JP7449586B2 - 変異型ステビオール配糖体の生合成製造 - Google Patents
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Description
本出願は、米国特許法第119条(e)に基づいて、2018年12月12日に出願された、「BIOSYNTHETIC PRODUCTION OF VARIANT STEVIOL GLYCOSIDES」と題する米国特許仮出願第62/778,422号に対する利益を主張する。この仮出願の全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の分野は、いくつかの特定のステビオール配糖体の酵素変換による製造に有用な方法および工程ならびに関連組成物に関する。
(I)反応混合物を以下のように調整し、
(i)レバウジオシドD3、
(ii)スクロース、ウリジン二リン酸(UDP)、ウリジン二リン酸-グルコース(UDP-グルコース)、およびこれらに組み合わせからなる群より選択される1種または複数の基質、および
(iii)以下の群から選択される酵素
(a)UDPグリコシルトランスフェラーゼ(UGT)、
(b)反応混合物に別々に添加されるUDPグリコシルトランスフェラーゼおよびスクロースシンターゼ、および
(c)スクロースシンターゼドメインに結合されたUDPグリコシルトランスフェラーゼドメインを含むUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素、からなる群より選択される酵素、を含む反応混合物を調製すること、
(II)反応混合物をレバウジオシドR6-2Aおよび/またはR6-2Bの製造に十分な時間にわたりインキュベートすること、を含み、
レバウジオシドD3は:
(I)反応混合物を以下のように調整し
(i)レバウジオシドD3、レバウジオシドR6-2A、およびR6-2Bのうちの1種または複数、
(ii)スクロース、ウリジン二リン酸(UDP)、ウリジン二リン酸-グルコース(UDP-グルコース)、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される1種または複数の基質、および
(iii)以下の群から選択される酵素
(a)UDPグリコシルトランスフェラーゼ(UGT)、
(b)反応混合物に別々に添加されるUDPグリコシルトランスフェラーゼおよびスクロースシンターゼ、および
(c)スクロースシンターゼドメインに結合したUDPグリコシルトランスフェラーゼドメインを含むUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素、からなる群より選択される酵素、を含む反応混合物を調製すること、および
(II)反応混合物をレバウジオシドR7-2を製造するのに十分な時間にわたりインキュベートすること、を含み、レバウジオシドD3は:
(I)反応混合物を以下のように調整し、
(i)レバウジオシドZ1およびレバウジオシドZ2のうちの少なくとも1種、
(ii)スクロース、ウリジン二リン酸(UDP)、ウリジン二リン酸-グルコース(UDP-グルコース)、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される1種または複数の基質、および
(iii)以下の群から選択される酵素
(a)UDPグリコシルトランスフェラーゼ(UGT)、
(b)反応混合物に別々に添加されるUDPグリコシルトランスフェラーゼおよびスクロースシンターゼ、および
(c)スクロースシンターゼドメインに結合したUDPグリコシルトランスフェラーゼドメインを含むUDPグリコシルトランスフェラーゼ融合酵素、からなる群より選択される酵素、を含む反応混合物を調製すること、および
(II)反応混合物をレバウジオシドR6-4Aおよび/またはレバウジオシドR6-4Bの製造に十分な時間にわたりインキュベートすること、を含み、
レバウジオシドZ1は:
(I)反応混合物以下のように調整し、
(i)レバウジオシドD、
(ii)スクロース、ウリジン二リン酸(UDP)、ウリジン二リン酸-グルコース(UDP-グルコース)、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される1種または複数の基質、および
(iii)以下の群から選択される酵素
(a)UDPグリコシルトランスフェラーゼ(UGT)、
(b)反応混合物に別々に添加されるUDPグリコシルトランスフェラーゼおよびスクロースシンターゼ、および
(c)スクロースシンターゼドメインに結合されたUDPグリコシルトランスフェラーゼドメインを含むUDPグリコシルトランスフェラーゼ融合酵素、からなる群より選択される酵素、を含む反応混合物を調製すること、
(II)反応混合物をレバウジオシドR6-1を製造するのに十分な時間にわたりインキュベートすること、を含み、レバウジオシドDは:
(i)構造:
本明細書で提供されるいずれか1つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、少なくとも1種の追加の甘味料は、ステビア抽出物、ステビオール配糖体、ステビオシド、レバウジオシドA、レバウジオシドB、レバウジオシドC、レバウジオシドD、組換え微生物の生合成由来のレバウジオシドE、レバウジオシドF、ズルコシドA、レバウジオシドM、レバウジオシドV、レバウジオシドW、レバウジオシドD3、レバウジオシドZ1、レバウジオシドZ2、ルブソシド、ステビオールビオシド、スクロース、高フルクトースコーンシロップ、フルクトース、グルコース、キシロース、アラビノース、ラムノース、エリスリトール、キシリトール、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、AceK、アスパルテーム、ネオテーム、スクラロース、サッカリン、ナリンギンジヒドロカルコン(NarDHC)、ネオヘスペリジンジヒドロカルコン(NDHC)、ルブソシド、モグロシドIV、シアメノシドI、モグロシドV、モナチン、タウマチン、モネリン、ブラゼイン、L-アラニン、グリシン、羅漢果、ヘルナンズルチン、フィロズルチン、トリロブタイン、およびこれらの組合せからなる群より選択される。
特に断らなければ、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本開示の実施または試験において、本明細書で記載のものと類似または等価の任意の方法および材料を使用することができるが、好ましい材料および方法が以下に記載される。
既に述べたように、ステビオール配糖体は、南米の植物ステビア・レバウディアナ(キク科)の葉、および植物ゴショイチゴ(Rubus chingii)(バラ科(Rosaceae))における甘味の原因となる化合物である。これらの化合物はグリコシル化ジテルペンである。特に、これらの分子は、そのヒドロキシル水素原子がグルコース分子で置換されてエステルが形成され、ヒドロキシル水素がグルコースおよびラムノースの組合せで置換されてアセタールが形成されたステビオール分子と見なすことができる。
本明細書で提供されるいずれか1つの方法または組成物のいくつかの実施形態では、細胞は藻類細胞または植物細胞である。
本開示のいくつかの態様は、「レバウジオシドR6-2A(Reb R6-2A)」と名付けられた甘味料(例えば、ノンカロリーおよび/または合成の甘味料)を提供する。レバウジオシドR6-2AはC56H90O33の分子式を有し、構造:
本開示のいくつかの態様は、「レバウジオシドR7-2(Reb R7-2)」と名付けられた甘味料(例えば、ノンカロリーおよび/または合成の甘味料)を提供する。
Reb R7-2化合物は、C-13ヒドロキシルに結合した4個のグルコシル部分を有し、そのうちの3個は2,3-分岐グルコトリオシル置換基としてエーテルの形で結合し、別の2,3-分岐グルコトリオシル部分はC-19にエステルとして結合する、ステビオール配糖体である。
本開示のいくつかの態様は、「レバウジオシドR6-4A(Reb R6-4A)」と名付けられた甘味料(例えば、ノンカロリーおよび/または合成の甘味料)を提供する。レバウジオシドR6-4AはC56H90O33の分子式を有し、構造:
提供されるいずれか1つの方法のいくつかの実施形態では、レバウジオシドR6-4Aは、レバウジオシドZ1またはレバウジオシドZ2から製造される。例えば、いくつかの実施形態では、方法は、(I)次のように反応混合物を調製し、(i)レバウジオシドZ1またはレバウジオシドZ2;(ii)スクロース、ウリジン二リン酸(UDP)、ウリジン二リン酸-グルコース(UDP-グルコース)、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される1種または複数の基質;および(iii)次の群から選択される酵素、(a)UDPグリコシルトランスフェラーゼ(UGT);(b)反応混合物に別々に添加されるUDPグリコシルトランスフェラーゼおよびスクロースシンターゼ;および(c)スクロースシンターゼドメインに結合したUDPグリコシルトランスフェラーゼドメインを含むUDPグリコシルトランスフェラーゼ融合酵素からなる群より選択される酵素;を含む反応混合物を調製すること;および(II)反応混合物をレバウジオシドR6-4Aを製造するのに十分な時間にわたりインキュベートすること、を含む。
本開示のいくつかの態様は、「レバウジオシドR6-1(Reb R6-1)」と名付けられた甘味料(例えば、ノンカロリーおよび/または合成の甘味料)を提供する。レバウジオシドR6-1はC56H90O33の分子式を有し、構造:
提供されるいずれか1つの方法のいくつかの実施形態では、反応混合物はインビトロの状態であり、すなわち、本明細書で記載の方法はインビトロで実施される。インビトロ反応の場合、単離酵素(例えば、UDPグリコシルトランスフェラーゼ、スクロースシンターゼ、および/またはUDPグリコシルトランスフェラーゼ融合酵素)は、インビトロで反応混合物に添加できる。
融合ベクターは、その中にコードされたタンパク質、通常は組換えタンパク質のアミノ末端にいくつかのアミノ酸を付加する。このような融合ベクターは、通常、次の3つの目的を果たす:1)組換えタンパク質の発現を増大させること;2)組換えタンパク質の溶解度を増大させること;および3)アフィニティー精製におけるリガンドとしての役割を果たすことにより組換えタンパク質の精製を支援助すること。多くの場合、融合タンパク質の精製の後に、組換えタンパク質を融合部分から分離可能にするために、融合部分と組換えタンパク質との接合部にタンパク質切断部位が導入される。このようなベクターは本開示の範囲内に含まれる。
本明細書記載いずれか1つの方法を用いて製造したレバウジオシド(例えば、レバウジオシドR6-1、R6-2A、R6-2B、R6-4A、R6-4B、およびR7-2)を甘味料として使用できる。本開示の他の態様は、甘味を付与する量の、レバウジオシドR6-1、レバウジオシドR6-2A、レバウジオシドR6-2B、レバウジオシドR6-4A、レバウジオシドR6-4B、および/またはR7-2を有する、例えば、飲料製品および消費製品からなる群より選択される経口消費製品を提供する。
実施例1:酵素生物変換による新規ステビオール配糖体R6-2およびR7-2の製造
本発明では、全ての候補UDPグルコシルトランスフェラーゼ(UGT)遺伝子の完全長DNAフラグメントを商業的に合成した。ほとんど全てのcDNAのコドンを大腸菌にとって好ましいものに変更した(Genscript,NJ)。合成したDNAを、細菌発現ベクターpETite N-His SUMO Kanベクターに挿入した(Lucigen)。
生成された化合物を確認するために、生成した化合物を標準と比較するLC-MS分析により解析し、それらの同一性を確認した。
生成されたR7-2化合物を上述の半分取クロマトグラフィーにより精製した。
全ての候補UDPグルコシルトランスフェラーゼ(UGT)遺伝子の完全長DNAフラグメントを商業的に合成した。ほとんど全てのcDNAのコドンを大腸菌にとって好ましいものに変更した(Genscript,NJ)。合成したDNAを、細菌発現ベクターpETite N-His SUMO Kanベクターに挿入した(Lucigen)。
生成された化合物を確認するために、生成した化合物を標準と比較するLC-MS分析により解析し、それらの同一性を確認した。
生成されたR6-1化合物を上述の半分取クロマトグラフィーにより精製した。
高解像度質量スペクトルデータを、解像度を30kに設定したLTQ Orbitrap Discovery HRMS測定器を用いて生成した。正イオンエレクトロスプレーモードで、m/z 150~1500のデータをスキャンした。ニードル電圧を4kVに設定し、その他のソース条件は、シースガス=25、補助ガス=0、スイープガス=5(全てのガス流は任意単位)、キャピラリー電圧=30V、キャピラリー温度=300℃、チューブレンズ電圧=75であった。試料をピリジンで希釈し、50マイクロリットルを注入した。
全ての候補UDPグルコシルトランスフェラーゼ(UGT)遺伝子の完全長DNAフラグメントを商業的に合成した。ほとんど全てのcDNAのコドンを大腸菌にとって好ましいものに変更した(Genscript,NJ)。合成したDNAを、細菌発現ベクターpETite N-His SUMO Kanベクターに挿入した(Lucigen)。
生成された化合物を確認するために、生成した化合物を標準と比較するLC-MS分析により解析し、それらの同一性を確認した。
生成されたR6-4化合物を上述の半分取クロマトグラフィーにより精製した。
HRMSデータを、解像度を30kに設定したLTQ Orbitrap Discovery HRMS測定器を用いて生成した。正イオンエレクトロスプレーモードで、m/z 150~1500のデータをスキャンした。ニードル電圧を4kVに設定し、その他のソース条件は、シースガス=25、補助ガス=0、スイープガス=5(全てのガス流は任意単位)、キャピラリー電圧=30V、キャピラリー温度=300℃、チューブレンズ電圧=75であった。試料をピリジンで希釈し、50マイクロリットルを注入した。
UGT76G1:アミノ酸配列(配列番号1)
MENKTETTVRRRRRIILFPVPFQGHINPILQLANVLYSKGFSITIFHTNFNKPKTSNYPHFTFRFILDNDPQDERISNLPTHGPLAGMRIPIINEHGADELRRELELLMLASEEDEEVSCLITDALWYFAQSVADSLNLRRLVLMTSSLFNFHAHVSLPQFDELGYLDPDDKTRLEEQASGFPMLKVKDIKSAYSNWQILKEILGKMIKQTKASSGVIWNSFKELEESELETVIREIPAPSFLIPLPKHLTASSSSLLDHDRTVFQWLDQQPPSSVLYVSFGSTSEVDEKDFLEIARGLVDSKQSFLWVVRPGFVKGSTWVEPLPDGFLGERGRIVKWVPQQEVLAHGAIGAFWTHSGWNSTLESVCEGVPMIFSDFGLDQPLNARYMSDVLKVGVYLENGWERGEIANAIRRVMVDEEGEYIRQNARVLKQKADVSLMKGGSSYESLESLVSYISSL
UGT76G1:DNA配列(配列番号2):
ATGGAGAATAAGACAGAAACAACCGTAAGACGGAGGCGGAGGATTATCTTGTTCCCTGTACCATTTCAGGGCCATATTAATCCGATCCTCCAATTAGCAAACGTCCTCTACTCCAAGGGATTTTCAATAACAATCTTCCATACTAACTTTAACAAGCCTAAAACGAGTAATTATCCTCACTTTACATTCAGGTTCATTCTAGACAACGACCCTCAGGATGAGCGTATCTCAAATTTACCTACGCATGGCCCCTTGGCAGGTATGCGAATACCAATAATCAATGAGCATGGAGCCGATGAACTCCGTCGCGAGTTAGAGCTTCTCATGCTCGCAAGTGAGGAAGACGAGGAAGTTTCGTGCCTAATAACTGATGCGCTTTGGTACTTCGCCCAATCAGTCGCAGACTCACTGAATCTACGCCGTTTGGTCCTTATGACAAGTTCATTATTCAACTTTCACGCACATGTATCACTGCCGCAATTTGACGAGTTGGGTTACCTGGACCCGGATGACAAAACGCGATTGGAGGAACAAGCGTCGGGCTTCCCCATGCTGAAAGTCAAAGATATTAAGAGCGCTTATAGTAATTGGCAAATTCTGAAAGAAATTCTCGGAAAAATGATAAAGCAAACCAAAGCGTCCTCTGGAGTAATCTGGAACTCCTTCAAGGAGTTAGAGGAATCTGAACTTGAAACGGTCATCAGAGAAATCCCCGCTCCCTCGTTCTTAATTCCACTACCCAAGCACCTTACTGCAAGTAGCAGTTCCCTCCTAGATCATGACCGAACCGTGTTTCAGTGGCTGGATCAGCAACCCCCGTCGTCAGTTCTATATGTAAGCTTTGGGAGTACTTCGGAAGTGGATGAAAAGGACTTCTTAGAGATTGCGCGAGGGCTCGTGGATAGCAAACAGAGCTTCCTGTGGGTAGTGAGACCGGGATTCGTTAAGGGCTCGACGTGGGTCGAGCCGTTGCCAGATGGTTTTCTAGGGGAGAGAGGGAGAATCGTGAAATGGGTTCCACAGCAAGAGGTTTTGGCTCACGGAGCTATAGGGGCCTTTTGGACCCACTCTGGTTGGAATTCTACTCTTGAAAGTGTCTGTGAAGGCGTTCCAATGATATTTTCTGATTTTGGGCTTGACCAGCCTCTAAACGCTCGCTATATGTCTGATGTGTTGAAGGTTGGCGTGTACCTGGAGAATGGTTGGGAAAGGGGGGAAATTGCCAACGCCATACGCCGGGTAATGGTGGACGAGGAAGGTGAGTACATACGTCAGAACGCTCGGGTTTTAAAACAAAAAGCGGACGTCAGCCTTATGAAGGGAGGTAGCTCCTATGAATCCCTAGAATCCTTGGTAAGCTATATATCTTCGTTATAA
HV1 UDPグリコシルトランスフェラーゼ:アミノ酸配列(配列番号3)
MDGNSSSSPLHVVICPWLALGHLLPCLDIAERLASRGHRVSFVSTPRNIARLPPLRPAVAPLVDFVALPLPHVDGLPEGAESTNDVPYDKFELHRKAFDGLAAPFSEFLRAACAEGAGSRPDWLIVDTFHHWAAAAAVENKVPCVMLLLGAATVIAGFARGVSEHAAAAVGKERPAAEAPSFETERRKLMTTQNASGMTVAERYFLTLMRSDLVAIRSCAEWEPESVAALTTLAGKPVVPLGLLPPSPEGGRGVSKEDAAVRWLDAQPAKSVVYVALGSEVPLRAEQVHELALGLELSGARFLWALRKPTDAPDAAVLPPGFEERTRGRGLVVTGWVPQIGVLAHGAVAAFLTHCGWNSTIEGLLFGHPLIMLPISSDQGPNARLMEGRKVGMQVPRDESDGSFRREDVAATVRAVAVEEDGRRVFTANAKKMQEIVADGACHERCIDGFIQQLRSYKA
HV1 UDPグリコシルトランスフェラーゼ:DNA配列(配列番号4)
ATGGATGGTAACTCCTCCTCCTCGCCGCTGCATGTGGTCATTTGTCCGTGGCTGGCTCTGGGTCACCTGCTGCCGTGTCTGGATATTGCTGAACGTCTGGCGTCACGCGGCCATCGTGTCAGTTTTGTGTCCACCCCGCGCAACATTGCCCGTCTGCCGCCGCTGCGTCCGGCTGTTGCACCGCTGGTTGATTTCGTCGCACTGCCGCTGCCGCATGTTGACGGTCTGCCGGAGGGTGCGGAATCGACCAATGATGTGCCGTATGACAAATTTGAACTGCACCGTAAGGCGTTCGATGGTCTGGCGGCCCCGTTTAGCGAATTTCTGCGTGCAGCTTGCGCAGAAGGTGCAGGTTCTCGCCCGGATTGGCTGATTGTGGACACCTTTCATCACTGGGCGGCGGCGGCGGCGGTGGAAAACAAAGTGCCGTGTGTTATGCTGCTGCTGGGTGCAGCAACGGTGATCGCTGGTTTCGCGCGTGGTGTTAGCGAACATGCGGCGGCGGCGGTGGGTAAAGAACGTCCGGCTGCGGAAGCCCCGAGTTTTGAAACCGAACGTCGCAAGCTGATGACCACGCAGAATGCCTCCGGCATGACCGTGGCAGAACGCTATTTCCTGACGCTGATGCGTAGCGATCTGGTTGCCATCCGCTCTTGCGCAGAATGGGAACCGGAAAGCGTGGCAGCACTGACCACGCTGGCAGGTAAACCGGTGGTTCCGCTGGGTCTGCTGCCGCCGAGTCCGGAAGGCGGTCGTGGCGTTTCCAAAGAAGATGCTGCGGTCCGTTGGCTGGACGCACAGCCGGCAAAGTCAGTCGTGTACGTCGCACTGGGTTCGGAAGTGCCGCTGCGTGCGGAACAAGTTCACGAACTGGCACTGGGCCTGGAACTGAGCGGTGCTCGCTTTCTGTGGGCGCTGCGTAAACCGACCGATGCACCGGACGCCGCAGTGCTGCCGCCGGGTTTCGAAGAACGTACCCGCGGCCGTGGTCTGGTTGTCACGGGTTGGGTGCCGCAGATTGGCGTTCTGGCTCATGGTGCGGTGGCTGCGTTTCTGACCCACTGTGGCTGGAACTCTACGATCGAAGGCCTGCTGTTCGGTCATCCGCTGATTATGCTGCCGATCAGCTCTGATCAGGGTCCGAATGCGCGCCTGATGGAAGGCCGTAAAGTCGGTATGCAAGTGCCGCGTGATGAATCAGACGGCTCGTTTCGTCGCGAAGATGTTGCCGCAACCGTCCGCGCCGTGGCAGTTGAAGAAGACGGTCGTCGCGTCTTCACGGCTAACGCGAAAAAGATGCAAGAAATTGTGGCCGATGGCGCATGCCACGAACGTTGTATTGACGGTTTTATCCAGCAACTGCGCAGTTACAAGGCGTAA
UGT76G1-スクロースシンターゼ(SUS)融合酵素:アミノ酸配列(配列番号5)
MENKTETTVRRRRRIILFPVPFQGHINPILQLANVLYSKGFSITIFHTNFNKPKTSNYPHFTFRFILDNDPQDERISNLPTHGPLAGMRIPIINEHGADELRRELELLMLASEEDEEVSCLITDALWYFAQSVADSLNLRRLVLMTSSLFNFHAHVSLPQFDELGYLDPDDKTRLEEQASGFPMLKVKDIKSAYSNWQILKEILGKMIKQTKASSGVIWNSFKELEESELETVIREIPAPSFLIPLPKHLTASSSSLLDHDRTVFQWLDQQPPSSVLYVSFGSTSEVDEKDFLEIARGLVDSKQSFLWVVRPGFVKGSTWVEPLPDGFLGERGRIVKWVPQQEVLAHGAIGAFWTHSGWNSTLESVCEGVPMIFSDFGLDQPLNARYMSDVLKVGVYLENGWERGEIANAIRRVMVDEEGEYIRQNARVLKQKADVSLMKGGSSYESLESLVSYISSLGSGANAERMITRVHSQRERLNETLVSERNEVLALLSRVEAKGKGILQQNQIIAEFEALPEQTRKKLEGGPFFDLLKSTQEAIVLPPWVALAVRPRPGVWEYLRVNLHALVVEELQPAEFLHFKEELVDGVKNGNFTLELDFEPFNASIPRPTLHKYIGNGVDFLNRHLSAKLFHDKESLLPLLKFLRLHSHQGKNLMLSEKIQNLNTLQHTLRKAEEYLAELKSETLYEEFEAKFEEIGLERGWGDNAERVLDMIRLLLDLLEAPDPCTLETFLGRVPMVFNVVILSPHGYFAQDNVLGYPDTGGQVVYILDQVRALEIEMLQRIKQQGLNIKPRILILTRLLPDAVGTTCGERLERVYDSEYCDILRVPFRTEKGIVRKWISRFEVWPYLETYTEDAAVELSKELNGKPDLIIGNYSDGNLVASLLAHKLGVTQCTIAHALEKTKYPDSDIYWKKLDDKYHFSCQFTADIFAMNHTDFIITSTFQEIAGSKETVGQYESHTAFTLPGLYRVVHGIDVFDPKFNIVSPGADMSIYFPYTEEKRRLTKFHSEIEELLYSDVENKEHLCVLKDKKKPILFTMARLDRVKNLSGLVEWYGKNTRLRELANLVVVGGDRRKESKDNEEKAEMKKMYDLIEEYKLNGQFRWISSQMDRVRNGELYRYICDTKGAFVQPALYEAFGLTVVEAMTCGLPTFATCKGGPAEIIVHGKSGFHIDPYHGDQAADTLADFFTKCKEDPSHWDEISKGGLQRIEEKYTWQIYSQRLLTLTGVYGFWKHVSNLDRLEARRYLEMFYALKYRPLAQAVPLAQDD
UGT76G1-スクロースシンターゼ(SUS)融合酵素:DNA配列(配列番号6)
ATGGAGAATAAGACAGAAACAACCGTAAGACGGAGGCGGAGGATTATCTTGTTCCCTGTACCATTTCAGGGCCATATTAATCCGATCCTCCAATTAGCAAACGTCCTCTACTCCAAGGGATTTTCAATAACAATCTTCCATACTAACTTTAACAAGCCTAAAACGAGTAATTATCCTCACTTTACATTCAGGTTCATTCTAGACAACGACCCTCAGGATGAGCGTATCTCAAATTTACCTACGCATGGCCCCTTGGCAGGTATGCGAATACCAATAATCAATGAGCATGGAGCCGATGAACTCCGTCGCGAGTTAGAGCTTCTCATGCTCGCAAGTGAGGAAGACGAGGAAGTTTCGTGCCTAATAACTGATGCGCTTTGGTACTTCGCCCAATCAGTCGCAGACTCACTGAATCTACGCCGTTTGGTCCTTATGACAAGTTCATTATTCAACTTTCACGCACATGTATCACTGCCGCAATTTGACGAGTTGGGTTACCTGGACCCGGATGACAAAACGCGATTGGAGGAACAAGCGTCGGGCTTCCCCATGCTGAAAGTCAAAGATATTAAGAGCGCTTATAGTAATTGGCAAATTCTGAAAGAAATTCTCGGAAAAATGATAAAGCAAACCAAAGCGTCCTCTGGAGTAATCTGGAACTCCTTCAAGGAGTTAGAGGAATCTGAACTTGAAACGGTCATCAGAGAAATCCCCGCTCCCTCGTTCTTAATTCCACTACCCAAGCACCTTACTGCAAGTAGCAGTTCCCTCCTAGATCATGACCGAACCGTGTTTCAGTGGCTGGATCAGCAACCCCCGTCGTCAGTTCTATATGTAAGCTTTGGGAGTACTTCGGAAGTGGATGAAAAGGACTTCTTAGAGATTGCGCGAGGGCTCGTGGATAGCAAACAGAGCTTCCTGTGGGTAGTGAGACCGGGATTCGTTAAGGGCTCGACGTGGGTCGAGCCGTTGCCAGATGGTTTTCTAGGGGAGAGAGGGAGAATCGTGAAATGGGTTCCACAGCAAGAGGTTTTGGCTCACGGAGCTATAGGGGCCTTTTGGACCCACTCTGGTTGGAATTCTACTCTTGAAAGTGTCTGTGAAGGCGTTCCAATGATATTTTCTGATTTTGGGCTTGACCAGCCTCTAAACGCTCGCTATATGTCTGATGTGTTGAAGGTTGGCGTGTACCTGGAGAATGGTTGGGAAAGGGGGGAAATTGCCAACGCCATACGCCGGGTAATGGTGGACGAGGAAGGTGAGTACATACGTCAGAACGCTCGGGTTTTAAAACAAAAAGCGGACGTCAGCCTTATGAAGGGAGGTAGCTCCTATGAATCCCTAGAATCCTTGGTAAGCTATATATCTTCGTTAGGTTCTGGTGCAAACGCTGAACGTATGATAACGCGCGTCCACAGCCAACGTGAGCGTTTGAACGAAACGCTTGTTTCTGAGAGAAACGAAGTCCTTGCCTTGCTTTCCAGGGTTGAAGCCAAAGGTAAAGGTATTTTACAACAAAACCAGATCATTGCTGAATTCGAAGCTTTGCCTGAACAAACCCGGAAGAAACTTGAAGGTGGTCCTTTCTTTGACCTTCTCAAATCCACTCAGGAAGCAATTGTGTTGCCACCATGGGTTGCTCTAGCTGTGAGGCCAAGGCCTGGTGTTTGGGAATACTTACGAGTCAATCTCCATGCTCTTGTCGTTGAAGAACTCCAACCTGCTGAGTTTCTTCATTTCAAGGAAGAACTCGTTGATGGAGTTAAGAATGGTAATTTCACTCTTGAGCTTGATTTCGAGCCATTCAATGCGTCTATCCCTCGTCCAACACTCCACAAATACATTGGAAATGGTGTTGACTTCCTTAACCGTCATTTATCGGCTAAGCTCTTCCATGACAAGGAGAGTTTGCTTCCATTGCTTAAGTTCCTTCGTCTTCACAGCCACCAGGGCAAGAACCTGATGTTGAGCGAGAAGATTCAGAACCTCAACACTCTGCAACACACCTTGAGGAAAGCAGAAGAGTATCTAGCAGAGCTTAAGTCCGAAACACTGTATGAAGAGTTTGAGGCCAAGTTTGAGGAGATTGGTCTTGAGAGGGGATGGGGAGACAATGCAGAGCGTGTCCTTGACATGATACGTCTTCTTTTGGACCTTCTTGAGGCGCCTGATCCTTGCACTCTTGAGACTTTTCTTGGAAGAGTACCAATGGTGTTCAACGTTGTGATCCTCTCTCCACATGGTTACTTTGCTCAGGACAATGTTCTTGGTTACCCTGACACTGGTGGACAGGTTGTTTACATTCTTGATCAAGTTCGTGCTCTGGAGATAGAGATGCTTCAACGTATTAAGCAACAAGGACTCAACATTAAACCAAGGATTCTCATTCTAACTCGACTTCTACCTGATGCGGTAGGAACTACATGCGGTGAACGTCTCGAGAGAGTTTATGATTCTGAGTACTGTGATATTCTTCGTGTGCCCTTCAGAACAGAGAAGGGTATTGTTCGCAAATGGATCTCAAGGTTCGAAGTCTGGCCATATCTAGAGACTTACACCGAGGATGCTGCGGTTGAGCTATCGAAAGAATTGAATGGCAAGCCTGACCTTATCATTGGTAACTACAGTGATGGAAATCTTGTTGCTTCTTTATTGGCTCACAAACTTGGTGTCACTCAGTGTACCATTGCTCATGCTCTTGAGAAAACAAAGTACCCGGATTCTGATATCTACTGGAAGAAGCTTGACGACAAGTACCATTTCTCATGCCAGTTCACTGCGGATATTTTCGCAATGAACCACACTGATTTCATCATCACTAGTACTTTCCAAGAAATTGCTGGAAGCAAAGAAACTGTTGGGCAGTATGAAAGCCACACAGCCTTTACTCTTCCCGGATTGTATCGAGTTGTTCACGGGATTGATGTGTTTGATCCCAAGTTCAACATTGTCTCTCCTGGTGCTGATATGAGCATCTACTTCCCTTACACAGAGGAGAAGCGTAGATTGACTAAGTTCCACTCTGAGATCGAGGAGCTCCTCTACAGCGATGTTGAGAACAAAGAGCACTTATGTGTGCTCAAGGACAAGAAGAAGCCGATTCTCTTCACAATGGCTAGGCTTGATCGTGTCAAGAACTTGTCAGGTCTTGTTGAGTGGTACGGGAAGAACACCCGCTTGCGTGAGCTAGCTAACTTGGTTGTTGTTGGAGGAGACAGGAGGAAAGAGTCAAAGGACAATGAAGAGAAAGCAGAGATGAAGAAAATGTATGATCTCATTGAGGAATACAAGCTAAACGGTCAGTTCAGGTGGATCTCCTCTCAGATGGACCGGGTAAGGAACGGTGAGCTGTACCGGTACATCTGTGACACCAAGGGTGCTTTTGTCCAACCTGCATTATATGAAGCCTTTGGGTTAACTGTTGTGGAGGCTATGACTTGTGGTTTACCGACTTTCGCCACTTGCAAAGGTGGTCCAGCTGAGATCATTGTGCACGGTAAATCGGGTTTCCACATTGACCCTTACCATGGTGATCAGGCTGCTGATACTCTTGCTGATTTCTTCACCAAGTGTAAGGAGGATCCATCTCACTGGGATGAGATCTCAAAAGGAGGGCTTCAGAGGATTGAGGAGAAATACACTTGGCAAATCTATTCACAGAGGCTCTTGACATTGACTGGTGTGTATGGATTCTGGAAGCATGTCTCGAACCTTGACCGTCTTGAGGCTCGCCGTTACCTTGAAATGTTCTATGCATTGAAGTATCGCCCATTGGCTCAGGCTGTTCCTCTTGCACAAGATGATTGA
HV1-SUS融合酵素:アミノ酸配列(配列番号7)
MDGNSSSSPLHVVICPWLALGHLLPCLDIAERLASRGHRVSFVSTPRNIARLPPLRPAVAPLVDFVALPLPHVDGLPEGAESTNDVPYDKFELHRKAFDGLAAPFSEFLRAACAEGAGSRPDWLIVDTFHHWAAAAAVENKVPCVMLLLGAATVIAGFARGVSEHAAAAVGKERPAAEAPSFETERRKLMTTQNASGMTVAERYFLTLMRSDLVAIRSCAEWEPESVAALTTLAGKPVVPLGLLPPSPEGGRGVSKEDAAVRWLDAQPAKSVVYVALGSEVPLRAEQVHELALGLELSGARFLWALRKPTDAPDAAVLPPGFEERTRGRGLVVTGWVPQIGVLAHGAVAAFLTHCGWNSTIEGLLFGHPLIMLPISSDQGPNARLMEGRKVGMQVPRDESDGSFRREDVAATVRAVAVEEDGRRVFTANAKKMQEIVADGACHERCIDGFIQQLRSYKAGSGANAERMITRVHSQRERLNETLVSERNEVLALLSRVEAKGKGILQQNQIIAEFEALPEQTRKKLEGGPFFDLLKSTQEAIVLPPWVALAVRPRPGVWEYLRVNLHALVVEELQPAEFLHFKEELVDGVKNGNFTLELDFEPFNASIPRPTLHKYIGNGVDFLNRHLSAKLFHDKESLLPLLKFLRLHSHQGKNLMLSEKIQNLNTLQHTLRKAEEYLAELKSETLYEEFEAKFEEIGLERGWGDNAERVLDMIRLLLDLLEAPDPCTLETFLGRVPMVFNVVILSPHGYFAQDNVLGYPDTGGQVVYILDQVRALEIEMLQRIKQQGLNIKPRILILTRLLPDAVGTTCGERLERVYDSEYCDILRVPFRTEKGIVRKWISRFEVWPYLETYTEDAAVELSKELNGKPDLIIGNYSDGNLVASLLAHKLGVTQCTIAHALEKTKYPDSDIYWKKLDDKYHFSCQFTADIFAMNHTDFIITSTFQEIAGSKETVGQYESHTAFTLPGLYRVVHGIDVFDPKFNIVSPGADMSIYFPYTEEKRRLTKFHSEIEELLYSDVENKEHLCVLKDKKKPILFTMARLDRVKNLSGLVEWYGKNTRLRELANLVVVGGDRRKESKDNEEKAEMKKMYDLIEEYKLNGQFRWISSQMDRVRNGELYRYICDTKGAFVQPALYEAFGLTVVEAMTCGLPTFATCKGGPAEIIVHGKSGFHIDPYHGDQAADTLADFFTKCKEDPSHWDEISKGGLQRIEEKYTWQIYSQRLLTLTGVYGFWKHVSNLDRLEARRYLEMFYALKYRPLAQAVPLAQDD
HV1-SUS融合酵素:DNA配列(配列番号8)ATGGATGGTAACTCCTCCTCCTCGCCGCTGCATGTGGTCATTTGTCCGTGGCTGGCTCTGGGTCACCTGCTGCCGTGTCTGGATATTGCTGAACGTCTGGCGTCACGCGGCCATCGTGTCAGTTTTGTGTCCACCCCGCGCAACATTGCCCGTCTGCCGCCGCTGCGTCCGGCTGTTGCACCGCTGGTTGATTTCGTCGCACTGCCGCTGCCGCATGTTGACGGTCTGCCGGAGGGTGCGGAATCGACCAATGATGTGCCGTATGACAAATTTGAACTGCACCGTAAGGCGTTCGATGGTCTGGCGGCCCCGTTTAGCGAATTTCTGCGTGCAGCTTGCGCAGAAGGTGCAGGTTCTCGCCCGGATTGGCTGATTGTGGACACCTTTCATCACTGGGCGGCGGCGGCGGCGGTGGAAAACAAAGTGCCGTGTGTTATGCTGCTGCTGGGTGCAGCAACGGTGATCGCTGGTTTCGCGCGTGGTGTTAGCGAACATGCGGCGGCGGCGGTGGGTAAAGAACGTCCGGCTGCGGAAGCCCCGAGTTTTGAAACCGAACGTCGCAAGCTGATGACCACGCAGAATGCCTCCGGCATGACCGTGGCAGAACGCTATTTCCTGACGCTGATGCGTAGCGATCTGGTTGCCATCCGCTCTTGCGCAGAATGGGAACCGGAAAGCGTGGCAGCACTGACCACGCTGGCAGGTAAACCGGTGGTTCCGCTGGGTCTGCTGCCGCCGAGTCCGGAAGGCGGTCGTGGCGTTTCCAAAGAAGATGCTGCGGTCCGTTGGCTGGACGCACAGCCGGCAAAGTCAGTCGTGTACGTCGCACTGGGTTCGGAAGTGCCGCTGCGTGCGGAACAAGTTCACGAACTGGCACTGGGCCTGGAACTGAGCGGTGCTCGCTTTCTGTGGGCGCTGCGTAAACCGACCGATGCACCGGACGCCGCAGTGCTGCCGCCGGGTTTCGAAGAACGTACCCGCGGCCGTGGTCTGGTTGTCACGGGTTGGGTGCCGCAGATTGGCGTTCTGGCTCATGGTGCGGTGGCTGCGTTTCTGACCCACTGTGGCTGGAACTCTACGATCGAAGGCCTGCTGTTCGGTCATCCGCTGATTATGCTGCCGATCAGCTCTGATCAGGGTCCGAATGCGCGCCTGATGGAAGGCCGTAAAGTCGGTATGCAAGTGCCGCGTGATGAATCAGACGGCTCGTTTCGTCGCGAAGATGTTGCCGCAACCGTCCGCGCCGTGGCAGTTGAAGAAGACGGTCGTCGCGTCTTCACGGCTAACGCGAAAAAGATGCAAGAAATTGTGGCCGATGGCGCATGCCACGAACGTTGTATTGACGGTTTTATCCAGCAACTGCGCAGTTACAAGGCGGGTTCTGGTGCAAACGCTGAACGTATGATAACGCGCGTCCACAGCCAACGTGAGCGTTTGAACGAAACGCTTGTTTCTGAGAGAAACGAAGTCCTTGCCTTGCTTTCCAGGGTTGAAGCCAAAGGTAAAGGTATTTTACAACAAAACCAGATCATTGCTGAATTCGAAGCTTTGCCTGAACAAACCCGGAAGAAACTTGAAGGTGGTCCTTTCTTTGACCTTCTCAAATCCACTCAGGAAGCAATTGTGTTGCCACCATGGGTTGCTCTAGCTGTGAGGCCAAGGCCTGGTGTTTGGGAATACTTACGAGTCAATCTCCATGCTCTTGTCGTTGAAGAACTCCAACCTGCTGAGTTTCTTCATTTCAAGGAAGAACTCGTTGATGGAGTTAAGAATGGTAATTTCACTCTTGAGCTTGATTTCGAGCCATTCAATGCGTCTATCCCTCGTCCAACACTCCACAAATACATTGGAAATGGTGTTGACTTCCTTAACCGTCATTTATCGGCTAAGCTCTTCCATGACAAGGAGAGTTTGCTTCCATTGCTTAAGTTCCTTCGTCTTCACAGCCACCAGGGCAAGAACCTGATGTTGAGCGAGAAGATTCAGAACCTCAACACTCTGCAACACACCTTGAGGAAAGCAGAAGAGTATCTAGCAGAGCTTAAGTCCGAAACACTGTATGAAGAGTTTGAGGCCAAGTTTGAGGAGATTGGTCTTGAGAGGGGATGGGGAGACAATGCAGAGCGTGTCCTTGACATGATACGTCTTCTTTTGGACCTTCTTGAGGCGCCTGATCCTTGCACTCTTGAGACTTTTCTTGGAAGAGTACCAATGGTGTTCAACGTTGTGATCCTCTCTCCACATGGTTACTTTGCTCAGGACAATGTTCTTGGTTACCCTGACACTGGTGGACAGGTTGTTTACATTCTTGATCAAGTTCGTGCTCTGGAGATAGAGATGCTTCAACGTATTAAGCAACAAGGACTCAACATTAAACCAAGGATTCTCATTCTAACTCGACTTCTACCTGATGCGGTAGGAACTACATGCGGTGAACGTCTCGAGAGAGTTTATGATTCTGAGTACTGTGATATTCTTCGTGTGCCCTTCAGAACAGAGAAGGGTATTGTTCGCAAATGGATCTCAAGGTTCGAAGTCTGGCCATATCTAGAGACTTACACCGAGGATGCTGCGGTTGAGCTATCGAAAGAATTGAATGGCAAGCCTGACCTTATCATTGGTAACTACAGTGATGGAAATCTTGTTGCTTCTTTATTGGCTCACAAACTTGGTGTCACTCAGTGTACCATTGCTCATGCTCTTGAGAAAACAAAGTACCCGGATTCTGATATCTACTGGAAGAAGCTTGACGACAAGTACCATTTCTCATGCCAGTTCACTGCGGATATTTTCGCAATGAACCACACTGATTTCATCATCACTAGTACTTTCCAAGAAATTGCTGGAAGCAAAGAAACTGTTGGGCAGTATGAAAGCCACACAGCCTTTACTCTTCCCGGATTGTATCGAGTTGTTCACGGGATTGATGTGTTTGATCCCAAGTTCAACATTGTCTCTCCTGGTGCTGATATGAGCATCTACTTCCCTTACACAGAGGAGAAGCGTAGATTGACTAAGTTCCACTCTGAGATCGAGGAGCTCCTCTACAGCGATGTTGAGAACAAAGAGCACTTATGTGTGCTCAAGGACAAGAAGAAGCCGATTCTCTTCACAATGGCTAGGCTTGATCGTGTCAAGAACTTGTCAGGTCTTGTTGAGTGGTACGGGAAGAACACCCGCTTGCGTGAGCTAGCTAACTTGGTTGTTGTTGGAGGAGACAGGAGGAAAGAGTCAAAGGACAATGAAGAGAAAGCAGAGATGAAGAAAATGTATGATCTCATTGAGGAATACAAGCTAAACGGTCAGTTCAGGTGGATCTCCTCTCAGATGGACCGGGTAAGGAACGGTGAGCTGTACCGGTACATCTGTGACACCAAGGGTGCTTTTGTCCAACCTGCATTATATGAAGCCTTTGGGTTAACTGTTGTGGAGGCTATGACTTGTGGTTTACCGACTTTCGCCACTTGCAAAGGTGGTCCAGCTGAGATCATTGTGCACGGTAAATCGGGTTTCCACATTGACCCTTACCATGGTGATCAGGCTGCTGATACTCTTGCTGATTTCTTCACCAAGTGTAAGGAGGATCCATCTCACTGGGATGAGATCTCAAAAGGAGGGCTTCAGAGGATTGAGGAGAAATACACTTGGCAAATCTATTCACAGAGGCTCTTGACATTGACTGGTGTGTATGGATTCTGGAAGCATGTCTCGAACCTTGACCGTCTTGAGGCTCGCCGTTACCTTGAAATGTTCTATGCATTGAAGTATCGCCCATTGGCTCAGGCTGTTCCTCTTGCACAAGATGATTAA
シロイヌナズナスクロースシンターゼI:アミノ酸配列(配列番号9)
MANAERMITRVHSQRERLNETLVSERNEVLALLSRVEAKGKGILQQNQIIAEFEALPEQTRKKLEGGPFFDLLKSTQEAIVLPPWVALAVRPRPGVWEYLRVNLHALVVEELQPAEFLHFKEELVDGVKNGNFTLELDFEPFNASIPRPTLHKYIGNGVDFLNRHLSAKLFHDKESLLPLLKFLRLHSHQGKNLMLSEKIQNLNTLQHTLRKAEEYLAELKSETLYEEFEAKFEEIGLERGWGDNAERVLDMIRLLLDLLEAPDPCTLETFLGRVPMVFNVVILSPHGYFAQDNVLGYPDTGGQVVYILDQVRALEIEMLQRIKQQGLNIKPRILILTRLLPDAVGTTCGERLERVYDSEYCDILRVPFRTEKGIVRKWISRFEVWPYLETYTEDAAVELSKELNGKPDLIIGNYSDGNLVASLLAHKLGVTQCTIAHALEKTKYPDSDIYWKKLDDKYHFSCQFTADIFAMNHTDFIITSTFQEIAGSKETVGQYESHTAFTLPGLYRVVHGIDVFDPKFNIVSPGADMSIYFPYTEEKRRLTKFHSEIEELLYSDVENKEHLCVLKDKKKPILFTMARLDRVKNLSGLVEWYGKNTRLRELANLVVVGGDRRKESKDNEEKAEMKKMYDLIEEYKLNGQFRWISQMDRVRNGELYRYICDTKGAFVQPALYEAFGLTVVEAMTCGLPTFATCKGGPAEIIVHGKSGFHIDPYHGDQAADTLADFFTKCKEDPSHWDEISKGGLQRIEEKYTWQIYSQRLLTLTGVYGFWKHVSNLDRLEARRYLEMFYALKYRPLAQAVPLAQDD
シロイヌナズナスクロースシンターゼI:DNA配列(配列番号10)
ATGGCAAACGCTGAACGTATGATTACCCGTGTCCACTCCCAACGCGAACGCCTGAACGAAACCCTGGTGTCGGAACGCAACGAAGTTCTGGCACTGCTGAGCCGTGTGGAAGCTAAGGGCAAAGGTATTCTGCAGCAAAACCAGATTATCGCGGAATTTGAAGCCCTGCCGGAACAAACCCGCAAAAAGCTGGAAGGCGGTCCGTTTTTCGATCTGCTGAAATCTACGCAGGAAGCGATCGTTCTGCCGCCGTGGGTCGCACTGGCAGTGCGTCCGCGTCCGGGCGTTTGGGAATATCTGCGTGTCAACCTGCATGCACTGGTGGTTGAAGAACTGCAGCCGGCTGAATTTCTGCACTTCAAGGAAGAACTGGTTGACGGCGTCAAAAACGGTAATTTTACCCTGGAACTGGATTTTGAACCGTTCAATGCCAGTATCCCGCGTCCGACGCTGCATAAATATATTGGCAACGGTGTGGACTTTCTGAATCGCCATCTGAGCGCAAAGCTGTTCCACGATAAAGAATCTCTGCTGCCGCTGCTGAAATTCCTGCGTCTGCATAGTCACCAGGGCAAGAACCTGATGCTGTCCGAAAAAATTCAGAACCTGAATACCCTGCAACACACGCTGCGCAAGGCGGAAGAATACCTGGCCGAACTGAAAAGTGAAACCCTGTACGAAGAATTCGAAGCAAAGTTCGAAGAAATTGGCCTGGAACGTGGCTGGGGTGACAATGCTGAACGTGTTCTGGATATGATCCGTCTGCTGCTGGACCTGCTGGAAGCACCGGACCCGTGCACCCTGGAAACGTTTCTGGGTCGCGTGCCGATGGTTTTCAACGTCGTGATTCTGTCCCCGCATGGCTATTTTGCACAGGACAATGTGCTGGGTTACCCGGATACCGGCGGTCAGGTTGTCTATATTCTGGATCAAGTTCGTGCGCTGGAAATTGAAATGCTGCAGCGCATCAAGCAGCAAGGCCTGAACATCAAACCGCGTATTCTGATCCTGACCCGTCTGCTGCCGGATGCAGTTGGTACCACGTGCGGTGAACGTCTGGAACGCGTCTATGACAGCGAATACTGTGATATTCTGCGTGTCCCGTTTCGCACCGAAAAGGGTATTGTGCGTAAATGGATCAGTCGCTTCGAAGTTTGGCCGTATCTGGAAACCTACACGGAAGATGCGGCCGTGGAACTGTCCAAGGAACTGAATGGCAAACCGGACCTGATTATCGGCAACTATAGCGATGGTAATCTGGTCGCATCTCTGCTGGCTCATAAACTGGGTGTGACCCAGTGCACGATTGCACACGCTCTGGAAAAGACCAAATATCCGGATTCAGACATCTACTGGAAAAAGCTGGATGACAAATATCATTTTTCGTGTCAGTTCACCGCGGACATTTTTGCCATGAACCACACGGATTTTATTATCACCAGTACGTTCCAGGAAATCGCGGGCTCCAAAGAAACCGTGGGTCAATACGAATCACATACCGCCTTCACGCTGCCGGGCCTGTATCGTGTGGTTCACGGTATCGATGTTTTTGACCCGAAATTCAATATTGTCAGTCCGGGCGCGGATATGTCCATCTATTTTCCGTACACCGAAGAAAAGCGTCGCCTGACGAAATTCCATTCAGAAATTGAAGAACTGCTGTACTCGGACGTGGAAAACAAGGAACACCTGTGTGTTCTGAAAGATAAAAAGAAACCGATCCTGTTTACCATGGCCCGTCTGGATCGCGTGAAGAATCTGTCAGGCCTGGTTGAATGGTATGGTAAAAACACGCGTCTGCGCGAACTGGCAAATCTGGTCGTGGTTGGCGGTGACCGTCGCAAGGAATCGAAAGATAACGAAGAAAAGGCTGAAATGAAGAAAATGTACGATCTGATCGAAGAATACAAGCTGAACGGCCAGTTTCGTTGGATCAGCTCTCAAATGGACCGTGTGCGCAATGGCGAACTGTATCGCTACATTTGCGATACCAAGGGTGCGTTTGTTCAGCCGGCACTGTACGAAGCTTTCGGCCTGACCGTCGTGGAAGCCATGACGTGCGGTCTGCCGACCTTTGCGACGTGTAAAGGCGGTCCGGCCGAAATTATCGTGCATGGCAAATCTGGTTTCCATATCGATCCGTATCACGGTGATCAGGCAGCTGACACCCTGGCGGATTTCTTTACGAAGTGTAAAGAAGACCCGTCACACTGGGATGAAATTTCGAAGGGCGGTCTGCAACGTATCGAAGAAAAATATACCTGGCAGATTTACAGCCAACGCCTGCTGACCCTGACGGGCGTCTACGGTTTTTGGAAACATGTGTCTAATCTGGATCGCCTGGAAGCCCGTCGCTATCTGGAAATGTTTTACGCACTGAAGTATCGCCCGCTGGCACAAGCCGTTCCGCTGGCACAGGACGACTAA
本開示は、食品、飼料、飲料、および薬理学的な産業における適用性を有する。本開示は、一般に、酵素および/または改変された微生物株による特定のステビオール配糖体の生合成製造法および食品および飲料のための甘味料ならびに関連組成物としてのそれらの利用可能性に関する。
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Claims (56)
- レバウジオシドR6-2Aおよび/またはR6-2Bの製造方法であって、
(I)反応混合物を調製することであって、
(i)レバウジオシドD3、
(ii)スクロース、ウリジン二リン酸(UDP)、ウリジン二リン酸-グルコース(UDP-グルコース)、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される1種または複数の基質、および
(iii)以下の群から選択される酵素
(a)反応混合物に別々に添加されるUDPグリコシルトランスフェラーゼおよびスクロースシンターゼ、および
(b)スクロースシンターゼドメインに結合したUDPグリコシルトランスフェラーゼドメインを含むUDPグリコシルトランスフェラーゼ融合酵素、からなる群より選択される酵素、を含む反応混合物を調製すること、および
(II)前記反応混合物をレバウジオシドR6-2Aおよび/またはR6-2Bの製造に十分な時間にわたりインキュベートすること、を含み、
前記レバウジオシドD3は:
の構造を有し、前記レバウジオシドR6-2Aは:
前記スクロースシンターゼまたはスクロースシンターゼドメインが、
(1)アラビドプシススクロースシンターゼI、アラビドプシススクロースシンターゼ3およびビグナ・ラディアテ(Vigna radiate)スクロースシンターゼからなる群より選択されるか、
(2)シロイヌナズナスクロースシンターゼIであるか、
(3)配列番号9のアミノ酸配列に少なくとも90%同一であるか、または
(4)配列番号9のアミノ酸配列を含む、方法。 - レバウジオシドR7-2の製造方法であって、
(I)反応混合物を調製することであって、
(i)レバウジオシドD3、レバウジオシドR6-2A、およびR6-2Bのうちの1種または複数、
(ii)スクロース、ウリジン二リン酸(UDP)、ウリジン二リン酸-グルコース(UDP-グルコース)、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される1種または複数の基質、および
(iii)以下の群から選択される酵素
(a)反応混合物に別々に添加されるUDPグリコシルトランスフェラーゼおよびスクロースシンターゼ、および
(b)スクロースシンターゼドメインに結合したUDPグリコシルトランスフェラーゼドメインを含むUDPグリコシルトランスフェラーゼ融合酵素、からなる群より選択される酵素、を含む反応混合物を調製すること、および
(II)前記反応混合物をレバウジオシドR7-2の製造に十分な時間にわたりインキュベートすること、を含み、
前記レバウジオシドD3は:
前記スクロースシンターゼまたはスクロースシンターゼドメインが、
(1)アラビドプシススクロースシンターゼI、アラビドプシススクロースシンターゼ3およびビグナ・ラディアテ(Vigna radiate)スクロースシンターゼからなる群より選択されるか、
(2)シロイヌナズナスクロースシンターゼIであるか、
(3)配列番号9のアミノ酸配列に少なくとも90%同一であるか、または
(4)配列番号9のアミノ酸配列を含む、方法。 - グルコースが、前記酵素により前記レバウジオシドD3に共有結合され、レバウジオシドR6-2Aおよび/またはR6-2Bが生成される、請求項1または2に記載の方法。
- 前記グルコースが、前記酵素によりレバウジオシドD3のショ糖Iに共有結合され、レバウジオシドR6-2Aが生成される、請求項3に記載の方法。
- 前記グルコースが、前記酵素によりレバウジオシドD3のショ糖IIに共有結合され、レバウジオシドR6-2Bが生成される、請求項3に記載の方法。
- 2つのグルコースが、前記酵素により前記レバウジオシドD3に共有結合され、レバウジオシドR7-2が生成される、請求項2に記載の方法。
- 前記2つのグルコースが、酵素によりレバウジオシドD3のショ糖Iおよびショ糖IIに共有結合され、レバウジオシドR7-2が生成される、請求項6に記載の方法。
- 前記UDPグリコシルトランスフェラーゼが、配列番号1のアミノ酸配列に少なくとも90%同一である、請求項1~7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記UDPグリコシルトランスフェラーゼが、配列番号1のアミノ酸配列を含む、請求項8に記載の方法。
- 前記UDPグリコシルトランスフェラーゼ融合酵素が、配列番号5のアミノ酸配列に少なくとも90%同一である、請求項1~7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記UDPグリコシルトランスフェラーゼ融合酵素が、配列番号5のアミノ酸配列を含む、請求項10に記載の方法。
- レバウジオシドEをUDPグリコシルトランスフェラーゼおよびスクロース、UDP、UDP-グルコース、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される基質と共にインキュベートすることにより、レバウジオシドD3を製造することをさらに含む、請求項1~11のいずれか1項に記載の方法。
- レバウジオシドR6-4Aおよび/またはレバウジオシドR6-4Bを製造する方法であって、
(I)反応混合物を調製することであって、
(i)レバウジオシドZ1およびレバウジオシドZ2のうちの少なくとも1種、
(ii)スクロース、ウリジン二リン酸(UDP)、ウリジン二リン酸-グルコース(UDP-グルコース)、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される1種または複数の基質、および
(iii)以下の群から選択される酵素
(a)UDPグリコシルトランスフェラーゼ(UGT)、
(b)反応混合物に別々に添加されるUDPグリコシルトランスフェラーゼおよびスクロースシンターゼ、および
(c)スクロースシンターゼドメインに結合したUDPグリコシルトランスフェラーゼドメインを含むUDPグリコシルトランスフェラーゼ融合酵素、からなる群より選択される酵素、を含む反応混合物を調製すること、および
(II)前記反応混合物をレバウジオシドR6-4Aおよび/またはレバウジオシドR6-4Bの製造に十分な時間にわたりインキュベートすること、を含み、
前記レバウジオシドZ1は:
- 前記スクロースシンターゼまたはスクロースシンターゼドメインが、アラビドプシススクロースシンターゼI、アラビドプシススクロースシンターゼ3およびビグナ・ラディアテ(Vigna radiate)スクロースシンターゼからなる群より選択される、請求項13に記載の方法。
- 前記スクロースシンターゼまたはスクロースシンターゼドメインが、シロイヌナズナスクロースシンターゼIである、請求項14に記載の方法。
- 前記スクロースシンターゼまたはスクロースシンターゼドメインが、配列番号9のアミノ酸配列に少なくとも90%同一である、請求項15に記載の方法。
- 前記スクロースシンターゼまたはスクロースシンターゼドメインが、配列番号9のアミノ酸配列を含む、請求項16に記載の方法。
- グルコースが、前記酵素により前記レバウジオシドZ1またはレバウジオシドZ2に共有結合され、レバウジオシドR6-4Aが生成される、請求項13~17のいずれか1項に記載の方法。
- 前記グルコースが、前記酵素によりレバウジオシドZ1のショ糖IVに共有結合され、レバウジオシドR6-4Aが生成される、請求項18に記載の方法。
- 前記グルコースが、前記酵素によりレバウジオシドZ2のショ糖IIIに共有結合され、レバウジオシドR6-4Aが生成される、請求項18に記載の方法。
- 前記グルコースが、前記酵素により前記レバウジオシドZ2に共有結合され、レバウジオシドR6-4Bが生成される、請求項13~17のいずれか1項に記載の方法。
- 前記グルコースが、前記酵素によりレバウジオシドZ2のショ糖Vに共有結合され、レバウジオシドR6-4Bが生成される、請求項21に記載の方法。
- 前記UDPグリコシルトランスフェラーゼが、配列番号3のアミノ酸配列に少なくとも90%同一である、請求項13~22のいずれか1項に記載の方法。
- 前記UDPグリコシルトランスフェラーゼが、配列番号3のアミノ酸配列を含む、請求項23に記載の方法。
- 前記UDPグリコシルトランスフェラーゼ融合酵素が、配列番号7のアミノ酸配列に少なくとも90%同一である、請求項13~22のいずれか1項に記載の方法。
- 前記UDPグリコシルトランスフェラーゼ融合酵素が、配列番号7のアミノ酸配列を含む、請求項25に記載の方法。
- レバウジオシドEをUDPグリコシルトランスフェラーゼおよびスクロース、UDP、UDP-グルコース、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される基質と共にインキュベートすることにより、レバウジオシドZ1またはレバウジオシドZ2を製造することをさらに含む、請求項13~26のいずれか1項に記載の方法。
- レバウジオシドR6-1の製造方法であって、
(I)反応混合物を調製することであって、
(i)レバウジオシドD、
(ii)スクロース、ウリジン二リン酸(UDP)、ウリジン二リン酸-グルコース(UDP-グルコース)、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される1種または複数の基質、および
(iii)以下の群から選択される酵素
(a)UDPグリコシルトランスフェラーゼ(UGT)、
(b)反応混合物に別々に添加されるUDPグリコシルトランスフェラーゼおよびスクロースシンターゼ、および
(c)スクロースシンターゼドメインに結合したUDPグリコシルトランスフェラーゼドメインを含むUDPグリコシルトランスフェラーゼ融合酵素、からなる群より選択される酵素、を含む反応混合物を調製すること、および
(II)前記反応混合物をレバウジオシドR6-1を製造するのに十分な時間にわたりインキュベートすること、を含み、前記レバウジオシドDは:
- 前記スクロースシンターゼまたはスクロースシンターゼドメインが、アラビドプシススクロースシンターゼI、アラビドプシススクロースシンターゼ3およびビグナ・ラディアテ(Vigna radiate)スクロースシンターゼからなる群より選択される、請求項28に記載の方法。
- 前記スクロースシンターゼまたはスクロースシンターゼドメインが、シロイヌナズナスクロースシンターゼIである、請求項29に記載の方法。
- 前記スクロースシンターゼまたはスクロースシンターゼドメインが、配列番号9のアミノ酸配列に少なくとも90%同一である、請求項30に記載の方法。
- 前記スクロースシンターゼまたはスクロースシンターゼドメインが、配列番号9のアミノ酸配列を含む、請求項31に記載の方法。
- グルコースが、前記酵素により前記レバウジオシドDに共有結合され、レバウジオシドR6-1が生成される、請求項29~32のいずれか1項に記載の方法。
- 前記グルコースが、前記酵素によりレバウジオシドのショ糖Vに共有結合され、レバウジオシドR6-1が生成される、請求項33に記載の方法。
- 前記UDPグリコシルトランスフェラーゼが、配列番号3のアミノ酸配列に少なくとも90%同一である、請求項29~34のいずれか1項に記載の方法。
- 前記UDPグリコシルトランスフェラーゼが、配列番号3のアミノ酸配列を含む、請求項35に記載の方法。
- 前記UDPグリコシルトランスフェラーゼ融合酵素が、配列番号7のアミノ酸配列に少なくとも90%同一である、請求項28~34のいずれか1項に記載の方法。
- 前記UDPグリコシルトランスフェラーゼ融合酵素が、配列番号7のアミノ酸配列を含む、請求項37に記載の方法。
- レバウジオシドEをUDPグリコシルトランスフェラーゼおよびスクロース、UDP、UDP-グルコース、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される基質と共にインキュベートすることにより、レバウジオシドDを製造することをさらに含む、請求項29~38のいずれか1項に記載の方法。
- レバウジオシドAをUDPグリコシルトランスフェラーゼおよびスクロース、UDP、UDP-グルコース、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される基質と共にインキュベートすることにより、レバウジオシドDを製造することをさらに含む、請求項29~39のいずれか1項に記載の方法。
- 前記反応混合物がインビトロ条件下にある、請求項1~40のいずれか1項に記載の方法。
- 前記反応混合物が細胞ベースの反応混合物である、請求項1~40のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞が、酵母、非ステビオール配糖体生成植物、藻類、真菌類、および細菌からなる群より選択される、請求項42に記載の方法。
- 下記から選択される合成レバウジオシド:
(i)構造:
- 請求項44に記載の合成レバウジオシドを含む、組成物。
- 甘味料として使用するための請求項44に記載の合成レバウジオシド。
- 飲料製品および消費製品からなる群より選択される、甘味を付与する量の、レバウジオシドR6-4A、R6-4B、および/またはR6-1からなる群より選択される甘味料を含む経口消費製品。
- 5ppm~100ppmのレバウジオシドを含む、請求項47に記載の経口消費製品。
- 前記経口消費製品は、1%(w/v-%)~4%(w/v-%)のスクロース溶液に同等の甘味強度を有する、請求項47または48に記載の経口消費製品。
- 前記甘味料が唯一の甘味料である、請求項47~49のいずれか1項に記載の経口消費製品。
- 少なくとも1種の追加の甘味料をさらに含む、請求項47~49のいずれか1項に記載の経口消費製品。
- 前記少なくとも1種の追加の甘味料が、ステビア抽出物、ステビオール配糖体、ステビオシド、レバウジオシドA、レバウジオシドB、レバウジオシドC、レバウジオシドD、組換え微生物の生合成由来のレバウジオシドE、レバウジオシドF、ズルコシドA、レバウジオシドM、レバウジオシドV、レバウジオシドW、レバウジオシドD3、レバウジオシドZ1、レバウジオシドZ2、ルブソシド、ステビオールビオシド、スクロース、高フルクトースコーンシロップ、フルクトース、グルコース、キシロース、アラビノース、ラムノース、エリスリトール、キシリトール、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、AceK、アスパルテーム、ネオテーム、スクラロース、サッカリン、ナリンギンジヒドロカルコン(NarDHC)、ネオヘスペリジンジヒドロカルコン(NDHC)、モグロシドIV、シアメノシドI、モグロシドV、モナチン、タウマチン、モネリン、ブラゼイン、L-アラニン、グリシン、羅漢果、ヘルナンズルチン、フィロズルチン、トリロブタイン、およびこれらの組合せからなる群より選択される、請求項51に記載の経口消費製品。
- 炭水化物、ポリオール、アミノ酸またはその塩、ポリアミノ酸またはその塩、糖酸またはその塩、ヌクレオチド、有機酸、無機酸、有機塩、有機酸塩、有機塩基塩、無機塩、苦味化合物、香味料、香味成分、収斂化合物、タンパク質、タンパク質加水分解物、界面活性剤、乳化剤、フラボノイド、アルコール、ポリマー、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される少なくとも1種の添加物をさらに含む、請求項47~52のいずれか1項に記載の経口消費製品。
- 前記消費製品が、食品、栄養補助食品、医薬品、健康補助食品、歯科用衛生組成物、食用ゲル組成物、化粧品および卓上調味料からなる群より選択される、請求項47~53のいずれか1項に記載の経口消費製品。
- 前記飲料製品が、炭酸飲料製品および非炭酸飲料製品からなる群より選択される、請求項47~53のいずれか1項に記載の経口消費製品。
- 前記飲料製品が、ソフトドリンク、ファウンテン飲料、フローズン飲料、レディ・トゥ・ドリンク飲料、フローズンおよびレディ・トゥ・ドリンク飲料、コーヒー、茶、乳飲料、粉末ソフトドリンク、液体濃縮物、フレーバー・ウォーター、強化水、果実ジュース、果実ジュース香味飲料、スポーツドリンク、またはエナジードリンクからなる群より選択される、請求項55に記載の飲料製品。
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