BR112021011419A2 - Método de produção de rebaudiosídeo r6-2a e/ou r6-2b, r7-2, r6-1 e r6-4a e/ou r6-4b, rebaudiosídeo sintético e produto de consumo oral - Google Patents

Método de produção de rebaudiosídeo r6-2a e/ou r6-2b, r7-2, r6-1 e r6-4a e/ou r6-4b, rebaudiosídeo sintético e produto de consumo oral Download PDF

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Yang Luo
Oliver Yu
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Abstract

método de produção de rebaudiosídeo r6-2a e/ou r6-2b, r7- 2, r6-1 e r6-4a e/ou r6-4b, rebaudiosídeo sintético eproduto de consumo oral. a presente invenção diz respeito a novos glicosídeos de esteviol r6-1, r6-2a, r6-2b, r6-4a, r6-4b e r7-2 e à produção desses novos glicosídeos de esteviol, como por meio de bioconversão enzimática. também é fornecido uso desses novos glicosídeos de esteviol como adoçantes e em produtos de consumo oral.

Description

MÉTODO DE PRODUÇÃO DE REBAUDIOSÍDEO R6-2A E/OU R6-2B, R7- 2, R6-1 E R6-4A E/OU R6-4B, REBAUDIOSÍDEO SINTÉTICO E
PRODUTO DE CONSUMO ORAL PEDIDO DE RELACIONADO
[0001] Este pedido reivindica o benefício sob 35 U.S.C. parágrafo 119(e) do Pedido Provisório dos EUA nº 62/778.422, depositado em 12 de dezembro de 2018 e intitulado "PRODUÇÃO BIOSSINTÉTICA DE VARIANTE ESTEVIOL GLICOSIDEOS", cujo conteúdo é totalmente incorporado neste documento por referência.
CAMPO DA INVENÇÃO
[0002] O campo da invenção se refere a métodos e processos úteis na produção de vários glicosídeos de esteviol específicos por meio de conversão enzimática, bem como composições relacionadas.
FUNDAMENTOS
[0003] Vários glicosídeos de esteviol são constatados como sendo compostos nas folhas de Stevia rebaudiana, e vários deles têm sido amplamente usados como adoçantes de baixa caloria e alta intensidade em alimentos, rações e bebidas. Esses glicosídeos de esteviol natural têm a mesma estrutura de diterpeno básico (infraestrutura do esteviol), mas diferem no número e na estrutura de suas modificações de resíduos de carboidratos (por exemplo, resíduos de glicose, ramnose e xilose) nas posições C13 e C19 da infraestrutura do esteviol. Significativamente, essas alterações na 'ornamentação' do açúcar da estrutura do esteviol de base podem afetar as propriedades dos próprios glicosídeos de esteviol individuais. Essas propriedades podem incluir, sem limitação: o perfil de gosto, ponto de cristalização, solubilidade, sensação na boca e doçura percebida entre outras diferenças. Os glicosídeos de esteviol com estruturas conhecidas incluem esteviosídeo, rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo B, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo E,
rebaudiosídeo I, rebaudiosídeo M, rebaudiosídeo D3, rebaudiosídeo N e rebaudiosídeo O. Em termos de uso comercial, os rebaudiosídeos D e M se tornaram geralmente considerados seguros (ou seja, tem o status 'GRAS') e estão sendo estudados para uma ampla variedade de usos nos mercados de alimentos e bebidas.
[0004] Em uma base de peso seco, esteviosídeo, rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo C e dulcosídeo A, contam com 9,1, 3,8, 0,6 e 0,30 por cento do peso total dos glicosídeos de esteviol constatados nas folhas de Stevia de tipo selvagem, respectivamente, enquanto os outros glicosídeos de esteviol, tais como Reb D e Reb M estão presentes em quantidades significativamente menores. Extratos a partir da planta Stevia rebaudiana estão disponíveis comercialmente e, em tais extratos, o esteviosídeo e o rebaudiosídeo A são mais frequentemente os componentes primários e podem ser usados como componentes ou substratos de partida para atividade enzimática adicional. Comparativamente, os outros glicosídeos de esteviol conhecidos estão tipicamente presentes no extrato de estévia como componentes menores ou vestigiais. Por exemplo, a quantidade de rebaudiosídeo A em preparações comerciais típicas pode variar a partir de cerca de 20% a mais do que 90% do teor total de glicosídeo de esteviol, com a quantidade de rebaudiosídeo B em cerca de 1 a 2%, a quantidade de rebaudiosídeo C cerca de 7 a 15% e a quantidade de rebaudiosídeo D pode ser cerca de 2% do total de glicosídeos de esteviol.
[0005] Cada um dos diferentes glicosídeos de esteviol pode ter diferentes graus de doçura, "sensação na boca" e gostos residuais específicos associados a eles. Em relação ao açúcar de mesa (isto é, “sacarose”), a doçura dos glicosídeos de esteviol é geralmente significativamente maior. Por exemplo, o esteviosídeo é 100 a 150 vezes mais doce do que a sacarose, mas tem um gosto residual amargo, conforme observado em numerosos testes de gosto, enquanto os rebaudiosídeos A e estevai são 250 a 450 vezes mais doce do que a sacarose e o perfil de gosto residual são muito melhores do que o esteviosídeo. No entanto, esses próprios glicosídeos de esteviol ainda retêm um gosto residual notável e se prestam naturalmente a essas aplicações nas indústrias de alimentos e bebidas onde esse gosto residual ou diferença da sacarose podem ser mascarados ou eliminados. Além disso, o perfil geral de gosto dos extratos de estévia derivados de plantas pode ser afetado pela presença de vários glicosídeos de esteviol no extrato, que por sua vez podem ser afetados pelas condições ambientais experimentadas pelas plantas subjacentes e pelo processo de extração usado. Essas variações na produção da planta, nas condições climáticas e nas condições de extração podem levar a composições inconsistentes dos glicosídeos de esteviol nos extratos de estévia, de tal modo que os perfis de gostos podem variar fortemente entre os diferentes lotes de produtos de extração. Em tais casos, esses lotes podem não ser úteis para usos ou formulações específicas na indústria de alimentos e bebidas. O perfil de gosto dos extratos de estévia também pode ser afetado por contaminantes derivados de plantas ou do ambiente (tais como pigmentos, lipídios, proteínas, fenólicos e sacarídeos) que permanecem no produto após o processo de extrações. Esses contaminantes tipicamente têm seus próprios sabores oxidados e podem tornar o extrato resultante indesejável para uso em produtos de consumo. Além disso, o custo de isolar combinações individuais ou específicas de rebaudiosídeos de esteviol que não são abundantes ou simplesmente não estão presentes em extratos de estévia pode ser proibitivo em termos de custo e recursos.
[0006] Geralmente os glicosídeos de esteviol são formados por uma série de reações de glicosilação de esteviol, que tipicamente são catalisadas por enzimas UDP-glicosiltransferase (UGT) usando uridina 5'- difosfoglicose (UDP-glicose) como um doador da porção de açúcar. Nas plantas, os UGTs são um grupo muito divergente de enzimas que podem transferir um resíduo de glicose da UDP-glicose para o esteviol. Nessas reações, o esteviosídeo é frequentemente um intermediário na biossíntese de vários compostos rebaudiosídeo. Por exemplo, a glicosilação de esteviosídeo no C-3’ na C-13-O-glicose do esteviosídeo produz rebaudiosídeo A; enquanto a glicosilação em C-2'na posição 19-O-glicose do esteviosídeo produz rebaudiosídeo E.
[0007] Foi descrito previamente que Reb D3 ácido (13-[(2-O-β- D-glicopiranosil-6-O-β-D-glicopiranosil-β-D-glicopiranosil)oxi] ent-caur-16- en-19-oico-(2-O-β-D-glicopiranosil-β-D glicopiranosil)éster) pode ser convertido a partir de Reb E por EUGT11 ou a enzima EUS. O Reb Z (Z1 e Z2) pode ser convertido a partir de Reb E pela enzima HV1. Uma mistura de dois compostos denominada Reb Z foi caracterizada como ácido 13-[(2- O-β-D-glicopiranosil-2-O-β-D-glicopiranosil-β-D-glicopiranosil)oxi] ent-caur- 16-en-19-oico-2-O-β-D-glicopiranosil-β-D-glicopiranosil éster (Reb Z1), ou ácido 13-[(2-O-β-D-glicopiranosil-β-D-glicopiranosil)oxi] ent-caur-16-en-19- óico-[(2-O-β-D-glicopiranosil-2-O-β-D-glicopiranosil-β-D-glicopiranosil)éster (Reb Z2).
[0008] A via de biossíntese do glicosídeo de esteviol envolve a conversão de ácido ent-caurenóico em esteviol pela atividade da enzima KAH. Foi mostrado que UGT76G1 exibe atividade de glicosilação em direção ao biosídeo de esteviol formando rebaudiosídeo B e esteviosídeo resultando na produção de rebaudiosídeo A. Além disso, a afinidade de interação de KAH, UGT85C2, UGT74G1 e UGT76G1 foi avaliada para ácidos ent-caurenóicos e esteviol. Um modelo para KAH mostrou maior afinidade para o ligante esteviol, seguido por esteviol-monosídeo e ácido ent-caurenóico. Os resultados de docagem para o modelo tridimensional de UGT76G1 sugeriram sua maior afinidade de vínculo para o ácido ent- caurenóico, mas também sugeriram que essas enzimas têm a capacidade de interagir com mais de um dos ligantes na via de biossíntese do glicosídeo de esteviol.
[0009] Uma abordagem prática para melhorar a qualidade do gosto dos extratos de estévia é elevar a produção desses compostos de rebaudiosídeo que têm características de gosto mais desejáveis em geral e fazer isso por meio de uma via sintética mais produtiva. Dos glicosídeos de esteviol testados, muitos acreditam que Reb M tem o gosto e as características químicas mais desejáveis para uso em uma variedade de alimentos e bebidas. Conforme afirmado acima, no entanto, a planta tem quantidades pequenas evanescentes desse composto presentes em suas folhas.
[0010] Indo além, o processo de extração de plantas, tipicamente emprega técnicas de extração sólido-líquido usando solventes como hexano, clorofórmio e etanol para recuperação de glicosídeo de esteviol (Catchpole et al., 2003). No entanto, a extração por solvente é ela própria intensiva em energia, leva a problemas de eliminação de resíduos tóxicos, requer extensa área para as próprias plantas serem cultivadas e produz um produto que requer purificação/modificação ou bioconversão adicional. O uso de fermentação e/ou tecnologia de bioconversão enzimática pode permitir a produção de glicosídeos de esteviol em espécies microbianas que podem elevar a seletividade, abundância e pureza dos glicosídeos de esteviol desejados.
[0011] Além do acima, enquanto os consumidores aprovam e buscam ativamente fontes naturais e biológicas para alimentos, rações, sabores ou componentes medicinais, eles também estão preocupados com o fornecimento, perfil de gosto consistente e produção sustentável ambientalmente. A fermentação microbiana e os métodos de produção podem fornecer rebaudiosídeos em quantidades úteis para uma variedade de indústrias e pesquisas, enquanto o fazem de um modo mais natural do que a síntese inorgânica ou as técnicas atuais de extração de plantas.
[0012] Por conseguinte, existe uma necessidade para o desenvolvimento de novas variantes de glicosídeo de esteviol, bem como métodos de produção relacionados que podem ser realizados de maneira econômica e conveniente para facilitar adicionalmente o consumo humano e animal.
RESUMO
[0013] A presente divulgação se refere, pelo menos em parte, à identificação, síntese e produção de vários glicosídeos de esteviol a partir de vários rebaudiosídeos. Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece o uso de Reb D3 na produção de Reb R7-2 ou Reb R6-2. Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece o uso de Reb D na produção de Reb R6-1. Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece o uso de Reb Z1 ou Reb Z2 como o material de partida para a produção de Reb R6-4A. Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece o uso de Reb Z2 como o material de partida para a produção de R6-4B. Os glicosídeos de esteviol do produto foram identificados por análise de NMR e após a produção foram submetidos a vários testes de gosto e testes de processamento para identificar seu sabor em particular e características de desempenho.
[0014] Alguns aspectos da presente divulgação fornecem métodos de produção de rebaudiosídeo R6-2A e/ou R6-2B, o método compreendendo: (I) preparar uma mistura de reação compreendendo: (i) rebaudiosídeo D3; (ii) um ou mais substratos selecionados a partir do grupo que consiste em sacarose, difosfato de uridina (UDP), difosfato de uridina- glicose (UDP-glicose) e combinações dos mesmos; e (iii) uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) uma UDP-glicosiltransferase (UGT); (b) uma UDP-glicosiltransferase e uma sacarose sintase adicionadas separadamente à mistura de reação; e (c) uma enzima de fusão UDP-glicosiltransferase compreendendo um domínio UDP-glicosiltransferase acoplado a um domínio de sacarose sintase; e incubar a mistura de reação por um tempo suficiente para produzir rebaudiosídeo R6-2A e/ou R6-2B; em que o rebaudiosídeo D3 tem a estrutura de:
o rebaudiosídeo R6-2A tem a estrutura de:
;e o rebaudiosídeo R6-2B tem a estrutura de:
[0015] Outros aspectos da presente divulgação fornecem métodos de produção de rebaudiosídeo R7-2, o método compreendendo: (I) preparar uma mistura de reação compreendendo: (i) um ou mais dentre rebaudiosídeo D3, rebaudiosídeo R6-2A e rebaudiosídeo R6-2B;
(ii) um ou mais substratos selecionados a partir do grupo que consiste em sacarose, difosfato de uridina (UDP), difosfato de uridina- glicose (UDP-glicose) e combinações dos mesmos; e
(iii) uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste em:
(a) uma UDP-glicosiltransferase (UGT);
(b) uma UDP-glicosiltransferase e uma sacarose sintase adicionadas separadamente à mistura de reação; e
(c) uma enzima de fusão UDP-glicosiltransferase compreendendo um domínio UDP-glicosiltransferase acoplado a um domínio de sacarose sintase; e
(II) incubar a mistura de reação por um tempo suficiente para produzir rebaudiosídeo R7-2; em que o rebaudiosídeo D3 tem a estrutura de:
o rebaudiosídeo R6-2A tem a estrutura de:
o rebaudiosídeo R6-2B tem a estrutura de:
,e o rebaudiosídeo R7-2 tem a estrutura de:
[0016] Em algumas modalidades, a sacarose sintase ou domínio de sacarose sintase é selecionado a partir do grupo que consiste em uma sacarose sintase I de Arabidopsis, uma sacarose sintase 3 de Arabidopsis e uma sacarose sintase de Vigna radiate. Em algumas modalidades, a sacarose sintase ou domínio de sacarose sintase é uma sacarose sintase I de Arabidopsis thaliana. Em algumas modalidades, a sacarose sintase ou o domínio de sacarose sintase é pelo menos 80% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9. Em algumas modalidades, a sacarose sintase ou domínio de sacarose sintase compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9.
[0017] Em algumas modalidades, uma glicose é covalentemente acoplada ao rebaudiosídeo D3 pela enzima para produzir rebaudiosídeo R6-2A e/ou R6-2B. Em algumas modalidades, a glicose é acoplada covalentemente ao açúcar I do rebaudiosídeo D3 pela enzima para produzir rebaudiosídeo R6-2A. Em algumas modalidades, a glicose é acoplada covalentemente ao açúcar Il do rebaudiosídeo D3 pela enzima para produzir rebaudiosídeo R6-2B. Em algumas modalidades, duas glicose são acopladas covalentemente ao rebaudiosídeo D3 pela enzima para produzir rebaudiosídeo R7-2. Em algumas modalidades, as duas glicoses são acopladas covalentemente ao açúcar I e ao açúcar Il do rebaudiosídeo D3 pela enzima para produzir rebaudiosídeo R7-2.
[0018] A UDP-glicosiltransferase é pelo menos 80% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a UDP-glicosiltransferase compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a enzima de fusão UDP- glicosiltransferase é pelo menos 80% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5. Em algumas modalidades, a enzima de fusão UDP- glicosiltransferase compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:
5.
[0019] Em algumas modalidades, os métodos compreendem adicionalmente a produção de rebaudiosídeo D3 pela incubação rebaudiosídeo E com uma UDP-glicosiltransferase e um substrato selecionado a partir do grupo que consiste em sacarose, UDP, UDP-glicose e combinações dos mesmos.
[0020] São fornecidos ainda neste documento métodos de produção de rebaudiosídeo R64A e/ou rebaudiosídeo R6-4B, o método compreendendo: (I) preparar uma mistura de reação compreendendo: (i) pelo menos um de rebaudiosídeo Z1 e rebaudiosídeo Z2; (ii) um ou mais substratos selecionados a partir do grupo que consiste em sacarose, difosfato de uridina (UDP), difosfato de uridina- glicose (UDP-glicose) e combinações dos mesmos; e (iii) uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) uma UDP-glicosiltransferase (UGT);
(b) uma UDP-glicosiltransferase e uma sacarose sintase adicionadas separadamente à mistura de reação; e
(c) uma enzima de fusão UDP-glicosiltransferase compreendendo um domínio UDP-glicosiltransferase acoplado a um domínio de sacarose sintase; e
(II) incubar a mistura de reação por um tempo suficiente para produzir rebaudiosídeo R6-4A e/ou rebaudiosídeo R6-4B; em que o rebaudiosídeo Z1 tem a estrutura de:
o rebaudiosídeo Z2 tem a estrutura de:
o rebaudiosídeo R6-4A tem a estrutura de:
;e o rebaudiosídeo R6-4B tem a estrutura de:
[0021] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidas neste documento, a sacarose sintase ou domínio de sacarose sintase é selecionado a partir do grupo que consiste em uma sacarose sintase I de Arabidopsis, uma sacarose sintase 3 de Arabidopsis e uma sacarose sintase de Vigna radiate.
Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidas neste documento, a sacarose sintase ou domínio de sacarose sintase é uma sacarose sintase I de Arabidopsis thaliana.
Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidas neste documento, a sacarose sintase ou o domínio de sacarose sintase é pelo menos 80% idêntico à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a sacarose sintase ou domínio de sacarose sintase compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9.
[0022] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, uma glicose é covalentemente acoplada ao rebaudiosídeo Z1 ou rebaudiosídeo Z2 pela enzima para produzir rebaudiosídeo R6-4A. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a glicose é covalentemente acoplada ao açúcar IV do rebaudiosídeo Z1 pela enzima para produzir rebaudiosídeo R6-4A. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a glicose é covalentemente acoplada ao açúcar III do rebaudiosídeo Z2 pela enzima para produzir rebaudiosídeo R6-4A. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a glicose é covalentemente acoplada ao rebaudiosídeo Z2 pela enzima para produzir rebaudiosídeo R6-4B. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a glicose é covalentemente acoplada ao açúcar V do rebaudiosídeo Z2 pela enzima para produzir rebaudiosídeo R6-4B.
[0023] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a UDP-glicosiltransferase é pelo menos 80% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, o UDP-glicosiltransferase compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a enzima de fusão UDP-glicosiltransferase é pelo menos 80% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a enzima de fusão UDP-glicosiltransferase compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7.
[0024] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, o método compreende adicionalmente a produção de rebaudiosídeo Z1 ou rebaudiosídeo Z2 pela incubação rebaudiosídeo E com uma UDP-glicosiltransferase e um substrato selecionado a partir do grupo que consiste em sacarose, UDP, UDP-glicose e combinações dos mesmos.
[0025] Outros aspectos da presente divulgação fornecem métodos de produção de rebaudiosídeo R6-1, o método compreendendo: (I) preparar uma mistura de reação compreendendo: (i) rebaudiosídeo D; (ii) um ou mais substratos selecionados a partir do grupo que consiste em sacarose, difosfato de uridina (UDP), difosfato de uridina- glicose (UDP-glicose) e combinações dos mesmos; e (iii) uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) uma UDP-glicosiltransferase (UGT); (b) uma UDP-glicosiltransferase e uma sacarose sintase adicionadas separadamente à mistura de reação; e (c) uma enzima de fusão UDP-glicosiltransferase compreendendo um domínio UDP-glicosiltransferase acoplado a um domínio de sacarose sintase; e (II) incubar a mistura de reação por um tempo suficiente para produzir rebaudiosídeo R6-1; em que o rebaudiosídeo D tem a estrutura de:
;e o rebaudiosídeo R6-1 tem a estrutura de:
[0026] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidas neste documento, a sacarose sintase ou domínio de sacarose sintase é selecionado a partir do grupo que consiste em uma sacarose sintase I de Arabidopsis, uma sacarose sintase 3 de Arabidopsis e uma sacarose sintase de Vigna radiate. Em algumas modalidades, a sacarose sintase ou domínio de sacarose sintase é uma sacarose sintase I de Arabidopsis thaliana. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidas neste documento, a sacarose sintase ou o domínio de sacarose sintase é pelo menos 80% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9. Em algumas modalidades, a sacarose sintase ou domínio de sacarose sintase compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, uma glicose é covalentemente acoplada ao rebaudiosídeo D pela enzima para produzir rebaudiosídeo R6-1. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a glicose é covalentemente acoplada ao açúcar V do rebaudiosídeo D pela enzima para produzir rebaudiosídeo R6-
1. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a UDP-glicosiltransferase é pelo menos 80% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a UDP-glicosiltransferase compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a enzima de fusão UDP-glicosiltransferase é pelo menos 80% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a enzima de fusão UDP-glicosiltransferase compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7.
[0027] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, o método compreende adicionalmente a produção de rebaudiosídeo D pela incubação de rebaudiosídeo E com uma UDP-glicosiltransferase e um substrato selecionado a partir do grupo que consiste em sacarose, UDP, UDP-glicose e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, o método compreende adicionalmente a produção de rebaudiosídeo D pela incubação de rebaudiosídeo A com uma UDP-glicosiltransferase e um substrato selecionado a partir do grupo que consiste em sacarose, UDP, UDP-glicose e combinações dos mesmos.
[0028] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a mistura de reação é in vitro. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a mistura de reação é uma mistura de reação com base em células. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a célula é selecionada a partir do grupo que consiste em uma levedura, uma planta não produtora de glicosídeo de esteviol, uma alga, um fungo e uma bactéria.
[0029] Outros aspectos da presente divulgação fornecem rebaudiosídeos (por exemplo, rebaudiosídeos sintéticos) selecionados a partir de: (i) o rebaudiosídeo R6-2A tendo a estrutura:
(ii) o rebaudiosídeo R6-2B tendo a estrutura:
(iii) o rebaudiosídeo R7-2 tendo a estrutura:
(iv) o rebaudiosídeo R6-4A tendo a estrutura:
(v) o rebaudiosídeo R6-4B tendo a estrutura:
;e (vi) o rebaudiosídeo R6-1 tendo a estrutura:
[0030] Composição compreendendo qualquer um dos rebaudiosídeos (por exemplo, rebaudiosídeos sintéticos) fornecidos neste documento também são fornecidos.
[0031] É fornecido adicionalmente neste documento o uso de qualquer um dos rebaudiosídeos (por exemplo, rebaudiosídeos sintéticos) descritos neste documento como um adoçante.
[0032] Outros aspectos da presente divulgação fornecem um produto de consumo oral compreendendo uma quantidade adoçante de qualquer um dos adoçantes fornecidos neste documento, tal como selecionado a partir do grupo que consiste em rebaudiosídeo R6-2A, R6- 2B, R7-2, R6-4A, R6 -4B e/ou R6-1, tal como em que o produto de consumo oral é selecionado a partir do grupo que consiste em um produto de bebida e um produto consumível.
[0033] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, o adoçante é o único adoçante. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, o produto de consumo oral compreende a partir de cerca de 5 ppm a 100 ppm do rebaudiosídeo. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, o produto de consumo oral tem uma intensidade de doçura equivalente a cerca de 1% (p/v por %) a cerca de 4% (p/v por %) de solução de sacarose.
[0034] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, o produto de consumo oral compreende adicionalmente pelo menos um adoçante adicional. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, o pelo menos um adoçante adicional é selecionado a partir do grupo que consiste em um extrato de estévia, um glicosídeo de esteviol, esteviosídeo, rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo B, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo E derivado de biossíntese microbiana recombinante, rebaudiosídeo F, dulcosídeo A, rebaudiosídeo M, rebaudiosídeo V, rebaudiosídeo W, rebaudiosídeo D3, rebaudiosídeo Z1, rebaudiosídeo Z2, rubusosídeo, esteviolbiosídeo, sacarose, xarope de milho de alta frutose, frutose, glicose, xilose, arabinose, ramnose, eritritol, xilitol, manitol, sorbitol, inositol, AceK, aspartame, neotame, sacarose, sacarina, naringina dihidrocalcona (NarDHC), neohesperidina dihidrocalcona (NDHC), rubusosídeo, mogrosídeo IV, siamenosídeo I, mogrosídeo V, monatina, taumatina, monelina brazzeina, L-alanina, glicina, Lo Han Guo, hernandulcina, filodulcina, trilobtaina e combinações dos mesmos.
[0035] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, o produto de consumo oral compreende adicionalmente pelo menos um aditivo, tal como selecionado a partir do grupo que consiste em um carboidrato, um poliol, um aminoácido ou sal do mesmo, um poliaminoácido ou sal do mesmo, um ácido de açúcar ou sal do mesmo, um nucleotídeo, um ácido orgânico, um ácido inorgânico, um sal orgânico, um sal de ácido orgânico, um sal de base orgânica, um sal inorgânico, um composto amargo, um aromatizante, um ingrediente aromatizante, um composto adstringente, uma proteína, um hidrolisado de proteína, um surfactante, um emulsificante, um flavonoide, um álcool, um polímero e combinações dos mesmos.
[0036] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, o produto consumível é selecionado a partir do grupo que consiste em um produto alimentar, um nutracêutico, um farmacêutico, um suplemento dietético, uma composição de higiene dental, uma composição de gel comestível, um produto cosmético e um aromatizante de mesa. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, o produto de bebida é selecionado a partir do grupo que consiste em um produto de bebida carbonatada e um produto de bebida não carbonatada. Em alguma modalidade de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, o produto de bebida é selecionado a partir do grupo que consiste em um refrigerante, uma bebida de máquina, uma bebida congelada; uma bebida pronta para beber; uma bebida congelada e pronta para beber, café, chá, uma bebida láctea, um refrigerante em pó, um concentrado líquido, água com sabor, água enriquecida, suco de fruta, uma bebida com sabor de suco de fruta, uma bebida esportiva e uma bebida energética.
[0037] Qualquer um dos rebaudiosídeos ou composições fornecidas neste documento, pode ser usado em um analgésico, repelente de pragas, alimento ou suplemento dietético. Qualquer uma de tais composições também são fornecidas neste documento. Qualquer uma das composições fornecidas neste documento pode estar na forma de aerossol, líquido, gel ou granular.
[0038] Em qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, o sistema celular é selecionado a partir do grupo que consiste em bactérias, leveduras e uma combinação dos mesmos, ou qualquer sistema celular que permitiria a transformação genética com genes selecionados e, posteriormente, a produção biossintética do glicosídeo de esteviol desejado. Em qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, o sistema celular é um sistema microbiano, tal como E. coli.
[0039] Em um aspecto, um rebaudiosídeo ou composição do mesmo, produzido por qualquer um dos métodos fornecidos neste documento, é fornecido.
[0040] Embora a divulgação é suscetível a várias modificações e formas alternativas, modalidades específicas dos mesmos são mostradas a título de exemplo nos desenhos e serão descritas neste documento em detalhes. Deve ser entendido, no entanto, que os desenhos e a descrição detalhada apresentada neste documento não se destinam a limitar a divulgação à modalidade em particular divulgada, mas, pelo contrário, a intenção é cobrir todas as modificações, equivalentes e alternativas caindo dentro do espírito e escopo da presente divulgação, conforme definido pelas reivindicações anexas.
[0041] Outras características e vantagens desta invenção se tornarão evidentes na seguinte descrição detalhada de modalidades preferenciais desta invenção, tomadas com referência aos desenhos que acompanham.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0042] Os desenhos que acompanham não se destinam a ser desenhados em escala. Nos desenhos, cada componente idêntico ou quase idêntico que é ilustrado em várias figuras é representado por um número semelhante. Para propósitos de clareza, nem todos os componentes podem ser rotulados em todos os desenhos. Nos desenhos:
[0043] Figura 1. Via biossintética de R6-1, R7-2, R6-4A e R6-4B.
[0044] Figura 2. Via biossintética de R6-2 e R7-2.
[0045] Figura 3. Reação de catálise UGT76G1 para produzir R6- 2 e R7-2 a partir de Reb D3. O painel A mostra o tempo de retenção de HPLC do padrão rebaudiosídeo D3 (“D3”). Os painéis B a D mostram R6-2 e R7-2 produzidos de maneira enzimática por UGT76G1 em 2 horas (Painel B), 4 horas (Painel C) e 19 horas (Painel D).
[0046] Figura 4. Análise de LC MS do composto R6-2 produzido.
[0047] Figura 5. Análise de LC MS do composto R7-2 produzido.
[0048] Figura 6. A estrutura de R7-2.
[0049] Figura 7A e 7B. As estruturas de R6-2A (Figura 7A) e R6- 2B (Figura 7B).
[0050] Figura 8. Correlações chave de TOCSY e HMBC de R7-
2.
[0051] Figura 9. A via de biossíntese do composto R6-1.
[0052] Figura 10. A reação de catálise HV1 para produzir R6-1 a partir de Reb D. O painel A mostra o tempo de retenção de HPLC do padrão rebaudiosídeo D (“Reb D”). Os painéis B e C mostram R6-1 produzido de maneira enzimática por HV1 em 6 horas (Painel B) e 24 horas (Painel C).
[0053] Figura 11. Análise de LC MS do composto R6-1 produzido.
[0054] Figura 12. A estrutura de R6-1.
[0055] Figura 13. Correlações chave de TOCSY e HMBC de R6-
1.
[0056] Figura 14. Via de biossíntese do composto R6-4A e R6- 4B.
[0057] Figura 15. Reação de catálise HV1 para produzir R6-4 a partir de Reb Z. O painel A mostra o tempo de retenção de HPLC do padrão rebaudiosídeo Z ("Z"). O R6-4 foi produzido de maneira enzimática por HV1 em 3 horas (Painel B) e 24 horas (Painel C).
[0058] Figura 16. Análise de LC MS do composto R6-4 produzido.
[0059] Figura 17. A estrutura de R6-4A e R6-4B.
DEFINIÇÕES
[0060] A menos que definidos de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado que compreendido comumente por alguém versado na técnica a qual a divulgação pertence. Embora quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos neste documento possam ser usados na prática ou teste da presente divulgação, os materiais e métodos preferenciais são descritos abaixo.
[0061] O termo "complementar" é usado de acordo com seu significado comum e habitual, conforme entendido por uma pessoa versada na técnica, e é usado sem limitação para descrever a relação entre bases de nucleotídeos que são capazes de hibridizar umas com as outras. Por exemplo, com relação ao DNA, a adenosina é complementar à timina e a citosina é complementar à guanina. Por conseguinte, a tecnologia em questão também inclui fragmentos de ácido nucleico isolados que são complementares às sequências completas, conforme relatado na Listagem de Sequências que acompanham, bem como aquelas sequências de ácido nucleico substancialmente semelhantes.
[0062] Os termos "ácido nucleico" e "nucleotídeo" são usados de acordo com seus respectivos significados comuns e habituais, conforme entendidos por uma pessoa versada na técnica, e são usados sem limitação para se referir a deoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos e polímeros dos mesmos em qualquer forma de filamento ou simples ou duplo. A menos que especificamente limitado, o termo abrange ácidos nucleicos contendo análogos conhecidos de nucleotídeos naturais que têm propriedades de vínculos similares ao ácido nucleico de referência e são metabolizados de maneira similar aos nucleotídeos de ocorrência natural.
Ao menos que indicado de outra forma, uma sequência de ácidos nucleicos em particular também abrange implicitamente as variantes modificadas ou degeneradas de maneira conservativa da mesma (por exemplo, substituições de códons degenerados) e sequências complementares, bem como a sequência indicada explicitamente.
[0063] O termo "isolado" é usado de acordo com seu significado comum e habitual, conforme entendido por uma pessoa versada na técnica, e quando usado no contexto de um ácido nucleico isolado ou um polipeptídeo isolado, é usado sem limitação para se referir a um ácido nucléico ou polipeptídeo que, por ações humanas, existe separado de seu ambiente nativo e, portanto, não é um produto da natureza. Um ácido nucleico ou polipeptídeo isolado pode existir em uma forma purificada ou pode existir em um ambiente não nativo, tal como, por exemplo, em uma célula hospedeira transgênica.
[0064] Os termos "incubar" e "incubação", conforme usados neste documento, referem-se a um processo de mistura de duas ou mais entidades químicas ou biológicas (tal como um composto químico e uma enzima) e permitindo que eles interajam sob condições favoráveis para a produção de uma composição de glicosídeo de esteviol.
[0065] O termo "variante degenerada" refere-se a uma sequência de ácido nucleico tendo uma sequência de resíduos que difere de uma sequência de ácido nucleico de referência por uma ou mais substituições de códons degenerados. As substituições de códon degenerado podem ser atingidas por meio da geração de sequências, na qual a terceira posição de um ou mais códons selecionados (ou todos) é substituída por resíduos de base misturada e/ou deoxi-inosina. Uma sequência de ácido nucleico e todas as suas variantes degeneradas expressarão o mesmo aminoácido ou polipeptídeo.
[0066] Os termos "polipeptídeo", "proteína" e "peptídeo" são usados de acordo com seus respectivos significados comuns e habituais,
conforme entendidos por uma pessoa versada na técnica; os três termos são algumas vezes usados indistintamente e são usados sem limitação para se referir a um polímero de aminoácidos ou análogos de aminoácidos, independentemente de seu tamanho ou função. Embora a "proteína" seja frequentemente usada em referência a polipeptídeos relativamente grandes, e "peptídeo" seja frequentemente usado em referência a polipeptídeos pequenos, o uso desses termos na técnica se sobrepõe e varia. O termo "polipeptídeo", conforme usado neste documento, refere-se a peptídeos, polipeptídeos e proteínas, a menos que indicado de outra forma. Os termos "proteína", "polipeptídeo" e "peptídeo" são usados indistintamente neste documento quando se referem a um produto polinucleotídico. Assim, polipeptídeos exemplares incluem produtos polinucleotídicos, proteínas de ocorrência natural, homólogos, ortólogos, parálogos, fragmentos e outros equivalentes, variantes e análogos dos anteriores.
[0067] Os termos "fragmento de polipeptídeo" e "fragmento", quando usados em referência a um polipeptídeo de referência, são usados de acordo com seus significados comuns e habituais para um versado na técnica e são usados sem limitação para se referir a um polipeptídeo em cujos resíduos de aminoácidos são deletados em comparação com o próprio polipeptídeo de referência, mas onde a sequência de aminoácidos remanescente é geralmente idêntica às posições correspondentes no polipeptídeo de referência. Tais deleções podem ocorrer no terminal amino ou terminal carboxi do polipeptídeo de referência ou, alternativamente, em ambos.
[0068] O termo "fragmento funcional" de um polipeptídeo ou proteína refere-se a um fragmento de peptídeo que é uma porção do polipeptídeo ou proteína de comprimento total e tem substancialmente a mesma atividade biológica, ou desenvolve substancialmente a mesma função que o polipeptídeo ou proteína de comprimento total (por exemplo,
desenvolvendo a mesma reação enzimática).
[0069] Os termos "polipeptídeo variante", "sequência de aminoácidos modificada" ou "polipeptídeo modificado", que são usados indistintamente, referem-se a uma sequência de aminoácidos que é diferente do polipeptídeo de referência por um ou mais aminoácidos, por exemplo, por um ou mais substituições, deleções e/ou adições de aminoácidos. Em um aspecto, uma variante é uma "variante funcional" que retém alguma ou toda a capacidade do polipeptídeo de referência.
[0070] O termo "variante funcional" inclui adicionalmente variantes substituídas de maneira conservativa. O termo "variante substituída de maneira conservativa" refere-se a um peptídeo tendo uma sequência de aminoácidos que difere de um peptídeo de referência por uma ou mais substituições de aminoácidos conservativas e mantém alguma ou toda a atividade do peptídeo de referência. Uma "substituição de aminoácido conservativa" é uma substituição de um resíduo de aminoácido por um resíduo funcionalmente semelhante. Exemplos de substituições conservativas incluem a substituição de um resíduo não polar (hidrofóbico) tais como isoleucina, valina, leucina ou metionina por outro; a substituição de um resíduo carregado ou polar (hidrofílico) por outro, tais como entre arginina e lisina, entre glutamina e asparagina, entre treonina e serina; a substituição de um resíduo básico como tal lisina ou arginina por outro; ou a substituição de um resíduo ácido, tal como ácido aspártico ou ácido glutâmico por outro; ou a substituição de um resíduo aromático, tais como fenilalanina, tirosina ou triptofano por outro. Espera-se que tais substituições tenham pouco ou nenhum efeito no peso molecular ou ponto isoelétrico da proteína ou polipeptídeo aparente. A frase "variante substituída de maneira conservativa" também inclui peptídeos em que um resíduo é substituído por um resíduo derivado quimicamente, contanto que o peptídeo resultante mantenha algumas ou toda a atividade do peptídeo de referência, conforme descrito neste documento.
[0071] O termo "variante", em conexão com os polipeptídeos da tecnologia em questão, inclui adicionalmente um polipeptídeo funcionalmente ativo tendo uma sequência de aminoácidos de pelo menos 75%, pelo menos 76%, pelo menos 77%, pelo menos 78%, pelo menos 79%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, e mesmo 100% idêntica à sequência de aminoácidos de um polipeptídeo de referência.
[0072] O termo "homólogo" em todas as suas formas gramaticais e variações ortográficas se refere à relação entre polinucleotídeos ou polipeptídeos que possuem uma "origem evolutiva comum", incluindo polinucleotídeos ou polipeptídeos de superfamílias e polinucleotídeos homólogos ou proteínas de diferentes espécies (Reeck et al., Cell 50:667, 1987). Tais polinucleotídeos ou polipeptídeos têm homologia de sequência, conforme refletido por sua similaridade de sequência, seja em termos de identidade percentual ou a presença de aminoácidos específicos ou motivos em posições conservadas. Por exemplo, dois polipeptídeos homólogos podem ter sequências de aminoácidos que são pelo menos 75%, pelo menos 76%, pelo menos 77%, pelo menos 78%, pelo menos 79%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% e mesmo 100% idênticas.
[0073] A "porcentagem (%) de identidade de sequência de aminoácidos" em relação às sequências polipeptídicas variantes da tecnologia em questão refere-se à porcentagem de resíduos de aminoácidos em uma sequência candidata que são idênticas aos resíduos de aminoácidos de um polipeptídeo de referência após o alinhamento das sequências e introduzir lacunas, se necessário, para atingir a porcentagem máxima de identidade de sequência.
[0074] O alinhamento para o propósito de determinar o percentual de identidade de sequência de aminoácidos pode ser atingido de várias formas que estão dentro da habilidade na técnica, por exemplo, usando softwares de computador disponíveis publicamente tais como software BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 ou Megalign (DNASTAR). Aqueles versados na técnica podem determinar os parâmetros apropriados para medir o alinhamento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para atingir o alinhamento máximo sobre o comprimento total das sequências sendo comparadas. Por exemplo, a % de identidade de sequência de aminoácidos pode ser determinada usando o programa de comparação de sequência NCBI-BLAST2. O programa de comparação de sequência NCBIBLAST2 pode ser baixado de ncbi.nlm.nih.gov. O NCBI-BLAST2 usa vários parâmetros de pesquisa, em que todos esses parâmetros de pesquisa são definidos para valores padrão, incluindo, por exemplo, desmascarar sim, filamento=todos, ocorrências esperadas 10, comprimento mínimo de baixa complexidade=15/5, valor eletrônico de múltiplas passagens=0,01, constante para múltiplas passagens=25, declínios de alinhamento incompleto final=25 e matriz de pontuação=BLOSUM62. Em situações onde NCBI-BLAST2 é empregado para comparações de sequência de aminoácidos, a % de identidade de sequência de aminoácidos de uma dada sequência de aminoácidos A para, com ou contra uma dada sequência de aminoácidos B (que pode alternativamente ser fraseada como um dado aminoácido sequência A que tem ou compreende uma certa % de identidade de sequência de aminoácidos para, com ou contra uma dada sequência de aminoácidos B) é calculada da seguinte forma: 100 vezes a fração X/Y, onde X é o número de resíduos de aminoácidos pontuado como idênticos corresponde pelo programa de alinhamento de sequência NCBI-BLAST2 no alinhamento desse programa de A e B, e onde Y é o número total de resíduos de aminoácidos em B. Será apreciado que onde o comprimento da sequência de aminoácidos A não é igual ao comprimento da sequência de aminoácidos B, a % de identidade de sequência de aminoácidos de A para B não será igual à % de identidade de sequência de aminoácidos de B para A.
[0075] Neste sentido, as técnicas para determinar a "similaridade" da sequência de aminoácidos são bem conhecidas na técnica. Em geral, "similaridade" se refere à comparação exata de aminoácidos para aminoácidos de dois ou mais polipeptídeos no local apropriado, onde os aminoácidos são idênticos ou possuem propriedades químicas e/ou físicas semelhantes, tal como carga ou hidrofobicidade. Uma assim denominada "similaridade percentual" pode então ser determinada entre as sequências polipeptídicas comparadas. As técnicas para determinar a identidade da sequência de ácido nucleico e de aminoácidos também são bem conhecidas na técnica e incluem a determinação da sequência de nucleotídeos do mRNA para esse gene (geralmente por meio de um intermediário de cDNA) e a determinação da sequência de aminoácidos nele codificada e a comparação com uma segunda sequência de aminoácidos. Em geral, "identidade" refere-se a uma correspondência exata de nucleotídeo a nucleotídeo ou aminoácido a aminoácido de dois polinucleotídeos ou sequências polipeptídicas, respectivamente. Duas ou mais sequências de polinucleotídeos podem ser comparadas pela determinação de sua "porcentagem de identidade", assim como duas ou mais sequências de aminoácidos. Os programas disponíveis no Wisconsin Sequence Analysis Package, Versão 8 (disponível em Genetics Computer Group, Madison, Wis.), por exemplo, o programa GAP, são capazes de calcular tanto a identidade entre dois polinucleotídeos quanto a identidade e semelhança entre duas sequências de polipeptídeos, respectivamente. Outros programas para calcular a identidade ou similaridade entre sequências são conhecidos pelos versados na técnica.
[0076] Uma posição de aminoácido "correspondente a" uma posição de referência se refere a uma posição que se alinha com uma sequência de referência, conforme identificado pelo alinhamento das sequências de aminoácidos. Tais alinhamentos podem ser feitos manualmente ou usando programas de alinhamento de sequência bem conhecidos, tal como ClustalW2, Blast 2, etc.
[0077] A menos que especificado de outra forma, a porcentagem de identidade de duas sequências de polipeptídeo ou polinucleotídeo refere-se à porcentagem de resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos idênticos ao longo de todo o comprimento da mais curta dentre as duas sequências.
[0078] A "sequência de codificação" é usada de acordo com seu significado comum e habitual, conforme entendido por um versado na técnica, e é usado sem limitação para se referir a uma sequência de DNA que codifica uma sequência de aminoácidos específica.
[0079] As "sequências regulatórias adequadas" são usadas de acordo com seu significado comum e habitual, conforme entendido por uma pessoa versada na técnica, e é usado sem limitação para se referir a sequências de nucleotídeos localizadas a montante (sequências não codificantes 5'), dentro ou a jusante (sequências não codificantes 3') de uma sequência de codificação e que influenciam a transcrição, o processamento ou estabilidade do RNA ou a tradução da sequência de codificação associada. As sequências regulatórias podem incluir promotores, sequências líderes de tradução, íntrons e sequências de reconhecimento de poliadenilação.
[0080] O "promotor" é usado de acordo com seu significado comum e habitual, conforme entendido por uma pessoa versada na técnica,
e é usado sem limitação para se referir a uma sequência de DNA capaz de controlar a expressão de uma sequência de codificação ou RNA funcional. Em geral, uma sequência de codificação está localizada a 3' de uma sequência de promotor. Os promotores podem ser derivados em sua totalidade de um gene nativo ou ser compostos de diferentes elementos derivados a partir de diferentes promotores encontrados na natureza ou mesmo compreender segmentos de DNA sintético. É entendido por aqueles versados na técnica que diferentes promotores podem dirigir a expressão de um gene em diferentes tipos de células ou em diferentes estágios de desenvolvimento ou em resposta a diferentes condições ambientais. Os promotores, que fazem com que um gene seja expresso na maioria dos tipos de células na maioria das vezes, são comumente referidos como "promotores constitutivos." É reconhecido adicionalmente que, uma vez que na maioria dos casos os limites exatos das sequências regulatórias não foram completamente definidos, fragmentos de DNA de diferentes comprimentos podem ter atividade promotora idêntica.
[0081] O termo "operacionalmente ligado" refere-se à associação de sequências de ácido nucleico em um único fragmento de ácido nucleico de modo que a função de um seja afetada pelo outro. Por exemplo, um promotor está operacionalmente ligado a uma sequência de codificação quando é capaz de afetar a expressão dessa sequência de codificação (isto é, que a sequência de codificação está sob o controle transcricional do promotor). As sequências de codificação podem ser operativamente ligadas a sequências regulatórias em orientação de sense ou antisense.
[0082] O termo "expressão", tal como usado neste documento, é usado de acordo com o seu significado comum e habitual, conforme entendido por uma pessoa versada na técnica, e é usado sem limitação para se referir à transcrição e acumulação estável de sense (mRNA) ou antisense RNA derivado do fragmento de ácido nucleico da tecnologia em questão. A "superexpressão" refere-se à produção de um produto gênico em organismos transgênicos ou recombinantes que excede os níveis de produção em organismos normais ou não transformados.
[0083] "Transformação" é usado, de acordo com seu significado comum e habitual, conforme entendido por uma pessoa versada na técnica, e é usado sem limitação para se referir à transferência de um polinucleotídeo para uma célula alvo. O polinucleotídeo transferido pode ser incorporado no genoma ou no DNA cromossômico de uma célula alvo, resultando em herança geneticamente estável ou pode se replicar independentemente do cromossomo hospedeiro. Os organismos hospedeiros contendo os fragmentos de ácido nucleico transformados são referidos como organismos "transgênicos" ou "recombinantes" ou "transformados".
[0084] Os termos "transformado", "transgênico" e "recombinante", quando usados neste documento em conexão com células hospedeiras, são usados de acordo com seus significados comuns e habituais, conforme entendidos por uma pessoa versada na técnica, e são usados sem limitação para se referir a uma célula de um organismo hospedeiro, tais como uma planta ou célula microbiana, na qual uma molécula de ácido nucleico heteróloga foi introduzida. A molécula de ácido nucleico pode ser integrada de maneira estável no genoma da célula hospedeira ou a molécula de ácido nucleico pode estar presente como uma molécula extracromossômica. Tal molécula extracromossômica pode ser autorreplicante. As células, tecidos ou sujeitos transformados são entendidos como abrangendo não apenas o produto final de um processo de transformação, mas também progênie transgênica do mesmo.
[0085] Os termos "recombinante", "heterólogo" e "exógeno", quando usados neste documento em conexão com polinucleotídeos, são usados de acordo com seus significados comuns e habituais, conforme entendidos por uma pessoa versada na técnica, e são usados sem limitação para referir-se a um polinucleotídeo (por exemplo, uma sequência de DNA ou um gene) que se origina de uma fonte estranha à célula hospedeira em particular ou, se for a partir da mesma fonte, é modificado de sua forma original. Assim, um gene heterólogo em uma célula hospedeira inclui um gene que é endógeno à célula hospedeira em particular, mas foi modificado através, por exemplo, do uso de mutagênese dirigida ao sítio ou outras técnicas recombinantes. Os termos também incluem múltiplas cópias não naturais de uma sequência de DNA natural. Assim, os termos referem-se a um segmento de DNA que é estranho ou heterólogo à célula, ou homólogo à célula, mas em uma posição ou forma dentro da célula hospedeira na qual o elemento não é normalmente encontrado.
[0086] Semelhantemente, os termos "recombinante", "heterólogo" e "exógeno", quando usados neste documento em conexão com um polipeptídeo ou sequência de aminoácidos, significam um polipeptídeo ou sequência de aminoácidos que se origina a partir de uma fonte estranha à célula hospedeira em particular ou, se for da mesma fonte, é modificado a partir de sua forma original. Assim, segmentos de DNA recombinante podem ser expressos em uma célula hospedeira para produzir um polipeptídeo recombinante.
[0087] Os termos "plasmídeo", "vetor" e "cassete" são usados, de acordo com seus significados comuns e habituais, conforme entendidos por uma pessoa versada na técnica, e são usados sem limitação para se referir a um elemento cromossômico extra, muitas vezes carregando genes que não fazem parte do metabolismo central da célula, e geralmente na forma de moléculas circulares de DNA de filamento duplo. Tais elementos podem ser sequências de replicação autônoma, sequências de integração de genoma, sequências de fago ou nucleotídeos, lineares ou circulares, de um DNA ou RNA de filamento simples ou duplo, derivado de qualquer fonte, no qual uma série de sequências de nucleotídeos foram juntadas ou recombinadas em uma construção única que é capaz de introduzir um fragmento promotor e uma sequência de DNA para um produto de gene selecionado juntamente com a sequência 3' não traduzida apropriada em uma célula. A "cassete de transformação" refere-se a um vetor específico contendo um gene estranho e tendo elementos além do gene estranho que facilitam a transformação de uma célula hospedeira em particular. A "cassete de expressão" refere-se a um vetor específico contendo um gene estranho e tendo elementos além do gene estranho que permitem a expressão realçada desse gene em um hospedeiro estranho.
[0088] O DNA recombinante padrão e técnicas de clonagem molecular usadas neste documento são bem conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, por Sambrook, J., Fritsch, E.F. e Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2o ed.; Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY, 1989 (doravante “Maniatis”); e por Silhavy, T.J., Bennan, M.L. e Enquist, L.W. Experiments with Gene Fusions; Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY, 1984; e por Ausubel, F.M. et al., In Current Protocols in Molecular Biology, publicado por Greene Publishing e Wiley-Interscience, 1987; a totalidade de cada um dos quais é por meio deste instrumento incorporada por referência neste documento na medida que são consistentes com o presente.
[0089] Tal como usado neste documento, "sintetizado" ou "sintetizado organicamente" ou "sintetizado quimicamente" ou "sintetizado organicamente" ou "sintetizado quimicamente" ou "síntese orgânica" ou "síntese química" são usados para se referir à preparação dos compostos através de uma série de reações a produtos químicos; isto não inclui extrair o composto, por exemplo, de uma fonte natural.
[0090] O termo "produto de consumo oral", tal como usado neste documento, refere-se a qualquer bebida, produto alimentício, suplemento dietético, nutracêutico, composição farmacêutica, composição higiênica dentária e produto cosmético que entra em contato com a boca do homem ou animal, incluindo substâncias que são tomadas e subsequentemente ejetadas pela boca e substâncias que são bebidas, comidas, engolidas ou de outra forma ingeridas; e que são seguros para consumo humano ou animal quando usados em uma variação geralmente aceitável de concentrações.
[0091] O termo “produto alimentício”, tal como usado neste documento, refere-se a frutas, vegetais, sumos, produtos de carne, tal como presunto, bacon e salsicha; produtos de ovo, concentrados de fruta, gelatinas e produtos do tipo gelatina, tais como compotas, geleias, conservas e semelhantes; produtos lácteos, tais como sorvete, creme de leite, iogurte e sorvete; coberturas, xaropes, incluindo melaço; milho, trigo, centeio, soja, aveia, arroz e produtos de cevada, produtos de cereais, noz- moscada e produtos de nozes, bolos, biscoitos, confeitos tais como balas, gomas, balas com sabor de frutas e chocolates, gomas de mascar, mentas, cremes, glacê, sorvetes, tortas e pães. O “produto alimentício” também se refere a condimentos tais como ervas, especiarias e temperos, realçadores de sabor, tal como glutamato monossódico. O "produto alimentício" também refere-se a produtos embalados preparados, tais como adoçantes dietéticos, adoçantes líquidos, aromatizantes de mesa, misturas de sabores granulados que, mediante a reconstituição com água, fornecem bebidas não carbonatadas, misturas de pudim instantâneo, café instantâneo e chá, branqueadores de café, misturas de leite maltado, alimentos para animais de estimação, ração para gado, tabaco e materiais para aplicações de panificação, tal como misturas de panificação em pó para a preparação de pães, biscoitos, bolos, panquecas, donuts e semelhantes. O “produto alimentício” também se refere à dieta ou alimentos e bebidas de baixa caloria contendo pouca ou nenhuma sacarose.
[0092] Conforme usado neste documento, o termo "estereoisômero" é um termo geral para todos os isômeros de moléculas individuais que diferem apenas na orientação de seus átomos no espaço. O
"estereoisômero" inclui enantiômeros e isômeros de compostos com mais de um centro quiral que não são imagens espelhadas um do outro (diastereômeros).
[0093] Tal conforme usado neste documento, o termo "intensidade de doçura" refere-se à força relativa da sensação doce como observada ou experimentada por um indivíduo, por exemplo, um humano ou um grau ou quantidade de doçura detectado por um degustador, por exemplo, em uma escala Brix.
[0094] Tal como usado neste documento, o termo "realçar a doçura" refere-se ao efeito dos rebaudiosídeos em elevar, aumentar, intensificar, acentuar, ampliar e/ou potencializar a percepção sensorial de uma ou mais características de doçura de um produto de bebida ou produto consumível da presente divulgação, sem alterar a natureza ou qualidade da mesma, em comparação com um produto de consumo oral correspondente que não contém um rebaudiosídeo da presente divulgação.
[0095] Conforme usado neste documento, o termo "gosto(s) estranho(s)" refere-se a uma quantidade ou grau de gosto que não é característica ou geralmente encontrado em um produto de bebida ou um produto consumível da presente divulgação. Por exemplo, um gosto estranho é um gosto indesejável de um consumível adoçado para os consumidores, tais como, um gosto amargo, um gosto tipo de alcaçuz, um gosto metálico, um gosto aversivo, um gosto adstringente, um início de doçura retardado, um gosto residual doce e semelhantes, etc.
[0096] Tal como usado neste documento, o termo "p/v por %" refere-se ao peso de um composto, tal como um açúcar (em gramas) para cada 100 ml de um produto líquido de consumo oral da presente divulgação contendo tal composto. Conforme usado neste documento, o termo "p/p por %" refere-se ao peso de um composto, tal como um açúcar (em gramas) para cada grama de um produto de consumo oral da presente divulgação contendo tal composto.
[0097] Tal como usado neste documento, o termo "ppm" refere- se a(s) parte(s) por milhão em peso, por exemplo, o peso de um composto, tal como um rebaudiosídeo da presente divulgação (em miligramas) por quilograma de um produto de consumo oral da presente divulgação contendo tal composto (isto é, mg/kg) ou o peso de um composto, tal como um rebaudiosídeo da presente divulgação (em miligramas) por litro de um produto de consumo oral da presente divulgação contendo tal composto (isto é, mg/L); ou em volume, por exemplo, o volume de um composto, tal como um rebaudiosídeo da presente divulgação (em mililitros) por litro de um produto de consumo oral da presente divulgação contendo tal composto (isto é, ml/L).
[0098] Os glicosídeos de esteviol são uma classe de compostos químicos responsáveis pelo gosto doce das folhas da planta sul-americana Stevia rebaudiana (Asteraceae), e podem ser usados como adoçantes em alimentos, rações e bebidas sozinhos, em combinação uns com os outros ou em combinação com outros adoçantes e modificadores de gosto.
[0099] O sistema celular é qualquer célula que forneça a expressão de proteínas ectópicas. Ele incluía bactérias, leveduras, células vegetais e células animais. Inclui células procarióticas e eucarióticas. Também inclui a expressão in vitro de proteínas com base em componentes celulares, tal como os ribossomos.
[00100] Cultivar o sistema celular. Cultivar inclui fornecer um meio apropriado que permitiria às células se multiplicarem e se dividirem. Também inclui o fornecimento de recursos para que as células ou componentes celulares possam traduzir e produzir proteínas recombinantes.
[00101] A expressão de proteína. A produção de proteínas pode ocorrer após a expressão gênica. Consiste nas etapas após a transcrição do DNA em RNA mensageiro (mRNA). O mRNA é então traduzido em cadeias polipeptídicas, que são finalmente dobradas em proteínas. O DNA está presente nas células através da transfecção - um processo de introdução deliberada de ácidos nucléicos nas células. O termo é normalmente usado para métodos não-virais nas células eucarióticas. Também pode referir-se a outros métodos e tipos de células, embora outros termos sejam preferenciais: "transformação" é mais geralmente usado para descrever a transferência de DNA não viral em bactérias, células eucarióticas não animais, incluindo células vegetais. Em células animais, a transfecção é o termo preferencial, pois a transformação também é usada para se referir à progressão para um estado canceroso (carcinogênese) nessas células. A transdução é geralmente usada para descrever a transferência de DNA mediada por vírus. A transformação, transdução e infecção viral estão incluídas sob a definição de transfecção para este pedido.
[00102] Conforme usado neste documento, a forma singular "uma", "um" e "a/o" inclui referências no plural, a menos que o contexto claramente dite de outra forma.
[00103] Na medida em que o termo "incluir", "ter" ou semelhante é usado na descrição ou nas reivindicações, tal termo se destina a ser inclusivo de uma maneira semelhante ao termo "compreender", como "compreender" é interpretado quando empregado como uma palavra de transição em uma reivindicação.
[00104] A palavra "exemplar" é usada neste documento para significar "servir como um exemplo, instância ou ilustração". Qualquer modalidade descrita neste documento como "exemplar" não deve necessariamente ser interpretada como preferencial ou vantajosa em relação a outras modalidades.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[00105] A presente invenção se refere, pelo menos em parte, a novos glicosídeos de esteviol, R7-2, R6-2A, R6-2B, R6-1, R6-4A e R6-4B e métodos de produção desses novos glicosídeos de esteviol, tais como através conversão enzimática. As estruturas químicas podem ser confirmadas por LC MS e análise de NMR. R6-1, R6-2A, R6-62B, R6-4A e R6-4B contêm 6 grupos glicosil e R7-2 contém 7 grupos glicosil. Síntese Precursora
[00106] Como afirmado previamente, os glicosídeos de esteviol são os compostos químicos responsáveis pelo gosto doce das folhas da planta sul-americana Stevia rebaudiana (Asteraceae) e da planta Rubus chingii (Rosaceae). Esses compostos são diterpenos glicosilados. Especificamente, suas moléculas podem ser vistas como uma molécula de esteviol, com seu átomo de hidrogênio hidroxil substituído por uma molécula de glicose para formar um éster e um hidrogênio hidroxil com combinações de glicose e ramnose para formar um acetal.
[00107] Um método para fazer os compostos de interesse na atual invenção é tomar precursores comuns ou econômicos, tal como esteviol, esteviosídeo, Reb E, Reb D ou rubusosídeo, tais como derivados quimicamente ou produzidos por meio de biossíntese em micróbios manipulados, tais como bactérias e/ou levedura e para sintetizar glicosídeos de esteviol alvo, tal como por meio de métodos conhecidos ou econômicos, tais como Reb D3 e Z.
[00108] Aspectos da presente invenção referem-se a métodos envolvendo enzimas que expressam de maneira recombinante em um sistema microbiano capaz de produzir esteviol. Em geral, tais enzimas podem incluir: copalildifosfato sintase (CPS), um caureno sintase (KS) e uma enzima geranilgeranil difosfato síntase (GGPPS). Preferencialmente, em algumas modalidades, isso ocorre em uma cepa microbiana que expressa uma via de síntese de isoprenóide endógena, tais como a via de não mevalonato (MEP) ou a via do ácido mevalônico (MVA). Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a célula é uma célula bacteriana, tais como E. coli ou uma célula de levedura, tais como uma célula de Saccharomyces, célula de
Pichia ou uma célula de Yarrowia. Em algumas modalidades, de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a célula é uma célula de algas ou uma célula vegetal.
[00109] Posteriormente, o precursor pode ser recuperado da cultura de fermentação e usado na síntese química. Tipicamente, este é o esteviol, embora possa ser caureno ou um glicosídeo de esteviol da cultura de células. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidas neste documento, o esteviol, caureno e/ou glicosídeos de esteviol são recuperados da fase gasosa, enquanto em outras modalidades, uma camada orgânica ou resina polimérica é adicionada à cultura de células e o caureno, o esteviol e/ou glicosídeos de esteviol são recuperados da camada orgânica ou resina polimérica. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, o glicosídeo de esteviol é selecionado a partir de rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo B, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo F ou dulcosídeo A. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, o terpenóide produzido é esteviobiosídeo ou esteviosídeo. Também deve ser apreciado que em algumas modalidades, pelo menos uma etapa enzimática, tal como uma ou mais etapas de glicosilação, são realizadas ex vivo.
[00110] Conforme descrito neste documento, as enzimas usadas nos métodos descritos neste documento têm atividades UDP- glicosiltransferase e são úteis para o desenvolvimento de métodos biossintéticos para a preparação de glicosídeos de esteviol que não estão presentes na natureza ou tipicamente de baixa abundância em fontes naturais, tais como rebaudiosídeo R6-1, R2-2A, R6-2B, R6-4A, R6-4B e R7- 2, respectivamente.
[00111] O substrato pode ser qualquer composto natural ou sintético capaz de ser convertido em um composto de glicosídeo de esteviol em uma reação catalisada por uma ou mais UDP-glicosiltransferases. Por exemplo, o substrato pode ser extrato natural de estévia, esteviol, esteviol- 13-O-glicosídeo, esteviol-19-O-glicosídeo, 2-biosídeo, rubusosídeo, esteviosídeo, rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo D3, rebaudiosídeo Z1, rebaudiosídeo Z2 ou rebaudiosídeo E. O substrato pode ser um composto puro ou uma mistura de diferentes compostos.
[00112] Também é descrito neste documento um sistema de reação de acoplamento no qual as enzimas (por exemplo, UDP transferases) descritas neste documento podem funcionar em combinação com uma ou mais enzimas adicionais (por exemplo, sacarose sintase) para aprimorar a eficiência ou modificar o resultado da biossíntese geral de compostos de glicosídeo de esteviol. Por exemplo, a enzima adicional pode regenerar a UDP-glicose necessária para a reação de glicosilação, pela conversão do UDP produzido a partir da reação de glicosilação de volta em UDP-glicose (usando, por exemplo, sacarose como um doador do resíduo de glicose), aprimorando assim a eficiência da reação de glicosilação.
[00113] A sacarose sintase catalisa a reação química entre UDP- glicose e D-frutose para produzir UDP e sacarose. A sacarose sintase é uma glicosiltransferase. O nome sistemático desta classe de enzimas é UDP-glicose: D-frutose 2-alfa-D-glicosiltransferase. Outros nomes de uso comum incluem UDP glicose-frutose glicosiltransferase, sacarose sintetase, sacarose-UDP glicosiltransferase, sacarose-uridina difosfato glicosiltransferase e uridina difosfoglicose-frutose glicosiltransferase. A adição da sacarose sintase à mistura de reação que inclui uma uridina difosfoglicosiltransferase cria um "sistema de acoplamento UGT-SUS". No sistema de acoplamento UGT-SUS, UDP-glicose pode ser regenerada a partir de UDP e sacarose, o que permite omitir a adição de UDP-glicose extra à mistura de reação ou usar UDP na mistura de reação.
[00114] Sacarose sintase adequada para uso nos métodos descritos neste documento incluem sacarose sintase I de Arabidopsis,
sacarose sintase 3 de Arabidopsis e sacarose sintase de Vigna radiate. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a sacarose sintase ou domínio de sacarose sintetase é uma sacarose sintase I de Arabidopsis thaliana.
[00115] A UDP-glicosiltransferase adequada inclui qualquer UGT conhecido na técnica como capaz de catalisar uma ou mais reações na biossíntese de compostos de glicosídeo de esteviol, tais como UGT85C2, UGT74G1, HV1, UGT76G1 ou homólogos funcionais dos mesmos. Em algumas modalidades, a UDP-glicotransferase usada em qualquer um dos métodos, descritos neste documento, é UGT76G1. Em algumas modalidades, a UDP-glicotransferase usada em qualquer um dos métodos, descritos neste documento, é uma enzima de fusão UGT76G1-sacarose sintase. Em algumas modalidades, a UDP-glicotransferase usada em qualquer um dos métodos, descritos neste documento, é HV1 UTG. Em algumas modalidades, a UDP-glicotransferase usada em qualquer um dos métodos, descritos neste documento, é uma enzima de fusão HV1 UGT- sacarose sintase.
[00116] O DNA recombinante padrão e técnicas de clonagem molecular usadas neste documento são bem conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, por Sambrook, J., Fritsch, E.F. e Maniatis, T. Molecular CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2° ed.; Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY, 1989 (doravante “Maniatis”); e por Silhavy, T.J., Bennan, M.L. e Enquist, L.W. EXPERIMENTS WITH GENE FUSIONS; Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, N.Y., 1984; e por Ausubel, F.M. et al., IN CURRENT PROTOCOLS MOLECULAR BIOLOGY, publicado por Greene Publishing e Wiley-Interscience, 1987; (a totalidade de cada um dos quais é por meio deste instrumento incorporada por referência neste documento).
[00117] A menos que definidos de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado que comumente entendido por alguém versado na técnica a qual a divulgação pertence. Embora quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos neste documento possam ser usados na prática ou teste da presente divulgação, os materiais e métodos preferenciais são descritos neste documento.
[00118] A divulgação será mais completamente entendida mediante a consideração dos seguintes Exemplos não limitantes. Deve ser entendido que estes Exemplos, enquanto indicam modalidades preferenciais da tecnologia em questão, são dados a título de ilustração apenas. A partir da discussão acima e destes Exemplos, um versado na técnica pode averiguar as características essenciais da tecnologia em questão, e sem partir do espírito e o escopo da mesma, pode fazer várias alterações e modificações da tecnologia em questão para adaptá-la para vários usos e condições.
[00119] A glicosilação é geralmente considerada uma reação onipresente que controla a bioatividade e o armazenamento de produtos naturais de plantas. A glicosilação de pequenas moléculas é catalisada por uma superfamília de transferases na maioria das espécies de plantas que foram estudadas até o momento. Essas glicosiltransferases (GTS) foram classificadas em mais de 60 famílias. Dentre estas, as enzimas GT da família 1, também conhecidas como UDP glicosiltransferases (UGTs) e UDP-ramnosiltransferase, transferem porções de açúcar para moléculas aceitadoras específicas. Essas são as moléculas que transferem tais porções de açúcar nos glicosídeos de esteviol para ajudar a criar vários rebaudiosídeos. Cada uma dessas enzimas tem seu próprio perfil de atividade e localizações de estrutura preferenciais para onde transferem suas porções de açúcar ativadas. Rebaudiosídeo Sintético R6-2A e R6-2B e métodos de produção
[00120] Alguns aspectos da presente divulgação fornecem um adoçante (por exemplo, não calórico e/ou sintético) que recebeu o nome de
"Rebaudiosídeo R6-2A (Reb R6-2A)." O rebaudiosídeo R6-2A tem a fórmula molecular de C56H90O33 e tem a estrutura de:
[00121] Alguns aspectos da presente divulgação fornecem um adoçante (por exemplo, não calórico e/ou sintético) que recebeu o nome de "Rebaudiosídeo R6-2B (Reb R6-2B)." O rebaudiosídeo R6-2B tem a fórmula molecular de C56H90O33 e tem a estrutura de:
[00122] Alguns aspectos da presente divulgação fornecem métodos de produção de rebaudiosídeo R6-2A e/ou rebaudiosídeo R6-2B. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, o rebaudiosídeo R6-2A e/ou rebaudiosídeo R6-2B é produzido a partir do rebaudiosídeo D3. Por exemplo, em algumas modalidades, o método compreende (I) preparar uma mistura de reação compreendendo: (i) rebaudiosídeo D3; (ii) um ou mais substratos selecionados a partir do grupo que consiste em sacarose, difosfato de uridina (UDP), difosfato de uridina-glicose (UDP-glicose) e combinações dos mesmos; e (iii) uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) uma UDP-glicosiltransferase (UGT); (b) uma UDP- glicosiltransferase e uma sacarose sintase adicionadas separadamente à mistura de reação; e (c) uma enzima de fusão UDP-glicosiltransferase compreendendo um domínio UDP-glicosiltransferase acoplado a um domínio de sacarose sintase; e (Il) incubar a mistura de reação por um tempo suficiente para produzir rebaudiosídeo R6-2A e/ou R6-2B.
[00123] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, uma glicose é covalentemente acoplada ao rebaudiosídeo D3 pela enzima para produzir rebaudiosídeo R6-2A e/ou R6-2B. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a glicose é covalentemente acoplada ao açúcar I do rebaudiosídeo D3 pela enzima para produzir rebaudiosídeo R6-2A. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a glicose é covalentemente acoplada ao açúcar II do rebaudiosídeo D3 pela enzima para produzir rebaudiosídeo R6-2B. A Figura 2 ilustra a numeração de açúcares no rebaudiosídeo D3, R6-2A e R6-2B.
[00124] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a enzima para a produção de um rebaudiosídeo R6-2A e/ou R6-2B a partir de rebaudiosídeo D3 compreende uma UDP-glicosiltransferase (UGT). Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, o UGT é uma uridina difosfoglicosiltransferase (por exemplo, UGT76G1 ou uma variante funcional da mesma). A UGT76G1 é uma UGT com uma atividade de glicosilação 1,3-13-O-glicose. Também foi mostrado que UGT76G1 tem atividade de glicosilação de 1,3-19-O-glicose. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a UGT76G1 é pelo menos 70% (por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%) idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a UGT76G1 é pelo menos? 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a UGT76G1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a UGT76G1 consiste essencialmente em, ou consiste na, sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
[00125] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a enzima para produzir um rebaudiosídeo R6-2A e/ou R6-2B a partir de rebaudiosídeo D3 compreende uma UDP-glicosiltransferase (UGT) e uma sacarose sintase adicionada separadamente à mistura de reação. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a UGT é UGT76G1 e variantes conforme descrito neste documento e a sacarose sintase é selecionada a partir do grupo que consiste em uma sacarose sintase I de Arabidopsis, uma sacarose sintase 3 de Arabidopsis e uma sacarose sintase de Vigna radiate. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a sacarose sintase ou domínio de sacarose sintase é uma sacarose sintase I de Arabidopsis thaliana. Em algumas modalidades, a sacarose sintase I de
Arabidopsis thaliana é de pelo menos 70% (por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%) idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9. Em algumas modalidades, a sacarose sintase I de Arabidopsis thaliana varia em pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a sacarose sintase I de Arabidopsis thaliana compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a sacarose sintase I de Arabidopsis thaliana consiste essencialmente em, ou consiste na, sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9.
[00126] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a enzima para produzir um rebaudiosídeo R6-2A e/ou R6-2B a partir de rebaudiosídeo D3 compreende uma enzima de fusão UDP-glicosiltransferase compreendendo um domínio UDP-glicosiltransferase acoplado a um domínio de sacarose sintase. A enzima de fusão tem a atividade da UDP-glicosiltransferase e da sacarose sintase. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, o domínio UDP- glicosiltransferase na enzima de fusão é qualquer uma das UGT76G1 e variantes, conforme descrito neste documento, e o domínio de sacarose sintase é qualquer uma das sacaroses sintases (por exemplo, uma sacarose sintase I de Arabidopsis, uma sacarose sintase 3 de Arabidopsis ou uma sacarose sintase de Vigna radiate) e variantes, conforme descrito neste documento. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a enzima de fusão é pelo menos 70% (por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos
80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%) idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a enzima de fusão varia em pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a enzima de fusão compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a enzima de fusão consiste essencialmente em, ou consiste na, sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.
[00127] Em algumas modalidades, qualquer um dos métodos de produção de rebaudiosídeo R6-2A e/ou R6-2B descritos neste documento compreende adicionalmente uma etapa de produção de rebaudiosídeo D3. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos fornecidos neste documento, o rebaudiosídeo D3 pode ser produzido incubando o rebaudiosídeo E com uma UDP-glicotransferase com um substrato selecionado a partir do grupo que consiste em sacarose, UDP, UDP-glicose e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos fornecidos neste documento, a UDP-glicotransferase usada para produzir rebaudiosídeo D3 a partir de rebaudiosídeo E é EUGT11. Métodos de produção de rebaudiosídeo D3 a partir de rebaudiosídeo E são descritos na Patente dos EUA N° US9765104, e tais métodos são incorporados neste documento por referência. O rebaudiosídeo D3 tem a estrutura de:
[00128] Em algumas modalidades, qualquer um dos métodos de produção de rebaudiosídeo R6-2A e/ou R6-2B descritos neste documento compreende adicionalmente isolar o rebaudiosídeo R6-2A e/ou R6-2B produzido. Rebaudiosídeo Sintético R7-2 e métodos de produção
[00129] Alguns aspectos da presente divulgação fornecem um adoçante (por exemplo, não calórico e/ou sintético) que recebeu o nome de "Rebaudiosídeo R7-2 (Reb R7-2)." O Reb R7-2 composto é um glicosídeo de esteviol com quatro porções de glicosil anexadas a hidroxil C-13, das quais três estão anexadas na forma de um éter como um substituinte glicotriosil 2,3-ramificada; e outra porção de glicotriosil 2,3-ramificada em C- 19 como um éster.
[00130] Rebaudiosídeo R7-2 tem a fórmula molecular de C62H100O38 e tem a estrutura de:
[00131] Alguns aspectos da presente divulgação fornecem métodos de produção de rebaudiosídeo R7-2. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos fornecidos, o rebaudiosídeo R7-2 é produzido a partir de um ou mais dentre rebaudiosídeo D3, rebaudiosídeo R6-2A e rebaudiosídeo R6-2B. A mistura de reação para produzir rebaudiosídeo R7- 2 pode ser a mesma que a mistura de reação para produzir rebaudiosídeo R6-2A e/ou R6-2B. A glicose pode ser covalentemente acoplada ao rebaudiosídeo D3 pela enzima para produzir rebaudiosídeo R6-2A e/ou R6- 2B. A enzima pode adicionalmente acoplar covalentemente uma segunda glicose ao rebaudiosídeo R6-2A e/ou R6-2B, produzindo rebaudiosídeo R7-
2. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, uma glicose é covalentemente acoplada a cada um dentre o açúcar I e açúcar II do rebaudiosídeo D3 pela enzima para produzir rebaudiosídeo R7-2. A Figura 2 ilustra a numeração de açúcares em rebaudiosídeo D3 e rebaudiosídeo R7-2.
[00132] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos fornecidos, o método compreende (I) preparar uma mistura de reação compreendendo: (i) um ou mais dentre rebaudiosídeo D3, rebaudiosídeo
R6-2A e rebaudiosídeo R6-2B; (ii) um ou mais substratos selecionados a partir do grupo que consiste em sacarose, difosfato de uridina (UDP), difosfato de uridina-glicose (UDP-glicose) e combinações dos mesmos; e (iii) uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) uma UDP-glicosiltransferase (UGT); (b) uma UDP-glicosiltransferase e uma sacarose sintase adicionadas separadamente à mistura de reação; e (c) uma enzima de fusão UDP-glicosiltransferase compreendendo um domínio UDP-glicosiltransferase acoplado a um domínio de sacarose sintase; e (Il) incubar a mistura de reação por um tempo suficiente para produzir rebaudiosídeo R7-2.
[00133] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a enzima para a produção de um rebaudiosídeo R7-2 a partir de rebaudiosídeo D3 compreende uma UDP-glicosiltransferase (UGT). Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a UGT é uma uridina difosfoglicosiltransferase (por exemplo, UGT76G1 ou uma variante funcional da mesma). A UGT76G1 é uma UGT com uma atividade de glicosilação 1,3-13-O-glicose. Também foi mostrado que UGT76G1 tem atividade de glicosilação de 1,3-19-O-glicose. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a UGT76G1 é pelo menos 70% (por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%) idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a UGT76G1 varia em pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a UGT76G1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a UGT76G1 consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
[00134] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a enzima para produzir um rebaudiosídeo R7-2 a partir de rebaudiosídeo D3 compreende uma UDP- glicosiltransferase (UGT) e uma sacarose sintase adicionada separadamente à mistura de reação. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a UGT é UGT76G1 e variantes conforme descrito neste documento e a sacarose sintase é selecionada a partir do grupo que consiste em uma sacarose sintase I de Arabidopsis, uma sacarose sintase 3 de Arabidopsis e uma sacarose sintase de Vigna radiate. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a sacarose sintase ou domínio de sacarose sintase é uma sacarose sintase I de Arabidopsis thaliana. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a sacarose sintase I de Arabidopsis thaliana é de pelo menos 70% (por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%) idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a sacarose sintase I de Arabidopsis thaliana varia em pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a sacarose sintase I de Arabidopsis thaliana compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a sacarose sintase I de Arabidopsis thaliana consiste essencialmente em, ou consiste na, sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9.
[00135] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a enzima para produzir um rebaudiosídeo R7-2 a partir de rebaudiosídeo D3 compreende uma enzima de fusão UDP-glicosiltransferase compreendendo um domínio UDP- glicosiltransferase acoplado a um domínio de sacarose sintase. A enzima de fusão tem a atividade da UDP-glicosiltransferase e da sacarose sintase. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, o domínio UDP-glicosiltransferase na enzima de fusão é qualquer uma das UGT76G1 e variantes, conforme descrito neste documento, e o domínio de sacarose sintase é qualquer uma das sacaroses sintases (por exemplo, uma sacarose sintase I de Arabidopsis, uma sacarose sintase 3 de Arabidopsis ou uma sacarose sintase de Vigna radiate) e variantes, conforme descrito neste documento. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a enzima de fusão é pelo menos 70% (por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%) idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a enzima de fusão varia em pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a enzima de fusão compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a enzima de fusão consiste essencialmente em, ou consiste na, sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.
[00136] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, os métodos de produção de rebaudiosídeo R7-2 descritos neste documento compreendem adicionalmente uma etapa de produção de rebaudiosídeo D3. Em algumas modalidades, o rebaudiosídeo D3 pode ser produzido pela incubação do rebaudiosídeo E com uma UDP-glicotransferase com um substrato selecionado a partir do grupo que consiste em sacarose, UDP, UDP-glicose e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos fornecidos neste documento, a UDP-glicotransferase usada para produzir rebaudiosídeo D3 a partir de rebaudiosídeo E é EUGT11. Métodos de produção de rebaudiosídeo D3 a partir de rebaudiosídeo E são descritos na Patente dos EUA N° US9765104, tais métodos são incorporados neste documento por referência. O rebaudiosídeo D3 tem a estrutura de:
[00137] Em algumas modalidades, qualquer um dos métodos de produção de rebaudiosídeo R7-2 descrito neste documento compreende adicionalmente isolar o rebaudiosídeo R7-2 produzido. Rebaudiosídeo Sintético R6-4A e R6-4B e métodos de produção
[00138] Alguns aspectos da presente divulgação fornecem um adoçante (por exemplo, não calórico e/ou sintético) que recebeu o nome de "Rebaudiosídeo R6-4A (Reb R6-4A)." O rebaudiosídeo R6-4A tem a fórmula molecular de C56H90O33 e tem a estrutura de:
[00139] Alguns aspectos da presente divulgação fornecem um adoçante (por exemplo, não calórico e/ou sintético) que recebeu o nome de "Rebaudiosídeo R6-4B (Reb R6-4B)." O rebaudiosídeo R6-4B tem a fórmula molecular de C56H90O33 e tem a estrutura de:
[00140] Alguns aspectos da presente divulgação fornecem métodos de produção de rebaudiosídeo R6-4A.
Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos fornecidos, o rebaudiosídeo R6-4A é produzido a partir de rebaudiosídeo Z1 ou rebaudiosídeo Z2. Por exemplo, em algumas modalidades, o método compreende (I) preparar uma mistura de reação compreendendo: (i) rebaudiosídeo Z1 ou rebaudiosídeo Z2; (ii) um ou mais substratos selecionados a partir do grupo que consiste em sacarose, difosfato de uridina (UDP), difosfato de uridina-glicose (UDP- glicose) e combinações dos mesmos; e (iii) uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) uma UDP-glicosiltransferase (UGT); (b) uma UDP-glicosiltransferase e uma sacarose sintase adicionadas separadamente à mistura de reação; e (c) uma enzima de fusão UDP- glicosiltransferase compreendendo um domínio UDP-glicosiltransferase acoplado a um domínio de sacarose sintase; e (Il) incubar a mistura de reação por um tempo suficiente para produzir rebaudiosídeo R6-4A.
[00141] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, uma glicose é covalentemente acoplada ao rebaudiosídeo Z1 ou rebaudiosídeo Z2 pela enzima para produzir rebaudiosídeo R6-4A. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a glicose é covalentemente acoplada ao açúcar IV do rebaudiosídeo Z1 pela enzima para produzir rebaudiosídeo R6-4A. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a glicose é covalentemente acoplada ao açúcar III do rebaudiosídeo Z2 pela enzima para produzir rebaudiosídeo R6-4A. A Figura 14 ilustra a numeração de açúcares no rebaudiosídeo Z1, Z2 e R6-4A.
[00142] Alguns aspectos da presente divulgação fornecem métodos de produção de rebaudiosídeo R6-4B. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos fornecidos, o rebaudiosídeo R6-4B é produzido a partir de rebaudiosídeo Z2. Por exemplo, em algumas modalidades, o método compreende (I) preparar uma mistura de reação compreendendo: (i) rebaudiosídeo Z2; (ii) um ou mais substratos selecionados a partir do grupo que consiste em sacarose, difosfato de uridina (UDP), difosfato de uridina-glicose (UDP-glicose) e combinações dos mesmos; e (iii) uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) uma UDP-glicosiltransferase (UGT); (b) uma UDP- glicosiltransferase e uma sacarose sintase adicionadas separadamente à mistura de reação; e (c) uma enzima de fusão UDP-glicosiltransferase compreendendo um domínio UDP-glicosiltransferase acoplado a um domínio de sacarose sintase; e (Il) incubar a mistura de reação por um tempo suficiente para produzir rebaudiosídeo R6-4B.
[00143] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, uma glicose é covalentemente acoplada ao rebaudiosídeo Z2 pela enzima para produzir rebaudiosídeo R6-4B. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a glicose é covalentemente acoplada ao açúcar V do rebaudiosídeo Z2 pela enzima para produzir rebaudiosídeo R6-4B. A Figura 14 ilustra a numeração de açúcares no rebaudiosídeo Z2 e R6-4B.
[00144] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a enzima para a produção de um rebaudiosídeo R6-4A e/ou R6-4B a partir de rebaudiosídeo Z1 ou Z2 compreende uma UDP-glicosiltransferase (UGT). Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a UGT é uma HV1 glicosiltransferase. HV1 é uma UGT com atividade de glicosilação a 1 a 1,2-19-O-glicose. Também foi mostrado que HV1 UGT tem atividade de glicosilação de 1,2-19-O-glicose. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a HV1 UGT é pelo menos 70% (por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%) idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a HV1 UGT varia em pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a HV1 UGT compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a HV1 UGT consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.
[00145] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos fornecidos neste documento, a enzima para produzir um rebaudiosídeo R6- 4A e/ou R6-4B a partir de rebaudiosídeo Z1 ou Z2 compreende uma UDP-
glicosiltransferase (UGT) e uma sacarose sintase adicionada separadamente à mistura de reação. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a UGT é HV1 UGT e variantes conforme descrito neste documento e a sacarose sintase é selecionada a partir do grupo que consiste em uma sacarose sintase I de Arabidopsis, uma sacarose sintase 3 de Arabidopsis e uma sacarose sintase de Vigna radiate. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a sacarose sintase ou domínio de sacarose sintase é uma sacarose sintase I de Arabidopsis thaliana. Em algumas modalidades, a sacarose sintase I de Arabidopsis thaliana é de pelo menos 70% (por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%) idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a sacarose sintase I de Arabidopsis thaliana varia em pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a sacarose sintase I de Arabidopsis thaliana compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a sacarose sintase I de Arabidopsis thaliana consiste essencialmente em, ou consiste na, sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9.
[00146] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos fornecidos neste documento, a enzima para produzir um rebaudiosídeo R6- 4A ou R6-4B a partir de rebaudiosídeo Z1 ou Z2 compreende uma enzima de fusão UDP-glicosiltransferase compreendendo um domínio UDP- glicosiltransferase acoplado a um domínio de sacarose sintase. A enzima de fusão tem a atividade da UDP-glicosiltransferase e da sacarose sintase. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, o domínio UDP-glicosiltransferase na enzima de fusão é qualquer um dos HV1 UGT e variantes conforme descrito neste documento e o domínio de sacarose sintase é qualquer uma das sacaroses sintases (por exemplo, uma sacarose sintase I de Arabidopsis, uma sacarose sintase 3 de Arabidopsis ou uma sacarose sintase de Vigna radiate) e variantes conforme descrito neste documento. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a enzima de fusão é pelo menos 70% (por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%) idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a enzima de fusão varia em pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a enzima de fusão compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a enzima de fusão consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7.
[00147] Em algumas modalidades, qualquer um dos métodos de produção de rebaudiosídeo R6-4A e/ou R6-4B descritos neste documento compreende adicionalmente uma etapa de produção de rebaudiosídeo Z1 e/ou Z2. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos fornecidos neste documento, o rebaudiosídeo Z1 e/ou Z2 pode ser produzido incubando o rebaudiosídeo E com uma UDP-glicosiltransferase com um substrato selecionado a partir do grupo que consiste em sacarose, UDP,
UDP-glicose e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a UDP-glicotransferase usada para produzir rebaudiosídeo Z1 e/ou Z2 a partir de rebaudiosídeo E é UGT76G1. Métodos de produção de rebaudiosídeo D3 a partir de rebaudiosídeo E são descritos na Patente dos EUA N° US10081826, tais métodos incorporados a este documento por referência.
[00148] O rebaudiosídeo Z1 tem a estrutura de:
[00149] O rebaudiosídeo Z2 tem a estrutura de:
[00150] Em algumas modalidades, qualquer um dos métodos de produção de rebaudiosídeo R6-4A e/ou R6-4B descritos neste documento compreende adicionalmente isolar o rebaudiosídeo R6-4A e/ou R6-4B produzido. Rebaudiosídeo Sintético R6-1 e métodos de produção
[00151] Alguns aspectos da presente divulgação fornecem um adoçante (por exemplo, não calórico e/ou sintético) que recebeu o nome de "Rebaudiosídeo R6-1 (Reb R6-1)". O rebaudiosídeo R6-1 tem a fórmula molecular de C56H90O33 e tem a estrutura de:
[00152] Alguns aspectos da presente divulgação fornecem métodos de produção de rebaudiosídeo R6-1. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos fornecidos neste documento, o rebaudiosídeo R6-1 é produzido a partir de rebaudiosídeo D. Por exemplo, em algumas modalidades, o método compreende (I) preparar uma mistura de reação compreendendo: (i) rebaudiosídeo D; (ii) um ou mais substratos selecionados a partir do grupo que consiste em sacarose, difosfato de uridina (UDP), difosfato de uridina-glicose (UDP-glicose) e combinações dos mesmos; e (iii) uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) uma UDP-glicosiltransferase (UGT); (b) uma UDP- glicosiltransferase e uma sacarose sintase adicionadas separadamente à mistura de reação; e (c) uma enzima de fusão UDP-glicosiltransferase compreendendo um domínio UDP-glicosiltransferase acoplado a um domínio de sacarose sintase; e (Il) incubar a mistura de reação por um tempo suficiente para produzir rebaudiosídeo R6-1.
[00153] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, uma glicose é covalentemente acoplada ao rebaudiosídeo D pela enzima para produzir rebaudiosídeo R6-1. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a glicose é covalentemente acoplada ao açúcar V do rebaudiosídeo D pela enzima para produzir rebaudiosídeo R6-1. A Figura 9 ilustra a numeração de açúcares no rebaudiosídeo D e R6-1.
[00154] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos fornecidos neste documento, a enzima para a produção de um rebaudiosídeo R6-1 a partir de rebaudiosídeo D compreende uma UDP- glicosiltransferase (UGT). Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a UGT é uma HV1 glicosiltransferase. HV1 é uma UGT com atividade de glicosilação a 1 a 1,2- 19-O-glicose. Também foi mostrado que HV1 UGT tem atividade de glicosilação de 1,2-19-O-glicose. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a HV1 UGT é pelo menos 70% (por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%) idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a HV1 UGT varia em pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a HV1 UGT compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a HV1 UGT consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.
[00155] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos fornecidos neste documento, a enzima para produzir um rebaudiosídeo R6- 1 a partir de rebaudiosídeo D compreende uma UDP-glicosiltransferase (UGT) e uma sacarose sintase adicionada separadamente à mistura de reação. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a UGT é HV1 UGT e variantes conforme descrito neste documento e a sacarose sintase é selecionada a partir do grupo que consiste em uma sacarose sintase I de Arabidopsis, uma sacarose sintase 3 de Arabidopsis e uma sacarose sintase de Vigna radiate. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a sacarose sintase ou domínio de sacarose sintase é uma sacarose sintase I de Arabidopsis thaliana. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a sacarose sintase I de Arabidopsis thaliana é de pelo menos 70% (por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%) idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a sacarose sintase I de Arabidopsis thaliana varia em pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a sacarose sintase I de Arabidopsis thaliana compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a sacarose sintase I de Arabidopsis thaliana consiste essencialmente em, ou consiste na, sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9.
[00156] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos fornecidos neste documento, a enzima para produzir um rebaudiosídeo R6-
1 a partir de rebaudiosídeo D compreende uma enzima de fusão UDP- glicosiltransferase compreendendo um domínio UDP-glicosiltransferase acoplado a um domínio de sacarose sintase. A enzima de fusão tem a atividade da UDP-glicosiltransferase e da sacarose sintase. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, o domínio UDP-glicosiltransferase na enzima de fusão é qualquer um dos HV1 UGT e variantes conforme descrito neste documento e o domínio de sacarose sintase é qualquer uma das sacaroses sintases (por exemplo, uma sacarose sintase I de Arabidopsis, uma sacarose sintase 3 de Arabidopsis ou uma sacarose sintase de Vigna radiate) e variantes conforme descrito neste documento. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a enzima de fusão é pelo menos 70% (por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%) idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a enzima de fusão varia em pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a enzima de fusão compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições fornecidos neste documento, a enzima de fusão consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7.
[00157] Em algumas modalidades, qualquer um dos métodos de produção de rebaudiosídeo R6-1 descritos neste documento compreende adicionalmente uma etapa de produção de rebaudiosídeo D. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos fornecidos, o rebaudiosídeo D pode ser produzido incubando rebaudiosídeo A com uma UDP- glicotransferase com e um substrato selecionado a partir do grupo que consiste em sacarose, UDP, UDP-glicose e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos fornecidos, a UDP- glicotransferase usada para produzir rebaudiosídeo D a partir de rebaudiosídeo A é EUGT11. Os métodos de produção de rebaudiosídeo D a partir de rebaudiosídeo A, são descritos na Publicação do Pedido de Patente U.S. No. US20180037600, tais métodos são incorporados a este documento por referência.
[00158] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos fornecidos neste documento, o rebaudiosídeo D pode ser produzido incubando o rebaudiosídeo E com uma UDP-glicotransferase com um substrato selecionado a partir do grupo que consiste em sacarose, UDP, UDP-glicose e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos fornecidos, a UDP-glicotransferase usada para produzir rebaudiosídeo D a partir de rebaudiosídeo E é HV1 UGT ou UGT76G1. Os métodos de produção de rebaudiosídeo D a partir de rebaudiosídeo E são descritos na Publicação do Pedido de Patente U.S. No. Patente U.S. No. 10253344, tais métodos são incorporados a este documento por referência.
[00159] O rebaudiosídeo D tem a estrutura de:
[00160] Em algumas modalidades, qualquer um dos métodos de produção de rebaudiosídeo R6-1 descritos neste documento compreende adicionalmente isolar o rebaudiosídeo R6-1 de produção. Misturas de Reação. Ácidos Nucléicos e Sistemas Celulares
[00161] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos fornecidos, a mistura de reação é in vitro, isto é, o método descrito neste documento é realizado in vitro. Para reações in vitro, enzimas isoladas (por exemplo, UDP-glicosiltransferase, a sacarose sintase e/ou as enzimas de fusão UDP-glicosiltransferase) podem ser adicionadas à mistura de reação in vitro.
[00162] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos fornecidos, a mistura de reação é uma mistura de reação baseada em células, isto é, a reação é realizada em uma célula. Para reações baseadas em células, as enzimas (por exemplo, UDP-glicosiltransferase, a sacarose sintase e/ou as enzimas de fusão UDP-glicosiltransferase) são expressas em uma célula hospedeira.
[00163] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos fornecidos, as enzimas (por exemplo, UDP-glicosiltransferase, a sacarose sintase e/ou as enzimas de fusão UDP-glicosiltransferase) são expressas a partir de sequências de nucleotídeos que as codificam, respectivamente. Como tal, ácidos nucleicos que codificam qualquer uma das enzimas descritas neste documento são fornecidos. A presente divulgação fornece adicionalmente células hospedeiras compreendendo uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 80% (por exemplo, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, em pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%) de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 e 10. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos fornecidos, a célula hospedeira compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 80% (por exemplo, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96% , pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%) de identidade com a SEQ ID NO: 2 e uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 80% (por exemplo, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%) de identidade com a SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos fornecidos, a célula hospedeira compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 80% (por exemplo, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%) de identidade com a SEQ ID NO: 4 e uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 80% (por exemplo, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%) de identidade com a SEQ ID NO: 10.
[00164] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos fornecidos, a célula hospedeira é selecionada a partir do grupo que consiste em uma levedura, uma planta não produtora de glicosídeo de esteviol, uma alga, um fungo e uma bactéria.
[00165] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos fornecidos, a célula hospedeira é selecionada a partir do grupo que consiste em Escherichia; Salmonella; Bacillus; Acinetobacter; Streptomyces; Corynebacterium; Methylosinus; Methylomonas; Rhodococcus; Pseudomonas; Rhodobacter; Synechocystis; Saccharomyces; Zygosaccharomyces; Kluyveromyces; Candida; Hansenula; Debaryomyces; Mucor; Pichia; Torulopsis; Aspergillus; Arthrobotlys; Brevibacteria; Microbacterium; Arthrobacter; Citrobacter; Klebsiella; Pantoea; e Clostridium Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos fornecidos, a célula hospedeira é uma célula bacteriana (por exemplo, uma célula de E. coli). Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos fornecidos, a célula hospedeira é uma célula de levedura (por exemplo, uma célula de Saccharomyces cerevisiae).
[00166] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos fornecidos, a célula hospedeira é uma célula isolada de plantas selecionadas a partir do grupo que consiste em soja; canola; girassol; algodão; milho; tabaco; alfafa; trigo; cevada; aveia; sorgo; arroz; brócolis; couve-flor; repolho; nabos; melões; cenouras; aipo; salsa; tomates; batatas; morangos; amendoins; uvas; lavouras de sementes de gramíneas; beterraba sacarina; cana de açúcar; feijões; ervilhas; centeio; linho; árvores de madeira dura; árvores de madeira macia; gramíneas forrageiras; Arabidopsis thaliana; arroz (Oryza sativa); Hordeum vulgare; switchgrass (Panicum vigratum); Brachypodium spp.; Brassica spp.; e Crambe abyssinica.
[00167] A expressão de proteínas em procariotas é mais frequentemente desenvolvida em uma célula hospedeira bacteriana com vetores contendo promotores constitutivos ou induzíveis que direcionam a expressão seja de proteínas de fusão ou de não fusão. Os vetores de fusão adicionam uma série de aminoácidos a uma proteína codificada nele, geralmente ao terminal amino da proteína recombinante. Tais vetores de fusão tipicamente servem para três propósitos: 1) elevar a expressão de proteína recombinante; 2) elevar a solubilidade da proteína recombinante; e 3) auxiliar a purificação da proteína recombinante atuando como um ligante na purificação por afinidade. Frequentemente, um sítio de clivagem proteolítica é introduzido à junção da porção de fusão e a proteína recombinante para permitir a separação da proteína recombinante da porção de fusão subsequente à purificação da proteína de fusão. Tais vetores estão dentro do escopo da presente divulgação.
[00168] Em uma modalidade, o vetor de expressão inclui aqueles elementos genéticos para a expressão do polipeptídeo recombinante em células bacterianas. Os elementos para transcrição e tradução na célula bacteriana podem incluir um promotor, uma região de codificação para o complexo de proteína e um terminador transcricional.
[00169] Um versado na técnica estará ciente das técnicas de biologia molecular disponíveis para a preparação de vetores de expressão. O polinucleotídeo usado para incorporação no vetor de expressão da tecnologia em questão, conforme descrito acima, pode ser preparado por técnicas de rotina, tal como reação em cadeia da polimerase (PCR).
[00170] Várias técnicas de biologia molecular podem ser desenvolvidas para ligar operacionalmente o DNA a vetores por meio de terminais coesivos complementares. Em uma modalidade, tratos de homopolímero complementares podem ser adicionados à molécula de ácido nucleico a ser inserida no DNA do vetor. O vetor e a molécula de ácido nucleico são então juntados por vinculação de hidrogênio entre as caudas homopoliméricas complementares para formar moléculas de DNA recombinante.
[00171] Em uma modalidade alternativa, ligadores sintéticos contendo um ou mais sítios de restrição fornecidos são usados para ligar operacionalmente o polinucleotídeo da tecnologia em questão ao vetor de expressão. Em uma modalidade, o polinucleotídeo é gerado por digestão com endonuclease de restrição. Em uma modalidade, a molécula de ácido nucleico é tratada com DNA polimerase de bacteriófago T4 ou DNA polimerase I de E. coli, enzimas que removem terminais de filamento simples 3' protuberantes com suas atividades 3'-5'-exonucleolíticas e preenchem extremidades 3' embutidas com suas atividades de polimerização, gerando, desse modo, segmentos de DNA de extremidades cegas. Os segmentos de extremidades cegas são então incubados com um grande excesso molar de moléculas de ligação na presença de uma enzima que pode catalisar a ligação de moléculas de DNA de extremidades cegas, tais como bacteriófago T4 DNA ligase. Assim, o produto da reação é um polinucleotídeo carregando sequências ligadoras poliméricas em suas extremidades. Esses polinucleotídeos são então clivados com a enzima de restrição apropriada e ligados a um vetor de expressão que foi clivado com uma enzima que produz terminais compatíveis com aqueles do polinucleotídeo.
[00172] Alternativamente, um vetor tendo sítios de clonagem independente de ligação (LIC) podem ser empregados. O polinucleotídeo amplificado por PCR requerido pode então ser clonado no vetor LIC sem digestão de restrição ou ligação (Aslanidis e de Jong, NUCL. ACID. RES. 18 606974, (1990), Haun, et al, BIOTECHNIQUES 13, 515-18 (1992), que é incorporado a este documento por referência na medida em que é consistente com este documento).
[00173] Em uma modalidade, para isolar e/ou modificar o polinucleotídeo de interesse para inserção no plasmídeo escolhido, é adequado usar PCR. Os primers apropriados para uso na preparação de PCR da sequência podem ser projetados para isolar a região de codificação requerida da molécula de ácido nucleico, adicionar endonuclease de restrição ou sítios LIC, colocar a região de codificação no quadro de leitura desejado.
[00174] Em uma modalidade, um polinucleotídeo para incorporação em um vetor de expressão da tecnologia em questão é preparado usando PCR usando primers oligonucleotídicos apropriados. A região de codificação é amplificada, enquanto os próprios primers são incorporados ao produto da sequência amplificada. Em uma modalidade, os primers de amplificação contêm sítios de reconhecimento de endonuclease de restrição, que permitem que o produto da sequência amplificada seja clonado em um vetor apropriado.
[00175] Os vetores de expressão podem ser introduzidos em células hospedeiras microbianas ou de plantas por técnicas convencionais de transformação ou transfecção. A transformação de células apropriadas com um vetor de expressão da tecnologia em questão é alcançada por métodos conhecidos na técnica e tipicamente depende tanto do tipo de vetor quanto da célula. As técnicas adequadas incluem fosfato de cálcio ou co-precipitação de cloreto de cálcio, transfecção mediada por DEAE- dextrano, lipofecção, quimoporação ou eletroporação.
[00176] Células transformadas com sucesso, ou seja, aquelas células que contêm o vetor de expressão, podem ser identificadas por técnicas bem conhecidas na técnica. Por exemplo, as células transfectadas com um vetor de expressão da tecnologia em questão podem ser cultivadas para produzir polipeptídeos descritos neste documento. As células podem ser examinadas quanto à presença do DNA do vetor de expressão por técnicas bem conhecidas na técnica.
[00177] As células hospedeiras podem conter uma única cópia do vetor de expressão descrito anteriormente ou, alternativamente, múltiplas cópias do vetor de expressão,
[00178] Em algumas modalidades, a célula transformada é uma célula animal, uma célula de inseto, uma célula vegetal, uma célula de algas, uma célula fúngica ou uma célula de levedura. Em algumas modalidades, a célula é uma célula vegetal selecionada a partir do grupo que consiste em: célula vegetal de canola, uma célula vegetal de canola,
uma célula vegetal de palmeira, uma célula vegetal de girassol, uma célula vegetal de algodão, uma célula vegetal de milho, uma célula vegetal de amendoim, uma célula vegetal de linho, uma célula vegetal de gergelim, uma célula vegetal de soja e uma célula vegetal de petúnia.
[00179] Sistemas de expressão de células hospedeiras microbianas e vetores de expressão contendo sequências regulatórias que direcionam a expressão de alto nível de proteínas estranhas são bem conhecidos pelos versados na técnica. Qualquer um destes pode ser usado para construir vetores para a expressão do polipeptídeo recombinante da tecnologia de sujeição em uma célula hospedeira microbiana. Esses vetores podem então ser introduzidos em microrganismos apropriados por meio de transformação para permitir a expressão de alto nível do polipeptídeo recombinante da tecnologia em questão.
[00180] Os vetores ou cassetes, úteis para a transformação de células hospedeiras microbianas adequadas, são bem conhecidos na técnica. Tipicamente, o vetor ou cassete contém sequências que direcionam a transcrição e tradução do polinucleotídeo relevante, um marcador selecionável e sequências que permitem a replicação autônoma ou integração cromossômica. Os vetores adequados compreendem uma região 5' do polinucleotídeo que abriga os controles de iniciação transcricional e uma região 3' do fragmento de DNA que controla a terminação transcricional. Em algumas modalidades, é preferido que ambas as regiões de controle sejam derivadas de genes homólogos à célula hospedeira transformada, embora deva ser entendido que tais regiões de controle não precisam ser derivadas dos genes nativos da espécie específica escolhida como uma hospedeira.
[00181] As regiões de controle de iniciação ou promotores, que são úteis para conduzir a expressão do polipeptídeo recombinante na célula hospedeira microbiana desejada, são numerosas e familiares aos versados na técnica. Praticamente qualquer promotor capaz de conduzir esses genes é adequado para a tecnologia em questão, incluindo, mas não se limitando a, CYCI, HIS3, GALI, GALIO, ADHI, PGK, PH05, GAPDH, ADCI, TRPI, URA3, LEU2, ENO, TPI (útil para expressão em Saccharomyces); AOXI (útil para expressão em Pichia); e lac, trp, JPL, IPR, T7, tac e trc (úteis para expressão em Escherichia coli).
[00182] As regiões de controle de terminação também podem ser derivadas de vários genes nativos aos hospedeiros microbianos. Um sítio de terminação opcionalmente pode ser incluído para os hospedeiros microbianos descritos neste documento.
[00183] Em células vegetais, os vetores de expressão da tecnologia em questão podem incluir uma região de codificação operacionalmente ligada a promotores capazes de dirigir a expressão do polipeptídeo recombinante da tecnologia em questão nos tecidos desejados no estágio de desenvolvimento desejado. Por razões de conveniência, os polinucleotídeos a serem expressos podem compreender sequências promotoras e sequências líderes de tradução derivadas do mesmo polinucleotídeo. As sequências não codificantes 3' que codificam sinais de terminação de transcrição também devem estar presentes. Os vetores de expressão também podem compreender um ou mais íntrons para facilitar a expressão de polinucleotídeos.
[00184] Para células hospedeiras vegetais, qualquer combinação de qualquer promotor e qualquer terminador capaz de induzir a expressão de uma região de codificação pode ser usada nas sequências de vetor da tecnologia em questão. Alguns exemplos adequados de promotores e terminadores incluem aqueles dos genes de nopalina sintetase (nos), octopina sintetase (ocs) e do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV). Um tipo de promotor vegetal eficiente que pode ser usado é um promotor vegetal de alto nível. Tais promotores, em ligação operável com um vetor de expressão da tecnologia em questão, devem ser capazes de promover a expressão do vetor. Promotores vegetais de alto nível que podem ser usados na tecnologia em questão incluem o promotor da pequena subunidade (ss) da ribulose-l, 5-bisfosfato carboxilase, por exemplo, de soja (Berry-Lowe et al., J. MOLECULAR E APP. GEN., 1: 483 498 (1982), cuja totalidade é incorporada a este documento na medida em que é consistente com este documento), e o promotor da proteína de ligação à clorofila a/b. Esses dois promotores são conhecidos por serem induzidos pela luz em células vegetais (ver, por exemplo, GENETIC ENGNEERING OF PLANTS, AN AGRICULTURAL PERSPECTIVE (Engenharia Genética de Plantas, uma perspectiva agrícola), A. Cashmore, Plenum, NY (1983), páginas 29- 38; Coruzzi, G. et al., THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 258: 1399 (1983), e Dunsmuir, P. et al., JOURNAL OF MOLEC. APPL. GEN., 2: 285 (1983), cada um dos quais é incorporado a este documento por referência na medida em que são consistentes com este documento). Produtos de Consumo Oral
[00185] Os rebaudiosídeos produzidos usando qualquer um dos métodos descritos neste documento (por exemplo, rebaudiosídeos R6-1, R6-2A, R6-2B, R6-4A, R6-4B e R7-2) podem ser usados como adoçantes. Outros aspectos da presente divulgação fornecem um produto de consumo oral tendo uma quantidade adoçante de rebaudiosídeo R6-1, rebaudiosídeo R6-2A, rebaudiosídeo R6-2B, rebaudiosídeo R6-4A, rebaudiosídeo R6-4B e/ou rebaudiosídeo R7-2, tal como selecionado a partir do grupo que consiste em um produto de bebida e um produto consumível.
[00186] Qualquer um dos produtos de consumo oral pode ter uma intensidade de doçura equivalente a cerca de 1% (p/v por %) a cerca de 4% (p/v por %) de solução de sacarose.
[00187] Qualquer um dos produtos de consumo oral pode ter de cerca de 5 ppm a cerca de 100 ppm de rebaudiosídeo R6-1. Qualquer um dos produtos de consumo oral pode ter de cerca de 5 ppm a cerca de 100 ppm de rebaudiosídeo R6-2A. Qualquer um dos produtos de consumo oral pode ter de cerca de 5 ppm a cerca de 100 ppm de rebaudiosídeo R6-2B.
Qualquer um dos produtos de consumo oral pode ter de cerca de 5 ppm a cerca de 100 ppm de rebaudiosídeo R6-4A. Qualquer um dos produtos de consumo oral pode ter de cerca de 5 ppm a cerca de 100 ppm de rebaudiosídeo R6-4B. Qualquer um dos produtos de consumo oral pode ter de cerca de 5 ppm a cerca de 100 ppm de rebaudiosídeo R7-2.
[00188] O rebaudiosídeo R6-1 pode ser o único adoçante no produto de consumo oral. O rebaudiosídeo R6-2A pode ser o único adoçante no produto de consumo oral. O rebaudiosídeo R6-2B pode ser o único adoçante no produto de consumo oral. O rebaudiosídeo R6-4A pode ser o único adoçante no produto de consumo oral. O rebaudiosídeo R6-4B pode ser o único adoçante no produto de consumo oral. O rebaudiosídeo R7-2 pode ser o único adoçante no produto de consumo oral.
[00189] Qualquer um dos produtos de consumo oral também pode ter pelo menos um adoçante adicional. O pelo menos um adoçante adicional pode ser um adoçante de alta intensidade natural, por exemplo. O adoçante adicional pode ser selecionado a partir de um extrato de estévia, um glicosídeo de esteviol, esteviosídeo, rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo B, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo D2, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo F, rebaudiosídeo M, rebaudiosídeo V, rebaudiosídeo W, rebaudiosídeo Z1, rebaudiosídeo Z2, rebaudiosídeo D3, dulcosídeo A, rubusosídeo, esteviolbiosídeo, sacarose, xarope de milho de alta frutose, frutose, glicose, xilose, arabinose, ramnose, eritritol, xilitol, manitol, sorbitol, inositol, AceK, aspartame, neotame, sacarose, sacarina, naringina di- hidrocalcona (NarDHC), neoesperidina di-hidrocalcona (NDHC), rubusosídeo, mogrosídeo IV, siamenosídeo I, mogrosídeo V, monatina, taumatina, monelina, brazzeína, L-alanina, glicina, Lo Han Guo, hernandulcina, filodulcina e combinações dos mesmos.
[00190] Qualquer um dos produtos de consumo oral também pode ter pelo menos um aditivo. O aditivo pode ser, por exemplo, um carboidrato, um poliol, um aminoácido ou sal do mesmo, um poliaminoácido ou sal do mesmo, um ácido de açúcar ou sal do mesmo, um nucleotídeo, um ácido orgânico, um ácido inorgânico, um sal orgânico, um sal de ácido orgânico, um sal de base orgânica, um sal inorgânico, um composto amargo, um aromatizante, um ingrediente aromatizante, um composto adstringente, uma proteína, um hidrolisado de proteína, um surfactante, um emulsificante, um flavonoide, um álcool, um polímero e combinações dos mesmos.
[00191] Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece um produto de bebida que compreende uma quantidade adoçante de rebaudiosídeo R6-1. Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece um produto de bebida que compreende uma quantidade adoçante de rebaudiosídeo R6-2A. Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece um produto de bebida que compreende uma quantidade adoçante de rebaudiosídeo R6-2B. Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece um produto de bebida que compreende uma quantidade adoçante de rebaudiosídeo R6-4A. Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece um produto de bebida que compreende uma quantidade adoçante de rebaudiosídeo R6-4B. Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece um produto de bebida que compreende uma quantidade adoçante de rebaudiosídeo R7-2.
[00192] Qualquer um dos produtos de bebida pode ser, por exemplo, um produto de bebida carbonatada e um produto de bebida não carbonatada. Qualquer um dos produtos de bebida também pode ser, por exemplo, um refrigerante, uma bebida de máquina, uma bebida congelada; uma bebida pronta para beber; uma bebida congelada e pronta para beber, café, chá, uma bebida láctea, um refrigerante em pó, um concentrado líquido, água com sabor, água enriquecida, suco de fruta, uma bebida com sabor de suco de fruta, uma bebida esportiva e uma bebida energética.
[00193] Em algumas modalidades, qualquer um dos produtos de bebida da presente divulgação pode incluir um ou mais ingredientes de bebida, tal como, por exemplo, acidulantes, sucos de frutas e/ou sucos de vegetais, polpa, etc., aromatizantes, corantes, conservantes, vitaminas, minerais, eletrólitos, eritritol, tagatose, glicerina e dióxido de carbono. Tais produtos de bebida podem ser fornecidos em qualquer forma adequada, tal como um concentrado de bebida e uma bebida carbonatada pronta para beber.
[00194] Em certas modalidades, qualquer um dos produtos de bebida da presente divulgação pode ter qualquer uma dentre numerosas formulações ou constituições específicas diferentes. A formulação de um produto de bebida da presente divulgação pode variar até certo ponto, dependendo de fatores tais como o segmento de mercado pretendido do produto, suas características nutricionais desejadas, perfil de sabor e semelhantes. Por exemplo, em certas modalidades, geralmente pode ser uma opção adicionar ingredientes adicionais à formulação de um produto de bebida específico. Por exemplo, adoçantes adicionais (isto é, mais e/ou outros) podem ser adicionados, aromatizantes, eletrólitos, vitaminas, sucos de frutas ou outros produtos de frutas, gostos, agentes de mascaramento e semelhantes, realçadores de gosto e/ou carbonação tipicamente podem ser adicionados a qualquer uma de tais formulações para variar o gosto, sensação na boca, características nutricionais, etc. Em modalidades, qualquer um dos produtos de bebida pode ser uma bebida de cola que contém água, cerca de 5 ppm a cerca de 100 ppm de rebaudiosídeo R6-1, um acidulante e aromatizante. Em modalidades, qualquer um dos produtos de bebida pode ser uma bebida de cola que contém água, cerca de 5 ppm a cerca de 100 ppm de rebaudiosídeo R6-2A, um acidulante e aromatizante. Em modalidades, qualquer um dos produtos de bebida pode ser uma bebida de cola que contém água, cerca de 5 ppm a cerca de 100 ppm de rebaudiosídeo R6-2B, um acidulante e aromatizante. Em modalidades, qualquer um dos produtos de bebida pode ser uma bebida de cola que contém água, cerca de 5 ppm a cerca de 100 ppm de rebaudiosídeo R6-4A, um acidulante e aromatizante. Em modalidades, qualquer um dos produtos de bebida pode ser uma bebida de cola que contém água, cerca de 5 ppm a cerca de 100 ppm de rebaudiosídeo R6-4B, um acidulante e aromatizante. Em modalidades, qualquer um dos produtos de bebida pode ser uma bebida de cola que contém água, cerca de 5 ppm a cerca de 100 ppm de rebaudiosídeo R7-2, um acidulante e aromatizante.
[00195] Aromatizantes exemplares podem ser, por exemplo, aroma de cola, aroma de frutas cítricas e aromatizantes de especiarias. Em algumas modalidades, a carbonação na forma de dióxido de carbono pode ser adicionada para efervescência. Em outras modalidades, conservantes podem ser adicionados, dependendo dos outros ingredientes, técnica de produção, prazo de validade desejado, etc. Em certas modalidades, cafeína pode ser adicionada. Em algumas modalidades, o produto de bebida pode ser uma bebida carbonatada com sabor de cola, caracteristicamente contendo água carbonatada, adoçante, extrato de noz de cola e/ou outro aromatizante, corante caramelo, um ou mais ácidos e, opcionalmente, outros ingredientes.
[00196] Quantidades adequadas de rebaudiosídeo R6-1, rebaudiosídeo R6-2A, rebaudiosídeo R6-2B, rebaudiosídeo R6-4A, rebaudiosídeo R6-4B ou rebaudiosídeo R7-2 presentes no produto de bebida podem ser, por exemplo, de cerca de 5 ppm a cerca de 100 ppm. Em algumas modalidades, baixas concentrações de rebaudiosídeo R6-1, rebaudiosídeo R6-2A, rebaudiosídeo R6-2B, rebaudiosídeo R6-4A, rebaudiosídeo R6-4B ou rebaudiosídeo R7-2, por exemplo, menos de 100 ppm e tem uma doçura equivalente a soluções de sacarose tendo concentrações entre 10.000 ppm e 30.000 ppm. A concentração final que varia de cerca de 5 ppm a cerca de 100 ppm, de cerca de 5 ppm a cerca de 95 ppm, de cerca de 5 ppm a cerca de 90 ppm, de cerca de 5 ppm a cerca de 85 ppm, de cerca de 5 ppm a cerca de 80 ppm, de cerca de 5 ppm a cerca de 75 ppm, de cerca de 5 ppm a cerca de 70 ppm, de cerca de 5 ppm a cerca de 65 ppm, de cerca de 5 ppm a cerca de 60 ppm, de cerca de 5 ppm a cerca de 55 ppm, de cerca de 5 ppm a cerca de 50 ppm, de cerca de 5 ppm a cerca de 45 ppm, de cerca de 5 ppm a cerca de 40 ppm, de cerca de 5 ppm a cerca de 35 ppm, de cerca de 5 ppm a cerca de 30 ppm, de cerca de 5 ppm a cerca de 25 ppm, de cerca de 5 ppm a cerca de 20 ppm, de cerca de 5 ppm a cerca de 15 ppm, ou de cerca de 5 ppm a cerca de 10 ppm. Alternativamente, rebaudiosídeo R6-1, rebaudiosídeo R6-2A, rebaudiosídeo R6-2B, rebaudiosídeo R6-4A, rebaudiosídeo R6-4B ou rebaudiosídeo R7-2 pode estar presente em produtos de bebida da presente divulgação em uma concentração final que varia de cerca de 5 ppm a cerca de 100 ppm, de cerca de 10 ppm a cerca de 100 ppm, de cerca de 15 ppm a cerca de 100 ppm, de cerca de 20 ppm a cerca de 100 ppm, de cerca de 25 ppm a cerca de 100 ppm, de cerca de 30 ppm a cerca de 100 ppm, de cerca de 35 ppm a cerca de 100 ppm, de cerca de 40 ppm a cerca de 100 ppm, de cerca de 45 ppm a cerca de 100 ppm, de cerca de 50 ppm a cerca de 100 ppm, de cerca de 55 ppm a cerca de 100 ppm, de cerca de 60 ppm a cerca de 100 ppm, de cerca de 65 ppm a cerca de 100 ppm, de cerca de 70 ppm a cerca de 100 ppm, de cerca de 75 ppm a cerca de 100 ppm, de cerca de 80 ppm a cerca de 100 ppm, de cerca de 85 ppm a cerca de 100 ppm, de cerca de 90 ppm a cerca de 100 ppm, ou de cerca de 95 ppm a cerca de 100 ppm.
[00197] Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece um consumível que compreende uma quantidade adoçante de rebaudiosídeo R6-1. Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece um consumível que compreende uma quantidade adoçante de rebaudiosídeo R6-2A. Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece um consumível que compreende uma quantidade adoçante de rebaudiosídeo R6-2B. Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece um consumível que compreende uma quantidade adoçante de rebaudiosídeo R6-4A. Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece um consumível que compreende uma quantidade adoçante de rebaudiosídeo R6-4B. Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece um consumível que compreende uma quantidade adoçante de rebaudiosídeo R7-2. O consumível pode ser, por exemplo, um produto alimentar, um nutracêutico, um farmacêutico, um suplemento dietético, uma composição de higiene dental, uma composição de gel comestível, um produto cosmético e um aromatizante de mesa.
[00198] Conforme usado neste documento, "suplemento(s) dietético(s)" refere-se a compostos destinados a suplementar a dieta e fornecer nutrientes, tais como vitaminas, minerais, fibra, ácidos graxos, aminoácidos, etc. que podem estar ausentes ou podem não ser consumidos em quantidade suficiente em uma dieta. Qualquer suplemento dietético adequado conhecido na técnica pode ser usado. Exemplos de suplementos dietéticos adequados podem ser, por exemplo, nutrientes, vitaminas, minerais, fibra, ácidos graxos, ervas, botânicos, aminoácidos e metabólitos.
[00199] Conforme usado neste documento, "nutracêutico(s)" refere-se a compostos, que incluem qualquer alimento ou parte de um alimento que pode fornecer benefícios medicinais ou de saúde, incluindo a prevenção e/ou tratamento de doenças ou distúrbios (por exemplo, fadiga, insônia, efeitos de envelhecimento, perda de memória, distúrbios de humor, doenças cardiovasculares e altos níveis de colesterol no sangue, diabetes, osteoporose, inflamação, distúrbios autoimunes, etc.). Qualquer nutracêutico adequado conhecido na técnica pode ser usado. Em algumas modalidades, nutracêuticos podem ser usados como suplementos para alimentos e bebidas e como formulações farmacêuticas para aplicações entéricas ou parenterais que podem ser formulações sólidas, tais como cápsulas ou comprimidos, ou formulações líquidas, tais como soluções ou suspensões.
[00200] Em algumas modalidades, os suplementos dietéticos e nutracêuticos podem conter adicionalmente hidrocoloides protetores (tais como gomas, proteínas, amidos modificados), ligantes, agentes formadores de filme, agentes/materiais encapsulantes, materiais de parede/invólucro, compostos de matriz, revestimentos, emulsificantes, tensoativos agentes, agentes solubilizantes (óleos, gorduras, ceras, lecitinas, etc.), adsorventes, carreadores, enchimentos, co-compostos, agentes dispersantes, agentes umectantes, auxiliares de processamento (solventes), agentes de fluidez, agentes de mascaramento de gosto, agentes de aumento de peso, agentes gelificantes, agentes formadores de gel, antioxidantes e antimicrobianos.
[00201] Conforme usado neste documento, um "gel" se refere a um sistema coloidal no qual uma rede de partículas abrange o volume de um meio líquido. Embora os géis sejam compostos principalmente de líquidos e, assim, exibam densidades semelhantes às dos líquidos, os géis têm a coerência estrutural dos sólidos devido à rede de partículas que abrange o meio líquido. Por essa razão, os géis geralmente parecem ser materiais sólidos semelhantes a gelatina. Os géis podem ser usados em uma série de aplicações. Por exemplo, géis podem ser usados em alimentos, tintas e adesivos. Os géis que podem ser comidos são referidos como "composições de gel comestíveis". As composições de gel comestíveis são tipicamente consumidas como lanches, como sobremesas, como parte de alimentos básicos ou junto com alimentos básicos. Exemplos de composições de gel comestíveis adequadas podem ser, por exemplo, sobremesas em gel, pudins, compotas, geleias, pastas, pavês, aspics, marshmallows, balas de goma e semelhantes. Em algumas modalidades, as misturas de gel comestível geralmente são sólidas em pó ou granulares aos quais um fluido pode ser adicionado para formar uma composição de gel comestível. Exemplos de fluidos adequados podem ser, por exemplo, água, fluidos lácteos, fluidos análogos a lácteos, sucos, álcool, bebidas alcoólicas e combinações dos mesmos. Exemplos de fluidos lácteos adequados podem ser, por exemplo, leite, leite fermentado, creme, soro de leite fluido e misturas dos mesmos. Exemplos de fluidos análogos lácteos adequados podem ser, por exemplo, leite de soja e branqueador de café não lácteo.
[00202] Conforme usado neste documento, o termo "ingrediente de gelificação" se refere a qualquer material que pode formar um sistema coloidal dentro de um meio líquido. Exemplos de ingredientes gelificantes adequados podem ser, por exemplo, gelatina, alginato, carragenina, goma, pectina, konjac, ágar, ácido alimentar, coalho, amido, derivados de amido e combinações dos mesmos. É bem conhecido pelos versados na técnica que a quantidade de ingrediente gelificante usada em uma mistura de gel comestível ou uma composição de gel comestível pode variar consideravelmente dependendo de uma série de fatores, tais como, por exemplo, o ingrediente gelificante em particular usado, o fluido base em particular usado e as propriedades desejadas do gel.
[00203] Misturas de gel e composições de gel da presente divulgação podem ser preparadas por qualquer método adequado conhecido na técnica. Em algumas modalidades, as misturas de gel comestível e as composições de gel comestível da presente divulgação podem ser preparadas usando outros ingredientes além do agente gelificante. Exemplos de outros ingredientes adequados podem ser, por exemplo, um ácido alimentar, um sal de um ácido alimentar, um sistema tampão, um agente de volume, um sequestrante, um agente de reticulação, um ou mais sabores, uma ou mais cores e combinações dos mesmos.
[00204] As composições farmacêuticas também são fornecidas compreendendo qualquer um dos rebaudiosídeos fornecidos neste documento. Em certas modalidades, qualquer uma das composições farmacêuticas da presente divulgação pode conter de cerca de 5 ppm a cerca de 100 ppm de rebaudiosídeo R6-1 e um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Em certas modalidades, qualquer uma das composições farmacêuticas da presente divulgação pode conter de cerca de 5 ppm a cerca de 100 ppm de rebaudiosídeo R6-2A e um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Em certas modalidades, qualquer uma das composições farmacêuticas da presente divulgação pode conter de cerca de 5 ppm a cerca de 100 ppm de rebaudiosídeo R6-2B e um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Em certas modalidades, qualquer uma das composições farmacêuticas da presente divulgação pode conter de cerca de 5 ppm a cerca de 100 ppm de rebaudiosídeo R6-4A e um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Em certas modalidades, qualquer uma das composições farmacêuticas da presente divulgação pode conter de cerca de 5 ppm a cerca de 100 ppm de rebaudiosídeo R6-4B e um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Em certas modalidades, qualquer uma das composições farmacêuticas da presente divulgação pode conter de cerca de 5 ppm a cerca de 100 ppm de rebaudiosídeo R7-2 e um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Em algumas modalidades, qualquer uma das composições farmacêuticas da presente divulgação pode ser usada para formular drogas farmacêuticas contendo um ou mais agentes ativos que exercem um efeito biológico. Por conseguinte, em algumas modalidades, qualquer uma das composições farmacêuticas da presente divulgação pode conter um ou mais agentes ativos que exercem um efeito biológico. Os agentes ativos adequados são bem conhecidos na técnica (por exemplo, The Physicians' Desk Reference (Referência de Mesa dos Médicos). Tais composições podem ser preparadas de acordo com procedimentos bem conhecidos na técnica, por exemplo, conforme descrito em Remington's Pharmaceutical Sciences (Ciências Farmacêuticas de Remington), Mack Publishing Co., Easton, Pa., EUA.
[00205] Rebaudiosídeo R6-1, rebaudiosídeo R6-2A, rebaudiosídeo R6-2B, rebaudiosídeo R6-4A, rebaudiosídeo R6-4B ou rebaudiosídeo R7-2 podem ser usados com quaisquer composições de higiene dental e oral adequadas conhecidas na técnica. Exemplos de composições de higiene dental e oral adequadas podem ser, por exemplo, pastas de dente, esmaltes dentais, fio dental, enxaguantes bucais, antissépticos bucais, dentifrícios, sprays bucais, refrescadores de hálito, enxaguantes de placa, analgésicos dentais e semelhantes. Composições de higiene dental e oral compreendendo qualquer um dos rebaudiosídeos fornecidos neste documento também são fornecidas.
[00206] Quantidades adequadas de rebaudiosídeo R6-1, rebaudiosídeo R6-2A, rebaudiosídeo R6-2B, rebaudiosídeo R6-4A, rebaudiosídeo R6-4B ou rebaudiosídeo R7-2 presentes em qualquer uma das composições fornecidas neste documento, tal como no consumível podem ser, por exemplo, de cerca de 5 partes por milhão (ppm) a cerca de 100 partes por milhão (ppm). Em algumas modalidades de qualquer uma das composições fornecidas, baixas concentrações de rebaudiosídeo R6-1, rebaudiosídeo R6-2A, rebaudiosídeo R6-2B, rebaudiosídeo R6-4A, rebaudiosídeo R6-4B ou rebaudiosídeo R7-2, por exemplo, menos de 100 ppm, tem uma doçura equivalente a soluções de sacarose tendo concentrações entre 10.000 ppm e 30.000 ppm. A concentração final pode variar de cerca de 5 ppm a cerca de 100 ppm, de cerca de 5 ppm a cerca de 95 ppm, de cerca de 5 ppm a cerca de 90 ppm, de cerca de 5 ppm a cerca de 85 ppm, de cerca de 5 ppm a cerca de 80 ppm, de cerca de 5 ppm a cerca de 75 ppm, de cerca de 5 ppm a cerca de 70 ppm, de cerca de 5 ppm a cerca de 65 ppm, de cerca de 5 ppm a cerca de 60 ppm, de cerca de 5 ppm a cerca de 55 ppm, de cerca de 5 ppm a cerca de 50 ppm, de cerca de 5 ppm a cerca de 45 ppm, de cerca de 5 ppm a cerca de 40 ppm, de cerca de 5 ppm a cerca de 35 ppm, de cerca de 5 ppm a cerca de 30 ppm, de cerca de 5 ppm a cerca de 25 ppm, de cerca de 5 ppm a cerca de 20 ppm, de cerca de 5 ppm a cerca de 15 ppm, ou de cerca de 5 ppm a cerca de 10 ppm. Alternativamente, rebaudiosídeo R6-1, rebaudiosídeo R6-2A, rebaudiosídeo R6-2B, rebaudiosídeo R6-4A, rebaudiosídeo R6-4B ou rebaudiosídeo R7-2 podem estar presentes em qualquer uma das composições fornecidas, tal como em qualquer um dos produtos consumíveis da presente divulgação, em uma concentração final que varia de cerca de 5 ppm a cerca de 100 ppm, de cerca de 10 ppm a cerca de 100 ppm, de cerca de 15 ppm a cerca de 100 ppm, de cerca de 20 ppm a cerca de 100 ppm, de cerca de 25 ppm a cerca de 100 ppm, de cerca de 30 ppm a cerca de 100 ppm, de cerca de 35 ppm a cerca de 100 ppm, de cerca de 40 ppm a cerca de 100 ppm, de cerca de 45 ppm a cerca de 100 ppm, de cerca de 50 ppm a cerca de 100 ppm, de cerca de 55 ppm a cerca de 100 ppm, de cerca de 60 ppm a cerca de 100 ppm, de cerca de 65 ppm a cerca de 100 ppm, de cerca de 70 ppm a cerca de 100 ppm, de cerca de 75 ppm a cerca de 100 ppm, de cerca de 80 ppm a cerca de 100 ppm, de cerca de 85 ppm a cerca de 100 ppm, de cerca de 90 ppm a cerca de 100 ppm, ou de cerca de 95 ppm a cerca de 100 ppm.
[00207] Em certas modalidades, de cerca de 5 ppm a cerca de 100 ppm de rebaudiosídeo R6-1, rebaudiosídeo R6-2A, rebaudiosídeo R6- 2B, rebaudiosídeo R6-4A, rebaudiosídeo R6-4B ou rebaudiosídeo R7-2 está presente em composições de produtos alimentícios. Tais composições também são fornecidas. Tal como usado neste documento, "composição(ões) de produto alimentar" se refere a qualquer material sólido ou líquido ingerível que pode, mas não precisa, ter um valor nutricional e ser destinado ao consumo por humanos e animais.
[00208] Exemplos de composições de produtos alimentícios adequadas podem ser, por exemplo, composições de confeitaria, tais como balas, balas de menta, pastilhas com sabor de frutas, produtos de cacau, chocolates e semelhantes; condimentos, tais como ketchup, mostarda, maionese e semelhantes; gomas de mascar; composições de cereais; produtos assados, tais como pães, bolos, tortas, bolachas e semelhantes; produtos lácteos, tais como leite, queijo, creme, sorvete, creme de leite, iogurte, sorbet e semelhantes; composições adoçantes de mesa; sopas; ensopados; comida de conveniência; carnes, tais como presunto, bacon,
salsichas, carne seca e semelhantes; gelatinas e produtos semelhantes a gelatina, tais como compotas, geleias, conservas e semelhantes; frutas; vegetais; produtos de ovo; glacês; xaropes incluindo melado; lanches; nozes e produtos de nozes; e ração animal.
[00209] As composições de produtos alimentícios também podem ser ervas, especiarias e temperos, sabores naturais e sintéticos e realçadores de sabor, tal como o glutamato monossódico. Em algumas modalidades, qualquer uma das composições de produtos alimentícios pode ser, por exemplo, produtos embalados preparados, tais como adoçantes dietéticos, adoçantes líquidos, misturas de sabores granulados, alimentos para animais de estimação, rações para gado, tabaco e materiais para aplicações de panificação, tal como misturas em pó para panificação para a preparação de pães, bolachas, bolos, panquecas, donuts e semelhantes. Em outras modalidades, qualquer uma das composições de produtos alimentícios também pode ser alimentos e bebidas diet e de baixa caloria contendo pouca ou nenhuma sacarose.
[00210] Em certas modalidades que podem ou não ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o rebaudiosídeo R6-1, rebaudiosídeo R6-2A, rebaudiosídeo R6-2B, rebaudiosídeo R6-4A, rebaudiosídeo R6-4B ou rebaudiosídeo R7-2 é o único adoçante e o produto tem uma intensidade de doçura equivalente a cerca de 1% a cerca de 4% (p/v por %) de solução de sacarose. Em certas modalidades que podem ou não ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, os produtos consumíveis e produtos de bebida podem incluir adicionalmente um adoçante adicional, onde o produto tem uma intensidade de doçura equivalente a cerca de 1% a cerca de 10% (p/v por %) de solução de sacarose. Em certas modalidades que podem ou não ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, cada ingrediente adoçante no produto é um adoçante de alta intensidade. Em certas modalidades que podem ou não ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, cada ingrediente adoçante no produto pode ser um adoçante natural de alta intensidade.
Em certas modalidades que podem ou não ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o adoçante adicional contém um ou mais adoçantes selecionados a partir de um extrato de estévia, um glicosídeo de esteviol, esteviosídeo, rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo B, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo D2, rebaudiosídeo F, rebaudiosídeo D3, rebaudiosídeo Z1, rebaudiosídeo Z2, rebaudiosídeo M, rebaudiosídeo W, rebaudiosídeo V, dulcosídeo A, rubusosídeo, esteviolbiosídeo, sacarose, xarope de milho de alta frutose, frutose, glicose, xilose, arabinose, ramnose, eritritol, xilitol, manitol, sorbitol, inositol, AceK, aspartame, neotame, sacarose, sacarina, naringina di-hidrocalcona (NarDHC), neoesperidina di- hidrocalcona (NDHC), rubusosídeo, mogrosídeo IV, siamenosídeo I, mogrosídeo V, monatina, taumatina, monelina, brazzeína, L-alanina, glicina, Lo Han Guo, hernandulcina, filodulcina, trilobtaína e combinações dos mesmos.
Em certas modalidades que podem ou não ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, os produtos consumíveis e produtos de bebida podem incluir adicionalmente um ou mais aditivos selecionados a partir de um carboidrato, um poliol, um aminoácido ou sal do mesmo, um poli-amino ácido ou sal do mesmo, um ácido de açúcar ou sal do mesmo, um nucleotídeo, um ácido orgânico, um ácido inorgânico, um sal orgânico, um sal de ácido orgânico, um sal de base orgânica, um sal inorgânico, um composto amargo, um aromatizante, um ingrediente aromatizante, um composto adstringente, uma proteína, um hidrolisado de proteína, um surfactante, um emulsificante, um flavonoide, um álcool, um polímero e combinações dos mesmos.
Em certas modalidades que podem ou não ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o rebaudiosídeo R6-1, rebaudiosídeo R6-2A, rebaudiosídeo R6-2B, rebaudiosídeo R6-4A, rebaudiosídeo R6-4B ou rebaudiosídeo R7-2 tem uma pureza de cerca de 50% a cerca de 100% em peso antes de ser adicionado ao produto.
EXEMPLOS Exemplo 1: Produção de Novos Glicosídeos de Esteviol R6-2 e R7-2 por Bioconversão Enzimática
[00211] De acordo com a invenção atual, fragmentos de DNA de comprimento total de todos os genes candidatos de UDP-glicosiltransferase (UGT) foram sintetizados comercialmente. Quase todos os códons do cDNA foram alterados para aqueles preferidos para E. coli (Genscript, NJ). O DNA sintetizado foi clonado em um vetor de expressão bacteriana pETite N-His SUMO Kan Vector (Lucigen).
[00212] Cada construto de expressão foi transformado em E. coli BL21 (DE3), que foi subsequentemente cultivada em meios LB contendo 50 μg/mL de canamicina a 37 °C até atingir um OD600 de 0,8-1,0. A expressão de proteína foi induzida por adição de 1 mM de isopropil (β-D-1- tiogalactopiranosídeo (IPTG) e a cultura foi adicionalmente cultivada a 16 °C por 22 h. As células foram colhidas por centrifugação (3.000 x g; 10 min; 4 °C). Os sedimentos celulares foram coletados e foram usados imediatamente ou armazenados a -80 °C.
[00213] Os sedimentos celulares foram tipicamente ressuspensos em tampão de lise (50 mM de tampão fosfato de potássio, pH 7,2, 25 μg/ml de lisozima, 5μg/ml de DNase I, 20 mM de imidazol, 500 mM de NaCl, 10% de glicerol e 0,4% de Triton X-100). As células foram rompidas por sonicação abaixo de 4 °C e os restos celulares foram clarificados por centrifugação (18.000 x g; 30 min). O sobrenadante foi carregado em uma coluna de afinidade equilibrada (tampão de equilíbrio: 50 mM de tampão fosfato de potássio, pH 7,2, 20 mM de imidazol, 500 mM de NaCL, 10% de glicerol) Ni-NTA (Qiagen). Após o carregamento da amostra de proteína, a coluna foi lavada com tampão de equilíbrio para remover proteínas contaminantes não ligadas. Os polipeptídeos recombinantes UGT marcados com His foram eluídos por tampão de equilíbrio contendo 250 mM de imidazol.
[00214] Os polipeptídeos recombinantes UGTs candidatos purificados foram verificados quanto à atividade de glicosilação usando rebaudiosídeo D3 (Reb D3) como substrato. Tipicamente, o polipeptídeo recombinante (10-50 pg) foi testado em um sistema de reação 200 μI in vitro. O sistema de reação continha 50 mM de tampão de fosfato de potássio, pH 7,2, 3 mM de MgCl2, 1 mg/ml de substrato Reb m, 1 mM de UDP-glicose ou UDP e/ou sacarose sintase (SUS) e 250 mM de sacarose. A reação foi realizada a 30-37 °C e a reação de 50 µL foi terminada adicionando 200 μL de 1-butanol em vários pontos de tempo. As amostras foram extraídas três vezes com 200 μL de 1-butanol. A fração reunida foi seca e dissolvida em 100 μL de metanol a 80% para análise por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC).
[00215] A análise por HPLC foi então realizada usando um sistema Dionex UPLC ultimate 3000 (Sunnyvale, CA), incluindo uma bomba quaternária, um compartimento de coluna de temperatura controlada, um amostrador automático e um detector de absorção de UV. Uma coluna Synergi Hydro-RP (Phenomenex) com coluna de guarda foi usada para a caracterização de glicosídeos de esteviol nas amostras reunidas. O acetonitrilo em água foi usado para a eluição isocrática na análise por HPLC. O comprimento de onda de detecção usado na análise por HPLC foi de 210 nm.
[00216] Após a triagem da atividade, constatou-se que UGT76G1 (SEQ ID NO: 1) tem forte atividade para produzir glicosídeos de esteviol R6-2 e R7-2 (Figura 2).
[00217] Conforme mostrado na Figura 3, UGT76G1 pode converter Reb D3 em R6-2 e o R6-2 produzido pode ser convertido em R7- 2 continentalmente. R6-2 e R7-2 foram produzidos no tempo de reação inicial (2 h, Figura 3, Painel B). O R6-2 produzido pode ser convertido em R7-2 em pontos de tempo posteriores (4 h, Figura 3, Painel C).
Eventualmente, todo Reb D3 e R6-2 produzido podem ser totalmente convertidos no composto R7-2 (19 h, Figura 3, Painel D). Exemplo 2: Identificação de Produção de R6-2 e R7-2 por meio de Análise LC-MS
[00218] A fim de confirmar os compostos produzidos, os compostos produzidos foram analisados por análise LC-MS comparando com os padrões e confirmaram as suas identidades.
[00219] As mesmas amostras da bioconversão enzimática acima foram analisadas por LC-MS usando a coluna Synergy Hydro-RP. A fase móvel A era 0,1% de ácido fórmico em água e a fase móvel B era 0,1% de ácido fórmico em acetonitrila. A taxa de fluxo foi de 0,6 ml/minuto. A análise por espectrometria de massa das amostras foi feita no Espectrômetro de Massa Q Exactive Hybrid Quadrupole-Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) com um método otimizado no modo de íon positivo.
[00220] A fórmula molecular do composto R6-2 foi deduzida como C56H90O33 com base em seu espectro de massa de alta resolução (HR) positivo que mostrou íons adutos correspondendo a [M + H]+ em m/z
1291.5401 (Figura 4). A estrutura prevista de R6-2 é apresentada na Figura
2.
[00221] A fórmula molecular do composto R7-2 foi deduzida como C62H100O38 com base em seu espectro de massa de alta resolução (HR) positivo que mostrou íons adutos correspondendo a [M+ H]+ em m/z
1453.5921 (Figura 5). A estrutura prevista de R7-2 é apresentada nas Figuras 2, 6 e 7. Exemplo 3: A estrutura de R7-2 foi analisada por NMR:
[00222] O composto R7-2 produzido foi purificado por cromatografia semi-preparativa conforme descrito acima.
[00223] Os dados de HRMS foram gerados com um instrumento LTQ Orbitrap Discovery HRMS, com sua resolução ajustada para 30k. Dados digitalizados de m/z 150 a 1500 no modo de eletropulverização de íons positivos. A tensão da agulha foi ajustada para 4 kV; as outras condições da fonte foram gás de bainha = 25, gás aux = 0, gás de varredura = 5 (todos os fluxos de gás em unidades arbitrárias), tensão capilar = 30 V, temperatura capilar = 30 °C e tensão da lente do tubo = 75. A amostra foi diluída com piridina e injetada 50 microlitros.
[00224] Os espectros de NMR foram adquiridos em instrumentos Bruker Avance DRX 500 MHz ou instrumento Varian INOVA 600 MHz usando sequências de pulso padrão. Os espectros de NMR 1D (1H e 13 C) e 2D (TOCSY, HSQC, ROESY e HMBC) foram realizados em C5D5N.
[00225] A fórmula molecular do composto R7-2 foi deduzida como C62H100O38 com base em seu espectro de massa de alta resolução (HR) positivo que mostrou íons adutos correspondendo a [M + NH4]+ em m/z 1470.6222 e [M+Na]+ em m/z 1475.5774; essa composição foi 13 suportada por C NMR e dados espectrais HSQC. O espectro 1H NMR de R7-2 mostrou a presença de dois singletos de sp3 metil em δ 1,33 e 1,39; dois prótons olefínicos como singletos em 5,00 e 5,74 de um vínculo duplo exocíclico; nove sp3 metilenos e dois prótons de sp3 metino entre δ 0,75- 2,74 característico para os diterpenoides ent-caurano isolados mais cedo a partir do gênero Stevia. A hidrólise enzimática de R7-2 ofereceu um composto que foi constatado como sendo idêntico ao esteviol com base nos dados espectrais de NMR (Ohtani et al, 1992). O espectro 1H NMR de R7-2 também mostrou a presença de prótons anoméricos ressonando em δ 4,99, 5,05, 5,35, 5,38, 5,43, 5,82 e 6,40, sugerindo sete unidades de açúcar em sua estrutura molecular. A hidrólise ácida de R7-2 com 5% de H2SO4 proporcionou D-glicose, que foi identificada por comparação direta com amostra autêntica por TLC, sugeriu a presença de seis porções glicopiranosil em sua estrutura molecular (Bedir et al., 2001; Chaturvedula et al., 2003; e Huan et al., 1998). Adicionalmente, a configuração de D- glicose foi identificada preparando seu correspondente derivado de carboxilato de tiocarbamoil-tiazolidina com éster metílico da L-cisteína e O-
tolil isotiocianato e, em comparação, de seu tempo de retenção com os açúcares padrão, conforme descrito na comparação da literatura (Tanaka et al., 2007). Com base nos resultados dos dados espectrais de NMR de R7- 2, foi concluído que há sete unidades D-glicosil em sua estrutura anexadas à porção de esteviol. O esqueleto básico de esteviol em R7-2 foi suportado por correlações TOCSY (H- 1/H-2; H2/H-3; H-5/H-6; H-6/H-7; H-9/H-11; H- 11/H-12) e HMBC (H-1/C-2, C-10; H-3/C-1, C-2, C-4, C-5, C-18, C-19; H- 5/C-4, C-6, C-7, C-9, C-10, C-18, C-19, C-20; H-9/C-8, C-10, C-11, C-12, C- 14, C-15, H-14/C-8, C-9, C-13, C-15, C-16 e H-17/C-13, C-15, C-16). 13
[00226] Os valores ¹H e C NMR para todos os prótons e carbonos em R7-2 foram atribuídos com base nas correlações TOCSY, HMQC e HMBC e são dados na Tabela 1.
[00227] Uma comparação próxima do espectro 1H e 13 C NMR de R7-2 com rebaudiosídeo D3 (Mao et al. 2017) sugeriu que esse composto também é um glicosídeo de esteviol com quatro porções de glicosil ligadas ao C-13 hidroxil, das quais três estão anexadas na forma de um éter como um substituinte glicotriosil 2,3-ramificado; e outra porção de glicotriosil 2,3- ramificado em C-19 como um éster. Os dados acima foram responsáveis por seis unidades de glicosil na estrutura molecular de R7-2, deixando uma identificação da porção de glicosil adicional no substituinte de glicotriosil 2,3-ramificado na posição C-13. Com base nas correlações chave TOCSY e HMBC mostradas na Figura 8, a colocação da sétima porção de glicosil foi atribuída à posição C-6 de Açúcar II como no rebaudiosídeo D3.
[00228] As grandes constantes de acoplamento observadas para todos os sete prótons anoméricos das porções de glicosil em δ 4,99 (d, J = 7,6 Hz), 5,05 (d, J = 7,4 Hz), 5,35 (d, J = 8,1 Hz), 5,38 (d, J = 7,7 Hz), 5,43 (d, J = 7,7 Hz), 5,82 (d, J = 6,6 Hz) e 6,40 (d, J = 8,1 Hz) sugeriram sua orientação β conforme relatado para glicosídeos de esteviol.
[00229] Com base nos dados espectrais de massa de NMR e HR, bem como em estudos de hidrólise, a estrutura de R7-2 produzida pela conversão enzimática de Rebaudiosídeo D3 foi deduzida como ácido 13- [(2-O-β-D-glicopiranosil-3-O-β-D-glicopiranosil-6-O-β-D-glicopiranosil-β-D- glicopiranosil)oxi]ent-caur-16-en-19-oico-[(2-O-β-D-glicopiranosil-3-O-β-D- glicopiranosil-β-D-glicopiranosil)éster.
[00230] R7-2 (500 µg) foi dissolvido em 5,0 ml de tampão de acetato de sódio 0,1 M mantendo o pH a 4,5 e 100 uL de pectinase crua a partir de Aspergillus niger (Sigma-Aldrich) foram adicionados. A mistura foi mexida a 50 °C por 96 horas e o produto precipitado durante a reação foi filtrado e então solidificado. O produto resultante obtido foi identificado como esteviol por comparação de seus dados espectrais de 1H NMR.
[00231] R7-2 (1 mg) é dissolvido em MeOH (8 mL) e adicionado H2SO4 a 5% (25 mL). A mistura foi refluxada por 16 horas, esfriada à temperatura ambiente e então neutralizada com carbonato de sódio saturado. A fase aquosa foi extraída com acetato de etila (EtOAc, 2 x 25 ml) e a camada aquosa foi concentrada e comparada com açúcares padrão usando o sistema TLC EtOAc/n-butanol/água (2:7:1) e CH2Cl2/MeOH/água (10:6:1) (Bedir et al., 2001; Chaturvedula et al., 2003; Huan et al., 1998); os açúcares em R7-2 foram identificados como D-glicose.
[00232] R7-2 (1 mg) foi hidrolisado com 0,5 M HCl (1,5 mL) por 1,5 h. Após esfriamento, a mistura foi passada através de uma coluna Amberlite IRA400 e o eluato foi liofilizado. O resíduo foi dissolvido em piridina (0,75 mL) e aquecido com éster metílico de L-cisteína HCI (7,5 mg) a 60 °C por 1,5 h e, então, isotiocianato de O-tolil (30 uL) foi adicionado à mistura e aquecido a 60 °C por 1,5 h adicional. A análise por HPLC da mistura de reação foi realizada por uma coluna Phenomenex Luna [C18, 150 x 4,6 mm (5 u)] usando a fase móvel 25% de acetonitrila-0,2% de água TFA, 1 mL/min sob detecção de UV a 250 nm. O açúcar foi identificado como D-glicose (tR, 12,72) [amostras autênticas, D-glicose (tR, 12,64) e L- glicose (tR, 11,48 min)] (Tanaka et al., 2007).
[00233] Um composto denominado R7-2 foi obtido a partir da bioconversão enzimática de rebaudiosídeo D3. A elucidação da estrutura e as atribuições espectrais de NMR completas (1H e 13 C) para R7-2 foram feitas com base em extensas NMR 1D e 2D, bem como dados espectrais de massa de alta resolução e estudos de hidrólise, que sugeriram a estrutura como ácido 13-[(2-O-β-D-glicopiranosil-3-O-β-D-glicopiranosil-6- O-β-D-glicopiranosil-β-D-glicopiranosil)oxi]ent-caur-16-en-19-oico-[(2-O-β- D-glicopiranosil-3-O-β-D-glicopiranosil-β-D-glicopiranosil)éster (Figura 6). Exemplo 5: Produção de Novo Glicosídeo de Esteviol R6-1 por Bioconversão Enzimática:
[00234] Fragmentos de DNA de comprimento total de todos os genes UDP-glicosiltransferase (UGT) candidatos foram sintetizados comercialmente. Quase todos os códons do cDNA foram alterados para aqueles preferidos para E. coli (Genscript, NJ). O DNA sintetizado foi clonado em um vetor de expressão bacteriana pETite N-His SUMO Kan Vector (Lucigen).
[00235] Cada construto de expressão foi transformado em E. coli BL21 (DE3), que foi subsequentemente cultivada em meios LB contendo 50 μg/mL de canamicina a 37 °C até atingir um OD600 de 0,8-1,0. A expressão de proteína foi induzida por adição de 1 mM de isopropil β-D-1- tiogalactopiranosídeo (IPTG) e a cultura foi adicionalmente cultivada a 16 °C por 22 h. As células foram colhidas por centrifugação (3.000 x g; 10 min; 4 °C). Os sedimentos celulares foram coletados e foram usados imediatamente ou armazenados a -80 °C.
[00236] Os sedimentos celulares foram tipicamente ressuspensos em tampão de lise (50 mM de tampão fosfato de potássio, pH 7,2, 25 ug/ml de lisozima, 5ug/ml de DNase I, 20 mM de imidazol, 500 mM de NaCl, 10% de glicerol e 0,4% de Triton X-100). As células foram rompidas por sonicação abaixo de 4 °C e os restos celulares foram clarificados por centrifugação (18.000 x g; 30 min). O sobrenadante foi carregado em uma coluna de afinidade equilibrada (tampão de equilíbrio: 50 mM de tampão fosfato de potássio, pH 7,2, 20 mM de imidazol, 500 mM de NaCL, 10% de glicerol) Ni-NTA (Qiagen). Após o carregamento da amostra de proteína, a coluna foi lavada com tampão de equilíbrio para remover proteínas contaminantes não ligadas. Os polipeptídeos recombinantes UGT marcados com His foram eluídos por tampão de equilíbrio contendo 250 mM de imidazol.
[00237] Os polipeptídeos recombinantes UGTs candidatos purificados foram verificados quanto à atividade de glicosilação usando rebaudiosídeo D (Reb D) como substrato. Tipicamente, o polipeptídeo recombinante (10-50 μg) foi testado em um sistema de reação 200 μI in vitro. O sistema de reação continha 50 mM de tampão de fosfato de potássio, pH 7,2, 3 mM de MgCl2, 0,5 mg/ml de substrato Reb D, 1 mM de UDP-glicose ou UDP e/ou sacarose sintase (SUS) e 250 mM de sacarose. A reação foi realizada a 30-37 °C e a reação de 50 uL foi terminada adicionando 200 μL de 1-butanol em vários pontos de tempo. As amostras foram extraídas três vezes com 200 μL de 1-butanol. A fração reunida foi seca e dissolvida em 100 μL de metanol a 80% para análise por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC).
[00238] A análise por HPLC foi então realizada usando um sistema Dionex UPLC ultimate 3000 (Sunnyvale, CA), incluindo uma bomba quaternária, um compartimento de coluna de temperatura controlada, um amostrador automático e um detector de absorção de UV. Uma coluna Synergi Hydro-RP (Phenomenex) com coluna de guarda foi usada para a caracterização de glicosídeos de esteviol nas amostras reunidas. A fase móvel A é água e a fase móvel B é acetonitrila. O comprimento de onda de detecção usado na análise por HPLC foi de 210 nm.
[00239] Após a triagem da atividade, constatou-se que HV1 (SEQ ID NO: 3) tinha forte atividade para produzir glicosídeo de esteviol R6-1 (Figura 9). Conforme mostrado na Figura 10, HV1 pode converter Reb D em R6-1. Mais R6-1 pode ser produzido após um tempo de reação mais longo (24 h, Figura 10, Painel C). Exemplo 6: Identificação de Produção de R6-1 por Análise LC-MS
[00240] A fim de confirmar os compostos produzidos, o composto produzido foi analisado por análise LC-MS comparando com os padrões e suas identidades, confirmadas.
[00241] As mesmas amostras da bioconversão enzimática acima foram analisadas por LCMS usando a coluna Synergy Hydro-RP. A fase móvel A era 0,1% de ácido fórmico em água e a fase móvel B era 0,1% de ácido fórmico em acetonitrila. A taxa de fluxo foi de 0,6 ml/minuto. A análise por espectrometria de massa das amostras foi feita no Espectrômetro de Massa Q Exactive Hybrid Quadrupole-Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) com um método otimizado em modo de íon positivo.
[00242] A fórmula molecular do composto R6-1 foi deduzida como C56H90O33 com base em seu espectro de massa de alta resolução (HR) positivo que mostrou íons adutos correspondendo a [M+ H]+ em m/z
1291.5430 e [M+ Na]+ em m/z 1313.5245 (Figura 11). A estrutura prevista de R6-1 é apresentada na Figura 9 e Figura 12. Exemplo 7: A estrutura de R6-1 foi analisada por NMR:
[00243] O composto R6-1 produzido foi purificado por cromatografia semi-preparativa conforme descrito acima.
[00244] Os dados espectrais de massa de alta resolução foram gerados com um instrumento LTQ Orbitrap Discovery HRMS, com sua resolução ajustada para 30k. Dados digitalizados de m/z 150 a 1500 no modo de eletropulverização de íons positivos. A tensão da agulha foi ajustada para 4 kV; as outras condições da fonte foram gás de bainha = 25, gás aux = 0, gás de varredura = 5 (todos os fluxos de gás em unidades arbitrárias), tensão capilar = 30V, temperatura capilar = 300 °C e tensão da lente do tubo = 75. A amostra foi diluída com piridina e injetada 50 microlitros.
[00245] Os espectros de NMR foram adquiridos em Bruker
Avance DRX 500 MHz ou instrumento Varian INOVA 600 MHz usando sequências de pulso padrão. Os espectros de NMR 1D (1H e 13 C) e 2D (TOCSY, HSQC, ROESY e HMBC) foram realizados em C5D5N.
[00246] A fórmula molecular de R6-1 foi deduzida como C56H90O33 com base em seu espectro de massa de alta resolução (HR) positivo que mostrou adutos em m/z 1308.5693 e 1313.5236 correspondendo a íons [M+ NH4]+ e [M+Na]+, respectivamente; essa 13 composição foi suportada por dados espectrais de C NMR. O espectro 1H NMR de R6-1 mostrou a presença de dois singletos de sp3 metil em δ 1,12 e 1,48; dois prótons olefínicos como singletos em δ 5,01 e 5,64 de um vínculo duplo exocíclico, nove sp3 metilenos e dois prótons de sp3 metino entre δ 0,74-2,87 característico para os diterpenoides ent-caurano isolados mais cedo a partir do gênero Stevia. O esqueleto básico de ent-caurano diterpenoides foi suportado por correlações TOCSY (H1/H-2; H-2/H-3; H- 5/H-6; H-6/H-7; H-9/H-11; H-11/H-12) e HMBC (H-1/C-2, C- 10; H-3/C-1, C- 2, C-4, C-5, C-18, C-19; H-5/C-4, C-6, C-7, C-9, C-10, C-18, C-19, C-20; H- 9/C-8, C-10, C-11, C-12, C-14, C-15; H-14/C-8, C-9, C-13, C-15, C-16 e H- 17/C-13, C-15, C-16).
[00247] A hidrólise ácida de R6-1 com 5% de H2SO4 proporcionou D-glicose, que foi identificada por comparação direta com amostra autêntica por TLC, sugeriu a presença de seis porções de glicopiranosil em sua estrutura molecular (Bedir et al., 2001; Chaturvedula et al., 2003; e Huan et al., 1998). A hidrólise enzimática de R6-1 ofereceu um composto que foi constatado como sendo idêntico ao esteviol com base nos dados espectrais de NMR (Ohtani et al, 1992). A configuração de D- glicose foi identificada preparando seu correspondente derivado de carboxilato de tiocarbamoil-tiazolidina com éster metílico da L-cisteína e O- tolil isotiocianato e, em comparação, de seu tempo de retenção com os açúcares padrão, conforme descrito na comparação da literatura (Tanaka et al., 2007). Com base nos resultados dos dados espectrais de NMR de R6-
1, foi concluído que há seis unidades de glicosil em sua estrutura que foi suportada pelo espectro 1H NMR de R6-1 que mostrou a presença de prótons anoméricos ressonando em δ 5,04, 5,05, 5,24, 5,37, 5,57 e 6,36; sugerindo seis unidades de açúcar em sua estrutura molecular. Uma comparação próxima do espectro 1H e 13 C NMR com rebaudiosídeo D sugeriu que o composto R6-1 também é um glicosídeo de esteviol que tem três resíduos de glicose que estão anexados ao C-13 hidroxil como um substituinte de glicotriosil 2,3-ramificado como um éter e porção de glicobiosil 2-substituída em C-19 como um éster deixando a atribuição da porção de glicosil adicional. As correlações chave TOCSY e HMBC mostradas na Figura 13 sugeriram a colocação da sexta porção de glicosil na posição C-2 do Açúcar V.
[00248] As grandes constantes de acoplamento observadas para os seis prótons anoméricos das frações de glicose em δ 5,04 (d, J = 7,6 Hz), 5,05 (d, J = 7,4 Hz), 5,24 (d, 1 = 7,6 Hz), 5,37 (d, J = 7,4 Hz), 5,57 (d, J = 7,7 Hz) e 6,36 (d, J = 7,6 Hz) sugeriram sua orientação β conforme relatado para glicosídeos de esteviol.
[00249] Os valores de 1H e 13 C NMR para todos os prótons e carbonos em R6-1 foram atribuídos com base nas correlações TOCSY, HMQC e HMBC e são dados na Tabela 2.
[00250] Com base nos resultados dos dados espectrais de massa de NMR e HR, bem como em estudos de hidrólise, a estrutura de R6-1 produzida pela conversão enzimática de rebaudiosídeo D foi deduzida como ácido 13-[(2-O-β-D-glicopiranosil-3-O-β-D-glicopiranosil-β-D- glicopiranosil)oxi]ent-caur-16-en-19-oico-[(2-O- {2-O-β-D-glicopiranosil)-β-D- glicopiranosil-β-D-glicopiranosil)éster (Figura 12).
[00251] R6-1 (250 µg) foi dissolvido em 2,5 ml de tampão de acetato de sódio 0,1 M mantendo o pH a 4,5 e 50 μL de pectinase crua a partir de Aspergillus niger (Sigma-Aldrich) foram adicionados. A mistura foi mexida a 50 °C por 48 horas e o produto precipitado durante a reação foi filtrado e então cristalizado. O produto resultante obtido foi identificado como esteviol por comparação de seus dados espectrais de 1H NMR (Ohtani et al., 1992).
[00252] R6-1 (500 μg) é dissolvido em MeOH (3 ml) e adicionado H2SO4 a 5% (10 mL). A mistura foi refluxada por 16 horas, esfriada à temperatura ambiente e então neutralizada com carbonato de sódio saturado. A fase aquosa foi extraída com acetato de etila (EtOAc, 2 x 15 ml) e a camada aquosa foi concentrada e comparada com açúcares padrão usando o sistema TLC EtOAc/n-butanol/água (2:7:1) e CH2Cl2/MeOH/água (Bedir et al., 2001; Chaturvedula et al., 2003; Huan et al., 1998); os açúcares em R6-1 foram identificados como D-glicose.
[00253] R6-1 (500 μg) foi hidrolisado com 0,5 M HCl (0,5 mL) por 1,5 h. Após esfriamento, a mistura foi passada através de uma coluna Amberlite IRA400 e o eluato foi liofilizado. O resíduo foi dissolvido em piridina (0,25 mL) e aquecido com éster metílico de L-cisteína HCI (2,5 mg) a 60 °C por 1,5 h e, então, isotiocianato de O-tolil (12,5 uL) foi adicionado à mistura e aquecido a 60 °C por 1,5 h adicional. A análise por HPLC da mistura de reação foi realizada por uma coluna Phenomenex Luna [C18, 150 x 4,6 mm (5 u)] usando a fase móvel 25% de acetonitrila-0,2% de água TFA, 1 mL/min sob detecção de UV a 250 nm. O açúcar foi identificado como D-glicose (tR, 12,64) [amostras autênticas, D-glicose (tR, 12,54) e L- glicose (tR, 11,42 min)] (Tanaka et al., 2007).
[00254] As atribuições espectrais de 1H e 13 C NMR completas para R6-1 foram feitas com base em extensas NMR 1D e 2D, bem como dados espectrais de massa de alta resolução e hidrólise, o que sugeriu a estrutura como ácido 13-[(2-O-β-D-glicopiranosil-3-O-β-D-glicopiranosil-β-D- glicopiranosil)oxi]ent-caur-16-en-19-oico [(2-O-{2-O-β-D-glicopiranosil)-β-D- glicopiranosil-β-D-glicopiranosil)éster (Figura 12). Exemplo 8: Produção de Glicosídeos de Esteviol Rebaudiosídeo R6- 4A e Rebaudiosídeo R6-4B por Bioconversão Enzimática
[00255] Fragmentos de DNA de comprimento total de todos os genes UDP-glicosiltransferase (UGT) candidatos foram sintetizados comercialmente. Quase todos os códons do cDNA foram alterados para aqueles preferidos para E. coli (Genscript, NJ). O DNA sintetizado foi clonado em um vetor de expressão bacteriana pETite N-His SUMO Kan Vector (Lucigen).
[00256] Cada construto de expressão foi transformado em E. coli BL21 (DE3), que foi subsequentemente cultivada em meios LB contendo 50 μg/mL de canamicina a 37 °C até atingir um OD600 de 0,8-1,0. A expressão de proteína foi induzida por adição de 1 mM de isopropil β-D-1- tiogalactopiranosídeo (IPTG) e a cultura foi adicionalmente cultivada a 16 °C por 22 h. As células foram colhidas por centrifugação (3.000 x g; 10 min; 4 °C). Os sedimentos celulares foram coletados e foram usados imediatamente ou armazenados a -80 °C.
[00257] Os sedimentos celulares foram tipicamente ressuspensos em tampão de lise (50 mM de tampão fosfato de potássio, pH 7,2, 25 ug/ml de lisozima, 5ug/ml de DNase I, 20 mM de imidazol, 500 mM de NaCl, 10% de glicerol e 0,4% de Triton X-100). As células foram rompidas por sonicação abaixo de 4 °C e os restos celulares foram clarificados por centrifugação (18.000 x g; 30 min). O sobrenadante foi carregado em uma coluna de afinidade equilibrada (tampão de equilíbrio: 50 mM de tampão fosfato de potássio, pH 7,2, 20 mM de imidazol, 500 mM de NaCL, 10% de glicerol) Ni-NTA (Qiagen). Após o carregamento da amostra de proteína, a coluna foi lavada com tampão de equilíbrio para remover proteínas contaminantes não ligadas. Os polipeptídeos recombinantes UGT marcados com His foram eluídos por tampão de equilíbrio contendo 250 mM de imidazol.
[00258] Os polipeptídeos recombinantes UGTs candidatos purificados foram verificados quanto à atividade de glicosilação usando rebaudiosídeo Z (uma mistura de Reb Z1 e Reb Z2) como substrato.
Tipicamente, o polipeptídeo recombinante (10-50 μg) foi testado em um sistema de reação 200 μI in vitro. O sistema de reação continha 50 mM de tampão de fosfato de potássio, pH 7,2, 3 mM de MgCl2, 1 mg/ml de substrato Reb Z, 1 mM de UDP-glicose ou UDP e/ou sacarose sintase (SUS) e 250 mM de sacarose. A reação foi realizada a 30-37 °C e a reação de 50 uL foi terminada adicionando 200 μL de 1-butanol em vários pontos de tempo. As amostras foram extraídas três vezes com 200 μL de 1- butanol. A fração reunida foi seca e dissolvida em 100 μL de metanol a 80% para análise por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC).
[00259] A análise por HPLC foi então realizada usando um sistema Dionex UPLC ultimate 3000 (Sunnyvale, CA), incluindo uma bomba quaternária, um compartimento de coluna de temperatura controlada, um amostrador automático e um detector de absorção de UV. Uma coluna Synergi Hydro-RP (Phenomenex) com coluna de guarda foi usada para a caracterização de glicosídeos de esteviol nas amostras reunidas. Acetonitrila e água foram usadas para solução móvel na análise por HPLC. O comprimento de onda de detecção usado na análise por HPLC foi de 210 nm.
[00260] Após a triagem da atividade, constatou-se que HV1 (SEQ ID NO: 3) tinha forte atividade para produzir glicosídeo de esteviol R6-4 (Figura 14). Conforme mostrado na Figura 15, HV1 pode converter Reb Z em R6-4. Mais R6-4 pode ser produzido em um tempo de reação posterior (Figura 15, Painel C). Exemplo 9: Identificação de Produção de R6-4 por Análise LC-MS
[00261] A fim de confirmar os compostos produzidos, o composto produzido foi analisado por análise LC-MS comparando com os padrões e suas identidades, confirmadas.
[00262] As mesmas amostras da bioconversão enzimática acima foram analisadas por LCMS usando a coluna Synergy Hydro-RP. A fase móvel A era 0,1% de ácido fórmico em água e a fase móvel B era 0,1% de ácido fórmico em acetonitrila. A taxa de fluxo foi de 0,6 ml/minuto. A análise por espectrometria de massa das amostras foi feita no Espectrômetro de Massa Q Exactive Hybrid Quadrupole-Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) com um método otimizado no modo de íon positivo.
[00263] A fórmula molecular do composto R6-4 foi deduzida como C56H90O33 com base em seu espectro de massa de alta resolução (HR) positivo que mostrou íons adutos correspondendo a [M+ Na]+ em m/z
1313.5242 (Figura 16). As estruturas previstas de R6-4A e R6-4B são apresentadas nas Figuras 14 e 17. Exemplo 10: A estrutura de R6-4 foi Analisada por NMR:
[00264] O composto R6-4 produzido foi purificado por cromatografia semi-preparativa conforme descrito acima.
[00265] Os dados de HRMS foram gerados com um instrumento LTQ Orbitrap Discovery HRMS, com sua resolução ajustada para 30k. Dados digitalizados de m/z 150 a 1500 no modo de eletropulverização de íons positivos. A tensão da agulha foi ajustada para 4 kV; as outras condições da fonte foram gás de bainha = 25, gás aux = 0, gás de varredura = 5 (todos os fluxos de gás em unidades arbitrárias), tensão capilar = 30V, temperatura capilar = 300 °C e tensão da lente do tubo = 75. A amostra foi diluída com piridina e injetada 50 microlitros.
[00266] Os espectros de NMR foram adquiridos em instrumentos Bruker Avance DRX 500 MHz ou instrumento Varian INOVA 600 MHz usando sequências de pulso padrão. Os espectros de NMR 1D (1H e 13 C) e 2D (TOCSY, HSQC, ROESY e HMBC) foram realizados em C5D5N.
[00267] A fórmula molecular do composto R6-4 foi deduzida como C56H90O33 com base em seu espectro de massa de alta resolução (HR) positivo que mostrou adutos em m/z 1308.5692 e 1313.5237 correspondendo a íons [M+ NH4]+ e [M+Na]+ respectivamente e essa 13 composição foi suportada por dados espectrais de C NMR. Os dados espectrais de NMR e HPLC de R6-4 indicaram que esse composto é uma mistura de dois compostos principais R6-4A e R6-4B na razão de cerca de 70:30, logo, os dados espectrais de 1H e 13 C NMR de R6-4 mostraram dois picos para a maioria dos prótons e carbonos presentes em sua estrutura molecular. O espectro 1H NMR de R6-4 mostrou a presença de dois singletos de sp3 metil; dois prótons olefínicos como singletos de um vínculo duplo exocíclico, nove sp3 metilenos e dois prótons de sp3 metino entre característico para os diterpenoides ent-caurano isolados mais cedo a partir do gênero Stevia. A hidrólise enzimática de R6-4 ofereceu um composto que foi constatado como sendo idêntico ao esteviol com base nos dados espectrais de NMR (Ohtani et al, 1992). A hidrólise ácida de R6-4 com H2SO4 a 5% proporcionou D-glicose, que foi identificada por comparação direta com amostra autêntica por TLC, sugeriu a presença de seis porções de glicopiranosil em sua estrutura molecular (Bedir et al., 2001; Chaturvedula et al., 2003; e Huan et al., 1998). A configuração de D-glicose foi identificada preparando seu correspondente derivado de carboxilato de tiocarbamoil-tiazolidina com éster metílico da L-cisteína e O-tolil isotiocianato e, em comparação, de seu tempo de retenção com os açúcares padrão, conforme descrito na comparação da literatura (Tanaka et al. 2007). Com base nos resultados dos dados espectrais de NMR e estudos de hidrólise, foi concluído que há seis unidades de glicosil na estrutura molecular de R6-4 que foi suportado pelo espectro de 1H NMR que mostrou seis prótons anoméricos ressonando entre δ 5,03-6,44. Adicionalmente, as grandes constantes de acoplamento observadas para todos os seis prótons anoméricos das porções de glicosil sugeriram sua orientação β, conforme relatado para glicosídeos de esteviol.
[00268] Os valores de 1H e 13 C NMR para todos os prótons e carbonos para compostos R64A e R6-4B foram atribuídos com base nas correlações TOCSY, HMQC, HMBC e ROESY e são dados na Tabela 3.
[00269] Uma comparação próxima do espectro de 1H e 13
C NMR com rebaudiosídeo Z (uma mistura de Reb Z1 e Reb Z2), bem como a partir das correlações chave de TOCSY, ROESY e HMBC sugeriram que o composto R6-4 é uma mistura de dois glicosídeos de esteviol, dos quais o principal composto está tendo três unidades de glicosil que estão anexadas ao C-13 hidroxil como um éter e outras três unidades de glicosil em C-19 como um éster, conforme mostrado em R6-4A, enquanto o composto menor está tendo duas unidades de glicosil que estão anexadas ao C-13 hidroxil como um éter e quatro unidades de glicosil em C-19 como um éster que foi representado em R6-4B.
[00270] Com base nos resultados dos dados espectrais de massa de NMR e HR, bem como nos estudos de hidrólise, a estrutura de R6-4 produzida pela conversão enzimática do rebaudiosídeo Z, que é uma mistura de dois compostos principais, foi deduzida como ácido 13-[(2-O-{2- O-β-D-glicopiranosil-β-D-glicopiranosil)-β-D-glicopiranosil)oxi]ent-caur-16- en-19-óico-[(2-O-{2-O-β-D-glicopiranosil)-β-D-glicopiranosil-β-D- glicopiranosil)éster (R6-4A) ou ácido 13-[(2-O-β-D-glicopiranosil-β-D- glicopiranosil)oxi]ent-caur-16-en-19-óico-[(2-0-[(2-0-{2-0-β-D-glicopiranosil- β-D-glicopiranosil)-β-D-glicopiranosil)-β-D-glicopiranosil)éster (R64B) (Figura 17).
[00271] O composto R6-4 (1 mg) foi dissolvido em 10 ml de tampão de acetato de sódio 0,1 M mantendo o pH a 4,5 e 250 μL de pectinase crua a partir de Aspergillus niger (SigmaAldrich). A mistura foi mexida a 50 °C por 48 h e o produto precipitado durante a reação foi filtrado e então solidificado. O produto resultante obtido foi identificado como esteviol por comparação de seus dados espectrais de 1H NMR (Ohtani et al., 1992).
[00272] O composto R6-4 (500 μg) é dissolvido em MeOH (5 mL) e adicionado H2SO4 a 5% (15 mL). A mistura foi refluxada por 24 horas, esfriada à temperatura ambiente e então neutralizada com carbonato de sódio saturado. A fase aquosa foi extraída com acetato de etila (EtOAc, 2 x 25 ml) e a camada aquosa foi concentrada e comparada com açúcares padrão usando o sistema TLC EtOAc/n-butanol/água (2:7:1) e CH2Cl2/MeOH/água (Bedir et al., 2001; Chaturvedula et al., 2003; Huan et al., 1998); os açúcares em R6-4 foram identificados como D-glicose.
[00273] O composto R6-4 (1 mg) foi hidrolisado com 0,5 M HCl (2 mL) por 1,5 h. Após esfriamento, a mistura foi passada através de uma coluna Amberlite IRA400 e o eluato foi liofilizado. O resíduo foi dissolvido em piridina (0,75 mL) e aquecido com éster metílico de L-cisteína HCI (5 mg) a 60 °C por 1,5 h e, então, isotiocianato de O-tolil (30 μL) foi adicionado à mistura e aquecido a 60 °C por 1,5 h adicional. A análise por HPLC da mistura de reação foi realizada por uma coluna Phenomenex Luna [C18, 150 x 4,6 mm (5 u)] usando a fase móvel 25% de acetonitrila-0,2% de água TFA, 1 mL/min sob detecção de UV a 250 nm. O açúcar foi identificado como D-glicose (tR, 12,38) [amostras autênticas, D-glicose (tR, 12,44) e L- glicose (tR, 11,30 min)] (Tanaka et al., 2007). Sequências: UGT76G1: Sequência de Aminoácidos (SEQ ID NO: 1)
MENKTETTVRRRRRIILFPVPFQGHINPILQLANVLYSKGFSITIFHTN FNKPKTSNYPHFTFRFILDNDPQDERISNLPTHGPLAGMRIPIINEHGADEL RRELELLMLASEEDEEVSCLITDALWYFAQSVADSLNLRRLVLMTSSLFNF HAHVSLPQFDELGYLDPDDKTRLEEQASGFPMLKVKDIKSAYSNWQILKEI LGKMIKQTKASSGVIWNSFKELEESELETVIREIPAPSFLIPLPKHLTASSSS LLDHDRTVFQWLDQQPPSSVLYVSFGSTSEVDEKDFLEIARGLVDSKQSF LWVVRPGFVKGSTWVEPLPDGFLGERGRIVKWVPQQEVLAHGAIGAFWT HSGWNSTLESVCEGVPMIFSDFGLDQPLNARYMSDVLKVGVYLENGWER GEIANAIRRVMVDEEGEYIRQNARVLKQKADVSLMKGGSSYESLESLVSYI
SSL UGT76G1: Sequência de DNA (SEQ ID NO: 2)
ATGGAGAATAAGACAGAAACAACCGTAAGACGGAGGCGGAGGA TTATCTTGTTCCCTGTACCATTTCAGGGCCATATTAATCCGATCCTCCA ATTAGCAAACGTCCTCTACTCCAAGGGATTTTCAATAACAATCTTCCATA CTAACTTTAACAAGCCTAAAACGAGTAATTATCCTCACTTTACATTCAGG TTCATTCTAGACAACGACCCTCAGGATGAGCGTATCTCAAATTTACCTA CGCATGGCCCCTTGGCAGGTATGCGAATACCAATAATCAATGAGCATG GAGCCGATGAACTCCGTCGCGAGTTAGAGCTTCTCATGCTCGCAAGTG AGGAAGACGAGGAAGTTTCGTGCCTAATAACTGATGCGCTTTGGTACT TCGCCCAATCAGTCGCAGACTCACTGAATCTACGCCGTTTGGTCCTTAT GACAAGTTCATTATTCAACTTTCACGCACATGTATCACTGCCGCAATTT GACGAGTTGGGTTACCTGGACCCGGATGACAAAACGCGATTGGAGGA ACAAGCGTCGGGCTTCCCCATGCTGAAAGTCAAAGATATTAAGAGCGC TTATAGTAATTGGCAAATTCTGAAAGAAATTCTCGGAAAAATGATAAAG CAAACCAAAGCGTCCTCTGGAGTAATCTGGAACTCCTTCAAGGAGTTA GAGGAATCTGAACTTGAAACGGTCATCAGAGAAATCCCCGCTCCCTCG TTCTTAATTCCACTACCCAAGCACCTTACTGCAAGTAGCAGTTCCCTCC TAGATCATGACCGAACCGTGTTTCAGTGGCTGGATCAGCAACCCCCGT CGTCAGTTCTATATGTAAGCTTTGGGAGTACTTCGGAAGTGGATGAAAA GGACTTCTTAGAGATTGCGCGAGGGCTCGTGGATAGCAAACAGAGCTT CCTGTGGGTAGTGAGACCGGGATTCGTTAAGGGCTCGACGTGGGTCG AGCCGTTGCCAGATGGTTTTCTAGGGGAGAGAGGGAGAATCGTGAAAT GGGTTCCACAGCAAGAGGTTTTGGCTCACGGAGCTATAGGGG CCTTTTGGACCCACTCTGGTTGGAATTCTACTCTTGAAAGTGTCTGTGA AGGCGTTCCAATGATATTTTCTGATTTTGGGCTTGACCAGCCTCTAAAC GCTCGCTATATGTCTGATGTGTTGAAGGTTGGCGTGTACCTGGAGAAT GGTTGGGAAAGGGGGGAAATTGCCAACGCCATACGCCGGGTAATGGT GGACGAGGAAGGTGAGTACATACGTCAGAACGCTCGGGTTTTAAAACA AAAAGCGGACGTCAGCCTTATGAAGGGAGGTAGCTCCTATGAATCCCT
AGAATCCTTGGTAAGCTATATATCTTCGTTATAA HV1 UDP-glicosiltransferase: Sequência de Aminoácidos (SEQ ID NO: 3)
MDGNSSSSPLHVVICPWLALGHLLPCLDIAERLASRGHRVSFVSTP RNIARLPPLRPAVAPLVDFVALPLPHVDGLPEGAESTNDVPYDKFELHRKA FDGLAAPFSEFLRAACAEGAGSRPDWLIVDTFHHWAAAAAVENKVPCVM LLLGAATVIAGFARGVSEHAAAAVGKERPAAEAPSFETERRKLMTTQNAS GMTVAERYFLTLMRSDLVAIRSCAEWEPESVAALTTLAGKPVVPLGLLPPS PEGGRGVSKEDAAVRWLDAQPAKSVVYVALGSEVPLRAEQVHELALGLE LSGARFLWALRKPTDAPDAAVLPPGFEERTRGRGLVVTGWVPQIGVLAH GAVAAFLTHCGWNSTIEGLLFGHPLIMLPISSDQGPNARLMEGRKVGMQV PRDESDGSFRREDVAATVRAVAVEEDGRRVFTANAKKMQEIVADGACHE
RCIDGFIQQLRSYKA HV1 UDP-glicosiltransferase: Sequência de DNA (SEQ ID NO: 4)
ATGGATGGTAACTCCTCCTCCTCGCCGCTGCATGTGGTCATTTG TCCGTGGCTGGCTCTGGGTCACCTGCTGCCGTGTCTGGATATTGCTGA ACGTCTGGCGTCACGCGGCCATCGTGTCAGTTTTGTGTCCACCCCGC GCAACATTGCCCGTCTGCCGCCGCTGCGTCCGGCTGTTGCACCGCTG GTTGATTTCGTCGCACTGCCGCTGCCGCATGTTGACGGTCTGCCGGA GGGTGCGGAATCGACCAATGATGTGCCGTATGACAAATTTGAACTGCA CCGTAAGGCGTTCGATGGTCTGGCGGCCCCGTTTAGCGAATTTCTGCG TGCAGCTTGCGCAGAAGGTGCAGGTTCTCGCCCGGATTGGCTGATTGT GGACACCTTTCATCACTGGGCGGCGGCGGCGGCGGTGGAAAACAAAG TGCCGTGTGTTATGCTGCTGCTGGGTGCAGCAACGGTGATCGCTGGTT TCGCGCGTGGTGTTAGCGAACATGCGGCGGCGGCGGTGGGTAAAGAA CGTCCGGCTGCGGAAGCCCCGAGTTTTGAAACCGAACGTCGCAAGCT GATGACCACGCAGAATGCCTCCGGCATGACCGTGGCAGAACGCTATTT CCTGACGCTGATGCGTAGCGATCTGGTTGCCATCCGCTCTTGCGCAGA ATGGGAACCGGAAAGCGTGGCAGCACTGACCACGCTGGCAGGTAAAC CGGTGGTTCCGCTGGGTCTGCTGCCGCCGAGTCCGGAAGGCGGTCGT GGCGTTTCCAAAGAAGATGCTGCGGTCCGTTGGCTGGACGCACAGCC GGCAAAGTCAGTCGTGTACGTCGCACTGGGTTCGGAAGTGCCGCTGC GTGCGGAACAAGTTCACGAACTGGCACTGGGCCTGGAACTGAGCGGT GCTCGCTTTCTGTGGGCGCTGCGTAAACCGACCGATGCACCGGACGC CGCAGTGCTGCCGCCGGGTTTCGAAGAACGTACCCGCGGCCGTGGTC TGGTTGTCACGGGTTGGGTGCCGCAGATTGGCGTTCTGGCTCATGGT GCGGTGGCTGCGTTTCTGACCCACTGTGGCTGGAACTCTACGATCGAA GGCCTGCTGTTCGGTCATCCGCTGATTATGCTGCCGATCAGCTCTGAT CAGGGTCCGAATGCGCGCCTGATGGAAGGCCGTAAAGTCGGTATGCA AGTGCCGCGTGATGAATCAGACGGCTCGTTTCGTCGCGAAGATGTTGC CGCAACCGTCCGCGCCGTGGCAGTTGAAGAAGACGGTCGTCGCGTCT TCACGGCTAACGCGAAAAAGATGCAAGAAATTGTGGCCGATGGCGCAT GCCACGAACGTTGTATTGACGGTTTTATCCAGCAACTGCGCAGTTACA
AGGCGTAA Enzima de fusão UGT76G1- sacarose sintase (SUS): Sequência de Aminoácidos (SEQ ID NO: 5)
MENKTETTVRRRRRIILFPVPFQGHINPILQLANVLYSKGFSITIFHTN FNKPKTSNYPHFTFRFILDNDPQDERISNLPTHGPLAGMRIPIINEHGADEL RRELELLMLASEEDEEVSCLITDALWYFAQSVADSLNLRRLVLMTSSLFNF HAHVSLPQFDELGYLDPDDKTRLEEQASGFPMLKVKDIKSAYSNWQILKEI LGKMIKQTKASSGVIWNSFKELEESELETVIREIPAPSFLIPLPKHLTASSSS LLDHDRTVFQWLDQQPPSSVLYVSFGSTSEVDEKDFLEIARGLVDSKQSF LWVVRPGFVKGSTWVEPLPDGFLGERGRIVKWVPQQEVLAHGAIGAFWT HSGWNSTLESVCEGVPMIFSDFGLDQPLNARYMSDVLKVGVYLENGWER GEIANAIRRVMVDEEGEYIRQNARVLKQKADVSLMKGGSSYESLESLVSYI SSLGSGANAERMITRVHSQRERLNETLVSERNEVLALLSRVEAKGKGILQ QNQIIAEFEALPEQTRKKLEGGPFFDLLKSTQEAIVLPPWVALAVRPRPGV WEYLRVNLHALVVEELQPAEFLHFKEELVDGVKNGNFTLELDFEPFNASIP RPTLHKYIGNGVDFLNRHLSAKLFHDKESLLPLLKFLRLHSHQGKNLMLSE KIQNLNTLQHTLRKAEEYLAELKSETLYEEFEAKFEEIGLERGWGDNAERV LDMIRLLLDLLEAPDPCTLETFLGRVPMVFNVVILSPHGYFAQDNVLGYPD TGGQVVYILDQVRALEIEMLQRIKQQGLNIKPRILILTRLLPDAVGTTCGERL ERVYDSEYCDILRVPFRTEKGIVRKWISRFEVWPYLETYTEDAAVELSKEL NGKPDLIIGNYSDGNLVASLLAHKLGVTQCTIAHALEKTKYPDSDIYWKKLD DKYHFSCQFTADIFAMNHTDFIITSTFQEIAGSKETVGQYESHTAFTLPGLY RVVHGIDVFDPKFNIVSPGADMSIYFPYTEEKRRLTKFHSEIEELLYSDVEN KEHLCVLKDKKKPILFTMARLDRVKNLSGLVEWYGKNTRLRELANLVVVG GDRRKESKDNEEKAEMKKMYDLIEEYKLNGQFRWISSQMDRVRNGELYR YICDTKGAFVQPALYEAFGLTVVEAMTCGLPTFATCKGGPAEIIVHGKSG FHIDPYHGDQAADTLADFFTKCKEDPSHWDEISKGGLQRIEEKYTWQIYS
QRLLTLTGVYGFWKHVSNLDRLEARRYLEMFYALKYRPLAQAVPLAQDD Enzima de fusão UGT76G1- sacarose sintase (SUS): Sequência de DNA (SEQ ID NO: 6)
ATGGAGAATAAGACAGAAACAACCGTAAGACGGAGGCGGAGGA TTATCTTGTTCCCTGTACCATTTCAGGGCCATATTAATCCGATCCTCCA ATTAGCAAACGTCCTCTACTCCAAGGGATTTTCAATAACAATCTTCCATA CTAACTTTAACAAGCCTAAAACGAGTAATTATCCTCACTTTACATTCAGG TTCATTCTAGACAACGACCCTCAGGATGAGCGTATCTCAAATTTACCTA CGCATGGCCCCTTGGCAGGTATGCGAATACCAATAATCAATGAGCATG GAGCCGATGAACTCCGTCGCGAGTTAGAGCTTCTCATGCTCGCAAGTG AGGAAGACGAGGAAGTTTCGTGCCTAATAACTGATGCGCTTTGGTACT TCGCCCAATCAGTCGCAGACTCACTGAATCTACGCCGTTTGGTCCTTAT GACAAGTTCATTATTCAACTTTCACGCACATGTATCACTGCCGCAATTT GACGAGTTGGGTTACCTGGACCCGGATGACAAAACGCGATTGGAGGA ACAAGCGTCGGGCTTCCCCATGCTGAAAGTCAAAGATATTAAGAGCGC TTATAGTAATTGGCAAATTCTGAAAGAAATTCTCGGAAAAATGATAAAG CAAACCAAAGCGTCCTCTGGAGTAATCTGGAACTCCTTCAAGGAGTTA GAGGAATCTGAACTTGAAACGGTCATCAGAGAAATCCCCGCTCCCTCG TTCTTAATTCCACTACCCAAGCACCTTACTGCAAGTAGCAGTTCCCTCC TAGATCATGACCGAACCGTGTTTCAGTGGCTGGATCAGCAACCCCCGT CGTCAGTTCTATATGTAAGCTTTGGGAGTACTTCGGAAGTGGATGAAAA GGACTTCTTAGAGATTGCGCGAGGGCTCGTGGATAGCAAACAGAGCTT CCTGTGGGTAGTGAGACCGGGATTCGTTAAGGGCTCGACGTGGGTCG AGCCGTTGCCAGATGGTTTTCTAGGGGAGAGAGGGAGAATCGTGAAAT GGGTTCCACAGCAAGAGGTTTTGGCTCACGGAGCTATAGGGGCCTTTT GGACCCACTCTGGTTGGAATTCTACTCTTGAAAGTGTCTGTGAAGGCG TTCCAATGATATTTTCTGATTTTGGGCTTGACCAGCCTCTAAACGCTCG CTATATGTCTGATGTGTTGAAGGTTGGCGTGTACCTGGAGAATGGTTG GGAAAGGGGGGAAATTGCCAACGCCATACGCCGGGTAATGGTGGACG AGGAAGGTGAGTACATACGTCAGAACGCTCGGGTTTTAAAACAAAAAG CGGACGTCAGCCTTATGAAGGGAGGTAGCTCCTATGAATCCCTAGAAT CCTTGGTAAGCTATATATCTTCGTTAGGTTCTGGTGCAAACGCTGAACG TATGATAACGCGCGTCCACAGCCAACGTGAGCGTTTGAACGAAACGCT TGTTTCTGAGAGAAACGAAGTCCTTGCCTTGCTTTCCAGGGTTGAAGC CAAAGGTAAAGGTATTTTACAACAAAACCAGATCATTGCTGAATTCGAA GCTTTGCCTGAACAAACCCGGAAGAAACTTGAAGGTGGTCCTTTCTTT GACCTTCTCAAATCCACTCAGGAAGCAATTGTGTTGCCACCATGGGTT GCTCTAGCTGTGAGGCCAAGGCCTGGTGTTTGGGAATACTTACGAGTC AATCTCCATGCTCTTGTCGTTGAAGAACTCCAACCTGCTGAGTTTCTTC ATTTCAAGGAAGAACTCGTTGATGGAGTTAAGAATGGTAATTTCACTCT TGAGCTTGATTTCGAGCCATTCAATGCGTCTATCCCTCGTCCAACACTC CACAAATACATTGGAAATGGTGTTGACTTCCTTAACCGTCATTTATCGG CTAAGCTCTTCCATGACAAGGAGAGTTTGCTTCCATTGCTTAAGTTCCT TCGTCTTCACAGCCACCAGGGCAAGAACCTGATGTTGAGCGAGAAGAT TCAGAACCTCAACACTCTGCAACACACCTTGAGGAAAGCAGAAGAGTA TCTAGCAGAGCTTAAGTCCGAAACACTGTATGAAGAGTTTGAGGCCAA GTTTGAGGAGATTGGTCTTGAGAGGGGATGGGGAGACAATGCAGAGC GTGTCCTTGACATGATACGTCTTCTTTTGGACCTTCTTGAGGCGCCTGA TCCTTGCACTCTTGAGACTTTTCTTGGAAGAGTACCAATGGTGTTCAAC GTTGTGATCCTCTCTCCACATGGTTACTTTGCTCAGGACAATGTTCTTG GTTACCCTGACACTGGTGGACAGGTTGTTTACATTCTTGATCAAGTTCG TGCTCTGGAGATAGAGATGCTTCAACGTATTAAGCAACAAGGACTCAA CATTAAACCAAGGATTCTCATTCTAACTCGACTTCTACCTGATGCGGTA GGAACTACATGCGGTGAACGTCTCGAGAGAGTTTATGATTCTGAGTAC TGTGATATTCTTCGTGTGCCCTTCAGAACAGAGAAGGGTATTGTTCGCA AATGGATCTCAAGGTTCGAAGTCTGGCCATATCTAGAGACTTACACCG AGGATGCTGCGGTTGAGCTATCGAAAGAATTGAATGGCAAGCCTGACC TTATCATTGGTAACTACAGTGATGGAAATCTTGTTGCTTCTTTATTGGCT CACAAACTTGGTGTCACTCAGTGTACCATTGCTCATGCTCTTGAGAAAA CAAAGTACCCGGATTCTGATATCTACTGGAAGAAGCTTGACGACAAGT ACCATTTCTCATGCCAGTTCACTGCGGATATTTTCGCAATGAACCACAC TGATTTCATCATCACTAGTACTTTCCAAGAAATTGCTGGAAGCAAAGAA ACTGTTGGGCAGTATGAAAGCCACACAGCCTTTACTCTTCCCGGATTG TATCGAGTTGTTCACGGGATTGATGTGTTTGATCCCAAGTTCAACATTG TCTCTCCTGGTGCTGATATGAGCATCTACTTCCCTTACACAGAGGAGAA GCGTAGATTGACTAAGTTCCACTCTGAGATCGAGGAGCTCCTCTACAG CGATGTTGAGAACAAAGAGCACTTATGTGTGCTCAAGGACAAGAAGAA GCCGATTCTCTTCACAATGGCTAGGCTTGATCGTGTCAAGAACTTGTCA GGTCTTGTTGAGTGGTACGGGAAGAACACCCGCTTGCGTGAGCTAGCT AACTTGGTTGTTGTTGGAGGAGACAGGAGGAAAGAGTCAAAGGACAAT GAAGAGAAAGCAGAGATGAAGAAAATGTATGATCTCATTGAGGAATAC AAGCTAAACGGTCAGTTCAGGTGGATCTCCTCTCAGATGGACCGGGTA AGGAACGGTGAGCTGTACCGGTACATCTGTGACACCAAGGGTGCTTTT GTCCAACCTGCATTATATGAAGCCTTTGGGTTAACTGTTGTGGAGGCTA TGACTTGTGGTTTACCGACTTTCGCCACTTGCAAAGGTGGTCCAGCTG AGATCATTGTGCACGGTAAATCGGGTTTCCACATTGACCCTTACCATGG TGATCAGGCTGCTGATACTCTTGCTGATTTCTTCACCAAGTGTAAGGAG GATCCATCTCACTGGGATGAGATCTCAAAAGGAGGGCTTCAGAGGATT GAGGAGAAATACACTTGGCAAATCTATTCACAGAGGCTCTTGACATTGA CTGGTGTGTATGGATTCTGGAAGCATGTCTCGAACCTTGACCGTCTTG AGGCTCGCCGTTACCTTGAAATGTTCTATGCATTGAAGTATCGCCCATT
GGCTCAGGCTGTTCCTCTTGCACAAGATGATTGA Enzima de fusão HV1-SUS: Sequência de Aminoácidos (SEQ ID NO: 7)
MDGNSSSSPLHVVICPWLALGHLLPCLDIAERLASRGHRVSFVSTP RNIARLPPLRPAVAPLVDFVALPLPHVDGLPEGAESTNDVPYDKFELHRKA FDGLAAPFSEFLRAACAEGAGSRPDWLIVDTFHHWAAAAAVENKVPCVM LLLGAATVIAGFARGVSEHAAAAVGKERPAAEAPSFETERRKLMTTQNAS GMTVAERYFLTLMRSDLVAIRSCAEWEPESVAALTTLAGKPVVPLGLLPPS PEGGRGVSKEDAAVRWLDAQPAKSVVYVALGSEVPLRAEQVHELALGLE LSGARFLWALRKPTDAPDAAVLPPGFEERTRGRGLVVTGWVPQIGVLAH GAVAAFLTHCGWNSTIEGLLFGHPLIMLPISSDQGPNARLMEGRKVGMQV PRDESDGSFRREDVAATVRAVAVEEDGRRVFTANAKKMQEIVADGACHE RCIDGFIQQLRSYKAGSGANAERMITRVHSQRERLNETLVSERNEVLALLS RVEAKGKGILQQNQIIAEFEALPEQTRKKLEGGPFFDLLKSTQEAIVLPPWV ALAVRPRPGVWEYLRVNLHALVVEELQPAEFLHFKEELVDGVKNGNFTLE LDFEPFNASIPRPTLHKYIGNGVDFLNRHLSAKLFHDKESLLPLLKFLRLHS HQGKNLMLSEKIQNLNTLQHTLRKAEEYLAELKSETLYEEFEAKFEEIGLER GWGDNAERVLDMIRLLLDLLEAPDPCTLETFLGRVPMVFNVVILSPHGYFA QDNVLGYPDTGGQVVYILDQVRALEIEMLQRIKQQGLNIKPRILILTRLLPDA VGTTCGERLERVYDSEYCDILRVPFRTEKGIVRKWISRFEVWPYLETYTED AAVELSKELNGKPDLIIGNYSDGNLVASLLAHKLGVTQCTIAHALEKTKYPD SDIYWKKLDDKYHFSCQFTADIFAMNHTDFIITSTFQEIAGSKETVGQYESH TAFTLPGLYRVVHGIDVFDPKFNIVSPGADMSIYFPYTEEKRRLTKFHSEIE ELLYSDVENKEHLCVLKDKKKPILFTMARLDRVKNLSGLVEWYGKNTRLRE LANLVVVGGDRRKESKDNEEKAEMKKMYDLIEEYKLNGQFRWISSQMDR VRNGELYRYICDTKGAFVQPALYEAFGLTVVEAMTCGLPTFATCKGGPAEI IVHGKSGFHIDPYHGDQAADTLADFFTKCKEDPSHWDEISKGGLQRIEEKY TWQIYSQRLLTLTGVYGFWKHVSNLDRLEARRYLEMFYALKYRPLAQAVP
LAQDD Enzima de fusão HV1-SUS: Sequência de DNA (SEQ ID NO: 8)
ATGGATGGTAACTCCTCCTCCTCGCCGCTGCATGTGGTCATTTGTCCG TGGCTGGCTCTGGGTCACCTGCTGCCGTGTCTGGATATTGCTGAACGT CTGGCGTCACGCGGCCATCGTGTCAGTTTTGTGTCCACCCCGCGCAA CATTGCCCGTCTGCCGCCGCTGCGTCCGGCTGTTGCACCGCTGGTTG ATTTCGTCGCACTGCCGCTGCCGCATGTTGACGGTCTGCCGGAGGGT GCGGAATCGACCAATGATGTGCCGTATGACAAATTTGAACTGCACCGT AAGGCGTTCGATGGTCTGGCGGCCCCGTTTAGCGAATTTCTGCGTGCA GCTTGCGCAGAAGGTGCAGGTTCTCGCCCGGATTGGCTGATTGTGGA CACCTTTCATCACTGGGCGGCGGCGGCGGCGGTGGAAAACAAAGTGC CGTGTGTTATGCTGCTGCTGGGTGCAGCAACGGTGATCGCTGGTTTCG CGCGTGGTGTTAGCGAACATGCGGCGGCGGCGGTGGGTAAAGAACGT CCGGCTGCGGAAGCCCCGAGTTTTGAAACCGAACGTCGCAAGCTGAT GACCACGCAGAATGCCTCCGGCATGACCGTGGCAGAACGCTATTTCCT GACGCTGATGCGTAGCGATCTGGTTGCCATCCGCTCTTGCGCAGAATG GGAACCGGAAAGCGTGGCAGCACTGACCACGCTGGCAGGTAAACCGG TGGTTCCGCTGGGTCTGCTGCCGCCGAGTCCGGAAGGCGGTCGTGGC GTTTCCAAAGAAGATGCTGCGGTCCGTTGGCTGGACGCACAGCCGGC AAAGTCAGTCGTGTACGTCGCACTGGGTTCGGAAGTGCCGCTGCGTG CGGAACAAGTTCACGAACTGGCACTGGGCCTGGAACTGAGCGGTGCT CGCTTTCTGTGGGCGCTGCGTAAACCGACCGATGCACCGGACGCCGC AGTGCTGCCGCCGGGTTTCGAAGAACGTACCCGCGGCCGTGGTCTGG TTGTCACGGGTTGGGTGCCGCAGATTGGCGTTCTGGCTCATGGTGCG GTGGCTGCGTTTCTGACCCACTGTGGCTGGAACTCTACGATCGAAGGC CTGCTGTTCGGTCATCCGCTGATTATGCTGCCGATCAGCTCTGATCAG GGTCCGAATGCGCGCCTGATGGAAGGCCGTAAAGTCGGTATGCAAGT GCCGCGTGATGAATCAGACGGCTCGTTTCGTCGCGAAGATGTTGCCG CAACCGTCCGCGCCGTGGCAGTTGAAGAAGACGGTCGTCGCGTCTTC ACGGCTAACGCGAAAAAGATGCAAGAAATTGTGGCCGATGGCGCATG CCACGAACGTTGTATTGACGGTTTTATCCAGCAACTGCGCAGTTACAA GGCGGGTTCTGGTGCAAACGCTGAACGTATGATAACGCGCGTCCACA GCCAACGTGAGCGTTTGAACGAAACGCTTGTTTCTGAGAGAAACGAAG TCCTTGCCTTGCTTTCCAGGGTTGAAGCCAAAGGTAAAGGTATTTTACA ACAAAACCAGATCATTGCTGAATTCGAAGCTTTGCCTGAACAAACCCG GAAGAAACTTGAAGGTGGTCCTTTCTTTGACCTTCTCAAATCCACTCAG GAAGCAATTGTGTTGCCACCATGGGTTGCTCTAGCTGTGAGGCCAAGG CCTGGTGTTTGGGAATACTTACGAGTCAATCTCCATGCTCTTGTCGTTG AAGAACTCCAACCTGCTGAGTTTCTTCATTTCAAGGAAGAACTCGTTGA TGGAGTTAAGAATGGTAATTTCACTCTTGAGCTTGATTTCGAGCCATTC AATGCGTCTATCCCTCGTCCAACACTCCACAAATACATTGGAAATGGTG TTGACTTCCTTAACCGTCATTTATCGGCTAAGCTCTTCCATGACAAGGA GAGTTTGCTTCCATTGCTTAAGTTCCTTCGTCTTCACAGCCACCAGGGC AAGAACCTGATGTTGAGCGAGAAGATTCAGAACCTCAACACTCTGCAA CACACCTTGAGGAAAGCAGAAGAGTATCTAGCAGAGCTTAAGTCCGAA ACACTGTATGAAGAGTTTGAGGCCAAGTTTGAGGAGATTGGTCTTGAG AGGGGATGGGGAGACAATGCAGAGCGTGTCCTTGACATGATACGTCTT CTTTTGGACCTTCTTGAGGCGCCTGATCCTTGCACTCTTGAGACTTTTC TTGGAAGAGTACCAATGGTGTTCAACGTTGTGATCCTCTCTCCACATGG TTACTTTGCTCAGGACAATGTTCTTGGTTACCCTGACACTGGTGGACAG GTTGTTTACATTCTTGATCAAGTTCGTGCTCTGGAGATAGAGATGCTTC AACGTATTAAGCAACAAGGACTCAACATTAAACCAAGGATTCTCATTCT AACTCGACTTCTACCTGATGCGGTAGGAACTACATGCGGTGAACGTCT CGAGAGAGTTTATGATTCTGAGTACTGTGATATTCTTCGTGTGCCCTTC AGAACAGAGAAGGGTATTGTTCGCAAATGGATCTCAAGGTTCGAAGTC TGGCCATATCTAGAGACTTACACCGAGGATGCTGCGGTTGAGCTATCG AAAGAATTGAATGGCAAGCCTGACCTTATCATTGGTAACTACAGTGATG GAAATCTTGTTGCTTCTTTATTGGCTCACAAACTTGGTGTCACTCAGTG TACCATTGCTCATGCTCTTGAGAAAACAAAGTACCCGGATTCTGATATC TACTGGAAGAAGCTTGACGACAAGTACCATTTCTCATGCCAGTTCACTG CGGATATTTTCGCAATGAACCACACTGATTTCATCATCACTAGTACTTTC CAAGAAATTGCTGGAAGCAAAGAAACTGTTGGGCAGTATGAAAGCCAC ACAGCCTTTACTCTTCCCGGATTGTATCGAGTTGTTCACGGGATTGATG TGTTTGATCCCAAGTTCAACATTGTCTCTCCTGGTGCTGATATGAGCAT CTACTTCCCTTACACAGAGGAGAAGCGTAGATTGACTAAGTTCCACTCT GAGATCGAGGAGCTCCTCTACAGCGATGTTGAGAACAAAGAGCACTTA TGTGTGCTCAAGGACAAGAAGAAGCCGATTCTCTTCACAATGGCTAGG CTTGATCGTGTCAAGAACTTGTCAGGTCTTGTTGAGTGGTACGGGAAG AACACCCGCTTGCGTGAGCTAGCTAACTTGGTTGTTGTTGGAGGAGAC AGGAGGAAAGAGTCAAAGGACAATGAAGAGAAAGCAGAGATGAAGAAA ATGTATGATCTCATTGAGGAATACAAGCTAAACGGTCAGTTCAGGTGGA TCTCCTCTCAGATGGACCGGGTAAGGAACGGTGAGCTGTACCGGTACA TCTGTGACACCAAGGGTGCTTTTGTCCAACCTGCATTATATGAAGCCTT TGGGTTAACTGTTGTGGAGGCTATGACTTGTGGTTTACCGACTTTCGC CACTTGCAAAGGTGGTCCAGCTGAGATCATTGTGCACGGTAAATCGGG TTTCCACATTGACCCTTACCATGGTGATCAGGCTGCTGATACTCTTGCT GATTTCTTCACCAAGTGTAAGGAGGATCCATCTCACTGGGATGAGATCT CAAAAGGAGGGCTTCAGAGGATTGAGGAGAAATACACTTGGCAAATCT ATTCACAGAGGCTCTTGACATTGACTGGTGTGTATGGATTCTGGAAGC ATGTCTCGAACCTTGACCGTCTTGAGGCTCGCCGTTACCTTGAAATGTT CTATGCATTGAAGTATCGCCCATTGGCTCAGGCTGTTCCTCTTGCACAA
GATGATTAA Sacarose sintase I de Arabidopsis thaliana: Sequência de Aminoácidos (SEQ ID NO: 9)
MANAERMITRVHSQRERLNETLVSERNEVLALLSRVEAKGKGILQQ NQIIAEFEALPEQTRKKLEGGPFFDLLKSTQEAIVLPPWVALAVRPRPGVW EYLRVNLHALVVEELQPAEFLHFKEELVDGVKNGNFTLELDFEPFNASIPR PTLHKYIGNGVDFLNRHLSAKLFHDKESLLPLLKFLRLHSHQGKNLMLSEKI QNLNTLQHTLRKAEEYLAELKSETLYEEFEAKFEEIGLERGWGDNAERVLD MIRLLLDLLEAPDPCTLETFLGRVPMVFNVVILSPHGYFAQDNVLGYPDTG GQVVYILDQVRALEIEMLQRIKQQGLNIKPRILILTRLLPDAVGTTCGERLER VYDSEYCDILRVPFRTEKGIVRKWISRFEVWPYLETYTEDAAVELSKELNG KPDLIIGNYSDGNLVASLLAHKLGVTQCTIAHALEKTKYPDSDIYWKKLDDK YHFSCQFTADIFAMNHTDFIITSTFQEIAGSKETVGQYESHTAFTLPGLYRV VHGIDVFDPKFNIVSPGADMSIYFPYTEEKRRLTKFHSEIEELLYSDVENKE HLCVLKDKKKPILFTMARLDRVKNLSGLVEWYGKNTRLRELANLVVVGGD RRKESKDNEEKAEMKKMYDLIEEYKLNGQFRWISSQMDRVRNGELYRYIC DTKGAFVQPALYEAFGLTVVEAMTCGLPTFATCKGGPAEIIVHGKSGFHID PYHGDQAADTLADFFTKCKEDPSHWDEISKGGLQRIEEKYTWQIYSQRLL
TLTGVYGFWKHVSNLDRLEARRYLEMFYALKYRPLAQAVPLAQDD Sacarose sintase I de Arabidopsis thaliana: Sequência de DNA (SEQ ID NO: 10)
ATGGCAAACGCTGAACGTATGATTACCCGTGTCCACTCCCAACG CGAACGCCTGAACGAAACCCTGGTGTCGGAACGCAACGAAGTTCTGG CACTGCTGAGCCGTGTGGAAGCTAAGGGCAAAGGTATTCTGCAGCAAA ACCAGATTATCGCGGAATTTGAAGCCCTGCCGGAACAAACCCGCAAAA AGCTGGAAGGCGGTCCGTTTTTCGATCTGCTGAAATCTACGCAGGAAG CGATCGTTCTGCCGCCGTGGGTCGCACTGGCAGTGCGTCCGCGTCCG GGCGTTTGGGAATATCTGCGTGTCAACCTGCATGCACTGGTGGTTGAA GAACTGCAGCCGGCTGAATTTCTGCACTTCAAGGAAGAACTGGTTGAC GGCGTCAAAAACGGTAATTTTACCCTGGAACTGGATTTTGAACCGTTCA ATGCCAGTATCCCGCGTCCGACGCTGCATAAATATATTGGCAACGGTG TGGACTTTCTGAATCGCCATCTGAGCGCAAAGCTGTTCCACGATAAAG AATCTCTGCTGCCGCTGCTGAAATTCCTGCGTCTGCATAGTCACCAGG GCAAGAACCTGATGCTGTCCGAAAAAATTCAGAACCTGAATACCCTGC AACACACGCTGCGCAAGGCGGAAGAATACCTGGCCGAACTGAAAAGT GAAACCCTGTACGAAGAATTCGAAGCAAAGTTCGAAGAAATTGGCCTG GAACGTGGCTGGGGTGACAATGCTGAACGTGTTCTGGATATGATCCGT CTGCTGCTGGACCTGCTGGAAGCACCGGACCCGTGCACCCTGGAAAC GTTTCTGGGTCGCGTGCCGATGGTTTTCAACGTCGTGATTCTGTCCCC GCATGGCTATTTTGCACAGGACAATGTGCTGGGTTACCCGGATACCGG CGGTCAGGTTGTCTATATTCTGGATCAAGTTCGTGCGCTGGAAATTGAA ATGCTGCAGCGCATCAAGCAGCAAGGCCTGAACATCAAACCGCGTATT CTGATCCTGACCCGTCTGCTGCCGGATGCAGTTGGTACCACGTGCGG TGAACGTCTGGAACGCGTCTATGACAGCGAATACTGTGATATTCTGCG TGTCCCGTTTCGCACCGAAAAGGGTATTGTGCGTAAATGGATCAGTCG CTTCGAAGTTTGGCCGTATCTGGAAACCTACACGGAAGATGCGGCCGT GGAACTGTCCAAGGAACTGAATGGCAAACCGGACCTGATTATCGGCAA CTATAGCGATGGTAATCTGGTCGCATCTCTGCTGGCTCATAAACTGGG TGTGACCCAGTGCACGATTGCACACGCTCTGGAAAAGACCAAATATCC GGATTCAGACATCTACTGGAAAAAGCTGGATGACAAATATCATTTTTCG TGTCAGTTCACCGCGGACATTTTTGCCATGAACCACACGGATTTTATTA TCACCAGTACGTTCCAGGAAATCGCGGGCTCCAAAGAAACCGTGGGTC AATACGAATCACATACCGCCTTCACGCTGCCGGGCCTGTATCGTGTGG TTCACGGTATCGATGTTTTTGACCCGAAATTCAATATTGTCAGTCCGGG CGCGGATATGTCCATCTATTTTCCGTACACCGAAGAAAAGCGTCGCCT GACGAAATTCCATTCAGAAATTGAAGAACTGCTGTACTCGGACGTGGA AAACAAGGAACACCTGTGTGTTCTGAAAGATAAAAAGAAACCGATCCTG TTTACCATGGCCCGTCTGGATCGCGTGAAGAATCTGTCAGGCCTGGTT GAATGGTATGGTAAAAACACGCGTCTGCGCGAACTGGCAAATCTGGTC GTGGTTGGCGGTGACCGTCGCAAGGAATCGAAAGATAACGAAGAAAA GGCTGAAATGAAGAAAATGTACGATCTGATCGAAGAATACAAGCTGAA CGGCCAGTTTCGTTGGATCAGCTCTCAAATGGACCGTGTGCGCAATGG CGAACTGTATCGCTACATTTGCGATACCAAGGGTGCGTTTGTTCAGCC GGCACTGTACGAAGCTTTCGGCCTGACCGTCGTGGAAGCCATGACGT GCGGTCTGCCGACCTTTGCGACGTGTAAAGGCGGTCCGGCCGAAATT ATCGTGCATGGCAAATCTGGTTTCCATATCGATCCGTATCACGGTGATC AGGCAGCTGACACCCTGGCGGATTTCTTTACGAAGTGTAAAGAAGACC CGTCACACTGGGATGAAATTTCGAAGGGCGGTCTGCAACGTATCGAAG AAAAATATACCTGGCAGATTTACAGCCAACGCCTGCTGACCCTGACGG GCGTCTACGGTTTTTGGAAACATGTGTCTAATCTGGATCGCCTGGAAG CCCGTCGCTATCTGGAAATGTTTTACGCACTGAAGTATCGCCCGCTGG
CACAAGCCGTTCCGCTGGCACAGGACGACTAA 1 13 Tabela 1. Dados espectrais de H e C NMR (deslocamentos químicos e constantes de acoplamento) para o composto R7-2 a c. 1 13 Posição H NMR C NMR
1 0,75 t (12,8), 40,0 1,78 m 2 1,65 m, 2,02 m 19,8
3 1,08 m, 2,27 m 38,7
4 --- 44,5
5 1,06 d (13,2) 57,6
6 2,27 m, 2,42 m 23,7
7 1,42 m, 1,76 m 42,8
8 --- 41,4
9 0,91 d (7,7) 54,5
10 --- 40,5
11 1,66 m, 1,74 m 20,4
12 2,26 m, 2,74 d 38,7 (13,3) 13 --- 87,6
14 2,02 m, 2,72 m 43,9
15 1,88 m, 2,02 m 46,6
16 --- 153,2
17 5,00 s, 5,74 s 105,5
18 1,33 s 28,4
19 --- 177,2
20 1,39 s 17,0
1' 6,40 d (8,1) 95,2
2’ 4,45 m 76,8
3' 5,16 m 88,7
4' 4,14 m 70,3
5' 4,16 m 77,7
6' 4,04 m, 4,28m 62,3
1’’ 5,43 d (7,7) 96,2
2” 3,98 m 81,4
3’’ 4,96 m 87,9
4’’ 4,12 m 70,4
5” 3,92 m 78,1
6’’ 4,24 m, 4,58 69,8 m 1’’’ 5,35 d (8,1) 103,9
2’’’ 4,14 m 75,8
3’’’ 4,16 m 78,6
4’’’ 3,96 m 73,4
5’’’ 3,73 ddd (2,8, 78,2 6,3, 9,2) 6”' 4,33 m, 4,53 64,2 m 1’’’’ 5,38 dd (7,7, 104,2 4,2) 2’’’’ 3,91 m 75,9
3’’’’ 4,04 m 78,1
4’’’’ 4,10 m 71,9
5’’’’ 3,88 m 78,6
6’’’’ 4,15 m, 4,27 63,0 m
1’’’’’ 5,05 d (7,4) 106,2
2’’’’’ 3,92 m 75,6
3’’’’’ 4,06 m 78,0
4’’’’’ 4,16m 73,8
5’’’’’ 3,89m 78,0
6’’’’’ 4,18 m, 4,48 62,5 m 1’’’’’’ 5,82 d (6,3) 104,3
2’’’’’’ 4,01 m 75,7
3’’’’’’ 4,18 m 78,3
4’’’’’’ 4,20 m 71,6
5’’’’’’ 3,96 m 78,7
6’’’’’’ 4,06 m, 4,32 62,0 m 1’’’’’’’ 4,99 d (7,6) 106,2
2’’’’’’’ 4,01 m 77,1
3’’’’’’’ 4,17 m 78,1
4’’’’’’’ 4,23 m 71,4
5’’’’’’’ 3,92 m 78,7
6’’’’’’’ 4,03 m, 4,28 64,2 m a atribuições feitas com base em correlações TOCSY, HSQC, ROESY e HMBC; b Valores dos deslocamentos químicos estão em δ (ppm); c As constantes de acoplamento estão em Hz. 1 13 Tabela 2. Dados espectrais de H e C NMR (deslocamentos químicos e constantes de acoplamento) para R6-1 produzidos por bioconversão enzimática a-c
Posição H NMR C NMR
1 0,74 t (12,4), 40,4 1,85 m 2 1,45 m, 2,18 m 19,8
3 1,09 m, 2,16 m 37,4
4 --- 42,1
5 0,98 d (12,4) 57,2
6 1,90 m, 2,14 m 21,8
7 1,73 m, 2,48 m 43,9
8 --- 41,5
9 0,88 d (6,3) 53,7
10 --- 37,4
11 1,66 m, 2,12 m 20,4
12 1,90 m, 2,87 d 39,5 (12,3) 13 --- 86,2
14 1,73 d (11,1), 44,1 2,48 d (10,7) 15 2,08 m, 2,11 m 47,5
16 --- 153,9
17 5,01 s, 5,64 s 104,5
18 1,48 s 29,0
19 --- 175,5
20 1,12 s 16,7
1' 6,36 d (7,6) 92,8
2’ 4,15 m 82,0
3' 4,54 m 78,2
4' 4,14 m 71,7
5' 4,16 m 78,8
6' 4,18 m, 4,35 m 61,3
1’’ 5,04 d (7,6) 97,8
2” 4,23 m 80,4
3’’ 4,05 m 85,2
4’’ 4,04 m 70,8
5” 3,96 m 77,8
6’’ 4,22 m, 4,36 m 61,9
1’’’ 5,05 d (7,4) 104,4
2’’’ 4,08 m 76,1
3’’’ 4,12 m 78,9
4’’’ 4,02 m 69,6
5’’’ 3,66 ddd (2,8, 77,6 6,4, 9,4) 6”' 4,32 m, 4,54 m 62,7
1’’’’ 5,24 d (7,6) 106,0
2’’’’ 4,04 m 76,4
3’’’’ 4,40 m 77,3
4’’’’ 4,19 m 71,3
5’’’’ 4,00 m 77,2
6’’’’ 4,20 m, 4,32 m 62,5
1’’’’’ 5,37 t (7,4) 103,6
2’’’’’ 4,28 m 87,7
3’’’’’ 4,35 m 77,0
4’’’’’ 4,24 m 74,9
5’’’’’ 3,92 ddd (2,8, 77,8 6,4, 9,9) 6’’’’’ 4,26 m, 4,51 m 62,1
1’’’’’’ 5,57 d (7,7) 104,6
2’’’’’’ 4,03 m 77,1
3’’’’’’ 4,38 m 78,8
4’’’’’’ 4,26 m 71,2
5’’’’’’ 3,96 ddd (2,1, 77,8 6,4, 9,4) 6’’’’’’ 4,06 m, 4,36 m 62,0 a atribuições feitas com base em correlações TOCSY, HSQC, ROESY e HMBC; b Valores dos deslocamentos químicos estão em δ (ppm); c As constantes de acoplamento estão em Hz. 1 13 Tabela 3. Dados espectrais de H e C NMR (deslocamentos químicos e constantes de acoplamento) para composto R6-4 (R64A/R6-4B) a
1 13 Posição H NMR (R6-4A/R6-4B) C NMR (R6-4A/R6-4B)
1 0,73 t (12,8), 1,65 m 40,0
2 1,42 m, 2,12m 20,4/20,3
3 1,13 m, 2,90 d (13,2)/1,11 m, 38,0 2,86 m 4 --- 44,7
5 0,97 d (12,2) 57,9
6 1,66 m, 2,09 m 22,4
7 1,25 m, 1,70 m 42,9
8 --- 42,0
9 0,88 br s 54,3
10 --- 41,0
11 1,68 m 20,9
12 1,12 m, 2,12m 37,5
13 --- 86,3/86,8
14 1,75 m, 2,45 d (11,3) 44,7
15 2,02 m, 2,12 m 48,2/48.1
16 --- 155,0/154,8
17 5,05/5,03s, 5,67/5,65 s 105,0/105,2
18 1,49/1,46 s 29,7/29,6
19 --- 176,0/176,1
20 1,09/1,13 s 17,1/17,2
1’ 6,35 d (7,7)/ 93,4/93,6 6,44 d (7,3)
2’ 3,97 82,6/81,6
3’ 4,25 m 78,4
4’ 4,22 m 71,6
5’ 3,74 m 79,6
6’ 4,12 m, 4,55 m 62,7
1’’ 5,12 d (7,6)/ 98,1/98,3 5,07 d (7,4)/ 2” 4,03 m 85,4/85,2
3” 4,32 m 78,3
4” 4,15 m 70,1
5’’ 3,88 m 78,5
6” 4,18 m, 4,42 m 62,8/62,6
1’’’ 5,33 d (7,8)/ 104,2/104,9 5,46 d (7,8)/
2’’’ 4,12 m 85,5/77,7
3’’’ 4,28 m 78,2
4’’’ 4,14 m 71,5/71,9
5’’’ 3,92 m 79,4/77,8
6”’ 4,17 m, 4,48 m 63,2/63,4
1’’’’ 5,48 d (7,9)/ 106,3/105,1 5,42 d (7,6)
2’’’’ 4,10 m 85,6
3’’’’ 4,19 m 78,2
4’’’’ 4,30 m 71,3/71,0
5’’’’ 3,96 m 79,4
6’’’’ 4,22 m, 4,54 m 62,8
1’’’’’ 5,28 d (7,5)/ 106,6/106,4 5,38 d (7,5)/
2’’’’’ 4,06 m 77,1/86,4
3’’’’’ 4,20 m 78,0 4’’’’’ 4,32 m 70,8/71,2 5’’’’’ 3,98 m 77,9 6’’’’’ 4,16 m, 4,43 m 62,7 1’’’’’’ 5,40 d (7,5)/ 104,3/105,0 5,58 d (7,5)/ 2’’’’’’ 4,08 m 76,7 3’’’’’’ 4,32 m 78,0 4’’’’’’ 4,17 m 72,0 5’’’’’’ 3,98 m 77,8 6’’’’’’ 4,12 m, 4,49 m 62,8 a atribuições feitas com base em correlações TOCSY, HSQC, ROESY e HMBC; b Valores dos deslocamentos químicos estão em δ (ppm); c As constantes de acoplamento estão em Hz. DECLARAÇÃO DE APLICABILIDADE INDUSTRIAL/CAMPO
TÉCNICO
[00274] Esta divulgação tem aplicabilidade nas indústrias de alimentos, rações, bebidas e farmacológica. Esta divulgação se refere geralmente a um método para a produção biossintética de certos glicosídeos de esteviol por meio de enzimas e/ou cepa(s) microbianas modificadas e potenciais usos dos mesmos como um adoçante para produtos alimentícios e bebidas, bem como composições relacionadas. Referências:
1. Bedir, E. et al., (2001), A new dammarane type triterpene glycoside from Polyscias fulva. J. NATURAL PRODUCTS, (64):95—97.
2. Brandle, J. E. et al., (1998). Stevia Rebaudiana: Its Agricultural,
Biological, and Chemical Properties, CANADIAN J. PLANT SCIENCE. 78 (4): 527—36.
3. Ceunen, S., and J.M. C. Geuns, Steviol Glycosides: Chemical Diversity, Metabolism, and Function, J. NAT. PROD., 2013, 76 (6), pp 1201- 28 (2013).
4. Chaturvedula, V.S.P. et al., (2003), New cytotoxic oleanane saponisfrom the infructescences of Polyscias amplifoliafrom the Madagascar rainforest. PLANTA MEDICA, (69): 440-44.
5. Daugherty, A.B., et al., Structural and Functional Consequences of Circular Permutation on the Active Site of Old Yellow Enzyme, ACS CATAL. (2015) 5:892-99.
6. Du J et al., (2011), Engineering microbial factories for synthesis of value-added products, J IND MICROBIOL. BIOTECHNOL. 38: 873-90.
7. GRAS Notices, USA Food and Drug Administration, United States Health & Human Services. (2016) (relevant to steviol glycosides & polyglycosides).
8. Huan, V.D. et al., (1998). Oleanane saponins from Polyscias fructicosa. PHYTOCHEMISTRY, (47):451—57.
9. Häusler A, and Münch T., (1997), Microbial Production of Natural Flavors, ASM NEWS (63): 551-59.
10. Mao, G. et al., (2017), Enzymatic Synthesis and Structural Characterization of Rebaudioside D3, a Minor Steviol Glycoside of Stevia rebaudiana Bertoni, AMER. J. PLANT SCIENCES, (8): 441-50.
11. Ohtani, K., et al., (1992). Minor diterpene glycosides from sweet leaves of Rubus Suavissimus, PHYTOCHEMISTRY, (31): 1553-59.
12. Prakash I., et al.; Isolation and Characterization of a Novel Rebaudioside M Isomer from a Bio conversion Reaction of Rebaudioside A and NMR Comparison Studies of Rebaudioside M Isolated from Stevia rebaudiana Bertoni and Stevia rebaudiana Morita, BIOMOLECULES, 2014 Jun; 4(2): 374-89. (Published online 2014 Mar 31. 2014).
13. Prakash I., et al., Development of Next Generation Stevia Sweetener: Rebaudioside M, FOODS, (2014), 3:162-175.
14. Qian, Z. et al., Improving the catalytic activity of Candida antarctica lipase B by circular permutation, J. OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY. (2005) 127(39): 13466-13467.
15. Richman A., et. al., Functional genomics uncovers three glucosyltransferases involved in the synthesis of the major sweet glucosides of Stevia rebaudiana, PLANT J. (2005) Jan;41(1):56-67.
16. Shockey J.M. et al., (2003), Arabidopsis contains a large superfamily of acyl-activating enzymes: phylogenetic and biochemical analysis reveals a new class of acyl-coenzyme A synthetases. PLANT PHYSIOL. 132 1065-76.
17. Tanaka, T. et al., (2007), Facile discrimination ofaldose enantiomers by reversed-phase HPLC, CHEM. PHARM. BULL, (55): 899-
901.
18. Topell, S. et al., Circularly permuted variants of the green fluorescent protein, FEBS LETTERS. (1999) 457(2): 283-89.
19. Wang J., et al., Pathway mining-based integration of critical enzyme parts for de novo biosynthesis of steviol glycosides sweetener in Escherichia coli, CELL RESEARCH (2016) 26:258-61.
[0274] Todas as publicações, patentes, pedidos de patentes, publicação e entradas de banco de dados (por exemplo, entradas de banco de dados de sequência) mencionadas neste documento, por exemplo, nas seções de Antecedentes, Sumário, Descrição Detalhada, Exemplos e/ou Referências, são incorporados a este documento por referência em sua totalidade como se cada publicação, patente, pedido de patente, publicação de pedido de patente e entrada de banco de dados individual fosse especificamente e individualmente incorporada a este documento por referência.
Em caso de conflito, o presente pedido, incluindo quaisquer definições neste documento, prevalecerá.

Claims (33)

REIVINDICAÇÕES
1. Método de produção de rebaudiosídeo R6-2A e/ou R6-2B, o método caracterizado pelo fato de que compreende: (I) preparar uma mistura de reação compreendendo: (i) rebaudiosídeo D3; (ii) um ou mais substratos selecionados a partir do grupo que consiste em sacarose, difosfato de uridina (UDP), difosfato de uridina- glicose (UDP-glicose) e combinações dos mesmos; e (iii) uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) uma UDP-glicosiltransferase (UGT); (b) uma UDP-glicosiltransferase e uma sacarose sintase adicionadas separadamente à mistura de reação; e (c) uma enzima de fusão UDP-glicosiltransferase compreendendo um domínio UDP-glicosiltransferase acoplado a um domínio de sacarose sintase; e (II) incubar a mistura de reação por um tempo suficiente para produzir rebaudiosídeo R6-2A e/ou R6-2B; em que o rebaudiosídeo D3 tem a estrutura de: ;
o rebaudiosídeo R6-2A tem a estrutura de:
;e o rebaudiosídeo R6-2B tem a estrutura de:
.
2. Método de produção de rebaudiosídeo R7-2, o método caracterizado pelo fato de que compreende: (I) preparar uma mistura de reação compreendendo: (i) um ou mais dentre rebaudiosídeo D3, rebaudiosídeo R6-2A e rebaudiosídeo R6-2B; (ii) um ou mais substratos selecionados a partir do grupo que consiste em sacarose, difosfato de uridina (UDP), difosfato de uridina- glicose (UDP-glicose) e combinações dos mesmos; e (iii) uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) uma UDP-glicosiltransferase (UGT); (b) uma UDP-glicosiltransferase e uma sacarose sintase adicionadas separadamente à mistura de reação; e (c) uma enzima de fusão UDP-glicosiltransferase compreendendo um domínio UDP-glicosiltransferase acoplado a um domínio de sacarose sintase; e (II) incubar a mistura de reação por um tempo suficiente para produzir rebaudiosídeo R7-2; em que o rebaudiosídeo D3 tem a estrutura de:
;
o rebaudiosídeo R6-2A tem a estrutura de:
; o rebaudiosídeo R6-2B tem a estrutura de:
;e o rebaudiosídeo R7-2 tem a estrutura de: .
3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a sacarose sintase ou domínio da sacarose sintase é selecionado a partir do grupo que consiste em uma sacarose sintase I de Arabidopsis, uma sacarose sintase 3 de Arabidopsis e uma sacarose sintase de Vigna radiate.
4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a sacarose sintase ou o domínio da sacarose sintase é uma sacarose sintase I de Arabidopsis thaliana.
5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a sacarose sintase ou o domínio da sacarose sintase é pelo menos 80% idêntico à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9.
6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a sacarose sintase ou o domínio da sacarose sintase compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9.
7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que uma glicose é covalentemente acoplada ao rebaudiosídeo D3 pela enzima para produzir rebaudiosídeo R6-2A e/ou R6- 2B.
8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a glicose é covalentemente acoplada ao açúcar I do rebaudiosídeo D3 pela enzima para produzir rebaudiosídeo R6-2A.
9. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a glicose é covalentemente acoplada ao açúcar II do rebaudiosídeo D3 pela enzima para produzir rebaudiosídeo R6-2B.
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 6, caracterizado pelo fato de que duas glicoses são covalentemente acopladas ao rebaudiosídeo D3 pela enzima para produzir rebaudiosídeo R7-2.
11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que as duas glicoses são covalentemente acopladas ao açúcar I e açúcar II do rebaudiosídeo D3 pela enzima para produzir rebaudiosídeo R7-
2.
12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a UDP-glicosiltransferase é pelo menos 80% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a UDP-glicosiltransferase compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a UDP-glicosiltransferase é pelo menos 80% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.
15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a enzima de fusão UDP-glicosiltransferase compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.
16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente a produção de rebaudiosídeo D3 incubando rebaudiosídeo E com uma UDP-
glicosiltransferase e um substrato selecionado a partir do grupo que consiste em sacarose, UDP, UDP-glicose e combinações dos mesmos.
17. Método de produção de rebaudiosídeo R6-4A e/ou rebaudiosídeo R6-4B, o método caracterizado pelo fato de que compreende: (I) preparar uma mistura de reação compreendendo: (i) pelo menos um de rebaudiosídeo Z1 e rebaudiosídeo Z2; (ii) um ou mais substratos selecionados a partir do grupo que consiste em sacarose, difosfato de uridina (UDP), difosfato de uridina- glicose (UDP-glicose) e combinações dos mesmos; e (iii) uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) uma UDP-glicosiltransferase (UGT); (b) uma UDP-glicosiltransferase e uma sacarose sintase adicionadas separadamente à mistura de reação; e (c) uma enzima de fusão UDP-glicosiltransferase compreendendo um domínio UDP-glicosiltransferase acoplado a um domínio de sacarose sintase; e (II) incubar a mistura de reação por um tempo suficiente para produzir rebaudiosídeo R6-4A e/ou rebaudiosídeo R6-4B; em que o rebaudiosídeo Z1 tem a estrutura de: ;
o rebaudiosídeo Z2 tem a estrutura de:
; o rebaudiosídeo R6-4A tem a estrutura de:
;e o rebaudiosídeo R6-4B tem a estrutura de: .
18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a sacarose sintase ou domínio da sacarose sintase é selecionado a partir do grupo que consiste em uma sacarose sintase I de Arabidopsis, uma sacarose sintase 3 de Arabidopsis e uma sacarose sintase de Vigna radiate.
19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a sacarose sintase ou o domínio da sacarose sintase é uma sacarose sintase I de Arabidopsis thaliana.
20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a sacarose sintase ou o domínio da sacarose sintase é pelo menos 80% idêntico à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9.
21. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a sacarose sintase ou o domínio da sacarose sintase compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9.
22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 21, caracterizado pelo fato de que uma glicose é covalentemente acoplada ao rebaudiosídeo Z1 ou rebaudiosídeo Z2 pela enzima para produzir rebaudiosídeo R6-4A.
23. Método, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a glicose é covalentemente acoplada ao açúcar IV do rebaudiosídeo Z1 pela enzima para produzir rebaudiosídeo R6-4B.
24. Método, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a glicose é covalentemente acoplada ao açúcar III do rebaudiosídeo Z2 pela enzima para produzir rebaudiosídeo R6-4A.
25. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 21, caracterizado pelo fato de que a glicose é covalentemente acoplada ao rebaudiosídeo Z2 pela enzima para produzir rebaudiosídeo R6-4B.
26. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a glicose é covalentemente acoplada ao açúcar V do rebaudiosídeo Z2 pela enzima para produzir rebaudiosídeo R6-4B.
27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 26, caracterizado pelo fato de que a UDP-glicosiltransferase é pelo menos 80% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.
28. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a UDP-glicosiltransferase compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.
29. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 26, caracterizado pelo fato de que a enzima de fusão UDP-glicosiltransferase é pelo menos 80% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7.
30. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que a enzima de fusão UDP-glicosiltransferase compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7.
31. Método de produção de rebaudiosídeo R6-1, o método caracterizado pelo fato de que compreende: (I) preparar uma mistura de reação compreendendo: (i) rebaudiosídeo D;
(ii) um ou mais substratos selecionados a partir do grupo que consiste em sacarose, difosfato de uridina (UDP), difosfato de uridina- glicose (UDP-glicose) e combinações dos mesmos; e (iii) uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) uma UDP-glicosiltransferase (UGT); (b) uma UDP-glicosiltransferase e uma sacarose sintase adicionadas separadamente à mistura de reação; e (c) uma enzima de fusão UDP-glicosiltransferase compreendendo um domínio de UDP-glicosiltransferase acoplado a um domínio de sacarose sintase; e (II) incubar a mistura de reação por um tempo suficiente para produzir rebaudiosídeo R6-1; em que o rebaudiosídeo D tem a estrutura de:
o rebaudiosídeo R6-1 tem a estrutura de:
.
32. Rebaudiosídeo sintético, caracterizado pelo fato de que é selecionado a partir de: (i) rebaudiosídeo R6-2A tendo a estrutura: ;
(ii) rebaudiosídeo R6-2B tendo a estrutura:
; (iii) rebaudiosídeo R7-2 tendo a estrutura:
(iv) rebaudiosídeo R6-4A tendo a estrutura:
; (v) rebaudiosídeo R6-4B tendo a estrutura:
;e
(vi) rebaudiosídeo R6-1 tendo a estrutura: .
33. Produto de consumo oral, caracterizado pelo fato de que compreende uma quantidade adoçante de um adoçante selecionado a partir do grupo que consiste em rebaudiosídeo R6-2A, R6-2B, R7-2, R6-4A, R6-4B e/ou R6-1, em que o produto de consumo oral é selecionado a partir do grupo que consiste em um produto de bebida e um produto de consumo.
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