CN106496332A - 一种高效水解大豆异黄酮苷的方法 - Google Patents

一种高效水解大豆异黄酮苷的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种高效水解大豆异黄酮苷的方法，具体是使用基因工程方法将纤维素结合域基因与β‑葡糖苷酶基因在毕赤酵母中进行融合表达。获得的融合蛋白的纤维素结合域与纤维素通过疏水作用结合而实现葡糖苷酶的固定化。与其他的固定化方法相比，本发明所用方法无需对酶进行预先纯化，也无需其他试剂协助固定化，大大降低了固定化所需的时间和材料成本，并且易于酶的回收利用，有利于工业化大规模利用。而固定化的β‑葡糖苷酶具有很好的热稳定性及很好的大豆异黄酮苷水解能力。

Description

一种高效水解大豆异黄酮苷的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及蛋白质的重组表达，高效固定化和大豆异黄酮苷的高效水解等领域，具体涉及一种能够高效快速固定化β-葡糖苷酶的方法，以及能够利用循环使用固定化酶进行高效大豆异黄酮苷的水解，还建立了连续水解大豆异黄酮苷的方法。
背景技术
大豆异黄酮为雌性激素类似物，具有类雌性激素样作用，是大豆中的活性成分。大豆异黄酮类物质是由一位美国学者在1986年制作大豆胚芽制品中发现的。在1990年，美国的国家癌症研究所(American CancerInstitute，ACI)根据大豆异黄酮的功能作用，邀请了有关专家对其抗癌效果进行研讨，证明大豆异黄酮是较好的抗癌防癌物质，并将大豆列为精深加工和医药产品的重点开发项目。但是从大豆中提取的天然大豆异黄酮主要以糖苷形式存在，大量研究表明植物中的大豆异黄酮类物质的苷元形式才能更好的被吸收，而且其苷元形式如黄豆苷元、染料木素的生物活性更好(Rufer et al.2008，Iovine etal.2012)。
大豆异黄酮苷为酚羟基与糖缩合形成的β-D葡糖苷类物质。通过水解的方法可以使其糖苷键断裂而得到糖基和高活性的大豆异黄酮苷元。其水解方法主要有(Coward etal.1993，Utkina et al.2004，Yuan et al.2008)：(1)酸水解法：在烯醇中使用稀酸如盐酸、稀硫酸等可将糖苷键水解得到异黄酮苷元。(2)碱水解法：异黄酮糖苷键具有酯苷键性质，可用碱将其水解。(3)Smith降解法：首先利用NaIO4将糖的二羟基氧化断裂为醛基，然后利用NaBH4将其还原为二元醇最后与稀酸作用而水解以达到水解目的。(4)酶解法：大豆异黄酮苷的糖苷键为β-D葡萄糖苷键，可利用β-D葡糖苷酶将其水解。酶解法的反应条件温和，专一性强，只对目的糖苷键进行水解，使得苷元的结构不被破坏。
目前已经有一些酶解法水解大豆异黄酮类物质的研究，其中，Xiaoqing Yang等利用Paecilomyces thermophila中的β-D-葡糖苷酶在4小时内、50℃下可将大豆或大豆胚芽提取物中的异黄酮水解93％(Yang et al.2009)。Otieno等对比杏仁中提取的外源性β-D-葡糖苷酶和双歧杆菌及乳酸菌中β-D-葡糖苷酶对豆奶中大豆异黄酮苷的转化作用，发现外源性的β-D-葡糖苷酶水解效果更好(Otieno and Shah 2007)。但是，由于商业化的β-D-葡糖苷酶价格昂贵，且不易回收利用，使得直接用β-D-葡糖苷酶水解大豆异黄酮苷的成本较高，使其在应用时受到限制。目前也有一些固定化葡糖苷酶技术水解大豆异黄酮苷的研究，如Jie Chang等人利用chitsoan-carbon作为固定化载体在水相-有机相两相系统中水解大豆异黄酮苷(Chang et al.2013)。但是在经过15次重复利用后其活性只有50％，而且其固定化载体价格昂贵、固定化过程较为繁琐，不利于工业上的大规模使用。
纤维素非常适合作为大规模亲和层析的树脂填料，具有以下优点：价格便宜；具有很好的物理特性；对于不含纤维素结合域的蛋白吸附能力弱；不与常见的缓冲液反应；无生物安全问题。能够与纤维素结合的亲和标记是纤维素结合域(CBM)。其与纤维素的结合能力强，能够耐受酶的水解和产品纯化过程中的酸碱；非特异性吸附低；促进蛋白质折叠(Wanet al.2011)。
发明内容
本发明通过将纤维素结合域基因与β-葡糖苷酶基因在毕赤酵母中进行融合表达获得重组蛋白；重组蛋白可以与磷酸溶胀纤维素通过疏水作用结合实现酶的固定化；固定化的重组酶可以水解大豆异黄酮类物质使其成为苷元的形式；固定化葡糖苷酶在水解后可通过离心直接回收以实现酶的循环使用。
本发明的第一个方面涉及一种融合蛋白，所述融合蛋白包含融合表达的纤维素结合域(以下也称为CBM3)和β-葡糖苷酶(以下也称为BGL1)。
在优选的实施方案中，所述纤维素结合域和β-葡糖苷酶分别由纤维素结合域基因(cbm3)与β-葡糖苷酶基因(bgl1)编码。
本发明的第二个方面涉及一种构建体，所述构建体用于编码上述的融合蛋白，所述构建体包含彼此连接的纤维素结合域基因(cbm3)与β-葡糖苷酶基因(bgl1)。
在优选的实施方案中，所述纤维素结合域基因的GenBank登陆号为EEU00265。
在优选的实施方案中，所述β-葡糖苷酶基因的GenBank登陆号为DQ114397.1。
本发明的第三个方面涉及一种重组载体，所述载体包含本发明第二个方面所述的构建体。
在优选的实施方案中，所述载体由出发质粒pPICZαA改造获得。
本发明的第四个方面涉及一种宿主细胞，所述宿主细胞包含本发明第二个方面所述的构建体或本发明第三个方面所述的重组载体。
在优选的实施方案中，所述宿主细胞是毕赤酵母。
在优选的实施方案中，所述宿主细胞是毕赤酵母KM71H。
本发明的第五个方面涉及一种固定化的β-葡糖苷酶，所述固定化的β-葡糖苷酶包含本发明第一个方面的融合蛋白以及与所述融合蛋白结合的纤维素。
在优选的实施方案中，所述纤维素为磷酸溶胀纤维素。
在优选的实施方案中，所述纤维素为磷酸溶胀无定形纤维素。
在优选的实施方案中，所述结合通过疏水相互作用结合。
本发明的第六个方面涉及一种固定化β-葡糖苷酶的方法，所述方法包括以下步骤：
1)将β-葡糖苷酶与纤维素结合域融合表达；
2)将得到的如本发明第一个方面所述的融合蛋白与纤维素接触。
在优选的实施方案中，所述纤维素为磷酸溶胀纤维素。
在优选的实施方案中，所述纤维素为磷酸溶胀无定形纤维素。
本发明的第七个方面涉及一种水解β-葡糖苷酶底物的方法，所述方法包括将本发明第五方面所述的固定化的β-葡糖苷酶与所述β-葡糖苷酶底物接触。
在优选的实施方案中，所述方法包括以下步骤：
1)利用蠕动泵将β-葡糖苷酶底物连续泵入装有固定化的β-葡糖苷酶的水解反应装置，同时保持所述水解反应装置温度恒定；
2)经β-葡糖苷酶酶解后得到的产物流入收集器。
在优选的实施方案中，所述β-葡糖苷酶底物是大豆异黄酮苷。
在优选的实施方案中，所述大豆异黄酮苷选自染料木苷、黄豆苷、黄豆黄苷或其组合。
本发明的第八个方面涉及一种连续水解装置，所述装置包括依次连接的底物储存器、蠕动泵、水解反应装置和水解产物收集器，所述水解反应装置温度恒定。
在优选的实施方案中，所述水解反应装置通过置于恒温水浴槽中保持温度恒定。
在优选的实施方案中，所述水解反应装置通过水循环装置保持温度恒定。
在优选的实施方案中，所述底物是大豆异黄酮苷，优选选自染料木苷、黄豆苷、黄豆黄苷或其组合，相应地，所述水解反应装置内装有固定化酶，优选如上文所述的固定化的β-葡糖苷酶。
在优选的实施方案中，所述融合蛋白的构建过程如下：
1)纤维素结合域基因(cbm3)与β-葡糖苷酶基因(bgl1)的融合，插入到质粒pPICZαA的构建表达载体。获得CBM3基因(cbm3，GenBank：HQ232851)和BGL1基因，酶切后使用T4连接酶进行连接构建融合表达载体。
2)将第一项中构建的表达载体pPICZαA-CBM3-BGL1使用Sac I酶切进行线性化后通过电穿孔转化进入表达菌株毕赤酵母KM71H中并通过甲醇诱导表达。
在优选的实施方案中，所述β-葡糖苷酶的固定化过程如下：
采用磷酸溶胀无定形纤维素与融合蛋白的表达上清在25℃混合30分钟，即完成了CBM3-BGL1的固定化。然后经过离心分离上清和纤维素，并洗涤即得到固定化重组β-葡糖苷酶。
具体地，采用5mg/ml的磷酸溶胀无定形纤维素1ml与1ml(9.6U/ml)的表达上清在25℃混合30分钟，即完成了CBM3-BGL1的固定化。然后经过5000g离心15min分离上清和纤维素，并使用50mM柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液洗涤3次后定容至1mL即可得到8.3U/ml的固定化重组β-葡糖苷酶。
在优选的实施方案中，对固定化的β-葡糖苷酶的稳定性以及其对大豆异黄酮类物质的水解进行研究。具体而言，固定化后的β-葡糖苷酶具有很好的热稳定性，在70℃、60℃、50℃的半衰期分别为6小时、45小时、100小时。而且固定化后的β-葡糖苷酶有较好的大豆异黄酮苷水解能力，0.05U的固定化后的β-葡糖苷酶在50℃水解40分钟可以将2mM的大豆异黄酮类物质完全水解。
在优选的实施方案中，对固定化的β-葡糖苷酶的进行循环使用及连续水解大豆异黄酮苷。具体而言，在40℃下，固定化的β-葡糖苷酶使用40次后仍有54.11％的酶活并能水解92.5％的黄豆苷、90.0％的染料木苷及97.5％的黄豆黄苷。采用构建的连续水解大豆异黄酮苷装置，在50℃下，在以0.2ml/min的流速下，经过60小时的反应，该反应体系仍能水解50％以上的黄豆苷和染料木苷。
优点和积极效果
虽然有一些β-葡糖苷酶水解大豆异黄酮苷的报道，但是无论是天然表达的还是重组表达的β-葡糖苷酶，获得纯酶都是一个高成本的过程，而酶的耐久性也是影响成本的重要因素。本发明通过基因工程的方法将纤维素结合域基因(cbm3，GenBank：EEU00265)(Wanet al.2011)与β-葡糖苷酶基因(bgl1，GenBank：DQ114397.1)(Hong et al.2007)在毕赤酵母(Pichia pastoris)KM71H中进行融合表达，建立了一个无需事先纯化，将β-葡糖苷酶的纯化与固定同时完成的方法，结合采用了成本极低的纤维素为固定材料(75元/千克)，以磷酸溶胀无定形纤维素作为β-葡糖苷酶的固定化载体使得其能够在常温条件下将纤维素与酶的表达上清混合后实现酶的固定化和提纯一步完成，与其他的固定化方法相比，本发明所用方法无需对酶进行预先纯化，也无需其他试剂协助固定化，大大降低了固定化所需的时间和材料成本，并且易于酶的回收利用，有利于工业化大规模利用。固定化的β-葡糖苷酶还具有很好的热稳定性，使得β-葡糖苷酶在大豆异黄酮苷水解中能够重复使用40次，远高于其他方法；而利用固定化的β-葡糖苷酶构建的连续水解体系，可以工作60小时，仍然可以水解50％的大豆异黄酮苷。
本专利中构建的固定化酶技术为基础的重组酶的循环利用次数更多。进而搭建的一个连续水解大豆异黄酮苷的体系更加方便、经济。
附图说明
图1.固定化葡糖苷酶的热稳定性。在不同温度(■，40℃；▲，50℃；◆，60℃；●，70℃)下保温一段时间后，在37℃下，在含有10mM p-硝基苯-β-D-葡萄糖苷(pNPG)的500μl反体系中测得剩余活性。重组后固定化酶在50℃下比较稳定，其半衰期为100小时。
图2.有机溶剂对固定化葡糖苷酶活性的影响。在37℃下，使用人工底物pNPG测得不同浓度甲醇、乙醇和乙腈对固定葡糖苷化酶的活性影响。结果表明甲醇和乙醇对固定化葡糖苷酶活性具有促进作用，当浓度为15％时，促进作用效果最好。
图3.循环使用固定化葡糖苷酶水解天然底物。在500μl含有2mM底物(1mM 染料木苷；0.84mM 黄豆苷；0.2mM 黄豆黄苷)的提取液中加入0.05U的固定化葡糖苷酶。在40℃下反应95min后分别回收固定化葡糖苷酶和反应液，继续加入500μl提取液于回收的固定化葡糖苷酶中进行反应，重复40次。最后测定第10、20、30、40个循环时反应体系中的底物水解效率和剩余酶活。
图4.固定化β-葡糖苷酶连续性水解大豆异黄酮类物质的示意图：A为底物储存器，其中装有底物大豆异黄酮苷，B为蠕动泵，C为水解反应装置，其中装有纤维素固定化的β-葡糖苷酶，D为恒温水浴槽，E为水解产物收集器，用于收集酶解得到的大豆异黄酮苷元。其中，该图左上角的框中显示固定化β-葡糖苷酶的示意图(1为BGL，2为CMB3，3为纤维素)在进行反应时，C中装有固定化酶，提取的大豆异黄酮类物质经蠕动泵不断供应入C中，经过C中的固定化β-葡糖苷酶水解后进入E中被收集起来。在进行水解反应时可通过控制加入的酶量和不同流速来控制反应。
图5.固定化酶连续性水解大豆异黄酮苷的水解效率。将含1.0mM染料木苷、0.84mM黄豆苷和0.2mM的黄豆黄苷的提取液以0.2ml/min的流速流经含有30U固定化β-葡糖苷酶的20ml反应体系。在50℃下连续反应60小时，该反应体系仍能水解50％的黄豆苷和65％以上的染料木苷、黄豆黄苷。
具体实施方式
试剂和菌株：本发明中的所有试剂均是市场购买的试剂级以上试剂。其中葡萄糖，酵母基本氮源，甲醇，胶回收试剂盒以及所有的限制性内切酶均来源于上海生工生物工程公司。Primer STAR HS DNA聚合酶，T4连接酶连接酶购自于大连宝生物公司。大肠杆菌Escherichia coli XL10-gold菌株作为DNA操作时使用的宿主菌，包含100g/ml氨苄青霉素的Luria-Bertani(LB)培养基用于培养E.coli。合成培养基(6.7g/l YNB酵母基本氮源，2％葡萄糖以及适当含量的氨基酸)主要用于转化。YPD培养基(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)用于酵母的前培养。YPM(2％酵母提取物，2％蛋白胨，0.5％甲醇)用作由于诱导表达培养基。质粒pUCBM(Wan et al，.2011)和pPICZαA/bgl1(Hong et al，.2007)均由本实验室提供。毕赤酵母KM71H购自invitrogen(Carlsbad，CA 92008美国)。
磷酸溶胀无定形纤维素的制作：
1.称取0.2g Avicel PH105(美国FMC公司)于50mL离心管中。
2.加入0.6mL蒸馏水，充分混匀。
3.一边震荡一边加入10mL 86.2％的磷酸。
4.待磷酸完全加入后将纤维素匀浆置于冰浴中1h。
5.将上述的匀浆一边震荡一边缓缓加入40mL冰水。
6.于5000×g，4℃离心除去上清液。
7.重复5-6步骤2次。
8.使用2M Na2CO3中和直至pH～6。
9.离心除去上清液并用冰水洗涤3次。
大豆异黄酮类物质的提取：
1.在50mL烧杯中将5g粗大豆异黄酮粉(西安瑞林生物科技有限公司)溶于20mL80％乙醇溶液中。
2.将上述混合物在130W超声仪中超声溶解30min。
3.5000g离心10min收集上清液。
4.将上清液使用0.45μm滤膜进行过滤既得到大豆异黄酮类物质提取液(主要成分：染料木苷，黄豆苷，黄豆黄苷，染料木素，大豆黄素，黄豆黄素)。
实施例1 CBM3和β-葡糖苷酶基因的融合表达
1.融合基因表达载体的构建
以pUCBM质粒为模板(Wan et al.2011)使用Primer STAR HS DNA聚合酶(大连宝生物)，以Xba I-CBM3-F、Xba I-CBM3-R(SEQ ID NO：1，2)为引物将进行PCR将CBM3基因扩增出来并用Xba I(Thermo Fisher Scientific)进行酶切。将含有BGL1基因的质粒pPICZaA/bgl1使用Xba I(Thermo Fisher Scientific)进行酶切后与CBM3使用T4连接酶进行连接，获得融合表达质粒pPICZαA/bgl1-cbm3。
引物Xba I-CBM3-F和Xba I-CBM3-R的序列如下：
SEQ ID NO：1：AGTTCTAGACGGTTCTGGATCTGGTTCTGG
SEQ ID NO：2：CGTTCTAGAATGGTTCCTTACCCCAAACC
具体操作如下：
①CBM3的PCR扩增体系
PCR程序
②CBM3的Xba I酶切
37℃酶切5h
(③pPICZαA/bgl1的Xba I酶切
37℃酶切5h
④pCBM3与PICZαA/bgl1的连接
16℃连接12h
将得到的重组质粒pPICZαA/bgl1-cbm3转化入E.coli进行扩增。
2.融合基因在毕赤酵母KM71H中的诱导表达
1)将pPICZαA/bgl1-cbm3质粒转化到毕赤酵母KM71H中。先将pPICZαA/bgl1-cbm3使用Sac I进行线性化后，然后通过电穿孔转化到毕赤酵母KM71H中。
具体操作如下：
线性化体系：
37℃酶切12h
将线性化的载体转化入毕赤酵母KM71H的过程：
1.将毕赤酵母KM71H划线于YPD培养基平板上，30℃培养24h
2.将上述划线的KM71H接菌于5mL液体YPD，30℃，250rpm，过夜培养。
3.取夜培养的细胞500μl转接入50mL液体YPD中，30℃，250rpm培养至OD600约为1.3～1.5。
4.收集上述培养细胞，1500g离心5min。
5.将收集的细胞重悬于50ml冰水中，1500g离心5min。
6.将上述细胞重悬于1M山梨醇中，4℃，1500g离心5min。
7.重悬于200μl 1M山梨醇中。
8.取100μl上述制备的细胞并加入10μl线性化的质粒。
9.将上述细胞与载体的混合溶液加入预冷的电转杯中，并在1.5Kv下进行电击转化。
10.电击后立即加入900μl 1M山梨醇，同时转入1.5mL离心管中，冰上放置20min。
11.在5000rpm，4℃下离心3min收集细胞。
12.将上述收集细胞重悬于1mL YPD溶液中，30℃，250rpm复苏3h。
13.将上述复苏后细胞涂布于YPD(含100μg/mL博莱霉素)平板上，30℃培养箱培养。
14.将上述YPD板上细胞重划线于含1000μg/mL YPD平板上进行复筛得到菌株Y4301-2。
2)获得的表达重组酶的KM71H菌株YSL4301-2的诱导表达
CBM3-BGL1在菌株YSL4301-2中受诱导型启动子AOX控制，可以在甲醇的诱导下表达。具体如下：
1.将上述复筛得到的表达重组酶的菌株Y4301-2接菌于300mL YPD培养基中，并于30℃250rpm条件下培养24h。
2.通过4℃，4000×g离心收集上述培养的细胞，重悬含有0.5％甲醇的100mL YPM培养基，30℃250rpm培养进行诱导表达。
3.每隔24h添加500μl 100％甲醇进行诱导表达并收取200μl培养上清液。诱导表达7-8天后收集全部菌液并根据Matsuura和Obata(Matsuura and Obata 1993)的方法使用对硝基苯酚吡喃葡萄糖苷(p-NPG)作为底物进行酶活的测定。
实施例2 重组葡糖苷酶的固定化及温度和有机溶剂对固定化酶的影响
1)重组葡糖苷酶的固定化及其动力学常数的测定
1.分别将总酶活为3.5U/ml、4.0U/ml、4.8U/ml、5.7U/ml、6.2U/ml的葡糖苷酶加入含有2mg磷酸溶胀无定型纤维素中。在25℃下结合30min，12000g离心5分钟后分离上清并将沉淀使用50mM柠檬酸-磷酸缓冲液(pH5.0)洗涤两次，定容至1.5mL。
2.测定上述回收的上清中酶活，根据Langmuir方程
其中Ea为吸附的葡糖苷酶(U/ml)；Wmax为β-葡糖苷酶的最大吸附量(U/g)；Ef为未结合的β-葡糖苷酶(U/ml)。求得磷酸溶胀无定型纤维素最大固定化能力为8333.3U/g。
3.取上述0.05U的固定化酶分别与不同浓度(0.05，0.1，0.2，0.4，0.8mM)的底物(染料木苷、黄豆苷、黄豆黄苷，Sigma公司)于50℃水浴中反应5min，测定其反应速率，并根据Lineweaver-Burk方程的双倒数法计算Km值和Vmax。
其中Km值为米氏常数，Vmax是酶被底物饱和时的反应速度，[S]为底物浓度。计算其动力学常数(表1)。
表1.固定化酶动力学常数*
*使用0.05U的固定化葡糖苷酶在50℃下反应测得的固定化葡糖苷酶动力学常数。
2)温度对固定化葡糖苷酶的影响
取10U上述固定化酶于40，50，60，70℃水浴中。保温一定时间后取出并根据Matsuurac和Obata(Matsuura and Obata 1993)的方法使用对硝基苯酚吡喃葡萄糖苷(p-NPG)作为底物分别测定残留酶活(图1)。由图1可以看出固定化酶在50℃下已经比较稳定，其半衰期为100小时。
4)有机溶剂对固定化葡糖苷酶的影响
分别在含有5％，10％，15％，20％(v/v)的甲醇、乙醇或乙腈的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲体系及不含有机溶剂的缓冲体系中加入0.05U的固定化酶，在37℃下保温20min后，测定含有有机溶剂体系的固定化葡糖苷酶相对于不含有机溶剂的活性(图2)。由图可以看出甲醇和乙醇对固定化葡糖苷酶活性具有促进作用，当浓度为15％时，促进作用最好。
实施例3 固定化重组酶水解大豆异黄酮类物质的研究
1)大豆异黄酮类物质的提取及水解
1.在50mL烧杯中将5g粗大豆异黄酮粉(西安瑞林生物科技有限公司)溶于20mL80％乙醇溶液中。
2.将上述混合物在130W超声仪中超声溶解30min。
3.5000g离心10min收集上清液。
4.将上清液使用0.45μm滤膜进行过滤既得到大豆异黄酮类物质提取液(主要成分：染料木苷，黄豆苷，黄豆黄苷，染料木素，大豆黄素，黄豆黄素)。
5.将167μl上述提取液加入333μl含有0.1U固定化酶的反应体系中，在50℃水浴中水解75min后取反应液进行HPLC分析，检测结果显示固定化酶能够将染料木苷、黄豆苷、黄豆黄苷水解成相应的苷元形式。
实施例4 循环使用固定化重组酶水解大豆异黄酮类物质
该实施例用于研究固定化β-葡糖苷酶的水解效率及重复使用次数。在40℃恒温水浴槽中进行反应，在1.5mL离心管中加入0.05U的固定化的酶和500μl含有2mM底物(1mM染料木苷；0.84mM黄豆苷；0.2mM黄豆黄苷)的提取液，反应95min后12000g离心5min，分别回收酶和反应液。反应液稀释10倍后进行HPLC分析，回收的酶重新加入500μl提取的大豆异黄酮类物质进行反应，总计反应40次。如图4经过HPLC分析得到染料木苷、黄豆苷和黄豆黄苷的水解效率和相应循环数时反应液中的剩余酶活。结果表明在40℃下，固定化的β-葡糖苷酶使用40次后仍有54.11％的酶活并能水解92.5％的黄豆苷、90.0％的染料木苷及97.5％的黄豆黄苷。
具体操作如下
1.将0.05U的固定化葡糖苷酶溶液加入500μl含有1mM染料木苷，0.84mM黄豆苷和0.2mM黄豆黄苷的提取液中，充分混合。
2.将上述混合液置于40℃水浴中反应95min。
3.通过12000g，5分钟离心分别收集上清和固定化酶。
4.将回收的固定化酶加入步骤1所用的提取液混合均匀后继续反应。
5.将收集的上清液使用乙腈进行稀释并使用0.22μm的滤膜进行过滤后进行HPLC分析。
6.重复第3，4，5步骤40次。
7.将收集的上清液进行HPLC分析并测定第10、20、30和40次循环后的剩余酶活(图3)。
实施例5 固定化β-葡糖苷酶连续性水解大豆异黄酮类物质
在50℃下，将浓度为1.0mM染料木苷、0.84mM黄豆苷和0.2mM黄豆黄苷的提取液以0.2ml/min的流速流经含有30U固定化β-葡糖苷酶的20ml反应体系(图4)。在不同的时间点收集反应液进行HPLC分析，研究葡糖苷酶水解情况。结果表明，在0.2ml/min的流速下，经过60小时的反应，该反应体系仍能水解50％的黄豆苷和65％以上的染料木苷、黄豆黄苷(图5)。
具体操作如下：
1.在恒温反应器中加入30U固定化葡糖苷酶(图4)。
2.加入20mL含有1mM染料木苷、0.84mM黄豆苷和0.2mM黄豆黄苷的大豆异黄酮提取液。
3.反应1小时后进行HPLC分析，检测是否水解完全。
4.待反应完全后，以0.2ml/min的流速向反应体系中泵入大豆异黄酮提取液，并保持反应体积不变。
每隔一段时间取样进行HPLC分析其水解效率(图5)。
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SEQUENCE LISTING
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<120> 一种高效水解大豆异黄酮苷的方法
<130> IB168573
<160> 2
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agttctagac ggttctggat ctggttctgg 30
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cgttctagaa tggttcctta ccccaaacc 29

Claims (10)

1.一种融合蛋白，所述融合蛋白包含融合表达的纤维素结合域和β-葡糖苷酶，优选所述纤维素结合域和β-葡糖苷酶分别由纤维素结合域基因和β-葡糖苷酶基因编码，其中优选所述纤维素结合域基因的GenBank登录号为EEU00265，所述β-葡糖苷酶基因的GenBank登录号为DQ114397.1。
2.一种构建体，所述构建体包含彼此连接的纤维素结合域基因与β-葡糖苷酶基因，其中优选所述纤维素结合域基因的GenBank登录号为EEU00265，所述β-葡糖苷酶基因的GenBank登录号为DQ114397.1。
3.一种重组载体，所述载体包含根据权利要求2所述的构建体。
4.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求2所述的构建体或权利要求3所述的重组载体，所述宿主细胞优选是毕赤酵母。
5.一种固定化的β-葡糖苷酶，所述固定化的β-葡糖苷酶包含根据权利要求1的融合蛋白以及与所述融合蛋白结合的纤维素，其中所述纤维素优选为磷酸溶胀纤维素，更优选为磷酸溶胀无定形纤维素。
6.一种固定化β-葡糖苷酶的方法，所述方法包括以下步骤：
1)将β-葡糖苷酶与纤维素结合域融合表达；
2)将得到的融合蛋白与纤维素接触；
其中，所述纤维素优选为磷酸溶胀纤维素，更优选为磷酸溶胀无定形纤维素。
7.一种水解β-葡糖苷酶底物的方法，所述方法包括将权利要求5所述的固定化的β-葡糖苷酶与所述β-葡糖苷酶底物接触，所述β-葡糖苷酶底物优选是大豆异黄酮苷，更优选选自染料木苷、黄豆苷、黄豆黄苷或其组合。
8.根据权利要求7所述的方法，所述方法包括以下步骤：
1)利用蠕动泵将β-葡糖苷酶底物连续泵入装有固定化的β-葡糖苷酶的水解反应装置，同时保持所述水解反应装置温度恒定；
2)经β-葡糖苷酶酶解后得到的产物流入收集器。
9.一种连续水解装置，所述装置包括依次连接的底物储存器、蠕动泵、水解反应装置和水解产物收集器，所述水解反应装置温度恒定，优选所述水解反应装置通过置于恒温水浴槽中或通过水循环装置保持温度恒定。
10.根据权利要求9所述的装置，所述底物是大豆异黄酮苷，优选选自染料木苷、黄豆苷、黄豆黄苷或其组合，相应地，所述水解反应装置内装有固定化酶，优选如权利要求5所述的固定化的β-葡糖苷酶。
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