture cells, or various forms of plant cells (eg, suspension culture cells), protoplasts, leaf sections, callus, etc. Also means.
  • the plant used for the transformation may be any plant belonging to the monocotyledonous plant class or the dicotyledonous plant class.
  • Whether or not the polynucleotide of the present invention has been introduced into a plant can be confirmed by PCR, Southern hybridization, Northern hybridization, or the like.
  • offspring can be obtained by sexual or asexual reproduction of the plant.
  • seeds, fruits, cuttings, tubers, tuberous roots, strains, callus, protoplasts, and the like can be obtained from the plant or its progeny, or clones thereof, and the plant can be mass-produced based on them. it can.
  • plant of the present invention contains more of the protein of the present invention than its wild type. For this reason, the protein of the present invention reacts with the sesaminol glycoside produced in the plant of the present invention to produce sesaminol in the plant.
  • the hydrolysis reaction of the glucoside bond of the sesaminol glycoside is suppressed, and the sesaminol glycoside in which the glucoside bond is maintained without being broken. Sesaminol glycosides in which only a part of the glucoside bond is cleaved are generated.
  • the transformant or the culture solution thereof has a high content of the sesaminol and / or sesaminol glycoside of the present invention compared to the wild type, and the extract or the culture solution includes The sesaminol and / or sesaminol glycoside of the present invention is contained in a high concentration.
  • the extract of the transformant of the present invention can be obtained by crushing the transformant using glass beads, a homogenizer, a sonicator or the like, centrifuging the crushed material, and collecting the supernatant. it can.
  • the transformant, the culture supernatant, and the culture supernatant are collected by a usual method (for example, centrifugation, filtration, etc.) after completion of the culture. Can be obtained to obtain a culture supernatant containing the sesaminol and / or sesaminol glycoside of the present invention.
  • the thus obtained extract or culture supernatant may be further subjected to a purification step.
  • Purification of sesaminol and / or sesaminol glycosides of the present invention can be performed according to ordinary separation and purification methods. The specific method is the same as described above.
  • “Sesaminol glycoside”, “sesaminol glycoside having at least one glucoside bond”, and “activity for hydrolyzing at least one glucoside bond” are the same as described above.
  • sesaminol and / or sesaminol glycoside of the present invention are produced according to conventional methods, for example, for foods, sweeteners, fragrances, pharmaceuticals, industrial raw materials (raw materials such as cosmetics and soaps). It can be used for such applications.
  • foods examples include foods for specific health use, functional nutritional foods, functional labeling foods, dietary supplements, health foods, functional foods, infant foods, foods for the elderly, and the like.
  • food is a general term for solids, fluids, liquids, and mixtures thereof that can be consumed.
  • Example 1 Search for ⁇ -glucosidase gene of Aspergillus by searching for ⁇ -glucosidase homologue from Aspergillus genome data (PRJNA28175), AO090701000244 (CDS sequence: SEQ ID NO: 1, deduced amino acid sequence: SEQ ID NO: 2, The ORF sequence: SEQ ID NO: 3, and the genomic DNA sequence: SEQ ID NO: 4) were found. We decided to clone this as AOBGL11. The cDNA sequence and amino acid sequence of AOBGL11 are shown in FIG.
  • AOBGL11-F 5'-ATGCCTCGTCTAGACGTCGAGAA-3 '(SEQ ID NO: 4)
  • AOBGL11-R 5'-TCACAGACCCAACCAGTAGCGA-3 '(SEQ ID NO: 5) Conidia of Aspergillus oryzae var.
  • Brunneus (IFO30102) were added to a liquid medium (1 g, glucose 20 g, bactotryptone 1 g, yeast extract 5 g, NaNO 3 1 g, K 2 HPO 4 0.5 g, MgSO 4 ⁇ 7H 2 O 0 0.5 g, FeSO 4 ⁇ 7H 2 O 0.01 g) was inoculated into 10 ml, and cultured at 30 ° C. for 1 day. Bacteria were collected by filtration, ground in liquid nitrogen, and then genomic DNA was prepared using DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN). PCR was performed with KOD-plus (Toyobo) using genomic DNA as a template and primers AOBGL11-F and AOBGL11-R. The obtained DNA fragment of about 2.57 kbp was cloned using Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit (Invitrogen) to obtain plasmid pCR-AOBGL11g.
  • a liquid medium (1 g, glucose 20 g,
  • Example 2 Production of AOBGL11p by Aspergillus Construction of a vector for expressing Aspergillus oryzae DNA fragment obtained by digestion of Aspergillus oryzae vector pUNA (Liquor Research Institute) with restriction enzyme SmaI and plasmid pCR-AOBGL11g with restriction enzyme EcoRI and blunting ends
  • the DNA fragment of about 2.57 kbp obtained by blunting with Kit (Takara Bio) was ligated to obtain 11 g of plasmid pUNA-AOBGL.
  • Koji molds were transformed as follows. As a host, Aspergillus oryzae niaD300 strain (Liquor Research Institute) was used. Host strains were inoculated on PDA plates and cultured at 30 ° C. for approximately 1 week. To obtain a conidial suspension, 0.1% tween 80, 0.8% NaCl was added to suspend the conidia. After filtration through Miracloth, conidia are collected by centrifugation, further washed with 0.1% tween 80, 0.8% NaCl, and suspended in sterilized water.
  • BR> B conidia are collected on a CD plate (per liter, NaNO 3 6 g, KCl 0.52 g, KH 2 PO 4 1.52 g, glucose 10 g, 1M MgSO 4 2 ml, Trace element solution (1 g of FeSO 4 ⁇ 7H 2 O, 1 g of ZnSO 4 ⁇ 7H 2 O 8.8 g, CuSO 4 ⁇ 5H 2 O 0.4g, NaB 4 O 7 ⁇ 10H 2 O 0.1g, the (NH 4) 6 Mo 7 O 24 ⁇ 4H 2 O 0.05g) 1ml, agar 20 g (pH 6.5)) After applying, DNA was introduced by a particle delivery method.
  • a liquid medium for enzyme production (100 g of maltose, 1 g of bactotryptone, 5 g of yeast extract, 1 g of NaNO 3 , 0.5 g of K 2 HPO 4, 0.5 g of MgSO 4 .7H 2 O, FeSO 4 7H 2 O (0.01 g) was inoculated and cultured with shaking at 30 ° C. for 2 days. The cells were collected by filtration through Miracloth (registered trademark). About 0.4 g of the obtained wet cells were frozen with liquid nitrogen and ground in a mortar. The ground cells were suspended in 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0), mixed well, and then centrifuged.
  • the obtained supernatant is concentrated by ultrafiltration with Amicon (registered trademark) Ultra-15 50k (Merck) and replaced with 50 mM sodium phosphate buffer pH 7.0 (buffer A) containing 0.1% CHAPS. As a result, about 1 ml of a crude enzyme solution was obtained.
  • Amicon registered trademark
  • Ultra-15 50k Merck
  • buffer A 50 mM sodium phosphate buffer pH 7.0
  • the protein concentration of the crude enzyme solution was quantified using a protein assay CBB solution (concentrated 5 times) (Nacalai Tesque). As a result, the BGL11-1 crude enzyme solution was 6.46 mg / ml and the C-1 crude enzyme solution was 4 mg / ml.
  • Example 3 pNP- ⁇ -Glc degradation activity The degradation activity of pNP- ⁇ -Glc was examined. 10 ⁇ L of the crude enzyme solution, 50 ⁇ L of 0.2 M sodium phosphate buffer (pH 7.0), 50 ⁇ L of 20 mM pNP- ⁇ -Glc aqueous solution and water were added to make a total of 200 ⁇ L, followed by reaction at 37 ° C. Since the BGL11-1 crude enzyme solution had high activity, the crude enzyme solution diluted 100-fold with 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.1% CHAPS was used.
  • the optimal temperature, optimal pH, thermal stability, and pH stability of AOBGL11p were examined (FIG. 2 (FIGS. 2A to 2D)).
  • the BGL11-1 crude enzyme solution was diluted 5000 times with buffer A (protein concentration 1.3 ⁇ g / ml).
  • the reaction solution is 20 ⁇ l of crude enzyme solution (1.3 ⁇ g / ml), 100 ⁇ l of 0.2 M sodium phosphate buffer (pH 6.5), 20 mM pNP- ⁇ -Glc, and water are added to make a total of 400 ⁇ l.
  • 100 ⁇ l was sampled and mixed with 100 ⁇ l 0.2 M sodium carbonate solution, and then the absorbance at 405 nm was measured to obtain ⁇ 405.
  • FIG. 2A shows the ratio of ⁇ 405 when the reaction is performed at each temperature with 45 ° C. at which ⁇ 405 is maximized as 1. As a result, it was found that 45-50 ° C. was the optimum temperature for the reaction.
  • Optimal pH The reaction solution was adjusted to a total of 400 ⁇ l by adding 20 ⁇ l of crude enzyme solution (1.3 ⁇ g / ml), 100 ⁇ l of 0.2 M buffer, 20 mM pNP- ⁇ -Glc, and water.
  • As the buffer sodium acetate buffer was used at pH 4.0-6.0, and sodium phosphate buffer was used at pH 6.0-8.0. Sampling and measurement were performed in the same manner as described above, and the ratio of ⁇ 405 when reacted at each pH with respect to the maximum value of ⁇ 405 is shown in FIG. 2B. As a result, it was found that pH 6.0-7.0 was the optimum reaction pH.
  • the crude enzyme solution (1.3 ⁇ g / ml) diluted 5000 times was kept at 30 ° C., 37 ° C., 45 ° C., and 50 ° C. for 10 minutes, and then cooled on ice.
  • the reaction solution was 5 ⁇ l of crude enzyme solution (1.3 ⁇ g / ml), 100 ⁇ l of 0.2 M sodium phosphate buffer (pH 6.5), 20 mM pNP- ⁇ -Glc, and water to make a total of 100 ⁇ l, at 37 ° C. for 45 minutes. After the reaction, 100 ⁇ l of 0.2M sodium carbonate solution was added, and the absorbance at 405 nm was measured.
  • AOBGL11p was stable up to 37 ° C. when treated for 10 minutes, but was deactivated to about half when treated at 45 ° C., and the activity was almost lost when treated at 50 ° C.
  • pH stability The crude enzyme solution was adjusted to pH 4.5, 5.0, 5.5, 6.0 (0.2 M acetate buffer), pH 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8. The sample was diluted 5000 times with each buffer of 0 (0.2 M sodium phosphate buffer), kept at 37 ° C. for 1 hour, and then ice-cooled.
  • the reaction solution was 5 ⁇ l of crude enzyme solution (1.3 ⁇ g / ml), 100 ⁇ l of 0.2 M sodium phosphate buffer (pH 6.5), 20 mM pNP- ⁇ -Glc, and water to make a total of 100 ⁇ l, at 37 ° C. for 45 minutes.
  • Example 4 Cloning of AOBGL11 cDNA The BGL11-1 strain was cultured in 10 ml of enzyme production medium, and the cells were collected by filtration. The cells were frozen with liquid nitrogen, ground in a mortar, and then total RNA was extracted with RNeasy (QIAGEN). CDNA was synthesized by SuperScript Double-Stranded cDNA Synthesis Kit (Life Technologies). Using this as a template, PCR was performed with KOD-plus (Toyobo) using primers AOBGL11-F and AOBGL11-R.
  • the obtained DNA fragment of about 2.52 kbp was cloned by using Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit (Invitrogen) to obtain the cDNA of AOBGL11 to obtain plasmid pCR-AOBGL11 cDNA.
  • the nucleotide sequence was confirmed, it was as shown in SEQ ID NO: 1, and the deduced amino acid sequence was as shown in SEQ ID NO: 2.
  • FIG. 3 shows a comparison between the genomic DNA sequence of AOBGL11 and the cDNA sequence.
  • Example 5 Production of AOBGL11p in Yeast Construction of Yeast Expression Vector and Transformation of Yeast About 2.52 kbp of DNA fragment obtained by digesting plasmid pCR-AOBGL11 cDNA with EcoRI was transformed into yeast expression vector pYE22m (Biosci. Biotech. Biochem , 59, 1221-1228, 1995), and the one in which AOBGL11 was inserted in the direction of expression from the GAPDH promoter of the vector pYE22m was selected and designated pYE-AOBGL3c.
  • the EH13-15 strain (trp1, MAT ⁇ ) of S. cerevisiae Appl. Microbiol.
  • Biotechnol., 30, 515-520, 1989 was used as a parent strain for transformation.
  • EH13-15 strain was transformed by lithium acetate method using plasmids pYE22m (control) and pYE-AOBGL11 (for AOBGL11 expression), respectively.
  • the transformed strain was SC-Trp (per 1 L, yeast nitrogen base w / o amino acids (DIFCO) 6.7 g, glucose 20 g, and amino acid powder (adenine sulfate 1.25 g, arginine 0.6 g, aspartic acid 3 g, Glutamic acid 3 g, histidine 0.6 g, leucine 1.8 g, lysine 0.9 g, methionine 0.6 g, phenylalanine 1.5 g, serine 11.25 g, tyrosine 0.9 g, valine 4.5 g, threonine 6 g, uracil 0.6 g 1) containing 1.3 g) and those growing on an agar medium (2% agar) were selected.
  • SC-Trp per 1 L, yeast nitrogen base w / o amino acids (DIFCO) 6.7 g, glucose 20 g, and amino acid powder (adenine sulfate 1.25 g, arginine
  • the strain obtained by transformation with plasmid pYE22m was designated as CY strain, and the strain obtained by transformation with plasmid pYE-AOBGL11 was designated as AOBGL11-Y strain.
  • the selected CY strain and AOBGL11-Y strain were inoculated with 1 platinum ear in 10 mL of SC-Trp liquid medium supplemented with 1/10 volume of 1M potassium phosphate buffer, and cultured with shaking at 30 ° C. and 125 rpm for 2 days. .
  • the obtained culture was separated into a culture supernatant and cells by centrifugation.
  • the culture supernatant was concentrated to ultrafiltration with Amicon (registered trademark) Ultra-15 50k (Merck), buffer-substituted with 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.1% CHAPS, and about 1 ml of culture. A supernatant concentrate was obtained.
  • Amicon registered trademark
  • Ultra-15 50k Merck
  • 50 mM sodium phosphate buffer pH 7.0
  • the cells are suspended in 1 ml of 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0) and 0.1% CHAPS solution. The cells are crushed with glass beads, and the supernatant obtained by centrifugation is crushed. Liquid. Take 20 ⁇ l of the culture supernatant concentrate or cell disruption solution, add 1 ⁇ l of 2% X- ⁇ -Glc / DMF solution and react at room temperature for 5 minutes. Only the cell disruption solution derived from AOBGL11-Y strain is blue. And was suggested to have X- ⁇ -Glc activity.
  • the absorbance change at 405 nm per minute ( ⁇ 405) based on p-nitrophenol (pNP) released by hydrolysis of pNP- ⁇ -Glc was 0.068 in the AOBGL11-Y crude enzyme solution, and CY crude enzyme.
  • the liquid was 0.000.
  • AOBGL11p Sesaminol Glycoside Hydrolysis Activity Sesaminol triglucoside (STG) was used as a substrate. STG was made into 50 ⁇ g / mL, 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0), the above BGL11-1 crude enzyme solution or 20 ⁇ L of the diluted solution to a total volume of 100 ⁇ L, and reacted at 37 ° C. for 1 hour. As a control, the above C-1 crude enzyme solution was reacted in the same manner. The reaction solution was treated at 100 ° C. for 3 minutes to stop the reaction, filtered through a Cosmo spin filter H (Nacalai Tesque), and then subjected to HPLC.
  • STG was made into 50 ⁇ g / mL, 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0), the above BGL11-1 crude enzyme solution or 20 ⁇ L of the diluted solution to a total volume of 100 ⁇ L, and reacted at 37 ° C. for 1
  • AOBGL11p is ⁇ -1,2 compared to ⁇ -1,2 bonds in the branched sugar chain of STG. It was suggested that it acts well on 6-bonds. From the above results, it is shown that AOBGL11p has a mode in which ⁇ -1,6 bonds are hydrolyzed in preference to ⁇ -1,2 bonds and finally hydrolyzed to sesaminol, which is an aglycone. It was done. It was also shown that the progress of hydrolysis of sesaminol glycosides can be controlled by adjusting the concentration of the enzyme solution. The result of the reaction between the C-1 crude enzyme solution and STG is shown in FIG. 4C, and this result shows that the C-1 crude enzyme solution does not advance the hydrolysis of STG.
  • the present invention provides a method for producing sesaminol and / or sesaminol glycoside by hydrolyzing sesaminol triglucoside using AOBGL11p, which is a glucoside hydrolase derived from Aspergillus oryzae.

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Abstract

セサミノール配糖体およびセサミノールの新たな製造方法が求められていた。　本発明は、セサミノール配糖体の少なくとも１つのグルコシド結合を切断する工程を含む、セサミノール配糖体および／またはセサミノールの製造方法を提供する。

Description

セサミノールまたはセサミノール配糖体の生産方法
　本発明は、セサミノールまたはセサミノール配糖体の生産方法に関する。
　ゴマ（Sesamum indicum）は、ゴマ科ゴマ属の一年性植物である。ゴマは約６０００年の歴史を有する最古の栽培油糧植物とされ、世界中で栽培されてきた。ゴマは、古来から貴重な食品であり、健康に良い食品として知られている。特に、ゴマの種子、ゴマの種子から得られる油、ゴマの種子の抽出物が利用されている。ゴマの種子に含まれる成分は、その約５０％が脂質であり、その主要成分は、オレイン酸およびリノール酸を主体とするトリグリセリドである。このほかに、ゴマの種子における特徴的な成分としてゴマリグナンが含まれている。
　リグナンは、植物の二次代謝物で、Ｃ６Ｃ３骨格を有するフェニルプロパノイド化合物２分子が、主としてこれらの８－８´位を介して重合（８，８´-結合）した化合物である。リグナンは植物における生体防御機構に寄与していると考えられている。ゴマに含まれるリグナンはゴマリグナンとよばれ、セサミン、セサミノール、セサモリン、ピノレジノール、およびセサモリノールがある（非特許文献１）。ゴマリグナンの１つであるセサミンは、多彩な生理活性を有しており、ゴマ種子またはゴマ種子の搾り粕から分離精製する方法がすでに実用化されている。
　ゴマリグナンのうちのいくつかは配糖体として植物中に存在することが知られている。ゴマリグナンの中でもセサミノールは高い抗酸化活性を持つ。セサミノールはゴマ種子中にセサミノール配糖体として存在し、セサミノール配糖体には、セサミノール２´-Ｏ-β-Ｄ-グルコピラノシド（セサミノールモノグルコシド、ＳＭＧ）、セサミノール２´-Ｏ-β-Ｄ-グルコピラノシル（１-２）-Ｏ-β-Ｄ-グルコピラノシド（セサミノール（１－２）ジグルコシド、ＳＤＧ（１，２））、セサミノール２´-Ｏ-β-Ｄ-グルコピラノシル（１-６）-Ｏ-β-Ｄ-グルコピラノシド（セサミノール（１－６）ジグルコシド、ＳＤＧ（１，６））、およびセサミノール２´-Ｏ-β-Ｄ-グルコピラノシル（１-２）-Ｏ-（-β-Ｄ-グルコピラノシル（１-２））β-Ｄ-グルコピラノシド（セサミノールトリグルコシド、ＳＴＧ）などがある。
　セサミノールは、また、ゴマ油の精製工程で、セサモリンから酸触媒反応によっても生成する。セサミノールには強い抗酸化活性があり、健康に好ましい生理活性が報告されている（非特許文献２）。セサミノールの生理活性は、糖部分が除去されたアグリコンで発揮される。
　また、ゴマ油製造の際に生じるゴマ搾り粕には、セサミノール配糖体が含まれるが、有効活用されていない。セサミノール配糖体を加水分解し、アグリコンであるセサミノールを得ることができれば、安価なゴマ搾り粕を原料としてセサミノールを生産することが可能である。セサミノール配糖体からセサミノールを取得する方法としては、真菌Aspergillus属微生物を用いる方法（特許文献１）や、バチルス属およびエンテロコッカス属菌の混合培養物を用いた発酵法（特許文献２）が開発されている。しかしながら、これらの方法ではセサミノール配糖体を完全に分解するためには長時間を要するなど、効率が低い。その他に、セサミノール配糖体からセサミノールを取得する方法として、Paenibacillus 属に属する細菌KB0549株由来のβ-グルコシダーゼを用いる方法が開示されている（特許文献３、非特許文献３）。この酵素は、セサミノール配糖体のβ－１、２－およびβ－１、６－グルコシド結合およびセサミノール－グルコース間β－グルコシド結合を切断する。ＳＴＧを基質とした場合、β－１、２－グルコシド結合をβ－１、６－グルコシド結合に比べて優先的に加水分解する。
特開２００５－２３１２５ 特開２００６－６１１１５ 特開２００８－１６７７１２
Biochemical Systematics and Ecology 13, 133-139 (1985) J. Agric. Food Chem., 64,4908-4913 (2016) PLOS ONE, 8, e60538 (2013)
　上記のような状況の下、セサミノールおよび／またはセサミノール配糖体の新たな生産方法が求められていた。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、麹菌由来のグリコシドヒドロラーゼであるＡＯＢＧＬ１１ｐが、セサミノールトリグルコシドを加水分解し、セサミノールおよびセサミノール配糖体を生成する活性を有することなどを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、以下の通りである。
（１）　以下の（ａ）～（ｃ）からなる群から選択されるタンパク質と、少なくとも１つのグルコシド結合を有する基質セサミノール配糖体を反応させて、基質セサミノール配糖体の少なくとも１つのグルコシド結合を加水分解する工程を含む、生成セサミノールまたは生成セサミノール配糖体の製造方法。
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において、１～８３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも１つのグルコシド結合を有する基質セサミノール配糖体のグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ少なくとも１つのグルコシド結合を有する基質セサミノール配糖体のグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質
（２）　前記基質セサミノール配糖体が、セサミノール２´-Ｏ-β-Ｄ-グルコピラノシド（セサミノールモノグルコシド、ＳＭＧ）、セサミノール２´-Ｏ-β-Ｄ-グルコピラノシル（１-２）-Ｏ-β-Ｄ-グルコピラノシド（セサミノール（１－２）ジグルコシド、、ＳＤＧ（１，２））、セサミノール２´-Ｏ-β-Ｄ-グルコピラノシル（１-６）-Ｏ-β-Ｄ-グルコピラノシド（セサミノール（１－６）ジグルコシド、ＳＤＧ（１，６））、およびセサミノール２´-Ｏ-β-Ｄ-グルコピラノシル（１-２）-Ｏ-（-β-Ｄ-グルコピラノシル（１-２））β-Ｄ-グルコピラノシド（セサミノールトリグルコシド、ＳＴＧ）からなる群より選択されるいずれか一つである、上記（１）に記載の方法。
（３）　前記基質セサミノール配糖体がセサミノールトリグルコシド（ＳＴＧ）である、上記（１）または（２）に記載の方法。
（４）　前記生成セサミノールまたは生成セサミノール配糖体が、ＳＤＧ（１，６）、ＳＤＧ（１，２）およびセサミノールから成る群より選択されるいずれか１つ以上である、上記（１）または（２）に記載の方法。
（５）　前記少なくとも１つのグルコシド結合が、セサミノール２´位に結合したグルコースとアグリコンとの間のグルコシド結合、セサミノール２´位に結合したゲンチオビオースのβ－１，６－グルコシド結合、セサミノール２´位に結合したソホロースのβ－１，２結合、またはセサミノールに２´位に結合した分岐三糖のβ－１，６－グルコシド結合もしくはβ－１，２結合からなる群より選択されるいずれか１つである、上記（１）～（４）のいずれかに記載の方法。
（６）　宿主細胞に、以下の（ａ）～（ｅ）からなる群から選択されるポリヌクレオチドが導入された非ヒト形質転換細胞に由来する酵素剤を、少なくとも１つのグルコシド結合を有する基質セサミノール配糖体と接触させて、基質セサミノール配糖体の少なくとも１つのグルコシド結合を加水分解する工程を含む、生成セサミノールまたは生成セサミノール配糖体の製造方法。
（ａ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列において、１～８３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも１つのグルコシド結合を有する基質セサミノール配糖体のグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ少なくとも１つのグルコシド結合を有する基質セサミノール配糖体のグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつ少なくとも１つのグルコシド結合を有する基質セサミノール配糖体のグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（７）　前記ポリヌクレオチドが、発現ベクターに挿入されたものである、上記（６）に記載の方法。
（８）　前記形質転換細胞が、形質転換植物、形質転換大腸菌、形質転換細菌、形質転換酵母、形質転換糸状菌からなる群から選択される、上記（６）または（７）に記載の方法。
（９）　前記基質セサミノール配糖体が、セサミノール２´-Ｏ-β-Ｄ-グルコピラノシド（セサミノールモノグルコシド、ＳＭＧ）、セサミノール２´-Ｏ-β-Ｄ-グルコピラノシル（１-２）-Ｏ-β-Ｄ-グルコピラノシド（セサミノール（１－２）ジグルコシド、ＳＤＧ（１，２））、セサミノール２´-Ｏ-β-Ｄ-グルコピラノシル（１-６）-Ｏ-β-Ｄ-グルコピラノシド（セサミノール（１－６）ジグルコシド、ＳＤＧ（１，６））、およびセサミノール２´-Ｏ-β-Ｄ-グルコピラノシル（１-２）-Ｏ-（-β-Ｄ-グルコピラノシル（１-２））β-Ｄ-グルコピラノシド（セサミノールトリグルコシド、ＳＴＧ）からなる群より選択されるいずれか一つである、上記（６）～（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）　前記生成セサミノールまたは生成セサミノール配糖体が、ＳＤＧ（１，６）、ＳＤＧ（１，２）およびセサミノールから成る群より選択されるいずれか１つ以上である、上記（６）～（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）　前記少なくとも１つのグルコシド結合が、セサミノール２´位に結合したグルコースとアグリコンとの間のグルコシド結合、セサミノール２´位に結合したゲンチオビオースのβ－１，６－グルコシド結合、セサミノール２´位に結合したソホロースのβ－１，２結合、またはセサミノールに２´位に結合した分岐三糖のβ－１，６－グルコシド結合もしくはβ－１，２結合からなる群より選択されるいずれか１つである、上記（６）～（１０）のいずれかに記載の方法。
（１２）　以下の（ａ）～（ｅ）からなる群から選択されるポリヌクレオチドが導入された非ヒト形質転換体を培養することを含む、生成セサミノールまたは生成セサミノール配糖体の生産方法。
（ａ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列において、１～８３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも１つのグルコシド結合を有する基質セサミノール配糖体のグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ少なくとも１つのグルコシド結合を有する基質セサミノール配糖体のグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつ少なくとも１つのグルコシド結合を有する基質セサミノール配糖体のグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（１３）　前記ポリヌクレオチドが、発現ベクターに挿入されたものである、上記（１０）に記載の方法。
（１４）　前記形質転換体が、形質転換植物、形質転換大腸菌、形質転換細菌、形質転換酵母、形質転換糸状菌からなる群から選択される、上記（１２）または（１３）に記載の方法。
（１５）　前記少なくとも１つのグルコシド結合が、セサミノール２´位に結合したグルコースとアグリコンとの間のグルコシド結合、セサミノール２´位に結合したゲンチオビオースのβ－１，６－グルコシド結合、セサミノール２´位に結合したソホロースのβ－１，２結合、またはセサミノールに２´位に結合した分岐三糖のβ－１，６－グルコシド結合もしくはβ－１，２結合からなる群より選択されるいずれか１つである、上記（１２）～（１４）のいずれかに記載の方法。
　本発明の方法により、セサミノールおよびセサミノール配糖体の新たな製造方法が提供される。
　また、反応条件を選択することで、各種セサミノール配糖体を製造することができる。本願発明の一実施形態では、酵素濃度等の反応条件を選択することで、セサミノールおよび／またはセサミノール配糖体の生成量を増加させることができる。また、本願発明の一実施形態により、ＳＤＧ（１，２）の生成量を選択的に増加させることができる。
ＡＯＢＧＬ１１のｃＤＮＡ配列とアミノ酸配列の図である。 ＡＯＢＧＬ１１のｃＤＮＡ配列とアミノ酸配列の図である。 Ａ：ｐＮＰ－β－Ｇｌｃを基質とした、ＡＯＢＧＬ１１ｐの至適温度。Ｂ：ｐＮＰ－β－Ｇｌｃを基質とした、ＡＯＢＧＬ１１ｐの至適ｐＨ。Ｃ：ｐＮＰ－β－Ｇｌｃを基質とした、ＡＯＢＧＬ１１ｐの熱安定性。Ｄ：ｐＮＰ－β－Ｇｌｃを基質とした、ＡＯＢＧＬ１１ｐのｐＨ安定性の図である。 ＡＯＢＧＬ１１のゲノムＤＮＡ配列とｃＤＮＡ配列の比較の図である。 ＡＯＢＧＬ１１のゲノムＤＮＡ配列とｃＤＮＡ配列の比較の図である。 セサミノールトリグルコシドの加水分解反応の図である。反応時間は１時間とした。Ａ：１０倍希釈したＢＧＬ１１－１粗酵素液、Ｂ：希釈なしのＢＧＬ１１－１粗酵素液、Ｃ：Ｃ－１粗酵素液。
　以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。　　なお、本明細書において引用した全ての文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、２０１６年９月２３日に出願された本願優先権主張の基礎となる日本国特許出願（特願２０１６－１８６０６６号）の明細書及び図面に記載の内容を包含する。
　なお、以下において基質としてのセサミノール配糖体を「基質セサミノール配糖体」と呼び、生成物としてのセサミノール配糖体を「生成セサミノール配糖体」と呼ぶこともある。また、両者を「セサミノール配糖体」と総称することもある。
　「ＡＯＢＧＬ１１ｐ」はグリコシドヒドロラーゼファミリー３（ＧＨ３）のβ-グルコシダーゼであり、そのｃＤＮＡ配列は配列番号１に、アミノ酸配列は配列番号２に、そしてゲノムＤＮＡ配列は配列番号３に示される。
１．セサミノールおよび／またセサミノール配糖体の製造方法
　本発明は、以下の（ａ）～（ｃ）からなる群から選択されるタンパク質（以下、「本発明のタンパク質」という）と、セサミノール配糖体を反応させて、少なくとも１つのグルコシド結合を加水分解する工程を含む、セサミノールおよび／またはセサミノール配糖体の製造方法を提供する。
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において、１～８３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつセサミノール配糖体の少なくとも１つのグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつセサミノール配糖体の少なくとも１つのグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質
　上記（ｂ）または（ｃ）に記載のタンパク質は、代表的には、配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質の変異体であるが、例えば、“Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol.4,Cold Spring Harbor Laboratory Press 2012”、”Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997”、”Nuc. Acids. Res., 10, 6487 (1982)”、“Proc.　Natl.　Acad.　Sci.　USA,　79,　6409　(1982)”、”Gene, 34, 315 (1985)”、”Nuc. Acids. Res., 13, 4431 (1985)”、”Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)”等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、人為的に取得することができるものも含まれる。
　「配列番号２のアミノ酸配列において、１～８３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつセサミノール配糖体の少なくとも１つのグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質」としては、配列番号２のアミノ酸配列において、例えば、１～８３個、１～８０個、１～７５個、１～７０個、１～６５個、１～６０個、１～５５個、１～５０個、１～４９個、１～４８個、１～４７個、１～４６個、１～４５個、１～４４個、１～４３個、１～４２個、１～４１個、１～４０個、１～３９個、１～３８個、１～３７個、１～３６個、１～３５個、１～３４個、１～３３個、１～３２個、１～３１個、１～３０個、１～２９個、１～２８個、１～２７個、１～２６個、１～２５個、１～２４個、１～２３個、１～２２個、１～２１個、１～２０個、１～１９個、１～１８個、１～１７個、１～１６個、１～１５個、１～１４個、１～１３個、１～１２個、１～１１個、１～１０個、１～９個（１～数個）、１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個、１～２個、または１個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつセサミノール配糖体の少なくとも１つのグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質が挙げられる。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の数は、一般的には小さい程好ましい。
　また、このようなタンパク質としては、配列番号２のアミノ酸配列と９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、または９９．９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつセサミノール配糖体の少なくとも１つのグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質が挙げられる。上記配列同一性の数値は一般的に大きい程好ましい。
　ここで、「セサミノール配糖体の少なくとも１つのグルコシド結合」とは、セサミノールに糖が結合した配糖体であるセサミノール配糖体において、アグリコンであるセサミノールと側鎖との間のグルコシド結合、および側鎖内のグルコシド結合を意味する。また、「少なくとも１つのグルコシド結合を有する基質セサミノール配糖体のグルコシド結合を加水分解する活性」とは、セサミノールに糖が結合した配糖体であるセサミノール配糖体において、アグリコンであるセサミノールと側鎖との間のグルコシド結合、および側鎖内のグルコシド結合のうち少なくとも１つを切断（加水分解）する活性を意味する。側鎖内のグルコシド結合の例としては、セサミノール２´位に結合したゲンチオビオースのβ－１，６－グルコシド結合、セサミノール２´位に結合したソホロースのβ－１，２－グルコシド結合、セサミノール２´位に結合した分岐三糖のβ－１，２－グルコシド結合、および／または、セサミノール２´位に結合した分岐三糖のβ－１，６－グルコシド結合が挙げられる。ある実施形態において、すべてのグルコシド結合が加水分解され、セサミノール配糖体からセサミノールを生じる。別の実施形態では、セサミノール２´位に結合した分岐三糖のβ－１，６－グルコシド結合が優先して加水分解される。このようにして、一部の糖のみ切断された生成セサミノール配糖体又はすべての糖が切断されたセサミノールを生じる。
　少なくとも１つのグルコシド結合を有する基質セサミノール配糖体のグルコシド結合を加水分解する活性は、本発明のタンパク質と、たとえばＳＴＧ、ＳＤＧ（１，２）、ＳＤＧ（１，６）、ＳＭＧからなる群より選択される少なくとも１つの基質セサミノール配糖体を反応させて、得られた反応生成物（セサミノールおよび／またはセサミノール配糖体）を精製し、精製したものを液体クロマトグラフィー（Ｌｉｑｕｉｄ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＬＣ）等の公知の手法により分析することで確認することができる。
　一実施形態において、本発明は、セサミノール配糖体のすべてのグルコシド結合を切断する工程を含むセサミノールの製造方法を提供する。別の実施態様では、本発明はセサミノール配糖体の特定の結合、例えば、セサミノール２´位に結合したグルコースとアグリコンとの間のグルコシド結合、セサミノール２´位に結合したゲンチオビオースのβ－１，６－グルコシド結合、セサミノール２´位に結合したソホロースのβ－１，２結合および／または、セサミノールに２´位に結合した分岐三糖のβ－１，６－グルコシド結合またはβ－１，２結合を切断する工程を含む、セサミノールおよび／またはセサミノール配糖体の製造方法を提供する。なお、本発明において、セサミノール２´位に結合した分岐三糖を加水分解する場合は、β－１，２－結合よりもβ－１，６－結合を優先して加水分解する。
　「配列番号２のアミノ酸配列において、１～８３個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加された」とは、同一配列中の任意かつ１～８３個のアミノ酸配列中の位置において、１～８３個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加があることを意味し、欠失、置換、挿入および付加のうち２種以上が同時に生じてもよい。
　以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２－アミノブタン酸、メチオニン、ｏ－メチルセリン、ｔ－ブチルグリシン、ｔ－ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン；
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２－アミノアジピン酸、２－アミノスベリン酸；
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン；
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４－ジアミノブタン酸、２，３－ジアミノプロピオン酸；
Ｅ群：プロリン、３－ヒドロキシプロリン、４－ヒドロキシプロリン；
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン；
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン。
　本発明のタンパク質は、これをコードするポリヌクレオチド（後述する「本発明のポリヌクレオチド」を参照）を適切な宿主細胞内で発現させることなどにより得ることができるが、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ－ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、ＡＡＰＰＴｅｃ　ＬＬＣ製、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｉｎｃ．製、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ．製、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製、ＳＨＩＭＡＤＺＵ　ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ製等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
　本発明において、「セサミノール配糖体」とは、セサミノールに糖が結合した配糖体である。　
　セサミノールおよびセサミノール配糖体の例は、下記一般式（Ｉ）で示される。なお、セサミノール２´位を式中に示した。本発明において、「分岐三糖」とは、下記一般式（Ｉ）においてＲ１の部分に付加されるもののうち三糖を構成するものをいう。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　セサミノール配糖体の例としては、ＳＭＧ、ＳＤＧ（１，２）、ＳＤＧ（１，６）およびＳＴＧ等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
　本発明の一実施形態では本発明の酵素は配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質および／またはその変異体からなるタンパク質を用いる。別の実施形態では、基質としてセサミノール配糖体が利用可能である。ここで、セサミノール配糖体の例は前述のとおりである。本発明の一実施形態では、本発明の酵素を用いて、反応に添加する酵素量を調節したり、反応液中に有機溶媒を添加したり、反応温度を調節したりすることで反応条件を調節することにより、ゴマ油搾り粕にもっとも多く含まれるセサミノール配糖体であるＳＴＧを基質として、ＳＤＧ（１，２）やＳＤＧ（１，６）といった希少なセサミノール配糖体を生成することも可能である。
　本発明において、セサミノール配糖体を基質とした反応の酵素量、基質／酵素比、温度、ｐＨ、溶媒の有無、反応時間等は、当業者が適宜調整でき、これらを調整することによりセサミノール配糖体に結合している糖をどこまで切断するか分解度合を制御することが可能である。
　本発明に係るセサミノールおよび／またはセサミノール配糖体の製造方法によって、セサミノール配糖体の少なくとも１つのグルコシド結合が加水分解される。
　本発明の酵素を使用した場合、セサミノール配糖体および／またはセサミノールが生じる。
　また、本発明の酵素は、セサミノール配糖体分子中の特定の結合を優先的に切断することが可能であり、これにより例えば、ＳＤＧ（１，２）を得ることができる。本願において、「セサミノール配糖体分子中の特定の結合を優先的に切断する」とは、セサミノール配糖体の特定のグルコシド結合を選択的に好んで加水分解することである。例えば、ＳＴＧを基質とした場合は、ＳＴＧのセサミノール２´位に結合した分岐三糖のβ－１，６結合が優先的に加水分解されたＳＤＧ（１，２）が生成する。「セサミノール配糖体分子中の特定の結合」としてはセサミノール２´位に結合した分岐三糖のβ－１，６結合等が挙げられる。
　本発明のセサミノールおよび／またはセサミノール配糖体の製造方法において、出発物質となるセサミノール配糖体は、ゴマ種子あるいはゴマ油搾り粕から適切な溶媒（水等の水性溶媒又はアルコール、エーテル及びアセトン等の有機溶媒）による抽出、酢酸エチルやその他の有機溶媒：水の勾配、高速液体クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　Ｌｉｑｕｉｄ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＨＰＬＣ）、超高性能液体クロマトグラフィー　（Ｕｌｔｒａ　（Ｈｉｇｈ）　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　Ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＵＰＬＣ）　等の公知の方法によって抽出し、精製することによって入手することができる。あるいは、出発物質となるセサミノール配糖体は、市販のものでもよい。本発明の出発物質となるセサミノール配糖体としては、ＳＴＧ、ＳＤＧ（１，２）、ＳＤＧ（１，６）、ＳＭＧ等があげられ、β－１，２－グルコシド結合またはβ－１，６グルコシド結合、および／またはアグリコンであるセサミノールとの間のグルコシド結合の切断により、ＳＤＧ（１，２）、ＳＤＧ（１，６）、ＳＭＧ、セサミノールなどが生じる。
　本発明に係るセサミノールおよび／またはセサミノール配糖体の製造方法は、本発明のタンパク質と、セサミノール配糖体を反応させて、セサミノール配糖体の少なくとも１つのグルコシド結合を加水分解する工程を含む。本発明の方法は、さらに、前記工程で生成した本発明のセサミノールおよび／またはセサミノール配糖体を精製する工程を含んでいてもよい。　本発明のセサミノールおよび／またはセサミノール配糖体は、適切な溶媒（水等の水性溶媒、またはアルコール、エーテル、アセトン等の有機溶媒）による抽出、酢酸エチルやその他の有機溶媒：水の勾配、高速液体クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　Ｌｉｑｕｉｄ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＨＰＬＣ）、超高性能液体クロマトグラフィー（Ｕｌｔｒａ　（Ｈｉｇｈ）　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　Ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＵＰＬＣ）等の公知の方法によって精製することができる。
　本発明に係るセサミノール配糖体および／またはセサミノールの製造方法は、基質を含む反応液に有機溶媒を添加した条件下で行うことができる。有機溶媒は、反応液全量に対し１％～２０％の範囲とすることができ、好ましくは５％～１５％、６～１２％、より好ましくは８％である。有機溶媒は、一般的に入手可能なものでよく、好ましくは水と任意の割合で混合するものがよく、アセトニトリル等を用いることができる。有機溶媒は、反応液に予め添加してもよく、また反応の途中段階で添加してもよい。
　本明細書中、「ポリヌクレオチド」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。
　配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。
　「配列番号２のアミノ酸配列において、１～８３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつセサミノール配糖体の少なくとも１つのグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質」としては、前述のものが挙げられる。
　「配列番号２のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつセサミノール配糖体の少なくとも１つのグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質」としては、前述のものが挙げられる。
　本明細書中、「高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、例えば、配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号２のアミノ酸配列をコードする塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドの全部または一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法またはサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えば、”Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 4, Cold Spring Harbor, Laboratory Press 2012”、”Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997”などに記載されている方法を利用することができる。
　本明細書中、「高ストリンジェントな条件」とは、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃、または０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃、または０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６２℃、または０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃の条件であるが、これに限定されるものではない。これらの条件において、温度を上げるほど高い配列同一性を有するＤＮＡが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度等の複数の要素が考えられ、当業者であればこれらの要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
　なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばＡｌｋｐｈｏｓ　Ｄｉｒｅｃｔ　Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ　ａｎｄ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコルにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを５５～６０℃の条件下で０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含む１次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたＤＮＡを検出することができる。あるいは、配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列、または配列番号２のアミノ酸配列をコードする塩基配列と相補的な塩基配列の全部または一部に基づいてプローブを作製する際に、市販の試薬（例えば、ＰＣＲラベリングミックス（ロシュ・ダイアグノスティクス社）等）を用いて該プローブをジゴキシゲニン（ＤＩＧ）ラベルした場合には、ＤＩＧ核酸検出キット（ロシュ・ダイアグノスティクス社）を用いてハイブリダイゼーションを検出することができる。
　上記以外にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、ＢＬＡＳＴの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメーターを用いて計算したときに、配列番号１の塩基配列のＤＮＡ、または配列番号２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡと６０％以上、６１％以上、６２％以上、６３％以上、６４％以上、６５％以上、６６％以上、６７％以上、６８％以上、６９％以上、７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、または９９．９％以上の配列同一性を有するＤＮＡをあげることができる。
　なお、アミノ酸配列や塩基配列の配列同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ　Ｌｏｃａｌ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　Ｓｅａｒｃｈ　Ｔｏｏｌ）（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264-2268, 1990; Proc Natl Acad Sci USA 90:5873, 1993）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
　上記した本発明のポリヌクレオチドは、公知の遺伝子工学的手法または公知の合成手法によって取得することが可能である。
　本発明のポリヌクレオチドは、さらに、分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドを含んでもよい。好ましくは、分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドの５’末端に含まれる。分泌シグナルペプチドおよびそれをコードする塩基配列からポリヌクレオチドは、前記と同様である。
　本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは、適切な発現ベクターに挿入された状態で宿主に導入される。
　適切な発現ベクターは、通常、
（ｉ）宿主細胞内で転写可能なプロモーター；
（ｉｉ）該プロモーターに結合した、本発明のポリヌクレオチド；および
（ｉｉｉ）ＲＮＡ分子の転写終結およびポリアデニル化に関し、宿主細胞内で機能するシグナルを構成要素として含む発現カセット
　を含むように構成される。
　発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージまたはコスミドなどを用いる方法が挙げられるが特に限定されない。
　ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターが適宜選択され得る。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に本発明のポリヌクレオチドを発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明のポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。
　本発明の発現ベクターは、導入されるべき宿主の種類に依存して、発現制御領域（例えば、プロモーター、ターミネーターおよび／または複製起点等）を含有する。細菌用発現ベクターのプロモーターとしては、慣用的なプロモーター（例えば、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター等）が使用され、酵母用プロモーターとしては、例えば、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、ＰＨ０５プロモーター等が挙げられ、糸状菌用プロモーターとしては、例えば、アミラーゼ、ｔｒｐＣ等が挙げられる。また、植物細胞内で目的遺伝子を発現させるためのプロモーターの例としては、カリフラワーモザイクウィルスの３５Ｓ　ＲＮＡプロモーター、ｒｄ２９Ａ遺伝子プロモーター、ｒｂｃＳプロモーター、前記カリフラワーモザイクウィルスの３５Ｓ　ＲＮＡプロモーターのエンハンサー配列をアグロバクテリウム由来のマンノピン合成酵素プロモーター配列の５’側に付加したｍａｃ－１プロモーター等が挙げられる。動物細胞宿主用プロモーターとしては、ウイルス性プロモーター（例えば、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター等）が挙げられる。外的な刺激によって誘導性に活性化されるプロモーターの例としては、ｍｏｕｓｅ　ｍａｍｍａｒｙ　ｔｕｍｏｒ　ｖｉｒｕｓ（ＭＭＴＶ）プロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター、メタロチオネインプロモーター及びヒートショックプロテインプロモーター等が挙げられる。
　発現ベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを含むことが好ましい。このようなマーカーとしては、栄養要求性マーカー（ｕｒａ５、ｎｉａＤ）、薬剤耐性マーカー（ハイグロマイシン、ゼオシン）、ジェネチシン耐性遺伝子（Ｇ４１８ｒ）、銅耐性遺伝子（ＣＵＰ１）（Marin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 81, p. 337, 1984）、セルレニン耐性遺伝子（ｆａｓ２ｍ，　ＰＤＲ４）（それぞれ、猪腰淳嗣ら，生化学，vol. 64, p. 660, 1992; Hussain et al., Gene, vol. 101, p. 149, 1991）などが利用可能である。
　本発明の形質転換体の作製方法（生産方法）は特に限定されないが、例えば、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを宿主に導入して形質転換する方法が挙げられる。形質転換の対象となる細胞または生物としては、従来公知の各種細胞または生物を好適に用いることができる。形質転換の対象となる細胞としては、例えば、大腸菌（Escherichia coli）等の細菌、酵母（出芽酵母Saccharomyces cerevisiae、分裂酵母Schizosaccharomyces pombe）、糸状菌（麹菌Aspergillus oryzae、Aspergillus sojae）、植物細胞、ヒトを除く動物細胞等が挙げられる。上記の宿主細胞のための適切な培養培地および条件は当分野で周知である。また、形質転換の対象となる生物も、特に限定されるものではなく、上記宿主細胞で例示した各種微生物または植物またはヒトを除く動物が挙げられる。形質転換体は、好ましくは、糸状菌、酵母または植物である。形質転換で用いられる宿主として、セサミノール配糖体のいずれかを生成するものを用いることもできる。ゴマのように、元来少なくとも１つのセサミノール配糖体を生成する植物だけではなく、本来セサミノール配糖体を生成しない細胞または生物に少なくとも１つのセサミノール配糖体の生成に必要な遺伝子を導入したものを宿主として用いることができる。「セサミノール配糖体の生成に必要な遺伝子」は、例えば、特開２００６－１２９７２８などに記載のセサミノール配糖体合成活性を有する遺伝子が挙げられる。
　宿主細胞の形質転換方法としては一般に用いられる公知の方法が利用できる。例えば、エレクトロポレーション法（Mackenxie, D. A. et al., Appl. Environ. Microbiol., vol. 66, p. 4655-4661, 2000）、パーティクルデリバリー法（特開2005-287403「脂質生産菌の育種方法」に記載の方法）、スフェロプラスト法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.75, p. 1929, 1978）、酢酸リチウム法（J. Bacteriology, vol. 153, p. 163, 1983）、Methods in yeast genetics,2000 Edition: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manualなどに記載の方法）で実施可能であるが、これらに限定されない。また、植物、もしくは植物に由来する組織や細胞への遺伝子導入の際には、例えばアグロバクテリウム法（Plant Molecular Biology Mannual, Gelvin, S.B.et al., Academic Press Publishers）、パーティクルガン法、ＰＥＧ法、エレクトロポーレーション法などを適宜選択して用いることができる。
　非ヒト形質転換細胞に由来する酵素剤を用いた本発明のセサミノール配糖体および／またはセサミノールの製造方法
　本発明のタンパク質を宿主細胞内で発現させ、細胞を破砕することにより本発明のタンパク質を得ることができる。本発明のタンパク質を基質セサミノール配糖体と作用させることで、本発明のセサミノール配糖体および／またはセサミノールを生成することもできる。
　具体的には、本発明の形質転換細胞に由来する酵素剤を、グルコシド結合を少なくとも１つを有するセサミノール配糖体と接触させることによりセサミノールを生成することができる。本発明のタンパク質は、酵母で発現させた場合にも麹菌で発現させた場合と同等の活性を示すことが実施例において確認されている。
　「形質転換細胞に由来する酵素剤」は、形質転換細胞を用いて調製され、本発明のタンパク質を含むものであれば限定されないが、例えば、形質転換細胞自体、形質転換細胞の粉砕物自体、形質転換細胞の培養上清自体、およびこれらの精製物である。そこで、本発明は、宿主細胞に、以下の（ａ）～（ｅ）からなる群から選択されるポリヌクレオチドが導入された非ヒト形質転換細胞に由来する酵素剤を、グルコシド結合を少なくとも１つを有するセサミノール配糖体と接触させて、少なくとも１つのグルコシド結合を加水分解する工程を含むセサミノールおよび／またはセサミノール配糖体の製造方法を提供する。（ａ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列において、１～８３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつセサミノール配糖体の少なくとも１つのグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつセサミノール配糖体の少なくとも１つのグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつセサミノール配糖体の少なくとも１つのグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
　上記（ａ）～（ｅ）からなる群から選択されるポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドであり、前記と同様である。
　「接触」とは、本発明の形質転換細胞に由来する酵素剤とグルコシド結合を少なくとも１つを有するセサミノール配糖体とを同一の反応系または培養系に存在させることを意味し、例えば、本発明の形質転換細胞に由来する酵素剤を含む容器に少なくとも１つのグルコシド結合を有するセサミノール配糖体を添加すること、本発明の形質転換細胞に由来する酵素剤と少なくとも１つのグルコシド結合を有するセサミノール配糖体とを混合すること、本発明の形質転換細胞に由来する酵素剤を少なくとも１つのグルコシド結合を有するセサミノール配糖体を含む容器に添加することが含まれる。
　形質転換体が、酵母または麹菌である場合、本発明のポリヌクレオチドで形質転換された酵母または麹菌は、野生型と比べて本発明のタンパク質を多く発現する。このため、発現した本発明のタンパク質が、酵母または麹菌で生成されたセサミノール配糖体と反応し、セサミノールおよび／またはセサミノール配糖体が酵母または麹菌の細胞内または培養液中、好ましくは、培養液中に生成される。
　形質転換体が、植物である場合、本発明において形質転換の対象となる植物は、植物体全体、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子など）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織など）または植物培養細胞、あるいは種々の形態の植物細胞（例えば、懸濁培養細胞）、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどのいずれをも意味する。形質転換に用いられる植物としては、単子葉植物綱または双子葉植物綱に属する植物のいずれでもよい。本発明のポリヌクレオチドが植物に導入されたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法などによって行うことができる。本発明のポリヌクレオチドがゲノム内に組み込まれた形質転換植物体が一旦取得されれば、当該植物体の有性生殖または無性生殖によって子孫を得ることができる。また、当該植物体またはその子孫、あるいはこれらのクローンから、例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラストなどを得て、それらを基に当該植物体を量産することができる。本発明のポリヌクレオチドで形質転換された植物（以下、「本発明の植物」）は、その野生型と比べて本発明のタンパク質を多く含む。このため、本発明のタンパク質が、本発明の植物で生成されたセサミノール配糖体と反応し、セサミノールが植物中に生成する。また、植物体のなかの環境が加水分解反応に最適でない場合は、セサミノール配糖体のグルコシド結合の加水分解反応は抑制され、グルコシド結合が切断されずに維持されたセサミノール配糖体やグルコシド結合の一部のみが切断されたセサミノール配糖体が生成する。
　本発明のいくつかの態様の形質転換体またはその培養液は、その野生型と比べて本発明のセサミノールおよび／またはセサミノール配糖体の含有量が高く、その抽出物または培養液には、本発明のセサミノールおよび／またはセサミノール配糖体が高濃度で含まれる。本発明の形質転換体の抽出物は、形質転換体をガラスビーズ、ホモジェナイザーまたはソニケーター等を用いて破砕し、当該破砕物を遠心処理し、その上清を回収することにより、得ることができる。本発明のセサミノールおよび／またはセサミノール配糖体が培養液中に蓄積される場合には、培養終了後、通常の方法（例えば、遠心分離、ろ過など）により形質転換体と培養上清とを分離することにより、本発明のセサミノールおよび／またはセサミノール配糖体を含む培養上清を得ることができる。
　このようにして得られた抽出液もしくは培養上清は、さらに精製工程に供してもよい。本発明のセサミノールおよび／またはセサミノール配糖体の精製は、通常の分離および精製方法に従って行うことができる。具体的な方法は、前記と同様である。
　「セサミノール配糖体」、「少なくとも１つのグルコシド結合を有するセサミノール配糖体」、及び「少なくとも１つのグルコシド結合を加水分解する活性」は、前記と同様である。
　その他、一般的な分子生物学的な手法に関しては、”Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol.4, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2012”、”Methods in Yeast Genetics、A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor, NY）”等を参照することができる。
　このようにして得られた本発明のセサミノールおよび/またはセサミノール配糖体は、常法に従って、例えば、食品、甘味料、香料、医薬品、工業原料（化粧料、石鹸等の原料）の製造等の用途に使用することができる。
　食品の例としては、特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品、栄養補助食品、健康食品、機能性食品、幼児用食品、老人用食品等が挙げられる。本明細書中、食品は、固体、流動体、および液体、並びにそれらの混合物であって、摂食可能なものの総称である。
　なお、本明細書において引用した全ての文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。
　以下、実施例を用いて本発明をより具体的に説明するが、本発明の範囲は、これらの実施例によって限定されない。
 [実施例１]
麹菌のβ‐グルコシダーゼ遺伝子の探索
　麹菌ゲノムデータ（PRJNA28175）より、β－グルコシダーゼホモログを探索し、菌体内β‐グルコシダーゼのホモログであるAO090701000244（ＣＤＳ配列：配列番号１、推定アミノ酸配列：配列番号２、ＯＲＦ配列：配列番号３、ゲノムＤＮＡ配列：配列番号４）を見出した。これをＡＯＢＧＬ１１としてクローン化することにした。ＡＯＢＧＬ１１のｃＤＮＡ配列とアミノ酸配列を図１に示す。
ＡＯＢＧＬ１１のゲノムＤＮＡのクローニング
　ＡＯＢＧＬ１１をクローニングするために、以下のプライマーを設計した。
 
ＡＯＢＧＬ１１－Ｆ：
　5´‐ATGCCTCGTCTAGACGTCGAGAA‐3´（配列番号４）
ＡＯＢＧＬ１１－Ｒ：
　5´‐TCACAGACCCAACCAGTAGCGA‐3´（配列番号５）
　
　麹菌　Aspergillus oryzae var.Brunneus（ＩＦＯ３０１０２）の分生子を液体培地（１Ｌあたり、グルコース　２０ｇ、バクトトリプトン　１ｇ、酵母エキス　５ｇ、ＮａＮＯ３　１ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４　０．５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　０．５ｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　０．０１ｇ）１０ｍｌに植菌し、３０℃で１日間培養した。ろ過により菌体を集め、液体窒素中ですりつぶしたあと、ＤＮｅａｓｙ　Ｐｌａｎｔ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、ゲノムＤＮＡを調製した。
　ゲノムＤＮＡを鋳型として、プライマーＡＯＢＧＬ１１－ＦとＡＯＢＧＬ１１－Ｒを用いて、ＫＯＤ－ｐｌｕｓ（東洋紡）でＰＣＲを行った。得られた約２．５７ｋｂｐのＤＮＡ断片を、Ｚｅｒｏ　Ｂｌｕｎｔ　ＴＯＰＯ　ＰＣＲ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（インビトロジェン）を使ってクローン化し、プラスミドｐＣＲ－ＡＯＢＧＬ１１ｇを得た。
 [実施例２]
麹菌によるＡＯＢＧＬ１１ｐの生産
麹菌発現用ベクターの構築
　麹菌用ベクターｐＵＮＡ（酒類総合研究所）を制限酵素ＳｍａＩで消化して得られたＤＮＡ断片と、プラスミドｐＣＲ－ＡＯＢＧＬ１１ｇを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し末端をＢｌｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ）によって平滑化して得られた約２．５７ｋｂｐのＤＮＡ断片を連結し、プラスミドｐＵＮＡ－ＡＯＢＧＬ１１ｇを得た。
麹菌の形質転換
　麹菌の形質転換は以下のとおり実施した。
　宿主として、Aspergillus oryzae niaD300株（酒類総合研究所）を使用した。宿主株をＰＤＡプレートに植菌し、３０℃でおよそ１週間培養した。分生子懸濁液を得るために、０．１％　ｔｗｅｅｎ８０，　０．８％　ＮａＣｌを加え、分生子を懸濁した。ミラクロスでろ過後、遠心分離により分生子を回収し、さらに、０．１％　ｔｗｅｅｎ８０，　０．８％　ＮａＣｌで洗浄し、滅菌水に懸濁した・BR>B　分生子をＣＤプレート（１Ｌあたり、ＮａＮＯ３　６ｇ、ＫＣｌ　０．５２ｇ、ＫＨ２ＰＯ４　１．５２ｇ、グルコース　１０ｇ、１Ｍ　ＭｇＳＯ４　２ｍｌ、Ｔｒａｃｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１Ｌあたり、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　１ｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　８．８ｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ　０．４ｇ、ＮａＢ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ　０．１ｇ、（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ　０．０５ｇ　）　１ｍｌ、アガー　２０ｇ（ｐＨ６．５））に塗布し、パーティクルデリバリー法により、ＤＮＡの導入を行った。ＰＤＳ－１０００／Ｈｅ（バイオラッド）を使って、パーティクル：タングステンＭ－１０、ラプチャーディスク：１１００ｐｓｉ、距離：３ｃｍとした。形質転換株として、ＣＤプレートで生育するものを選抜した。プラスミドｐＵＮＡ－ＡＯＢＧＬ１１ｇにより形質転換して得られた形質転換株をＢＧＬ１１－１株、コントロールベクターｐＵＮＡにより形質転換して得られた形質転換株をＣ－１株とした。
麹菌によるＡＯＢＧＬ１１ｐの発現
　ＢＧＬ１１－１株またはＣ－１株をＣＤプレートに植菌し、３０℃で７日間培養し、分生子を形成させた。分生子懸濁液を得るために、０．１％　ｔｗｅｅｎ８０，　０．８％　ＮａＣｌを加え、分生子を懸濁した。ミラクロス（登録商標）でろ過後、遠心分離により分生子を回収し、さらに、０．１％　ｔｗｅｅｎ８０，　０．８％　ＮａＣｌで洗浄し、滅菌水に懸濁し、分生子懸濁液としたこの分生子懸濁液を酵素生産用液体培地（１Ｌあたり、マルトース　１００ｇ、バクトトリプトン　１ｇ、酵母エキス　５ｇ、ＮａＮＯ３　１ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４　０．５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　０．５ｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　０．０１ｇ）　に植菌し、３０℃で２日間振とう培養を行った。ミラクロス（登録商標）によりろ過して菌体を集めた。得られた湿菌体のうち約０．４ｇを液体窒素で凍結し、乳鉢ですりつぶした。すりつぶした菌体を５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）に懸濁し、よく混合した後、遠心分離した。得られた上清を、アミコン（登録商標）ウルトラ－１５　５０ｋ（メルク）で、限外ろ過により濃縮し、０．１％　ＣＨＡＰＳを含む５０ｍＭ　リン酸ナトリウムバッファーｐＨ７．０（バッファーＡ）で置換することにより、約１ｍｌの粗酵素液を得た。
タンパク質濃度の測定
　粗酵素液のタンパク質濃度は、プロテインアッセイＣＢＢ溶液（５倍濃縮）（ナカライテスク）を用いて定量した。その結果、ＢＧＬ１１－１粗酵素液　６．４６ｍｇ／ｍｌ、Ｃ－１粗酵素液４ｍｇ／ｍｌであった。
　[実施例３]
ｐＮＰ－β－Ｇｌｃ分解活性
　ｐＮＰ－β－Ｇｌｃの分解活性を検討した。粗酵素液１０μＬ、０．２Ｍ　リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）５０μＬ、２０ｍＭ　ｐＮＰ－β－Ｇｌｃ水溶液　５０μＬ、水を加えてトータル２００μＬとし、３７℃で反応させた。なお、ＢＧＬ１１－１粗酵素液は活性が高かったため、粗酵素液を０．１％　ＣＨＡＰＳを含む５０ｍＭ　リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）バッファーで１００倍に希釈したものを用いた。ｐＮＰ－β－Ｇｌｃ　が加水分解して遊離したｐ－ニトロフェノール（ｐＮＰ）に基づく１分間あたりの４０５ｎｍの吸光度変化（Δ４０５）は、ＢＧＬ１１－１粗酵素液で０．２４４、Ｃ－１粗酵素液で０．０００であった。以上のことからも、ＡＯＢＧＬ１１ｐがβ－グルコシダーゼ活性を担っていることが示唆された。
　ｐＮＰ－β－Ｇｌｃを基質として、ＡＯＢＧＬ１１ｐの至適温度、至適ｐＨおよび熱安
　定性、ｐＨ安定性を調べた（図２（図２Ａ－図２Ｄ））。なお、ＢＧＬ１１－１粗酵素液はバッファーＡで５０００倍希釈したもの（タンパク質濃度　１．３μｇ／ｍｌ）を使用した。
　至適温度：反応液は、粗酵素液（１．３μｇ／ｍｌ）　２０μｌ、０．２Ｍ　リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）　１００μｌ、２０ｍＭ　ｐＮＰ－β－Ｇｌｃ、水を加えてトータル４００μｌとし、反応開始から１５分、３０分、４５分に１００μｌをサンプリングして１００μｌ　０．２Ｍ　炭酸ナトリウム溶液と混合してから、４０５ｎｍの吸光度を測定し、Δ４０５を求めた。Δ４０５が最大となった４５℃を１として、各温度で反応させたときのΔ４０５の比率を図２Ａに示した。これにより、４５－５０℃が反応至適温度であることが分かった。
　至適ｐＨ：反応液は、粗酵素液（１．３μｇ／ｍｌ）　２０μｌ、０．２Ｍ　バッファー　１００μｌ、２０ｍＭ　ｐＮＰ－β－Ｇｌｃ、水を加えてトータル４００μｌとした。バッファーは、ｐＨ４．０－６．０のとき酢酸ナトリウムバッファーを、ｐＨ６．０－８．０のときリン酸ナトリウムバッファーを用いた。上記と同様にサンプリング、測定を行い、Δ４０５の最大値に対する各ｐＨで反応させたときのΔ４０５の比率を図２Ｂに示した。これにより、ｐＨ６．０－７．０が反応至適ｐＨであることが分かった。
　熱安定性：５０００倍希釈した粗酵素液（１．３μｇ／ｍｌ）を３０℃、３７℃、４５℃、５０℃でそれぞれ１０分間保持したあと氷冷した。反応液は、粗酵素液（１．３μｇ／ｍｌ）　５μｌ、０．２Ｍ　リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）　１００μｌ、２０ｍＭ　ｐＮＰ－β－Ｇｌｃ、水を加えてトータル１００μｌとし、３７℃で４５分間反応させたあと、０．２Ｍ炭酸ナトリウム溶液　１００μｌを添加し、４０５ｎｍの吸光度を測定した。熱処理しなかった酵素液による４５分後の４０５ｎｍの吸光度に対する各温度で処理したときの比率を求め、図２Ｃに示した。ＡＯＢＧＬ１１ｐは、１０分間の処理では３７℃まで安定であるが、４５℃での処理で約半分にまで失活し、５０℃の処理では、活性がほぼ失われることが分かった。
　ｐＨ安定性：粗酵素液を、ｐＨ４．５、５．０、５．５、６．０（０．２Ｍ酢酸バッファー）、ｐＨ６．０、６．５、７．０、７．５、８．０（０．２Ｍ　リン酸ナトリウムバッファー）の各バッファーで５０００倍希釈し、３７℃で１時間保持したあと氷冷した。反応液は、粗酵素液（１．３μｇ／ｍｌ）　５μｌ、０．２Ｍ　リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）　１００μｌ、２０ｍＭ　ｐＮＰ－β－Ｇｌｃ、水を加えてトータル１００μｌとし、３７℃で４５分間反応させたあと、０．２Ｍ炭酸ナトリウム溶液　１００μｌを添加し、４０５ｎｍの吸光度を測定した。活性のもっとも高かったｐＨ６．５で保持したときの吸光度に対する各ｐＨで保持したときの吸光度の比率を求め、図２Ｄに示した。ＡＯＢＧＬ１１ｐは、ｐＨ６．５付近で最も安定であることがわかった。
[実施例４]
ＡＯＢＧＬ１１のｃＤＮＡのクローニング
　ＢＧＬ１１－１株を酵素生産用培地１０ｍｌで培養し、ろ過により菌体を集めた。菌体を液体窒素で凍結し、乳鉢で菌体をすりつぶしてから、ＲＮｅａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ）でトータルＲＮＡを抽出した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　Ｄｏｕｂｌｅ－Ｓｔｒａｎｄｅｄ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズ）により、ｃＤＮＡを合成した。これを鋳型として、プライマーＡＯＢＧＬ１１－ＦとＡＯＢＧＬ１１－Ｒを用いて、ＫＯＤ－ｐｌｕｓ（東洋紡）でＰＣＲを行った。得られた約２．５２ｋｂｐのＤＮＡ断片を、Ｚｅｒｏ　Ｂｌｕｎｔ　ＴＯＰＯ　ＰＣＲ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（インビトロジェン）を使ってＡＯＢＧＬ１１のｃＤＮＡをクローン化し、プラスミドｐＣＲ－ＡＯＢＧＬ１１ｃＤＮＡを得た。塩基配列を確認したところ、配列番号１の通りであり、推定アミノ酸配列は配列番号２の通りであった。ＡＯＢＧＬ１１のゲノムＤＮＡ配列とｃＤＮＡ配列を比較したものを図３に示す。なお、すでにＳＴＧ加水分解活性が確認されているPaenibacillus 属に属する細菌KB0549株由来のβ-グルコシダーゼの推定アミノ酸配列との同一性は３０．３％であった。
[実施例５]
酵母でのＡＯＢＧＬ１１ｐの生産
酵母用発現ベクターの構築と酵母の形質転換
　プラスミドｐＣＲ－ＡＯＢＧＬ１１　ｃＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化して得られた約２．５２ｋｂｐのＤＮＡ断片を、酵母発現ベクターｐＹＥ２２ｍ（Biosci. Biotech. Biochem., 59, 1221-1228, 1995）のＥｃｏＲＩサイトに挿入し、ＡＯＢＧＬ１１がベクターｐＹＥ２２ｍのＧＡＰＤＨプロモーターから発現する向きに挿入されたものを選抜し、ｐＹＥ－ＡＯＢＧＬ３ｃとした。形質転換の親株として、S.cerevisiaeのＥＨ１３－１５株（ｔｒｐ１，ＭＡＴα）（Appl. Microbiol. Biotechnol., 30, 515-520, 1989）を用いた。　プラスミドｐＹＥ２２ｍ（コントロール）、ｐＹＥ－ＡＯＢＧＬ１１（ＡＯＢＧＬ１１発現用）をそれぞれ用いて酢酸リチウム法により、ＥＨ１３－１５株を形質転換した。形質転換株は、ＳＣ－Ｔｒｐ（１Ｌあたり、Ｙｅａｓｔ　ｎｉｔｒｏｇｅｎ　ｂａｓｅ　ｗ／ｏ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ（ＤＩＦＣＯ）６．７ｇ、グルコース２０ｇ、およびアミノ酸パウダー（アデニン硫酸塩１．２５ｇ、アルギニン０．６ｇ、アスパラギン酸３ｇ、グルタミン酸３ｇ、ヒスチジン０．６ｇ、ロイシン１．８ｇ、リジン０．９ｇ、メチオニン０．６ｇ、フェニルアラニン１．５ｇ、セリン１１．２５ｇ、チロシン０．９ｇ、バリン４．５ｇ、スレオニン６ｇ、ウラシル０．６ｇを混合したもの）１．３ｇを含む）寒天培地（２％アガー）上で生育するものを選抜した。
　プラスミドｐＹＥ２２ｍで形質転換して得られた株をＣ－Ｙ株、プラスミドｐＹＥ－ＡＯＢＧＬ１１で形質転換して得られた株をＡＯＢＧＬ１１－Ｙ株とした。　選抜したＣ－Ｙ株とＡＯＢＧＬ１１－Ｙ株を、１Ｍリン酸カリウムバッファーを１／１０量添加したＳＣ－Ｔｒｐ液体培地１０ｍＬに１白金耳植菌し、３０℃、１２５ｒｐｍで２日間振とう培養した。得られた培養物を遠心分離により、培養上清と菌体に分けた。培養上清は、アミコン(登録商標)ウルトラ－１５　５０ｋ（メルク）で限界ろ過に濃縮して０．１％　ＣＨＡＰＳを含む５０ｍＭ　リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）でバッファー置換し、約１ｍｌの培養上清濃縮液を得た。
　菌体は、５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）、０．１％ＣＨＡＰＳ溶液　１ｍｌに懸濁して、ガラスビーズにて菌体を破砕し、遠心分離して得られた上清を菌体破砕液とした。　培養上清濃縮液または菌体破砕液を２０μｌとり、２％　Ｘ‐β‐Ｇｌｃ／ＤＭＦ溶液を１μｌ添加し、室温で５分間反応させたところ、ＡＯＢＧＬ１１－Ｙ株由来の菌体破砕液のみ青色を呈し、Ｘ－β－Ｇｌｃ活性を有することが示唆された。
　ｐＮＰ－β－Ｇｌｃ活性測定
　ｐＮＰ－β－Ｇｌｃの分解活性を検討した。粗酵素液１０μＬ、０．２Ｍ　リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）５０μＬ、２０ｍＭ　ｐＮＰ－β－Ｇｌｃ水溶液　５０μＬ、水を加えてトータル２００μＬとし、３７℃で反応させた。なお、ＢＧＬ１１－１粗酵素液は活性が高かったため、粗酵素液を０．１％　ＣＨＡＰＳを含む５０ｍＭ　リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）バッファーで１００倍に希釈したものを用いた。ｐＮＰ－β－Ｇｌｃが加水分解して遊離したｐ－ニトロフェノール（ｐＮＰ）に基づく１分間あたりの４０５ｎｍの吸光度変化（Δ４０５）は、ＡＯＢＧＬ１１－Ｙ粗酵素液で０．０６８、Ｃ－Ｙ粗酵素液で０．０００であった。
[実施例６]
ＡＯＢＧＬ１１ｐのセサミノール配糖体加水分解活性
　基質としてはセサミノールトリグルコシド（ＳＴＧ）を用いた。ＳＴＧを５０μｇ／ｍＬ、５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）、上記ＢＧＬ１１－１粗酵素液またはその希釈液２０μＬで、全量１００μＬとし、３７℃で、１時間反応させた。コントロールとして、上記Ｃ－１粗酵素液も同様に反応させた。反応液を１００℃で３分間処理し反応を停止させた後、コスモスピンフィルターＨ（ナカライテスク）でろ過後、ＨＰＬＣに供した。
ＨＰＬＣの分析条件は以下の通りである。
 
カラム：コスモシール５Ｃ１８－ＡＲ－ＩＩ　４．６ｍｍＩ．Ｄ．ｘ２５０ｍｍ（ナカライテスク）
 
移動相：Ａ；０．１％（v/v）トリフルオロ酢酸、２：８（ｖ/ｖ）アセトニトリル：水Ｂ；０．１％（v/v）トリフルオロ酢酸、８：２（ｖ/ｖ）アセトニトリル：水
 
Ｂ　ｃｏｎｃ．１０％（０分―３分）→１００％　２４分　ｌｉｎｅａｒ　
ｇｒａｄｉｅｎｔ、 １００％（２４分―３５分）
 
流速：０．７ｍｌ／分
温度：４０℃
検出：ＵＶ　２９０ｎｍ
 
　結果を図４に示す。
　１０倍希釈したＢＧＬ１１－１粗酵素液と反応させた場合、基質のＳＴＧの一部が加水分解され、ＳＤＧ（１，６）およびＳＤＧ（１，２）、およびアグリコンであるセサミノールも生成した（図４Ａ）。
　また、ＢＧＬ１１－１粗酵素液を希釈せずに反応させた場合には、基質として添加したＳＴＧはほとんど加水分解され、ＳＤＧ（１，２）およびアグリコンであるセサミノールが生成した（図４Ｂ）。１０倍希釈したＢＧＬ１１－１粗酵素液と反応させた場合、ＳＤＧ（１，６）に比べてＳＤＧ（１，２）が多いことと、ＢＧＬ１１－１粗酵素液を希釈せずに反応させた場合、ＳＤＧ（１，６）は検出されずＳＤＧ（１，２）のみ検出されることから、ＡＯＢＧＬ１１ｐは、ＳＴＧの分岐した糖鎖の中のβ－１，２結合に比べてβ－１，６結合に対してよく作用することが示唆された。
　以上の結果から、ＡＯＢＧＬ１１ｐは、β－１，２結合に比べてβ－１，６結合を優先して加水分解し、最終的にアグリコンであるセサミノールにまで加水分解する様式であることが示された。また、酵素液の濃度を調整することにより、セサミノール配糖体の加水分解の進行を制御することが可能であることが示された。なお、Ｃ－１粗酵素液とＳＴＧとの反応の結果は図４Ｃに示され、この結果により、Ｃ－１粗酵素液はＳＴＧの加水分解を進行させないことが示された。
　本願発明は、麹菌由来のグルコシドヒドラーゼであるＡＯＢＧＬ１１ｐを用いて、セサミノールトリグルコシドを加水分解し、セサミノールおよび／またはセサミノール配糖体を生産する方法を提供する。

Claims (15)

  1. 　以下の（ａ）～（ｃ）からなる群から選択されるタンパク質と、少なくとも１つのグルコシド結合を有する基質セサミノール配糖体を反応させて、基質セサミノール配糖体の少なくとも１つのグルコシド結合を加水分解する工程を含む、生成セサミノールまたは生成セサミノール配糖体の製造方法。
    （ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質；
    （ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において、１～８３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも１つのグルコシド結合を有する基質セサミノール配糖体のグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質；
    （ｃ）配列番号２のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ少なくとも１つのグルコシド結合を有する基質セサミノール配糖体のグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質
  2. 　前記基質セサミノール配糖体が、セサミノール２´-Ｏ-β-Ｄ-グルコピラノシド（セサミノールモノグルコシド、ＳＭＧ）、セサミノール２´-Ｏ-β-Ｄ-グルコピラノシル（１-２）-Ｏ-β-Ｄ-グルコピラノシド（セサミノール（１－２）ジグルコシド、ＳＤＧ（１，２））、セサミノール２´-Ｏ-β-Ｄ-グルコピラノシル（１-６）-Ｏ-β-Ｄ-グルコピラノシド（セサミノール（１－６）ジグルコシド、ＳＤＧ（１，６））、およびセサミノール２´-Ｏ-β-Ｄ-グルコピラノシル（１-２）-Ｏ-（-β-Ｄ-グルコピラノシル（１-２））β-Ｄ-グルコピラノシド（セサミノールトリグルコシド、ＳＴＧ）からなる群より選択されるいずれか一つである、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記基質セサミノール配糖体がＳＴＧである、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　前記生成セサミノールまたは生成セサミノール配糖体が、ＳＤＧ（１，６）、ＳＤＧ（１，２）およびセサミノールから成る群より選択されるいずれか１つ以上である、請求項１または２に記載の方法。
  5. 　前記少なくとも１つのグルコシド結合が、セサミノール２´位に結合したグルコースとアグリコンとの間のグルコシド結合、セサミノール２´位に結合したゲンチオビオースのβ－１，６－グルコシド結合、セサミノール２´位に結合したソホロースのβ－１，２結合、またはセサミノールに２´位に結合した分岐三糖のβ－１，６－グルコシド結合もしくはβ－１，２結合からなる群より選択されるいずれか１つである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 　宿主細胞に、以下の（ａ）～（ｅ）からなる群から選択されるポリヌクレオチドが導入された非ヒト形質転換細胞に由来する酵素剤を、少なくとも１つのグルコシド結合を有する基質セサミノール配糖体と接触させて、基質セサミノール配糖体の少なくとも１つのグルコシド結合を加水分解する工程を含む、生成セサミノールまたは生成セサミノール配糖体の製造方法。
    （ａ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
    （ｂ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ｃ）配列番号２のアミノ酸配列において、１～８３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも１つのグルコシド結合を有する基質セサミノール配糖体のグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ｄ）配列番号２のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ少なくとも１つのグルコシド結合を有する基質セサミノール配糖体のグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ｅ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつ少なくとも１つのグルコシド結合を有する基質セサミノール配糖体のグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
  7. 　前記ポリヌクレオチドが、発現ベクターに挿入されたものである、請求項６に記載の方法。
  8. 　前記形質転換細胞が、形質転換植物、形質転換大腸菌、形質転換細菌、形質転換酵母、形質転換糸状菌からなる群から選択される、請求項６または７に記載の方法。
  9. 　前記基質セサミノール配糖体が、セサミノール２´-Ｏ-β-Ｄ-グルコピラノシド（セサミノールモノグルコシド、ＳＭＧ）、セサミノール２´-Ｏ-β-Ｄ-グルコピラノシル（１-２）-Ｏ-β-Ｄ-グルコピラノシド（セサミノール（１－２）ジグルコシド、ＳＤＧ（１，２））、セサミノール２´-Ｏ-β-Ｄ-グルコピラノシル（１-６）-Ｏ-β-Ｄ-グルコピラノシド（セサミノール（１－６）ジグルコシド、ＳＤＧ（１，６））、およびセサミノール２´-Ｏ-β-Ｄ-グルコピラノシル（１-２）-Ｏ-（-β-Ｄ-グルコピラノシル（１-２））β-Ｄ-グルコピラノシド（セサミノールトリグルコシド、ＳＴＧ）からなる群より選択されるいずれか一つである、請求項６～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 　前記生成セサミノールまたは生成セサミノール配糖体が、ＳＤＧ（１，６）、ＳＤＧ（１，２）およびセサミノールから成る群より選択されるいずれか１つ以上である、請求項６～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 　前記少なくとも１つのグルコシド結合が、セサミノール２´位に結合したグルコースとアグリコンとの間のグルコシド結合、セサミノール２´位に結合したゲンチオビオースのβ－１，６－グルコシド結合、セサミノール２´位に結合したソホロースのβ－１，２結合、またはセサミノールに２´位に結合した分岐三糖のβ－１，６－グルコシド結合もしくはβ－１，２結合からなる群より選択されるいずれか１つである、請求項６～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 　以下の（ａ）～（ｅ）からなる群から選択されるポリヌクレオチドが導入された非ヒト形質転換体を培養することを含む、生成セサミノールまたは生成セサミノール配糖体の生産方法。
    （ａ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
    （ｂ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ｃ）配列番号２のアミノ酸配列において、１～８３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも１つのグルコシド結合を有する基質セサミノール配糖体のグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ｄ）配列番号２のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ少なくとも１つのグルコシド結合を有する基質セサミノール配糖体のグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ｅ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつ少なくとも１つのグルコシド結合を有する基質セサミノール配糖体のグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
  13. 　前記ポリヌクレオチドが、発現ベクターに挿入されたものである、請求項１０に記載の方法。
  14. 　前記形質転換体が、形質転換植物、形質転換大腸菌、形質転換細菌、形質転換酵母、形質転換糸状菌からなる群から選択される、請求項１２または１３に記載の方法。
  15. 　前記少なくとも１つのグルコシド結合が、セサミノール２´位に結合したグルコースとアグリコンとの間のグルコシド結合、セサミノール２´位に結合したゲンチオビオースのβ－１，６－グルコシド結合、セサミノール２´位に結合したソホロースのβ－１，２結合、またはセサミノールに２´位に結合した分岐三糖のβ－１，６－グルコシド結合もしくはβ－１，２結合からなる群より選択されるいずれか１つである、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の方法。 
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