ES2964976T3 - Producción biosintética de glucósidos de esteviol y procesos para el mismo - Google Patents

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Abstract

La presente invención se refiere a la producción de rebaudiósidos D4, WB1 y WB2 de glucósidos de esteviol y a la producción de rebaudiósido M a partir de Reb D4. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Producción biosintética de glucósidos de esteviol y procesos para el mismo
Campo de la invención
El campo de la invención se refiere a métodos y procesos útiles en la producción de glucósidos de esteviol específicos. Más específicamente, la presente divulgación proporciona la producción de un rebaudiósido recientemente designado, rebaudiósido D4 ("Reb D4"), que puede convertirse en rebaudiósido M ("Reb M") a través de conversión enzimática. La presente divulgación también proporciona la producción de rebaudiósidos designados en el presente documento rebaudiósido WB1 ("Reb WB1") y rebaudiósido W<b>2 ("Reb WB2").
Antecedentes de la invención
Los glucósidos de esteviol son productos naturales aislados de hojas deStevia rebaudiana,y se utilizan ampliamente como edulcorantes bajos en calorías, de alta intensidad en alimentos, piensos y bebidas. Los glucósidos de esteviol de origen natural tienen la misma estructura básica de diterpeno (esteviol) pero difieren en el número y la estructura de las modificaciones de los residuos de carbohidratos (por ejemplo, residuos de glucosa, ramnosa y xilosa) en las posiciones C13 y C19 de la columna vertebral de esteviol. Los glucósidos de esteviol con estructuras conocidas incluyen esteviósido, rebaudiósido A, rebaudiósido B, rebaudiósido C, rebaudiósido D, rebaudiósido E, rebaudiósido F, rebaudiósido M y dulcósido A. En términos de utilización comercial el rebaudiósido M en sí se ha considerado generalmente como seguro (estado 'GRAS').
En peso seco, el esteviósido, el rebaudiósido A, el rebaudiósido C y el dulcósido A, representan el 9.1, 3.8, 0.6 y 0.30 por ciento del peso total de los glucósidos de esteviol en hojas deSteviade tipo silvestre, respectivamente, mientras que otros glucósidos de esteviol, tales como Reb M están presentes en cantidades significativamente menores. Extractos deStevia rebaudianadisponibles comercialmente, donde dichos extractos normalmente contienen esteviósido y rebaudiósido A como componentes principales. Los otros glucósidos de esteviol conocidos típicamente están presentes en el extracto desteviacomo componentes menores o traza. Por ejemplo, la cantidad de rebaudiósido A en preparaciones comerciales puede variar desde aproximadamente el 20% hasta más del 90% del contenido total de glicósido de esteviol, mientras que la cantidad de rebaudiósido B es típicamente aproximadamente el 1-2%, la cantidad de rebaudiósido C puede ser aproximadamente el 7-15%, y la cantidad de rebaudiósido D puede ser aproximadamente el 2% del total de glucósidos de esteviol. En tales extractos el rebaudiósido M está presente sólo en cantidades extremadamente pequeñas. Curiosamente, el rebaudiósido E es también uno de los glucósidos de esteviol menos abundantes presentes en variedades de la plantaStevia rebaudiana,que representan menos del 0.5% del total de glucósidos.
Como edulcorantes naturales, diferentes glucósidos de esteviol tienen diferentes grados de dulzor, "sensación en la boca" y regustos específicos asociados con cada especie de rebaudiósido probada. En comparación con el azúcar de mesa (es decir, "sacarosa"), el dulzor de los glucósidos de esteviol es significativamente mayor. Por ejemplo, el esteviósido es entre 100-150 veces más dulce que la sacarosa pero tiene un regusto amargo como se observó en las pruebas de sabor, mientras que los rebaudiósidos A y E son 250-450 veces más dulces que la sacarosa y el regusto es mucho mejor que el esteviósido, sin embargo, todavía queda un regusto notable. En consecuencia, los perfiles gustativos de cualesquier extractos desteviase ven profundamente afectados por el contenido relativo de glucósidos de esteviol en el extracto, que a su vez puede verse afectado por las condiciones ambientales experimentadas por las plantas subyacentes y el proceso de extracción utilizado. Estas variaciones en la producción vegetal, las condiciones climáticas y las condiciones de extracción pueden dar lugar a composiciones inconsistentes de los glucósidos de esteviol en los extractos destevia,de modo que el perfil de sabor varía fuertemente entre diferentes lotes de productos de extracción.
El perfil gustativo de extractos desteviatambién pueden verse afectados por contaminantes de derivados de plantas o derivados del entorno (tales como pigmentos, lípidos, proteínas, fenólicos y sacáridos) que permanecen en el producto después del proceso de extracción. Estos contaminantes típicamente tienen sus propios sabores desagradables indeseables para el uso del extractosteviacomo edulcorante en productos de consumo. Además, el coste de aislar combinaciones individuales o específicas de rebaudiósidos de esteviol que no son abundantes en extractos desteviaes prohibitivo en costes y recursos. Dado que la calidad y la disponibilidad de algunos glucósidos de esteviol específicos son limitadas, el suministro comercial puede abordarse mejor mediante la bio-conversión, donde se pueden modificar enzimas naturales o microbios específicos para transportar las enzimas necesarias y utilizar procesos de fermentación comercialmente significativos para aumentar específicamente la producción de glucósidos de interés. Por ejemplo, se ha informado anteriormente sobre la bio-conversión de esteviósido en Reb E (véanse, por ejemplo, las publicaciones de solicitudes PCT Nos. WO/2015/065650 y WO/2015/171555) utilizando enzimas obtenidas de microbios modificados. Alternativamente, se pueden utilizar otros medios sintéticos no biológicos para desarrollar glucósidos de esteviol de interés.
Desde una perspectiva biológica, todos los glucósidos de esteviol se forman mediante una serie de reacciones de glicosilación del esteviol, que típicamente son catalizadas por enzimas UDP-glicosiltransferasa (UGT) que utilizan uridina 5'-difosfoglucosa (UDP-glucosa) como un donante de la fracción de azúcar. En las plantas, las UGTs son un grupo muy divergente de enzimas que transfieren un residuo de glucosa de la UDP-glucosa al esteviol. En estas reacciones, el esteviósido suele ser un intermediario en la biosíntesis de diversos compuestos de rebaudiósidos. Por ejemplo, la glicosilación del esteviósido en el C-3' en la C-13-O-glucosa del esteviósido produce el rebaudiósido A; mientras que la glicosilación en el C-2' en la posición 19-O-glucosa del esteviósido produce el rebaudiósido E.
Como se describe en el presente documento, la glicosilación específica y dirigida del rebaudiósido E (en el C-19-O-glucosa) puede producir el rebaudiósido Reb D4 y la glicosilación adicional de Reb D4 por enzimas UGT produce el rebaudiósido M. Sin embargo, ahora se reivindica una ruta sintética para la producción de D4 enzimáticamente comenzando con rebaudiósido W. Reb D4 puede convertirse adicionalmente en reb M como se enseña en el presente documento.
Un enfoque práctico para mejorar la calidad del sabor de extractos desteviaes aumentar el rendimiento de aquellos compuestos de rebaudiósidos que tienen características de sabor más deseables en general y hacer esto a través de una vía sintética más productiva. De los glucósidos de esteviol probados, muchos creen que Reb M tiene el sabor y las características químicas más deseables para su uso en alimentos y bebidas. Sin embargo, como se indicó anteriormente, la planta tiene cantidades extremadamente pequeñas de este compuesto presente en sus hojas y, por lo tanto, necesita una biosíntesis alternativa que se desarrollará para la producción a gran escala de este glucósido, así como para proporcionar edulcorantes alternativos a la industria de alimentos y bebidas.
En consecuencia, existe una necesidad de desarrollar como productos comerciales glucósidos de esteviol con perfiles de sabor mejores y más consistentes y de que dichos glucósidos de esteviol utilicen un sustrato de partida relativamente común, tal como glucósidos de esteviol más abundantes como molécula de partida, de modo que dicha producción de glucósidos deseables pueda ser comercialmente lo más rentables posible.
Además, el proceso de extracción de las plantas típicamente emplea técnicas de extracción sólido-líquido utilizando solventes como hexano, cloroformo y etanol para la recuperación de glucósidos de esteviol (Catchpole et al., 2003). Sin embargo, la extracción con disolventes consume mucha energía, genera problemas de eliminación de desechos tóxicos, requiere una gran superficie para cultivar las plantas y produce un producto que requiere una purificación adicional para recuperar los componentes menores. Por lo tanto, también se necesitan nuevos métodos de producción para reducir los costes de producción de glucósidos de esteviol y disminuir el impacto ambiental del cultivo y procesamiento a gran escala (Yao et al., 1994). Una de esas posibles soluciones es el uso de tecnología de bioconversión de fermentación que permite la producción de ciertas especies microbianas que aumentan la selectividad, abundancia y pureza de los glucósidos de esteviol deseados disponibles para el comercio.
Además de lo anterior, si bien los consumidores aprueban y buscan activamente fuentes naturales y biológicas para alimentos, piensos, sabores o componentes medicinales, también les preocupa el abastecimiento, el perfil de sabor consistente y la producción ambientalmente sostenible. En esta situación, los métodos de producción y fermentación microbiana de la divulgación actual proporcionan Reb M en cantidades útiles para una variedad de industrias e investigaciones y al mismo tiempo lo hacen de una manera más natural que la síntesis inorgánica o las técnicas actuales de extracción de plantas.
En consecuencia, existe la necesidad de desarrollar un método novedoso para producir Reb M de manera económica y conveniente para permitir además el consumo humano y animal. El documento WO2016/073740 describe Reb W como "SG27", Reb W b 1 como "SG17", Reb WB2 como "SG13", Reb D4 como "SG25" y Reb M como "SG32". Además, se describen las conversiones de Reb WB1 en Reb W usando UGT76G1, y la conversión de Reb D4 en Reb M usando UGT76G1; se proporciona la conversión de Reb WB2 a Reb WB1 usando UGT85C2, y la conversión de Reb WB1 a Reb D4. El documento WO 2016/120486 proporciona Reb WB1 como "compuesto 4.26" o "esteviol+4Glc(#26)", así como Reb M.
Resumen de la invención
La presente invención proporciona la producción de glucósido de esteviol rebaudiósido D4 ("Reb D4") que se identifica como -[(2-O-p-D-glucopiranosil-3-O-p-D-glucopiranosil-p-D-glucopiranosil)éster]) del ácido (13-[(2-O-p-D-glucopiranosil-p-D-glucopiranosil)oxi]ent-kaur-16-en-19-oico y su conversión a Reb M mediante una UDP-glicosiltransferasa específica (Véase Fig. 1). El punto de partida es una ruta enzimática sintética para la producción de Reb WB1 y Reb WB2 como se describe en el presente documento.
Por lo tanto, en un aspecto la presente invención proporciona un método para preparar una composición de glicósido de esteviol, comprendiendo el método preparar una mezcla de reacción que comprende:
(a) rebaudiósido W que tiene la estructura
(b) una beta-glucosidasa; e incubar la mezcla de reacción durante un tiempo suficiente para producir una composición de glucósido de esteviol que comprende rebaudiósido WB1, rebaudiósido WB2 o una combinación de los mismos, en donde el rebaudiósido w B1 tiene la estructura
El rebaudiósido WB2 tiene la estructura
En una realización adicional, el reb WB1 así producido se puede utilizar para producir el reb D4.
Por lo tanto, un método de la invención como se indicó anteriormente puede comprender además incubar reb WB1 con una enzima HVI UGT durante un tiempo suficiente para producir reb D4 que tiene la estructura
Una realización adicional es producir rebaudiósido M a partir de rebaudiósido D4 obtenido como anteriormente mediante el uso de una UDP-glicosiltransferasa como se describe en el presente documento; véase la Fig. 14.
En una realización de la presente divulgación, como se muestra en la Fig. 14, se proporciona así un método que permite la producción de Reb M utilizando una vía a través de Reb WB2, Reb WB1 y Reb D4.
Un método de la invención reivindicada puede proporcionar una composición que comprende Reb D4, opcionalmente en donde el contenido de Reb D4 en la composición es al menos 70% (por ejemplo, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 95%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100%) puro. En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un producto consumible que comprende una cantidad edulcorante de Reb D4. En algunas realizaciones, el producto consumible se selecciona del grupo que consiste en bebidas, confiterías, productos de panadería, galletas y gomas de mascar.
Un método de la invención puede proporcionar una composición que comprende una mezcla de Reb D4 y Reb M. En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un producto consumible que comprende una cantidad edulcorante de una mezcla de Reb D4 y Reb M. En algunas realizaciones, el producto consumible se selecciona del grupo que consiste en bebidas, confiterías, productos de panadería, galletas y gomas de mascar.
Un método de la invención puede proporcionar una composición que comprende Reb WB1, opcionalmente en donde el contenido de Reb WB1 en la composición es al menos 70% (por ejemplo, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 95%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100%) puro. En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un producto consumible que comprende una cantidad edulcorante de Reb WB1. En algunas realizaciones, el producto consumible se selecciona del grupo que consiste en bebidas, confitería, productos de panadería, galletas y gomas de mascar.
Un método de la invención también puede proporcionar una composición que comprende Reb WB2, opcionalmente en donde el contenido de Reb WB2 en la composición es al menos 70% (por ejemplo, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 95%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100%) puro. En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un producto consumible que comprende una cantidad edulcorante de Reb WB2. En algunas realizaciones, el producto consumible se selecciona del grupo que consiste en bebidas, confitería, productos de panadería, galletas y gomas de mascar.
Como se divulga en el presente documento, un glicósido de esteviol de interés puede producirse mediante un sistema celular transformado que crece dentro de un medio. En algunas realizaciones, dicho sistema celular transformado se selecciona del grupo que consiste en: levadura, plantas productoras de glucósidos no esteviol, algas y bacterias. En algunas realizaciones, dicho sistema celular es una bacteria y se selecciona del grupo que consiste enEscherichia; Salmonella; Bacillus; Acinetobacter; Streptomyces; Corynebacterium; Methylosinus; Methylomonas; Rhodococcus; Pseudomonas; Rhodobacter; Synechocystis; Saccharomyces; Zygosaccharomyces; Kluyveromyces; Candida; Hansenula; Debaryomyces; Mucor; Pichia; Torulopsis; Aspergillus; Arthrobotlys; Brevibacteria; Microbacterium; Arthrobacter; Citrobacter; Escherichia; Klebsiella; Pantoea; Salmonella Corynebacterium; Clostridium;yClostridium acetobutylicum.En algunas realizaciones, dicho sistema celular esE. coli.En algunas realizaciones, dicho glucósido de esteviol es Reb D4. En algunas realizaciones, dicho glucósido de esteviol es Reb WB1. En algunas realizaciones, dicho glucósido de esteviol es Reb WB2. En algunas realizaciones, el material de origen es esteviol. En algunas realizaciones, dicho contenido de glicósido de esteviol es al menos un 70% puro. En algunas realizaciones, el método de producción comprende además: i) purificar un producto crudo; y, ii) eliminar los disolventes bajo vacío para proporcionar un producto concentrado. En algunas realizaciones, dicho producto crudo se purifica mediante cromatografía en columna. En algunas realizaciones, dicho producto crudo se purifica mediante extracción ácido-base. En algunas realizaciones, dicho producto crudo se purifica mediante destilación al vacío. En algunas realizaciones, el método de producción comprende además purificar dicho glicósido de esteviol usando una HPLC semi-preparativa.
La conversión de reb D4 en reb M como se divulga ahora puede emplear un polipéptido recombinante CP1 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80% (por ejemplo, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 95%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100%) de identidad con SEQ ID NO:3. En algunas realizaciones, la secuencia de ADN que codifica la secuencia del polipéptido recombinante CP1 tiene al menos un 80% (por ejemplo, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 95%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100%) de identidad con SEQ ID NO:4. En algunas realizaciones, el polipéptido recombinante CP1 tiene una o más mutaciones en una o más posiciones enumeradas en la Tabla 2.
Además, la divulgación proporciona un método biosintético para preparar un glicósido de esteviol de interés que comprende expresar una enzima CP1 en un sistema celular transformado; hacer crecer el sistema celular en un medio que contiene un sustrato; y producir el glucósido de esteviol de interés. En algunas realizaciones, el método comprende además incubar una sacarosa sintasa recombinante con el sustrato. En algunas realizaciones, el método comprende además incubar una UDP glicosiltransferasa recombinante UGT85C2 con la sacarosa sintasa, el sustrato y el polipéptido recombinante CP1. En algunas realizaciones, el método comprende además agregar una enzima beta glucosidasa a la mezcla de reacción. En algunas realizaciones, la sacarosa sintasa se selecciona del grupo que consiste en unaArabidopsissacarosa sintasa 1, unaArabidopsissacarosa sintasa 3 y unaVigna radiatesacarosa sintasa. En algunas realizaciones, la sacarosa sintasa es unaArabidopsis thalianasacarosa sintasa 1. En algunas realizaciones, los glucósidos de esteviol producidos son una mezcla de Reb D4 y Reb M. En algunas realizaciones, el método comprende además: i) purificar un producto crudo; y, ii) eliminar los disolventes al vacío para proporcionar un producto concentrado. En algunas realizaciones, dicho producto crudo se purifica mediante cromatografía en columna. En algunas realizaciones, dicho producto crudo se purifica mediante extracción ácido-base. En algunas realizaciones, dicho producto crudo se purifica mediante destilación al vacío. En algunas realizaciones, el método comprende además purificar dicho glucósido de esteviol usando una HPLC semi-preparativa. En algunas realizaciones, dicho glucósido de esteviol es Reb WB1. En algunas realizaciones, dicho glucósido de esteviol es Reb WB2. En algunas realizaciones, dicho glucósido de esteviol es Reb D4. En algunas realizaciones, dicho glucósido de esteviol es Reb M. En algunas realizaciones, el método comprende además el uso de HV1 (SEQ ID NO:9). En algunas realizaciones, el método comprende además el uso de UGT76G1 (SEQ ID NO:1).
En otro aspecto, la divulgación proporciona un método para producir rebaudiósido M, que comprende cultivar una célula recombinante en condiciones de crecimiento adecuadas donde dicha célula recombinante exhibe la capacidad de producir glucósidos de esteviol, comprendiendo el método poner en contacto dicha célula recombinante con una composición de reacción que contiene esteviósido, sacarosa sintasa y sacarosa; en donde dicha célula recombinante expresa una primera UDP-glicosiltransferasa (UGT) o una porción catalíticamente activa de la misma capaz de usar dicho sustrato de esteviósido para producir rebaudiósido E; en donde dicha célula recombinante expresa una segunda UDP-glicosiltransferasa (UGT) o una porción catalíticamente activa de la misma capaz de usar dicho rebaudiósido E para producir rebaudiósido D4; y, en donde dicha célula recombinante expresa una tercera UDP-glicosiltransferasa (UGT) o una porción catalíticamente activa de la misma capaz de usar dicho Rebaudiósido D4 para producir rebaudiósido M. En algunas realizaciones, el método comprende además un gen de sacarosa sintasa o una porción catalíticamente activa del mismo expresándose en dicha célula recombinante. En algunas realizaciones, el método comprende además la adición de sacarosa sintasa a la composición de reacción.
La divulgación proporciona adicionalmente una célula recombinante que expresa una vía biosintética para producir Reb M (por ejemplo, mediante la conversión de Reb D4 en Reb M o mediante la conversión de Reb E en Reb D4 en Reb M). En algunas realizaciones, la célula expresa una o más de una primera UDP-glicosiltransferasa (UGT) o una porción catalíticamente activa de la misma capaz de usar dicho sustrato de esteviósido para producir rebaudiósido E, una segunda UDP-glicosiltransferasa (UGT) o una porción catalíticamente activa de la misma capaz de usar dicho Rebaudiósido E para producir rebaudiósido D4, y una tercera UDP-glicosiltransferasa (UGT) o una porción catalíticamente activa de la misma capaz de usar dicho Rebaudiósido D4 para producir rebaudiósido M. En algunas realizaciones, la célula es una célula de levadura. En algunas realizaciones, la célula es una célula bacteriana. En algunas realizaciones, la célula es una célula vegetal.
Se divulga un método para producir Reb M utilizando las enzimas y sustratos descritos en la FIG. 14, o un subconjunto de los mismos (por ejemplo, comenzando con Reb W, Reb WB1 o Reb D4 y/o utilizando UGT76G1, CP1 o CR1). En algunas realizaciones, el Reb M se produjo usando una mezcla de reacciónin vitroque contiene las enzimas y sustratos descritos en la FIG. 14, o un subconjunto de los mismos (por ejemplo, comenzando con Reb W, Reb WB1 o Reb D4 y/o utilizando UGT76G1, CP1 o CR1). En algunas realizaciones, el Reb M se produjoin vivoen una célula que expresa las enzimas descritas en la FIG. 14, o un subconjunto de las mismas (por ejemplo, UGT76G1, CP1 o CR1), en donde la célula se incuba con un sustrato descrito en la FIG. 14 (por ejemplo, Reb W, Reb WB1, o Reb D4). En algunas realizaciones, la célula es una célula de levadura. En algunas realizaciones, la célula es una célula bacteriana. En algunas realizaciones, la célula es una célula vegetal.
En términos de producto/utilidad comercial, hay varias docenas de productos que contienen glucósidos de esteviol en el mercado de los Estados Unidos y pueden usarse en todo desde analgésicos hasta repelentes de plagas así como en alimentos y como suplemento dietético. Los productos que contienen glucósidos de esteviol pueden ser aerosoles, líquidos o formulaciones granulares.
Si bien la divulgación es susceptible a diversas modificaciones y formas alternativas, realizaciones específicas de la misma se muestran a modo de ejemplo en los dibujos y se describirán en detalle en el presente documento.
Otras características y ventajas de la invención resultarán evidentes en la siguiente descripción detallada de realizaciones preferidas tomadas con referencia a los dibujos adjuntos.
Breve descripción de los dibujos
FIG. 1. Muestra la estructura del rebaudiósido D4 -[(2-0-p-D-glucopiranosil-3-0-p-D-glucopiranosil-p-D-glucopiranosil) éster]) del ácido (13-[(2-0-p-D-glucopiranosil-p-D-glucopiranosil)oxi] ent-kaur-16-en-19-oico.
FIG. 2. Muestra las estructuras del rebaudiósido WB1 y WB2.
FIG. 3. Muestra los perfiles de HPLC de los productos de hidrólisis del rebaudiósido W. El rebaudiósido W es hidrolizado por la enzima B-glu1. A: Estándar de rebaudiósido W ("W"); B-D: El rebaudiósido W se hidrolizó mediante la enzima B-glu1 recombinante a 1 hora (B), 6 horas (C) y 24 horas (D).
FIG. 4. Muestra el perfil de HPLC de la bioconversión de rebaudiósido WB2 ("WB2") a rebaudiósido WB1 ("WB1") mediante UGT85C2. Se incubó rebaudiósido WB2 con enzima UGT85C2 a las 0 horas (A), 2 horas (B), 6 horas (C) y 18 horas (D).
FIG. 5. Muestra el análisis LC-MS de rebaudiósido WB1 y WB2.
FIG. 6. Muestra los perfiles de HPLC de la bioconversión de rebaudiósido WB1 en rebaudiósido D4 mediante la enzima HV1. A: Estándar de rebaudiósido WB1 ("WB1"); B-C: El rebaudiósido WB1 se convirtió mediante enzima HV1 a las 2 horas (B) y 6 horas (C).
FIGs. 7A y 7B. Muestran la estructura y los datos de LC-MS alrededor de la molécula Reb D4.
FIG. 8. Muestra la estructura de la enzima UDP UGT71G1. Se muestra la orientación estándar con Histidina ubicada a la izquierda y UDP a la derecha.
FIG. 9. Muestra la estructura de la enzima UGT76G1, destacando las hélices alfa y las láminas beta en la estructura UGT76G1.
FIG. 10. Muestra una comparación de las enzimas CP1 y UGT76G1. La estructura cristalina del UGT76G1 es de color gris, mientras que el modelo CP1 es de color negro.
FIG. 11. Muestra la estructura cristalina UGT76G1 y su interacción con la molécula CP1. Esta estructura cristalina resalta la ausencia de láminas beta en el modelo de CP1. La estructura cristalina del UGT76G1 es de color gris, mientras que el modelo CP1 es de color negro.
FIG. 12. Muestra el Rebaudiósido D4 en el centro de reacción de la enzima CP1. La molécula de color gris oscuro ubicada en la parte inferior de la imagen es el rebaudiósido D4.
FIG. 13. Muestra la producciónin vitrode Reb M a partir de Reb D4 catalizada por una combinación de un polipéptido UGT76G1 recombinante, una CP1 recombinante y un mutante (CR1). A: muestra los estándares de rebaudiósido D ("D") y rebaudiósido M ("M"). B: muestra el estándar del rebaudiósido D4 ("D4"). Reb M producido enzimáticamente por UGT76G1 en 30 min (C) y 1 h (F), Reb M producido enzimáticamente por CP1 a los 30 min (D) y 1 h (G). Reb M producido enzimáticamente por CR1 a los 30 min (E) y 1 hr (H).
FIG. 14. Muestra la vía sintética para la biosíntesis del rebaudiósido M a partir del rebaudiósido W.
FIG. 15 Muestra correlaciones clave de GHMBC de Reb WB2.
FIG. 16 Muestra correlaciones clave de GHMBC de Reb WB1.
FIG. 17 Muestra correlaciones clave TOCSY y GHMBC de Reb D4.
Descripción detallada de ciertas realizaciones de la invención
Explicación de los términos utilizados en este documento:
Los glucósidos de esteviol son una clase de compuestos químicos responsables del sabor dulce de las hojas de la planta sudamericana.Stevia rebaudiana (Asteráceas),y pueden utilizarse como edulcorantes en alimentos, piensos y bebidas.
Definiciones:
"Sistema celular" es cualquier célula que proporcione la expresión de proteínas ectópicas. Incluía bacterias, levaduras, células vegetales y células animales. Incluye tanto células procarióticas como eucariotas. También incluye la expresiónin vitrode proteínas basadas en componentes celulares, tales como los ribosomas.
A "secuencia de codificación" se le debe dar su significado normal y habitual para una persona con conocimientos normales en la técnica, y se utiliza sin limitación para referirse a una secuencia de ADN que codifica una secuencia de aminoácidos específica.
"Crecimiento del sistema celular". El crecimiento incluye proporcionar un medio apropiado que permitiría a las células multiplicarse y dividirse. También incluye proporcionar recursos para que las células o componentes celulares puedan traducir y producir proteínas recombinantes.
"Expresión de proteínas". La producción de proteínas puede ocurrir después de la expresión genética. Consiste en las etapas posteriores a la transcripción del<a>D<n>a ARN mensajero (ARNm). Luego, el ARNm se traduce en cadenas polipeptídicas, que finalmente se pliegan en proteínas. El ADN está presente en las células mediante la transfección -un proceso de introducción deliberada de ácidos nucleicos en las células. El término se utiliza a menudo para métodos no virales en células eucariotas. También puede referirse a otros métodos y tipos de células, aunque se prefieren otros términos: "transformación" se utiliza más a menudo para describir la transferencia de ADN no viral en bacterias, células eucariotas no animales, incluidas las células vegetales. En células animales, transfección es el término preferido ya que transformación también se usa para referirse a la progresión a un estado canceroso (carcinogénesis) en estas células. La transducción se utiliza a menudo para describir la transferencia de ADN mediada por virus. La transformación, la transducción y la infección viral se incluyen en la definición de transfección para esta solicitud.
"Levadura". De acuerdo con la descripción actual, una levadura como se reivindica en el presente documento son microorganismos unicelulares eucariotas clasificados como miembros del reino de los hongos. Las levaduras son organismos unicelulares que evolucionaron a partir de ancestros multicelulares, pero algunas especies útiles para la presente divulgación son aquellas que tienen la capacidad de desarrollar características multicelulares formando cadenas de células en crecimiento conectadas conocidas como pseudohifas o falsas hifas.
"Enzimas UGT". Los nombres de las enzimas UGT utilizadas en la presente divulgación son consistentes con el sistema de nomenclatura adoptado por el Comité de Nomenclatura de la UGT (Mackenzie et al.,"The UDP glycosyltransferase gene super family: recommended nomenclature updated based on evolutionary divergence,"<p>H<a r>M<a>COGENETICS, 1997, vol. 7, pp. 255-269), que clasifica los genes UGT mediante la combinación de un número de familia, una letra que indica una subfamilia y un número para un gen individual. Por ejemplo, el nombre "UGT76G1" se refiere a una enzima UGT codificada por un gen perteneciente a la familia UGT número 76 (que es de origen vegetal), subfamilia G y gen número 1.
Términos estructurales:
Como se usa en el presente documento, las formas singulares "un, uno, una" y "el, la" incluyen referencias en plural a menos que el contenido indique claramente lo contrario.
En la medida en que el término "incluye", "tiene" o similar se utiliza en la descripción o las reivindicaciones, se pretende que dicho término sea inclusivo de una manera similar al término "comprende" como "comprende". se interpreta cuando se emplea como palabra de transición en una reivindicación.
La palabra "ejemplar" se utiliza en el presente documento con el significado de "que sirve como ejemplo, instancia o ilustración". Cualquier realización descrita en el presente documento como "ejemplar" no necesariamente debe interpretarse como preferida o ventajosa sobre otras realizaciones.
El término "complementario" debe recibir su significado normal y habitual para una persona con conocimientos normales en la técnica, y se utiliza sin limitación para describir la relación entre bases de nucleótidos que son capaces de hibridarse entre sí. Por ejemplo, con respecto al ADN, la adenosina es complementaria a la timina y la citosina es complementaria a la guanina. En consecuencia, la tecnología de sujeción también incluye fragmentos de ácidos nucleicos aislados que son complementarios de las secuencias completas tal como se informa en el Listado de Secuencias adjunto, así como aquellas secuencias de ácidos nucleicos sustancialmente similares.
Los términos "ácido nucleico" y "nucleótido" deben recibir sus respectivos significados normales y habituales para una persona con conocimientos normales en la técnica, y se utilizan sin limitación para referirse a desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos y polímeros de los mismos en cualquiera de los dos casos o bien sea en forma monocatenaria o bicatenaria. A menos que se limite específicamente, el término abarca ácidos nucleicos que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales que tienen propiedades de unión similares a las del ácido nucleico de referencia y se metabolizan de una manera similar a los nucleótidos de origen natural. A menos que se indique otra cosa, una secuencia de ácido nucleico particular también abarca implícitamente variantes degeneradas o modificadas de forma conservadora de la misma (por ejemplo, sustituciones de codones degenerados) y secuencias complementarias, así como la secuencia indicada explícitamente.
Al término "aislado" se le debe dar su significado normal y habitual para una persona con experiencia normal en la técnica, y cuando se usa en el contexto de un ácido nucleico aislado o un polipéptido aislado, se usa sin limitación para referirse a un ácido nucleico o polipéptido que, por obra del hombre, existe aparte de su entorno nativo y, por tanto, no es un producto de la naturaleza. Un ácido nucleico o polipéptido aislado puede existir en una forma purificada o puede existir en un entorno no nativo tal como, por ejemplo, en una célula huésped transgénica.
Los términos "incubar" e "incubación" como se usan en el presente documento significan un proceso de mezclar dos o más entidades químicas o biológicas (tales como un compuesto químico y una enzima) y permitirles interactuar en condiciones favorables para producir una composición de glucósido de esteviol.
El término "variante degenerada" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que tiene una secuencia de residuos que difiere de una secuencia de ácido nucleico de referencia por una o más sustituciones de codones degenerados. Las sustituciones de codones degenerados se pueden lograr generando secuencias en las que la tercera posición de uno o más codones seleccionados (o todos) se sustituye con bases mixtas y/o residuos de desoxiinosina. Una secuencia de ácido nucleico y todas sus variantes degeneradas expresarán el mismo aminoácido o polipéptido.
Los términos "polipéptido", "proteína" y "péptido" deben recibir sus respectivos significados normales y habituales para una persona con conocimientos normales en la técnica; los tres términos a veces se usan indistintamente y se usan sin limitación para referirse a un polímero de aminoácidos o análogos de aminoácidos, independientemente de su tamaño o función. Aunque "proteína" se utiliza a menudo en referencia a polipéptidos relativamente grandes, y "péptido" se utiliza a menudo en referencia a polipéptidos pequeños, el uso de estos términos en la técnica se superpone y varía. El término "polipéptido", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a péptidos, polipéptidos y proteínas, a menos que se indique otra cosa. Los términos "proteína", "polipéptido" y "péptido" se usan indistintamente en el presente documento cuando se refieren a un producto polinucleotídico. Por lo tanto, los polipéptidos ejemplares incluyen productos polinucleotídicos, proteínas naturales, homólogos, ortólogos, parálogos, fragmentos y otros equivalentes, variantes y análogos de los anteriores.
Los términos "fragmento de polipéptido" y "fragmento", cuando se usan en referencia a un polipéptido de referencia, deben recibir sus significados normales y habituales para una persona con experiencia normal en la técnica, y se usan sin limitación para referirse a un polipéptido en donde los residuos de aminoácidos están eliminados en comparación con el propio polipéptido de referencia, pero donde la secuencia de aminoácidos restante usualmente es idéntica a las posiciones correspondientes en el polipéptido de referencia. Tales eliminaciones pueden ocurrir en el terminal amino o terminal carboxi del polipéptido de referencia, o alternativamente en ambos.
El término "fragmento funcional" de un polipéptido o proteína se refiere a un fragmento peptídico que es una porción del polipéptido o proteína de longitud completa, y tiene sustancialmente la misma actividad biológica, o lleva a cabo sustancialmente la misma función que el polipéptido o proteína de longitud completa (por ejemplo, llevando a cabo la misma reacción enzimática).
Los términos "polipéptido variante", "secuencia de aminoácidos modificada" o "polipéptido modificado", que se usan indistintamente, se refieren a una secuencia de aminoácidos que es diferente del polipéptido de referencia en uno o más aminoácidos, por ejemplo, por una o más sustituciones, eliminaciones y/o adiciones de aminoácidos. En un aspecto, una variante es una "variante funcional" que conserva parte o toda la capacidad del polipéptido de referencia.
El término "variante funcional" incluye además variantes sustituidas de forma conservadora. El término "variante sustituida de forma conservadora" se refiere a un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de un péptido de referencia en una o más sustituciones de aminoácidos conservadoras, y mantiene parte o toda la actividad del péptido de referencia. Una "sustitución de aminoácidos conservadora" es una sustitución de un residuo de aminoácidos por un residuo funcionalmente similar. Ejemplos de sustituciones conservadoras incluyen la sustitución de un residuo no polar (hidrófobo) tal como isoleucina, valina, leucina o metionina por otro; la sustitución de un residuo cargado o polar (hidrofílico) por otro tal como entre arginina y lisina, entre glutamina y asparagina, entre treonina y serina; la sustitución de un residuo básico tal como lisina o arginina por otro; o la sustitución de un residuo ácido, tal como ácido aspártico o ácido glutámico por otro; o la sustitución de un residuo aromático, tal como fenilalanina, tirosina o triptófano, por otro. Se espera que tales sustituciones tengan poco o ningún efecto sobre el peso molecular aparente o el punto isoeléctrico de la proteína o polipéptido. La expresión "variante sustituida conservadoramente" también incluye péptidos en donde un residuo se reemplaza con un residuo químicamente derivado, siempre que el péptido resultante mantenga parte o toda la actividad del péptido de referencia como se describe en el presente documento.
El término "variante", en relación con los polipéptidos de la tecnología en cuestión, incluye además un polipéptido funcionalmente activo que tiene una secuencia de aminoácidos de al menos 75%, al menos 76%, al menos 77%, al menos 78%, al menos 79%, al menos 80%, al menos 81%, al menos 82%, al menos 83%, al menos 84%, al menos 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos 88%, al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, e incluso 100% idéntico a la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de referencia.
El término "homólogo" en todas sus formas gramaticales y variaciones ortográficas se refiere a la relación entre polinucleótidos o polipéptidos que poseen un "origen evolutivo común", incluyendo polinucleótidos o polipéptidos de superfamilias y polinucleótidos o proteínas homólogas de diferentes especies (Reeck et al., CELL 50:667, 1987). Dichos polinucleótidos o polipéptidos tienen homología de secuencia, como se refleja en su similitud de secuencia, ya sea en términos de porcentaje de identidad o de presencia de aminoácidos o motivos específicos en posiciones conservadas. Por ejemplo, dos polipéptidos homólogos pueden tener secuencias de aminoácidos que son al menos 75%, al menos 76%, al menos 77%, al menos 78%, al menos 79%, al menos 80%, al menos 81%, al menos 82%, al menos 83%, al menos 84%, al menos 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos 88%, al menos 89%, al menos 900 al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% e incluso 100% idénticos.
A "secuencias reguladoras adecuadas" se le debe dar su significado normal y habitual para una persona con conocimientos normales en la técnica, y se utiliza, sin limitación, para referirse a secuencias de nucleótidos situadas corriente arriba (secuencias no codificantes 5'), dentro de, o corriente abajo (secuencias no codificantes 3') de una secuencia de codificación, y que influyen en la transcripción, el procesamiento o la estabilidad del ARN, o la traducción de la secuencia de codificación asociada. Las secuencias reguladoras pueden incluir promotores, secuencias líderes de traducción, intrones y secuencias de reconocimiento de poliadenilación.
"Promotor" debe recibir su significado normal y habitual para una persona con experiencia normal en la técnica, y se usa sin limitación para referirse a una secuencia de ADN capaz de controlar la expresión de una secuencia de codificación o ARN funcional. En general, una secuencia de codificación está situada en 3' con respecto a una secuencia promotora. Los promotores pueden derivarse en su totalidad de un gen nativo o estar compuestos de diferentes elementos derivados de diferentes promotores que se encuentran en naturaleza, o incluso comprender segmentos de ADN sintético. Los expertos en la técnica entienden que diferentes promotores pueden dirigir la expresión de un gen en diferentes tejidos o tipos de células, o en diferentes etapas de desarrollo, o en respuesta a diferentes condiciones ambientales.
Los promotores, que hacen que un gen se exprese en la mayoría de los tipos de células en la mayoría de los momentos, se denominan comúnmente "promotores constitutivos". Se reconoce además que, dado que en la mayoría de los casos los límites exactos de las secuencias reguladoras no se han definido completamente, los fragmentos de ADN de diferentes longitudes pueden tener una actividad promotora idéntica.
El término "unido operativamente" se refiere a la asociación de secuencias de ácido nucleico en un único fragmento de ácido nucleico de modo que la función de uno se ve afectada por el otro. Por ejemplo, un promotor está unido operativamente con una secuencia de codificación cuando es capaz de afectar la expresión de esa secuencia de codificación (es decir, que la secuencia de codificación está bajo el control transcripcional del promotor). Las secuencias codificantes pueden unirse operativamente a secuencias reguladoras en orientación en sentido o antisentido.
El término "expresión", como se usa en el presente documento, debe darse su significado normal y habitual para una persona con experiencia normal en la técnica, y se usa sin limitación para referirse a la transcripción y acumulación estable del ARN en sentido (ARNm) o antisentido derivado del fragmento de ácido nucleico de la tecnología en cuestión. "Sobreexpresión" se refiere a la producción de un producto genético en organismos transgénicos o recombinantes que excede los niveles de producción en organismos normales o no transformados.
A "transformación" se le debe dar su significado normal y habitual para una persona con experiencia razonable en el campo, y se usa, sin limitación, para referirse a la transferencia de un polinucleótido a una célula diana para su posterior expresión por esa célula. El polinucleótido transferido puede incorporarse al genoma o al ADN cromosómico de una célula diana, dando como resultado una herencia genéticamente estable, o puede replicarse independientemente del cromosoma huésped. Los organismos huéspedes que contienen los fragmentos de ácido nucleico transformados se denominan organismos "transgénicos", "recombinantes" o "transformados".
Los términos "transformado", "transgénico" y "recombinante", cuando se usan en el presente documento en relación con células huésped, deben recibir sus respectivos significados normales y habituales para una persona con experiencia normal en la técnica, y se usan sin limitación, para referirse a una célula de un organismo huésped, tal como una planta o una célula microbiana, en donde se ha introducido una molécula de ácido nucleico heteróloga. La molécula de ácido nucleico puede integrarse de manera estable en el genoma de la célula huésped, o la molécula de ácido nucleico puede estar presente como una molécula extracromosómica. Una molécula extracromosómica de este tipo puede autorreplicarse. Se entiende que las células, tejidos o sujetos transformados abarcan no sólo el producto final de un proceso de transformación, sino también su progenie transgénica.
Los términos "recombinante", "heterólogo" y "exógeno", cuando se usan en el presente documento en relación con polinucleótidos, deben recibir sus significados normales y habituales para una persona con experiencia normal en la técnica, y se usan sin limitación para referirse a un polinucleótido (por ejemplo, una secuencia de ADN o un gen) que se origina a partir de una fuente extraña a la célula huésped particular o, si proviene de la misma fuente, se modifica desde su forma original. Por tanto, un gen heterólogo en una célula huésped incluye un gen que es endógeno para la célula huésped particular pero que ha sido modificado mediante, por ejemplo, el uso de mutagénesis dirigida u otras técnicas recombinantes. Los términos también incluyen copias múltiples de origen no natural de una secuencia de ADN de origen natural. Por tanto, los términos se refieren a un segmento de ADN que es extraño o heterólogo a la célula, u homólogo a la célula pero en una posición o forma dentro de la célula huésped en donde el elemento normalmente no se encuentra.
De manera similar, los términos "recombinante", "heterólogo" y "exógeno", cuando se usan en el presente documento en relación con un polipéptido o secuencia de aminoácidos, significan un polipéptido o secuencia de aminoácidos que se origina a partir de una fuente extraña a la célula huésped particular o, si proviene de la misma fuente, se modifica desde su forma original. Por tanto, se pueden expresar segmentos de ADN recombinante en una célula huésped para producir un polipéptido recombinante.
Los términos "plásmido", "vector" y "casete" deben recibir sus respectivos significados normales y habituales para una persona con conocimientos normales en la técnica, y se utilizan sin limitación para referirse a un elemento extracromosómico a menudo que portan genes que no forman parte del metabolismo central de la célula y usualmente se encuentran en forma de moléculas circulares de ADN bicatenario. Dichos elementos pueden ser secuencias que se replican de forma autónoma, secuencias que integran el genoma, secuencias de fagos o de nucleótidos, lineales o circulares, de ADN o ARN monocatenario o bicatenario, derivadas de cualquier fuente, en las que se han unido o recombinado varias secuencias de nucleótido. en una construcción única que es capaz de introducir un fragmento promotor y una secuencia de ADN para un producto génico seleccionado junto con una secuencia 3' no traducida apropiada en una célula. "Casete de transformación" se refiere a un vector específico que contiene un gen extraño y que tiene elementos además del gen extraño que facilitan la transformación de una célula huésped particular. "Casete de expresión" se refiere a un vector específico que contiene un gen extraño y que tiene elementos además del gen extraño que permiten una expresión mejorada de ese gen en un huésped extraño.
Descripción detallada
La presente divulgación se relaciona con la producción de un glucósido de esteviol de interés, Reb D4 y luego el uso de enzimas UGT para permitir que el glucósido Reb D4 se convierta en Reb M. La presente divulgación también se relaciona con la producción de otros glucósidos de esteviol de interés, Reb WB1 y Reb WB2. La tecnología en cuestión utiliza polipéptidos recombinantes con actividades UDP glicosiltransferasa, tales como actividad de glicosilación de 1, 2-13-O-glucosa y actividad de glicosilación de 1, 3-13-O glucosa para sintetizar glucósidos de esteviol. En la presente divulgación, UDP-glicosiltransferasa (UGT) se refiere a una enzima que transfiere un residuo de azúcar de una molécula donadora activada (típicamente UDP-glucosa) a una molécula aceptora. La actividad de glicosilación de 1,3-13-O-glucosa se refiere a una actividad enzimática que transfiere una fracción de azúcar al C-3' de la fracción de 13-O glucosa del rebaudiósido D4 para producir Reb M (FIG. 14). La tecnología en cuestión también utiliza polipéptidos recombinantes con actividad beta-glucosidasa para sintetizar glucósidos de esteviol.
Biología sintética
Las técnicas de clonación molecular y de ADN recombinante estándar utilizadas aquí son bien conocidas en la técnica y están descritas, por ejemplo, por Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, N.Y., 1989 (de aquí en adelante "Maniatis"); y por Silhavy, T. J., Bennan, M. L. and Enquist, L. W. EXPERIMENTS WITH GENE FUSIONS; Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, N.Y., 1984; y por Ausubel, F. M. et al., IN CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, publicado por GREENE PUBLISHING AND WILEY- INTERSCIENCE, 1987.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en este documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece la divulgación. Aunque en la práctica o prueba de la presente divulgación se puede utilizar cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento, los materiales y métodos preferidos se describen a continuación.
La divulgación se comprenderá mejor tras la consideración de los siguientes Ejemplos no limitantes. Debe entenderse que estos Ejemplos, si bien indican realizaciones preferidas de la tecnología en cuestión, se dan únicamente a modo de ilustración.
La glicosilación a menudo se considera una reacción ubicua que controla la bioactividad y el almacenamiento de productos naturales vegetales. La glicosilación de moléculas pequeñas está catalizada por una superfamilia de transferasas en la mayoría de las especies vegetales que se han estudiado hasta la fecha. Estas glicosiltransferasas (GTs) se han clasificado en más de 60 familias. De estas, las enzimas de la familia 1 GT, también conocidas como UDP glicosiltransferasas (UGTs), transfieren fracciones de azúcar activadas por UDP a moléculas aceptoras específicas. Estas son las moléculas que transfieren dichas fracciones de azúcar en los glucósidos de esteviol para crear diversos rebaudiósidos. Cada una de estas UGTs tiene su propio perfil de actividad y ubicaciones estructurales preferidas donde transfieren sus fracciones de azúcar activadas.
Sistemas de producción
La expresión de proteínas en procariotas se lleva a cabo con mayor frecuencia en una célula huésped bacteriana con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión de bien sea proteínas de fusión o no de fusión. Los vectores de fusión añaden un número de aminoácidos a una proteína codificada en ellos, usualmente al terminal amino de la proteína recombinante. Estos vectores de fusión típicamente tienen tres propósitos: 1) aumentar la expresión de proteína recombinante; 2) aumentar la solubilidad de la proteína recombinante; y 3) ayudar en la purificación de la proteína recombinante actuando como ligando en la purificación por afinidad. A menudo, se introduce un sitio de escisión proteolítica en la unión de la fracción de fusión y la proteína recombinante para permitir la separación de la proteína recombinante de la fracción de fusión después de la purificación de la proteína de fusión. Dichos vectores están dentro del alcance de la presente divulgación.
En una realización, el vector de expresión incluye aquellos elementos genéticos para la expresión del polipéptido recombinante en células bacterianas. Los elementos para la transcripción y traducción en la célula bacteriana pueden incluir un promotor, una región de codificación para el complejo proteico y un terminador transcripcional.
Una persona con conocimientos normales en la técnica conocerá las técnicas de biología molecular disponibles para la preparación de vectores de expresión. El polinucleótido usado para la incorporación en el vector de expresión de la tecnología en cuestión, como se describe anteriormente, puede prepararse mediante técnicas rutinarias tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Se ha desarrollado un número de técnicas de biología molecular para unir operativamente el ADN a los vectores a través de terminales cohesivos complementarios. En una realización, se pueden añadir tractos de homopolímero complementarios a la molécula de ácido nucleico que se va a insertar en el ADN del vector. Luego, el vector y la molécula de ácido nucleico se unen mediante enlaces de hidrógeno entre las colas homopoliméricas complementarias para formar moléculas de ADN recombinante.
En una realización alternativa, se usan enlazadores sintéticos que contienen uno o más sitios de restricción para enlazar operativamente el polinucleótido de la tecnología en cuestión al vector de expresión. En una realización, el polinucleótido se genera mediante digestión con endonucleasas de restricción. En una realización, la molécula de ácido nucleico se trata con ADN polimerasa del bacteriófago T4 o ADN polimerasa I de E. coli, enzimas que eliminan los terminales 3' monocatenarios que sobresalen, con sus actividades 3'-5'-exonucleolíticas y rellenan los extremos 3' rebajados con sus actividades polimerizantes, generando así segmentos de ADN con extremos romos. Luego, los segmentos con extremos romos se incuban con un gran exceso molar de moléculas enlazadoras en presencia de una enzima que es capaz de catalizar la ligación de moléculas de ADN con extremos romos, tales como la ADN ligasa del bacteriófago T4. Por tanto, el producto de la reacción es un polinucleótido que lleva secuencias enlazadoras poliméricas en sus extremos. A continuación, estos polinucleótidos se escinden con la enzima de restricción apropiada y se ligan a un vector de expresión que se ha escindido con una enzima que produce terminales compatibles con los del polinucleótido.
Alternativamente, se puede emplear un vector que tenga sitios de clonación independientes de ligación (LIC). El polinucleótido amplificado por PCR requerido puede luego clonarse en el vector LIC sin digestión ni ligación de restricción (Aslanidis and de Jong, NUCL. ACID. RES. 18, 6069-74, (1990), Haun, et al., BIOTECHNIQUES 13, 515 18 (1992)).
En una realización, para aislar y/o modificar el polinucleótido de interés para su inserción en el plásmido elegido, es adecuado utilizar PCR. Los cebadores apropiados para su uso en la preparación de PCR de la secuencia se pueden diseñar para aislar la región de codificación requerida de la molécula de ácido nucleico, agregar endonucleasa de restricción o sitios LIC, colocar la región de codificación en el marco de lectura deseado.
En una realización, un polinucleótido para su incorporación en un vector de expresión de la tecnología en cuestión se prepara mediante el uso de PCR usando cebadores oligonucleotídicos apropiados. La región de codificación se amplifica, mientras que los propios cebadores se incorporan al producto de la secuencia amplificada. En una realización, los cebadores de amplificación contienen sitios de reconocimiento de endonucleasas de restricción, que permiten clonar el producto de la secuencia amplificada en un vector apropiado.
Los vectores de expresión se pueden introducir en células huésped vegetales o microbianas mediante técnicas de transformación o transfección convencionales. La transformación de células apropiadas con un vector de expresión de la tecnología en cuestión se logra mediante métodos conocidos en la técnica y típicamente depende tanto del tipo de vector como de célula. Las técnicas adecuadas incluyen coprecipitación con fosfato cálcico o cloruro cálcico, transfección mediada por DEAE-dextrano, lipofección, quimioporación o electroporación.
Las células transformadas con éxito, es decir, aquellas células que contienen el vector de expresión, pueden identificarse mediante técnicas bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, las células transfectadas con un vector de expresión de la tecnología en cuestión se pueden cultivar para producir los polipéptidos descritos en el presente documento. Las células pueden examinarse para determinar la presencia del ADN del vector de expresión mediante técnicas bien conocidas en la técnica.
Las células huésped pueden contener una única copia del vector de expresión descrito anteriormente, o alternativamente, múltiples copias del vector de expresión,
En algunas realizaciones, la célula transformada es una célula animal, una célula de insecto, una célula vegetal, una célula de alga, una célula fúngica o una célula de levadura. En algunas realizaciones, la célula es una célula vegetal seleccionada del grupo que consiste en: célula vegetal de canola, célula vegetal de colza, célula vegetal de palma, célula vegetal de girasol, célula vegetal de algodón, célula vegetal de maíz, célula vegetal de cacahuete, una célula vegetal de lino, una célula vegetal de sésamo, una célula vegetal de soja y una célula vegetal de petunia.
Los sistemas de expresión de células huésped microbianas y los vectores de expresión que contienen secuencias reguladoras que dirigen un alto nivel de expresión de proteínas extrañas son bien conocidos por los expertos en la técnica. Cualquiera de estos podría usarse para construir vectores para la expresión del polipéptido recombinante de la tecnología de sujeción en una célula huésped microbiana. Estos vectores podrían luego introducirse en microorganismos apropiados a través de transformación para permitir un alto nivel de expresión del polipéptido recombinante de la tecnología en cuestión.
Los vectores o casetes útiles para la transformación de células huésped microbianas adecuadas son bien conocidos en la técnica. Típicamente el vector o casete contiene secuencias que dirigen la transcripción y traducción del polinucleótido relevante, un marcador seleccionable y secuencias que permiten la replicación autónoma o la integración cromosómica. Los vectores adecuados comprenden una región 5' del polinucleótido que alberga controles de iniciación transcripcional y una región 3' del fragmento de ADN que controla la terminación transcripcional. Se prefiere que ambas regiones de control deriven de genes homólogos a la célula huésped transformada, aunque debe entenderse que dichas regiones de control no necesitan derivar de genes nativos de la especie específica elegida como huésped.
Las regiones o promotores de control de iniciación, que son útiles para impulsar la expresión del polipéptido recombinante en la célula huésped microbiana deseada, son numerosos y familiares para los expertos en la técnica. Prácticamente cualquier promotor capaz de impulsar estos genes es adecuado para la tecnología en cuestión, incluidos, pero no limitados a, CYCI, HIS3, GALI, GALIO, ADHI, PGK, PH05, GAPDH, ADCI, TRPI, URA3, LEU2, ENO, TPI (útil para la expresión enSaccharomyces);AOXI (útil para la expresión enPichia);y lac, trp, JPL, IPR, T7, tac y trc (útiles para expresión enEscherichia coli).
Las regiones de control de terminación también pueden derivar de diversos genes nativos de los huéspedes microbianos. Opcionalmente se puede incluir un sitio de terminación para los huéspedes microbianos descritos en el presente documento.
En células vegetales, los vectores de expresión de la tecnología en cuestión pueden incluir una región de codificación unida operativamente a promotores capaces de dirigir la expresión del polipéptido recombinante de la tecnología en cuestión en los tejidos deseados en la etapa de desarrollo deseada. Por razones de conveniencia, los polinucleótidos que se van a expresar pueden comprender secuencias promotoras y secuencias líderes de traducción derivadas del mismo polinucleótido. También deberían estar presentes secuencias 3' no codificantes que codifiquen señales de terminación de la transcripción. Los vectores de expresión también pueden comprender uno o más intrones para facilitar la expresión de polinucleótidos.
Para células huésped de plantas, se puede usar cualquier combinación de cualquier promotor y cualquier terminador capaz de inducir la expresión de una región de codificación en las secuencias de vector de la tecnología en cuestión. Algunos ejemplos adecuados de promotores y terminadores incluyen los de los genes de la nopalina sintasa (nos), la octopina sintasa (ocs) y el virus del mosaico de la coliflor (CaMV). Un tipo de promotor vegetal eficaz que puede usarse es un promotor vegetal de alto nivel. Dichos promotores, en enlace operable con un vector de expresión de la tecnología en cuestión, deberían ser capaces de promover la expresión del vector. Los promotores de plantas de alto nivel que pueden usarse en la presente tecnología incluyen el promotor de las subunidades pequeñas de la ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa, por ejemplo de la soja (Berry-Lowe et al., J. MOLECULAR AND APP. GEN., 1:483 498 (1982)), y el promotor de la proteína de unión a clorofila. Se sabe que estos dos promotores son inducidos por luz en células vegetales (véase, por ejemplo, GENETIC ENGINEERING OF PLANTS, AN AGRICULTURAL PERSPECTIVE, A. Cashmore, Plenum, N.Y. (1983), páginas 29 38; Coruzzi, G. et al., The Journal of Biological CHEMISTRY, 258: 1399 (1983), y Dunsmuir, P. et al., JOURNAL OF MOLECULAR AND APPLIED GENETICS, 2:285 (1983)).
Síntesis precursora de Reb D4
Como se dijo anteriormente, los glucósidos de esteviol son los compuestos químicos responsables del sabor dulce de las hojas de la planta sudamericanaStevia rebaudiana (Asteraceae)y en la plantaRubus chingii (Rosaceae).Estos compuestos son diterpenos glicosilados.
Específicamente, sus moléculas pueden verse como una molécula de esteviol, con su átomo de hidrógeno hidroxilo reemplazado por una molécula de glucosa para formar un éster, y un hidrógeno hidroxilo con combinaciones de glucosa y ramnosa para formar un acetal.
Un método para preparar los compuestos de interés en la presente divulgación es tomar precursores comunes o económicos tales como esteviol o rubosusida derivados químicamente o producidos a través de biosíntesis en microbios diseñados como bacterias y/o levaduras y para sintetizar glucósidos de esteviol direccionados mediante métodos conocidos o económicos, tales como Reb D4.
Aspectos de la presente divulgación se relacionan con métodos que implican la expresión recombinante de enzimas en un sistema microbiano capaz de producir esteviol. En general, dichas enzimas pueden incluir: una copalil difosfato sintasa (CPS), una kaureno sintasa (KS) y un difosfato de geranilgeranilo a la enzima de sintasa (GGPPS). Esto debería ocurrir en una cepa microbiana que exprese una vía de síntesis de isoprenoides endógena, tal como la vía del no mevalonato (MEP) o la vía del ácido mevalónico (MVA). En algunas realizaciones la célula es una célula bacteriana, incluyendoE. coli,o células de levadura tales como celúla deSaccharomyces,celúla dePichia,o una celúla deYarrowia.En algunas realizaciones, la célula es una célula de alga o una célula vegetal.
Posteriormente, el precursor se recupera del cultivo de fermentación para su uso en síntesis química. Típicamente, este es esteviol, aunque puede ser kaureno, o un glucósido de esteviol procedente del cultivo celular. En algunas realizaciones, el esteviol, kaureno y/o glucósidos de esteviol se recuperan de la fase gaseosa, mientras que en otras realizaciones, se añade una capa orgánica o resina polimérica al cultivo celular, y al kaureno, esteviol y/o glucósidos de esteviol se recuperan de la capa orgánica o resina polimérica. En algunas realizaciones, el glicósido de esteviol se selecciona de rebaudiósido A, rebaudiósido B, rebaudiósido C, rebaudiósido D, rebaudiósido E, rebaudiósido F o dulcósido A. En algunas realizaciones, el terpenoide producido es esteviobiósido o esteviósido. También debe apreciarse que en algunas realizaciones, se realizanex-vivoal menos una etapa enzimática, tal como una o más etapas de glicosilación. Parte de la invención es la producción del glucósido de esteviol Reb D4 que luego se somete a una conversión enzimática adicional a Reb M. De acuerdo con la divulgación actual la biosíntesis para la conversión de esteviol producido microbianamente en glucósidos de esteviol deseados (aquí Reb D4) ocurre cuando el diterpenoide esteviol se convierte en esteviósido y rebaudiósido A usando un ensamblaje químico multi-etapas de la fracción de azúcar en la estructura principal de esteviol. Más específicamente la síntesis química consta de las siguientes etapas: 1) Se sintetiza un trimetilsililo (TMS) protegido en el grupo COOH C19 del esteviol a partir del precursor de partida esteviol. La tri-glucosilación en la posición C13-OH del esteviol se realiza utilizando el grupo p-Glc-p-Glc(2—>1 )-p-Glc(3—► 1) protegido. A esto le sigue una desprotección del TMS y el acoplamiento de una fracción mono p-Glc-Br protegida. La desprotección final elimina todos los grupos protectores para producir rebaudiósido D4.
Biosíntesis de glucósidos de esteviol
Como se describe en el presente documento, los polipéptidos recombinantes de la presente tecnología tienen actividades UDP-glicosiltransferasa y son útiles para desarrollar métodos biosintéticos para preparar glucósidos de esteviol que no están presentes o típicamente son de baja abundancia en fuentes naturales, tales como rebaudiósido D4 y rebaudiósido M respectivamente. Los polipéptidos recombinantes de la presente tecnología tienen actividades beta-glucosidasa o UDP-glicosiltransferasa, son útiles para desarrollar métodos biosintéticos para preparar nuevos glucósidos de esteviol, tales como rebaudiósido D4 y útiles en la producción de rebaudiósido M.
El sustrato puede ser cualquier compuesto natural o sintético capaz de ser convertido en un compuesto de glicósido de esteviol en una reacción catalizada por uno o más UDP glicosiltransferasas. Por ejemplo, el sustrato puede ser extracto natural destevia,esteviol, esteviol-13-O-glucósido, esteviol-19-O-glucósido, esteviol-1,2-biosido, rubusosido, esteviosido, rebaudiósido A, rebaudiósido G o rebaudiósido E. El sustrato puede ser un compuesto puro o una mezcla de diferentes compuestos. Preferiblemente, el sustrato incluye un compuesto seleccionado del grupo que consiste en rubusósido, esteviósido, esteviol, rebaudiósido A, rebaudiósido E y combinaciones de los mismos.
El método descrito en el presente documento también proporciona un sistema de reacción de acoplamiento en donde se permite que los péptidos recombinantes descritos en el presente documento funcionen en combinación con una o más enzimas adicionales para mejorar la eficiencia o modificar el resultado de la biosíntesis general de compuestos de glucósidos de esteviol. Por ejemplo, la enzima adicional puede regenerar la UDP-glucosa necesaria para la reacción de glicosilación convirtiendo la UDP producida a partir de la reacción de glicosilación nuevamente en UDP-glucosa (usando, por ejemplo, sacarosa como donante del residuo de glucosa), mejorando así la eficiencia de la reacción de glicosilación.
En otra realización, el método de la tecnología en cuestión incluye además incubar una UDP-glicosiltransferasa recombinante con la sacarosa sintasa recombinante, el sustrato y el polipéptido recombinante descrito en el presente documento. La UDP-glicosiltransferasa recombinante puede catalizar una reacción de glicosilación diferente a la catalizada por el polipéptido recombinante de la tecnología en cuestión.
La UDP-glicosiltransferasa adecuada incluye cualquier UGT conocida en la técnica como capaz de catalizar una o más reacciones en la biosíntesis de compuestos de glucósidos de esteviol, tales como UGT85C2, UGT74G1, UGT76G1 o sus homólogos funcionales.
Típicamente, en el métodoin vitrode la tecnología en cuestión, se incluye UDP-glucosa en el tampón a una concentración de aproximadamente 0.2 mM a aproximadamente 5 mM, preferiblemente de aproximadamente 0.5 mM a aproximadamente 2 mM, más preferiblemente de aproximadamente 0.7 mM a aproximadamente 1.5 mM. En una realización, cuando se incluye una sacarosa sintasa recombinante en la reacción, la sacarosa también se incluye en el tampón a una concentración de aproximadamente 100 mM a aproximadamente 500 mM, preferiblemente de aproximadamente 200 mM a aproximadamente 400 mM, más preferiblemente de aproximadamente 250 mM a aproximadamente 350 mm.
Típicamente, en el métodoin vitrode la tecnología en cuestión, la relación en peso del polipéptido recombinante al sustrato, en base al peso seco, es de aproximadamente 1:100 a aproximadamente 1:5, preferiblemente de aproximadamente 1:50 a aproximadamente 1:10, más preferiblemente de aproximadamente 1:25 a aproximadamente 1:15.
Típicamente, la temperatura de reacción del métodoin vitroes de aproximadamente 20°C a aproximadamente 40°C, adecuadamente de 25°C a aproximadamente 37°C, más adecuadamente de 28°C a aproximadamente 32°C.
Un experto en la técnica reconocerá que la composición de glicósidos de esteviol producida mediante el método descrito en el presente documento se puede purificar y mezclar adicionalmente con otros glucósidos, saborizantes o edulcorantes de esteviol para obtener una composición de sabor o edulcorante deseada. Por ejemplo, una composición enriquecida con rebaudiósido D4 producida como se describe en el presente documento se puede mezclar con un extracto natural desteviaque contiene rebaudiósido A como glicósido de esteviol predominante, o con otros productos de glicósidos de esteviol sintéticos o naturales para preparar una composición edulcorante deseada. Alternativamente, un glucósido de esteviol sustancialmente purificado (por ejemplo, rebaudiósido D4) obtenido a partir de la composición de glucósido de esteviol descrita en el presente documento se puede combinar con otros edulcorantes, tales como sacarosa, maltodextrina, aspartamo, sucralosa, neotamo, acesulfamo potásico y sacarina. La cantidad de glucósido de esteviol en relación con otros edulcorantes se puede ajustar para obtener el sabor deseado, como se conoce en la técnica. La composición de glucósido de esteviol descrita en el presente documento (incluido rebaudiósido D, rebaudiósido E, rebaudiósido D4, rebaudiósido M o una combinación de los mismos) se pueden incluir en productos alimenticios (tales como bebidas, refrescos, helados, productos lácteos, confitería, cereales, gomas de mascar, productos horneados, etc.), suplementos dietéticos, nutrición médica, así como como productos farmacéuticos.
Un experto en la técnica reconocerá que la composición de glucósidos de esteviol producida mediante el método descrito en el presente documento puede purificarse adicionalmente y mezclarse con otros glucósidos, saborizantes o edulcorantes de esteviol para obtener una composición de sabor o edulcorante deseada. Por ejemplo, una composición enriquecida con rebaudiósido D4 producida como se describe en el presente documento se puede mezclar con un extracto natural desteviaque contiene rebaudiósido A como glicósido de esteviol predominante, o con otros productos de glicósidos de esteviol sintéticos o naturales para preparar una composición edulcorante deseada. Alternativamente, un glucósido de esteviol sustancialmente purificado (por ejemplo, rebaudiósido D4) obtenido a partir de la composición de glucósido de esteviol descrita en el presente documento se puede combinar con otros edulcorantes, tales como sacarosa, maltodextrina, aspartamo, sucralosa, neotamo, acesulfamo potásico y sacarina. La cantidad de glucósido de esteviol en relación con otros edulcorantes se puede ajustar para obtener el sabor deseado, como se conoce en la técnica. La composición de glucósido de esteviol descrita en el presente documento (que incluye rebaudiósido D, rebaudiósido E, rebaudiósido D4, rebaudiósido WB1, rebaudiósido WB2, rebaudiósido M o una combinación de los mismos) se puede incluir en productos alimenticios (tales como bebidas, refrescos, helados, productos lácteos, confitería, cereales, gomas de mascar, productos horneados, etc.), complementos dietéticos, nutrición médica, así como productos farmacéuticos.
Análisis de similitud de secuencia mediante puntuación de identidad
Como se usa en el presente documento, "identidad de secuencia" se refiere al grado en que dos secuencias de polinucleótidos o péptidos alineadas óptimamente son invariantes a lo largo de una ventana de alineación de componentes, por ejemplo, nucleótidos o aminoácidos. Una "fracción de identidad" para segmentos alineados de una secuencia de prueba y una secuencia de referencia es el número de componentes idénticos que comparten las dos secuencias alineadas dividido por el número total de componentes en el segmento de secuencia de referencia, es decir, la secuencia de referencia completa o una parte definida más pequeña de la secuencia de referencia.
Como se usa en el presente documento, el término "porcentaje de identidad de secuencia" o "porcentaje de identidad" se refiere al porcentaje de nucleótidos idénticos en una secuencia de polinucleótidos lineal de una molécula de polinucleótido de referencia ("consulta") (o su cadena complementaria) en comparación con una molécula de polinucleótido de prueba ("sujeto") (o su cadena complementaria) cuando las dos secuencias están alineadas de manera óptima (con inserciones, eliminaciones o brechas de nucleótidos apropiados que suman menos más del 20 por ciento de la secuencia de referencia durante la ventana de comparación). Los expertos en la técnica conocen bien el alineamiento óptimo de secuencias para alinear una ventana de comparación y pueden realizarse mediante herramientas tales como el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, el algoritmo de alineamiento por homología de Needleman y Wunsch, el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, y preferiblemente mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos tales como GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA disponibles como parte de GCG® Wisconsin Package® (Accelrys Inc., Burlington, MA). Una "fracción de identidad" para segmentos alineados de una secuencia de prueba y una secuencia de referencia es el número de componentes idénticos que comparten las dos secuencias alineadas dividido por el número total de componentes en el segmento de secuencia de referencia, es decir, la secuencia de referencia completa o una parte definida más pequeña de la secuencia de referencia. El porcentaje de identidad de secuencia se representa como la fracción de identidad multiplicada por 100. La comparación de una o más secuencias de polinucleótidos puede ser con una secuencia de polinucleótidos de longitud completa o una porción de la misma, o con una secuencia de polinucleótidos más larga. Para los fines de esta divulgación, el "porcentaje de identidad" también se puede determinar utilizando BLASTX versión 2.0 para secuencias de nucleótidos traducidas y BLASTN versión 2.0 para secuencias de polinucleótidos.
El porcentaje de identidad de secuencia se determina preferiblemente utilizando el programa "Best Fit" o "Gap" del Sequence Analysis Software Package™ (Versión 10; Genetics Computer Group, Inc., Madison, WI). "Gap" utiliza el algoritmo de Needleman y Wunsch (Needleman and Wunsch, JOURNAL OF MOLECULAR BIO<l>O<g>Y 48:443-453, 1970) para encontrar el alineamiento de dos secuencias que maximiza el número de coincidencias y minimiza el número de brechas. "BestFit" realiza una alineación óptima del mejor segmento de similitud entre dos secuencias e inserta brechas para maximizar el número de coincidencias utilizando el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (Smith and Waterman, ADVANCES IN APPLIED MATHEMATICS, 2:482-489, 1981, Smith et al., NUCLEIC ACIDS RESEARCH 11:2205-2220, 1983). El porcentaje de identidad se determina más preferiblemente usando el programa "Best Fit".
También se divulgan métodos útiles para determinar la identidad de secuencia en los programas de la Herramienta de búsqueda de alineación local básica (BLAST) que están disponibles públicamente en el National Center Biotechnology Information (NCBI) en la National Library of Medicine, National Institute of Health, Bethesda, Md.
20894; véase Manual BLAST, Altschul et al., NCBI, NLM, NIH; Altschul et al., J. MOL. BIOL. 215:403-410 (1990); la versión 2.0 o superior de los programas BLAST permite la introducción de brechas (eliminaciones e inserciones) en las alineaciones; para la secuencia peptídica se puede utilizar BLASTX para determinar la identidad de la secuencia; y, para la secuencia de polinucleótidos, se puede utilizar BLASTN para determinar la identidad de la secuencia.
Como se usa en el presente documento, el término "porcentaje sustancial de identidad de secuencia" se refiere a un porcentaje de identidad de secuencia de al menos aproximadamente 70% de identidad de secuencia, al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia, al menos aproximadamente 85% de identidad, al menos aproximadamente 90% identidad de secuencia, o incluso mayor identidad de secuencia, tal como aproximadamente 98% o aproximadamente 99% de identidad de secuencia. Por lo tanto, una realización de la divulgación es una molécula de polinucleótido que tiene al menos aproximadamente un 70% de identidad de secuencia, al menos aproximadamente un 80% de identidad de secuencia, al menos aproximadamente un 85% de identidad, al menos aproximadamente un 90% de identidad de secuencia o incluso una mayor identidad de secuencia. tal como aproximadamente 98% o aproximadamente 99% de identidad de secuencia con una secuencia de polinucleótidos descrita en el presente documento. Las moléculas de polinucleótidos que tienen la actividad de los genes Blu1 y CP1 de la presente divulgación son capaces de dirigir la producción de una variedad de glucósidos de esteviol y tienen un porcentaje sustancial de identidad de secuencia con las secuencias de polinucleótidos proporcionadas en el presente documento y están abarcadas dentro del alcance de esta divulgación.
Identidad y similitud
La identidad es la fracción de aminoácidos que son iguales entre un par de secuencias después de un alineamiento de las secuencias (que se puede hacer usando solo información de secuencia o información estructural o alguna otra información, pero generalmente se basa en información de secuencia solo), y la similitud es la puntuación asignada con base en una alineación utilizando alguna matriz de similitud. El índice de similitud puede ser cualquiera de los siguientes BLOSUM62, PAM250 o GONNET, o cualquier matriz utilizada por un experto en la técnica para el alineamiento de secuencias de proteínas.
La identidad es el grado de correspondencia entre dos subsecuencias (sin brechas entre las secuencias). Una identidad del 25% o más implica similitud de función, mientras que el 18-25% implica similitud de estructura o función. Tenga en cuenta que dos secuencias aleatorias o completamente no relacionadas (que tengan más de 100 residuos) pueden tener una identidad superior al 20%. La similitud es el grado de semejanza entre dos secuencias cuando se comparan. Esto depende de su identidad.
Productos consumibles
En otro aspecto, la presente divulgación se dirige a un producto consumible que comprende un rebaudiósido como se describe en el presente documento, por ejemplo, Reb W1, Reb W2, Reb D4, Reb M, o una combinación de los mismos, tal como Reb D4 y Reb M. En algunas realizaciones, el producto consumible comprende una cantidad edulcorante de un rebaudiósido como se describe en el presente documento, por ejemplo, Reb W1, Reb W2, Reb D4 y/o Reb M. En algunas realizaciones, el producto consumible se selecciona del grupo que consiste en un producto de bebida, un producto alimenticio, un nutracéutico, un producto farmacéutico, un suplemento dietético, una composición de higiene dental, una composición de gel comestible, un producto cosmético y un saborizante de mesa.
En algunas realizaciones, el producto consumible puede tener una intensidad de dulzor equivalente a aproximadamente un 1% (p/v-%) a aproximadamente un 4% (p/v-%) de solución de sacarosa.
En algunas realizaciones, el rebaudiósido como se describe en el presente documento, por ejemplo, Reb W1, Reb W2, Reb D4, Reb M, o una combinación de los mismos tales como Reb D4 y Reb M, es el único edulcorante en el producto de consumo oral.
En algunas realizaciones, el producto consumible también puede tener al menos un edulcorante adicional. El al menos un edulcorante adicional puede ser, por ejemplo, un edulcorante natural de alta intensidad. El edulcorante adicional se puede seleccionar entre un extracto de stevia, un glucósido de esteviol, esteviósido, rebaudiósido A, rebaudiósido B, rebaudiósido C, rebaudiósido D, rebaudiósido D2, rebaudiósido E, rebaudiósido F, dulcósido A, rubusósido, esteviolbiósido, sacarosa, jarabe de maíz con alto contenido de fructosa, fructosa, glucosa, xilosa, arabinosa, ramnosa, eritritol, xilitol, manitol, sorbitol, inositol, AceK, aspartamo, neotamo, sucralosa, sacarina, naringina dihidrocalcona (NarDHC), neohesperidina dihidrocalcona (NDHC), rubusósido, mogrósido IV, siamenósido I, mogrósido V, monatina, taumatina, monelina, brazeína, L-alanina, glicina, Lo Han Guo, hernandulcina, filodulcina, trilobtaína, y combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, el producto consumible también puede tener al menos un aditivo. El aditivo puede ser, por ejemplo, un carbohidrato, un poliol, un aminoácido o una sal del mismo, un poliaminoácido o una sal del mismo, un ácido de azúcar o una sal del mismo, un nucleótido, un ácido orgánico, un ácido inorgánico, una sal orgánica, una sal de ácido orgánico, una sal de base orgánica, una sal inorgánica, un compuesto amargo, un saborizante, un ingrediente saborizante, un compuesto astringente, una proteína, un hidrolizado de proteína, un tensioactivo, un emulsionante, un flavonoide, un alcohol, un polímero y combinaciones de los mismos.
En un aspecto, la presente divulgación se dirige a un producto de bebida que comprende una cantidad edulcorante de un rebaudiósido como se describe en el presente documento, por ejemplo, Reb W1, Reb W2, Reb D4, Reb M, o una combinación de los mismos tal como Reb D4 y Reb M.
El producto de bebida puede ser, por ejemplo, un producto de bebida carbonatada o un producto de bebida no carbonatada. El producto de bebida también puede ser, por ejemplo, un refresco, una bebida de fuente, una bebida congelada, una bebida lista para beber, una bebida congelada y lista para beber, café, té, una bebida láctea, una bebida suave en polvo, un concentrado líquido, agua saborizada, agua mejorada, zumo de frutas, una bebida con sabor a zumo de frutas, una bebida deportiva o una bebida energética.
En algunas realizaciones, un producto de bebida de la presente divulgación puede incluir uno o más ingredientes de bebida tales como, por ejemplo, acidulantes, zumos de frutas y/o zumos de vegetales, pulpa, etc., saborizantes, colorantes, conservantes, vitaminas, minerales, electrolitos, eritritol, tagatosa, glicerina y dióxido de carbono. Dichos productos de bebidas se pueden proporcionar en cualquier forma adecuada, tal como un concentrado de bebida o una bebida carbonatada lista para beber.
En ciertas realizaciones, los productos de bebidas de la presente divulgación pueden tener cualquiera de numerosas formulaciones o constituciones específicas diferentes. La formulación de un producto de bebida de la presente divulgación puede variar hasta cierto punto, dependiendo de factores tales como el segmento de mercado al que se dirige el producto, sus características nutricionales deseadas, perfil de sabor y similares. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, generalmente puede ser una opción agregar ingredientes adicionales a la formulación de un producto de bebida particular. Por ejemplo, se pueden agregar edulcorantes adicionales, saborizantes, electrolitos, vitaminas, zumos de frutas u otros productos de frutas, saborizantes, agentes enmascarantes y similares, potenciadores del sabor y/o carbonatación típicamente se pueden agregar a cualquiera de dichas formulaciones para variar el sabor. sensación en boca, características nutricionales, etc. En realizaciones, el producto de bebida puede ser una bebida de cola que contiene agua, un rebaudiósido como se describe en el presente documento (por ejemplo, Reb W1, Reb W2, Reb D4, Reb M, o una combinación de los mismos tales como Reb D4 y Reb M), un acidulante y saborizante. Los sabores ejemplares pueden ser, por ejemplo, sabores de cola, sabores de cítricos y sabores de especias. En algunas realizaciones, se puede agregar carbonatación en forma de dióxido de carbono para lograr efervescencia. En otras realizaciones, se pueden agregar conservantes, dependiendo de los otros ingredientes, la técnica de producción, la vida útil deseada, etc. En ciertas realizaciones, se puede agregar cafeína. En algunas realizaciones, el producto de bebida puede ser una bebida carbonatada con sabor a cola, que contiene característicamente agua carbonatada, edulcorante, extracto de nuez de cola y/u otro saborizante, colorante de caramelo, uno o más ácidos y opcionalmente otros ingredientes.
En otro aspecto, la presente divulgación se dirige a un producto consumible que comprende un rebaudiósido como se describe en el presente documento (por ejemplo, Reb W1, Reb W2, Reb D4, Reb M, o una combinación de los mismos, tal como Reb D4 y Reb M), en donde el producto consumible es un producto alimenticio, un nutracéutico, un producto farmacéutico, un suplemento dietético, una composición de higiene dental, una composición de gel comestible, un producto cosmético o un saborizante de mesa. En algunas realizaciones, el rebaudiósido está presente en una cantidad edulcorante.
Como se usa en el presente documento, "suplementos dietéticos" se refiere a compuestos destinados a complementar la dieta y proporcionar nutrientes, tales como vitaminas, minerales, fibra, ácidos grasos, aminoácidos, etc., que pueden faltar o pueden no ser consumidos en cantidades suficientes en una dieta. Puede usarse cualquier suplemento dietético adecuado conocido en la técnica. Ejemplos de suplementos de dietas adecuadas pueden ser, por ejemplo, nutrientes, vitaminas, minerales, fibra, ácidos grasos, hierbas, productos botánicos, aminoácidos y metabolitos.
Como se usa en el presente documento, "nutracéuticos" se refiere a compuestos, que incluyen cualquier alimento o parte de un alimento que pueda proporcionar beneficios medicinales o para la salud, incluida la prevención y/o el tratamiento de enfermedades o trastornos (por ejemplo, fatiga, insomnio, efectos del envejecimiento, pérdida de memoria, trastornos del estado de ánimo, enfermedades cardiovasculares y niveles elevados de colesterol en sangre, diabetes, osteoporosis, inflamación, trastornos autoinmunes, etc.). Puede usarse cualquier nutracéutico adecuado conocido en la técnica. En algunas realizaciones, los nutracéuticos se pueden usar como suplementos de alimentos y bebidas y como formulaciones farmacéuticas para aplicaciones enterales o parenterales que pueden ser formulaciones sólidas, como cápsulas o tabletas, o formulaciones líquidas, como soluciones o suspensiones.
En algunas realizaciones, los suplementos dietéticos y nutracéuticos pueden contener además hidrocoloides protectores (tales como gomas, proteínas, almidones modificados), aglutinantes, agentes formadores de película, agentes/materiales encapsulantes, materiales de pared/cubierta, compuestos de matriz, recubrimientos, emulsionantes, agentes tensioactivos, agentes solubilizantes (aceites, grasas, ceras, lecitinas, etc.), adsorbentes, portadores, cargas, co-compuestos, agentes dispersantes, agentes humectantes, coadyuvantes de procesamiento (disolventes), agentes fluidos, agentes enmascaradores del sabor, agentes de ponderación, agentes gelificantes, agentes formadores de gel, antioxidantes y antimicrobianos.
Como se usa en el presente documento, un "gel" se refiere a un sistema coloidal en donde una red de partículas abarca el volumen de un medio líquido. Aunque los geles están compuestos principalmente de líquidos y, por lo tanto, exhiben densidades similares a las de los líquidos, los geles tienen la coherencia estructural de los sólidos debido a la red de partículas que se extiende por el medio líquido. Por esta razón, los geles generalmente parecen ser materiales sólidos similares a la gelatina. Los geles se pueden utilizar en un número de aplicaciones. Por ejemplo, los geles se pueden utilizar en alimentos, pinturas y adhesivos. Los geles que se pueden comer se denominan "composiciones de gel comestibles". Las composiciones de gel comestibles típicamente se consumen como tentempiés, como postres, como parte de alimentos básicos o junto con alimentos básicos. Ejemplos de composiciones de gel comestibles adecuadas pueden ser, por ejemplo, postres en gel, pudines, mermeladas, jaleas, pastas, bagatelas, gelatina de caldo, malvaviscos, caramelos de goma y similares. En algunas realizaciones, las mezclas de geles comestibles generalmente son sólidos en polvo o granulares a los que se les puede agregar un fluido para formar una composición de gel comestible. Ejemplos de fluidos adecuados pueden ser, por ejemplo, agua, fluidos lácteos, fluidos análogos de lácteos, zumos, alcohol, bebidas alcohólicas y combinaciones de los mismos. Ejemplos de fluidos lácteos adecuados pueden ser, por ejemplo, leche, leche cultivada, nata, suero fluido y mezclas de los mismos. Ejemplos de fluidos análogos lácteos adecuados pueden ser, por ejemplo, leche de soja y blanqueador de café no lácteo.
Como se usa en el presente documento, el término "ingrediente gelificante" se refiere a cualquier material que pueda formar un sistema coloidal dentro de un medio líquido. Ejemplos de ingredientes gelificantes adecuados pueden ser, por ejemplo, gelatina, alginato, carragenano, gelatinas de caldo, pectina, konjac, agar, ácido alimentario, cuajo, almidón, derivados de almidón y combinaciones de los mismos. Es bien conocido por los expertos en la técnica que la cantidad de ingrediente gelificante usado en una mezcla de gel comestible o una composición de gel comestible puede variar considerablemente dependiendo de una serie de factores tales como, por ejemplo, el ingrediente gelificante particular usado, el fluido particular base utilizado y las propiedades deseadas del gel.
Las mezclas de gel y las composiciones de gel de la presente divulgación se pueden preparar mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica. En algunas realizaciones, las mezclas de geles comestibles y las composiciones de geles comestibles de la presente divulgación se pueden preparar usando otros ingredientes además del agente gelificante. Ejemplos de otros ingredientes adecuados pueden ser, por ejemplo, un ácido alimentario, una sal de un ácido alimentario, un sistema tampón, un agente de carga, un secuestrante, un agente de reticulación, uno o más sabores, uno o más colores, y combinaciones de los mismos.
Se puede utilizar cualquier composición farmacéutica adecuada conocida en la técnica. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación se pueden usar para formular fármacos que contienen uno o más agentes activos que ejercen un efecto biológico. Por consiguiente, en algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación pueden contener uno o más agentes activos que ejercen un efecto biológico. Los agentes activos adecuados son bien conocidos en la técnica (por ejemplo, The Physician's Desk Reference). Tales composiciones se pueden preparar según procedimientos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, como se describe en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., EE.UU.
Un rebaudiósido como se describe en el presente documento (por ejemplo, Reb W1, Reb W2, Reb D4, Reb M, o una combinación de los mismos tales como Reb D4 y Reb M) se puede usar con cualquier composición de higiene dental y bucal adecuada conocida en la técnica. Ejemplos de composiciones adecuadas para la higiene dental y bucal pueden ser, por ejemplo, pastas dentales, esmaltes dentales, hilo dental, lavados bucales, enjuagues bucales, dentífricos, pulverizadores bucales, refrescantes bucales, enjuagues antiplaca, aliviadores del dolor dental y similares.
Como se usa en el presente documento, "producto alimenticio" se refiere a cualquier material ingerible sólido o líquido que puede, pero no necesariamente, tener un valor nutricional y estar destinado al consumo de humanos y animales.
Ejemplos de productos alimenticios adecuados pueden ser, por ejemplo, composiciones de confitería, tales como caramelos, mentas, gotas con sabor a frutas, productos de cacao, chocolates y similares; condimentos, tales como kétchup, mostaza, mayonesa y similares; gomas de mascar; composiciones de cereales; productos horneados, tales como panes, pasteles, tartas, galletas y similares; productos lácteos, tales como leche, queso, nata, helado, crema agria, yogur, sorbete y similares; composiciones edulcorantes de mesa; sopas; guisos; comida de conveniencia; carnes, tales como jamón, tocino, salchichas, cecina y similares; gelatinas y productos similares a gelatinas tales como mermeladas, jaleas, conservas y similares; frutas; verduras; productos de huevo; glaseados; jarabes, incluida la melaza; tentempiés; carnes de frutos secos y productos de frutos secos; y piensos para animales.
Los productos alimenticios también pueden ser hierbas, especias y condimentos, sabores naturales y sintéticos y potenciadores del sabor, tales como glutamato monosódico. En algunas realizaciones, los productos alimenticios pueden ser, por ejemplo, productos envasados preparados, tales como edulcorantes dietéticos, edulcorantes líquidos, mezclas de sabores granulados, alimentos para mascotas, alimento para ganado, tabaco y materiales para aplicaciones de horneado, tales como mezclas de horneado en polvo para la preparación. de panes, galletas, pasteles, panqueques, rosquillas y similares. En otras realizaciones, los productos alimenticios también pueden ser alimentos y bebidas dietéticos y bajos en calorías que contienen poca o ninguna sacarosa.
En ciertas realizaciones que se pueden combinar con cualquiera de las realizaciones anteriores, el rebaudiósido como se describe en el presente documento (por ejemplo, Reb W1, Reb W2, Reb D4, Reb M, o una combinación de los mismos tales como Reb D4 y Reb M) es el único edulcorante, opcionalmente en donde el producto tiene una intensidad de dulzor equivalente a aproximadamente un 1% a aproximadamente un 4% (p/v-%) de solución de sacarosa. En ciertas realizaciones que se pueden combinar con cualquiera de las realizaciones anteriores, los productos consumibles y bebidas pueden incluir además un edulcorante adicional, opcionalmente en donde el producto tiene una intensidad de dulzor equivalente a aproximadamente 1% a aproximadamente 10% (p/v-%) de solución de sacarosa. En ciertas realizaciones que se pueden combinar con cualquiera de las realizaciones anteriores, cada ingrediente edulcorante del producto es un edulcorante de alta intensidad. En ciertas realizaciones que se pueden combinar con cualquiera de las realizaciones anteriores, cada ingrediente edulcorante del producto puede ser un edulcorante natural de alta intensidad. En ciertas realizaciones que se pueden combinar con cualquiera de las realizaciones anteriores, el edulcorante adicional contiene uno o más edulcorantes seleccionados de un extracto de stevia, un glucósido de esteviol, esteviósido, rebaudiósido A, rebaudiósido B, rebaudiósido C, rebaudiósido D, rebaudiósido D2, rebaudiósido F, dulcósido A, rubusósido, esteviolbiósido, sacarosa, jarabe de maíz con alto contenido de fructosa, fructosa, glucosa, xilosa, arabinosa, ramnosa, eritritol, xilitol, manitol, sorbitol, inositol, AceK, aspartamo, neotamo, sucralosa, sacarina, naringina dihidrocalcona (NarDHC), neohesperidina dihidrocalcona (NDHC), rubusósido mogrósido IV, siamenósido I, mogrósido V, monatina, taumatina, monelina, brazzeína, L-alanina, glicina, Lo Han Guo, hernandulcina, filodulcina, trilobtaína y combinaciones de los mismos. En ciertas realizaciones que se pueden combinar con cualquiera de las realizaciones anteriores, los productos consumibles y productos de bebidas pueden incluir además uno o más aditivos seleccionados de un carbohidrato, un poliol, un aminoácido o una sal del mismo, un poliaminoácido o una sal del mismo, un ácido de azúcar o una sal del mismo, un nucleótido, un ácido orgánico, un ácido inorgánico, una sal orgánica, una sal de ácido orgánico, un sal de base orgánica, una sal inorgánica, un compuesto amargo, un saborizante, un ingrediente saborizante, un compuesto astringente, una proteína, un hidrolizado de proteína, un tensioactivo, un emulsionante, un flavonoide, un alcohol, un polímero y combinaciones de los mismos. En ciertas realizaciones que se pueden combinar con cualquiera de las realizaciones anteriores, el rebaudiósido como se describe en el presente documento (por ejemplo, Reb W1, Reb W2, Reb D4, Reb M, o una combinación de los mismos tales como Reb D4 y Reb M) tiene una pureza de aproximadamente del 50% a aproximadamente el 100% en peso antes de añadirlo al producto.
En algunas realizaciones, un rebaudiósido como se describe en el presente documento (por ejemplo, Reb W1, Reb W2, Reb D4, Reb M, o una combinación de los mismos tales como Reb D4 y Reb M) se proporciona en una composición que comprende además uno o más de un agente de relleno, un agente de carga y un agente antipelmazamiento. En la técnica se conocen agentes de relleno, agentes de carga y agentes antipelmazamiento adecuados.
En determinadas realizaciones, se puede incluir y/o añadir un rebaudiósido como se describe en el presente documento (por ejemplo, Reb W1, Reb W2, Reb D4, Reb M, o una combinación de los mismos, como Reb D4 y Reb M) en una concentración final que sea suficiente para endulzar y/o mejorar el dulzor de los productos consumibles y productos de bebidas. La "concentración final" del rebaudiósido como se describe en el presente documento (por ejemplo, Reb W1, Reb W2, Reb D4, Reb M, o una combinación de los mismos tales como Reb D4 y Reb M) presente en los productos consumibles y bebidas finales (es decir, después de que se hayan agregado todos los ingredientes y/o compuestos para producir los productos consumibles y productos de bebidas). Por consiguiente, en determinadas realizaciones, un rebaudiósido como se describe en el presente documento (por ejemplo, Reb W1, Reb W2, Reb D4, Reb M, o una combinación de los mismos tales como Reb D4 y Reb M) se incluye y/o se añade a un compuesto o ingrediente usado para preparar los productos consumibles y productos de bebidas. El rebaudiósido como se describe en el presente documento (por ejemplo, Reb W1, Reb W2, Reb D4, Reb M, o una combinación de los mismos tales como Reb D4 y Reb M) puede estar presente en un único compuesto o ingrediente, o en múltiples compuestos e ingredientes. En algunas realizaciones, un rebaudiósido como se describe en el presente documento (por ejemplo, Reb W1, Reb W2, Reb D4, Reb M, o una combinación de los mismos tales como Reb D4 y Reb M) se incluye y/o se agrega a los productos consumibles y productos de bebidas.
En ciertas realizaciones, un rebaudiósido como se describe en el presente documento (por ejemplo, Reb W1, Reb W2, Reb D4, Reb M, o una combinación de los mismos tales como Reb D4 y Reb M) es el único edulcorante incluido y/o añadido a los productos consumibles y productos de bebidas. En algunas realizaciones, los productos consumibles y productos de bebidas que comprenden los rebaudiósidos tienen una intensidad de dulzor equivalente a aproximadamente 1% a aproximadamente 4% (p/v-%) de solución de sacarosa, de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 3% (p/v-%) de solución de sacarosa, o de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 2% (p/v-%) de solución de sacarosa. Alternativamente, los productos consumibles y los productos de bebidas tienen una intensidad de dulzor equivalente a aproximadamente un 1% a aproximadamente un 4% (p/v-%) de solución de sacarosa, aproximadamente un 2% a aproximadamente un 4% (p/v-%) de solución de sacarosa, aproximadamente 3% a aproximadamente 4% (p/v-%) de solución de sacarosa, o aproximadamente 4%. Por ejemplo, los productos consumibles y productos de bebidas pueden tener una intensidad de dulzor equivalente a aproximadamente el 1%, aproximadamente el 2%, aproximadamente el 3% o aproximadamente el 4% (p/v-%) de solución de sacarosa, incluyendo cualquier rango entre estos valores.
Los productos consumibles y productos de bebidas de la presente divulgación pueden incluir una mezcla de un rebaudiósido como se describe en el presente documento (por ejemplo, Reb W1, Reb W2, Reb D4, Reb M, o una combinación de los mismos tales como Reb D4 y Reb M) y uno o más edulcorantes de la presente divulgación en una proporción suficiente para lograr una intensidad de dulzor, característica nutricional, perfil de sabor, sensación en boca u otro factor organoléptico deseable.
Debe entenderse que la descripción y los siguientes ejemplos no deben interpretarse como limitantes del alcance de la invención, que está delineada por las reivindicaciones adjuntas.
Ejemplo 1: Síntesis enzimática de Reb D4
Existen varios métodos enzimáticos para producir Reb D4. Aquí se presenta uno de los métodos a partir de Reb W.
Anteriormente, demostramos la producción de Reb W a partir de Reb V (WO2016054540). Aquí, encontramos que Reb W puede ser hidrolizado por la beta-glucosidasa (B-glu1, SEQ: 5) dePichia pastorispara producir un novedoso glucósido de esteviol lo llamamos "Rebaudiósido WB1". El Rebaudiósido WB1 producido puede ser hidrolizado a su vez por B-glu1 para producir Rebaudiósido WB2. (véase, Fig. 14).
Más específicamente, los fragmentos de ADN de longitud completa de B-glu1 (SEQ ID NO: 6) se sintetizó el gen. Específicamente, el ADNc se optimizó con codones para la expresión deE. coli(Genscript, Piscataway, NJ). El ADN sintetizado se clonó en un vector de expresión bacteriano pETite N-His SUMO Kan Vector (Lucigen). La secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 6) que codifica el B-glu1 (véase SEQ ID NO:5) se insertó en el marco.
El constructo de expresión se transformó enE. coliBL21 (DE3), que posteriormente se cultivó en medio LB que contenía 50 pg/ml de kanamicina a 37°C hasta alcanzar una OD600 de 0.8-1.0. La expresión de proteínas se indujo mediante la adición de isopropil p-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) 1 mM y el cultivo se cultivó adicionalmente a 16°C durante 22 horas. Las células se recogieron mediante centrifugación (3,000 x g; 10 min; 4°C). Las pellas celulares se recogieron y se utilizaron inmediatamente o se almacenaron a -80°C.
Las pellas celulares se resuspendieron en tampón de lisis (tampón fosfato de potasio 50 mM, pH 7.2, lisozima 25 pg/ml, DNasa I 5 pg/ml, imidazol 20 mM, NaCl 500 mM, glicerol al 10%, y TRlToN X-100 al 0.4%). Las células se rompieron mediante sonicación a 4°C y los restos celulares se clarificaron mediante centrifugación (18,000 x g; 30 min). El sobrenadante se cargó en una columna de afinidad equilibrada (tampón de equilibrio: Tampón fosfato de potasio 50 mM, pH 7.2, imidazol 20 mM, NaCl 500 mM, glicerol al 10%) Ni-NTA (Qiagen). Después de cargar la muestra de proteína, la columna se lavó con tampón de equilibrio para eliminar las proteínas contaminantes no unidas. El polipéptido recombinante B-glu1 marcado con His se eluyó mediante tampón de equilibrio que contenía imidazol 250 mM.
El B-glu1 recombinante (10 pg) se añadió en un sistema de reacciónin vitrode 200 pL. El sistema de reacción contenía tampón fosfato de potasio 50 mM, pH 7.2, y 1 mg/ml de Rebaudiósido W como el sustrato. La reacción se realizó a 37°C y se terminó añadiendo 200 pL de 1-butanol. Las muestras se extrajeron tres veces con 200 pL de 1-butanol. La fracción reunida se secó y se disolvió en 70 pL de metanol al 80% para análisis por cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC).
El análisis por HPLC se realizó utilizando un sistema Dionex UPLC ultímate 3000 (Sunnyvale, CA), que incluye una bomba cuaternaria, un compartimento de columna con temperatura controlada, un automuestreador y un detector de absorbancia UV. Se utilizó la columna Synergi Hydro-RP con columna protectora para la caracterización de glucósidos de esteviol. Se usó acetonitrilo en agua para la elución en el análisis de HPLC. La longitud de onda de detección fue de 210 nm.
Como se muestra en la FIG. 3, sustrato de rebaudiósido W hidrolizado con B-glu1 para producir rebaudiósido WB1 en 1 hora (Fig. 3B). El rebaudiósido WB1 producido se puede convertir aún más en rebaudiósido WB2 en puntos de tiempo de reacción posteriores (Fig. 3C y 3D).
En conclusión, el Rebaudiósido W fue hidrolizado por B-glu1 para producir WB1, el WB1 producido fue hidrolizado adicionalmente por B-glu1 para producir WB2.
El rebaudiósido WB2 intermedio anterior se puede convertir nuevamente en rebaudiósido WB1 incubando con la enzima UGT85C2 (FIG. 4). La enzima UGT85C2 recombinante (10 |jg) se probó en un sistema de reacciónin vitrode 200 jL . El sistema de reacción contenía tampón fosfato de potasio 50 mM, pH 7.2, MgCl2 3 mM, sustrato de rebaudiósido WB2 0.5 mg/ml y UDP-glucosa 3 mM. Como se muestra en la FIG. 3, el rebaudiósido WB2 se puede convertir en rebaudiósido WB1 mediante UGT85C2 (SEQ ID NO: 7, Fig. 4). La enzima UGT85C2 tiene actividad para formar esteviol-13-monósido a partir de esteviol agregando una glucosa al C-13 del carboxilo C4. Estos resultados indicaron que B-glu1 hidrolizó una glucosa de la posición C13 del rebaudiósido WB1 para producir rebaudiósido WB2. Las estructuras predichas del rebaudiósido WB1 y del rebaudiósido WB2 se muestran en la FIG. 2. Las estructuras se confirmaron mediante análisis LC-MS (FIG. 5).
El Reb WB1 intermedio anterior se puede convertir en Reb D4 incubando con la enzima HV1 UGT (WO/2015/065650). El HV1 recombinante (10 jg ) se probó en un sistema de reacciónin vitrode 200 jL . El sistema de reacción contenía tampón fosfato de potasio 50 mM, pH 7.2, MgCh 3 mM, sustrato de rebaudiósido WB1 0.5 mg/ml y UDP-glucosa 3 mM. Como se muestra en la FIG. 4, el rebaudiósido WB1 se puede convertir completamente en rebaudiósido D4 mediante HV1 en 6 horas (FIG. 6C).
De acuerdo con las reacciones enzimáticas anteriores, la estructura de D4 se predijo como -[(2-O-p-D-glucopiranosil-3-O-p-D-glucopiranosil-p-D-glucopiranosil] éster] de ácido (13-[(2-O-p-D-glucopiranosil-p-D-glucopiranosil)oxi]entkaur-16-en-19-oico (FIG. 7A). La estructura de Reb D4 se confirmó mediante LC-MS (FIG. 7B). El análisis espectral de masas mostró la misma masa [(M+Na) 1151.47 m/z] que la estructura predicha.
Ejemplo 2: Conversión de Reb D4 en Reb M mediante una enzima de tipo salvaje
Descubrimos que el Reb D4 se puede convertir además en Reb M mediante UGT76G1. Se sintetizaron los fragmentos de ADN de longitud completa de UGT76G1 (SEQ ID NO: 2). El ADNc fue optimizado con codones para expresión deE. coli(Genscript). El ADN sintetizado se clonó en un vector de expresión bacteriano pETite N-His SUMO Kan Vector (Lucigen). La secuencia de nucleótidos que codifica el 76G1 se insertó en marco.
El constructo de expresión se transformó enE. coliBL21 (DE3), que posteriormente se cultivó en medio LB que contenía 50 jg/m L de kanamicina a 37°C hasta alcanzar una OD600 de 0.8-1.0. La expresión de proteínas se indujo mediante la adición de IPTG 0.5 mM y el cultivo se cultivó adicionalmente a 16°C durante 22 h. Las células se recogieron mediante centrifugación (3,000 x g; 10 min; 4°C). Las pellas celulares se recogieron y se utilizaron inmediatamente o se almacenaron a -80°C.
Las pellas celulares se resuspendieron en tampón de lisis como se describe anteriormente. Las células se alteraron mediante sonicación a 4°C y los restos celulares se clarificaron mediante centrifugación (18,000 x g; 30 min). El sobrenadante se cargó en una columna de afinidad de Ni-NTA (Qiagen) equilibrada como se describe anteriormente. Después de cargar la muestra de proteína, la columna se lavó con tampón de equilibrio para eliminar las proteínas contaminantes no unidas. El polipéptido recombinante 76G1 marcado con His se eluyó mediante tampón de equilibrio que contenía imidazol 250 mM.
Se añadió el UGT76G1 recombinante (10 jg ) en un sistema de reacciónin vitrode 200 jL . El sistema de reacción contenía tampón fosfato de potasio 50 mM, pH 7.2, UDPG 1 mM como co-factor y Reb D41 mg/ml como sustrato. La reacción se realizó a 37°C y se terminó añadiendo 200 jL de 1-butanol. Las muestras se extrajeron tres veces con 200 jL de 1-butanol. La fracción reunida se secó y se disolvió en 70 jL de metanol al 80% para análisis por cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC).
El análisis por HPLC se realizó utilizando un sistema Dionex UPLC ultimate 3000, que incluye una bomba cuaternaria, un compartimento de columna con temperatura controlada, un automuestreador y un detector de absorbancia UV. Se utilizó la columna Synergi Hydro-RP con columna protectora para la caracterización de glucósidos de esteviol. Se usó acetonitrilo en agua para la elución en el análisis de HPLC. La longitud de onda de detección fue de 210 nm.
Como se muestra en la FIG. 13, UGT76G1 puede convertir Reb D4 en Reb M (FIG. 13C; y F).
Ejemplo 3: Resolución de los centros de reacción de las enzimas UGT que catalizan Reb D4 a Reb M
Para determinar más eficientemente los procesos químicos de la UDP-glucosil transferasa, obtuvimos la estructura cristalina de una esteviol UDP-glucosil transferasa UGT76G1 de tipo salvaje. Esta enzima es la primera enzima reportada que lleva a cabo bioconversiones de glucósidos de esteviol. Queremos adquirir la información estructural del centro de reacción y los sitios de unión del sustrato para diseñar enzimas para la conversión de Reb D4 a Reb M para comprenderlo más completamente y luego usar este conocimiento para encontrar o diseñar enzimas de manera más eficiente que puedan ser útiles en la bioconversión de Reb D4 a Reb M.
Para la producción de proteína sustituida con selenometionina (SeMet), las células BL21 deEscherichia coli(DE3) se transformaron con el vector pET-28a-UGT76G1 y se cultivaron en medio mínimo M9 suplementado con SeMet (Doublie, 2007) que contenía 50 ug mL-1 kanamicina a 37°C (250 rpm) hasta A600 nm~0.8. La adición de isopropil 1-tio-p-D galactopiranósido (0.8 mM final) indujo la expresión de proteínas con células cultivadas durante la noche (16°C). Las pellas celulares se recogieron mediante centrifugación (10,000 x g; 10 min) y se suspendieron en tampón de lisis (Tris 50 mM, pH 8.0, NaCl 500 mM, imidazol 20 mM, p-mercaptoetanol (p-ME) 1 mM, glicerol al 10% (v/v), y 1% (v/v) Tween-20). Después de la lisis por sonicación, los restos celulares se eliminaron mediante centrifugación (30,000 x g; 45 min) y el sobrenadante se pasó sobre una columna de ácido Ni2+-nitriloacético (NTA; Qiagen) equilibrada con tampón de lavado (tampón de lisis menos Tween-20). Después de la carga, la columna se lavó con 10 volúmenes de columna de tampón de lavado. La proteína de fusión unida se eluyó con tampón de elución (tampón de lavado con imidazol 250 mM) y se recogió. Para una purificación adicional, se realizó una cromatografía de exclusión por tamaño en una columna FPLC Superdex-20026/60 HiLoad equilibrada con Tris 50 mM, pH 8.0, NaCl 25 mM, tris(2-carboxietil) fosfina (TCEP) 1 mM. Las fracciones pico se recogieron y concentraron usando concentradores centrífugos (Amicon) con la concentración de proteína determinada usando el ensayo de Bradford con albúmina sérica bovina como estándar. La proteína purificada se congeló instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenó a -80°C.
Se concentró UGT761 purificado a 10 mg mL-1 y se cristalizó usando el método de difusión de vapor de gota colgante con una gota de 2 pl (proteína concentrada 1:1 y condición de cristalización). Se obtuvieron cristales de calidad de difracción a 4°C con PEG-4000 al 20% (p/v), 2-propanol al 20% (v/v) y tampón dihidrato tribásico de citrato de sodio 100 mM (pH 5.6). Los cristales individuales se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido y el licor madre contenían 25% de glicerol como crioprotector. Los datos de difracción (100 K) se recopilaron en la línea de luz 19-ID de la fuente avanzada de fotones del National Laboratory Argonne (X= 0.98 A). HKL3000 (Otwinowski & Minor, 1997) se utilizó para indexar, integrar y escalar datos de difracción. La estructura de UGT76G1 sustituido con SeMet se determinó mediante fase de difracción anómala de longitud de onda única (SAD). Se utilizó SHELX (Sheldrick, 2008) para determinar las posiciones de SeMet y estimar las fases iniciales a partir del conjunto de datos de longitud de onda pico. El refinamiento de las posiciones y parámetros de SeMet se realizó con MLPHARE (Terwilliger, 2000). Para construir un modelo inicial se empleó el aplanamiento con solvente mediante modificación de densidad implementada con ARP/wARP (Morris et al., 2003). Las rondas iterativas posteriores de construcción y refinamiento manual de modelos, que incluyeron el refinamiento de parámetros de pantalla de traducción-libración, utilizaron COOT (Emsley et al., 2010) y PHENIX (Adams et al., 2007), respectivamente. Los datos de recopilación y datos de refinamiento se resumen en la Tabla 1.
Tabla 1. Resumen de estadísticas cristalográficas
Recolección de datosAfiGM15*AMP*IAA
Grupo espacialF2i
Dimensiones celularesi? 91.61 Á,b1435 Á
1023 A ; j3 ~ 114,
<Longitud de onda ( Á )>0.979
Resolución (A.) (capa más alta) 42.2 - 25 0 (2.25 - 2.2
Reflecciones. (total/única) 254,788 / 108566
Completitud (capa más alta) 89 3 % ( / /5 % )
< 1 /fS>(capa más alta) 11.2(vZQ\
R ( c a p a más alta) 9.3%(515% )
Refinamiento
.5%
No. de waters 1,002
No. de átomos de ligando 154
R.m.s.d., longitudes de enlace 0.008
R.m.s.d., ángulos de enlace: 0 1,167
Factor B Prom. (Á A proteína, agua, 30.7, 28.3, 26.4
ligando
Estereoquímica: más favorecida, 97 .3 ,2.5 ,0.2 %
permitida, no permitida
La estructura de UGT71G1 consiste en un dominio N-terminal y un dominio C-terminal con pliegues de tipo Rossmann similares y, como se predijo, pertenece al pliegue GT-B (FIG. 8). La orientación estándar de la estructura cristalina UGT76G1 se muestra en la FlG. 8. El dominio N-terminal contiene una lámina p paralela central de siete hebras flanqueada por ocho hélices a. El dominio también contiene la histidina catalítica. El dominio C-terminal contiene una lámina p de seis hebras flanqueada por siete hélices a (FIG. 9). Los dos dominios se empaquetan muy estrechamente y forman una hendidura profunda a la que se une una molécula de UDP.
Ejemplo 4: Diseño racional de mutantes
Basándonos en la estructura UGT76G1, pudimos diseñar las permutaciones circulares (PLoS computational Biology, 2012, 8(3) e1002445; BIOINFORMATIc S, 2015, (3) y un conjunto de mutaciones. El análisis de permutación circular es una herramienta poderosa para desarrollar enzimas útiles o valiosas. Después de probar varias versiones de permutaciones circulares, encontramos que una versión de mutación circular con actividad muy alta, la "permutación circular 1" ("CP1") tiene la actividad más alta. De acuerdo con la divulgación actual, estudiamos la actividad de la enzima CP1 (SEQ ID NO: 3) y su capacidad para ayudar en las conversiones de Reb D4 en Reb M.
La estructura de UGT76G1 y CP1 se compara en la FIG. 10. Aunque la mayoría de las características estructurales de la estructura cristalina UGT76G1 son similares entre UGT y CP1, la CP1 tiene una secuencia y estructura significativamente diferentes en la porción de "láminas beta" de su estructura (FIG. 11).
Para predecir la actividad catalítica de nuestras enzimas, acoplamos el Reb D4 al centro de reacción de CP1.
Destacamos el centro de reacción centrándose en las interacciones de la enzima con Reb D4. El ligando de rebaudiósido D4 acoplado está en una posición favorable en relación con la histidina catalítica y el UDP unido (FIG.
12). Basándonos en este experimento de acoplamiento, pudimos encontrar residuos específicos que valían la pena probar en la actividad a través de estudios de mutagénesis.
Basado en el análisis de modelado de CP1, seleccionamos y probamos múltiples sitios de mutación de CP1 para aumentar la actividad enzimática. Finalmente, encontramos varios sitios de mutación (Tabla 2) relacionados con la bioconversión del rebaudiósido D4 a rebaudiósido M. CR1 es un tipo de CP1 mutante incluye al menos un sitio de mutación en la Tabla 2.
Tabla 2. Resumen de sitios de mutación de CP1.
Ejemplo 5: Conversión de Reb D4 en Reb M mediante el uso de UGTs mutantes.
En este ejemplo, para confirmar la conversión de Reb D4 en rebaudiósido Min vitro,los mutantes UGT76G1, CP1 y enzimas se analizaron utilizando Reb D4 como sustrato de glucósido de esteviol. El polipéptido recombinante (10 |jg) se probó en un sistema de reacciónin vitrode 200 jL . El sistema de reacción contenía tampón fosfato de potasio 50 mM, pH 7.2, MgCh 3 mM, 1 mg/ml de sustrato de glicósido de esteviol y UDP-glucosa 1 mM. La reacción se realizó a 30°C y se terminó añadiendo 200 jL de 1-butanol. Las muestras se extrajeron tres veces con 200 jL de 1-butanol. La fracción reunida se secó y se disolvió en 70 jL de metanol al 80% para análisis por cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). Se utilizó rebaudiósido D4 como sustrato. El análisis de HPLC se realizó utilizando un sistema Dionex UPLC ultimate 3000 (Sunnyvale, CA), que incluye una bomba cuaternaria, un compartimento de columna con temperatura controlada, un automuestreador y un detector de absorbancia UV. Se utilizó una columna Synergi HydroRP con columna protectora para la caracterización de glucósidos de esteviol. Se usó acetonitrilo en agua para la elución en el análisis de HPLC. La longitud de onda de detección fue de 210 nm.
Como se muestra en la FIG. 13, los mutantes UGT76G1, CP1 y CR1 pueden transferir una molécula de glucosa a Reb D4 para formar Reb M. Sin embargo, CP1 y CR1 tienen una actividad enzimática significativamente mayor que la enzima UGT76G1.
Ejemplo 6: La estructura de Reb WB2 analizada por RMN.
El material utilizado para la caracterización de Reb WB2 se produjo mediante el uso de conversión enzimática de Reb W y se purificó por HPLC. Los espectros de RMN se adquirieron en instrumentos Agilent VNMRS 500 MHz instrument utilizando secuencias de pulsos estándar. Los espectros de RMN 1D (1H y 13C) y 2D (TOCSY, ASAPHMQC, GCOSY y GHMBC) se realizaron en CD3OD.
La fórmula molecular de Reb WB2 se ha deducido como C<38>H<60>O<18>basándose en su espectro de masas de alta resolución positiva (HR) que mostró iones aductos correspondientes a [M+ Na]+ enm/z827.3671; esta composición fue respaldada por los datos espectrales de RMN.
Los datos espectrales de RMN de Reb WB2 revelaron el esqueleto básico de diterpenoidesent-kauranoy fue confirmado además por los experimentos GHMBC, COSY y TOCSY. Las multiplicidades de carbono se confirmaron usando la prueba APT. La 13C RMN mostró 3 carbonos anoméricos (8 102.8, 101.7 y 92.46), así como tres señales -CH2OH en 8 62.2, 61.14 y 60.88 que confirman las 3 unidades de azúcar. También estuvieron presentes una resonancia de carbonilo en 8177.1 y dos carbonos de alqueno en 8 152.2 y 104.4. Las correlaciones de GHMBC de H21 a Cl9 confirmaron los puntos de unión de los azúcares a la estructura núcleo del diterpenoide. El desplazamiento químico del C13 en 8 79.4 indica un oxígeno unido a este carbono. Los valores 1H y 13C RMN para Reb WB2 se asignaron sobre la base de los datos de TOCSY, HMQC y HMBC y se proporcionan en la Tabla 3.
Tabla 3. Datos espectrales de 1H y 13C RMN (desplazamientos químicos y constantes de acoplamiento) para asignaciones de Reb WB2a-c. a realizadas sobre la base de correlaciones TOCSY, ASAPHMQC y GHMBC; bLos valores de desplazamiento químico están en 8 (ppm); c Las constantes de acoplamiento están en Hz.
Las correlaciones clave de GHMBC entre H33 a C25, H27 a C24 confirmaron la conectividad de las 3 moléculas de azúcar. Con base en todas las correlaciones 2D observadas y las señales de desplazamiento químico la estructura de Reb WB2 es como se muestra en la FIG. 15. La estructura de Reb WB2 se dedujo como -[(2-O-p-D-glucopiranosil-3-O-p-D-glucopiranosil-p-D-glucopiranosil) éster de ácido 13-hidroxi-ent-kaur-16-en-19-oico.
Ejemplo 7: La estructura de Reb WB1 analizada por RMN.
El material usado para la caracterización de Reb WB1 se produjo usando conversión enzimática de Reb W y purificado por HPLC. Los espectros de RMN se adquirieron en instrumentos Agilent VNMRS 500 MHz instrument utilizando secuencias de pulsos estándar. Los espectros de RMN 1D (1H y 13C) y 2D (TOCSY, ASAPHMQC, GCOSY y GHMBC) se realizaron en 80% CD3OD - 20% D2O.
Se ha deducido que la fórmula molecular de Reb WB1 es C<44>H<70>O<23>basándose en su espectro de masas de alta resolución positiva (HR) que mostró iones aductos correspondientes a [M+ Na]+ enm/z989.4206; esta composición fue respaldada por los datos espectrales de RMN.
Los datos espectrales de RMN de Reb WB1 reveló el esqueleto básico de diterpenoidesent-kauranoy fue confirmado además por los experimentos de GHMBC, COSY y TOCSY. Las multiplicidades de carbono se confirmaron mediante la prueba APT. El 13C RMN mostró 4 carbonos anoméricos (8102.6, 101.697.6 y 92.61 así como señales de cuatro -CH2OH en 8 62.0, 61.1, 61.0 y 60.8 que confirman las 4 unidades de azúcar. También estuvieron presentes una resonancia de carbonilo en 8177.0 y dos carbonos de alqueno en 8152.5 y 104.4. Las correlaciones de GHMBC de H21 a Cl9 y de H39 a C13 confirmaron los puntos de unión de los azúcares a la estructura núcleo del diterpenoide. Los valores 1H y 13C RMN para Reb WB1 se asignaron sobre la base de los datos de TOCSY, HMQC y HMBC y se dan en la Tabla 4.
Tabla 4. Datos espectrales de 1H y 13C RMN (desplazamientos químicos y constantes de acoplamiento) para Reb WB1a_c. a asignaciones realizadas sobre la base de correlaciones TOCSY, ASAPHMQC, y GHMBC; bLos valores de desplazamiento químico están en 8 (ppm);c Las constantes de acoplamiento están en Hz.
Otras correlaciones clave de GHMBC entre H33 a C25, H27 a C24 (y viceversa) confirmaron los enlaces de 3 de las moléculas de azúcar. Con base en todas las correlaciones 2D observadas y las señales de desplazamiento químico la estructura de Reb WB1 es como se muestra en la FIG. 16. La estructura de Reb WB1 se dedujo como -[(2-O-p-D-glucopiranosil-3-O-p-D-glucopiranosil-p-D-glucopiranosil) éster de ácido 13-p-D-glucopiranosiloxi ent-kaur-16-en-19-oico.
Ejemplo 8: La estructura de Reb D4 analizada por RMN.
El material utilizado para la caracterización de Reb D4 se produjo mediante conversión enzimática de Reb WB1 y se purificó mediante HPLC. Los espectros de RMN se adquirieron en instrumentos Agilent VNMRS 500 MHz instrument utilizando secuencias de pulsos estándar. Los espectros de RMN 1D (1H y 13C) y 2D (TOCSY, ASAPHMQC, GCOSY y GHMBC) se realizaron en 80%CD3OD y 20% D2O.
La fórmula molecular de Reb D4 se ha deducido como C<50>H<80>O<28>sobre la base de su espectro de masas de alta resolución positiva (HR) que mostró iones aductos correspondientes a [M+ Na]+ enm/z1151.4728; esta composición fue respaldada por los datos espectrales de RMN.
Los datos espectrales de 1H RMN de Reb D4 mostraron la presencia de dos singletes de metilo en 81.24 y 0.92, dos protones olefínicos como singletes en 8 5.20 y 4.86 de un doble enlace exocíclico. El esqueleto básico de los diterpenoides ent-kaurano fue respaldado por los experimentos GHMBC, COSY y TOCSY. Las multiplicidades de carbono se confirmaron mediante la prueba APT. La 13C RMN mostró 5 carbonos anoméricos (8103.5, 102.5, 101.8, 95.6 y 92.8) confirmando las 5 unidades de azúcar, un carbonilo en 8177.1 y dos carbonos de alqueno en 8152.2 y 104.4. Las correlaciones de GHMBC de H40 a C12 y de H22 a C19 confirmaron los puntos de unión de los azúcares a la estructura núcleo del diterpenoide. 1Los valores de 1H y 13C RMN para Reb D4 se asignaron sobre la base de los datos de TOCSY, HMQC y HMBC y se proporcionan en la Tabla 5.
Tabla 5. Datos espectrales de 1H y 13C RMN (desplazamientos químicos y constantes de acoplamiento) para Reb D4 a-c. a asignaciones realizadas sobre la base de correlaciones TOCSY, ASAPHMQC, y GHMBC; b Los valores de desplazamiento químico están en 8 (ppm); c Las constantes de acoplamiento están en Hz.
Las correlaciones clave de GHMBC entre H45 a C46, H28 a C27 y H26 a C34 (y viceversa) confirmaron la conectividad de las 5 moléculas de azúcar. Con base en todas las correlaciones 2D observadas y las señales de desplazamiento químico la estructura de Reb D4 es como se muestra en la FIG. 17. La estructura de Reb D4 se dedujo como -[(2-O-p-D-glucopiranosil-3-O-p-D-glucopiranosil-p-D-glucopiranosil) éster de ácido 13-[(2-O-p-D-glucopiranosil-p-D-glucopiranosil)oxi] ent-kaur-16-en-19-oico.
Ejemplo 9: Prueba de sabor de rebaudiósidos.
Se realizó una evaluación sensorial de rebaudiósidos utilizando sacarosa como control. La muestra de sacarosa se adquirió de Sigma-Aldrich y se usó para preparar muestras de control en tres concentraciones diferentes de 1.0%, 3.0% y 6.0% de sacarosa en agua embotellada (p/v) a temperatura ambiente. El rebaudiósido se preparó a 300 ppm para evaluación sensorial agregando una masa correspondiente a 1000 mL de agua embotellada. La mezcla se agitó a temperatura ambiente y luego se evaluó la muestra de glicósido de esteviol frente a varias muestras de control de sacarosa al 1.0%, 3.0% y 6.0% por un panel de 13 sujetos humanos voluntarios. Los resultados de la evaluación sensorial se muestran en la Tabla 6.
Tabla 6. Evaluación sensorial de Reb W1, Reb W2 y Reb D4 en comparación con sacarosa
Declaración de aplicabilidad industrial/campo técnico
Esta divulgación tiene aplicabilidad en las industrias de alimentos, piensos, bebidas y farmacológicas. Esta divulgación se refiere en general a un método para la producción biosintética de glucósidos de esteviol a través de una cepa microbiana modificada.
Literatura citada:
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Secuencias de interés:
Secuencia UGT76G1:
Secuencia de aminoácidos: (SEQ ID NO: 1)
MENKTETT VRRRRRTTLFP VPF QGHINPILQL ANVL Y SKGFSITIFHTNFNKPKT SNYPHF TFRFILDNDPQDERISNLPTELGPLAGMRIPIINEHGADELRRELELLMLASEEDEEVSCLI TD ALW YF A Q S V AD SLNLRRL VLMT S SLFNFH AFTV SLPQFDELGYEDPDDK TRLEEQ A SGFPMLKVKDIKSAYSNWQILKErLGKMIKQTKASSGVIWNSFKELEESELETVIREIPA PSFLIPLPKHLTASSSSLLDHDRTVFQWLDQQPPSSVLYVSFGSTSEVDEKDFLE1ARGL VDSKQSFLWVVRPGFVKGSTWVEPLPDGFLGERGR1VKWVPQQEVLAHGAIGAFWT HSGWNSTLESVCEGVPMIFSDFGLDQPLNARYMSDVLKVGVYLENGWERGEIANAIRRVM VDEEGE YIRQN AR VLKQK AD VSLMKGGS S YESLE SLV S YI SSL
Secuencia de ADN: (SEQ ID NO: 2) ATGGAGAATAAGACAGAAACAACCGTAAGACGGAGGCGGAGGATTATCTTGTTCC CTGTACCATTTCAGGGCCATATTAATCCGATCCTCCAATTAGCAAACGTCCTCTAC TCCAAGGGATTTTCAATAACAATCTTCCATACTAACTTTAACAAGCCTAAAACGAG TAATTATCCTCACTTTACATTCAGGTTCATTCTAGACAACGACCCTCAGGATGAGC GTATCTCAAATTTACCTACGCATGGCCCCTTGGCAGGTATGCGAATACCAATAATC AATGAGCATGGAGCCGATGAACTCCGTCGCGAGTTAGAGCTTCTCATGCTCGCAA GTGAGGAAGACGAGGAAGTTTCGTGCCTAATAACTGATGCGCTTTGGTACTTCGCC CAATCAGTCGCAGACTCACTGAATCTACGCCGTTTGGTCCTTATGACAAGTTCATT ATTCAACTTTCACGCACATGTATCACTGCCGCAATTTGACGAGTTGGGTTACCTGG ACCCGGATGACAAAACGCGATTGGAGGAACAAGCGTCGGGCTTCCCCATGCTGAA AGTCAAAGATATTAAGAGCGCTTATAGTAATTGGCAAATTCTGAAAGAAATTCTC GGAAAAATGATAAAGCAAACCAAAGCGTCCTCTGGAGTAATCTGGAACTCCTTCA AGGAGTTAGAGGAATCTGAACTTGAAACGGTCATCAGAGAAATCCCCGCTCCCTC GTTCTTAATTCCACTACCCAAGCACCTTACTGCAAGTAGCAGTTCCCTCCTAGATC ATGACCGAACCGTGTTTCAGTGGCTGGATCAGCAACCCCCGTCGTCAGTTCTATAT GT AAGC TTT GGGAGT ACTTC GGAAGT GGAT GAA A AGGAC TTCTT AGAGATTGCGC GAGGGCTCGTGGATAGCAAACAGAGCTTCCTGTGGGTAGTGAGACCGGGATTCGT TAAGGGCTCGACGTGGGTCGAGCCGTTGCCAGATGGTTTTCTAGGGGAGAGAGGG AGAATCGTGAAATGGGTTCCACAGCAAGAGGTTTTGGCTCACGGAGCTATAGGGG CCTTTTGGACCCACTCTGGTTGGAATTCTACTCTTGAAAGTGTCTGTGAAGGCGTTC CAATGATATTTTCTGATTTTGGGCTTGACCAGCCTCTAAACGCTCGCTATATGTCTG ATGTGTTGAAGGTTGGCGTGTACCTGGAGAATGGTTGGGAAAGGGGGGAAATTGC CAACGCCATACGCCGGGTAATGGTGGACGAGGAAGGTGAGTACATACGTCAGAAC GCTCGGGTTTTAAAACAAAAAGCGGACGTCAGCCTTATGAAGGGAGGTAGCTCCT AT G AAT CCC T AG AAT CC TT GGT A AGC TAT AT ATC TTCGTT AT AA
Secuencia de CP1:
Aminoácidos: (SEQ ID NO:3) MNWQ1LKE1LGKMIKQTKASSGV1WNSFKELEESELETVIRE1PAPSFLIPLPKHLTASSS SLLDHDRTVFQWLDQQPPSSVLYVSFGSTSEVDEKDFLEIARGLVDSKQSFLWVVRPG FVKGSTWVEPLPDGFLGERGRIVKWVPQQEVLAHGAIGAFWTHSGWNSTLESVCEGV PMIFSDFGLDQPLNARYMSDVLKVGVYLENGWERGEIANAIRRVMVDEEGEYIRQNA RVLKQKADVSLMKGGSSYESLESLVSYISSLENKTETTVRRRRRIILFPVPFQGHINPIL QLANVLYSKGFSIT1FHTNFNKPKTSNYPE1FTFRF1LDNDPQDERISNLPTHGPLAGMRI PI1NEHGADELRRELELLMLASEEDEEVSCLITDALWYFAQSVADSLNLRRLVLMTSSL FNFELAHVSLPQFDELGYLDPDDKTRLEEQASGFPMLKVKDIKSAYS
Secuencia de ADN: (SEQ ID NO:4) ATGAACTGGCAAATCCTGAAAGAAATCCTGGGTAAAATGATCAAACAAACCAAAG CGTCGTCGGGCGTTATCTGGAACTCCTTCAAAGAACTGGAAGAATCAGAACTGGA AACCGTTATTCGCGAAATCCCGGCTCCGTCGTTCCTGATTCCGCTGCCGAAACATC TGACCGCGAGCAGCAGCAGCCTGCTGGATCACGACCGTACGGTCTTTCAGTGGCT GGATCAGCAACCGCCGTCATCGGTGCTGTATGTTTCATTCGGTAGCACCTCTGAAG TCGATGAAAAAGACTTTCTGGAAATCGCTCGCGGCCTGGTGGATAGTAAACAGTC CTTCCTGTGGGTGGTTCGTCCGGGTTTTGTGAAAGGCAGCACGTGGGTTGAACCGC TGCCGGATGGCTTCCTGGGTGAACGCGGCCGTATTGTCAAATGGGTGCCGCAGCA AGAAGTGCTGGCACATGGTGCTATCGGCGCGTTTTGGACCCACTCTGGTTGGAACA GTACGCTGGAATCCGTTTGCGAAGGTGTCCCGATGATTTTCAGCGATTTTGGCCTG GACCAGCCGCTGAATGCCCGCTATATGTCTGATGTTCTGAAAGTCGGTGTGTACCT GGAAAACGGTTGGGAACGTGGCGAAATTGCGAATGCCATCCGTCGCGTTATGGTC GATGAAGAAGGCGAATACATTCGCCAGAACGCTCGTGTCCTGAAACAAAAAGCGG ACGTGAGCCTGATGAAAGGCGGTAGCTCTTATGAATCACTGGAATCGCTGGTTAG CTACATCAGTTCCCTGGAAAATAAAACCGAAACCACGGTGCGTCGCCGTCGCCGT ATTATCCTGTTCCCGGTTCCGTTTCAGGGTCATATTAACCCGATCCTGCAACTGGC GAATGTTCTGTATTCAAAAGGCTTTTCGATCACCATCTTCCATACGAACTTCAACA AACCGAAAACC AGT AACT ACCCGC ACTTT ACGTTCCGCTTTATTCTGGAT AACGAC CCGCAGGATGAACGTATCTCCAATCTGCCGACCCACGGCCCGCTGGCCGGTATGC GCATTCCGATTATCAATGAACACGGTGCAGATGAACTGCGCCGTGAACTGGAACT GCTGATGCTGGCCAGTGAAGAAGATGAAGAAGTGTCCTGTCTGATCACCGACGCA CTGTGGTATTTCGCCCAGAGCGTTGCAGATTCTCTGAACCTGCGCCGTCTGGTCCT GATGACGTCATCGCTGTTCAATTTTCATGCGCACGTTTCTCTGCCGCAATTTGATGA ACTGGGCTACCTGGACCCGGATGACAAAACCCGTCTGGAAGAACAAGCCAGTGGT TTTCCGATGCTGAAAGTCAAAGACATTAAATCCGCCTATTCGTAA
Secuencia B-glu1:
Aminoácidos: (SEQ ID NO:5) MTQLDVESLIQELTLNEKVQLLSGSDFWHTTPVRRLG1PKMRLSDGPNGVRGTKFFNG VPTACFPCGTGLGATFDKELLKEAGSLMADEAKAKAASVVLGPTANIARGPNGGRGF ESFGEDPVVNGLSSAAMINGLQGKYIAATMKFÍYVCNDLEMDRNCTDAQVSHRALRE VYLLPFQIAVRDANPRATMTAYNKANGEHVSQSKFLLDEVLRKEWGWDGLLMSDWF GVYDAKSSITNGLDLEMPGPPQCRVHSATDHAINSGEIHINDVDERVRSLLSLINYCHQ SGVTEEDPETSDNNTPETTEKLRKISRESIVLLKDDDRNRSILPLKKSDKIAVIGNNAKQ AAYCGGGSASVLSYHTTTPFDS1KSRLEDSNTPAYTIGADAYKNLPPLGPQMTDSDGK PGFDAKFFVGSPTSKDRKL1DHFQLTNSQVFLVDYYNEQ1PENKEFYVDVEGQF1PEED GTYNFGLTVFGTGRLFVDDKLVSDSSQNQTPGDSFFGLAAQEVIGSIHLVKGKAYK1K VLYGSSVTRTYEIAASVAFEGGAFTFGAAKQRNEDEEIARAVEIAKANDKVVLCIGLN QDFE SEGFDRPDIKIPGATNKM VS A VLK ANPNTVIVNQTGTP VE VÍP W A SD AP VILQ A WF GGSE AGT AIAD VLF GD YNP SGKLT VTFPLRFEDNP A YLNFQSNKQ AC W Y GED VYV GYRYYETTDRPVLFPFGHGLSFTEFDFTDMFVRLEEENLEVEVVVRNTGKYDGAEVVQ LYVAPVSPSLKRP1KELKEYAK1FLASGEAKTVHLSVP1KYATSFFDEYQKKWCSEKGE YT1LLGS S S ADIK VSQ SITLEKTTF WKGL
ADN: (SEQ ID NO:6)
ATGACCCAACTGGATGTGGAGAGCCTGATTCAAGAGCTGACCCTGAACGAAAAGG TGCAACTGCTGAGCGGTAGCGACTTCTGGCATACCACCCCGGTTCGTCGTCTGGGC ATCCCGAAGATGCGTCTGAGCGACGGTCCGAACGGCGTTCGTGGTACCAAATTCTT TAACGGTGTTCCGACCGCGTGCTTCCCGTGCGGTACCGGTCTGGGCGCGACCTTTG AC AAGG A AC T GC T G A AAG AGGC GGGT AGCC TG AT GGCGG AT G A AGC G A AAGC G A AAGCGGCGAGCGTGGTTCTGGGTCCGACCGCGAACATTGCGCGTGGTCCGAACGG TGGCCGTGGCTTCGAGAGCTTCGGCGAGGACCCGGTGGTTAACGGTCTGAGCAGC GCGGCGATGATCAACGGCCTGCAGGGCAAGTACATTGCGGCGACCATGAAACACT ATGTTTGCAACGATCTGGAAATGGACCGTAACTGCATTGACGCGCAAGTTAGCCA CCGTGCGCTGCGTGAGGTGTACCTGCTGCCGTTCCAAATCGCGGTGCGTGATGCGA ACCCGCGTGCGATTATGACCGCGTATAACAAGGCGAACGGCGAACACGTTAGCCA GAGCAAATTCCTGCTGGACGAAGTGCTGCGTAAGGAGTGGGGCTGGGATGGTCTG CTGATGAGCGACTGGTTTGGTGTTTACGATGCGAAAAGCAGCATCACCAACGGCC TGGACCTGGAGATGCCGGGTCCGCCGCAGTGCCGTGTGCACAGCGCGACCGATCA C GC GAT C A AC AGC GGC GA A ATCC AC ATT A ACGAT GTT GACG AGC GT GT GCGT AGC CTGCTGAGCCTGATTAACTACTGCCACCAAAGCGGTGTTACCGAGGAAGATCCGG AAACCAGCGACAACAACACCCCGGAAACCATCGAGAAGCTGCGTAAAATCAGCC GTGAGAGCATTGTGCTGCTGAAGGACGATGACCGTAACCGTAGCATTCTGCCGCT GAAGAAAAGCGACAAAATCGCGGTTATTGGTAACAACGCGAAACAAGCGGCGTA TTGCGGTGGCGGTAGCGCGAGCGTGCTGAGCTATCACACCACCACCCCGTTCGAC AGCATCAAGAGCCGTCTGGAAGATAGCAACACCCCGGCGTACACCATTGGTGCGG ACGCGTATAAAAACCTGCCGCCGCTGGGTCCGCAAATGACCGATAGCGACGGCAA GCCGGGTTTTGATGCGAAATTCTTTGTTGGCAGCCCGACCAGCAAGGATCGTAAAC TGATCGACCACTTCCAGCTGACCAACAGCCAAGTTTTTCTGGTGGACTACTATAAC GAACAGATCCCGGAAAACAAGGAGTTCTACGTTGACGTGGAGGGTCAATTTATTC CGGAGGAAGATGGCACCTATAACTTCGGTCTGACCGTGTTTGGTACCGGCCGTCTG TTCGTTGATGACAAACTGGTTAGCGACAGCAGCCAGAACCAAACCCCGGGCGATA GCTTCTTTGGTCTGGCGGCGCAGGAAGTGATCGGCAGCATTCACCTGGTGAAGGGT AAAGCGTACAAGATCAAAGTTCTGTATGGCAGCAGCGTGACCCGTACCTACGAAA TTGCGGCGAGCGTTGCGTTTGAGGGCGGTGCGTTCACCTTTGGTGCGGCGAAACAG CGTAACGAAGACGAGGAAATCGCGCGTGCGGTGGAGATTGCGAAGGCGAACGAC AAAGTGGTTCTGTGCATCGGCCTGAACCAAGATTTCGAAAGCGAGGGTTTTGATCG TCCGGACATCAAGATTCCGGGCGCGACCAACAAAATGGTTAGCGCGGTGCTGAAG GCGAACCCGAACACCGTTATTGTGAACCAGACCGGTACCCCGGTTGAGATGCCGT GGGCGAGC GATGCGC CGGT G ATC CTGC A AGC GT GGTTT GGC GGT AGC GAGGC GGG TACCGCGATTGCGGATGTTCTGTTTGGCGACTACAACCCGAGCGGCAAGCTGACC GTGACCTTCCCGCTGCGTTTTGAGGATAACCCGGCGTACCTGAACTTCCAGAGCAA CAAACAAGCGTGCTGGTATGGCGAAGACGTTTACGTGGGTTATCGTTACTATGAG ACCATCGATCGTCCGGTGCTGTTCCCGTTTGGTCACGGCCTGAGCTTCACCGAGTT C GATTTT ACCGAC AT GTTTGTTC GT CTGGAGGA AGAGA AC CTGGAAGTT GAGGTGG TTGTGCGTAACACCGGCAAGTACGACGGTGCGGAAGTGGTGCAGCTGTATGTTGC GCCGGTTAGCCCGAGCCTGAAACGTCCGATCAAGGAACTGAAAGAGTACGCGAAA ATTTTC CT GGCGAGCGGT GA AGCGAAGAC C GTT C AC CT GAGCGT GCCGAT C AAAT ACGCGACCAGCTTCTTTGATGAGTATCAAAAGAAATGGTGCAGCGAAAAGGGCGA GTATACCATTCTGCTGGGTAGCAGCAGCGCGGACATCAAAGTTAGCCAAAGCATC ACCCTGGAAAAAACCACCTTCTGGAAAGGTCTGTAA
Secuencia UGT85C2:
Aminoácidos: (SEQ ID NO:7)MDAMATTEKKPHVIFIPFPAQSHIKAMLKLAQLLHHKGLQITFVNTDFIHNQFLESSGP HCLDGAPGFRFETIPDGVSHSPEASIPIRESLLRSIETNFLDRFTDLVTKLPDPPTCIISDGF LSVFTTDAAKKLGIPVMMYWTLAACGFMGFYHIHSLTEKGFAPLKDASYLTNGYLDTV IDWVPGMEGTRLKDFPLDWSTDLNDKVEMFTTEAPQRSHKVSfíHTFHTFDELEPSTIKT LSLRYNHIYTIGPLQLLLDQ1PEEKKQTGITSLHGYSLVKEEPECFQWLQSKEPNSVVYV NFGSTTVMSLEDMTEFGWGLANSNHYFLWIIRSNLVIGENAVLPPELEEHIKKRGFIAS WCSQEKVLKFIPSVGGFLTHCGWGST1ESLSAGVPMICWPYSWDQLTNCRYICKEWEV GLEMGTKVKRDEVKRLVQELMGEGGHKMRNKAKDWKEKARIAIAPNGSSSLNIDKM VKEITVLARN
ADN (SEQ ID NO: 8) ATGGACGCTATGGCCACGACCGAAAAGAAACCGCACGTTATCTTTATTCCGTTCCC GGCACAGAGTCACATCAAGGCTATGCTGAAGCTGGCCCAACTGCTGCATCACAAA GGCCTGCAAATTACCTTTGTGAACACGGATTTCATCCATAATCAGTTTCTGGAAAG CTCTGGCCCGCACTGCCTGGATGGTGCGCCGGGTTTTCGCTTCGAAACCATCCCGG ATGGTGTCTCGCATAGCCCGGAAGCCTCTATTCCGATCCGTGAATCGCTGCTGCGC AGCATTGAAACCAACTTTCTGGATCGTTTCATCGACCTGGTGACGAAACTGCCGGA CCCGCCGACGTGCATTATCTCCGACGGCTTTCTGTCAGTTTTCACCATTGATGCGG CCAAAAAGCTGGGTATCCCGGTCATGATGTATTGGACGCTGGCAGCTTGTGGCTTT ATGGGTTTCTACCATATTCACTCACTGATCGAAAAAGGCTTTGCACCGCTGAAGGA TGCTAGTTATCTGACCAACGGCTATCTGGATACGGTCATTGACTGGGTGCCGGGCA TGGAAGGTATCCGTCTGAAAGATTTCCCGCTGGACTGGAGCACCGATCTGAATGA CAAAGTGCTGATGTTTACCACGGAAGCGCCGCAGCGCTCTCATAAAGTTAGTCATC ACATTTTTCACACCTTCGATGAACTGGAACCGTCGATTATCAAAACCCTGAGCCTG CGTTATAATCATATTTACACCATTGGCCCGCTGCAACTGCTGCTGGACCAAATCCC GG AAGAAAAG A AAC AAACCGGC ATC ACGTCGCT GC ACGGTT AT AGCCTGGT GAAA GAAGAACCGGAATGCTTCCAGTGGCTGCAATCTAAGGAACCGAACAGTGTGGTTT ACGTGAATTTTGGTTCCACCACGGTTATGTCACTGGAAGATATGACCGAATTTGGC TGGGGTCTGGCAAACTCTAACCATTATTTTCTGTGGATCATCCGTAGTAACCTGGT CATTGGCGAAAATGCAGTGCTGCCGCCGGAACTGGAAGAACACATTAAAAAGCGC GGTTTCATCGCTTCCTGGTGTTCACAGGAAAAAGTTCTGAAGCATCCGTCCGTCGG CGGTTTTCTGACCCACTGCGGCTGGGGTAGCACGATTGAATCTCTGAGTGCTGGTG TTCCGATGATTTGCTGGCCGTATAGCTGGGATCAACTGACCAACTGCCGCTACATC TGTAAAGAATGGGAAGTCGGCCTGGAAATGGGTACGAAAGTGAAGCGTGACGAA GTTAAACGCCTGGTCCAAGAACTGATGGGCGAAGGCGGTCATAAAATGCGTAACA AAGCGAAGGATTGGAAAGAAAAGGCCCGCATTGCGATTGCGCCGAACGGCAGCA GCAGCCTGAACATTGACAAAATGGTGAAGGAAATCACCGTTCTGGCGCGTAATTA A
Secuencia HV1:
Secuencia de aminoácidos: (SEQ ID NO:9)
MDGN S S S SPLH W IC P WL ALGHLLPCLDT AERL A SRGHR V SF VSTPRNT ARLPPLRP A V APLVDFVALPLPHVDGLPEGAESTNDVPYDKFELFTRKAFDGLAAPFSEFLRAACAEGA GSRPDWLIVDTFHHWAAAAAVENKVPCVMLLLGAATV1AGFARGVSEHAAAAVGKE RPAAEAPSFETERRKLMTTQNASGMTVAERYFLTLMRSDLVAIRSCAEWEPESVAALT TLAGKPWPLGLLPPSPEGGRGVSKEDAAVRWLDAQPAKSWYVALGSEYPLRAEQV HELALGLELSGARFLWALRKPTDAPDAAVLPPGFEERTRGRGLVVTGWVPQIGVLAH GAVAAFLTHCGWNST1EGLLFGHPL1MLPISSDQGPNARLMEGRKVGMQVPRDESDGS FRREDVAATVRAVAVEEDGRRVFTANAKKMQEIVADGACHERCIDGFIQQLRSYKA
Secuencia de ADN:(SEQ ID NO: 10) ATGGATGGTAACTCCTCCTCCTCGCCGCTGCATGTGGTCATTTGTCCGTGGCTGGC TCTGGGTCACCTGCTGCCGTGTCTGGATATTGCTGAACGTCTGGCGTCACGCGGCC ATCGTGTCAGTTTTGTGTCCACCCCGCGCAACATTGCCCGTCTGCCGCCGCTGCGT CCGGCTGTTGCACCGCTGGTTGATTTCGTCGCACTGCCGCTGCCGCATGTTGACGG TCT GC C GGAGGGT GC GG A AT CG ACC AAT G AT GT GCC GT AT G AC AA ATTT G AACT G CACCGTAAGGCGTTCGATGGTCTGGCGGCCCCGTTTAGCGAATTTCTGCGTGCAGC TTGCGCAGAAGGTGCAGGTTCTCGCCCGGATTGGCTGATTGTGGACACCTTTCATC ACTGGGCGGCGGCGGCGGCGGTGGAAAACAAAGTGCCGTGTGTTATGCTGCTGCT GGGTGCAGCAACGGTGATCGCTGGTTTCGCGCGTGGTGTTAGCGAACATGCGGCG GCGGCGGTGGGTAAAGAACGTCCGGCTGCGGAAGCCCCGAGTTTTGAAACCGAAC GTCGCAAGCTGATGACCACGCAGAATGCCTCCGGCATGACCGTGGCAGAACGCTA TTTCCTGACGCTGATGCGTAGCGATCTGGTTGCCATCCGCTCTTGCGCAGAATGGG AACC GG AAAGC GT GGC AGC AC T G AC C AC GCT GGC AGGT AAAC CGGT GGTT C CGCT GGGTCTGCTGCCGCCGAGTCCGGAAGGCGGTCGTGGCGTTTCCAAAGAAGATGCT GCGGTCCGTTGGCTGGACGCACAGCCGGCAAAGTCAGTCGTGTACGTCGCACTGG GTTCGGAAGTGCCGCTGCGTGCGGAACAAGTTCACGAACTGGCACTGGGCCTGGA ACTGAGCGGTGCTCGCTTTCTGTGGGCGCTGCGTAAACCGACCGATGCACCGGAC GCCGCAGTGCTGCCGCCGGGTTTCGAAGAACGTACCCGCGGCCGTGGTCTGGTTGT CACGGGTTGGGTGCCGCAGATTGGCGTTCTGGCTCATGGTGCGGTGGCTGCGTTTC TGACCCACTGTGGCTGGAACTCTACGATCGAAGGCCTGCTGTTCGGTCATCCGCTG ATTATGCTGCCGATCAGCTCTGATCAGGGTCCGAATGCGCGCCTGATGGAAGGCC GTAAAGTCGGTATGCAAGTGCCGCGTGATGAATCAGACGGCTCGTTTCGTCGCGA AGATGTTGCCGCAACCGTCCGCGCCGTGGCAGTTGAAGAAGACGGTCGTCGCGTC TTCACGGCTAACGCGAAAAAGATGCAAGAAATTGTGGCCGATGGCGCATGCCACG AACGTTGTATTGACGGTTTTATCCAGCAACTGCGCAGTTACAAGGCGTGA

Claims (13)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un método para preparar una composición de glicósido de esteviol, comprendiendo el método: preparar una mezcla de reacción que comprende: (a) rebaudiósido W que tiene la estructura:
    y (b) una beta-glucosidasa; e incubar la mezcla de reacción durante un tiempo suficiente para producir una composición de glucósido de esteviol que comprende rebaudiósido WB1, rebaudiósido WB2 o una combinación de los mismos, en donde el rebaudiósido WB1 tiene la estructura:
    el rebaudiósido WB2 tiene la estructura:
  2. 2. El método de la reivindicación 1, en donde la beta-glucosidasa es una beta-glucosidasa dePichia pastorisque tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.
  3. 3. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que comprende además obtener un producto crudo que comprende rebaudiósido WB1.
  4. 4. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que comprende además incubar rebaudiósido WB1 con una UDP-glicosiltransferasa durante un tiempo suficiente para producir rebaudiósido D4, en donde la UDP-glicosiltransferasa es una enzima HVI UGT y el rebaudiósido D4 tiene la estructura:
  5. 5. El método de la reivindicación 4, en donde dicha UDP-glicosiltransferasa se incuba con una sacarosa sintasa en presencia de sacarosa, uridina difosfato (UDP) y uridina difosfato-glucosa (UDP-glucosa).
  6. 6. El método de la reivindicación 4, que comprende además incubar rebaudiósido D4 con una UDP-glicosiltransferasa durante un tiempo suficiente para producir rebaudiósido M, en donde la UDP-glicosiltransferasa es UGT76G1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o un homólogo funcional de la misma.
  7. 7. El método de la reivindicación 4, que comprende además incubar rebaudiósido D4 con una UDP-glicosiltransferasa durante un tiempo suficiente para producir rebaudiósido M, en donde la UDP-glicosiltransferasa comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.
  8. 8. El método de la reivindicación 4, que comprende además incubar rebaudiósido D4 con una UDP-glicosiltransferasa durante un tiempo suficiente para producir rebaudiósido M, en donde la UDP-glicosiltransferasa es un mutante de una enzima que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, en donde el mutante comprende al menos una mutación en una posición de residuo de aminoácido correspondiente a una posición seleccionada de 3, 6, 90, 91, 93, 181, 183, 184, 185, 350, 389, 410, 418, 450, 451, 452 y 454 de SEQ ID NO: 3.
  9. 9. Un método como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 que comprende además obtener rebaudiósido M así producido a partir de la mezcla de reacción en una forma adecuada para uso como edulcorante.
  10. 10. Un método como se reivindica en la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que comprende además obtener rebaudiósido WB1 que tiene la estructura:
    de la mezcla de reacción en una forma adecuada para uso como edulcorante.
  11. 11. Un método como se reivindica en la reivindicación 1 o la reivindicación 2 que comprende además obtener rebaudiósido WB2 que tiene la estructura
    de la mezcla de reacción en una forma adecuada para uso como edulcorante.
  12. 12. Un método como se reivindica en la reivindicación 4 o la reivindicación 5 que comprende además obtener rebaudiósido D4 que tiene la estructura
    del medio de reacción en una forma adecuada para uso como edulcorante.
  13. 13. Un método como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12 que comprende además incorporar una cantidad edulcorante de dicho rebaudiósido en un producto consumible por vía oral seleccionado de un producto de bebida u otro producto consumible.
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