JP2020526185A - β−グルコシダーゼによるステビオール配糖体の加水分解 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図1
Description
本出願は、35U.S.C.§119(e)の下で、2017年6月30日に出願された米国仮特許出願第62/527,482号(その内容全体は参照によって本明細書中に援用される)に対する優先権を主張する。
ステビオール配糖体は南米の植物ステビア・レバウジアナ(Stevia rebaudiana)(キク科(Asteraceae))の葉の甘味の原因となる化合物の種類であり、食品、飼料及び飲料における甘味料として使用され得る。
細胞系は、異所性タンパク質の発現を提供する任意の細胞である。これには、細菌、酵母、植物細胞及び動物細胞が含まれる。これには、原核細胞及び真核細胞の両方が含まれる。またこれには、リボソームなどの細胞成分に基づいたタンパク質のインビトロ発現も含まれる。
本明細書で使用される場合、単数形「a、an」及び「the」は、内容が他に明白に指示しない限り、複数の指示対照を含む。
本明細書で使用される標準組換えDNA及び分子クローニング技術は当該技術分野においてよく知られており、例えば、Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniatis,T.MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,2nd ed.;Cold Spring Harbor Laboratory:Cold Spring Harbor,N.Y.,1989(以下、「Maniatis」);及びSilhavy,T.J.,Bennan,M.L.and Enquist,L.W.EXPERIMENTS WITH GENE FUSIONS;Cold Spring Harbor Laboratory:Cold Spring Harbor,N.Y.,1984;及びAusubel,F.M.et al.,IN CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,GREENE PUBLISHING AND WILEY−INTERSCIENCEにより出版,1987によって記載されている(これらのそれぞれの全体は、参照によって本明細書中に援用される)。
原核生物におけるタンパク質の発現は、ほとんどの場合、融合又は非融合タンパク質のいずれかの発現を指示する構成的又は誘導性プロモーターを含有するベクターを用いて細菌宿主細胞において実行される。融合ベクターは、その中にコードされたタンパク質、通常は組換えタンパク質のアミノ末端にいくつかのアミノ酸を付加する。このような融合ベクターは、通常、3つの目的を果たす:1)組換えタンパク質の発現を増大させること;2)組換えタンパク質の溶解度を増大させること;及び3)アフィニティー精製におけるリガンドとしての役割を果たすことにより組換えタンパク質の精製を補助すること。多くの場合、融合タンパク質の精製の後に、組換えタンパク質を融合部分から分離できるようにするために、融合部分と組換えタンパク質との接合部にタンパク質分解的切断部位が導入される。このようなベクターは本開示の範囲内に含まれる。
細胞破壊は、細胞の内部から対象の生体分子を放出させるために使用される技術の集まりである。バイオ技術で生成される多くの化合物は細胞内にあり、回収の前に細胞から放出させなければならない。生成物の効率的な回収は細胞破壊を必要とし、これは、対象の生体分子及び使用される細胞系に応じて異なる方法及び技術(機械的又は非機械的な方法のいずれか)を用いることにより達成され得る。全ての破壊方法は、対象の分子、ここではステビオール配糖体と、溶解物内の対象のタンパク質の分解を引き起こし得る他の分子とを放出することに注意すべきである。これを防止するために、タンパク質の活性が下流の作用にとって重要であるかどうかを考慮することが必要である。高度の変性溶液又は高いpHにおけるサンプルの溶解は、酵素活性を最小化する。また氷上又はより低温での破壊の実施は、サンプルの分解を最小化するのに役立つであろう。従って、プロテアーゼ活性を阻害するための1つの技術は、一般的なホスファターゼ阻害剤混合物を、破壊された時点で溶解物が利用できるようにすることである。
標準的な破壊は、機械的均質化、フレンチプレス、超音波処理、ビーズ均質化、粉砕、凍結融解溶解(freeze−thaw lysis)、洗剤溶解、酵素溶解及び浸透圧溶解からなる。
本明細書で使用される場合、「配列同一性」は、最適に整列された2つのポリヌクレオチド又はペプチド配列が構成要素(例えば、ヌクレオチド又はアミノ酸)のアライメントのウィンドウ全体にわたって不変である程度を指す。試験配列及び参照配列の整列されたセグメントの「同一性分率」は、整列された2つの配列により共有される同一の構成要素の数を、参照配列セグメント(すなわち、参照配列全体又は参照配列のより小さい画定された部分)中の構成要素の総数で割ったものである。
同一性は、配列のアライメントの後に一対の配列の間で同じであるアミノ酸の分率であり(これは、配列情報又は構造情報又は何らかの他の情報のみを用いて行なうことができるが、通常は配列情報のみに基づく)、類似性は、いくつかの類似性マトリックスを使用するアライメントに基づいて割り当てられたスコアである。類似性インデックスは、以下のBLOSUM62、PAM250、もしくはGONNET、又はタンパク質の配列アライメントのために当業者により使用される任意のマトリックスのいずれか1つであり得る。
本開示に従って、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)ゲノム分析を完了させ、いくつかのβグリコシダーゼ候補遺伝子を同定した。全ての候補βグルコシダーゼ遺伝子の全長DNA断片を商業的に合成した。cDNAのほとんど全てのコドンを大腸菌(E.coli)にとって好ましいものに変化させた(Genscript,NJ)。合成したDNAを細菌発現ベクターpETite N−His SUMO Kanベクター(Lucigen)にクローニングした。これらの同じ実験は、このような使用に最適化された配列を有するヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)において実施され得る。
ルブソシドは組換えB−glu1酵素及び破壊ピキア属(Pichia)細胞によって加水分解されて、ステビオール−13−グルコシドを生成することができる。生成したステビオール−13−グルコシドは続いて加水分解されて、ステビオールを生成することができる(図1B)。反応は、実施例1に記載されるように設定した。1g/Lのルブソシドを基質として反応に添加した。図1Aに示されるように、B−glu1はルブソシドのC19位からグルコシル基を除去して、ステビオール−13−グルオシド(gluoside)を生成することができる(図1A−c)。生成したステビオール−13−グルコシド(gluocside)(S−13−G)は、その後の時点でステビオールに変換され得る(図1A−d)。B−glu1は、ステビオール−13−グルコシドのC13位から別のグルコシル基を除去する。B−glu1はピキア属(Pichia)細胞の細胞間酵素なので、破壊ピキア属(Pichia)細胞はB−glu1酵素を放出し、これは、ルブソシドをステビオール−13−グルコシドに加水分解し、継続してステビオールを生成するために同じ酵素活性を有する(図1A−e及びf)。
ステビオシドは組換えB−glu1酵素及び破壊ピキア属(Pichia)細胞によって加水分解されて、ステビオールビオシドを生成することができる(図2B)。反応は、実施例1に記載されるように設定した。1g/Lのステビオシドを基質として反応に添加した。図2に示されるように、B−glu1はステビオシドのC19位からグルコシル基を除去して、ステビオールビオシドを生成することができる(図2A c及びd)。B−glu1はピキア属(Pichia)細胞の細胞間酵素なので、破壊ピキア属(Pichia)細胞はB−glu1酵素を放出し、これは、ステビオシドをステビオールビオシドに加水分解するために同じ酵素活性を有する(図8C)。
レバウジオシドEは組換えB−glu1酵素によって加水分解されて、ステビオールビオシドを生成することができる(図3B)。反応は、実施例1に記載されるように設定した。1g/LのレバウジオシドEを基質として反応に添加した。図3に示されるように、B−glu1はレバウジオシドEのC19位からグルコシル基を除去して、ステビオシド及びステビオールビオシドを生成することができる(図3A c〜e)。B−glu1はピキア属(Pichia)細胞の細胞間酵素なので、破壊ピキア属(Pichia)細胞はB−glu1酵素を放出し、これは、レバウジオシドEをステビオールビオシドに加水分解するために同じ酵素活性を有する(図8D)。
レバウジオシドAは組換えB−glu1酵素によって加水分解されて、レバウジオシドBを生成することができる(図4B)。反応は、実施例1に記載されるように設定した。1g/LのレバウジオシドAを基質として反応に添加した。図4に示されるように、B−glu1はレバウジオシドAのC19位からグルコシル基を除去して、レバウジオシドBを生成することができる(図4A c〜d)。B−glu1はピキア属(Pichia)細胞の細胞間酵素なので、破壊ピキア属(Pichia)細胞はB−glu1酵素を放出し、これは、レバウジオシドAをレバウジオシドBに加水分解するために同じ酵素活性を有する(図8e)。
レバウジオシドIは組換えB−glu1酵素によって加水分解されて、レバウジオシドAを生成することができ、生成したAは加水分解されて、レバウジオシドBを生成することができる(図5B)。反応は、実施例1に記載されるように設定した。1g/LのレバウジオシドIを基質として反応に添加した。図5に示されるように、B−glu1はレバウジオシドIのC19位からグルコシル基を除去して、レバウジオシドAを生成することができ、続いて、レバウジオシドAのC19位の別のグルコシル基を除去して、レバウジオシドBを生成する(図5A d〜f)。レバウジオシドIは、24時間で完全にレバウジオシドAに変換され得る(図5A f)。B−glu1はピキア属(Pichia)細胞の細胞間酵素なので、破壊ピキア属(Pichia)細胞はB−glu1酵素を放出し、これは、レバウジオシドIをレバウジオシドBに加水分解するために同じ酵素活性を有する(図8f)。
レバウジオシドDは組換えB−glu1酵素によって加水分解されて、レバウジオシドB(図6B)及びReb Aを生成することができる。反応は、実施例1に記載されるように設定した。1g/LのレバウジオシドDを基質として反応に添加した。図6に示されるように、B−glu1はレバウジオシドDのC19位からグルコシル基を除去して、レバウジオシドを生成することができる(図6A c〜e)。B−glu1はピキア属(Pichia)細胞の細胞間酵素なので、破壊ピキア属(Pichia)細胞はB−glu1酵素を放出し、これは、レバウジオシドDをレバウジオシドBに加水分解するために同じ酵素活性を有する(図8g)。
レバウジオシドGは組換えB−glu1酵素及び破壊ピキア属(Pichia)細胞によって加水分解されて、ステビオール−13−グルコシドを生成することができる。生成したステビオール−13−グルコシドは継続して加水分解されて、ステビオールを生成することができる(図7B)。反応は、実施例1に記載されるように設定した。1g/LのレバウジオシドGを基質として反応に添加した。図7Aに示されるように、B−glu1はレバウジオシドGのC13及びC19位からグルコシル基を除去して、ステビオール−13−グルオシド(gluoside)を生成することができる(図7A b〜c)。生成したステビオール−13−グルコシド(gluocside)(S−13−G)は、ステビオールに変換される(図7A)。生成したステビオール−13−グルコシドは、24時間で完全にステビオールに変換される(図7A d)。B−glu1は、ステビオール−13−グルコシドのC13位から別のグルコシル基を除去する。B−glu1はピキア属(Pichia)細胞の細胞間酵素なので、破壊ピキア属(Pichia)細胞はB−glu1酵素を放出し、これは、レバウジオシドGをステビオール−13−グルコシドに加水分解し、継続してステビオールを生成するために同じ酵素活性を有する(図7A e)。
本開示は、食品、飼料、飲料、及び薬理学的な産業における適用性を有する。本開示は、一般に、βグルコシダーゼの加水分解を用いるステビオール配糖体の生合成のための方法に関する。
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Claims (37)
- ステビオール配糖体のグリコシル化を変更する方法であって、
a)第1の基質を産生するように改変された組換え微生物、藻類又は植物細胞を提供することと、
b)前記組換え微生物、藻類又は植物細胞を破壊してその細胞サイトゾルを放出させることであって、このようなサイトゾルが前記第1の基質を含有することと、
c)前記組換え微生物、藻類又は植物細胞から前記サイトゾルを得ることと、
d)前記第1の基質から少なくとも1つのグルコシル基を除去することにより対象の第2の基質を生成するのに十分な時間、前記サイトゾルをβグルコシダーゼに曝露することであって、このようなβグルコシダーゼが加水分解活性を有することと、
e)前記対象の第2の基質を捕集することと
を含む方法。 - 前記第1の基質がステビオール配糖体である、請求項1に記載の方法。
- 前記加水分解活性が、前記ステビオール配糖体のC19位からグルコシル基を除去する機能を果たす、請求項2に記載の方法。
- 前記加水分解活性が、前記ステビオール配糖体のC13位からグルコシル基を除去する機能を果たす、請求項2に記載の方法。
- 前記加水分解活性が、前記ステビオール配糖体のC19位又は前記ステビオール配糖体のC13位のいずれかからグルコシル基を除去する機能を果たす、請求項2に記載の方法。
- 前記加水分解活性が、前記ステビオール配糖体のC19位及び前記基質のC13位の両方からグルコシル基を除去する機能を果たす、請求項2に記載の方法。
- 前記加水分解活性が、ルブソシドのC19位からグルコシル基を除去して、ステビオール−13−グルオシド(gluoside)を生成する機能を果たす、請求項3に記載の方法。
- 前記加水分解活性が、ステビオシドのC19位からグルコシル基を除去して、ステビオールビオシドを生成する機能を果たす、請求項3に記載の方法。
- 前記加水分解活性が、Reb EのC19位からグルコシル基を除去して、ステビオールビオシドを生成する機能を果たす、請求項3に記載の方法。
- 前記加水分解活性が、Reb IのC19位からグルコシル基を除去して、Reb Aを生成する機能を果たす、請求項3に記載の方法。
- 前記加水分解活性が、Reb AのC19位からグルコシル基を除去して、Reb Bを生成する機能を果たす、請求項3に記載の方法。
- 前記加水分解活性が、ステビオール−13−グルオシド(gluoside)のC13位からグルコシル基を除去して、ステビオールを生成する機能を果たす、請求項4に記載の方法。
- 前記加水分解活性が、Reb DのC13位からグルコシル基を除去して、Reb B又はReb Aを生成する機能を果たす、請求項4に記載の方法。
- 前記加水分解活性が、Reb GのC19位及びC13位からグルコシル基を除去して、ステビオール−13−グルコシドを生成する機能を果たす、請求項5に記載の方法。
- 前記対象の第2の基質がReb Mである、請求項1に記載の方法。
- 前記対象の第2の基質がReb Bである、請求項1に記載の方法。
- 前記対象の第2の基質がReb Aである、請求項1に記載の方法。
- 酵素加水分解の速度を増大させるために、βガラクトシダーゼ又はペクチナーゼ酵素の使用をさらに含む、請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 形質転換細胞系においてステビオール配糖体を発現させることと、
前記細胞系を培地中で成長させることと、
前記対象の第2の基質を生じさせることと
をさらに含む、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。 - 前記第1の基質への前記βグルコシダーゼの曝露の時間が少なくとも6時間である、請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の基質への前記βグルコシダーゼの曝露の時間が少なくとも12時間である、請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の基質への前記βグルコシダーゼの曝露の時間が少なくとも18時間である、請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の基質への前記βグルコシダーゼの曝露の時間が少なくとも24時間である、請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象の第2の基質がステビオール配糖体である、請求項1に記載の方法。
- 前記βグルコシダーゼが、配列番号1に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項1〜24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記βグルコシダーゼが、配列番号3と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を有する、請求項1〜24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組換え微生物、藻類又は植物細胞が、細菌、酵母、糸状菌、シアノバクテリア藻類及び植物細胞からなる群から選択される、請求項1〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組換え微生物が、エシェリキア属(Escherichia)、サルモネラ属(Salmonella)、バチルス属(Bacillus)、アシネトバクター属(Acinetobacter)、ストレプトミセス属(Streptomyces)、コリネバクテリウム属(Corynebacterium)、メチロサイナス属(Methylosinus)、メチロモナス属(Methylomonas)、ロドコッカス属(Rhodococcus)、シュードモナス属(Pseudomonas)、ロドバクター属(Rhodobacter)、シネコシスティス属(Synechocystis)、サッカロミセス属(Saccharomyces)、ジゴサッカロミセス属(Zygosaccharomyces)、クルイベロミセス属(Kluyveromyces)、カンジダ属(Candida)、ハンゼヌラ属(Hansenula)、デバリオミセス属(Debaryomyces)、ムコール属(Mucor)、ピキア属(Pichia)、トルロプシス属(Torulopsis)、アスペルギルス属(Aspergillus)、アルツロボトリス属(Arthrobotlys)、ブレビバクテリア属(Brevibacteria)、ミクロバクテリウム属(Microbacterium)、アルスロバクター属(Arthrobacter)、シトロバクター属(Citrobacter)、エシェリキア属(Escherichia)、ヤロウイア属(Yarrowia)、クレブシエラ属(Klebsiella)、パンテア属(Pantoea)、サルモネラ属(Salmonella)、コリネバクテリウム属(Corynebacterium)、クロストリジウム属(Clostridium)、及びクロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)からなる群から選択される、請求項1〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象の第2の基質がReb Eである、請求項1に記載の方法。
- 前記第2の基質が、Reb E、Reb D4及びReb Mの混合物である、請求項1に記載の方法。
- 前記対象の第2の基質がReb D4である、請求項1に記載の方法。
- 前記対象の第2の基質がステビオール配糖体混合物であり、この混合物のステビオール配糖体の合わせた含量が、乾燥ベースの重量で、前記サイトゾル由来の濃縮物の他の成分よりも多い、請求項1に記載の方法。
- ステップe)の前記対象の第2の基質が粗生成物であり、ステップe)がさらに、i)前記粗生成物を精製すること、及びii)真空下で溶媒を除去して濃縮生成物を提供することを含む、請求項1〜32のいずれか一項に記載の方法。
- 前記粗生成物がカラムクロマトグラフィによって精製される、請求項33に記載の方法。
- 前記粗生成物が酸−塩基抽出によって精製される、請求項33に記載の方法。
- 前記粗生成物が真空蒸留によって精製される、請求項33に記載の方法。
- 半分取HPLCを用いて前記濃縮生成物を精製することをさらに含む、請求項33に記載の方法。
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