BR112019007504B1 - Método de preparação de uma composição de glicosídeo de esteviol - Google Patents

Método de preparação de uma composição de glicosídeo de esteviol Download PDF

Info

Publication number
BR112019007504B1
BR112019007504B1 BR112019007504-6A BR112019007504A BR112019007504B1 BR 112019007504 B1 BR112019007504 B1 BR 112019007504B1 BR 112019007504 A BR112019007504 A BR 112019007504A BR 112019007504 B1 BR112019007504 B1 BR 112019007504B1
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
rebaudioside
reb
udp
glycosyltransferase
steviol
Prior art date
Application number
BR112019007504-6A
Other languages
English (en)
Other versions
BR112019007504A2 (pt
Inventor
Guohong Mao
Jacob Edward Vick
Michael Batten
David Byun
Yang Luo
Yilin Wu
Beihua Zhang
Xiaodan Yu
Original Assignee
Conagen Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Conagen Inc filed Critical Conagen Inc
Publication of BR112019007504A2 publication Critical patent/BR112019007504A2/pt
Publication of BR112019007504B1 publication Critical patent/BR112019007504B1/pt

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L2/00—Non-alcoholic beverages; Dry compositions or concentrates therefor; Their preparation
    • A23L2/52—Adding ingredients
    • A23L2/60—Sweeteners
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/20—Carbocyclic rings
    • C07H15/24—Condensed ring systems having three or more rings
    • C07H15/256—Polyterpene radicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A21—BAKING; EDIBLE DOUGHS
    • A21D—TREATMENT, e.g. PRESERVATION, OF FLOUR OR DOUGH, e.g. BY ADDITION OF MATERIALS; BAKING; BAKERY PRODUCTS; PRESERVATION THEREOF
    • A21D13/00—Finished or partly finished bakery products
    • A21D13/06—Products with modified nutritive value, e.g. with modified starch content
    • A21D13/062—Products with modified nutritive value, e.g. with modified starch content with modified sugar content; Sugar-free products
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23G—COCOA; COCOA PRODUCTS, e.g. CHOCOLATE; SUBSTITUTES FOR COCOA OR COCOA PRODUCTS; CONFECTIONERY; CHEWING GUM; ICE-CREAM; PREPARATION THEREOF
    • A23G4/00—Chewing gum
    • A23G4/06—Chewing gum characterised by the composition containing organic or inorganic compounds
    • A23G4/10—Chewing gum characterised by the composition containing organic or inorganic compounds characterised by the carbohydrates used, e.g. polysaccharides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L27/00—Spices; Flavouring agents or condiments; Artificial sweetening agents; Table salts; Dietetic salt substitutes; Preparation or treatment thereof
    • A23L27/30—Artificial sweetening agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L27/00—Spices; Flavouring agents or condiments; Artificial sweetening agents; Table salts; Dietetic salt substitutes; Preparation or treatment thereof
    • A23L27/30—Artificial sweetening agents
    • A23L27/33—Artificial sweetening agents containing sugars or derivatives
    • A23L27/36—Terpene glycosides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/20—Carbocyclic rings
    • C07H15/24—Condensed ring systems having three or more rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8245—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified carbohydrate or sugar alcohol metabolism, e.g. starch biosynthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12N9/1062—Sucrose synthase (2.4.1.13)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1081—Glycosyltransferases (2.4) transferring other glycosyl groups (2.4.99)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2445—Beta-glucosidase (3.2.1.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/18—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a glycosyl transferase, e.g. alpha-, beta- or gamma-cyclodextrins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C12P19/56—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen atom of the saccharide radical directly bound to a condensed ring system having three or more carbocyclic rings, e.g. daunomycin, adriamycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/163—Sugars; Polysaccharides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12Y204/01013—Sucrose synthase (2.4.1.13)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12Y204/01028—Glucosyl-DNA beta-glucosyltransferase (2.4.1.28)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01021—Beta-glucosidase (3.2.1.21)

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

A presente invenção se relaciona com a produção de glicosídeo de esteviol rebaudiosídeos D4, WB1 e WB2 e à produção de rebaudiosídeo M a partir de Reb D4.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[001] Este pedido reivindica prioridade sobre o Pedido Provisório dos EUA No. 62/408,179 depositado em 14 de outubro de 2016, e o Pedido Provisório dos EUA No. 62/555,809 depositado em 8 de setembro de 2017, os conteúdos de cada um dos quais são incorporados por referência aqui na sua totalidade.
CAMPO DA INVENÇÃO
[002] O campo da invenção se relaciona com métodos e processos úteis na produção de glicosídeos de esteviol específicos. Mais especificamente, a presente divulgação proporciona a produção de um rebaudiosídeo anteriormente desconhecido, D4 rebaudiosídeo ("Reb D4") que pode então ser convertido em rebaudiosídeo M ("Reb M") via conversão enzimática. A presente divulgação também revela para a produção de rebaudiosídeos anteriormente desconhecidos, rebaudiosídeo WB1 ("Reb WB1") e rebaudiosídeo WB2 ("Reb WB2").
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[003] A presente divulgação é focada na produção de novos esteviosídeos Reb D4, Reb WB1 e Reb WB2 e na conversão de Reb D4 para Reb M. Em particular, a presente divulgação se relaciona com a síntese de Reb D4 e o seu consequente uso na produção de Reb M.
[004] Os glicosídeos de esteviol são produtos naturais isolados de folhas de Stevia rebaudiana e são amplamente usados como edulcorantes de alta intensidade e baixa caloria em comida, ração e bebidas. Glicosídeos de esteviol de ocorrência natural têm a mesma estrutura de base diterpeno (esteviol), mas diferem no número e na estrutura de modificações de resíduos de carboidrato (por exemplo, resíduos de glicose, ramnose e xilose) nas posições C13 e C19 da estrutura principal de esteviol. Os glicosídeos de esteviol com estruturas conhecidas incluem esteviosídeo, rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo B, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo F, rebaudiosídeo M e dulcosídeo A. Em termos de utilização comercial, o rebaudiosídeo M isoladamente tem sido geralmente considerado seguro (estado 'GRAS').
[005] Com base no peso seco, esteviosídeo, rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo C e dulcosídeo A são responsáveis por 9,1, 3,8, 0,6 e 0,30 por cento do peso total dos glicosídeos de esteviol nas folhas de Stevia do tipo selvagem, respectivamente, enquanto os outros glicosídeos de esteviol, como Reb M, estão presentes em quantidades significativamente menores. Extratos da planta Stevia rebaudiana estão comercialmente disponíveis, onde tais extratos contêm tipicamente esteviosídeo e rebaudiosídeo A como componentes primários. Os outros glicosídeos de esteviol conhecidos estão tipicamente presentes no extrato de stevia como componentes minoritários ou vestigiais. Por exemplo, a quantidade de rebaudiosídeo A em preparações comerciais pode variar de cerca de 20% a mais de 90% do conteúdo total de glicosídeos de esteviol, enquanto a quantidade de rebaudiosídeo B é tipicamente de aproximadamente 1-2%, a quantidade de rebaudiosídeo C pode ser cerca de 7-15% e a quantidade de rebaudiosídeo D pode ser cerca de 2% do total de glicosídeos de esteviol. Em tais extratos, o rebaudiosídeo M está presente apenas em quantidades extremamente pequenas. Curiosamente, o Rebaudiosídeo E é também um dos glicosídeos de esteviol menos abundantes presentes nas variedades de plantas Stevia rebaudiana, representando menos de 0,5% do total de glicosídeos.
[006] Como edulcorantes naturais, diferentes glicosídeos de esteviol têm diferentes graus de doçura, "sensação na boca" e sabores residuais específicos associados a cada espécie de rebaudiosídeo testada. Em relação ao açúcar de mesa (ou seja, "sacarose"), a doçura dos glicosídeos de esteviol é significativamente maior. Por exemplo, o esteviosídeo é 100-150 vezes mais doce do que a sacarose, mas tem um sabor residual amargo depois - como observado em testes de sabor, enquanto rebaudiosídeos A e E são 250-450 vezes mais doces do que a sacarose tendo sabor residual muito melhor do que esteviosídeo, no entanto, um sabor residual perceptível ainda está presente. Desse modo, os perfis gustativos de quaisquer extratos de stevia são profundamente afetados pelo teor relativo dos glicosídeos de esteviol no extrato, que por sua vez podem ser afetados pelas condições ambientais experimentadas pelas plantas subjacentes e pelo processo de extração usado. Estas variações na produção de plantas, condições climáticas e condições de extração podem levar a composições inconsistentes dos glicosídeos de esteviol nos extratos de stevia, de tal forma que o perfil de sabor varia fortemente entre diferentes lotes de produtos de extração.
[007] O perfil de sabor dos extratos de stevia também pode ser afetado por contaminantes derivados de plantas ou derivados do ambiente (como pigmentos, lipídeos, proteínas, fenólicos e sacarídeos) que permanecem no produto após o processo de extração. Estes contaminantes têm tipicamente os seus próprios sabores desagradáveis indesejados para o uso do extrato de stevia como edulcorante em produtos de consumo. Além disso, o custo de isolar combinações individuais ou específicas de rebaudiosídeos de esteviol que não são abundantes em extratos de stevia é proibitivo em termos de custo e recursos. Dado que há uma qualidade e disponibilidade limitada de alguns glicosídeos de esteviol específicos, a oferta comercial pode ser melhor abordada por bioconversão, onde enzimas naturais ou micróbios específicos podem ser modificados para transportar as enzimas necessárias e usar processos de fermentação comercialmente significativos para aumentar especificamente a produção de glicosídeos de interesse. Por exemplo, a bioconversão de esteviosídeo para Reb E foi relatada anteriormente (ver, por exemplo, Publicações de Pedido PCT Nos. WO/2015/065650 e WO/2015/171555) usando enzimas obtidas a partir de micróbios modificados. Alternativamente, outros meios sintéticos não biológicos podem ser usados para desenvolver glicosídeos de esteviol de interesse.
[008] A partir de uma perspectiva biológica, todos os glicosídeos de esteviol são formados por uma série de reações de glicosilação de esteviol, que tipicamente são catalisadas por enzimas UDP-glicosiltransferase (UGT) usando uridina 5'- difosfoglicose (UDP-glicose) como um doador da porção de açúcar. Nas plantas, as UGTs são um grupo muito diferente de enzimas que transferem um resíduo de glicose da UDP-glicose para o esteviol. Nestas reações, o esteviosídeo é frequentemente um intermediário na biossíntese de vários compostos rebaudiosídeos. Por exemplo, a glicosilação de esteviosídeo no C-3' na C-13-O-glicose de esteviosídeo produz rebaudiosídeo A; enquanto a glicosilação no C-2' na posição de 19-O-glicose do esteviosídeo produz rebaudiosídeo E.
[009] Como aqui descrito, a glicosilação específica e dirigida do rebaudiosídeo E (na C-19-O-glicose) pode produzir rebaudiosídeo Reb D4 e a glicosilação adicional de Reb D4 pelas enzimas UGT produz o rebaudiosídeo M. No entanto, até a presente divulgação, passos de síntese para a produção enzimática de D4 ainda não haviam sido relatados.
[0010] De acordo com a presente descrição, uma abordagem prática para melhorar a qualidade do sabor dos extratos de stevia é aumentar o rendimento dos compostos de rebaudiosídeo que têm características de sabor mais desejáveis em geral e tornar esta via uma via sintética mais produtiva. Desses glicosídeos de esteviol testados, muitos acreditam que Reb M tem o sabor e características químicas mais desejáveis para uso em alimentos e bebidas. Como afirmado acima, no entanto, a planta tem quantidades extremamente pequenas deste composto presentes em suas folhas e, portanto, um biossintético alternativo precisa ser desenvolvido para a produção em larga escala deste glicosídeo, bem como para proporcionar edulcorantes alternativos para a indústria alimentar e de bebidas.
[0011] Dessa forma, existe uma necessidade de glicosídeos de esteviol com perfis de sabor melhores e mais consistentes para serem desenvolvidos como produtos comerciais e para tais glicosídeos de esteviol utilizarem um substrato de partida relativamente comum, tal como glicosídeos de esteviol mais abundantes como molécula de partida, de modo que tal produção de glicosídeos desejáveis possa ser comercialmente tão rentável quanto possível. A presente divulgação proporciona um método para produzir o rebaudiosídeo M a partir de um glicosídeo de esteviol anteriormente desconhecido, Reb D4, bem como métodos para produzir Reb D4, Reb WB1 e Reb WB2.
[0012] Indo mais longe, o processo de extração a partir de plantas, tipicamente emprega técnicas de extração sólido-líquido usando solventes como hexano, clorofórmio e etanol para recuperação de glicosídeos de esteviol (Catchpole et al., 2003). No entanto, a extração de solvente é ela própria intensiva em energia, leva a problemas de eliminação de resíduos tóxicos, requer extensiva área cultivada para que as próprias plantas sejam cultivadas e produz um produto que requer purificação adicional para componentes menores serem recuperados. Assim, novos métodos de produção também são necessários para reduzir os custos da produção de glicosídeos de esteviol e diminuir o impacto ambiental do cultivo e processamento em larga escala (Yao et al., 1994). Uma dessas potenciais soluções é o uso da tecnologia de fermentação de bioconversão que permite a produção em certas espécies microbianas que aumenta a seletividade, abundância e pureza dos glicosídeos de esteviol disponíveis para a comercialização.
[0013] Além do acima exposto, enquanto os consumidores aprovam e buscam ativamente fontes naturais e biológicas para alimentos, rações, sabor ou componentes medicinais, eles também estão preocupados com a obtenção, perfil consistente de sabor e produção ambientalmente sustentável. Nesta situação, os métodos de fermentação e produção microbiana da presente divulgação proporcionam Reb M em quantidades úteis para uma variedade de indústrias e investigação, ao fazê-lo de uma forma mais natural do que as técnicas correntes de síntese inorgânica ou de extração de plantas.
[0014] Desse modo, existe uma necessidade para o desenvolvimento de um novo método para produzir Reb M de modo econômico e conveniente para possibilitar adicionalmente o consumo humano e animal.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0015] Aspectos da divulgação se relacionam com glicosídeos de esteviol, métodos de produção de glicosídeos de esteviol e composições compreendendo os glicosídeos de esteviol. Em alguns aspectos, a presente divulgação abrange métodos de produção de Reb M a partir do glicosídeo de esteviol Reb D4, anteriormente não divulgado.
[0016] Em particular, a presente divulgação proporciona a produção do glicosídeo de esteviol rebaudiosídeo D4 "Reb D4" que é identificado como (ácido 13- [(2-O-β-D-glicopiranosil-β-D-glicopiranosil)oxi] ent-caur- 16-en-19-óico - éster [(2-O-β-D-glicopiranosil-3-O-β-D- glicopiranosil-β-D-glicopiranosil)]) e a sua conversão para Reb M por uma UDP-glicosiltransferase específica (Ver Fig. 1). A presente invenção também proporciona a produção de Reb WB1 e Reb WB2, tal como aqui descrito.
[0017] Os métodos correntes aqui descritos proporcionam uma abordagem para a síntese de glicosídeos de esteviol específicos usando vias sintéticas.
[0018] Uma modalidade alternativa é produzir o rebaudiosídeo D4 a partir do rebaudiosídeo W utilizando uma via através de RebWB1.
[0019] Uma modalidade adicional é produzir o rebaudiosídeo M a partir do rebaudiosídeo D4.
[0020] Em uma modalidade da presente divulgação, é proporcionado um método que permite a produção de Reb M usando uma via através de Reb WB2, Reb WB1 e Reb D4.
[0021] Em uma modalidade alternativa, a beta- glicosidase é usada para catalisar a bioconversão enzimática de Reb W para Reb WB1, ver FIG. 14
[0022] Em alguns aspectos, a divulgação proporciona um glicosídeo de esteviol Reb D4 tendo a estrutura:
Figure img0001
[0023] Em algumas modalidades, a divulgação proporciona uma composição compreendendo Reb D4, opcionalmente em que o referido teor de Reb D4 na composição é pelo menos 70% (por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%) puro. Em algumas modalidades, a divulgação proporciona um produto de consumo compreendendo uma quantidade de edulcorante de Reb D4. Em algumas modalidades, o produto de consumo é selecionado do grupo que consiste em bebidas, produtos de confeitaria, produtos de panificação, biscoitos e gomas de mascar.
[0024] Em outros aspectos, a divulgação proporciona uma composição compreendendo uma mistura de Reb D4 e Reb M. Em algumas modalidades, a divulgação proporciona um produto de consumo compreendendo uma quantidade de edulcorante de uma mistura de Reb D4 e Reb M. Em algumas modalidades, o produto de consumo é selecionado do grupo que consiste em bebidas, produtos de confeitaria, produtos de panificação, biscoitos e gomas de mascar.
[0025] Em ainda outros aspectos, a divulgação proporciona um glicosídeo de esteviol Reb WB1 tendo a estrutura:
Figure img0002
[0026] Em algumas modalidades, a divulgação proporciona uma composição compreendendo Reb WB1, opcionalmente em que o referido teor de Reb WB1na composição é pelo menos 70% (por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%) puro. Em algumas modalidades, a divulgação proporciona um produto de consumo compreendendo uma quantidade de edulcorante de Reb WB1. Em algumas modalidades, o produto de consumo é selecionado do grupo que consiste em bebidas, produtos de confeitaria, produtos de panificação, biscoitos e gomas de mascar.
[0027] Em ainda outros aspectos, a divulgação proporciona um glicosídeo de esteviol Reb WB2 tendo a estrutura:
Figure img0003
[0028] Em algumas modalidades, a divulgação proporciona uma composição compreendendo Reb WB2, opcionalmente em que o referido teor de Reb WB2 na composição é pelo menos 70% (por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%) puro. Em algumas modalidades, a divulgação proporciona um produto de consumo compreendendo uma quantidade de edulcorante de Reb WB2. Em algumas modalidades, o produto de consumo é selecionado do grupo que consiste em bebidas, produtos de confeitaria, produtos de panificação, biscoitos e gomas de mascar.
[0029] Em alguns aspectos, a divulgação proporciona um glicosídeo de esteviol de interesse produzido por um sistema celular transformado crescendo em um meio. Em algumas modalidades, o referido sistema celular transformado é selecionado do grupo que consiste em: leveduras, plantas produzindo glicosídeo que não esteviol, algas e bactérias. Em algumas modalidades, o referido sistema celular é uma bactéria e é selecionada do grupo que consiste em Escherichia; Salmonella; Bacillus; Acinetobacter; Streptomyces; Corynebacterium; Methylosinus; Methylomonas; Rhodococcus; Pseudomonas; Rhodobacter; Synechocystis; Saccharomyces; Zygosaccharomyces; Kluyveromyces; Candida; Hansenula; Debaryomyces; Mucor; Pichia; Torulopsis; Aspergillus; Arthrobotlys; Brevibacteria; Microbacterium; Arthrobacter; Citrobacter; Escherichia; Klebsiella; Pantoea; Salmonella Corynebacterium; Clostridium; e Clostridium acetobutylicum. Em algumas modalidades, o referido sistema celular é E. Coli. Em algumas modalidades, o referido glicosídeo de esteviol é Reb D4. Em algumas modalidades, o referido glicosídeo de esteviol é Reb WB1. Em algumas modalidades, o referido glicosídeo de esteviol é Reb WB2. Em algumas modalidades, o material de origem é esteviol. Em algumas modalidades, o referido teor de glicosídeo de esteviol é, pelo menos, 70% puro. Em algumas modalidades, o método de produção compreende adicionalmente: i) purificar um produto em bruto; e, ii) remover solventes sob vácuo para proporcionar um produto concentrado. Em algumas modalidades, o referido produto em bruto é purificado por cromatografia em coluna. Em algumas modalidades, o referido produto em bruto é purificado por extração ácido-base. Em algumas modalidades, o referido produto em bruto é purificado por destilação sob vácuo. Em algumas modalidades, o método de produção compreende adicionalmente purificar o referido glicosídeo de esteviol usando uma HPLC semi-preparativa. Em outros aspectos, a divulgação proporciona um produto de consumo compreendendo uma quantidade de edulcorante do glicosídeo de esteviol. Em algumas modalidades, o produto de consumo é selecionado do grupo que consiste em bebidas, produtos de confeitaria, produtos de panificação, biscoitos e gomas de mascar.
[0030] Em outros aspectos, a divulgação proporciona um polipeptídeo recombinante CP1 compreendendo uma sequência de DNA possuindo pelo menos 80% (por exemplo, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%) de identidade com a SEQ ID NO:3. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos do polipeptídeo recombinante CP1 tem pelo menos 80% (por exemplo, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%) de identidade com a SEQ ID NO:4. Em algumas modalidades, o polipeptídeo recombinante CP1 tem uma ou mais mutações em uma ou mais posições listadas na Tabela 2.
[0031] Ainda em outros aspectos, a divulgação proporciona um método biossintético para produzir um glicosídeo de esteviol de interesse compreendendo expressar uma enzima CP1 em um sistema celular transformado; crescer o sistema celular em um meio contendo um substrato; e produzir o glicosídeo de esteviol de interesse. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente a incubação de uma sacarose sintase recombinante com o substrato. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente a incubação de uma UDP-glicosiltransferase recombinante UGT85C2 com a sacarose sintase, o substrato e o polipeptídeo recombinante CP1. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente a adição de uma enzima beta- glicosidase à mistura de reação. Em algumas modalidades, a sacarose sintase é selecionada do grupo que consiste em uma sacarose sintase l de Arabidopsis, uma sacarose sintase 3 de Arabidopsis e uma sacarose sintase de Vigna radiate. Em algumas modalidades, a sacarose sintase é uma sacarose sintase l de Arabidopsis thaliana. Em algumas modalidades, os glicosídeos de esteviol produzidos são uma mistura de Reb D4 e Reb M. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente: i) purificar um produto em bruto; e, ii) remover solventes sob vácuo para proporcionar um produto concentrado. Em algumas modalidades, o referido produto em bruto é purificado por cromatografia em coluna. Em algumas modalidades, o referido produto em bruto é purificado por extração ácido-base. Em algumas modalidades, o referido produto em bruto é purificado por destilação sob vácuo. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente purificar o referido glicosídeo de esteviol usando uma HPLC semi-preparativa. Em algumas modalidades, o referido glicosídeo de esteviol é Reb WB1. Em algumas modalidades, o referido glicosídeo de esteviol é Reb WB2. Em algumas modalidades, o referido glicosídeo de esteviol é Reb D4. Em algumas modalidades, o referido glicosídeo de esteviol é Reb M. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente o uso de HV1 (SEQ ID NO:9). Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente o uso de UGT76G1 (SEQ ID NO:1).
[0032] Em outros aspectos, a invenção proporciona um método de produção de rebaudiosídeo M, compreendendo cultivar uma célula recombinante sob condições de crescimento adequadas, em que a referida célula recombinante exibe a capacidade para produzir glicosídeos de esteviol, o método compreendendo o contato da referida célula recombinante com uma composição de reação contendo esteviosídeo, sacarose sintase e sacarose; em que a referida célula recombinante expressa uma primeira UDP- glicosiltransferase (UGT) ou uma sua porção cataliticamente ativa capaz de usar o referido substrato de esteviosídeo para produzir rebaudiosídeo E; em que a referida célula recombinante expressa uma segunda UDP-glicosiltransferase (UGT) ou uma sua porção cataliticamente ativa capaz de usar o referido Rebaudiosídeo E para produzir rebaudiosídeo D4; e, em que a referida célula recombinante expressa uma terceira UDP-glicosiltransferase (UGT) ou uma sua porção cataliticamente ativa capaz de usar o referido Rebaudiosídeo D4 para produzir rebaudiosídeo M. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente um gene de sacarose sintase ou uma sua porção cataliticamente ativa sendo expressa na referida célula recombinante. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente uma sacarose sintase a ser adicionada à composição da reação.
[0033] Em alguns aspectos, a divulgação proporciona Reb M produzido por um método descrito no parágrafo acima ou como de outro modo aqui divulgado.
[0034] Em outros aspectos, a divulgação proporciona uma célula recombinante que expressa uma via biossintética para produzir Reb M (por exemplo, através da conversão de Reb D4 para Reb M ou através da conversão de Reb E para Reb D4 para Reb M). Em algumas modalidades, a célula expressa uma ou mais de uma primeira UDP-glicosiltransferase (UGT) ou uma sua porção cataliticamente ativa capaz de usar o referido substrato de esteviosídeo para produzir rebaudiosídeo E, uma segunda UDP-glicosiltransferase (UGT) ou uma sua porção cataliticamente ativa capaz de usar o referido Rebaudiosídeo E para produzir o rebaudiosídeo D4 e uma terceira UDP- glicosiltransferase (UGT) ou uma sua porção cataliticamente ativa capaz de usar o referido Rebaudiosídeo D4 para produzir o rebaudiosídeo M. Em algumas modalidades, a célula é uma célula de levedura. Em algumas modalidades, a célula é uma célula bacteriana. Em algumas modalidades, a célula é uma célula de planta.
[0035] Em outros aspectos, a divulgação proporciona um método para produzir Reb M usando as enzimas e substratos descritos na FIG. 14, ou um seu subconjunto (por exemplo, começando com Reb W, Reb WB1 ou Reb D4 e/ou utilizando UGT76G1, CP1 ou CR1). Em algumas modalidades, a Reb M é produzida usando uma mistura de reação in vitro contendo as enzimas e substratos descritos na FIG. 14, ou um seu subconjunto (por exemplo, começando com Reb W, Reb WB1 ou Reb D4 e/ou utilizando UGT76G1, CP1 ou CR1). Em algumas modalidades, o Reb M é produzido in vivo em uma célula que expressa as enzimas descritas na FIG. 14, ou um seu subconjunto (por exemplo, UGT76G1, CP1 ou CR1), em que a célula é incubada com um substrato descrito na FIG. 14 (por exemplo, Reb W, Reb WB1 ou Reb D4). Em algumas modalidades, a célula é uma célula de levedura. Em algumas modalidades, a célula é uma célula bacteriana. Em algumas modalidades, a célula é uma célula de planta.
[0036] Em termos de produto/utilidade comercial, existem várias dezenas de produtos contendo glicosídeos de esteviol no mercado nos Estados Unidos e podem ser usados em tudo, desde analgésicos a repelentes de pragas, bem como em alimentos e como suplemento dietético. Os produtos contendo glicosídeos de esteviol podem ser aerossóis, líquidos ou formulações granulares.
[0037] Quanto ao sistema celular na modalidade, em algumas modalidades, ele é selecionado do grupo que consiste em bactérias, leveduras e uma sua combinação, ou qualquer sistema celular que permita a transformação genética com os genes selecionados e, posteriormente, a produção biossintética dos glicosídeos de esteviol desejados a partir de esteviol. Em um sistema microbiano mais preferencial, E. coli são usadas para produzir os compostos glicosídeos de esteviol desejados.
[0038] Embora a divulgação seja susceptível a várias modificações e formas alternativas, modalidades específicas são mostradas a título de exemplo nos desenhos e serão aqui descritas em detalhe. Deve ser entendido, no entanto, que os desenhos e descrição detalhada aqui apresentados não pretendem limitar a divulgação a modalidades particulares divulgadas, mas, pelo contrário, a intenção é cobrir todas as modificações, equivalentes e alternativas que se enquadram na essência e âmbito da presente divulgação como definido pelas reivindicações anexas.
[0039] Outras características e vantagens da presente invenção se tornarão evidentes na seguinte descrição detalhada de modalidades preferidas da presente invenção, tomadas com referência aos desenhos anexos.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0040] Figura 1. Mostra a estrutura de rebaudiosídeo D4 (ácido 13-[(2-O-β-D-glicopiranosil-β-D- glicopiranosil)oxi] ent-caur-16-en-19-óico -[éster (2-O-β- D-glicopiranosil-3-O-β-D-glicopiranosil-β-D- glicopiranosil)]).
[0041] FIG. 2. Mostra as estruturas de rebaudiosídeos WB1 e WB2.
[0042] FIG. 3. Mostra os perfis de HPLC dos produtos de hidrólise do rebaudiosídeo W. O rebaudiosídeo W é hidrolisado pela enzima B-glu1. A: Padrão de rebaudiosídeo W ("W"); B-D: O rebaudiosídeo W foi hidrolisado pela enzima B-glu1 recombinante em 1 hora (B), 6 horas (C) e 24 horas (D).
[0043] FIG. 4. Mostra o perfil de HPLC da bioconversão do rebaudiosídeo WB2 ("WB2") para rebaudiosídeo WB1 ("WB1") pela UGT85C2. O rebaudiosídeo WB2 foi incubado com a enzima UGT85C2 em 0 hora (A), 2 horas (B), 6 horas (C) e 18 horas (D).
[0044] FIG. 5. Mostra a análise LC-MS do rebaudiosídeo WB1 e WB2.
[0045] FIG. 6. Mostra os perfis de HPLC da bioconversão do rebaudiosídeo WB1 para rebaudiosídeo D4 pela enzima HV1. A: Padrão de rebaudiosídeo WB1 ("WB1"); B-C: O rebaudiosídeo WB1 foi convertido pela enzima HV1 em 2 horas (B) e 6 horas (C).
[0046] FIGs. 7A e 7B. Mostram a estrutura e os dados de LC-MS em torno da molécula Reb D4.
[0047] FIG. 8. Mostra a estrutura da enzima UDP UGT71G1. A orientação padrão com Histidina localizada na esquerda e UDP na direita é mostrada.
[0048] FIG. 9. Mostra a estrutura da enzima UGT76G1, destacando as hélices alfa e as folhas beta na estrutura de UGT76G1.
[0049] FIG. 10. Mostra uma comparação das enzimas CP1 e UGT76G1. A estrutura do cristal de UGT76G1 é de cor cinza, enquanto o modelo CP1 é de cor preta.
[0050] FIG. 11. Mostra a Estrutura do Cristal de UGT76G1 e sua interação com a molécula CP1. Esta estrutura do cristal destaca a ausência de folhas beta no modelo CP1. A estrutura do cristal de UGT76G1 é de cor cinza, enquanto o modelo CP1 é de cor preta.
[0051] FIG. 12. Mostra o Rebaudiosídeo D4 no centro de reação da enzima CP1. A molécula cinza escura localizada na parte inferior da imagem é o rebaudiosídeo D4.
[0052] FIG. 13. Mostra a produção in vitro de Reb M a partir de Reb D4 catalisada por uma combinação de um polipeptídeo de UGT76G1 recombinante, um CP1 recombinante, e um mutante (CR1). A: mostra os padrões de rebaudiosídeo D ("D") e rebaudiosídeo M ("M"). B: mostra o padrão de rebaudiosídeo D4 ("D4"). Reb M enzimaticamente produzido por UGT76G1 em 30 min (C) e 1 h (F), Reb M enzimaticamente produzido por CP1 em 30 min (D) e 1 h (G). Reb M enzimaticamente produzido por CR1 aos 30 min (E) e 1 h (H).
[0053] FIG. 14. Mostra a Via Sintética para a via de biossíntese do Rebaudiosídeo M a partir de Rebaudiosídeo W.
[0054] FIG. 15 Mostra as principais correlações GHMBC de Reb WB2.
[0055] FIG. 16 Mostra as principais correlações GHMBC de Reb WB1.
[0056] FIG. 17 Mostra as principais correlações TOCSY e GHMBC de Reb D4.
DESCRIÇÃO DETALHADA DE CERTAS MODALIDADES DA INVENÇÃO Explicação dos Termos Aqui Usados:
[0057] Os glicosídeos de esteviol são uma classe de compostos químicos responsáveis pelo sabor doce das folhas da planta sul-americana Stevia rebaudiana (Asteraceae) e podem ser usados como edulcorantes em alimentos, rações e bebidas.
Definições:
[0058] "Sistema celular" é qualquer célula que fornece a expressão de proteínas ectópicas. Este inclui bactérias, leveduras, células vegetais e células animais. Este inclui células procarióticas e eucarióticas. Este inclui também a expressão in vitro de proteínas baseadas em componentes celulares, como os ribossomos.
[0059] "Sequência codificante" é para ser dado o seu significado normal e habitual para um perito na técnica, e é usado, sem limitação, para se referir a uma sequência de DNA que codifica para uma sequência de aminoácidos específica.
[0060] "Crescer o Sistema Celular". O crescimento inclui proporcionar um meio adequado que permita que as células se multipliquem e se dividam. Também inclui proporcionar recursos para que células ou componentes celulares possam traduzir e produzir proteínas recombinantes.
[0061] "Expressão de Proteína". A produção de proteínas pode ocorrer após a expressão de genes. Consiste nas etapas após o DNA ter sido transcrito para o RNA mensageiro (mRNA). O mRNA é então traduzido em cadeia de polipeptídeos, que são finalmente dobradas em proteínas. O DNA está presente nas células por meio da transfecção - um processo de introdução deliberada de ácidos nucléicos nas células. O termo é frequentemente usado para métodos não virais em células eucarióticas. Pode também se referir a outros métodos e tipos de células, embora outros termos sejam preferidos: "transformação" é mais frequentemente usada para descrever a transferência de DNA não viral em bactérias, células eucarióticas não animais, incluindo células vegetais. Nas células animais, a transfecção é o termo preferido, uma vez que transformação é também usada para referir a progressão para um estado canceroso (carcinogênese) nestas células. A transdução é frequentemente usada para descrever a transferência de DNA mediada por vírus. Transformação, transdução e infecção viral estão incluídas na definição de transfecção para este pedido.
[0062] "Levedura". De acordo com a presente divulgação, uma levedura como aqui reivindicada são microrganismos eucarióticos unicelulares classificados como membros do reino dos fungos. Leveduras são organismos unicelulares que evoluíram de ancestrais multicelulares, mas com algumas espécies úteis para a divulgação atual sendo aquelas que têm a capacidade de desenvolver características multicelulares pela formação de cadeias de células gemuladas conectadas conhecidas como pseudo-hifas ou hifas falsas.
[0063] "Enzimas UGT". Os nomes das enzimas UGT usados na presente divulgação são consistentes com o sistema de nomenclatura adotado pelo Comitê de Nomenclatura de UGT (Mackenzie et al., "The UDP glycosyltransferase gene super family: recommended nomenclature updated based on evolutionary divergence," PHARMACOGENETICS, 1997, vol. 7, pp. 255-269), que classifica os genes UGT pela combinação de um número para a família, uma letra indicando uma subfamília e um número para um gene individual. Por exemplo, o nome "UGT76Gl" se refere a uma enzima UGT codificada por um gene pertencente à família UGT número 76 (que é de origem vegetal), subfamília G e número de gene l.
Termos Estruturais:
[0064] Como usado no presente documento, as formas singulares "um/uma" e "o/a" incluem referências plurais, a menos que o conteúdo dite claramente o contrário.
[0065] Na medida em que o termo "incluir", "ter" ou semelhante é usado na descrição ou nas reivindicações, tal termo pretende ser inclusivo de uma maneira semelhante ao termo "compreende" como "compreende" é interpretado quando empregue como uma palavra de transição em uma reivindicação.
[0066] A palavra "exemplificativo" é usada aqui para significar "servir como um exemplo, exemplo ou ilustrativo". Qualquer modalidade aqui descrita como "exemplificativa" não é necessariamente para ser interpretada como preferida ou vantajosa em relação a outras modalidades.
[0067] Ao termo "complementar" deve ser dado o seu significado ordinário e habitual de uma pessoa de habilidade comum na técnica, e é usado sem limitação para descrever a relação entre bases de nucleotídeos que são capazes de hibridizar entre si. Por exemplo, com respeito ao DNA, a adenosina é complementar à timina e a citosina é complementar à guanina. Da mesma forma, a tecnologia em questão também inclui fragmentos de ácido nucleico isolados que são complementares às sequências completas como relatado na Listagem de Sequências anexa, bem como às sequências de ácido nucleico substancialmente semelhantes.
[0068] Aos termos "ácido nucleico" e "nucleotídeo" devem ser dados os seus significados ordinários e habituais de uma pessoa de habilidade comum na técnica, e são usados sem limitação para se referirem a desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos e seus polímeros quer na forma de fita simples ou dupla. A menos que especificamente limitado, o termo abrange ácidos nucleicos contendo análogos conhecidos de nucleotídeos de ocorrência natural que têm propriedades de ligação semelhantes ao ácido nucleico de referência e são metabolizados de uma maneira semelhante aos nucleotídeos de ocorrência natural. Salvo indicação em contrário, uma sequência de ácido nucleico particular também engloba implicitamente variantes modificadas ou degeneradas de forma conservativa (por exemplo, substituições de códons degenerados) e sequências complementares, bem como a sequência explicitamente indicada.
[0069] Ao termo "isolado" deve ser dado o seu significado ordinário e habitual de uma pessoa de habilidade comum na técnica, e quando usado no contexto de um ácido nucleico isolado ou de um polipeptídeo isolado, é usado sem limitação para se referir a um ácido nucleico ou polipeptídeo que, pela mão do homem, existe separado do seu ambiente nativo e, portanto, não é um produto da natureza. Um ácido nucleico ou polipeptídeo isolado pode existir em uma forma purificada ou pode existir em um ambiente não nativo tal como, por exemplo, em uma célula hospedeira transgênica.
[0070] Os termos "incubar" e "incubação" como aqui usados significam um processo de mistura de duas ou mais entidades químicas ou biológicas (tal como um composto químico e uma enzima) e permitindo estas interagir em condições favoráveis para produzir uma composição de glicosídeo de esteviol.
[0071] O termo "variante degenerada" se refere a uma sequência de ácido nucleico possuindo uma sequência de resíduos que difere de uma sequência de ácido nucleico de referência por uma ou mais substituições de códons degenerados. Substituições de códons degenerados podem ser conseguidas gerando-se sequências nas quais a terceira posição de um ou mais códons selecionados (ou todos) é substituída por resíduos de base mista e/ou desoxiinosina. Uma sequência de ácido nucleico e todas as suas variantes degeneradas irão expressar o mesmo aminoácido ou polipeptídeo.
[0072] Aos termos "polipeptídeo", "proteína" e "peptídeo" devem ser dados os seus significados ordinários e habituais de uma pessoa de habilidade comum na técnica; os três termos são por vezes usados indistintamente e são usados sem limitação para se referirem a um polímero de aminoácidos ou análogos de aminoácidos, independentemente do seu tamanho ou função. Embora "proteína" seja frequentemente usado em referência a polipeptídeos relativamente grandes, e "peptídeo" seja frequentemente usado em referência a polipeptídeos pequenos, a utilização destes termos na técnica se sobrepõe e varia. O termo "polipeptídeo", tal como aqui usado, se refere a peptídeos, polipeptídeos e proteínas, salvo indicação em contrário. Os termos "proteína", "polipeptídeo" e "peptídeo" são aqui indistintamente usados quando se refere a um produto polinucleotídeo. Assim, polipeptídeos exemplificativos incluem produtos de polinucleotídeos, proteínas de ocorrência natural, homólogos, ortólogos, parálogos, fragmentos e outros equivalentes, variantes e análogos dos anteriormente mencionados.
[0073] Os termos "fragmento de polipeptídeo" e "fragmento", quando usados em referência a um polipeptídeo de referência, são para ser dados os seus significados ordinários e habituais de uma pessoa de habilidade comum na técnica, e são usados sem limitação para se referir a um polipeptídeo em que os resíduos de aminoácidos são eliminados em comparação com o próprio polipeptídeo de referência, mas onde a sequência de aminoácidos restante é normalmente idêntica às posições correspondentes no polipeptídeo de referência. Tais deleções podem ocorrer no terminal amino ou no terminal carboxi do polipeptídeo de referência, ou alternativamente em ambos.
[0074] O termo "fragmento funcional" de um polipeptídeo ou proteína se refere a um fragmento de peptídeo que é uma porção do polipeptídeo ou proteína completa, e tem substancialmente a mesma atividade biológica, ou desempenha substancialmente a mesma função que o polipeptídeo ou proteína completa (por exemplo, realizando a mesma reação enzimática).
[0075] Os termos "polipeptídeo variante", "sequência de aminoácidos modificada" ou "polipeptídeo modificado", que são usados indistintamente, se referem a uma sequência de aminoácidos que é diferente do polipeptídeo de referência por um ou mais aminoácidos, por exemplo, por uma ou mais substituições, deleções e/ou adições de aminoácidos. Em um aspecto, uma variante é uma "variante funcional" que retém alguma ou toda a capacidade do polipeptídeo de referência.
[0076] O termo "variante funcional" inclui ainda variantes conservativamente substituídas. O termo "variante conservativamente substituída" se refere a um peptídeo possuindo uma sequência de aminoácidos que difere de um peptídeo de referência por uma ou mais substituições de aminoácidos conservativas, e mantém alguma ou toda a atividade do peptídeo de referência. Uma "substituição conservativa de aminoácidos" é uma substituição de um resíduo de aminoácido por um resíduo funcionalmente semelhante. Exemplos de substituições conservativas incluem a substituição de um resíduo não polar (hidrofóbico) tal como isoleucina, valina, leucina ou metionina por outro; a substituição de um resíduo carregado ou polar (hidrofílico) por outro tal como entre arginina e lisina, entre glutamina e asparagina, entre treonina e serina; a substituição de um resíduo básico tal como lisina ou arginina por outro; ou a substituição de um resíduo ácido, tal como ácido aspártico ou ácido glutâmico por outro; ou a substituição de um resíduo aromático, tal como fenilalanina, tirosina ou triptofano por outro. É esperado que tais substituições tenham pouco ou nenhum efeito no peso molecular aparente ou ponto isoelétrico da proteína ou polipeptídeo. A frase "variante conservativamente substituída" também inclui peptídeos em que um resíduo é substituído por um resíduo quimicamente derivado, desde que o peptídeo resultante mantenha alguma ou toda a atividade do peptídeo de referência como aqui descrito.
[0077] O termo "variante", em conexão com os polipeptídeos da tecnologia em questão, inclui ainda um polipeptídeo funcionalmente ativo tendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 75%, pelo menos 76%, pelo menos 77%, pelo menos 78%, pelo menos 79%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, e mesmo 100% idêntico à sequência de aminoácidos de um polipeptídeo de referência.
[0078] O termo "homólogo" em todas as suas formas gramaticais e variações de grafia se refere à relação entre polinucleotídeos ou polipeptídeos que possuem uma "origem evolutiva comum", incluindo polinucleotídeos ou polipeptídeos de superfamílias e polinucleotídeos ou proteínas homólogas de diferentes espécies (Reeck et al., CELL 50:667, 1987). Tais polinucleotídeos ou polipeptídeos têm homologia de sequência, tal como refletido pela sua similaridade de sequência, seja em termos de percentagem de identidade ou da presença de aminoácidos ou motivos específicos em posições conservadas. Por exemplo, dois polipeptídeos homólogos podem ter sequências de aminoácidos que são pelo menos 75%, pelo menos 76%, pelo menos 77%, pelo menos 78%, pelo menos 79%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 900, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% e mesmo 100% idênticas.
[0079] Às "sequências reguladoras adequadas" deve ser dado o seu significado ordinário e habitual de uma pessoa de habilidade comum na técnica, e é usado, sem limitação, para se referir a sequências de nucleotídeos localizadas a montante (sequências 5' não codificantes), dentro ou a jusante (sequências 3' não codificantes) de uma sequência codificante, e que influenciam a transcrição, processamento ou estabilidade de RNA, ou a tradução da sequência codificante associada. As sequências reguladoras podem incluir promotores, sequências líder de tradução, íntrons e sequências de reconhecimento de poliadenilação.
[0080] "Promotor" é para ser dado o seu significado normal e habitual para um perito na técnica, e é usado sem limitação para se referir a uma sequência de DNA capaz de controlar a expressão de uma sequência codificante ou RNA funcional. Em geral, uma sequência codificante está localizada 3' em relação a uma sequência promotora. Os promotores podem ser derivados na sua totalidade de um gene nativo, ou ser compostos por diferentes elementos derivados de diferentes promotores encontrados na natureza, ou mesmo compreender segmentos de DNA sintéticos. É entendido por aqueles peritos na técnica que diferentes promotores podem dirigir a expressão de um gene em diferentes tecidos ou tipos de células, ou em diferentes etapas de desenvolvimento, ou em resposta a diferentes condições ambientais. Os promotores, que fazem com que um gene seja expresso na maioria dos tipos de células na maioria das vezes, são comumente referidos como "promotores constitutivos". É adicionalmente reconhecido que, uma vez que na maioria dos casos as fronteiras exatas de sequências reguladoras não foram completamente definidas, os fragmentos de DNA de diferentes comprimentos podem ter atividade promotora idêntica.
[0081] O termo "operacionalmente ligado" se refere à associação de sequências de ácido nucleico em um único fragmento de ácido nucleico de modo que a função de uma seja afetada pela outra. Por exemplo, um promotor está operacionalmente ligado a uma sequência codificante quando tem capacidade de afetar a expressão daquela sequência codificante (ou seja, que a sequência codificante está sob o controle de transcrição do promotor). As sequências codificantes podem ser operacionalmente ligadas às sequências reguladoras em uma orientação senso ou antissenso.
[0082] Ao termo "expressão", tal como aqui usado, deve ser dado o seu significado ordinário e habitual de uma pessoa de habilidade comum na técnica, e é usado, sem limitação para se referir à transcrição e acumulação estável de RNA senso (mRNA) ou antissenso derivado do fragmento de ácido nucleico da tecnologia em questão. "Sobreexpressão" se refere à produção de um produto de um gene em organismos transgênicos ou recombinantes que excede os níveis de produção em organismos normais ou não transformados.
[0083] A "transformação" deve ser dado o seu significado ordinário e habitual de uma pessoa de habilidade comum na técnica, e é usado, sem limitação, para se referir à transferência de um polinucleotídeo para uma célula alvo para maior expressão por essa célula. O polinucleotídeo transferido pode ser incorporado no genoma ou DNA cromossômico de uma célula alvo, resultando em herança geneticamente estável, ou pode-se replicar independentemente do cromossomo do hospedeiro. Os organismos hospedeiros contendo os fragmentos de ácido nucleico transformados são denominados como organismos "transgênicos" ou "recombinantes" ou "transformados".
[0084] Aos termos "transformado", "transgênico" e "recombinante", quando aqui usados em ligação com células hospedeiras, são para ser dados os seus significados ordinários e habituais de uma pessoa de habilidade comum na técnica, e são usados sem limitação para se referir a uma célula de um organismo hospedeiro, tal como uma célula de planta ou microbiana, na qual foi introduzida uma molécula de ácido nucleico heterólogo. A molécula de ácido nucleico pode ser estavelmente integrada no genoma da célula hospedeira ou a molécula de ácido nucleico pode estar presente como uma molécula extracromossômica. Uma tal molécula extracromossômica pode ser autorreplicante. Células, tecidos ou sujeitos transformados são entendidos como englobando não só o produto final de um processo de transformação, mas também a sua progênie transgênica.
[0085] Aos termos "recombinante", "heterólogo" e "exógeno", quando aqui usados em ligação com polinucleotídeos, devem ser dados os seus significados ordinários e habituais de uma pessoa de habilidade comum na técnica, e são usados sem limitação para se referirem a um polinucleotídeo (por exemplo, uma sequência de DNA ou um gene) que se origina de uma fonte estranha à célula hospedeira particular ou, se da mesma fonte, é modificada a partir da sua forma original. Assim, um gene heterólogo em uma célula hospedeira inclui um gene que é endógeno à célula hospedeira particular, mas foi modificado através, por exemplo, do uso de mutagênese dirigida ao sítio ou outras técnicas recombinantes. Os termos também incluem cópias múltiplas de ocorrência não natural de uma sequência de DNA de ocorrência natural. Assim, os termos se referem a um segmento de DNA que é estranho ou heterólogo à célula, ou homólogo à célula, mas em uma posição ou forma dentro da célula hospedeira na qual o elemento não é normalmente encontrado.
[0086] De um modo semelhante, os termos "recombinante", "heterólogo" e "exógeno", quando aqui usados em ligação com um polipeptídeo ou sequência de aminoácidos, significam um polipeptídeo ou sequência de aminoácidos que se origina a partir de uma fonte estranha à célula hospedeira particular ou, se da mesma fonte, é modificada da sua forma original. Assim, os segmentos de DNA recombinante podem ser expressos em uma célula hospedeira para produzir um polipeptídeo recombinante.
[0087] Aos termos "plasmídeo", "vetor" e "cassete" devem ser dados os seus significados ordinários e habituais de uma pessoa de habilidade comum na técnica, e são usados sem limitação para se referir a um elemento extra cromossômico frequentemente transportando genes que não fazem parte do metabolismo central da célula, e geralmente na forma de moléculas de DNA de fita dupla circulares. Tais elementos podem ser sequências autonomamente replicantes, sequências integrantes do genoma, sequências de fagos ou nucleotídeos, lineares ou circulares, de um DNA ou RNA de fita simples ou dupla, derivadas de qualquer fonte, nas quais um número de sequências de nucleotídeos foram unidas ou recombinadas em um construto único que é capaz de introduzir um fragmento de promotor e sequência de DNA para um produto de gene selecionado em conjunto com sequência 3' não traduzida apropriada em uma célula. "Cassete de transformação" se refere a um vetor específico que contém um gene estranho e que tem elementos adicionalmente ao gene que facilita a transformação de uma célula hospedeira específica. "Cassete de expressão" se refere a um vetor específico que contém um gene estranho e que tem elementos adicionalmente ao gene estranho que permitem a expressão melhorada daquele gene em um hospedeiro estranho.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0088] A presente divulgação se refere à produção de um glicosídeo de esteviol de interesse, Reb D4 e, em seguida, à utilização de enzimas UGT para permitir o glicosídeo Reb D4 se converter em Reb M. A presente divulgação se refere também à produção de outros glicosídeos de esteviol de interesse, Reb WB1 e Reb WB2. A tecnologia em questão proporciona polipeptídeos recombinantes com atividades UDP- glicosiltransferase, tal como atividade de glicosilação 1,2- 13-O-glicose e atividade de glicosilação 1,3-13-O-glicose para a síntese de glicosídeos de esteviol. O polipeptídeo recombinante da tecnologia em questão é útil para a biossíntese de compostos de glicosídeos de esteviol. Na presente divulgação, a UDP-glicosiltransferase (UGT) se refere a uma enzima que transfere um resíduo de açúcar de uma molécula dadora ativada (tipicamente UDP-glicose) para uma molécula aceitadora. A atividade de glicosilação 1,3-13- O-glicose se refere a uma atividade enzimática que transfere uma porção de açúcar para o C-3' da porção 13-O glicose do rebaudiosídeo D4 para produzir Reb M (Fig. 14). A tecnologia em questão também proporciona polipeptídeos recombinantes com atividade de beta-glicosidase para sintetizar glicosídeos de esteviol.
Biologia Sintética
[0089] As técnicas de DNA recombinante e clonagem molecular padrão usadas aqui são bem conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, por Sambrook, J., Fritsch, E.F. e Maniatis, T. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2 a ed.; Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NI, 1989 (daqui em diante "Maniatis"); e por Silhavy, T. J., Bennan, M. L. e Enquist, L. W. EXPERIMENTS WITH GENE FuSIoNS; Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, N.I., 1984; e por Ausubel, F. M. et al., EM CuRRENT PRoToCoLS IN MoLECuLAR BIoLoGY, publicado por GREENE PuBLISHING E WILEY-INTERSCIENCE, 1987; (a totalidade de cada uma das quais é aqui incorporada por referência).
[0090] A menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado conforme comumente entendido por aquele com habilidade comum na técnica à qual a divulgação pertence. Embora quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos aqui possam ser usados na prática ou teste da presente divulgação, os materiais e métodos preferidos são descritos abaixo.
[0091] A divulgação será mais completamente compreendida após consideração dos seguintes Exemplos não limitativos. Deve ser entendido que estes Exemplos, enquanto indicando modalidades preferidas da tecnologia em questão, são dados apenas a título de ilustração. A partir da discussão acima e destes Exemplos, um perito na técnica pode determinar características essenciais da tecnologia em questão, e sem se afastar do espírito e do escopo da mesma, pode fazer várias mudanças e modificações da tecnologia em questão para adaptar a mesma para vários usos e condições.
[0092] A glicosilação é frequentemente considerada uma reação ubíqua que controla a bioatividade e o armazenamento de produtos naturais de plantas. A glicosilação de moléculas pequenas é catalisada por uma superfamília de transferases na maioria das espécies de plantas que foram estudadas até à data. Estas glicosiltransferases (GTs) foram classificadas em mais de 60 famílias. Destas, as enzimas da família 1 da GT, também conhecidas como as UDP-glicosiltransferases (UGTs), transferem frações de açúcar ativadas por UDP para moléculas aceitadoras específicas. Estas são as moléculas que transferem essas frações de açúcar nos glicosídeos de esteviol para criar vários rebaudiosídeos. Cada uma destas UGTs tem seu próprio perfil de atividade e localizações na estrutura preferidas onde transferem as suas frações de açúcar ativadas.
Sistemas de Produção
[0093] A expressão de proteínas em procariotos é mais frequentemente realizada em uma célula hospedeira bacteriana com vetores contendo promotores constitutivos ou induzíveis que direcionam a expressão de proteínas quer de fusão ou de não fusão. Os vetores de fusão adicionam um número de aminoácidos a uma proteína aí codificada, normalmente ao terminal amino da proteína recombinante. Tais vetores de fusão servem tipicamente três finalidades: l) para aumentar a expressão da proteína recombinante; 2) para aumentar a solubilidade da proteína recombinante; e 3) para ajudar na purificação da proteína recombinante ao atuar como um ligando na purificação por afinidade. Frequentemente, um sítio de clivagem proteolítica é introduzido na junção da porção de fusão e da proteína recombinante para permitir a separação da proteína recombinante da porção de fusão subsequente à purificação da proteína de fusão. Tais vetores estão dentro do escopo da presente divulgação.
[0094] Em uma modalidade, o vetor de expressão inclui os elementos genéticos para a expressão do polipeptídeo recombinante em células bacterianas. Os elementos para transcrição e tradução na célula bacteriana podem incluir um promotor, uma região codificante para o complexo de proteína e um terminador transcricional.
[0095] Um perito na técnica estará ciente das técnicas de biologia molecular disponíveis para a preparação de vetores de expressão. O polinucleotídeo usado para incorporação no vetor de expressão da tecnologia em questão, tal como descrito acima, pode ser preparado por técnicas de rotina, tais como a reação em cadeia da polimerase (PCR).
[0096] Várias técnicas de biologia molecular foram desenvolvidas para ligar operacionalmente o DNA a vetores via terminais coesivos complementares. Em uma modalidade, podem ser adicionados tratos homopoliméricos complementares à molécula de ácido nucleico a ser inserida no vetor de DNA. O vetor e a molécula de ácido nucleico são então ligados por ligação de hidrogênio entre as caudas homopoliméricas complementares para formar moléculas de DNA recombinante.
[0097] Em uma modalidade alternativa, ligantes sintéticos proporcionados contendo um ou mais locais de restrição são usados para ligar operacionalmente o polinucleotídeo da tecnologia em questão ao vetor de expressão. Em uma modalidade, o polinucleotídeo é gerado por digestão com endonucleases de restrição. Em uma modalidade, a molécula de ácido nucleico é tratada com polimerase de DNA de bacteriófago T4 ou polimerase de DNA I de E. coli, enzimas que removem saliências, terminal de fita simples 3' com as suas atividades exonucleolíticas 3'-5', e preenchem o recuo dos terminais 3' com as suas atividades de polimerização, gerando assim segmentos de DNA de extremidades cegas. Os segmentos de extremidades cegas são então incubados com um grande excesso molar de moléculas ligantes na presença de uma enzima que é capaz de catalisar a ligação de moléculas de DNA de extremidades cegas, tal como ligase de DNA de bacteriófago T4. Assim, o produto da reação é um polinucleotídeo que transporta sequências ligantes poliméricas nas suas extremidades. Estes polinucleotídeos são então clivados com a enzima de restrição apropriada e ligados a um vetor de expressão que foi clivado com uma enzima que produz terminais compatíveis com os do polinucleotídeo.
[0098] Alternativamente, pode ser usado um vetor possuindo sítios de clonagem independentes de ligação (LIC). O polinucleotídeo necessário amplificado por PCR pode então ser clonado no vetor LIC sem digestão de restrição ou ligação (Aslanidis e de Jong, NUCL. ACID. RES. 18 6069-74, (1990), Haun, et al, BIOTECHNIQUES 13, 515-18 (1992), que é incorporada aqui por referência na medida em que é consistente com esta).
[0099] Em uma modalidade, de modo a isolar e/ou modificar o polinucleotídeo de interesse para inserção no plasmídeo escolhido, é adequado usar PCR. Os iniciadores apropriados para uso na preparação de PCR da sequência podem ser concebidos para isolar a região codificante necessária da molécula de ácido nucleico, adicionar endonuclease de restrição ou sítios LIC, colocar a região codificante na grelha de leitura desejada.
[00100] Em uma modalidade, um polinucleotídeo a ser incorporado em um vetor de expressão da tecnologia em questão é preparado através do uso de PCR usando iniciadores oligonucleotídeos apropriados. A região codificante é amplificada, enquanto os próprios iniciadores são incorporados no produto da sequência amplificada. Em uma modalidade, os iniciadores da amplificação contêm sítios de reconhecimento de endonucleases de restrição, que permitem que o produto da sequência amplificada seja clonado em um vetor apropriado.
[00101] Os vetores de expressão podem ser introduzidos em células hospedeiras vegetais ou microbianas por técnicas convencionais de transformação ou transfecção. A transformação de células apropriadas com um vetor de expressão da tecnologia em questão é realizada por métodos conhecidos na técnica e tipicamente depende tanto do tipo de vetor como da célula. As técnicas adequadas incluem co- precipitação com fosfato de cálcio ou cloreto de cálcio, transfecção mediada por DEAE-dextrano, lipofecção, quimoporação ou eletroporação.
[00102] As células transformadas com sucesso, isto é, as células que contêm o vetor de expressão, podem ser identificadas por técnicas bem conhecidas na técnica. Por exemplo, as células transfectadas com um vetor de expressão da tecnologia em questão podem ser cultivadas para produzir polipeptídeos aqui descritos. As células podem ser examinadas para determinar a presença do DNA do vetor de expressão por meio de técnicas bem conhecidas na técnica.
[00103] As células hospedeiras podem conter uma única cópia do vetor de expressão descrito anteriormente ou, alternativamente, múltiplas cópias do vetor de expressão,
[00104] Em algumas modalidades, a célula transformada é uma célula animal, uma célula de inseto, uma célula de planta, uma célula de alga, uma célula de fungo ou uma célula de levedura. Em algumas modalidades, a célula é uma célula de planta selecionada do grupo que consiste em: célula de planta de canola, uma célula de planta de colza, uma célula de planta de palma, uma célula de planta de girassol, uma célula de planta de algodão, uma célula de planta de milho, uma célula de planta de amendoim, uma célula de planta de linho, uma célula de planta de gergelim, uma célula de planta de soja e uma célula de planta de petúnia.
[00105] Sistemas de expressão de células hospedeiras microbianas e vetores de expressão contendo sequências reguladoras que dirigem a expressão de alto nível de proteínas estranhas são bem conhecidos dos peritos na técnica. Qualquer um destes pode ser usado para construir vetores para a expressão do polipeptídeo recombinante da tecnologia em questão em uma célula hospedeira microbiana. Estes vetores podem então ser introduzidos em microrganismos apropriados via transformação para permitir a expressão de alto nível do polipeptídeo recombinante da tecnologia em questão.
[00106] Vetores ou cassetes úteis para a transformação de células hospedeiras microbianas adequadas são bem conhecidos na técnica. Tipicamente, o vetor ou cassete contêm sequências que direcionam a transcrição e tradução do polinucleotídeo relevante, um marcador selecionável e sequências que permitem replicação autônoma ou integração cromossômica. Os vetores adequados compreendem uma região 5' do polinucleotídeo que abriga controles de iniciação transcricional e uma região 3' do fragmento de DNA que controla a terminação transcricional. É preferido que ambas as regiões de controle sejam derivadas de genes homólogos à célula hospedeira transformada, embora deva ser entendido que tais regiões de controle não precisam de ser derivadas dos genes nativos das espécies específicas escolhidas como hospedeiro.
[00107] Regiões ou promotores de controle da iniciação, que são úteis para conduzir a expressão do polipeptídeo recombinante na célula hospedeira microbiana desejada são numerosos e familiares aos peritos na técnica. Praticamente qualquer promotor capaz de dirigir estes genes é adequado para a tecnologia em questão, incluindo, mas não limitado a CYCI, HIS3, GALI, GALIO, ADHI, PGK, PH05, GAPDH, ADCI, TRPI, URA3, LEU2, ENO, TPI (útil para expressão em Saccharomyces); AOXI (útil para expressão em Pichia); e lac, trp, JPL, IPR, T7, tac, e trc (útil para expressão em Escherichia coli).
[00108] As regiões de controle da terminação também podem ser derivadas de vários genes nativos aos hospedeiros microbianos. Pode ser incluído opcionalmente um local de terminação para os hospedeiros microbianos aqui descritos.
[00109] Em células de plantas, os vetores de expressão da tecnologia em questão podem incluir uma região codificante operacionalmente ligada a promotores capazes de dirigir a expressão do polipeptídeo recombinante da tecnologia em questão nos tecidos desejados no estágio de desenvolvimento desejado. Por razões de conveniência, os polinucleotídeos a serem expressos podem compreender sequências de promotor e sequências líder de tradução derivadas do mesmo polinucleotídeo. As sequências não codificantes 3' que codificam sinais de terminação da transcrição também devem estar presentes. Os vetores de expressão podem também compreender um ou mais íntrons de modo a facilitar a expressão de polinucleotídeos.
[00110] Para células hospedeiras de planta, qualquer combinação de qualquer promotor e qualquer terminador capaz de induzir a expressão de uma região codificante pode ser usada nas sequências do vetor da tecnologia em questão. Alguns exemplos adequados de promotores e terminadores incluem os genes da nopalina sintase (nos), octopina sintetase (ocs) e vírus do mosaico da couve-flor (CaMV). Um tipo de promotor de planta eficiente que pode ser usado é um promotor de plantas de alto nível. Tais promotores, em ligação operacional com um vetor de expressão da tecnologia em questão, devem ser capazes de promover a expressão do vetor. Promotores de plantas de alto nível que podem ser usados na tecnologia em questão incluem o promotor da(s) subunidade(s) pequena(s) do gene da ribulose-1,5-bifosfato carboxilase, por exemplo, de soja (Berry-Lowe et al., J. MOLECULAR AND APP. GEN., 1:483 498 (1982), cuja totalidade é aqui incorporada na medida em que é consistente com esta) e o promotor da proteína de ligação à clorofila. Estes dois promotores são conhecidos por serem induzidos pela luz em células de plantas (ver, por exemplo, GENETIC ENGINEERING OF PLANTS, AN AGRICULTURAL PERSPECTIVE, A. Cashmore, Plenum, N.I. (1983), páginas 29-38; Coruzzi, G. et al., The Journal of Biological CHEMISTRY, 258: 1399 (1983), e Dunsmuir, P. et al., JOURNAL OF MOLECULAR AND APPLIED GENETICS, 2:285 (1983), cada uma das quais é aqui incorporada por referência na medida em que são consistentes com esta).
Síntese de Precursores de Reb D4
[00111] Como previamente afirmado, os glicosídeos de esteviol são os compostos químicos responsáveis pelo sabor adocicado das folhas da planta sul-americana Stevia rebaudiana (Asteraceae) e na planta Rubus chingii (Rosaceae). Estes compostos são diterpenos glicosilados. Especificamente, as suas moléculas podem ser vistas como uma molécula de esteviol, com seu átomo de hidrogênio de hidroxila substituído por uma molécula de glicose para formar um éster e um hidrogênio de hidroxila com combinações de glicose e ramnose para formar um acetal.
[00112] Um método para produzir os compostos de interesse na divulgação atual é tomar precursores comuns ou de baixo custo, tais como esteviol ou rubosusídeo derivado quimicamente ou produzido via biossíntese em micróbios manipulados, tais como bactérias e/ou leveduras e sintetizar os glicosídeos de esteviol alvo através de métodos conhecidos ou de baixo custo, tal como Reb D4.
[00113] Aspectos da presente divulgação se relacionam com métodos que envolvem a expressão recombinante de enzimas em um sistema microbiano capaz de produzir esteviol. Em geral, tais enzimas podem incluir: uma enzima copalil difosfato sintase (CPS), uma enzima caureno sintase (KS) e uma enzima geranilgeranil difosfato sintase (GGPPS). Isto deve ocorrer em uma cepa microbiana que expresse uma via de síntese de isoprenoides endógenos, tal como a via do não- mevalonato (MEP) ou a via do ácido mevalônico (MVA). Em algumas modalidades a célula é uma célula bacteriana, incluindo E. coli, ou célula de levedura tal como uma célula de Saccharomyces, célula de Pichia ou uma célula de Yarrowia. Em algumas modalidades, a célula é uma célula de alga ou uma célula de planta.
[00114] Em seguida, o precursor é recuperado da cultura de fermentação para uso em síntese química. Tipicamente, este é o esteviol, embora possa ser o caureno, ou um glicosídeo de esteviol da cultura de células. Em algumas modalidades, o esteviol, caureno e/ou glicosídeos de esteviol são recuperados da fase gasosa enquanto em outras modalidades, uma camada orgânica ou resina polimérica é adicionada à cultura de células, e o caureno, esteviol e/ou glicosídeos de esteviol são recuperados da camada orgânica ou resina polimérica. Em algumas modalidades, o glicosídeo de esteviol é selecionado de rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo B, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo F ou dulcosídeo A. Em algumas modalidades, o terpenoide produzido é esteviobiosídeo ou esteviosídeo. Deve também ser entendido que em algumas modalidades, pelo menos uma etapa enzimática, tal como uma ou mais etapas de glicosilação, são realizadas ex vivo.
[00115] Parte da invenção é a produção do glicosídeo de esteviol Reb D4 que é então sujeito à conversão enzimática adicional para Reb M. De acordo com a presente divulgação a biossíntese para a conversão de esteviol produzido microbianamente para um glicosídeo de esteviol desejado (aqui Reb D4) ocorre quando o esteviol diterpenoide é convertido para esteviosídeo e rebaudiosídeo A usando química de montagem em múltiplas etapas da porção de açúcar na estrutura principal de esteviol. Mais especificamente, a síntese química consiste nas seguintes etapas: 1) Um trimetilsililo (TMS) protegido no grupo C19 COOH do esteviol é sintetizado a partir do esteviol precursor de partida. A triglicosilação na posição C13-OH do esteviol é realizada usando o grupo protegido de β-Glc-β-Glc(2^1)-β-Glc(3^1). Isto é seguido por uma desproteção do TMS e acoplamento de uma porção mono β-Glc-Br protegida. A desproteção final remove todos os grupos de proteção para produzir o rebaudiosídeo D4.
Biossíntese de Glicosídeos de Esteviol
[00116] Como aqui descrito, os polipeptídeos recombinantes da presente tecnologia têm atividades UDP- glicosiltransferase e são úteis para o desenvolvimento de métodos biossintéticos para a preparação de glicosídeos de esteviol que não estão presentes ou tipicamente de baixa abundância em fontes naturais, tais como rebaudiosídeo D4 e rebaudiosídeo M, respectivamente. Os polipeptídeos recombinantes da presente tecnologia têm atividades de beta- glicosidase ou UDP-glicosiltransferase, são úteis para o desenvolvimento de métodos biossintéticos para preparar novos glicosídeos de esteviol, tal como rebaudiosídeo D4 e úteis na produção de rebaudiosídeo M.
[00117] O substrato pode ser qualquer composto natural ou sintético capaz de ser convertido em um composto de glicosídeo de esteviol em uma reação catalisada por uma ou mais UDP-glicosiltransferases. Por exemplo, o substrato pode ser extrato natural de stevia, esteviol, esteviol-13-O- glicosídeo, esteviol-19-O-glicosídeo, esteviol-l, 2- biosídeo, rubusosídeo, esteviosídeo, rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo G ou rebaudiosídeo E. O substrato pode ser um composto puro ou uma mistura de diferentes compostos. Preferencialmente, o substrato inclui um composto selecionado do grupo consistindo em rubusosídeo, esteviosídeo, esteviol, rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo E e suas combinações.
[00118] O método aqui descrito proporciona também um sistema reacional de acoplamento no qual os peptídeos recombinantes aqui descritos são permitidos funcionar em combinação com uma ou mais enzimas adicionais para melhorar a eficiência ou modificar o resultado da biossíntese global de compostos de glicosídeo de esteviol. Por exemplo, a enzima adicional pode regenerar a UDP-glicose necessária para a reação de glicosilação pela conversão de UDP produzida a partir da reação de glicosilação de volta para UDP-glicose (usando, por exemplo, sacarose como doador do resíduo de glicose), melhorando assim a eficiência da reação de glicosilação.
[00119] Em outra modalidade, o método da tecnologia em questão inclui ainda a incubação de uma UDP- glicosiltransferase recombinante com a sacarose sintase recombinante, o substrato e o polipeptídeo recombinante aqui descrito. A UDP-glicosiltransferase recombinante pode catalisar uma reação de glicosilação diferente que aquela catalisada pelo polipeptídeo recombinante da tecnologia em questão.
[00120] A UDP-glicosiltransferase adequada inclui qualquer UGT conhecida na técnica como capaz de catalisar uma ou mais reações na biossíntese de compostos de glicosídeo de esteviol, tais como UGT85C2, UGT74G1, UGT76G1, ou os seus homólogos funcionais.
[00121] Tipicamente, no método in vitro da tecnologia em questão, a UDP-Glicose é incluída no tampão a uma concentração de cerca de 0,2 mM a cerca de 5 mM, preferencialmente de cerca de 0,5 mM a cerca de 2 mM, mais preferencialmente de cerca de 0,7 mM a cerca de 1,5 mM. Em uma modalidade, quando uma sacarose sintase recombinante está incluída na reação, a sacarose é também incluída no tampão em uma concentração de entre cerca de 100 mM a cerca de 500 mM, preferencialmente entre cerca de 200 mM a cerca de 400 mM, mais preferencialmente entre cerca de 250 mM a cerca de 350 mM.
[00122] Tipicamente, no método in vitro da tecnologia em questão, a razão em peso do polipeptídeo recombinante para o substrato, em uma base de peso seco, é de cerca de 1:100 a cerca de 1:5, preferencialmente de cerca de 1:50 a cerca de 1:10, mais preferencialmente de cerca de 1:25 a cerca de 1:15.
[00123] Tipicamente, a temperatura da reação do método in vitro é de cerca de 20 °C a cerca de 40 °C, adequadamente de 25 °C a cerca de 37 °C, mais adequadamente de 28 °C a cerca de 32 °C.
[00124] Um perito na técnica reconhecerá que a composição de glicosídeo de esteviol produzida pelo método aqui descrito pode ser purificada adicionalmente e misturada com outros glicosídeos de esteviol, aromatizantes ou edulcorantes, para obter um sabor desejado ou composição edulcorante. Por exemplo, uma composição enriquecida com rebaudiosídeo D4 produzida como aqui descrita pode ser misturada com um extrato natural de stevia contendo rebaudiosídeo A como o glicosídeo de esteviol predominante, ou com outros produtos de glicosídeo de esteviol sintéticos ou naturais para fazer uma composição edulcorante desejada. Alternativamente, um glicosídeo de esteviol substancialmente purificado (por exemplo, rebaudiosídeo D4) obtido da composição de glicosídeo de esteviol aqui descrita pode ser combinado com outros edulcorantes, tais como sacarose, maltodextrina, aspartamo, sucralose, neotamo, acesulfame de potássio e sacarina. A quantidade de glicosídeo de esteviol em relação a outros edulcorantes pode ser ajustada para se obter um sabor desejado, como é conhecido na técnica. A composição de glicosídeo de esteviol aqui descrita (incluindo rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo D4, rebaudiosídeo M ou uma sua combinação) pode ser incluída em produtos alimentares (tais como bebidas, refrigerantes, gelados, produtos lácteos, produtos de confeitaria, cereais, gomas de mascar, produtos assados, etc.), suplementos dietéticos, nutrição médica, bem como produtos farmacêuticos.
[00125] Um perito na técnica reconhecerá que a composição de glicosídeo de esteviol produzida pelo método aqui descrito pode ser purificada adicionalmente e misturada com outros glicosídeos de esteviol, aromatizantes ou edulcorantes, para obter um sabor desejado ou composição edulcorante. Por exemplo, uma composição enriquecida com rebaudiosídeo D4 produzida como aqui descrita pode ser misturada com um extrato natural de stevia contendo rebaudiosídeo A como o glicosídeo de esteviol predominante, ou com outros produtos de glicosídeo de esteviol sintéticos ou naturais para fazer uma composição edulcorante desejada. Alternativamente, um glicosídeo de esteviol substancialmente purificado (por exemplo, rebaudiosídeo D4) obtido da composição de glicosídeo de esteviol aqui descrita pode ser combinado com outros edulcorantes, tais como sacarose, maltodextrina, aspartamo, sucralose, neotamo, acesulfame de potássio e sacarina. A quantidade de glicosídeo de esteviol em relação a outros edulcorantes pode ser ajustada para se obter um sabor desejado, como é conhecido na técnica. A composição de glicosídeo de esteviol aqui descrita (incluindo rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo D4, rebaudiosídeo WB1, rebaudiosídeo WB2, rebaudiosídeo M ou uma sua combinação) pode ser incluída em produtos alimentares (tais como bebidas, refrigerantes, gelados, produtos lácteos, produtos de confeitaria, cereais, gomas de mascar, produtos assados, etc.), suplementos dietéticos, nutrição médica, bem como produtos farmacêuticos.
Análise da Similaridade de Sequências Usando o Escore de Identidade
[00126] Como usada aqui, "identidade de sequências" se refere à extensão à qual duas sequências de polinucleotídeos ou peptídeos otimamente alinhadas são invariantes ao longo de uma janela de alinhamento de componentes, por exemplo, nucleotídeos ou aminoácidos. Uma "fração de identidade" para segmentos alinhados de uma sequência de teste e uma sequência de referência é o número de componentes idênticos que são partilhados pelas duas sequências alinhadas dividido pelo número total de componentes no segmento da sequência de referência, ou seja, a sequência de referência inteira ou uma parte definida menor da sequência de referência.
[00127] Como usado aqui, o termo "percentagem de identidade de sequência" ou "percentagem de identidade" se refere à percentagem de nucleotídeos idênticos em uma sequência de polinucleotídeos linear de uma molécula de polinucleotídeos de referência ("consulta") (ou sua fita complementar) em comparação com uma molécula de polinucleotídeo de teste ("objeto") (ou sua fita complementar) quando as duas sequências estão otimamente alinhadas (com inserções, deleções, ou espaços apropriados totalizando menos do que 20 por cento da sequência de referência ao longo da janela de comparação). O alinhamento ótimo de sequências para alinhamento em uma janela de comparação é bem conhecido daqueles peritos na técnica e pode ser conduzido por ferramentas tais como o algoritmo de homologia local de Smith e Waterman, o algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman e Wunsch, o método de procura por similaridade de Pearson e Lipman e preferencialmente por implementações computadorizadas destes algoritmos tais como GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA disponíveis como parte do GCG® Wisconsin Package® (Accelrys Inc., Burlington, MA). Uma "fração de identidade" para segmentos alinhados de uma sequência de teste e uma sequência de referência é o número de componentes idênticos que são partilhados pelas duas sequências alinhadas dividido pelo número total de componentes no segmento da sequência de referência, ou seja, a sequência de referência inteira ou uma parte definida mais pequena da sequência de referência. A percentagem de identidade de sequência é representada como a fração de identidade multiplicada por 100. A comparação de uma ou mais sequências de polinucleotídeos pode ser com uma sequência de polinucleotídeos de comprimento total ou uma sua porção ou com uma sequência de polinucleotídeos mais longa. Para propósitos desta divulgação, "percentagem de identidade" pode ser também determinada usando BLASTX versão 2.0 para sequências de nucleotídeos traduzidas e BLASTN versão 2.0 para sequências de polinucleotídeos.
[00128] A percentagem de identidade de sequências é preferencialmente determinada usando o programa "Best Fit" ou "Gap" do Sequence Analysis Software Package™ (Versão 10; Genetics Computer Group, Inc., Madison, WI). "Gap" emprega o algoritmo de Needleman e Wunsch (Needleman e Wunsch, JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY 48:443-453, 1970) para encontrar o alinhamento de duas sequências que maximiza o número de emparelhamentos e minimiza o número de intervalos. "BestFit" realiza um alinhamento ótimo do melhor segmento de similaridade entre duas sequências e insere espaços para maximizar o número de correspondências usando o algoritmo de homologia local de Smith e Waterman (Smith e Waterman, ADVANCES IN APPLIED MATHEMATICS, 2:482-489, 1981, Smith et al., NUCLEIC ACIDS RESEARCH 11:2205-2220, 1983). A percentagem de identidade é mais preferencialmente determinada usando o programa "Best Fit".
[00129] Métodos úteis para determinação de identidade de sequência são também divulgados nos programas Ferramenta Básica de Busca de Alinhamentos Locais (BLAST), que são publicamente disponibilizados pelo National Center Biotechnology Information (NCBI) na National Library of Medicine, National Institute of Health, Bethesda, Md. 20894; ver "BLAST Manual", Altschul et al., NCBI, NLM, NIH; Altschul et al., J. MOL. BIOL. 215:403-410 (1990); a versão 2.0 ou superior de programas BLAST permite a introdução de intervalos (deleções e inserções) nos alinhamentos; para sequências peptídicas pode ser usado BLASTX para determinar a identidade de sequência e para sequências de polinucleotídeos pode ser usado BLASTN para determinar a identidade de sequência.
[00130] Como aqui usado, o termo "percentagem substancial de identidade de sequência" se refere a uma percentagem de identidade de sequência de pelo menos cerca de 70% de identidade de sequência, pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência, pelo menos cerca de 85% de identidade, pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência, ou ainda maior identidade de sequência, tal como cerca de 98% ou cerca de 99% de identidade de sequência. Assim, uma modalidade da divulgação é uma molécula de polinucleotídeos que tem pelo menos cerca de 70% de identidade de sequência, pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência, pelo menos cerca de 85% de identidade, pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência, ou ainda maior identidade de sequência tal como cerca de 98% ou cerca de 99% de identidade de sequência com uma sequência de polinucleotídeos aqui descrita. As moléculas de polinucleotídeos que têm a atividade dos genes Blu1 e CP1 da divulgação atual são capazes de dirigir a produção de uma variedade de glicosídeos de esteviol e têm uma percentagem substancial de identidade de sequência com as sequências de polinucleotídeos aqui proporcionadas e são englobadas dentro do âmbito desta divulgação.
Identidade e Similaridade
[00131] Identidade é a fração de aminoácidos que são idênticos entre um par de sequências após um alinhamento das sequências (o que pode ser feito usando apenas informação da sequência ou informação estrutural ou alguma outra informação, mas geralmente é baseado somente na informação de sequência), e similaridade é a pontuação atribuída com base em um alinhamento usando alguma matriz de similaridade. O índice de similaridade pode ser qualquer um dos seguintes BLOSUM62, PAM250 ou GONNET, ou qualquer matriz usada por um perito na técnica para o alinhamento de sequências de proteínas.
[00132] Identidade é o grau de correspondência entre duas subsequências (sem espaços entre as sequências). Uma identidade de 25% ou superior implica similaridade de função, enquanto 18-25% implica similaridade de estrutura ou função. Deve-se ter em mente que duas sequências completamente independentes ou aleatórias (que são maiores que 100 resíduos) podem ter mais de 20% de identidade. Similaridade é o grau de semelhança entre duas sequências quando elas são comparadas. Isto é dependente da sua identidade.
Produtos de Consumo
[00133] Em outro aspecto, a presente divulgação é direcionada a um produto de consumo compreendendo um rebaudiosídeo como aqui descrito, por exemplo, Reb W1, Reb W2, Reb D4, Reb M, ou uma sua combinação, tal como Reb D4 e Reb M. Em algumas modalidades, o produto de consumo compreende uma quantidade de edulcorante de um rebaudiosídeo tal como aqui descrito, por exemplo, Reb W1, Reb W2, Reb D4 e/ou Reb M. Em algumas modalidades, o produto de consumo é selecionado do grupo que consiste em um produto de bebida, um produto alimentar, um nutracêutico, um produto farmacêutico, um suplemento dietético, uma composição para higiene dentária, uma composição de gel comestível, um produto cosmético e um aromatizante de mesa.
[00134] Em algumas modalidades, o produto de consumo pode ter uma intensidade de doçura equivalente a cerca de 1% (p/v-%) a cerca de 4% (p/v-%) da solução de sacarose.
[00135] Em algumas modalidades, o rebaudiosídeo tal como aqui descrito, por exemplo, Reb W1, Reb W2, Reb D4, Reb M, ou uma sua combinação, como Reb D4 e Reb M, é o único edulcorante no produto de consumo oral.
[00136] Em algumas modalidades, o produto de consumo também pode ter pelo menos um edulcorante adicional. O pelo menos um edulcorante adicional pode ser um edulcorante natural de alta intensidade, por exemplo. O edulcorante adicional pode ser selecionados de um extrato de estévia, um glicosídeo de esteviol, esteviosídeo, rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo B, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo D2, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo F, dulcosídeo A, rubusosídeo, esteviolbiosídeo, sacarose, xarope de milho com alto teor de frutose, frutose, glicose, xilose, arabinose, ramnose, eritritol, xilitol, manitol, sorbitol, inositol, AceK, aspartamo, neotamo, sucralose, sacarina, naringina di-hidrocalcona (NarDHC), neohesperidina di-hidrocalcona (NDHC), rubusosídeo, mogrosídeo IV, siamenosídeo I, mogrosídeo V, Monatina, taumatina, monelina, brazeína, L-alanina, glicina, Lo Han Guo, hernandulcina, filodulcina, trilobtaína, e suas combinações.
[00137] Em algumas modalidades, o produto de consumo também pode ter pelo menos um aditivo. O aditivo pode ser, por exemplo, um carboidrato, um poliol, um aminoácido ou seu sal, um poliaminoácido ou um seu sal, um ácido de açúcar ou um seu sal, um nucleotídeo, um ácido orgânico, um ácido inorgânico, um sal orgânico, um sal de ácido orgânico, um sal de base orgânico, um sal inorgânico, um composto amargo, um aromatizante, um ingrediente aromatizante, um composto adstringente, uma proteína, um hidrolisado de proteína, um tensoativo, um emulsionante, um flavonoide, um álcool, um polímero, e suas combinações.
[00138] Em um aspecto, a presente divulgação se refere a um produto de bebida compreendendo uma quantidade de edulcorante de um rebaudiosídeo como aqui descrito, por exemplo, Reb W1, Reb W2, Reb D4, Reb M, ou uma sua combinação, tal como Reb D4 e Reb M.
[00139] O produto de bebida pode ser, por exemplo, um produto de bebida carbonatada ou um produto de bebida não carbonatada. O produto de bebida também pode ser, por exemplo, um refrigerante, uma bebida de fonte, uma bebida congelada, uma bebida pronta a beber, uma bebida congelada e pronta a beber, café, chá, uma bebida láctea, um pó refrigerante, um concentrado líquido, água aromatizada, água enriquecida, suco de frutas, uma bebida com sabor de suco de fruta, uma bebida esportiva ou uma bebida energética.
[00140] Em algumas modalidades, um produto de bebida da presente divulgação pode incluir um ou mais ingredientes da bebida tais como, por exemplo, acidulantes, sumos de fruta e/ou sumos vegetais, polpa, etc., aromatizantes, corantes, conservantes, vitaminas, minerais, eletrólitos, eritritol, tagatose, glicerina e dióxido de carbono. Tais produtos de bebidas podem ser fornecidos em qualquer forma adequada, tal como um concentrado de bebida ou uma bebida carbonatada pronta a beber.
[00141] Em certas modalidades, os produtos de bebidas da presente divulgação podem ter qualquer uma de numerosas formulações ou constituições específicas diferentes. A formulação de um produto de bebida da presente divulgação pode variar até certo ponto, dependendo de fatores tais como o segmento de mercado pretendido do produto, as suas características nutricionais desejadas, perfil de sabor e semelhantes. Por exemplo, em certas modalidades, pode geralmente ser uma opção para adicionar ingredientes adicionais à formulação de um produto de bebida particular. Por exemplo, edulcorantes adicionais podem ser adicionados, aromatizantes, eletrólitos, vitaminas, sumos de fruta ou outros produtos de fruta, saborizantes, agentes de mascaramento e semelhantes, intensificadores de sabor e/ou carbonatação podem ser tipicamente adicionados a qualquer uma dessas formulações para variar o sabor, sensação na boca, características nutricionais, etc. Em modalidades, o produto de bebida pode ser uma bebida de cola que contém água, um rebaudiosídeo como aqui descrito (por exemplo, Reb W1, Reb W2, Reb D4, Reb M, ou uma sua combinação tal como Reb D4 e Reb M), um acidulante e aromatizante. Os aromatizantes exemplificativos podem ser, por exemplo, aromatizante de cola, aromatizante cítrico e aromatizantes de especiarias. Em algumas modalidades, a carbonatação na forma de dióxido de carbono pode ser adicionada para efervescência. Em outras modalidades, podem ser adicionados conservantes, dependendo dos outros ingredientes, técnica de produção, tempo de prateleira desejado, etc. Em certas modalidades, cafeína pode ser adicionada. Em algumas modalidades, o produto de bebida pode ser uma bebida carbonatada com sabor de cola, caracteristicamente contendo água carbonatada, edulcorante, extrato de noz de cola e/ou outros aromatizantes, corante de caramelo, um ou mais ácidos, e opcionalmente outros ingredientes.
[00142] Em outro aspecto, a presente divulgação é direcionada a um produto de consumo compreendendo um rebaudiosídeo como aqui descrito (por exemplo, Reb W1, Reb W2, Reb D4, Reb M, ou uma sua combinação, tal como Reb D4 e Reb M), em que o produto de consumo é um produto alimentar, um nutracêutico, um produto farmacêutico, um suplemento dietético, uma composição para higiene dentária, uma composição de gel comestível, um produto cosmético ou um aromatizante de mesa. Em algumas modalidades, o rebaudiosídeo está presente em uma quantidade de edulcorante.
[00143] Como aqui usado, "suplemento(s) dietético(s)" se refere a compostos destinados a suplementar a dieta e fornecer nutrientes, tais como vitaminas, minerais, fibras, ácidos graxos, aminoácidos, etc, que podem estar em falta ou não serem consumidos em quantidades suficientes em uma dieta. Pode ser usado qualquer suplemento dietético adequado conhecido na técnica. Exemplos de suplementos dietéticos adequados podem ser, por exemplo, nutrientes, vitaminas, minerais, fibras, ácidos gordos, ervas aromáticas, botânicos, aminoácidos e metabolitos.
[00144] Tal como aqui utilizado, "nutracêutico(s)" se refere a compostos, que incluem qualquer alimento ou parte de um alimento que possa proporcionar benefícios medicinais ou de saúde, incluindo a prevenção e/ou tratamento de doença ou distúrbio (por exemplo, fadiga, insônia, efeitos de envelhecimento, perda de memória, transtornos do humor, doenças cardiovasculares e altos níveis de colesterol no sangue, diabetes, osteoporose, inflamação, distúrbios autoimunes, etc.). Pode ser usado qualquer nutracêutico adequado conhecido na técnica. Em algumas modalidades, os nutracêuticos podem ser usados como suplementos para alimentos e bebidas e como formulações farmacêuticas para aplicações entéricas ou parentéricas que podem ser formulações sólidas, tais como cápsulas ou comprimidos, ou formulações líquidas, tais como soluções ou suspensões.
[00145] Em algumas modalidades, os suplementos dietéticos e nutracêuticos podem conter adicionalmente hidrocoloides protetores (tais como gomas, proteínas, amidos modificados), aglutinantes, agentes formadores de película, agentes/materiais encapsulantes, materiais de parede/invólucro, compostos de matriz, revestimentos, emulsionantes agentes, agentes solubilizantes (óleos, gorduras, ceras, lecitinas, etc.), adsorventes, transportadores, enchimentos, co-compostos, agentes dispersantes, agentes molhantes, auxiliares de processamento (solventes), agentes de fluxo, agentes de mascaramento de sabor, agentes de ponderação, agentes gelificantes, agentes formadores de gel, antioxidantes e antimicrobianos.
[00146] Como aqui usado, um "gel" se refere a um sistema coloidal no qual uma rede de partículas abrange o volume de um meio líquido. Embora os géis sejam compostos principalmente de líquidos e, portanto, exibam densidades semelhantes a líquidos, os géis têm a coerência estrutural dos sólidos devido à rede de partículas que abrange o meio líquido. Por esta razão, os géis geralmente parecem ser sólidos, materiais do tipo gelatinoso. Géis podem ser usados em diversas aplicações. Por exemplo, os géis podem ser usados em alimentos, tintas e adesivos. Os géis que podem ser comidos são referidos como "composições de gel comestível”. As composições de gel comestível são tipicamente consumidas como lanche, como sobremesas, como parte de alimentos básicos ou juntamente com alimentos básicos. Exemplos de composições de gel comestível adequadas podem ser, por exemplo, sobremesas em gel, pudins, compotas, geleias, pastas, trufas, gelatina, marshmallows, guloseimas de gomas e semelhantes. Em algumas modalidades, as misturas de gel comestível são geralmente sólidos em pó ou granulares aos quais pode ser adicionado um fluido para formar uma composição de gel comestível. Exemplos de fluidos adequados podem ser, por exemplo, água, fluidos lácteos, fluidos lácteos análogos, sumos, álcool, bebidas alcoólicas e suas combinações. Exemplos de fluidos lácteos adequados podem ser, por exemplo, leite, leite fermentado, nata, soro líquido e suas misturas. Exemplos de fluidos lácteos análogos adequados podem ser, por exemplo, leite de soja e creme de café não lácteo.
[00147] Como aqui usado, o termo "ingrediente gelificante" se refere a qualquer material que possa formar um sistema coloidal dentro de um meio líquido. Exemplos de ingredientes gelificantes adequados podem ser, por exemplo, gelatina, alginato, carragenina, goma, pectina, konjac, ágar, ácido alimentar, coalho, amido, derivados de amido e suas combinações. É bem conhecido dos peritos na técnica que a quantidade de ingrediente gelificante usada em uma mistura de gel comestível ou em uma composição de gel comestível pode variar consideravelmente dependendo de vários fatores tais como, por exemplo, o ingrediente gelificante particular usado, o fluido base particular usado e as propriedades desejadas do gel.
[00148] As misturas em gel e composições em gel da presente divulgação podem ser preparadas por qualquer método adequado conhecido na técnica. Em algumas modalidades, misturas de gel comestível e composições de gel comestível da presente divulgação podem ser preparadas usando outros ingredientes para além do agente gelificante. Exemplos de outros ingredientes adequados podem ser, por exemplo, um ácido alimentar, um sal de um ácido alimentar, um sistema de tampão, um agente de volume, um sequestrante, um agente de reticulação, um ou mais aromatizantes, uma ou mais cores e suas combinações.
[00149] Pode ser usado qualquer composição farmacêutica adequada conhecida na técnica. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas da presente divulgação podem ser usadas para formular fármacos farmacêuticos contendo um ou mais agentes ativos que exercem um efeito biológico. Desse modo, em algumas modalidades, as composições farmacêuticas da presente divulgação podem conter um ou mais agentes ativos que exercem um efeito biológico. Agentes ativos adequados são bem conhecidos na técnica (por exemplo, “The Physician's Desk Reference”). Tais composições podem ser preparadas de acordo com procedimentos bem conhecidos na técnica, por exemplo, como descrito em Remington 's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., EUA.
[00150] Um rebaudiosídeo tal como aqui descrito (por exemplo, Reb W1, Reb W2, Reb D4, Reb M, ou uma sua combinação tal como Reb D4 e Reb M) pode ser usado com quaisquer composições de higiene oral e dentária adequadas conhecidas na técnica. Exemplos de composições de higiene oral e dentária adequadas podem ser, por exemplo, pastas de dentes, polidores de dentes, fio dental, colutório, enxaguantes bucais, dentifrícios, vaporizadores bucais, refrescantes bucais, enxaguantes de placas, analgésicos dentários e semelhantes.
[00151] Como aqui usado, "produto alimentar" se refere a qualquer material ingerível sólido ou líquido que pode, mas não precisa, ter um valor nutricional e ser destinado ao consumo por seres humanos e animais.
[00152] Exemplos de produtos alimentares adequados podem ser, por exemplo, composições de confeitaria, tais como balas, balas de hortelã, gotas com sabor a fruta, produtos de cacau, chocolates e semelhantes; condimentos, tais como ketchup, mostarda, maionese e semelhantes; gomas de mascar; composições de cereais; produtos assados, tais como pães, bolos, tortas, biscoitos e semelhantes; produtos lácteos, tais como leite, queijo, nata, gelado, creme de leite, iogurte, sorvete e afins; composições edulcorantes de mesa; sopas; guisados; alimentos preparados; carnes, tais como presunto, bacon, salsichas, carne seca e semelhantes; gelatinas e produtos semelhantes à gelatina tais como compotas, geleias, conservas e semelhantes; frutas; legumes; produtos de ovo; coberturas de açúcar; xaropes, incluindo melaço; lanches; carnes de nozes e produtos de nozes; e ração animal.
[00153] Os produtos alimentares também podem ser ervas aromáticas, especiarias e condimentos, sabores naturais e sintéticos e intensificadores de sabor, como o glutamato monossódico. Em algumas modalidades, os produtos alimentares podem ser, por exemplo, produtos preparados embalados, tais como edulcorantes dietéticos, edulcorantes líquidos, misturas granuladas de sabores, alimentos para animais de estimação, ração animal, tabaco e materiais para aplicações de panificação, tais como misturas de panificação para a preparação de pães, biscoitos, bolos, panquecas, rosquilhas e semelhantes. Em outras modalidades, os produtos alimentares podem também ser alimentos de dieta e baixo teor calórico e bebidas que contêm pouca ou nenhuma sacarose.
[00154] Em certas modalidades, que podem ser combinadas com quaisquer das modalidades anteriores, o rebaudiosídeo como aqui descrito (por exemplo, Reb W1, Reb W2, Reb D4, Reb M, ou uma sua combinação, tal como Reb D4 e Reb M) é o único edulcorante, opcionalmente em que o produto tem uma intensidade de doçura equivalente a cerca de 1% a cerca de 4% (p/v-%) da solução de sacarose. Em certas modalidades, que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, os produtos de consumo e produtos de bebida podem incluir ainda um edulcorante adicional, opcionalmente em que o produto tem uma intensidade de doçura equivalente a cerca de 1% a cerca de 10% (p/v-%) da solução de sacarose. Em certas modalidades, que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, cada ingrediente edulcorante no produto é um adoçante natural de alta intensidade. Em certas modalidades, que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, cada ingrediente edulcorante no produto pode ser um adoçante natural de alta intensidade. Em certas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o edulcorante adicional contém um ou mais edulcorantes selecionados de um extrato de estévia, um glicosídeo de esteviol, esteviosídeo, rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo B, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo D2, rebaudiosídeo F, dulcosídeo A, rubusosídeo, esteviolbiosídeo, sacarose, xarope de milho com alto teor de frutose, frutose, glicose, xilose, arabinose, ramnose, eritritol, xilitol, manitol, sorbitol, inositol, AceK, aspartamo, neotamo, sucralose, sacarina, naringina di-hidrocalcona (NarDHC), neohesperidina di-hidrocalcona (NDHC), rubusosídeo mogrosídeo IV, siamenosídeo I, mogrosídeo V, Monatina, taumatina, monelina, brazeína, L-alanina, glicina, Lo Han Guo, hernandulcina, filodulcina, trilobtaína, e suas combinações. Em certas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, os produtos de consumo e produtos de bebidas podem incluir adicionalmente um ou mais aditivos selecionados de um carboidrato, um poliol, um aminoácido ou seu sal, um poliaminoácido ou um seu sal, um ácido de açúcar ou um seu sal, um nucleotídeo, um ácido orgânico, um ácido inorgânico, um sal orgânico, um sal de ácido orgânico, um sal de base orgânico, um sal inorgânico, um composto amargo, um aromatizante, um ingrediente aromatizante, um composto adstringente, uma proteína, um hidrolisado de proteína, um tensoativo, um emulsionante, um flavonoide, um álcool, um polímero, e suas combinações. Em certas modalidades, que podem ser combinadas com qualquer das modalidades anteriores, o rebaudiosídeo como aqui descrito (por exemplo, Reb W1, Reb W2, Reb D4, Reb M, ou uma sua combinação, tal como Reb D4 e Reb H) tem um grau de pureza cerca de 50% a cerca de 100% em peso antes de ser adicionado ao produto.
[00155] Em algumas modalidades, um rebaudiosídeo como aqui descrito (por exemplo, Reb W1, Reb W2, Reb D4, Reb M, ou uma sua combinação, tal como Reb D4 e Reb M) é proporcionado em uma composição compreendendo adicionalmente um ou mais de um enchimento, um agente de volume e um agente antiaglomerante. Enchimentos adequados, agentes de volume e agentes antiaglomerantes são conhecidos na técnica.
[00156] Em certas modalidades, um rebaudiosídeo como aqui descrito (por exemplo, Reb W1, Reb W2, Reb D4, Reb M, ou uma sua combinação, tal como Reb D4 e Reb M) pode ser incluído e/ou adicionado a uma concentração final que é suficiente para adoçar e/ou aumentar a doçura dos produtos de consumo e produtos de bebidas. A "concentração final" do rebaudiosídeo como aqui descrito (por exemplo, Reb W1, Reb W2, Reb D4, Reb M, ou uma sua combinação, tal como Reb D4 e Reb M) presente nos produtos de consumo e produtos de bebidas finais (isto é, depois de todos os ingredientes e/ou compostos terem sido adicionados para produzir os produtos de consumo e produtos de bebidas). Desse modo, em certas modalidades, um rebaudiosídeo como aqui descrito (por exemplo, Reb W1, Reb W2, Reb D4, Reb M, ou uma sua combinação, tal como Reb D4 e Reb M) é incluído e/ou adicionado a um composto ou ingrediente usado para preparar os produtos de consumo e produtos de bebidas. O rebaudiosídeo como aqui descrito (por exemplo, Reb W1, Reb W2, Reb D4, Reb M, ou uma sua combinação, tal como Reb D4 e Reb M) pode estar presente em um único composto ou ingrediente, ou múltiplos compostos e ingredientes. Em algumas modalidades, um rebaudiosídeo como aqui descrito (por exemplo, Reb W1, Reb W2, Reb D4, Reb M, ou uma sua combinação, tal como Reb D4 e Reb M) é incluído e/ou adicionado aos produtos de consumo e produtos de bebidas.
[00157] Em certas modalidades, um rebaudiosídeo como aqui descrito (por exemplo, Reb W1, Reb W2, Reb D4, Reb M, ou uma sua combinação, tal como Reb D4 e Reb M) é o único edulcorante incluído e/ou adicionado aos produtos de consumo e aos produtos de bebidas. Em algumas modalidades, os produtos de consumo e os produtos de bebidas compreendendo os rebaudiosídeos têm uma intensidade de doçura equivalente a cerca de 1% a cerca de 4% (p/v-%) da solução de sacarose, cerca de 1% a cerca de 3% (p/v-%) da solução de sacarose, ou cerca de 1% a cerca de 2% (p/v-%) da solução de sacarose. Alternativamente, os produtos de consumo e os produtos de bebidas têm uma intensidade de doçura equivalente a cerca de 1% a cerca de 4% (p/v-%) da solução de sacarose, cerca de 2% a cerca de 4% (p/v-%) da solução de sacarose, cerca de 3% a cerca de 4% (p/v-%) da solução de sacarose, ou cerca de 4%. Por exemplo, os produtos de consumo e os produtos de bebidas podem ter uma intensidade de doçura equivalente a cerca de 1%, cerca de 2%, cerca de 3% ou cerca de 4% (p/v-%) da solução de sacarose, incluindo qualquer intervalo entre estes valores.
[00158] Os produtos de consumo e produtos de bebidas da presente divulgação podem incluir uma mistura de um rebaudiosídeo como aqui descrito (por exemplo, Reb W1, Reb W2, Reb D4, Reb M, ou uma sua combinação, tal como Reb D4 e Reb M) e um ou mais edulcorantes da presente divulgação em uma razão suficiente para se conseguir uma intensidade de doçura desejável, características nutricionais, perfil de sabor, sensação na boca, ou outro fator organoléptico.
[00159] Como é evidente a partir da descrição anterior, certos aspectos da presente divulgação não são limitados pelos detalhes particulares dos exemplos aqui ilustrados, e é por isso contemplado que outras modificações e aplicações, ou seus equivalentes, ocorrerão aos peritos na técnica. Por conseguinte, é pretendido que as reivindicações abranjam todas as modificações e aplicações que não se afastam do espírito e escopo da presente divulgação.
[00160] Além do mais, a menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado como comumente entendido por aquele com habilidade comum na técnica à qual a divulgação pertence. Apesar de quaisquer métodos e materiais semelhantes a ou equivalentes aos descritos aqui poderem ser usados na prática ou teste da presente divulgação, os métodos e materiais preferidos são descritos acima.
[00161] Embora a invenção anterior tenha sido descrita com algum detalhe através de ilustrações e exemplos para propósitos de compreensão, será evidente para aqueles peritos na técnica que certas alterações e modificações podem ser praticadas. Por conseguinte, a descrição e exemplos não devem ser interpretados como limitativos do escopo da invenção, que é delineado pelas reivindicações anexas.
EXEMPLO 1: Síntese Enzimática de Reb D4
[00162] Existem vários métodos enzimáticos de preparar Reb D4. Um dos métodos começando a partir de Reb W é apresentado aqui.
[00163] Anteriormente, demonstramos a produção de Reb W a partir de Reb V (WO2016054540). Aqui, observamos que Reb W pode ser hidrolisado por beta-glicosidase (B-glu1, SEQ: 5) de Pichia pastoris para produzir um novo glicosídeo de esteviol, que chamamos de "Rebaudiosídeo WB1". O Rebaudiosídeo WB1 produzido pode ser hidrolisado por sua vez por B-glu1 para produzir o Rebaudiosídeo WB2. (ver, FIG. 14).
[00164] Mais especificamente, os fragmentos do DNA de comprimento completo do gene B-glu1 (SEQ ID NO: 6) foram sintetizados. Especificamente, o cDNA foi otimizado quanto ao códon para a expressão em E. coli (Genscript, Piscataway, NJ). O DNA sintetizado foi clonado em um vetor de expressão bacteriana pETite N-His SUMO Kan Vector (Lucigen). A sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 6) codificando o B- glu1 (ver, SEQ ID NO:5) foi inserida em quadro.
[00165] O construto de expressão foi transformado em BL21 de E. coli (DE3), que foi subsequentemente cultivado em meio LB contendo 50 μg/mL de canamicina a 37 °C até atingir uma OD600 de 0,8-1,0. A expressão de proteína foi induzida por adição de β-D-1-tiogalactopiranosideo de isopropila (IPTG) a 1 mM e a cultura cresceu adicionalmente em 16 °C durante 22 h. As células foram recolhidas por centrifugação (3,000 x g; 10 min; 4 °C). Os sedimentos de células foram recolhidos e foram usados imediatamente ou armazenados a - 80 °C.
[00166] Os sedimentos de células foram ressuspensos em tampão de lise (tampão fosfato de potássio a 50 mM, pH 7,2, lisozima a 25 μg/mL, DNase I a 5 μg/mL, imidazol a 20 mM, NaCl a 500 mM, glicerol a 10% e TRITON X-100 a 0,4%). As células foram rompidas por sonicação a 4 °C e os resíduos celulares foram clarificados por centrifugação (18,000 x g; 30 min). O sobrenadante foi carregado em uma coluna de afinidade Ni-NTA (Qiagen) equilibrada (tampão de equilibração: tampão de fosfato de potássio a 50 mM, pH 7,2, imidazol a 20 mM, NaCl a 500 mM, glicerol a 10%). Após o carregamento da amostra de proteína, a coluna foi lavada com tampão de equilibração para remover proteínas contaminantes não ligadas. O polipeptídeo recombinante B-glu1 marcado com His foi eluído pelo tampão de equilíbrio contendo imidazol a 250 mM.
[00167] O B-glu1 recombinante (10 μg) foi adicionado em um sistema reacional in vitro de 200 μL. O sistema reacional continha tampão fosfato de potássio a 50 mM, pH 7,2 e Rebaudiosídeo W a 1 mg/mL como o substrato. A reação foi realizada a 37 °C e terminada pela adição de 200 μL de 1- butanol. As amostras foram extraídas três vezes com 200 μL de 1-butanol. A fração reunida foi seca e dissolvida em 70 μL de metanol a 80% para análise por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC).
[00168] A análise por HPLC foi realizada usando um sistema Dionex UPLC ultimate 3000 (Sunnyvale, CA), incluindo uma bomba quaternária, um compartimento de coluna com temperatura controlada, um amostrador automático e um detector de absorvância no UV. A coluna Synergi Hydro-RP com coluna de proteção foi usada para a caracterização dos glicosídeos de esteviol. Acetonitrila em água foi usada para eluição na análise de HPLC. O comprimento de onda de detecção foi 210 nm.
[00169] Como mostrado na FIG. 3, B-glu1 hidrolisou o substrato rebaudiosídeo W para produzir o rebaudiosídeo WB1 em 1 hora (Fig. 3B). O rebaudiosídeo WB1 produzido pode ser convertido adicionalmente para o rebaudiosídeo WB2 em pontos de tempo de reação posteriores (Fig. 3C e 3D).
[00170] Em conclusão, Rebaudiosídeo W foi hidrolisado por B-glu1 para produzir WB1, o WB1 produzido foi hidrolisado adicionalmente por B-glu1 para produzir WB2.
[00171] O intermediário acima rebaudiosídeo WB2 pode ser convertido de volta para rebaudiosídeo WB1 por incubação com a enzima UGT85C2 (FIG. 4). A enzima UGT85C2 recombinante (10 μg) foi testada em um sistema reacional in vitro de 200 μL. O sistema reacional continha tampão fosfato de potássio a 50 mM, pH 7,2, MgCl2 a 3 mM, substrato rebaudiosídeo WB2 a 0,5 mg/mL e UDP-glicose a 3 mM. Como mostrado na FIG. 3, o rebaudiosídeo WB2 pode ser convertido em rebaudiosídeo WB1 por UGT85C2 (SEQ ID NO: 7, FIG. 4). A enzima UGT85C2 tem atividade para formar o esteviol-13-monosídeo a partir de esteviol adicionando uma glicose ao C-13 de carboxilo C4. Estes resultados indicaram que B-glu1 hidrolisou uma glicose da posição C13 do rebaudiosídeo WB1 para produzir o rebaudiosídeo WB2. As estruturas previstas do rebaudiosídeo WB1 e rebaudiosídeo WB2 são mostradas na FIG. 2 As estruturas foram confirmadas por análise de LC-MS (FIG. 5).
[00172] O intermediário acima Reb WB1 pode ser convertido para Reb D4 por incubação com enzima HV1 UGT (WO/2015/065650). A HV1 recombinante (10 μg) foi testada em um sistema reacional in vitro de 200 μL. O sistema reacional continha tampão fosfato de potássio a 50 mM, pH 7,2, MgCl2 a 3 mM, substrato rebaudiosídeo WB1 a 0,5 mg/mL e UDP-glicose a 3 mM. Como mostrado na FIG. 4, o rebaudiosídeo WB1 pode ser completamente convertido em rebaudiosídeo D4 por HV1 em 6 horas (FIG. 6 C).
[00173] De acordo com as reações enzimáticas acima, a estrutura de D4 foi predita como (ácido 13-[(2-O-β-D- glicopiranosil-β-D-glicopiranosil)oxi] ent-caur-16-en-19- óico -[éster (2-O-β-D-glicopiranosil-3-O-β-D- glicopiranosil-β-D-glicopiranosil] (Fig. 7 A). A estrutura de Reb D4 foi confirmada por LC-MS (FIG. 7 B). A análise espectral de massa mostrou a mesma massa [(M+Na) 1151,47 m/z] como a estrutura estabelecida.
EXEMPLO 2: Conversão de Reb D4 para Reb M por enzima do tipo selvagem
[00174] Descobrimos que o Reb D4 pode ser convertido adicionalmente em Reb M pela UGT76G1. Os fragmentos do DNA de comprimento completo de UGT76G1 (SEQ ID NO: 2) foram sintetizados. O cDNA foi otimizado quanto ao códon para a expressão em E. coli (Genscript). O DNA sintetizado foi clonado em um vetor de expressão bacteriana pETite N-His SUMO Kan Vector (Lucigen). A sequência de nucleotídeos que codifica o 76G1 foi inserida em quadro.
[00175] O construto de expressão foi transformado em BL21 de E. coli (DE3), que foi subsequentemente cultivado em meio LB contendo 50 μg/mL de canamicina a 37 °C até atingir uma OD600 de 0,8-1,0. A expressão de proteína foi induzida por adição de IPTG a 0,5 mM e a cultura cresceu adicionalmente em 16 °C durante 22 h. As células foram recolhidas por centrifugação (3,000 x g; 10 min; 4 °C). Os sedimentos de células foram recolhidos e foram usados imediatamente ou armazenados a -80 °C.
[00176] Os sedimentos de células foram ressuspensos em tampão de lise como descrito acima. As células foram rompidas por sonicação a 4 °C e os resíduos celulares foram clarificados por centrifugação (18,000 x g; 30 min). O sobrenadante foi carregado em uma coluna de afinidade Ni-NTA (Qiagen) equilibrada como descrito acima. Após o carregamento da amostra de proteína, a coluna foi lavada com tampão de equilibração para remover proteínas contaminantes não ligadas. O polipeptídeo recombinante 76G1 marcado com His foi eluído pelo tampão de equilíbrio contendo imidazol a 250 mM.
[00177] O UGT76G1 recombinante (10 μg) foi adicionado em um sistema reacional in vitro de 200 μL. O sistema reacional continha tampão fosfato de potássio a 50 mM, pH 7,2, UDPG a 1 mM como cofator e Reb D4 a 1 mg/mL como o substrato. A reação foi realizada a 37 °C e terminada pela adição de 200 μL de 1-butanol. As amostras foram extraídas três vezes com 200 μL de 1-butanol. A fração reunida foi seca e dissolvida em 70 μL de metanol a 80% para análise por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC).
[00178] A análise por HPLC foi realizada usando um sistema Dionex UPLC ultimate 3000, incluindo uma bomba quaternária, um compartimento de coluna com temperatura controlada, um amostrador automático e um detector de absorvância no UV. A coluna Synergi Hydro-RP com coluna de proteção foi usada para a caracterização dos glicosídeos de esteviol. Acetonitrila em água foi usada para eluição na análise de HPLC. O comprimento de onda de detecção foi 210 nm.
[00179] Como mostrado na FIG. 13, UGT76G1 pode converter Reb D4 para Reb M (FIG. 13 C; e F).
EXEMPLO 3: Resolução dos centros de reação das enzimas UGT que catalisam Reb D4 em Reb M
[00180] Para determinar mais eficientemente os processos químicos da UDP-glicosiltransferase, obtivemos a estrutura de cristal de uma UDP-glicosiltransferase de esteviol UGT76G1 de tipo selvagem. Esta enzima é a primeira enzima relatada que realiza bioconversões de glicosídeos de esteviol. Queremos adquirir as informações estruturais do centro de reação e dos sítios de ligação do substrato para projetar enzimas para conversão de Reb D4 para Reb M para compreender estasmais completamente e depois usar esse conhecimento para encontrar mais eficientemente ou projetar enzimas que possam ser úteis na bioconversão de Reb D4 para Reb M.
[00181] Para a produção de proteína substituída por selenometionina (SeMet), as células de Escherichia coli BL21 (DE3) foram transformadas com o vetor pET-28a-UGT76G1 e cultivadas em meio mínimo M9 suplementado com SeMet (Doublie, 2007) contendo 50 μg mL-1 de canamicina a 37 °C (250 rpm) até A600nm~0,8. A adição de 1-tio-β-D-galactopiranosideo de isopropila (0,8 mM final) induziu a expressão de proteína com células cultivadas durante a noite (16 °C). Os sedimentos celulares foram colhidos por centrifugação (10,000 x g; 10 min) e suspensos em tampão de lise (Tris a 50 mM, pH 8,0, NaCl a 500 mM, imidazol a 20 mM, β-mercaptoetanol (β-ME) a 1 mM, glicerol a 10% (v/v) e Tween-20 a 1% (v/v)). Após a lise por sonicação, os fragmentos celulares foram removidos por centrifugação (30,000 x g; 45 min) e o sobrenadante foi passado sobre uma coluna de ácido nitriloacético Ni2+ (NTA; Qiagen) equilibrada com tampão de lavagem (tampão de lise menos Tween-20). Após o carregamento, a coluna foi lavada com 10 volumes de coluna de tampão de lavagem. A proteína de fusão ligada foi eluída com tampão de eluição (tampão de lavagem com imidazol a 250 mM) e recolhida. Para purificação adicional, a cromatografia por exclusão de tamanho foi realizada em uma coluna Superdex-200 26/60 HiLoad FPLC equilibrada com Tris a 50 mM, pH 8,0, NaCl a 25 mM, tris (2- carboxietil) fosfina a 1 mM (TCEP). As frações do pico foram recolhidas e concentradas usando concentradores centrífugos (Amicon) com a concentração de proteína determinada usando o ensaio de Bradford com albumina de soro bovino como padrão. A proteína purificada foi congelada rapidamente em nitrogênio líquido e armazenada a -80 °C.
[00182] A UGT761 purificada foi concentrada para 10 mg mL-1 e cristalizada usando o método de difusão de vapor de gota pendurada “hanging-drop” com uma gota de 2 μL (proteína concentrada 1:1 e condição de cristalização). Os cristais de qualidade de difração foram obtidos a 4 °C com PEG-4000 a 20% (p/v), 2-propanol a 20% (v/v) e tampão de di-hidrato tribásico de citrato de sódio a 100 mM (pH 5,6). Cristais individuais foram congelados em nitrogênio líquido com o licor-mãe contendo 25% de glicerol como crioprotetor. Os dados de difração (100 K) foram coletados na linha de luz 19-ID na Advanced Photon Source no Argonne National Laboratory (À = 0,98 Â). HKL3000 (Otwinowski & Minor, 1997) foi usado para indexar, integrar e dimensionar dados de difração. A estrutura da UGT76G1 substituída com SeMet foi determinada por faseamento de difração anômala a um único comprimento de onda (SAD). SHELX (Sheldrick, 2008) foi utilizado para determinar as posições SeMet e estimar as fases iniciais a partir do conjunto de dados de pico de comprimento de onda. O refinamento das posições e parâmetros de SeMet foi realizado com MLPHARE (Terwilliger, 2000). A retificação com solvente usando modificação de densidade implementada com ARP/wARP (Morris et al., 2003) foi empregada para construir um modelo inicial. As subsequentes rodadas iterativas de modelagem manual e refinamento, que incluíram o refinamento do parâmetro translação-calibração-avaliação, usaram COOT (Emsley et al., 2010) e PHENIX (Adams et al., 2007), respectivamente. A coleta de dados e os dados de refinamento estão resumidos na Tabela 1. Tabela 1. Resumo da estatística cristalográfica
Figure img0004
Figure img0005
[00183] A estrutura da UGT71G1 consiste em um domínio do terminal N e domínio do terminal C com dobras do tipo Rossmann semelhantes e, como previsto, pertence ao enrolamento GT-B (FIG. 8). A orientação padrão da estrutura de cristal de UGT76G1 é mostrada na FIG. 8. O domínio do terminal N contém uma folha β paralela central de sete fitas flanqueada por oito hélices α. O domínio também contém a histidina catalítica. O domínio do terminal C contém uma folha β de seis fitas simples flanqueada por sete hélices α (Fig. 9). Os dois domínios se encaixam muito bem e formam uma fenda profunda com uma molécula de UDP ligada.
EXEMPLO 4: Concepção Racional de Mutantes
[00184] Com base na estrutura da UGT76G1, foi possível projetar as permutações circulares (PLoS computational Biology, 2012, 8(3) e1002445; BIOINFORMATICS, 2015, (3) e um conjunto de mutações. A análise de permutação circular é uma ferramenta poderosa para desenvolver enzimas úteis ou valiosas. Depois de testar várias versões de permutações circulares, descobrimos que uma versão de mutação circular com atividade muito alta "permutação circular 1" ("CP1") tem a maior atividade. De acordo com a presente divulgação, estudamos a atividade da enzima CP1 (SEQ ID NO: 3) e sua capacidade de auxiliar as conversões de Reb D4 para Reb M.
[00185] A estrutura de UGT76G1 e CP1 é comparada na FIG. 10. Embora a maioria das características estruturais da estrutura de cristal de UGT76G1 são semelhantes como entre UGT e CP1, a CP1 tem significativamente diferente sequência e estrutura na porção "folhas beta" da sua estrutura (FIG. 11).
[00186] De modo a prever a atividade catalítica das nossas enzimas, ancoramos o Reb D4 no centro de reação de CP1. Destacamos o centro de reação com foco nas interações da enzima com Reb D4. O ligando de rebaudiosídeo D4 ancorado está em uma posição favorável em relação à histidina catalítica e à UDP ligada (Figura 12). Com base nesta experiência de ancoragem, fomos capazes de encontrar resíduos específicos com valor para o teste de atividade via estudos de mutagênese.
[00187] Com base na análise de modelação de CP1, selecionamos e testamos vários locais de mutação de CP1 para aumentar a atividade enzimática. Finalmente, encontramos vários locais de mutação (Tabela 2) relacionados com a bioconversão do rebaudiosídeo D4 em rebaudiosídeo M. CR1 é um tipo de mutante CP1 que inclui pelo menos um sítio de mutação na Tabela 2. Tabela 2. Resumo dos sítios de mutação de CP1.
Figure img0006
EXEMPLO 5: Conversão de Reb D4 para Reb M usando UGTs mutantes.
[00188] Neste Exemplo, para confirmar a conversão de Reb D4 para rebaudiosídeo M in vitro, os mutantes de UGT76G1, CP1 e enzima foram testados usando Reb D4 como substrato de glicosídeo de esteviol. O polipeptídeo recombinante (10 μg) foi testado em um sistema reacional in vitro de 200 μL. O sistema reacional continha tampão fosfato de potássio a 50 mM, pH 7,2, MgCl2 a 3 mM, substrato glicosídeo de esteviol a 1 mg/mL e UDP-glicose a 1 mM. A reação foi realizada a 30 °C e terminada pela adição de 200 μL de 1-butanol. As amostras foram extraídas três vezes com 200 μL de 1-butanol. A fração reunida foi seca e dissolvida em 70 μL de metanol a 80% para análise por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Rebaudiosídeo D4 foi usado como substrato. A análise por HPLC foi realizada usando um sistema Dionex UPLC ultimate 3000 (Sunnyvale, CA), incluindo uma bomba quaternária, um compartimento de coluna com temperatura controlada, um amostrador automático e um detector de absorvância no UV. A coluna Synergi Hydro-RP com coluna de proteção foi usada para a caracterização dos glicosídeos de esteviol. Acetonitrila em água foi usada para eluição na análise de HPLC. O comprimento de onda de detecção foi 210 nm. Como mostrado na FIG. 13, o mutante de UGT76G1, CP1 e CR1 pode transferir uma molécula de glicose para Reb D4 para formar Reb M. No entanto, CP1 e CR1 possuem atividade enzimática significativamente mais elevada do que a enzima UGT76G1.
EXEMPLO 6: A estrutura de Reb WB2 analisada por RMN
[00189] O material usado para a caracterização de Reb WB2 foi produzido usando conversão enzimática de Reb W e purificado por HPLC. Os espectros de RMN foram adquiridos em instrumentos Agilent VNMRS 500 MHz usando sequências de pulso padrão. Os espectros de RMN 1D (1H e 13C) e 2D (TOCSY, ASAPHMQC, GCOSY e GHMBC) foram realizados em CD3OD.
[00190] A fórmula molecular de Reb WB2 foi deduzida como C38H60O18 com base no seu espectro de massa positivo de alta resolução (HR) que apresentou íons adutos correspondentes à [M+ Na]+ em m/z 827,3671; esta composição foi suportada pelos dados espectrais de RMN.
[00191] Os dados espectrais de RMN de Reb WB2 revelaram o esqueleto básico dos diterpenoides ent-caurano e foram adicionalmente confirmados pelas experiências GHMBC, COSY e TOCSY. As multiplicidades de carbono foram confirmadas usando o teste APT. A RMN de 13C mostrou 3 átomos de carbono anomérico (δ 102,8, 101,7 e 92,46), bem como três sinais - CH2OH em δ 62,2, 61,14 e 60,88 confirmando as 3 unidades de açúcar. Também estava presente uma ressonância carbonila em δ177,1 e dois carbonos alquenos em δ 152,2 e 104,4. Correlações GHMBC de H21 a C19 confirmaram os pontos de ligação dos açúcares à estrutura central do diterpenoide. O deslocamento químico de C13 em δ 79,4 indica um oxigênio ligado a este carbono. Os valores de RMN de 1H e 13C para Reb WB2 foram atribuídos com base nos dados de TOCSY, HMQC e HMBC e são apresentados na Tabela 3. Tabela 3. Dados espectrais de RMN de 1H e 13C (desvios químicos e constantes de acoplamento) para Reb WB2a-c. a atribuições feitas com base nas correlações TOCSY, ASAPHMQC e GHMBC; b Os valores do desvio químico estão em δ (ppm); c As constantes de acoplamento estão em Hz.
Figure img0007
Figure img0008
[00192] As principais correlações GHMBC entre H33 a C25, H27 a C24 confirmaram a conectividade das 3 moléculas de açúcar. Com base em todas as correlações 2D observadas e o desvio químico sinaliza a estrutura de Reb WB2 como é mostrada na FIG. 15. A estrutura de Reb WB2 foi deduzida como ácido 13-hidróxi-ent-caur-16-en-19-óico-éster[(2-O-e- D-glicopiranosil-3-O-β-D-glicopiranosil-β-D- glicopiranosil).
EXEMPLO 7: A estrutura de Reb WB1 analisada por RMN
[00193] O material usado para a caracterização de Reb WB1 foi produzido usando conversão enzimática de Reb W e purificado por HPLC. Os espectros de RMN foram adquiridos em instrumentos Agilent VNMRS 500 MHz usando sequências de pulso padrão. Os espectros de RMN 1D (1H e 13C) e 2D (TOCSY, ASAPHMQC, GCOSY e GHMBC) foram realizados em 80% CD3OD - 20% D2O.
[00194] A fórmula molecular de Reb WB1 foi deduzida como C44H70O23 com base no seu espectro de massa positivo de alta resolução (HR) que apresentou íons adutos correspondentes à [M+ Na]+ em m/z 989,4206; esta composição foi suportada pelos dados espectrais de RMN.
[00195] Os dados espectrais de RMN de Reb WB1 revelaram o esqueleto básico dos diterpenoides ent-caurano e foram adicionalmente confirmados pelas experiências GHMBC, COSY e TOCSY. As multiplicidades de carbono foram confirmadas usando o teste APT. A RMN de 13C mostrou 4 átomos de carbono anomérico (δ 102,6, 101,6, 97,6 e 92,61), bem como quatro sinais -CH2OH em δ 62,0, 61,1, 61,0 e 60,8 confirmando as 4 unidades de açúcar. Também estava presente uma ressonância carbonila em δ177,0 e dois carbonos alquenos em δ 152,5 e 104,4. Correlações GHMBC de H21 a C19 e H39 a C13 confirmaram os pontos de ligação dos açúcares à estrutura central do diterpenoide. Os valores de RMN de 1H e 13C para Reb WB1 foram atribuídos com base nos dados de TOCSY, HMQC e HMBC e são apresentados na Tabela 4. Tabela 4. Dados espectrais de RMN de 1H e 13C (desvios químicos e constantes de acoplamento) para Reb WB1a-c. a atribuições feitas com base nas correlações TOCSY, ASAPHMQC e GHMBC; bOs valores do desvio químico estão em δ (ppm); c As const antes de acoplamento estão em Hz .
Figure img0009
Figure img0010
Figure img0011
[00196] Outras correlações principais GHMBC entre H33 a C25, H27 a C24 (e vice-versa) confirmaram as ligações de 3 das moléculas de açúcar. Com base em todas as correlações 2D observadas e o desvio químico sinaliza a estrutura de Reb WB1 como é mostrada na FIG. 16. A estrutura de Reb WB1 foi deduzida como ácido 13-β-D-glicopiranosil0xi ent-caur-16-en- 19-óico-éster[(2-O-β-D-glicopiranosil-3-O-β-D- glicopiranosil-β-D-glicopiranosil).
EXEMPLO 8: A estrutura de Reb D4 analisada por RMN
[00197] O material usado para a caracterização de Reb D4 foi produzido usando conversão enzimática de Reb WB1 e purificado por HPLC. Os espectros de RMN foram adquiridos em instrumentos Agilent VNMRS 500 MHz usando sequências de pulso padrão. Os espectros de RMN 1D (1H e 13C) e 2D (TOCSY, ASAPHMQC, GCOSY e GHMBC) foram realizados em 80% CD3OD e 20% D2O.
[00198] A fórmula molecular de Reb D4 foi deduzida como C50H80O28 com base no seu espectro de massa positivo de alta resolução (HR) que apresentou íons adutos correspondentes à [M+ Na]+ em m/z 1151,4728; esta composição foi suportada pelos dados espectrais de RMN.
[00199] Os dados espectrais de RMN de 1H de Reb D4 mostraram a presença de dois singletos de metilo em δ 1,24 e 0,92, dois prótons olefínicos como singletos em δ 5,20 e 4,86 de uma ligação dupla exocíclica. O esqueleto básico dos diterpenoides ent-caurano foi suportado pelas experiências GHMBC, COSY e TOCSY. As multiplicidades de carbono foram confirmadas usando o teste APT. A RMN de 13C mostrou 5 átomos de carbono anomérico (δ 103,5, 102,5, 101,8, 95,6 e 92,8), confirmando as 5 unidades de açúcar, um carbonilo em δ177,1 e dois átomos de carbono alqueno em δ 152,2 e 104,4. As correlações GHMBC de H40 a C12 e H22 a C19 confirmaram os pontos de ligação dos açúcares à estrutura central do diterpenoide. Os valores de RMN de 1H e 13C para Reb D4 foram atribuídos com base nos dados de TOCSY, HMQC e HMBC e são apresentados na Tabela 5. Tabela 5. Dados espectrais de RMN de 1H e 13C (desvios químicos e constantes de acoplamento) para Reb D4a-c. a atribuições feitas com base nas correlações TOCSY, ASAPHMQC e GHMBC; b Os valores do desvio químico estão em δ (ppm); c As const antes de acoplamento estão em Hz .
Figure img0012
Figure img0013
Figure img0014
[00200] As principais correlações GHMBC entre H45 a C46, H28 a C27 e H26 a C34 (e vice-versa) confirmaram a conectividade das 5 moléculas de açúcar. Com base em todas as correlações 2D observadas e o desvio químico sinaliza a estrutura de Reb D4 como é mostrada na FIG. 17. A estrutura de Red D4 foi deduzida como ácido 13-[(2-O-β-D- glicopiranosil-β-D-glicopiranosil)oxi] ent-caur-16-en-19- óico-éster [(2-O-β-D-glicopiranosil-3-O-β-D-glicopiranosil- β-D-glicopiranosil)].
EXEMPLO 9: Teste de sabor de rebaudiosídeos
[00201] Uma avaliação sensorial dos rebaudiosídeos foi realizada usando sacarose como controle. A amostra de sacarose foi comprada da Sigma-Aldrich e foi usada para preparar amostras de controle a três concentrações diferentes de 1,0%, 3,0% e 6,0% de sacarose em água engarrafada (p/v) à temperatura ambiente. O rebaudiosídeo foi preparado a 300 ppm para avaliação sensorial por adição de uma massa correspondente em 1000 mL de água engarrafada. A mistura foi agitada à temperatura ambiente e a amostra de glicosídeo de esteviol foi então avaliada contra várias amostras de sacarose de controle a 1,0%, 3,0% e 6,0% por um painel de 13 voluntários humanos. Os resultados da avaliação sensorial são mostrados na Tabela 6. Tabela 6. Avaliação sensorial de Reb W1, D4 em comparação com a sacarose Reb W2 e Reb
Figure img0015
DECLARAÇÃO DE APLICABILIDADE INDUSTRIAL / CAMPO TÉCNICO
[00202] Esta divulgação tem aplicabilidade nas indústrias de alimentos, rações, bebidas e farmacológicas. Esta divulgação se refere em geral a um método para a produção biossintética de glicosídeos de esteviol via uma cepa microbiana modificada. Literatura Citada e Incorporado por Referência: 1. Brandle, J. E. et al., (1998). Stevia Rebaudiana: Its Agricultural, Biological, and Chemical Properties, CANADIAN J. PLANT SCIENCE. 78 (4): 527-36. 2. Ceunen, S., e J.M. C. Geuns, Steviol Glycosides: Chemical Diversity, Metabolism, and Function, J. NAT. PROD., 2013, 76 (6), pp 1201-28 (2013) . 3. Du J et al., (2011), Engineering microbial factories for synthesis of value-added products, J IND MICROBIOL BIOTECHNOL. 38: 873-90. 4. GRAS Notices, USA Food and Drug Administration, United States Health & Human Services. (2016) (relevante para glicosídeos de esteviol & poliglicosídeos). 5. Hâusler A, e Münch T., (1997), Microbial production of natural flavors, ASM NEWS 63:551-59. 6. Prakash I., et al.; Isolation and Characterization of a Novel Rebaudioside M Isomer from a Bioconversion Reaction of Rebaudioside A and NMR Comparison Studies of Rebaudioside M Isolated from Stevia rebaudiana Bertoni and Stevia rebaudiana Morita, BIOMOLECULES, junho de 2014; 4(2): 374-89. (Publicado online em 31 de março de 2014. 2014). 7. Prakash I., et al., Development of Next Generation Stevia Sweetener: Rebaudioside M, FOODS, 2014, 3:162-175. 8. Shockey JM. Et a., (2003), Arabidopsis contains a large superfamily of acyl-activating enzymes: phylogenetic and biochemical analysis reveals a new class of acyl-coenzyme A synthetases. PLANT PHYSIOL 132 1065-76. Sequências de Interesse: Sequência de UGT76G1: Sequência de Aminoácidos: (SEQ ID NO: 1) MENKTETTVRRRRRIILFPVPFQGHINPILQLANVLYSKGFSITIFHTNFNKPKTSNYP HFTFRFILDNDPQDERISNLPTHGPLAGMRIPIINEHGADELRRELELLMLASEEDEEV SCLITDALWYFAQSVADSLNLRRLVLMTSSLFNFHAHVSLPQFDELGYLDPDDKTRLEE QASGFPMLKVKDIKSAYSNWQILKEILGKMIKQTKASSGVIWNSFKELEESELETVIRE IPAPSFLIPLPKHLTASSSSLLDHDRTVFQWLDQQPPSSVLYVSFGSTSEVDEKDFLEI ARGLVDSKQSFLWVVRPGFVKGSTWVEPLPDGFLGERGRIVKWVPQQEVLAHGAIGAFW THSGWNSTLESVCEGVPMIFSDFGLDQPLNARYMSDVLKVGVYLENGWERGEIANAIRR VMVDEEGEYIRQNARVLKQKADVSLMKGGSSYESLESLVSYISSL Sequência de DNA: (SEQ ID NO: 2) ATGGAGAATAAGACAGAAACAACCGTAAGACGGAGGCGGAGGATTATCTTGTTCCCTGT ACCATTTCAGGGCCATATTAATCCGATCCTCCAATTAGCAAACGTCCTCTACTCCAAGG GATTTTCAATAACAATCTTCCATACTAACTTTAACAAGCCTAAAACGAGTAATTATCCT CACTTTACATTCAGGTTCATTCTAGACAACGACCCTCAGGATGAGCGTATCTCAAATTT ACCTACGCATGGCCCCTTGGCAGGTATGCGAATACCAATAATCAATGAGCATGGAGCCG ATGAACTCCGTCGCGAGTTAGAGCTTCTCATGCTCGCAAGTGAGGAAGACGAGGAAGTT TCGTGCCTAATAACTGATGCGCTTTGGTACTTCGCCCAATCAGTCGCAGACTCACTGAA TCTACGCCGTTTGGTCCTTATGACAAGTTCATTATTCAACTTTCACGCACATGTATCAC TGCCGCAATTTGACGAGTTGGGTTACCTGGACCCGGATGACAAAACGCGATTGGAGGAA CAAGCGTCGGGCTTCCCCATGCTGAAAGTCAAAGATATTAAGAGCGCTTATAGTAATTG GCAAATTCTGAAAGAAATTCTCGGAAAAATGATAAAGCAAACCAAAGCGTCCTCTGGAG TAATCTGGAACTCCTTCAAGGAGTTAGAGGAATCTGAACTTGAAACGGTCATCAGAGAA ATCCCCGCTCCCTCGTTCTTAATTCCACTACCCAAGCACCTTACTGCAAGTAGCAGTTC CCTCCTAGATCATGACCGAACCGTGTTTCAGTGGCTGGATCAGCAACCCCCGTCGTCAG TTCTATATGTAAGCTTTGGGAGTACTTCGGAAGTGGATGAAAAGGACTTCTTAGAGATT GCGCGAGGGCTCGTGGATAGCAAACAGAGCTTCCTGTGGGTAGTGAGACCGGGATTCGT TAAGGGCTCGACGTGGGTCGAGCCGTTGCCAGATGGTTTTCTAGGGGAGAGAGGGAGAA TCGTGAAATGGGTTCCACAGCAAGAGGTTTTGGCTCACGGAGCTATAGGGGCCTTTTGG ACCCACTCTGGTTGGAATTCTACTCTTGAAAGTGTCTGTGAAGGCGTTCCAATGATATT TTCTGATTTTGGGCTTGACCAGCCTCTAAACGCTCGCTATATGTCTGATGTGTTGAAGG TTGGCGTGTACCTGGAGAATGGTTGGGAAAGGGGGGAAATTGCCAACGCCATACGCCGG GTAATGGTGGACGAGGAAGGTGAGTACATACGTCAGAACGCTCGGGTTTTAAAACAAAA AGCGGACGTCAGCCTTATGAAGGGAGGTAGCTCCTATGAATCCCTAGAATCCTTGGTAA GCTATATATCTTCGTTATAA Sequência de CP1: Aminoácido: (SEQ ID NO:3) MNWQILKEILGKMIKQTKASSGVIWNSFKELEESELETVIREIPAPSFLIPLPKHLTAS SSSLLDHDRTVFQWLDQQPPSSVLYVSFGSTSEVDEKDFLEIARGLVDSKQSFLWVVRP GFVKGSTWVEPLPDGFLGERGRIVKWVPQQEVLAHGAIGAFWTHSGWNSTLESVCEGVP MIFSDFGLDQPLNARYMSDVLKVGVYLENGWERGEIANAIRRVMVDEEGEYIRQNARVL KQKADVSLMKGGSSYESLESLVSYISSLENKTETTVRRRRRIILFPVPFQGHINPILQL ANVLYSKGFSITIFHTNFNKPKTSNYPHFTFRFILDNDPQDERISNLPTHGPLAGMRIP IINEHGADELRRELELLMLASEEDEEVSCLITDALWYFAQSVADSLNLRRLVLMTSSLF NFHAHVSLPQFDELGYLDPDDKTRLEEQASGFPMLKVKDIKSAYS Sequência de DNA: (SEQ ID NO:4) ATGAACTGGCAAATCCTGAAAGAAATCCTGGGTAAAATGATCAAACAAACCAAAGCGTC GTCGGGCGTTATCTGGAACTCCTTCAAAGAACTGGAAGAATCAGAACTGGAAACCGTTA TTCGCGAAATCCCGGCTCCGTCGTTCCTGATTCCGCTGCCGAAACATCTGACCGCGAGC AGCAGCAGCCTGCTGGATCACGACCGTACGGTCTTTCAGTGGCTGGATCAGCAACCGCC GTCATCGGTGCTGTATGTTTCATTCGGTAGCACCTCTGAAGTCGATGAAAAAGACTTTC TGGAAATCGCTCGCGGCCTGGTGGATAGTAAACAGTCCTTCCTGTGGGTGGTTCGTCCG GGTTTTGTGAAAGGCAGCACGTGGGTTGAACCGCTGCCGGATGGCTTCCTGGGTGAACG CGGCCGTATTGTCAAATGGGTGCCGCAGCAAGAAGTGCTGGCACATGGTGCTATCGGCG CGTTTTGGACCCACTCTGGTTGGAACAGTACGCTGGAATCCGTTTGCGAAGGTGTCCCG ATGATTTTCAGCGATTTTGGCCTGGACCAGCCGCTGAATGCCCGCTATATGTCTGATGT TCTGAAAGTCGGTGTGTACCTGGAAAACGGTTGGGAACGTGGCGAAATTGCGAATGCCA TCCGTCGCGTTATGGTCGATGAAGAAGGCGAATACATTCGCCAGAACGCTCGTGTCCTG AAACAAAAAGCGGACGTGAGCCTGATGAAAGGCGGTAGCTCTTATGAATCACTGGAATC GCTGGTTAGCTACATCAGTTCCCTGGAAAATAAAACCGAAACCACGGTGCGTCGCCGTC GCCGTATTATCCTGTTCCCGGTTCCGTTTCAGGGTCATATTAACCCGATCCTGCAACTG GCGAATGTTCTGTATTCAAAAGGCTTTTCGATCACCATCTTCCATACGAACTTCAACAA ACCGAAAACCAGTAACTACCCGCACTTTACGTTCCGCTTTATTCTGGATAACGACCCGC AGGATGAACGTATCTCCAATCTGCCGACCCACGGCCCGCTGGCCGGTATGCGCATTCCG ATTATCAATGAACACGGTGCAGATGAACTGCGCCGTGAACTGGAACTGCTGATGCTGGC CAGTGAAGAAGATGAAGAAGTGTCCTGTCTGATCACCGACGCACTGTGGTATTTCGCCC AGAGCGTTGCAGATTCTCTGAACCTGCGCCGTCTGGTCCTGATGACGTCATCGCTGTTC AATTTTCATGCGCACGTTTCTCTGCCGCAATTTGATGAACTGGGCTACCTGGACCCGGA TGACAAAACCCGTCTGGAAGAACAAGCCAGTGGTTTTCCGATGCTGAAAGTCAAAGACA TTAAATCCGCCTATTCGTAA Sequência de B-glu1: Aminoácido: (SEQ ID NO:5) MTQLDVESLIQELTLNEKVQLLSGSDFWHTTPVRRLGIPKMRLSDGPNGVRGTKFFNGV PTACFPCGTGLGATFDKELLKEAGSLMADEAKAKAASVVLGPTANIARGPNGGRGFESF GEDPVVNGLSSAAMINGLQGKYIAATMKHYVCNDLEMDRNCIDAQVSHRALREVYLLPF QIAVRDANPRAIMTAYNKANGEHVSQSKFLLDEVLRKEWGWDGLLMSDWFGVYDAKSSI TNGLDLEMPGPPQCRVHSATDHAINSGEIHINDVDERVRSLLSLINYCHQSGVTEEDPE TSDNNTPETIEKLRKISRESIVLLKDDDRNRSILPLKKSDKIAVIGNNAKQAAYCGGGS ASVLSYHTTTPFDSIKSRLEDSNTPAYTIGADAYKNLPPLGPQMTDSDGKPGFDAKFFV GSPTSKDRKLIDHFQLTNSQVFLVDYYNEQIPENKEFYVDVEGQFIPEEDGTYNFGLTV FGTGRLFVDDKLVSDSSQNQTPGDSFFGLAAQEVIGSIHLVKGKAYKIKVLYGSSVTRT YEIAASVAFEGGAFTFGAAKQRNEDEEIARAVEIAKANDKVVLCIGLNQDFESEGFDRP DIKIPGATNKMVSAVLKANPNTVIVNQTGTPVEMPWASDAPVILQAWFGGSEAGTAIAD VLFGDYNPSGKLTVTFPLRFEDNPAYLNFQSNKQACWYGEDVYVGYRYYETIDRPVLFP FGHGLSFTEFDFTDMFVRLEEENLEVEVVVRNTGKYDGAEVVQLYVAPVSPSLKRPIKE LKEYAKIFLASGEAKTVHLSVPIKYATSFFDEYQKKWCSEKGEYTILLGSSSADIKVSQ SITLEKTTFWKGL DNA: (SEQ ID NO:6) ATGACCCAACTGGATGTGGAGAGCCTGATTCAAGAGCTGACCCTGAACGAAAAGGTGCA ACTGCTGAGCGGTAGCGACTTCTGGCATACCACCCCGGTTCGTCGTCTGGGCATCCCGA AGATGCGTCTGAGCGACGGTCCGAACGGCGTTCGTGGTACCAAATTCTTTAACGGTGTT CCGACCGCGTGCTTCCCGTGCGGTACCGGTCTGGGCGCGACCTTTGACAAGGAACTGCT GAAAGAGGCGGGTAGCCTGATGGCGGATGAAGCGAAAGCGAAAGCGGCGAGCGTGGTTC TGGGTCCGACCGCGAACATTGCGCGTGGTCCGAACGGTGGCCGTGGCTTCGAGAGCTTC GGCGAGGACCCGGTGGTTAACGGTCTGAGCAGCGCGGCGATGATCAACGGCCTGCAGGG CAAGTACATTGCGGCGACCATGAAACACTATGTTTGCAACGATCTGGAAATGGACCGTA ACTGCATTGACGCGCAAGTTAGCCACCGTGCGCTGCGTGAGGTGTACCTGCTGCCGTTC CAAATCGCGGTGCGTGATGCGAACCCGCGTGCGATTATGACCGCGTATAACAAGGCGAA CGGCGAACACGTTAGCCAGAGCAAATTCCTGCTGGACGAAGTGCTGCGTAAGGAGTGGG GCTGGGATGGTCTGCTGATGAGCGACTGGTTTGGTGTTTACGATGCGAAAAGCAGCATC ACCAACGGCCTGGACCTGGAGATGCCGGGTCCGCCGCAGTGCCGTGTGCACAGCGCGAC CGATCACGCGATCAACAGCGGCGAAATCCACATTAACGATGTTGACGAGCGTGTGCGTA GCCTGCTGAGCCTGATTAACTACTGCCACCAAAGCGGTGTTACCGAGGAAGATCCGGAA ACCAGCGACAACAACACCCCGGAAACCATCGAGAAGCTGCGTAAAATCAGCCGTGAGAG CATTGTGCTGCTGAAGGACGATGACCGTAACCGTAGCATTCTGCCGCTGAAGAAAAGCG ACAAAATCGCGGTTATTGGTAACAACGCGAAACAAGCGGCGTATTGCGGTGGCGGTAGC GCGAGCGTGCTGAGCTATCACACCACCACCCCGTTCGACAGCATCAAGAGCCGTCTGGA AGATAGCAACACCCCGGCGTACACCATTGGTGCGGACGCGTATAAAAACCTGCCGCCGC TGGGTCCGCAAATGACCGATAGCGACGGCAAGCCGGGTTTTGATGCGAAATTCTTTGTT GGCAGCCCGACCAGCAAGGATCGTAAACTGATCGACCACTTCCAGCTGACCAACAGCCA AGTTTTTCTGGTGGACTACTATAACGAACAGATCCCGGAAAACAAGGAGTTCTACGTTG ACGTGGAGGGTCAATTTATTCCGGAGGAAGATGGCACCTATAACTTCGGTCTGACCGTG TTTGGTACCGGCCGTCTGTTCGTTGATGACAAACTGGTTAGCGACAGCAGCCAGAACCA AACCCCGGGCGATAGCTTCTTTGGTCTGGCGGCGCAGGAAGTGATCGGCAGCATTCACC TGGTGAAGGGTAAAGCGTACAAGATCAAAGTTCTGTATGGCAGCAGCGTGACCCGTACC TACGAAATTGCGGCGAGCGTTGCGTTTGAGGGCGGTGCGTTCACCTTTGGTGCGGCGAA ACAGCGTAACGAAGACGAGGAAATCGCGCGTGCGGTGGAGATTGCGAAGGCGAACGACA AAGTGGTTCTGTGCATCGGCCTGAACCAAGATTTCGAAAGCGAGGGTTTTGATCGTCCG GACATCAAGATTCCGGGCGCGACCAACAAAATGGTTAGCGCGGTGCTGAAGGCGAACCC GAACACCGTTATTGTGAACCAGACCGGTACCCCGGTTGAGATGCCGTGGGCGAGCGATG CGCCGGTGATCCTGCAAGCGTGGTTTGGCGGTAGCGAGGCGGGTACCGCGATTGCGGAT GTTCTGTTTGGCGACTACAACCCGAGCGGCAAGCTGACCGTGACCTTCCCGCTGCGTTT TGAGGATAACCCGGCGTACCTGAACTTCCAGAGCAACAAACAAGCGTGCTGGTATGGCG AAGACGTTTACGTGGGTTATCGTTACTATGAGACCATCGATCGTCCGGTGCTGTTCCCG TTTGGTCACGGCCTGAGCTTCACCGAGTTCGATTTTACCGACATGTTTGTTCGTCTGGA GGAAGAGAACCTGGAAGTTGAGGTGGTTGTGCGTAACACCGGCAAGTACGACGGTGCGG AAGTGGTGCAGCTGTATGTTGCGCCGGTTAGCCCGAGCCTGAAACGTCCGATCAAGGAA CTGAAAGAGTACGCGAAAATTTTCCTGGCGAGCGGTGAAGCGAAGACCGTTCACCTGAG CGTGCCGATCAAATACGCGACCAGCTTCTTTGATGAGTATCAAAAGAAATGGTGCAGCG AAAAGGGCGAGTATACCATTCTGCTGGGTAGCAGCAGCGCGGACATCAAAGTTAGCCAA AGCATCACCCTGGAAAAAACCACCTTCTGGAAAGGTCTGTAA Sequência de UGT85C2: Aminoácido: (SEQ ID NO: 7) MDAMATTEKKPHVIFIPFPAQSHIKAMLKLAQLLHHKGLQITFVNTDFIHNQFLESSGP HCLDGAPGFRFETIPDGVSHSPEASIPIRESLLRSIETNFLDRFIDLVTKLPDPPTCII SDGFLSVFTIDAAKKLGIPVMMYWTLAACGFMGFYHIHSLIEKGFAPLKDASYLTNGYL DTVIDWVPGMEGIRLKDFPLDWSTDLNDKVLMFTTEAPQRSHKVSHHIFHTFDELEPSI IKTLSLRYNHIYTIGPLQLLLDQIPEEKKQTGITSLHGYSLVKEEPECFQWLQSKEPNS VVYVNFGSTTVMSLEDMTEFGWGLANSNHYFLWIIRSNLVIGENAVLPPELEEHIKKRG FIASWCSQEKVLKHPSVGGFLTHCGWGSTIESLSAGVPMICWPYSWDQLTNCRYICKEW EVGLEMGTKVKRDEVKRLVQELMGEGGHKMRNKAKDWKEKARIAIAPNGSSSLNIDKMV KEITVLARN DNA (SEQ ID NO: 8) ATGGACGCTATGGCCACGACCGAAAAGAAACCGCACGTTATCTTTATTCCGTTCCCGGC ACAGAGTCACATCAAGGCTATGCTGAAGCTGGCCCAACTGCTGCATCACAAAGGCCTGC AAATTACCTTTGTGAACACGGATTTCATCCATAATCAGTTTCTGGAAAGCTCTGGCCCG CACTGCCTGGATGGTGCGCCGGGTTTTCGCTTCGAAACCATCCCGGATGGTGTCTCGCA TAGCCCGGAAGCCTCTATTCCGATCCGTGAATCGCTGCTGCGCAGCATTGAAACCAACT TTCTGGATCGTTTCATCGACCTGGTGACGAAACTGCCGGACCCGCCGACGTGCATTATC TCCGACGGCTTTCTGTCAGTTTTCACCATTGATGCGGCCAAAAAGCTGGGTATCCCGGT CATGATGTATTGGACGCTGGCAGCTTGTGGCTTTATGGGTTTCTACCATATTCACTCAC TGATCGAAAAAGGCTTTGCACCGCTGAAGGATGCTAGTTATCTGACCAACGGCTATCTG GATACGGTCATTGACTGGGTGCCGGGCATGGAAGGTATCCGTCTGAAAGATTTCCCGCT GGACTGGAGCACCGATCTGAATGACAAAGTGCTGATGTTTACCACGGAAGCGCCGCAGC GCTCTCATAAAGTTAGTCATCACATTTTTCACACCTTCGATGAACTGGAACCGTCGATT ATCAAAACCCTGAGCCTGCGTTATAATCATATTTACACCATTGGCCCGCTGCAACTGCT GCTGGACCAAATCCCGGAAGAAAAGAAACAAACCGGCATCACGTCGCTGCACGGTTATA GCCTGGTGAAAGAAGAACCGGAATGCTTCCAGTGGCTGCAATCTAAGGAACCGAACAGT GTGGTTTACGTGAATTTTGGTTCCACCACGGTTATGTCACTGGAAGATATGACCGAATT TGGCTGGGGTCTGGCAAACTCTAACCATTATTTTCTGTGGATCATCCGTAGTAACCTGG TCATTGGCGAAAATGCAGTGCTGCCGCCGGAACTGGAAGAACACATTAAAAAGCGCGGT TTCATCGCTTCCTGGTGTTCACAGGAAAAAGTTCTGAAGCATCCGTCCGTCGGCGGTTT TCTGACCCACTGCGGCTGGGGTAGCACGATTGAATCTCTGAGTGCTGGTGTTCCGATGA TTTGCTGGCCGTATAGCTGGGATCAACTGACCAACTGCCGCTACATCTGTAAAGAATGG GAAGTCGGCCTGGAAATGGGTACGAAAGTGAAGCGTGACGAAGTTAAACGCCTGGTCCA AGAACTGATGGGCGAAGGCGGTCATAAAATGCGTAACAAAGCGAAGGATTGGAAAGAAA AGGCCCGCATTGCGATTGCGCCGAACGGCAGCAGCAGCCTGAACATTGACAAAATGGTG AAGGAAATCACCGTTCTGGCGCGTAATTAA Sequência de HV1: Sequência de aminoácidos: (SEQ ID NO: 9) MDGNSSSSPLHVVICPWLALGHLLPCLDIAERLASRGHRVSFVSTPRNIARLPPLRPAV APLVDFVALPLPHVDGLPEGAESTNDVPYDKFELHRKAFDGLAAPFSEFLRAACAEGAG SRPDWLIVDTFHHWAAAAAVENKVPCVMLLLGAATVIAGFARGVSEHAAAAVGKERPAA EAPSFETERRKLMTTQNASGMTVAERYFLTLMRSDLVAIRSCAEWEPESVAALTTLAGK PVVPLGLLPPSPEGGRGVSKEDAAVRWLDAQPAKSVVYVALGSEVPLRAEQVHELALGL ELSGARFLWALRKPTDAPDAAVLPPGFEERTRGRGLVVTGWVPQIGVLAHGAVAAFLTH CGWNSTIEGLLFGHPLIMLPISSDQGPNARLMEGRKVGMQVPRDESDGSFRREDVAATV RAVAVEEDGRRVFTANAKKMQEIVADGACHERCIDGFIQQLRSYKA Sequência de DNA: (SEQ ID NO: 10) ATGGATGGTAACTCCTCCTCCTCGCCGCTGCATGTGGTCATTTGTCCGTGGCTGGCTCT GGGTCACCTGCTGCCGTGTCTGGATATTGCTGAACGTCTGGCGTCACGCGGCCATCGTG TCAGTTTTGTGTCCACCCCGCGCAACATTGCCCGTCTGCCGCCGCTGCGTCCGGCTGTT GCACCGCTGGTTGATTTCGTCGCACTGCCGCTGCCGCATGTTGACGGTCTGCCGGAGGG TGCGGAATCGACCAATGATGTGCCGTATGACAAATTTGAACTGCACCGTAAGGCGTTCG ATGGTCTGGCGGCCCCGTTTAGCGAATTTCTGCGTGCAGCTTGCGCAGAAGGTGCAGGT TCTCGCCCGGATTGGCTGATTGTGGACACCTTTCATCACTGGGCGGCGGCGGCGGCGGT GGAAAACAAAGTGCCGTGTGTTATGCTGCTGCTGGGTGCAGCAACGGTGATCGCTGGTT TCGCGCGTGGTGTTAGCGAACATGCGGCGGCGGCGGTGGGTAAAGAACGTCCGGCTGCG GAAGCCCCGAGTTTTGAAACCGAACGTCGCAAGCTGATGACCACGCAGAATGCCTCCGG CATGACCGTGGCAGAACGCTATTTCCTGACGCTGATGCGTAGCGATCTGGTTGCCATCC GCTCTTGCGCAGAATGGGAACCGGAAAGCGTGGCAGCACTGACCACGCTGGCAGGTAAA CCGGTGGTTCCGCTGGGTCTGCTGCCGCCGAGTCCGGAAGGCGGTCGTGGCGTTTCCAA AGAAGATGCTGCGGTCCGTTGGCTGGACGCACAGCCGGCAAAGTCAGTCGTGTACGTCG CACTGGGTTCGGAAGTGCCGCTGCGTGCGGAACAAGTTCACGAACTGGCACTGGGCCTG GAACTGAGCGGTGCTCGCTTTCTGTGGGCGCTGCGTAAACCGACCGATGCACCGGACGC CGCAGTGCTGCCGCCGGGTTTCGAAGAACGTACCCGCGGCCGTGGTCTGGTTGTCACGG GTTGGGTGCCGCAGATTGGCGTTCTGGCTCATGGTGCGGTGGCTGCGTTTCTGACCCAC TGTGGCTGGAACTCTACGATCGAAGGCCTGCTGTTCGGTCATCCGCTGATTATGCTGCC GATCAGCTCTGATCAGGGTCCGAATGCGCGCCTGATGGAAGGCCGTAAAGTCGGTATGC AAGTGCCGCGTGATGAATCAGACGGCTCGTTTCGTCGCGAAGATGTTGCCGCAACCGTC CGCGCCGTGGCAGTTGAAGAAGACGGTCGTCGCGTCTTCACGGCTAACGCGAAAAAGAT GCAAGAAATTGTGGCCGATGGCGCATGCCACGAACGTTGTATTGACGGTTTTATCCAGC AACTGCGCAGTTACAAGGCGTGA

Claims (13)

1. Método de preparação de uma composição de glicosídeo de esteviol, o método caracterizado por compreender: preparar uma mistura de reação compreendendo: (a) rebaudiosídeo W tendo a estrutura:
Figure img0016
b) beta-glicosidase; e incubar a mistura de reação por um tempo suficiente para produzir uma composição de glicosídeo de esteviol compreendendo rebaudiosídeo WB1, rebaudiosídeo WB2 ou uma combinação dos mesmos, em que rebaudiosídeo WB1 tem a estrutura:
Figure img0017
rebaudiosídeo WB2 tem a estrutura:
Figure img0018
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de a beta-glicosidase ser uma beta-glicosidase de Pichia pastoris possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de compreender ainda obter um produto bruto que compreende rebaudiosídeo WB1.
4. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de compreender ainda incubar rebaudiosídeo WB1 com uma UDP-glicosiltransferase por um tempo suficiente para produzir rebaudiosídeo D4, em que a UDP-glicosiltransferase é uma enzima HVI UGT e o rebaudiosídeo D4 tem a estrutura:
Figure img0019
5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a referida UDP-glicosiltransferase é incubada com uma sacarose sintase na presença de sacarose, difosfato de uridina (UDP) e difosfato de uridina-glicose (UDP-glicose).
6. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de compreender ainda incubar rebaudiosídeo D4 com uma UDP-glicosiltransferase por um tempo suficiente para produzir rebaudiosídeo M, em que a UDP-glicosiltransferase é UGT76G1 tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou um homólogo funcional desta.
7. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a incubação de rebaudiosídeo D4 com uma UDP-glicosiltransferase por um tempo suficiente para produzir rebaudiosídeo M, em que a UDP-glicosiltransferase compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.
8. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de compreende ainda a incubação de rebaudiosídeo D4 com uma UDP-glicosiltransferase por um tempo suficiente para produzir rebaudiosídeo M, em que a UDP- glicosiltransferase é um mutante de uma enzima tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, em que o mutante compreende pelo menos uma mutação em uma posição de resíduo de aminoácido correspondente a uma posição selecionada de 3, 6, 90, 91, 93, 181, 183, 184, 185, 350, 389, 410, 418, 450, 451, 452 e 454 da SEQ ID NO: 3.
9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, caracterizado pelo fato de compreender ainda obter rebaudiosídeo M assim produzido a partir da mistura de reação para uso como adoçante.
10. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de compreender ainda obter Rebaudiosídeo WB1 que tem a estrutura:
Figure img0020
a partir da mistura de reação para uso como adoçante.
11. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de ainda compreender obter Rebaudiosídeo WB2 que tem a estrutura:
Figure img0021
a partir da mistura de reação para uso como adoçante.
12. Método, de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizado pelo fato de ainda compreender Rebaudiosídeo D4 que tem a estrutura:
Figure img0022
a partir do meio de reação para uso como adoçante.
13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 12, caracterizado por ainda compreender incorporar uma quantidade de adoçante do referido rebaudiosídeo a um produto de consumo oral selecionado a partir de um produto de bebida ou outro produto de consumo.
BR112019007504-6A 2016-10-14 2017-10-13 Método de preparação de uma composição de glicosídeo de esteviol BR112019007504B1 (pt)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662408179P 2016-10-14 2016-10-14
US62/408,179 2016-10-14
US201762555809P 2017-09-08 2017-09-08
US62/555,809 2017-09-08
PCT/US2017/056457 WO2018071744A1 (en) 2016-10-14 2017-10-13 Biosynthetic production of steviol glycosides and processes therefore

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BR112019007504A2 BR112019007504A2 (pt) 2019-07-02
BR112019007504B1 true BR112019007504B1 (pt) 2023-05-09

Family

ID=61906334

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112019007504-6A BR112019007504B1 (pt) 2016-10-14 2017-10-13 Método de preparação de uma composição de glicosídeo de esteviol

Country Status (13)

Country Link
US (3) US11098315B2 (pt)
EP (1) EP3525598B1 (pt)
JP (2) JP7177048B2 (pt)
KR (1) KR102540615B1 (pt)
CN (1) CN110191643B (pt)
AU (1) AU2017341798B2 (pt)
BR (1) BR112019007504B1 (pt)
CA (1) CA3039105C (pt)
ES (1) ES2964976T3 (pt)
HU (1) HUE064754T2 (pt)
MX (1) MX2019004368A (pt)
RU (1) RU2019114181A (pt)
WO (1) WO2018071744A1 (pt)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6854238B2 (ja) * 2014-10-03 2021-04-14 コナゲン インコーポレイテッド ノンカロリー甘味料および合成するための方法
CN110191643B (zh) 2016-10-14 2023-06-06 科纳根公司 甜菊醇糖苷的生物合成生产及其工艺
US20230132596A1 (en) 2016-11-14 2023-05-04 Purecircle Usa Inc. Stevia-derived molecules, methods of obtaining such molecules, and uses of the same
CA3055288A1 (en) 2017-03-06 2018-09-13 Conagen Inc. Biosynthetic production of steviol glycoside rebaudioside d4 from rebaudioside e
WO2019006244A1 (en) 2017-06-30 2019-01-03 Conagen Inc. HYDROLYSIS OF STEVIOL GLYCOSIDES BY BETA-GLUCOSIDASE
WO2019178116A1 (en) * 2018-03-12 2019-09-19 Conagen Inc. Biosynthetic production of steviol glycosides rebaudioside j and rebaudioside n
CA3094205A1 (en) * 2018-03-16 2019-09-19 Purecircle Usa Inc. High-purity steviol glycosides
CN112312773A (zh) * 2018-03-16 2021-02-02 谱赛科美国股份有限公司 高纯度甜菊糖苷
WO2021252814A1 (en) * 2020-06-11 2021-12-16 Corn Products Development, Inc. Production and uses of oligosaccharides and steviol glycosides
WO2024068511A1 (en) * 2022-09-28 2024-04-04 Société des Produits Nestlé S.A. Diterpenoid derivatives as inhibitors of sglt2

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8507022B2 (en) * 2009-10-15 2013-08-13 Purecircle Sdn Bhd High-purity rebaudioside D and low-calorie carbonated lemon-flavored beverage containing the same
US8916138B2 (en) * 2009-10-15 2014-12-23 Purecircle Sdn Bhd High-purity rebaudioside D and low-calorie tooth paste composition containing the same
CA3128532A1 (en) 2011-08-08 2013-02-14 Evolva Sa Recombinant production of steviol glycosides
WO2013026151A1 (en) * 2011-08-19 2013-02-28 Justbio Inc. Improved stevia rebaudiana extract and formulation, and uses thereof
US9752174B2 (en) * 2013-05-28 2017-09-05 Purecircle Sdn Bhd High-purity steviol glycosides
EP2852296B1 (en) * 2012-05-22 2021-12-15 PureCircle SDN BHD Process for producing a high-purity steviol glycoside
JP6379112B2 (ja) * 2013-02-06 2018-08-22 エヴォルヴァ エスアー．Ｅｖｏｌｖａ Ｓａ． レバウディオサイドｄおよびレバウディオサイドｍの改良された産生方法
TWI657746B (zh) 2013-06-19 2019-05-01 美商科納根股份有限公司 含有甜葉菊苷ｅ之可食用產品及使用其製備和強化可食用產品之甜味的方法
CN103397064B (zh) * 2013-08-14 2015-04-15 苏州汉酶生物技术有限公司 一种酶法制备瑞鲍迪甙m的方法
CA2928940C (en) 2013-11-01 2021-12-14 Guohong MAO Recombinant production of steviol glycosides
US9522929B2 (en) 2014-05-05 2016-12-20 Conagen Inc. Non-caloric sweetener
EP2957182A1 (en) 2014-06-18 2015-12-23 Technische Hochschule Mittelhessen Improved natural sweetener compositions
US11653679B2 (en) * 2014-09-19 2023-05-23 Purecircle Sdn Bhd High-purity steviol glycosides
JP6854238B2 (ja) 2014-10-03 2021-04-14 コナゲン インコーポレイテッド ノンカロリー甘味料および合成するための方法
US10463062B2 (en) * 2014-11-05 2019-11-05 Manus Bio Inc. Microbial production of steviol glycosides
US10058112B2 (en) 2014-11-21 2018-08-28 Eco Sweeteners Llc Sweetener composition including enzymatically processed stevia and method of manufacturing
AU2016211124B2 (en) * 2015-01-30 2022-04-14 Evolva Sa Production of steviol glycosides in recombinant hosts
CN110191643B (zh) 2016-10-14 2023-06-06 科纳根公司 甜菊醇糖苷的生物合成生产及其工艺
CA3055288A1 (en) 2017-03-06 2018-09-13 Conagen Inc. Biosynthetic production of steviol glycoside rebaudioside d4 from rebaudioside e
WO2019006244A1 (en) 2017-06-30 2019-01-03 Conagen Inc. HYDROLYSIS OF STEVIOL GLYCOSIDES BY BETA-GLUCOSIDASE
US20220042060A1 (en) 2017-09-08 2022-02-10 Conagen Inc. Biosynthesis production of steviol glycosides and processes therefore

Also Published As

Publication number Publication date
JP7177048B2 (ja) 2022-11-22
KR102540615B1 (ko) 2023-06-08
US11098315B2 (en) 2021-08-24
BR112019007504A2 (pt) 2019-07-02
US20210002685A1 (en) 2021-01-07
JP2022153385A (ja) 2022-10-12
RU2019114181A (ru) 2020-11-16
EP3525598A4 (en) 2020-10-07
WO2018071744A1 (en) 2018-04-19
AU2017341798A1 (en) 2019-04-18
EP3525598B1 (en) 2023-11-29
JP2019535238A (ja) 2019-12-12
CN110191643B (zh) 2023-06-06
EP3525598C0 (en) 2023-11-29
KR20190064627A (ko) 2019-06-10
CA3039105A1 (en) 2018-04-19
CA3039105C (en) 2024-03-05
US20190078102A1 (en) 2019-03-14
CN110191643A (zh) 2019-08-30
EP3525598A1 (en) 2019-08-21
RU2019114181A3 (pt) 2021-02-20
US11680281B2 (en) 2023-06-20
HUE064754T2 (hu) 2024-04-28
US10724062B2 (en) 2020-07-28
ES2964976T3 (es) 2024-04-10
MX2019004368A (es) 2019-08-12
AU2017341798B2 (en) 2021-10-21
US20190345528A1 (en) 2019-11-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11680281B2 (en) Biosynthetic production of steviol glycosides and processes therefore
US20200361978A1 (en) Non-caloric sweetener
US20200339621A1 (en) Non-caloric sweeteners and methods for synthesizing
US20220042060A1 (en) Biosynthesis production of steviol glycosides and processes therefore
CA3118675A1 (en) Methods for making high intensity sweeteners
BR112019018361B1 (pt) Método de produção de uma composição de glicosídeos de esteviol compreendendo rebaudiosídeo d4
US20210381019A1 (en) Biosynthetic production of variant steviol glycosides
US20240132929A1 (en) Biosynthetic production of steviol glycosides and processes therefore
BR112017006330B1 (pt) Método para a sintetização de rebaudiosídeo e a partir de rubusosídeo

Legal Events

Date Code Title Description
B350 Update of information on the portal [chapter 15.35 patent gazette]
B06W Patent application suspended after preliminary examination (for patents with searches from other patent authorities) chapter 6.23 patent gazette]
B06A Patent application procedure suspended [chapter 6.1 patent gazette]
B09A Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette]
B16A Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette]

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 13/10/2017, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS