CN113474464A

CN113474464A - 变体甜菊醇糖苷的生物合成生产

Info

Publication number: CN113474464A
Application number: CN201980091848.0A
Authority: CN
Inventors: 毛国红; M·巴腾; 骆洋; O·余
Original assignee: Conagen Inc
Current assignee: Conagen Inc
Priority date: 2018-12-12
Filing date: 2019-12-12
Publication date: 2021-10-01
Also published as: BR112021011419A2; EP3894577A1; MX2021006986A; JP7449586B2; WO2020123877A1; CA3122403A1; US20210381019A1; JP2022513480A; EP3894577A4

Abstract

本发明涉及新型甜菊醇糖苷R6‑1、R6‑2A、R6‑2B、R6‑4A、R6‑4B和R7‑2，以及例如通过酶促生物转化生产这些新型甜菊醇糖苷。还提供了这些新型甜菊醇糖苷作为甜味剂以及在口服消费产品中的用途。

Description

变体甜菊醇糖苷的生物合成生产

相关申请

本申请根据35 U.S.C. § 119(e)要求于2018年12月12日提交的且名称为“BIOSYNTHETIC PRODUCTION OF VARIANT STEVIOL GLYCOSIDES”的美国临时申请号62/778,422的权益，所述美国临时申请的全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明的领域涉及可用于经由酶促转化生产几种特定甜菊醇糖苷的方法和工艺，以及相关组合物。

背景技术

几种甜菊醇糖苷在甜叶菊(Stevia rebaudiana)叶中作为化合物发现，并且其中几种已被广泛用作食物、饲料和饮料中的高强度、低热量甜味剂。这些天然存在的甜菊醇糖苷具有相同的基础二萜结构(甜菊醇主链)，但在甜菊醇主链的C13和C19位置处的其碳水化合物残基修饰(例如葡萄糖、鼠李糖和木糖残基)的数目和结构方面不同。有趣的是，基础甜菊醇结构的糖‘装饰(ornamentation)’中的这些变化可以影响各个甜菊醇糖苷本身的性质。这些性质可以包括但不限于：味道特性、结晶点、溶解度、口感和感知的甜味以及其它差异。具有已知结构的甜菊醇糖苷包括甜菊糖苷、莱鲍迪甙A、莱鲍迪甙B、莱鲍迪甙C、莱鲍迪甙D、莱鲍迪甙E、莱鲍迪甙I、莱鲍迪甙M、莱鲍迪甙D3、莱鲍迪甙N和莱鲍迪甙O。在商业用途方面，莱鲍迪甙D和M已被公认为安全的(即，它具有‘GRAS’状态)，并且正在针对在食物和饮料市场中的广泛范围的用途进行研究。

在干重的基础上，甜菊糖苷、莱鲍迪甙A、莱鲍迪甙C和杜克甙A分别占野生型甜菊(Stevia)叶中发现的甜菊醇糖苷总重量的9.1、3.8、0.6和0.30百分比，而其它甜菊醇糖苷，例如Reb D和Reb M，以显著更低的量存在。来自甜叶菊植物的提取物是商购可得的，并且在此类提取物中，甜菊糖苷和莱鲍迪甙A最经常是主要组分，并且可以用作起始组分或进一步酶促活性的底物。相比之下，其它已知的甜菊醇糖苷通常作为微量或痕量组分存在于甜菊提取物中。例如，在典型的商业制剂中莱鲍迪甙A的量可以从总甜菊醇糖苷含量的约20%到多于90%不等，而莱鲍迪甙B的量为约1-2%，莱鲍迪甙C的量为约7-15%，并且莱鲍迪甙D的量可以是总甜菊醇糖苷的约2%。

每种不同的甜菊醇糖苷可以具有不同程度的甜度、‘口感’以及与其相关的特定余味。相对于食糖(table sugar)(即，“蔗糖”)，甜菊醇糖苷的甜度一般显著更高。例如，甜菊糖苷的甜度是蔗糖的100-150倍，但具有如在众多的味觉测试中注意到的苦涩余味，而莱鲍迪甙A和E的甜度是蔗糖的250-450倍，并且余味特性比甜菊糖苷好得多。然而，这些甜菊醇糖苷本身仍保留明显的余味，并且天然地适合于食物和饮料行业中的那些应用，在所述应用中，这种余味或与蔗糖的差异可以被掩盖或消除。另外，植物衍生的甜菊提取物的总体味道特性可以受到提取物中存在的各种甜菊醇糖苷的影响，这进而又可能受到由潜在植物所经历的环境条件和所使用的提取工艺的影响。植物生产、天气条件和提取条件中的这些变动可以导致甜菊提取物中的甜菊醇糖苷的组成不一致，使得味道特性在不同批次的提取产物中可以强烈变化。在这种情况下，这些批次可能不适用于食物和饮料行业的特定用途或制剂。甜菊提取物的味道特性还可以受到提取工艺后残留在产物中的植物衍生或环境衍生的污染物(如色素、脂质、蛋白质、酚和糖)的影响。这些污染物通常具有其自身的异味，并且可以使得所得的提取物对于在消费产品中的使用是不期望的。另外，分离在甜菊提取物中并不丰富或根本不存在的甜菊醇莱鲍迪甙的各个或特定组合的成本可能是成本和资源禁止的。

一般地，甜菊醇糖苷通过甜菊醇的一系列糖基化反应形成，所述糖基化反应通常由UDP-糖基转移酶(UGT)酶催化，所述UDP-糖基转移酶使用尿苷5'-二磷酸葡萄糖(UDP-葡萄糖)作为糖部分的供体。在植物中，UGT是一组非常趋异的酶，其可以将葡萄糖残基从UDP-葡萄糖转移到甜菊醇。在这些反应中，甜菊糖苷经常是各种莱鲍迪甙化合物的生物合成中的中间体。例如，甜菊糖苷在甜菊糖苷的C-13-O-葡萄糖的C-3'处的糖基化产生莱鲍迪甙A；而在甜菊糖苷的19-O-葡萄糖位置的C-2'处的糖基化产生莱鲍迪甙E。

先前已描述了Reb D3(13-[(2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-6-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D吡喃葡萄糖基)氧基]对映-贝壳杉-16-烯-19-酸-(2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D吡喃葡萄糖基)酯)可以通过EUGT11或EUS酶从Reb E进行转化。Reb Z(Z1和Z2)可以通过HV1酶从Reb E进行转化。命名为Reb Z的两种化合物的混合物被表征为13-[(2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]对映-贝壳杉-16-烯-19-酸-2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基酯(Reb Z1)、或13-[(2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]对映-贝壳杉-16-烯-19-酸-[(2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)酯(Reb Z2)。

甜菊醇糖苷生物合成途径涉及通过酶KAH的活性将对映-贝壳杉烯酸(ent-kaurenoic acid)转化为甜菊醇。已显示了UGT76G1显示出针对甜菊醇双糖苷的糖基化活性，形成莱鲍迪甙B，以及针对甜菊糖苷的糖基化活性，导致莱鲍迪甙A的产生。另外，KAH、UGT85C2、UGT74G1和UGT76G1的相互作用亲和力已对于对映-贝壳杉烯酸和甜菊醇进行评估。关于KAH的模型显示了对于配体甜菊醇的最高亲和力，随后为甜菊醇-单糖苷和对映-贝壳杉烯酸。关于UGT76G1三维模型的对接结果提示了其对于对映-贝壳杉烯酸的最高结合亲和力，但也提示了这些酶具有与甜菊醇糖苷生物合成途径中的多于一种配体相互作用的能力。

改善甜菊提取物的味道质量的实用方法是增加一般而言具有更期望的味道特征的那些莱鲍迪甙化合物的产率，并且经由更具生产力的合成途径来实现这一点。在测试的甜菊醇糖苷中，许多人认为Reb M具有用于各种食物和饮料中的最期望的味道和化学特征。然而，如上文陈述的，植物在其叶中存在极少量的这种化合物。

更进一步地，从植物的提取工艺通常采用固液提取技术，使用溶剂如己烷、氯仿和乙醇用于甜菊醇糖苷回收(Catchpole等人，2003)。然而，溶剂提取本身是能源密集型的，导致有毒废物处置的问题，需要用于植物本身生长的广泛种植面积，并且产生需要进一步纯化/修饰或生物转化的产物。发酵和/或酶促生物转化技术的使用可以允许在微生物物种中生产甜菊醇糖苷，这可以增加所需甜菊醇糖苷的选择性、丰度和纯度。

除上述之外，虽然消费者认可并积极寻求食物、饲料、香料或药用组分的天然和生物来源，但他们还关注采购、一致的味道特性和环境上可持续的生产。本发明的微生物发酵和生产方法可以以对于各种工业和研究有用的数量提供莱鲍迪甙，同时以比无机合成或当前植物提取技术更天然的方式实现这一点。

相应地，需要开发新型甜菊醇糖苷变体以及有关的生产方法，所述生产方法可以经济方便地执行，以进一步实现人和动物的消费。

发明内容

本公开内容至少部分地涉及来自各种莱鲍迪甙的几种甜菊醇糖苷的鉴定、合成和生产。在一些方面，本公开内容提供了Reb D3在Reb R7-2或Reb R6-2的生产中的用途。在一些方面，本公开内容提供了Reb D在Reb R6-1的生产中的用途。在一些方面，本公开内容提供了Reb Z1或Reb Z2作为用于Reb R6-4A生产的原材料的用途。在一些方面，本公开内容提供了Reb Z2作为用于R6-4B生产的原材料的用途。产物甜菊醇糖苷通过NMR分析进行鉴定，并在生产后经受各种味觉测试和加工测试，以鉴定其特定的风味和性能特征。

本公开内容的一些方面提供了生产莱鲍迪甙R6-2A和/或R6-2B的方法，该方法包括：

(I)制备包含以下的反应混合物：

(i)莱鲍迪甙D3；

(ii)选自蔗糖、尿苷二磷酸(UDP)、尿苷二磷酸-葡萄糖(UDP-葡萄糖)及其组合的一种或多种底物；和

(iii)选自以下的酶：

(a)UDP-糖基转移酶(UGT)；

(b)分开加入反应混合物中的UDP-糖基转移酶和蔗糖合酶；和

(c)UDP-糖基转移酶融合酶，其包含与蔗糖合酶结构域偶联的UDP-糖基转移酶结构域；和

(II)使反应混合物温育足够的时间，以产生莱鲍迪甙R6-2A和/或R6-2B；

其中所述莱鲍迪甙D3具有以下的结构：

；

莱鲍迪甙R6-2A具有以下的结构：

；和

莱鲍迪甙R6-2B具有以下的结构：

。

本公开内容的其它方面提供了生产莱鲍迪甙R7-2的方法，该方法包括：

(I)制备包含以下的反应混合物：

(i)莱鲍迪甙D3、莱鲍迪甙R6-2A和莱鲍迪甙R6-2B中的一种或多种；

(iii)选自以下的酶：

(a)UDP-糖基转移酶(UGT)；

(b)分开加入反应混合物中的UDP-糖基转移酶和蔗糖合酶；和

(II)使反应混合物温育足够的时间，以产生莱鲍迪甙R7-2；

其中所述莱鲍迪甙D3具有以下的结构：

；

莱鲍迪甙R6-2A具有以下的结构：

；

莱鲍迪甙R6-2B具有以下的结构：

；和

莱鲍迪甙R7-2具有以下的结构：

。

在一些实施方案中，蔗糖合酶或蔗糖合酶结构域选自拟南芥属(Arabidopsis)蔗糖合酶I、拟南芥属蔗糖合酶3和绿豆(Vigna radiate)蔗糖合酶。在一些实施方案中，蔗糖合酶或蔗糖合酶结构域是拟南芥(Arabidopsis thaliana)蔗糖合酶I。在一些实施方案中，蔗糖合酶或蔗糖合酶结构域与SEQ ID NO: 9的氨基酸序列具有至少80%同一性。在一些实施方案中，蔗糖合酶或蔗糖合酶结构域包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列。

在一些实施方案中，葡萄糖通过酶与莱鲍迪甙D3共价偶联，以产生莱鲍迪甙R6-2A和/或R6-2B。在一些实施方案中，葡萄糖通过酶与莱鲍迪甙D3的糖I共价偶联，以产生莱鲍迪甙R6-2A。在一些实施方案中，葡萄糖通过酶与莱鲍迪甙D3的糖II共价偶联，以产生莱鲍迪甙R6-2B。在一些实施方案中，两个葡萄糖通过酶与莱鲍迪甙D3共价偶联，以产生莱鲍迪甙R7-2。在一些实施方案中，两个葡萄糖通过酶与莱鲍迪甙D3的糖I和糖II共价偶联，以产生莱鲍迪甙R7-2。

UDP-糖基转移酶与SEQ ID NO: 1的氨基酸序列具有至少80%同一性。在一些实施方案中，UDP-糖基转移酶包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列。在一些实施方案中，UDP-糖基转移酶融合酶与SEQ ID NO: 5的氨基酸序列具有至少80%同一性。在一些实施方案中，UDP-糖基转移酶融合酶包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列。

在一些实施方案中，该方法进一步包括通过使莱鲍迪甙E与UDP-糖基转移酶以及选自蔗糖、UDP、UDP-葡萄糖及其组合的底物一起温育，来生产莱鲍迪甙D3。

本文进一步提供的是生产莱鲍迪甙R6-4A和/或莱鲍迪甙R6-4B的方法，该方法包括：

(I)制备包含以下的反应混合物：

(i)莱鲍迪甙Z1和莱鲍迪甙Z2中的至少一种；

(iii)选自以下的酶：

(a)UDP-糖基转移酶(UGT)；

(b)分开加入反应混合物中的UDP-糖基转移酶和蔗糖合酶；和

(II)使反应混合物温育足够的时间，以产生莱鲍迪甙R6-4A和/或莱鲍迪甙R6-4B；

其中所述莱鲍迪甙Z1具有以下的结构：

；

莱鲍迪甙Z2具有以下的结构：

；

莱鲍迪甙R6-4A具有以下的结构：

；和

莱鲍迪甙R6-4B具有以下的结构：

。

在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，蔗糖合酶或蔗糖合酶结构域选自拟南芥属蔗糖合酶I、拟南芥属蔗糖合酶3和绿豆蔗糖合酶。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，蔗糖合酶或蔗糖合酶结构域是拟南芥蔗糖合酶I。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，蔗糖合酶或蔗糖合酶结构域与SEQ IDNO: 9的氨基酸序列具有至少80%同一性。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，蔗糖合酶或蔗糖合酶结构域包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列。

在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，葡萄糖通过酶与莱鲍迪甙Z1或莱鲍迪甙Z2共价偶联，以产生莱鲍迪甙R6-4A。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，葡萄糖通过酶与莱鲍迪甙Z1的糖IV共价偶联，以产生莱鲍迪甙R6-4A。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，葡萄糖通过酶与莱鲍迪甙Z2的糖III共价偶联，以产生莱鲍迪甙R6-4A。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，葡萄糖通过酶与莱鲍迪甙Z2共价偶联，以产生莱鲍迪甙R6-4B。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，葡萄糖通过酶与莱鲍迪甙Z2的糖V共价偶联，以产生莱鲍迪甙R6-4B。

在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，UDP-糖基转移酶与SEQID NO: 3的氨基酸序列具有至少80%同一性。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，UDP-糖基转移酶包含SEQ ID NO: 3的氨基酸序列。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，UDP-糖基转移酶融合酶与SEQ ID NO: 7的氨基酸序列具有至少80%同一性。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，UDP-糖基转移酶融合酶包含SEQ ID NO: 7的氨基酸序列。

在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，该方法进一步包括通过使莱鲍迪甙E与UDP-糖基转移酶以及选自蔗糖、UDP、UDP-葡萄糖及其组合的底物一起温育，来生产莱鲍迪甙Z1或莱鲍迪甙Z2。

本公开内容的其它方面提供了生产莱鲍迪甙R6-1的方法，该方法包括：

(I)制备包含以下的反应混合物：

(i)莱鲍迪甙D；

(iii)选自以下的酶：

(a)UDP-糖基转移酶(UGT)；

(b)分开加入反应混合物中的UDP-糖基转移酶和蔗糖合酶；和

(II)使反应混合物温育足够的时间，以产生莱鲍迪甙R6-1；

其中所述莱鲍迪甙D具有以下的结构：

；和

莱鲍迪甙R6-1具有以下的结构：

。

在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，蔗糖合酶或蔗糖合酶结构域选自拟南芥属蔗糖合酶I、拟南芥属蔗糖合酶3和绿豆蔗糖合酶。在一些实施方案中，蔗糖合酶或蔗糖合酶结构域是拟南芥蔗糖合酶I。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，蔗糖合酶或蔗糖合酶结构域与SEQ ID NO: 9的氨基酸序列具有至少80%同一性。在一些实施方案中，蔗糖合酶或蔗糖合酶结构域包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，葡萄糖通过酶与莱鲍迪甙D共价偶联，以产生莱鲍迪甙R6-1。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，葡萄糖通过酶与莱鲍迪甙D的糖V共价偶联，以产生莱鲍迪甙R6-1。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，UDP-糖基转移酶与SEQ ID NO: 3的氨基酸序列具有至少80%同一性。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，UDP-糖基转移酶包含SEQID NO: 3的氨基酸序列。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，UDP-糖基转移酶融合酶与SEQ ID NO: 7的氨基酸序列具有至少80%同一性。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，UDP-糖基转移酶融合酶包含SEQ ID NO: 7的氨基酸序列。

在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，该方法进一步包括通过使莱鲍迪甙E与UDP-糖基转移酶以及选自蔗糖、UDP、UDP-葡萄糖及其组合的底物一起温育，来生产莱鲍迪甙D。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，该方法进一步包括通过使莱鲍迪甙A与UDP-糖基转移酶以及选自蔗糖、UDP、UDP-葡萄糖及其组合的底物一起温育，来生产莱鲍迪甙D。

在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，反应混合物是在体外的。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，反应混合物是基于细胞的反应混合物。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，细胞选自酵母、非甜菊醇糖苷生产植物、藻类、真菌和细菌。

本公开内容的其它方面提供选自以下的莱鲍迪甙(例如，合成莱鲍迪甙)：

(i)莱鲍迪甙R6-2A，其具有以下结构：

；

(ii)莱鲍迪甙R6-2B，其具有以下结构：

(iii)莱鲍迪甙R7-2，其具有以下结构：

；

(iv)莱鲍迪甙R6-4A，其具有以下结构：

(v)莱鲍迪甙R6-4B，其具有以下结构：

；和

(vi)莱鲍迪甙R6-1，其具有以下结构：

。

还提供了包含本文提供的任何一种莱鲍迪甙(例如，合成莱鲍迪甙)的组合物。

本文进一步提供的是本文描述的任何一种莱鲍迪甙(例如，合成莱鲍迪甙)作为甜味剂的用途。

本公开内容的其它方面提供了口服消费产品，其包含增甜量的本文提供的任何一种甜味剂，例如选自莱鲍迪甙R6-2A、R6-2B、R7-2、R6-4A、R6-4B和/或R6-1的甜味剂，例如其中所述口服消费产品选自饮料产品和消费产品。

在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，甜味剂是唯一的甜味剂。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，口服消费产品包含约5 ppm至100 ppm的莱鲍迪甙。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，口服消费产品具有等价于约1%(w/v-%)至约4%(w/v-%)蔗糖溶液的甜味强度。

在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，口服消费产品进一步包含至少一种另外的甜味剂。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，至少一种另外的甜味剂选自甜菊提取物、甜菊醇糖苷、甜菊糖苷、莱鲍迪甙A、莱鲍迪甙B、莱鲍迪甙C、莱鲍迪甙D、衍生自重组微生物生物合成的莱鲍迪甙E、莱鲍迪甙F、杜克甙A、莱鲍迪甙M、莱鲍迪甙V、莱鲍迪甙W、莱鲍迪甙D3、莱鲍迪甙Z1、莱鲍迪甙Z2、甜茶苷、甜菊醇双糖苷、蔗糖、高果糖玉米糖浆、果糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、赤藓糖醇、木糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、AceK、阿斯巴甜、纽甜、三氯蔗糖、糖精、柚皮苷二氢查耳酮(NarDHC)、新橙皮苷二氢查耳酮(NDHC)、甜茶苷、罗汉果苷IV、赛门苷I、罗汉果苷V、莫纳甜(monatin)、索马甜(thaumatin)、应乐果甜蛋白、甜味蛋白、L-丙氨酸、甘氨酸、罗汉果、hernandulcin、叶甜素、三叶苷(trilobtain)及其组合。

在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，口服消费产品进一步包含例如选自以下的至少一种添加剂：碳水化合物、多元醇、氨基酸或其盐、聚氨基酸或其盐、糖酸或其盐、核苷酸、有机酸、无机酸、有机盐、有机酸盐、有机碱盐、无机盐、苦味化合物、食用香料、调味成分、收敛剂化合物、蛋白质、蛋白质水解物、表面活性剂、乳化剂、类黄酮、醇、聚合物及其组合。

在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，消费产品选自食物产品、营养制品、药物、膳食补充剂、牙科卫生组合物、可食用凝胶组合物、化妆品和桌面调味剂。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，饮料产品选自碳酸饮料产品和非碳酸饮料产品。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，饮料产品选自软饮料、喷泉饮料(fountain beverage)、冷冻饮料；即饮饮料；冷冻即饮饮料、咖啡、茶、乳饮料、粉末状软饮料、浓缩液、调味水、强化水、果汁、果汁调味饮料、运动饮料和能量饮料。

本文提供的任何一种莱鲍迪甙或组合物可以用于镇痛剂、害虫驱避剂、食物或膳食补充剂中。本文还提供了任何一种这样的组合物。本文提供的任何一种组合物可以是气溶胶、液体、凝胶或颗粒形式。

在本文提供的任何一种方法或组合物中，细胞系统选自细菌、酵母及其组合，或任何细胞系统，其允许用所选基因进行的遗传转化、以及其后所需甜菊醇糖苷的生物合成生产。在本文提供的任何一种方法或组合物中，细胞系统是微生物系统，例如大肠杆菌(E. coli)。

在一个方面，提供了通过本文提供的任何一种方法产生的莱鲍迪甙或其组合物。

虽然本公开内容易受各种修改和替代形式影响，但其具体实施方案在附图中以示例的方式显示并且将在本文中详细描述。然而，应当理解，本文呈现的附图和详细描述并不预期将本公开内容限制于所公开的特定实施方案，而是相反，其意图是涵盖落入如由所附权利要求限定的本公开内容的精神和范围内的所有修改、等价物和替代物。

本发明的其它特征和优点将在参考附图的本发明的优选实施方案的下述详细描述中变得显而易见。

附图说明

附图并不预期是按比例绘制的。在附图中，在各个图中示出的每个等同或几乎等同的部件由类似的数字表示。为清楚起见，并非每一个部件都可能在每个附图中进行标记。在附图中：

图1. R6-1、R7-2、R6-4A和R6-4B的生物合成途径。

图2. R6-2和R7-2的生物合成途径。

图3. 从Reb D3产生R6-2和R7-2的UGT76G1催化反应。小图A显示莱鲍迪甙D3(“D3”)标准品的HPLC保留时间。小图B-D显示了通过UGT76G1在2小时(小图B)、4小时(小图C)和19小时(小图D)酶促产生的R6-2和R7-2。

图4. 所产生的R6-2化合物的LC MS分析。

图5. 所产生的R7-2化合物的LC MS分析。

图6. R7-2的结构。

图7A和7B. R6-2A(图7A)和R6-2B(图7B)的结构。

图8. R7-2的关键TOCSY和HMBC相关性。

图9. R6-1化合物的生物合成途径。

图10. 从Reb D产生R6-1的HV1催化反应。小图A显示了莱鲍迪甙D(“Reb D”)标准品的HPLC保留时间。小图B和C显示了通过HV1在6小时(小图B)和24小时(小图C)酶促产生的R6-1。

图11. 所产生的R6-1化合物的LC MS分析。

图12. R6-1的结构。

图13. R6-1的关键TOCSY和HMBC相关性。

图14. R6-4A和R6-4B化合物的生物合成途径。

图15. 从Reb Z产生R6-4的HV1催化反应。小图A显示了莱鲍迪甙Z(“Z”)标准品的HPLC保留时间。R6-4通过HV1在3小时(小图B)和24小时(小图C)酶促产生。

图16. 所产生的R6-4化合物的LC MS分析。

图17. R6-4A和R6-4B的结构。

定义

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与由本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。尽管与本文中描述的那些相似或等价的任何方法和材料都可用于本公开内容的实践或测试中，但下文描述了优选的材料和方法。

术语“互补的”根据其如由本领域普通技术人员理解的普通和习惯含义使用，并且非限制地用于描述能够彼此杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，就DNA而言，腺苷与胸腺嘧啶互补，而胞嘧啶与鸟嘌呤互补。相应地，主题技术还包括分离的核酸片段，其与伴随序列表中报告的完整序列以及那些基本上相似的核酸序列互补。

术语“核酸”和“核苷酸”根据其如由本领域普通技术人员理解的分别的普通和习惯含义使用，并且非限制地用于指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其以单链或双链形式的聚合物。除非特别限制，否则该术语包括含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有与参考核酸相似的结合性质，并且以与天然存在的核苷酸相似的方式代谢。除非另有说明，否则特定的核酸序列还隐含地包括其保守修饰或简并变体(例如简并密码子取代)和互补序列、以及明确指示的序列。

术语“分离的”根据其如由本领域普通技术人员理解的普通和习惯含义使用，并且当在分离的核酸或分离的多肽的上下文中使用时，非限制地用于指通过人为与其天然环境分开存在并且因此并非天然产物的核酸或多肽。分离的核酸或多肽可以以纯化的形式存在，或可以存在于非天然环境例如转基因宿主细胞中。

如本文使用的，术语“温育(incubating)”和“温育(incubation)”指混合两种或更多种化学实体或生物实体(例如化学化合物和酶)，并且允许其在有利于产生甜菊醇糖苷组合物的条件下相互作用的过程。

术语“简并变体”指具有残基序列的核酸序列，其通过一个或多个简并密码子取代而不同于参考核酸序列。简并密码子取代可以通过生成序列来实现，在所述序列中，一个或多个所选(或所有)密码子的第三个位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代。核酸序列及其所有简并变体将表达相同的氨基酸或多肽。

术语“多肽”、“蛋白质”和“肽”根据其如由本领域普通技术人员理解的分别的普通和习惯含义使用；这三个术语有时可互换使用，非限制地用于指氨基酸或氨基酸类似物的聚合物，无论其大小或功能如何。尽管“蛋白质”经常用于指相对大的多肽，而“肽”经常用于指小的多肽，但这些术语在本领域中的使用重叠且变化。除非另有说明，否则如本文使用的术语“多肽”指肽、多肽和蛋白质。当提及多核苷酸产物时，术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”在本文中可互换使用。因此，示例性多肽包括多核苷酸产物、天然存在的蛋白质、同源物、直向同源物、旁系同源物、片段以及前述的其它等价物、变体和类似物。

当用于指参考多肽时，术语“多肽片段”和“片段”根据其对本领域普通技术人员的普通和习惯含义使用，非限制地用于指这样的多肽，其中与参考多肽本身相比，氨基酸残基被缺失，但其中剩余的氨基酸序列通常与参考多肽中的相应位置等同。这种缺失可以在参考多肽的氨基末端或羧基末端、或者可替代地两者处发生。

术语多肽或蛋白质的“功能片段”指这样的肽片段，其为全长多肽或蛋白质的一部分，并且具有与全长多肽或蛋白质基本上相同的生物活性，或者执行与全长多肽或蛋白质基本上相同的功能(例如，进行相同的酶促反应)。

可互换使用的术语“变体多肽”、“修饰的氨基酸序列”或“修饰的多肽”指这样的氨基酸序列，其例如通过一个或多个氨基酸取代、缺失和/或添加，与参考多肽相差一个或多个氨基酸。在一个方面，变体是“功能变体”，其保留了参考多肽的一些或全部能力。

术语“功能变体”进一步包括保守取代的变体。术语“保守取代的变体”指具有这样的氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列通过一个或多个保守氨基酸取代而不同于参考肽，并且维持参考肽的一些或全部活性。“保守氨基酸取代”是用功能上相似的残基取代氨基酸残基。保守取代的实例包括用一个非极性(疏水)残基如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸取代另一个；用一个荷电或极性(亲水)残基取代另一个，例如在精氨酸和赖氨酸之间、在谷氨酰胺和天冬酰胺之间、在苏氨酸和丝氨酸之间；用一个碱性残基如赖氨酸或精氨酸取代另一个；或者用一个酸性残基如天冬氨酸或谷氨酸取代另一个；或者用一个芳香族残基如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸取代另一个。预计此类取代对蛋白质或多肽的表观分子量或等电点具有很小的作用或没有作用。短语“保守取代的变体”还包括其中残基被化学衍生的残基替换的肽，条件是所得到的肽维持如本文所述的参考肽的一些或全部活性。

与主题技术的多肽结合的术语“变体”进一步包括功能上活性的多肽，其具有的氨基酸序列与参考多肽的氨基酸序列具有至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%且甚至100%同一性。

以其所有语法形式和拼写变化的术语“同源的”指具有“共同进化起源”的多核苷酸或多肽之间的关系，包括来自超家族的多核苷酸或多肽、以及来自不同物种的同源多核苷酸或蛋白质(Reeck等人，Cell 50:667，1987)。这种多核苷酸或多肽具有如通过其序列相似性反映的序列同源性，无论是依据同一性百分比还是在保守位置处特定氨基酸或基序的存在。例如，两个同源多肽可以具有至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%且甚至100%同一的氨基酸序列。

关于主题技术的变体多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(%)”，指在比对序列以及在需要时引入缺口以实现最大的序列同一性百分比后，候选序列中与参考多肽的氨基酸残基等同的氨基酸残基百分比。

可以以在本领域的技术内的各种方式来实现用于确定氨基酸序列同一性百分比目的的比对，例如，使用可公开获得的计算机软件，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括在待比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。例如，可以使用序列比较程序NCBI-BLAST2来确定%氨基酸序列同一性。NCBI-BLAST2序列比较程序可以从ncbi.nlm.nih.gov下载。NCBI BLAST2使用几个搜索参数，其中所有这些搜索参数都设定为缺省值，包括例如无屏蔽=是、链=全部、预计出现次数10、最小低复杂度长度=15/5、多次通过(multi-pass) e值=0.01、多次通过常数=25，关于最终的缺口比对的下降=25和评分矩阵= BLOSUM62。在其中采用NCBI-BLAST2用于氨基酸序列比较的情形下，给定氨基酸序列A与、对于或针对给定氨基酸序列B的%氨基酸序列同一性(其可以可替代地表述为与、对于或针对给定的氨基酸序列B具有或包含某一%氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下进行计算：100×分数X/Y，其中X是通过序列比对程序NCBI-BLAST2，在该程序的A和B的比对中，评分为等同匹配的氨基酸残基数目，而其中Y是B中的氨基酸残基的总数。将了解，当氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A与B的%氨基酸序列同一性将不等于B与A的%氨基酸序列同一性。

在这个意义上，用于确定氨基酸序列“相似性”的技术是本领域众所周知的。一般而言，“相似性”指两个或更多个多肽在适当位置处的确切氨基酸与氨基酸比较，其中氨基酸是等同的或具有相似的化学性质和/或物理性质，例如电荷或疏水性。然后可以确定所比较的多肽序列之间所谓的“相似性百分比”。用于确定核酸和氨基酸序列同一性的技术也是本领域众所周知的，并且包括确定该基因的mRNA的核苷酸序列(通常经由cDNA中间体)和确定其中编码的氨基酸序列，并且将其与第二个氨基酸序列进行比较。一般而言，“同一性”分别指两个多核苷酸序列或多肽序列的确切核苷酸与核苷酸或氨基酸与氨基酸的对应关系。两个或更多个多核苷酸序列可以通过确定其“同一性百分比”来比较，两个或更多个氨基酸序列亦可以这样进行。Wisconsin Sequence Analysis Package，版本8(可得自GeneticsComputer Group，Madison，Wis.)中可获得的程序，例如GAP程序，能够分别计算两个多核苷酸之间的同一性以及两个多肽序列之间的同一性和相似性。用于计算序列之间的同一性或相似性的其它程序是本领域技术人员已知的。

“对应于”参考位置的氨基酸位置指与参考序列比对的位置，如通过比对氨基酸序列所鉴定的。这种比对可以手动完成，或通过使用众所周知的序列比对程序如ClustalW2、Blast 2等来完成。

除非另有说明，否则两个多肽序列或多核苷酸序列的同一性百分比，指跨越两个序列中较短的整个长度的等同氨基酸残基或核苷酸的百分比。

“编码序列”根据其如由本领域普通技术人员理解的普通和习惯含义使用，非限制地用于指编码特定氨基酸序列的DNA序列。

“合适的调控序列”根据其如由本领域普通技术人员理解的普通和习惯含义使用，非限制地用于指这样的核苷酸序列，其位于编码序列的上游(5'非编码序列)、其内或下游(3'非编码序列)，并且影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译。调控序列可以包括启动子、翻译前导序列、内含子和多聚腺苷酸化识别序列。

“启动子”根据其如由本领域普通技术人员理解的普通和习惯含义使用，非限制地用于指能够控制编码序列或功能RNA的表达的DNA序列。一般而言，编码序列定位于启动子序列的3'。启动子可以其整体衍生自天然基因，或者由衍生自自然界中发现的不同启动子的不同元件组成，或者甚至包含合成的DNA区段。本领域技术人员理解，不同的启动子可以指导基因在不同细胞类型中、或在不同发育阶段下、或响应不同环境条件的表达。促使基因在大多数时间下在大多数细胞类型中表达的启动子通常被称为“组成型启动子”。进一步认识到，由于在大多数情况下，调控序列的确切边界尚未完全限定，因此不同长度的DNA片段可能具有等同的启动子活性。

术语“可操作地连接”指核酸序列在单个核酸片段上的缔合，使得一者的功能受到另一者的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达(即，编码序列处于启动子的转录控制下)时，启动子与该编码序列可操作地连接。编码序列可以以有义取向或反义取向与调控序列可操作地连接。

如本文使用的，术语“表达”根据其如由本领域普通技术人员理解的普通和习惯含义使用，非限制地用于指衍生自主题技术的核酸片段的有义(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积累。“过表达”指在转基因生物或重组生物中产生的基因产物超过正常生物或非转化生物中的生产水平。

“转化”根据其如由本领域普通技术人员理解的普通和习惯含义使用，非限制地用于指将多核苷酸转移到靶细胞内。所转移的多核苷酸可以整合到靶细胞的基因组或染色体DNA内，导致遗传上稳定的继承，或者它可以不依赖于宿主染色体而复制。含有所转化的核酸片段的宿主生物被称为“转基因”或“重组”或“转化”生物。

当在本文中与宿主细胞结合使用时，术语“转化的”、“转基因的”和“重组的”，根据其如由本领域普通技术人员理解的普通和习惯含义使用，非限制地用于指异源核酸分子已引入其内的宿主生物的细胞，例如植物或微生物细胞。核酸分子可以稳定地整合到宿主细胞的基因组内，或者核酸分子可以作为染色体外分子存在。这种染色体外分子可以是自我复制的。转化的细胞、组织或受试者被理解为不仅包括转化过程的最终产物，而且还包括其转基因后代。

当在本文中与多核苷酸结合使用时，术语“重组的”、“异源的”和“外源的”根据其如由本领域普通技术人员理解的普通和习惯含义使用，非限制地用于指以下多核苷酸(例如，DNA序列或基因)，其源于对于特定宿主细胞外来的来源，或者如果来自相同的来源，则从其原始形式进行修饰。因此，宿主细胞中的异源基因包括对于特定宿主细胞是内源的，但已通过例如使用定点诱变或其它重组技术进行修饰的基因。该术语还包括天然存在的DNA序列的非天然存在的多重拷贝。因此，该术语指对于细胞是外来的或异源的，或与细胞同源但在宿主细胞内通常未发现该元件的位置或形式的DNA区段。

类似地，当在本文中与多肽序列或氨基酸序列结合使用时，术语“重组的”、“异源的”和“外源的”意指以下多肽或氨基酸序列，其源于对于特定宿主细胞外来的来源，或者如果来自相同的来源，则从其原始形式进行修饰。因此，重组DNA区段可以在宿主细胞中表达，以产生重组多肽。

术语“质粒”、“载体”和“盒”根据其如由本领域普通技术人员理解的普通和习惯含义使用，非限制地用于指额外的染色体元件，其经常携带并非细胞的中心代谢的部分的基因，且通常以环状双链DNA分子的形式。这种元件可以是衍生自任何来源的、单链或双链DNA或RNA的线性或环状的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列，其中许多核苷酸序列已被连接或重组到独特的构造内，所述构造能够将启动子片段和所选择的基因产物的DNA序列连同适当的3'非翻译序列一起引入细胞内。“转化盒”指含有外来基因并且具有除外来基因之外的元件的特定载体，所述元件促进特定宿主细胞的转化。“表达盒”指含有外来基因并且具有除外来基因之外的元件的特定载体，所述元件允许该基因在外来宿主中的增强表达。

本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域众所周知的，并且例如由以下进行描述：Sambrook，J.，Fritsch，E. F.和Maniatis，T. Molecular Cloning: ALaboratory Manual，第2版；Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor，N.Y.，1989(下文“Maniatis”)；以及Silhavy，T. J.，Bennan，M. L.和Enquist，L. W.Experiments with Gene Fusions；Cold Spring Harbor Laboratory: Cold SpringHarbor，N.Y.，1984；以及Ausubel，F. M.等人，载于Current Protocols in MolecularBiology，通过Greene Publishing and Wiley-Interscience出版，1987；所述参考文献各自整体在此通过引用并入本文至它们与此一致的程度。

如本文使用的，“合成的”或“有机合成的”或“化学合成的”或“有机合成(organically synthesizing)”或“化学合成(chemically synthesizing)”或“有机合成(organic synthesis)”或“化学合成(chemical synthesis)”，用于指通过一系列化学反应制备化合物；这并不包括例如从天然来源中提取化合物。

如本文使用的术语“口服消费产品”指与人或动物的口接触的任何饮料、食物产品、膳食补充剂、营养制品、药物组合物、牙科卫生组合物和化妆品，包括被放入口内并随后从口中吐出的物质，以及被喝下、吃下、吞下或以其它方式摄入的物质；并且当以一般可接受的浓度范围使用时，对于人或动物消费是安全的物质。

如本文使用的，术语“食物产品”指水果，蔬菜，果汁，肉制品例如火腿、培根和香肠；蛋制品，水果浓缩物，明胶和明胶样制品例如果酱、果冻、蜜饯等等；乳制品例如冰淇淋、酸奶油、酸奶和果子露；糖霜、糖浆包括糖蜜；玉米、小麦、黑麦、大豆、燕麦、大米和大麦制品、谷物制品、果仁和坚果制品、蛋糕、饼干、糖果点心例如糖果、橡皮糖(gum)、水果味滴剂和巧克力、口香糖、薄荷糖、奶油、糖霜、冰淇淋、馅饼和面包。“食物产品”还指调味品例如草药、香料和调味料，风味增强剂例如味精。“食物产品”进一步指还包括制备的包装产品，例如饮食甜味剂、液体甜味剂、桌面调味剂、用水重构后提供非碳酸饮料的颗粒状调料混合物、速溶布丁混合物、速溶咖啡和茶、咖啡增白剂、麦乳精混合物、宠物食物、牲畜饲料、烟草和用于烘焙应用的材料，例如用于制备面包、饼干、蛋糕、煎饼、甜甜圈等等的粉末状烘焙混合物。“食物产品”还指含有很少的蔗糖或不含蔗糖的饮食或低热量食物和饮料。

如本文使用的，术语“立体异构体”是关于各个分子的所有异构体的通用术语，所述分子仅在其原子在空间中的取向上不同。“立体异构体”包括对映异构体，以及并非彼此的镜像、具有多于一个手性中心的化合物的异构体(非对映异构体)。

如本文使用的，术语“甜味强度”指如通过个体例如人观察到或体会到的甜味感觉的相对强度，或者通过品尝者例如在白利糖度(Brix)量表上检测到的甜味的程度或量。

如本文使用的，术语“增强甜味”指与不含本公开内容的莱鲍迪甙的相应口服消费产品相比，莱鲍迪甙在增加、加强、强化、强调、放大和/或增效本公开内容的饮料产品或消费产品的一种或多种甜味特征的感官知觉，而不改变其性质或质量方面的效应。

如本文使用的，术语“异味”指在本公开内容的饮料产品或消费产品中并非特征性地或通常没有发现的味道的量或程度。例如，异味是甜味消费品对消费者所不期望的味道，例如苦味、甘草样味道、金属味、厌恶味、涩味、延迟的甜味发作、逗留的甜味余味等等。

如本文使用的，术语“w/v-%”指对于每100 ml含有这种化合物的本公开内容的液体口服消费产品，化合物例如糖的重量(以克计)。如本文使用的，术语“w/w-%”指对于每克含有这种化合物的本公开内容的口服消费产品，化合物例如糖的重量(以克计)。

如本文使用的，术语“ppm”指按重量计的百万分率，例如化合物如本公开内容的莱鲍迪甙的重量(以毫克计)/千克含有这种化合物的本公开内容的口服消费产品(即，mg/kg)，或化合物如本公开内容的莱鲍迪甙的重量(以毫克计)/升含有这种化合物的本公开内容的口服消费产品(即，mg/L)；或按体积计的百万分率，例如化合物如本公开内容的莱鲍迪甙的体积(以毫升计)/升含有这种化合物的本公开内容的口服消费产品(即，ml/L)。

甜菊醇糖苷是负责南美植物甜叶菊(菊科(Asteraceae))叶的甜味的一类化学化合物，并且可以单独，与彼此组合或与其它甜味剂和味道修饰剂组合用作食物、饲料和饮料中的甜味剂。

细胞系统是提供异位蛋白质的表达的任何细胞。它包括细菌、酵母、植物细胞和动物细胞。它包括原核细胞和真核细胞两者。它还包括基于细胞组分如核糖体的蛋白质的体外表达。

使细胞系统生长。生长包括提供适当的培养基，其允许细胞繁殖且分裂。它还包括提供资源，使得细胞或细胞组分可以翻译且制备重组蛋白质。

蛋白质表达。蛋白质生产可以在基因表达后发生。它由DNA已转录为信使RNA(mRNA)后的阶段组成。然后将mRNA翻译成多肽链，其最终折叠成蛋白质。DNA通过转染存在于细胞中，所述转染是将核酸有意引入细胞内的过程。该术语经常用于真核细胞中的非病毒方法。它也可能指其它方法和细胞类型，尽管其它术语是优选的：“转化”更经常用于描述细菌、非动物真核细胞包括植物细胞中的非病毒DNA转移。在动物细胞中，转染是优选术语，因为转化也用于指这些细胞中向癌变状态(癌发生)的进展。转导经常用于描述病毒介导的DNA转移。在用于本申请的转染的定义下包括转化、转导和病毒感染。

如本文使用的，单数形式“一个、一种”和“该/所述”包括复数所指物，除非内容另有明确说明。

就术语“包括”、“具有”等等在说明书或权利要求中使用的程度而言，这种术语预期以类似于术语“包含”的方式是包含性的，如“包含”当在权利要求中用作过渡词时被解释的。

词语“示例性”在本文中用于意指“充当实例、例证或说明”。在本文中描述为“示例性”的任何实施方案不一定被解释为相对于其它实施方案优选或有利的。

具体实施方式

本发明至少部分地涉及新型甜菊醇糖苷R7-2、R6-2A、R6-2B、R6-1、R6-4A和R6-4B，以及例如通过酶促转化生产这些新型甜菊醇糖苷的方法。化学结构可以通过LC MS和NMR分析进行确认。R6-1、R6-2A、R6-62B、R6-4A和R6-4B含有6个葡萄糖基，而R7-2含有7个葡萄糖基。

前体合成

如先前陈述的，甜菊醇糖苷是负责南美植物甜叶菊(菊科)和植物覆盆子(Rubus chingii)(蔷薇科(Rosaceae))叶的甜味的化学化合物。这些化合物是糖基化的二萜。具体而言，它们的分子可以被视为甜菊醇分子，其羟基氢原子被葡萄糖分子替换，以形成酯，并且羟基氢由葡萄糖和鼠李糖的组合替换，以形成缩醛。

制备本发明中感兴趣的化合物的一种方法是采用例如化学衍生的或经由改造的微生物如细菌和/或酵母中的生物合成产生的常见或廉价的前体，例如甜菊醇、甜菊糖苷、Reb E、Reb D或甜茶苷，并且例如通过已知或廉价的方法合成靶甜菊醇糖苷例如Reb D3和Z。

本发明的方面涉及在能够产生甜菊醇的微生物系统中重组表达酶的方法。一般而言，这种酶可以包括：柯巴基焦磷酸合酶(copalyl diphosphate synthase)(CPS)、贝壳杉烯合酶(KS)和牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶(GGPPS)酶。优选地，在一些实施方案中，这在微生物菌株中发生，所述微生物菌株表达内源性类异戊二烯合成途径，例如非甲羟戊酸(MEP)途径或甲羟戊酸途径(MVA)。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，细胞是细菌细胞例如大肠杆菌，或酵母细胞例如酵母属(Saccharomyces)细胞、毕赤酵母属(Pichia)细胞或耶氏酵母属(Yarrowia)细胞。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，细胞是藻类细胞或植物细胞。

此后，前体可以从发酵培养物中回收并且用于化学合成中。通常，这是甜菊醇，尽管它可以是贝壳杉烯或来自细胞培养物的甜菊醇糖苷。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，从气相中回收甜菊醇、贝壳杉烯和/或甜菊醇糖苷，而在其它实施方案中，将有机层或聚合树脂加入细胞培养物中，并且从有机层或聚合物树脂中回收贝壳杉烯、甜菊醇和/或甜菊醇糖苷。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，甜菊醇糖苷选自莱鲍迪甙A、莱鲍迪甙B、莱鲍迪甙C、莱鲍迪甙E、莱鲍迪甙F或杜克甙A。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，所生产的萜类化合物为甜菊醇双糖苷或甜菊糖苷。还应当理解，在一些实施方案中，至少一个酶促步骤，例如一个或多个糖基化步骤，是离体执行的。

如本文所述，本文所述方法中使用的酶具有UDP-糖基转移酶活性，并且可用于开发用于制备甜菊醇糖苷的生物合成方法，所述甜菊醇糖苷或是自然界中不存在的或通常在天然来源中具有低丰度，例如分别为莱鲍迪甙R6-1、R2-2A、R6-2B、R6-4A、R6-4B和R7-2。

底物可以是能够在由一种或多种UDP-葡萄糖基转移酶催化的反应中，被转化成甜菊醇糖苷化合物的任何天然化合物或合成化合物。例如，底物可以是天然甜菊提取物、甜菊醇、甜菊醇-13-O-葡萄糖苷、甜菊醇-19-O-葡萄糖苷、2-双糖苷、甜茶苷、甜菊糖苷、莱鲍迪甙A、莱鲍迪甙D、莱鲍迪甙D3、莱鲍迪甙Z1、莱鲍迪甙Z2或莱鲍迪甙E。底物可以是纯化合物或不同化合物的混合物。

本文还描述的是偶联反应系统，其中本文描述的酶(例如UDP转移酶)可以与一种或多种另外的酶(例如蔗糖合酶)组合发挥功能，以改善效率或修饰甜菊醇糖苷化合物的总体生物合成的结果。例如，另外的酶可以通过将由糖基化反应产生的UDP转化回UDP-葡萄糖(例如使用蔗糖作为葡萄糖残基的供体)，来再生对于糖基化反应所需的UDP-葡萄糖，因此改善糖基化反应的效率。

蔗糖合酶催化UDP-葡萄糖和D-果糖之间的化学反应，以产生UDP和蔗糖。蔗糖合酶是一种糖基转移酶。这个酶类别的系统名称是UDP-葡萄糖:D-果糖2-α-D-葡萄糖基转移酶。其它常用名称包括UDP葡萄糖-果糖葡萄糖基转移酶、蔗糖合成酶、蔗糖-UDP葡萄糖基转移酶、蔗糖-尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶和尿苷二磷酸葡萄糖-果糖葡萄糖基转移酶。将蔗糖合酶加入包括尿苷二磷酸糖基转移酶的反应混合物中，产生“UGT-SUS偶联系统”。在UGT-SUS偶联系统中，UDP-葡萄糖可以由UDP和蔗糖再生，这允许省略向反应混合物中添加额外的UDP-葡萄糖或在反应混合物中使用UDP。

用于本文所述方法中的合适的蔗糖合酶包括拟南芥属蔗糖合酶I、拟南芥属蔗糖合酶3和绿豆蔗糖合酶。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，蔗糖合酶或蔗糖合酶结构域是拟南芥蔗糖合酶I。

合适的UDP-糖基转移酶包括本领域已知的任何UGT，其能够催化甜菊醇糖苷化合物的生物合成中的一个或多个反应，例如UGT85C2、UGT74G1、HV1、UGT76G1或其功能同源物。在一些实施方案中，在本文所述的任何一种方法中使用的UDP-糖转移酶(glycotransferase)是UGT76G1。在一些实施方案中，在本文所述的任何一种方法中使用的UDP-糖转移酶是UGT76G1-蔗糖合酶融合酶。在一些实施方案中，在本文所述的任何一种方法中使用的UDP-糖转移酶是HV1 UTG。在一些实施方案中，在本文所述的任何一种方法中使用的UDP-糖转移酶是HV1 UGT-蔗糖合酶融合酶。

此处使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域众所周知的，并且例如由以下进行描述：Sambrook，J.，Fritsch，E. F.和Maniatis，T. Molecular Cloning: ALaboratory Manual，第2版；Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor，N.Y.，1989(下文“Maniatis”)；以及Silhavy，T. J.，Bennan，M. L.和Enquist，L. W.Experiments with Gene Fusions；Cold Spring Harbor Laboratory: Cold SpringHarbor，N.Y.，1984；以及Ausubel，F. M.等人，载于Current Protocols in MolecularBiology，通过Greene Publishing and Wiley-Interscience出版，1987；(所述参考文献各自整体在此通过引用并入本文)。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与由本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。尽管与本文中描述的那些相似或等价的任何方法和材料都可以用于本公开内容的实践或测试中，但本文描述了优选的材料和方法。

本公开内容在考虑下述非限制性实施例后将得到更充分地理解。应当理解，这些实施例虽然指示了主题技术的优选实施方案，但仅作为说明而给出。根据上文论述和这些实施例，本领域技术人员可以确定主题技术的基本特征，并且在不脱离其精神和范围的情况下，可以进行主题技术的各种变化和修改，以使其适应各种用途和条件。

糖基化经常被视为控制植物天然产物的生物活性和贮存的普遍存在的反应。小分子的糖基化通过迄今为止已研究的大多数植物物种中的转移酶超家族进行催化。这些糖基转移酶(GT)已分类为超过60个家族。其中，家族1 GT酶，也称为UDP糖基转移酶(UGT)和UDP-鼠李糖基转移酶，将糖部分转移到特定的受体分子。这些是这样的分子，其在甜菊醇糖苷中转移这种糖部分，以帮助产生各种莱鲍迪甙。这些酶各自具有其自身的活性特性，以及它们在其中转移其活化糖部分的优选结构位置。

合成莱鲍迪甙R6-2A和R6-2B及生产方法

本公开内容的一些方面提供了已给予名称“莱鲍迪甙R6-2A(Reb R6-2A)”的甜味剂(例如，无热量和/或合成的)。莱鲍迪甙R6-2A具有C₅₆H₉₀O₃₃的分子式且具有以下的结构：

本公开内容的一些方面提供了已给予名称“莱鲍迪甙R6-2B(Reb R6-2B)”的甜味剂(例如，无热量和/或合成的)。莱鲍迪甙R6-2B具有C₅₆H₉₀O₃₃的分子式且具有以下的结构：

本公开内容的一些方面提供了生产莱鲍迪甙R6-2A和/或莱鲍迪甙R6-2B的方法。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，莱鲍迪甙R6-2A和/或莱鲍迪甙R6-2B由莱鲍迪甙D3产生。例如，在一些实施方案中，该方法包括(I)制备包含以下的反应混合物：(i)莱鲍迪甙D3；(ii)选自蔗糖、尿苷二磷酸(UDP)、尿苷二磷酸-葡萄糖(UDP-葡萄糖)及其组合的一种或多种底物；以及(iii)选自以下的酶：(a)UDP-糖基转移酶(UGT)；(b)分开加入反应混合物中的UDP-糖基转移酶和蔗糖合酶；和(c)UDP-糖基转移酶融合酶，其包含与蔗糖合酶结构域偶联的UDP-糖基转移酶结构域；并且(II)使反应混合物温育足够的时间，以产生莱鲍迪甙R6-2A和/或R6-2B。

在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，葡萄糖通过酶与莱鲍迪甙D3共价偶联，以产生莱鲍迪甙R6-2A和/或R6-2B。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，葡萄糖通过酶与莱鲍迪甙D3的糖I共价偶联，以产生莱鲍迪甙R6-2A。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，葡萄糖通过酶与莱鲍迪甙D3的糖II共价偶联，以产生莱鲍迪甙R6-2B。图2示出了莱鲍迪甙D3、R6-2A和R6-2B中的糖编号。

在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，用于从莱鲍迪甙D3产生莱鲍迪甙R6-2A和/或R6-2B的酶包含UDP-糖基转移酶(UGT)。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，UGT是尿苷二磷酸糖基转移酶(例如，UGT76G1或其功能变体)。UGT76G1是具有1,3-13-O-葡萄糖糖基化活性的UGT。还已显示了UGT76G1具有1,3-19-O-葡萄糖糖基化活性。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，UGT76G1与SEQID NO: 1的氨基酸序列具有至少70%(例如，至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)同一性。在一些实施方案中，UGT76G1与SEQ ID NO: 1的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性。在一些实施方案中，UGT76G1包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列。在一些实施方案中，UGT76G1基本上由SEQ ID NO: 1的氨基酸序列组成、或由SEQ ID NO: 1的氨基酸序列组成。

在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，用于从莱鲍迪甙D3产生莱鲍迪甙R6-2A和/或R6-2B的酶包含分开加入反应混合物中的UDP-糖基转移酶(UGT)和蔗糖合酶。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，UGT是UGT76G1以及如本文所述的变体，并且蔗糖合酶选自拟南芥属蔗糖合酶I、拟南芥属蔗糖合酶3和绿豆蔗糖合酶。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，蔗糖合酶或蔗糖合酶结构域是拟南芥蔗糖合酶I。在一些实施方案中，拟南芥蔗糖合酶I与SEQ ID NO: 9的氨基酸序列具有至少70%(例如，至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)同一性。在一些实施方案中，拟南芥蔗糖合酶I与SEQ ID NO: 9的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，拟南芥蔗糖合酶I包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，拟南芥蔗糖合酶I基本上由SEQ ID NO: 9的氨基酸序列组成、或由SEQ ID NO: 9的氨基酸序列组成。

在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，用于从莱鲍迪甙D3产生莱鲍迪甙R6-2A和/或R6-2B的酶包含UDP-糖基转移酶融合酶，其包含与蔗糖合酶结构域偶联的UDP-糖基转移酶结构域。融合酶具有UDP-糖基转移酶的活性和蔗糖合酶活性。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，融合酶中的UDP-糖基转移酶结构域是UGT76G1以及如本文所述的变体中的任何一种，并且蔗糖合酶结构域是蔗糖合酶(例如，拟南芥属蔗糖合酶I、拟南芥属蔗糖合酶3或绿豆蔗糖合酶)以及如本文所述的变体中的任何一种。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，融合酶与SEQ ID NO: 5的氨基酸序列具有至少70%(例如，至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)同一性。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，融合酶与SEQ ID NO: 5的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，融合酶包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，融合酶基本上由SEQ ID NO: 5的氨基酸序列组成、或由SEQ IDNO: 5的氨基酸序列组成。

在一些实施方案中，本文所述的任何一种产生莱鲍迪甙R6-2A和/或R6-2B的方法进一步包括产生莱鲍迪甙D3的步骤。在本文提供的任何一种方法的一些实施方案中，可以通过使莱鲍迪甙E与UDP-糖转移酶以及选自蔗糖、UDP、UDP-葡萄糖及其组合的底物一起温育，来产生莱鲍迪甙D3。在本文提供的任何一种方法的一些实施方案中，用于从莱鲍迪甙E产生莱鲍迪甙D3的UDP-糖基转移酶是EUGT11。从莱鲍迪甙E产生莱鲍迪甙D3的方法在美国专利号US9765104中进行描述，并且此类方法通过引用并入本文。莱鲍迪甙D3具有以下的结构：

在一些实施方案中，本文所述的任何一种产生莱鲍迪甙R6-2A和/或R6-2B的方法进一步包括分离所产生的莱鲍迪甙R6-2A和/或R6-2B。

合成莱鲍迪甙R7-2及生产方法

本公开内容的一些方面提供了已给予名称“莱鲍迪甙R7-2(Reb R7-2)”的甜味剂(例如，无热量和/或合成的)。Reb R7-2化合物是甜菊醇糖苷，其具有在C-13羟基处附着的四个葡萄糖基部分，其中三个作为2,3-支链的葡萄糖三糖基(glucotriosyl)取代基以醚的形式附着；以及作为酯在C-19处的另一个2,3-支链的葡萄糖三糖基部分。

莱鲍迪甙R7-2具有C₆₂H₁₀₀O₃₈的分子式且具有以下的结构：

本公开内容的一些方面提供了生产莱鲍迪甙R7-2的方法。在所提供的任何一种方法的一些实施方案中，莱鲍迪甙R7-2由莱鲍迪甙D3、莱鲍迪甙R6-2A和莱鲍迪甙R6-2B中的一种或多种产生。用于生产莱鲍迪甙R7-2的反应混合物可以与用于生产莱鲍迪甙R6-2A和/或R6-2B的反应混合物相同。葡萄糖可以通过酶与莱鲍迪甙D3共价偶联，以产生莱鲍迪甙R6-2A和/或R6-2B。该酶可以进一步将第二个葡萄糖与莱鲍迪甙R6-2A和/或R6-2B共价偶联，产生莱鲍迪甙R7-2。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，葡萄糖通过酶与莱鲍迪甙D3的糖I和糖II各自共价偶联，以产生莱鲍迪甙R7-2。图2示出了莱鲍迪甙D3和莱鲍迪甙R7-2中的糖编号。

在所提供的任何一种方法的一些实施方案中，该方法包括(I)制备包含以下的反应混合物：(i)莱鲍迪甙D3、莱鲍迪甙R6-2A和莱鲍迪甙R6-2B中的一种或多种；(ii)选自蔗糖、尿苷二磷酸(UDP)、尿苷二磷酸-葡萄糖(UDP-葡萄糖)及其组合的一种或多种底物；以及(iii)选自以下的酶：(a)UDP-糖基转移酶(UGT)；(b)分开加入反应混合物中的UDP-糖基转移酶和蔗糖合酶；和(c)UDP-糖基转移酶融合酶，其包含与蔗糖合酶结构域偶联的UDP-糖基转移酶结构域；并且(II)使反应混合物温育足够的时间，以产生莱鲍迪甙R7-2。

在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，用于从莱鲍迪甙D3产生莱鲍迪甙R7-2的酶包含UDP-糖基转移酶(UGT)。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，UGT是尿苷二磷酸糖基转移酶(例如，UGT76G1或其功能变体)。UGT76G1是具有1,3-13-O-葡萄糖糖基化活性的UGT。还已显示了UGT76G1具有1,3-19-O-葡萄糖糖基化活性。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，UGT76G1与SEQ ID NO: 1的氨基酸序列具有至少70%(例如，至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)同一性。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，UGT76G1与SEQ ID NO: 1的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，UGT76G1包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，UGT76G1基本上由SEQ ID NO: 1的氨基酸序列组成、或由SEQ IDNO: 1的氨基酸序列组成。

在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，用于从莱鲍迪甙D3产生莱鲍迪甙R7-2的酶包含分开加入反应混合物中的UDP-糖基转移酶(UGT)和蔗糖合酶。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，UGT是UGT76G1以及如本文所述的变体，并且蔗糖合酶选自拟南芥属蔗糖合酶I、拟南芥属蔗糖合酶3和绿豆蔗糖合酶。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，蔗糖合酶或蔗糖合酶结构域是拟南芥蔗糖合酶I。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，拟南芥蔗糖合酶I与SEQID NO: 9的氨基酸序列具有至少70%(例如，至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)同一性。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，拟南芥蔗糖合酶I与SEQ IDNO: 9的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，拟南芥蔗糖合酶I包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，拟南芥蔗糖合酶I基本上由SEQID NO: 9的氨基酸序列组成、或由SEQ ID NO: 9的氨基酸序列组成。

在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，用于从莱鲍迪甙D3产生莱鲍迪甙R7-2的酶包含UDP-糖基转移酶融合酶，其包含与蔗糖合酶结构域偶联的UDP-糖基转移酶结构域。融合酶具有UDP-糖基转移酶的活性和蔗糖合酶活性。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，融合酶中的UDP-糖基转移酶结构域是UGT76G1以及如本文所述的变体中的任何一种，并且蔗糖合酶结构域是蔗糖合酶(例如，拟南芥属蔗糖合酶I、拟南芥属蔗糖合酶3或绿豆蔗糖合酶)以及如本文所述的变体中的任何一种。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，融合酶与SEQ ID NO: 5的氨基酸序列具有至少70%(例如，至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)同一性。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，融合酶与SEQ ID NO: 5的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，融合酶包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，融合酶基本上由SEQ ID NO: 5的氨基酸序列组成、或由SEQ ID NO: 5的氨基酸序列组成。

在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，本文描述的产生莱鲍迪甙R7-2的方法进一步包括产生莱鲍迪甙D3的步骤。在一些实施方案中，可以通过使莱鲍迪甙E与UDP-糖转移酶以及选自蔗糖、UDP、UDP-葡萄糖及其组合的底物一起温育，来产生莱鲍迪甙D3。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，用于从莱鲍迪甙E产生莱鲍迪甙D3的UDP-糖基转移酶是EUGT11。从莱鲍迪甙E产生莱鲍迪甙D3的方法在美国专利号US9765104中进行描述，此类方法通过引用并入本文。莱鲍迪甙D3具有以下的结构：

在一些实施方案中，本文所述的任何一种产生莱鲍迪甙R7-2的方法进一步包括分离所产生的莱鲍迪甙R7-2。

合成莱鲍迪甙R6-4A和R6-4B及生产方法

本公开内容的一些方面提供了已给予名称“莱鲍迪甙R6-4A(Reb R6-4A)”的甜味剂(例如，无热量和/或合成的)。莱鲍迪甙R6-4A具有C₅₆H₉₀O₃₃的分子式且具有以下的结构：

本公开内容的一些方面提供了已给予名称“莱鲍迪甙R6-4B(Reb R6-4B)”的甜味剂(例如，无热量和/或合成的)。莱鲍迪甙R6-4B具有C₅₆H₉₀O₃₃的分子式且具有以下的结构：

本公开内容的一些方面提供了生产莱鲍迪甙R6-4A的方法。在所提供的任何一种方法的一些实施方案中，莱鲍迪甙R6-4A由莱鲍迪甙Z1或莱鲍迪甙Z2产生。例如，在一些实施方案中，该方法包括(I)制备包含以下的反应混合物：(i)莱鲍迪甙Z1或莱鲍迪甙Z2；(ii)选自蔗糖、尿苷二磷酸(UDP)、尿苷二磷酸-葡萄糖(UDP-葡萄糖)及其组合的一种或多种底物；以及(iii)选自以下的酶：(a)UDP-糖基转移酶(UGT)；(b)分开加入反应混合物中的UDP-糖基转移酶和蔗糖合酶；和(c)UDP-糖基转移酶融合酶，其包含与蔗糖合酶结构域偶联的UDP-糖基转移酶结构域；并且(II)使反应混合物温育足够的时间，以产生莱鲍迪甙R6-4A。

在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，葡萄糖通过酶与莱鲍迪甙Z1或莱鲍迪甙Z2共价偶联，以产生莱鲍迪甙R6-4A。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，葡萄糖通过酶与莱鲍迪甙Z1的糖IV共价偶联，以产生莱鲍迪甙R6-4A。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，葡萄糖通过酶与莱鲍迪甙Z2的糖III共价偶联，以产生莱鲍迪甙R6-4A。图14示出了莱鲍迪甙Z1、Z2和R6-4A中的糖编号。

本公开内容的一些方面提供了生产莱鲍迪甙R6-4B的方法。在所提供的任何一种方法的一些实施方案中，莱鲍迪甙R6-4B由莱鲍迪甙Z2产生。例如，在一些实施方案中，该方法包括(I)制备包含以下的反应混合物：(i)莱鲍迪甙Z2；(ii)选自蔗糖、尿苷二磷酸(UDP)、尿苷二磷酸-葡萄糖(UDP-葡萄糖)及其组合的一种或多种底物；以及(iii)选自以下的酶：(a)UDP-糖基转移酶(UGT)；(b)分开加入反应混合物中的UDP-糖基转移酶和蔗糖合酶；和(c)UDP-糖基转移酶融合酶，其包含与蔗糖合酶结构域偶联的UDP-糖基转移酶结构域；并且(II)使反应混合物温育足够的时间，以产生莱鲍迪甙R6-4B。

在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，葡萄糖通过酶与莱鲍迪甙Z2共价偶联，以产生莱鲍迪甙R6-4B。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，葡萄糖通过酶与莱鲍迪甙Z2的糖V共价偶联，以产生莱鲍迪甙R6-4B。图14示出了莱鲍迪甙Z2和R6-4B中的糖编号。

在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，用于从莱鲍迪甙Z1或Z2产生莱鲍迪甙R6-4A或R6-4B的酶包含UDP-糖基转移酶(UGT)。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，UGT是HV1糖基转移酶。HV1是具有1,2-19-O-葡萄糖糖基化活性的UGT。还已显示了HV1 UGT具有1,2-19-O-葡萄糖糖基化活性。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，HV1 UGT与SEQ ID NO: 3的氨基酸序列具有至少70%(例如，至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)同一性。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，HV1 UGT与SEQ ID NO: 3的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，HV1 UGT包含SEQ ID NO: 3的氨基酸序列。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，HV1 UGT基本上由SEQ ID NO: 3的氨基酸序列组成、或由SEQ ID NO: 3的氨基酸序列组成。

在本文提供的任何一种方法的一些实施方案中，用于从莱鲍迪甙Z1或Z2产生莱鲍迪甙R6-4A和/或R6-4B的酶包含分开加入反应混合物中的UDP-糖基转移酶(UGT)和蔗糖合酶。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，UGT是HV1 UGT以及如本文所述的变体，并且蔗糖合酶选自拟南芥属蔗糖合酶I、拟南芥属蔗糖合酶3和绿豆蔗糖合酶。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，蔗糖合酶或蔗糖合酶结构域是拟南芥蔗糖合酶I。在一些实施方案中，拟南芥蔗糖合酶I与SEQ ID NO: 9的氨基酸序列具有至少70%(例如，至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)同一性。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，拟南芥蔗糖合酶I与SEQ ID NO: 9的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，拟南芥蔗糖合酶I包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，拟南芥蔗糖合酶I基本上由SEQ ID NO: 9的氨基酸序列组成、或由SEQ ID NO: 9的氨基酸序列组成。

在本文提供的任何一种方法的一些实施方案中，用于从莱鲍迪甙Z1或Z2产生莱鲍迪甙R6-4A或R6-4B的酶包含UDP-糖基转移酶融合酶，其包含与蔗糖合酶结构域偶联的UDP-糖基转移酶结构域。融合酶具有UDP-糖基转移酶的活性和蔗糖合酶活性。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，融合酶中的UDP-糖基转移酶结构域是HV1 UGT以及如本文所述的变体中的任何一种，并且蔗糖合酶结构域是蔗糖合酶(例如，拟南芥属蔗糖合酶I、拟南芥属蔗糖合酶3或绿豆蔗糖合酶)以及如本文所述的变体中的任何一种。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，融合酶与SEQ ID NO: 7的氨基酸序列具有至少70%(例如，至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)同一性。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，融合酶与SEQ ID NO: 7的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，融合酶包含SEQ ID NO: 7的氨基酸序列。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，融合酶基本上由SEQ ID NO: 7的氨基酸序列组成、或由SEQ ID NO: 7的氨基酸序列组成。

在一些实施方案中，本文所述的任何一种产生莱鲍迪甙R6-4A和/或R6-4B的方法进一步包括产生莱鲍迪甙Z1和/或Z2的步骤。在本文提供的任何一种方法的一些实施方案中，可以通过使莱鲍迪甙E与UDP-糖基转移酶以及选自蔗糖、UDP、UDP-葡萄糖及其组合的底物一起温育，来产生莱鲍迪甙Z1和/或Z2。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，用于从莱鲍迪甙E产生莱鲍迪甙Z1和/或Z2的UDP-糖基转移酶是UGT76G1。从莱鲍迪甙E产生莱鲍迪甙D3的方法在美国专利号US10081826中进行描述，此类方法通过引用并入本文。

莱鲍迪甙Z1具有以下的结构：

莱鲍迪甙Z2具有以下的结构：

在一些实施方案中，本文所述的任何一种产生莱鲍迪甙R6-4A和/或R6-4B的方法进一步包括分离所产生的莱鲍迪甙R6-4A和/或R6-4B。

合成莱鲍迪甙R6-1及生产方法

本公开内容的一些方面提供了已给予名称“莱鲍迪甙R6-1(Reb R6-1)”的甜味剂(例如，无热量和/或合成的)。莱鲍迪甙R6-1具有C₅₆H₉₀O₃₃的分子式且具有以下的结构：

本公开内容的一些方面提供了生产莱鲍迪甙R6-1的方法。在本文提供的任何一种方法的一些实施方案中，莱鲍迪甙R6-1由莱鲍迪甙D产生。例如，在一些实施方案中，该方法包括(I)制备包含以下的反应混合物：(i)莱鲍迪甙D；(ii)选自蔗糖、尿苷二磷酸(UDP)、尿苷二磷酸-葡萄糖(UDP-葡萄糖)及其组合的一种或多种底物；以及(iii)选自以下的酶：(a)UDP-糖基转移酶(UGT)；(b)分开加入反应混合物中的UDP-糖基转移酶和蔗糖合酶；和(c)UDP-糖基转移酶融合酶，其包含与蔗糖合酶结构域偶联的UDP-糖基转移酶结构域；并且(II)使反应混合物温育足够的时间，以产生莱鲍迪甙R6-1。

在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，葡萄糖通过酶与莱鲍迪甙D共价偶联，以产生莱鲍迪甙R6-1。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，葡萄糖通过酶与莱鲍迪甙D的糖V共价偶联，以产生莱鲍迪甙R6-1。图9示出了莱鲍迪甙D和R6-1中的糖编号。

在本文提供的任何一种方法的一些实施方案中，用于从莱鲍迪甙D产生莱鲍迪甙R6-1的酶包含UDP-糖基转移酶(UGT)。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，UGT是HV1糖基转移酶。HV1是具有1,2-19-O-葡萄糖糖基化活性的UGT。还已显示了HV1UGT具有1,2-19-O-葡萄糖糖基化活性。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，HV1 UGT与SEQ ID NO: 3的氨基酸序列具有至少70%(例如，至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)同一性。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，HV1UGT与SEQ ID NO: 3的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，HV1 UGT包含SEQ ID NO: 3的氨基酸序列。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，HV1 UGT基本上由SEQ IDNO: 3的氨基酸序列组成、或由SEQ ID NO: 3的氨基酸序列组成。

在本文提供的任何一种方法的一些实施方案中，用于从莱鲍迪甙D产生莱鲍迪甙R6-1的酶包含分开加入反应混合物中的UDP-糖基转移酶(UGT)和蔗糖合酶。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，UGT是HV1 UGT以及如本文所述的变体，并且蔗糖合酶选自拟南芥属蔗糖合酶I、拟南芥属蔗糖合酶3和绿豆蔗糖合酶。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，蔗糖合酶或蔗糖合酶结构域是拟南芥蔗糖合酶I。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，拟南芥蔗糖合酶I与SEQ ID NO: 9的氨基酸序列具有至少70%(例如，至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)同一性。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，拟南芥蔗糖合酶I与SEQ ID NO: 9的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，拟南芥蔗糖合酶I包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，拟南芥蔗糖合酶I基本上由SEQ ID NO: 9的氨基酸序列组成、或由SEQ ID NO: 9的氨基酸序列组成。

在本文提供的任何一种方法的一些实施方案中，用于从莱鲍迪甙D产生莱鲍迪甙R6-1的酶包含UDP-糖基转移酶融合酶，其包含与蔗糖合酶结构域偶联的UDP-糖基转移酶结构域。融合酶具有UDP-糖基转移酶的活性和蔗糖合酶活性。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，融合酶中的UDP-糖基转移酶结构域是HV1 UGT以及如本文所述的变体中的任何一种，并且蔗糖合酶结构域是蔗糖合酶(例如，拟南芥属蔗糖合酶I、拟南芥属蔗糖合酶3或绿豆蔗糖合酶)以及如本文所述的变体中的任何一种。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，融合酶与SEQ ID NO: 7的氨基酸序列具有至少70%(例如，至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)同一性。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，融合酶与SEQ ID NO: 7的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，融合酶包含SEQ ID NO: 7的氨基酸序列。在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，融合酶基本上由SEQ ID NO: 7的氨基酸序列组成、或由SEQ ID NO: 7的氨基酸序列组成。

在一些实施方案中，本文所述的任何一种产生莱鲍迪甙R6-1的方法进一步包括产生莱鲍迪甙D的步骤。在所提供的任何一种方法的一些实施方案中，可以通过使莱鲍迪甙A与UDP-糖转移酶以及选自蔗糖、UDP、UDP-葡萄糖及其组合的底物一起温育，来产生莱鲍迪甙D。在所提供的任何一种方法的一些实施方案中，用于从莱鲍迪甙A产生莱鲍迪甙D的UDP-糖基转移酶是EUGT11。从莱鲍迪甙A产生莱鲍迪甙D的方法在美国专利申请公开号US20180037600中进行描述，此类方法通过引用并入本文。

在本文提供的任何一种方法的一些实施方案中，可以通过使莱鲍迪甙E与UDP-糖转移酶以及选自蔗糖、UDP、UDP-葡萄糖及其组合的底物一起温育，来产生莱鲍迪甙D。在所提供的任何一种方法的一些实施方案中，用于从莱鲍迪甙E产生莱鲍迪甙D的UDP-糖基转移酶是HV1 UGT或UGT76G1。从莱鲍迪甙E产生莱鲍迪甙D的方法在美国专利申请公开号美国专利号10253344中进行描述，此类方法通过引用并入本文。

莱鲍迪甙D具有以下的结构：

在一些实施方案中，本文所述的任何一种产生莱鲍迪甙R6-1的方法进一步包括分离所产生的莱鲍迪甙R6-1。

反应混合物、核酸和细胞系统

在所提供的任何一种方法的一些实施方案中，反应混合物是在体外的，即，本文所述的方法在体外执行。对于体外反应，可以将分离的酶(例如，UDP-糖基转移酶、蔗糖合酶和/或UDP-糖基转移酶融合酶)加入体外反应混合物中。

在所提供的任何一种方法的一些实施方案中，反应混合物是基于细胞的反应混合物，即，反应在细胞中执行。对于基于细胞的反应，酶(例如，UDP-糖基转移酶、蔗糖合酶和/或UDP-糖基转移酶融合酶)在宿主细胞中表达。

在所提供的任何一种方法的一些实施方案中，酶(例如，UDP-糖基转移酶、蔗糖合酶和/或UDP-糖基转移酶融合酶)分别由编码其的核苷酸序列表达。因此，提供了编码本文所述的任何一种酶的核酸。本公开内容进一步提供了宿主细胞，其包含与SEQ ID NO: 2、4、6、8和10中的任何一个具有至少80%(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)同一性的核苷酸序列。在所提供的任何一种方法的一些实施方案中，宿主细胞包含与SEQ ID NO: 2具有至少80%(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)同一性的核苷酸序列，以及与SEQ ID NO: 10具有至少80%(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)同一性的核苷酸序列。在所提供的任何一种方法的一些实施方案中，宿主细胞包含与SEQ ID NO: 4具有至少80%(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)同一性的核苷酸序列，以及与SEQ IDNO: 10具有至少80%(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)同一性的核苷酸序列。

在所提供的任何一种方法的一些实施方案中，宿主细胞选自酵母、非甜菊醇糖苷生产植物、藻类、真菌和细菌。

在所提供的任何一种方法的一些实施方案中，宿主细胞选自埃希氏菌属(Escherichia)；沙门氏菌属(Salmonella)；芽孢杆菌属(Bacillus)；不动杆菌属(Acinetobacter)；链霉菌属(Streptomyces)；棒状杆菌属(Corynebacterium)；甲基弯曲菌属(Methylosinus)；甲基单胞菌属(Methylomonas)；红球菌属(Rhodococcus)；假单胞菌属(Pseudomonas)；红杆菌属(Rhodobacter)；集胞藻属(Synechocystis)；酵母属；接合酵母属(Zygosaccharomyces)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)；假丝酵母属(Candida)；汉逊酵母属(Hansenula)；德巴利酵母属(Debaryomyces)；毛霉属(Mucor)；毕赤酵母属；球拟酵母属(Torulopsis)；曲霉属(Aspergillus)；节丛孢属(Arthrobotlys)；短杆菌属(Brevibacteria)；微杆菌属(Microbacterium)；节杆菌属(Arthrobacter)；柠檬酸杆菌属(Citrobacter)；克雷伯氏菌属(Klebsiella)；泛菌属(Pantoea)；和梭菌属(Clostridium)。在所提供的任何一种方法的一些实施方案中，宿主细胞是细菌细胞(例如，大肠杆菌细胞)。在所提供的任何一种方法的一些实施方案中，宿主细胞是酵母细胞(例如，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞)。

在所提供的任何一种方法的一些实施方案中，宿主细胞是从选自以下的植物中分离的细胞：大豆；油菜籽；向日葵；棉花；玉米；烟草；苜蓿；小麦；大麦；燕麦；高粱；稻；西兰花；花椰菜；甘蓝；欧防风；甜瓜；胡萝卜；芹菜；欧芹；番茄；土豆；草莓；花生；葡萄；草种作物；甜菜；甘蔗；豆；豌豆；黑麦；亚麻；阔叶树；针叶树；牧草；拟南芥；稻(水稻(Oryza sativa))；大麦(Hordeum yulgare)；柳枝稷(switchgrass)(柳枝稷(Panicum vigratum))；短柄草属(Brachypodium)物种；芸苔属(Brassica)物种；和海甘蓝(Crambe abyssinica)。

蛋白质在原核生物中的表达最经常用载体在细菌宿主细胞中进行，所述载体含有指导融合蛋白或非融合蛋白表达的组成型启动子或诱导型启动子。融合载体将许多氨基酸加入其中编码的蛋白质中，通常加入重组蛋白质的氨基末端。这种融合载体通常发挥三个目的：l)增加重组蛋白质的表达；2)增加重组蛋白质的溶解度；以及3)通过在亲和纯化中充当配体来帮助重组蛋白质的纯化。经常地，在融合部分和重组蛋白质的连接处引入蛋白酶解切割位点，以使得在融合蛋白的纯化之后能够将重组蛋白质与融合部分分开。这种载体在本公开内容的范围内。

在一个实施方案中，表达载体包括用于在细菌细胞中表达重组多肽的那些遗传元件。用于细菌细胞中的转录和翻译的元件可以包括启动子、蛋白质复合物的编码区和转录终止子。

本领域的普通技术人员将知道可用于制备表达载体的分子生物学技术。如上所述，用于掺入主题技术的表达载体内的多核苷酸可以通过常规技术如聚合酶链反应(PCR)进行制备。

可以开发几种分子生物学技术，以经由互补的粘性末端将DNA与载体可操作地连接。在一个实施方案中，可以将互补的均聚物束加入待插入载体DNA内的核酸分子中。载体和核酸分子然后通过互补的均聚物尾部之间的氢键合进行连接，以形成重组DNA分子。

在一个替代实施方案中，所提供的含有一个或多个限制性位点的合成接头用于将主题技术的多核苷酸与表达载体可操作地连接。在一个实施方案中，多核苷酸通过限制性内切核酸酶消化来生成。在一个实施方案中，核酸分子用细菌噬菌体T4 DNA聚合酶或大肠杆菌DNA聚合酶I进行处理，所述酶用其3'-5'-核酸外切活性去除突出的3'-单链末端，并且用其聚合活性填充凹陷的3'端，从而生成平端的DNA区段。然后在可以催化平端DNA分子的连接的酶(如细菌噬菌体T4 DNA连接酶)的存在下，使平端区段与大量摩尔过量的接头分子一起温育。因此，反应的产物是在其端部处携带聚合接头序列的多核苷酸。这些多核苷酸然后用适当的限制性酶进行切割，并且与已用酶进行切割的表达载体连接，所述酶产生与多核苷酸的末端相容的末端。

可替代地，可以采用具有不依赖连接的克隆(LIC)位点的载体。然后无需限制性消化或连接，可以将所需的PCR扩增的多核苷酸克隆到LIC载体内(Aslanidis和de Jong，Nucl. Acid. Res. 18 6069-74,(1990)，Haun等人，Biotechniques 13，515-18(1992)，所述参考文献通过引用并入本文至它与此一致的程度)。

在一个实施方案中，为了分离和/或修饰感兴趣的多核苷酸用于插入所选的质粒内，使用PCR是合适的。可以设计用于序列的PCR制备中的适当引物，以分离所需的核酸分子的编码区，添加限制性内切核酸酶或LIC位点，将编码区置于所需的读码框中。

在一个实施方案中，使用适当的寡核苷酸引物，使用PCR制备用于掺入主题技术的表达载体内的多核苷酸。将编码区扩增，而引物本身变得整合到所扩增的序列产物内。在一个实施方案中，扩增引物含有限制性内切核酸酶识别位点，其允许将扩增的序列产物克隆到适当的载体内。

可以通过常规转化或转染技术将表达载体引入植物或微生物宿主细胞内。用主题技术的表达载体转化适当的细胞通过本领域已知的方法来完成，并且通常取决于载体和细胞的类型两者。合适的技术包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂转染、化学穿孔(chemoporation)或电穿孔。

成功转化的细胞，即含有表达载体的那些细胞，可以通过本领域众所周知的技术进行鉴定。例如，可以培养用主题技术的表达载体转染的细胞，以产生本文所述的多肽。可以通过本领域众所周知的技术，就表达载体DNA的存在检查细胞。

宿主细胞可以含有先前描述的表达载体的单个拷贝，或可替代地表达载体的多重拷贝。

在一些实施方案中，所转化的细胞是动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、藻类细胞、真菌细胞或酵母细胞。在一些实施方案中，细胞是选自以下的植物细胞：卡诺拉油菜(canola)植物细胞、油菜籽植物细胞、棕榈植物细胞、向日葵植物细胞、棉花植物细胞、玉米植物细胞、花生植物细胞、亚麻植物细胞、芝麻植物细胞、大豆植物细胞和矮牵牛植物细胞。

含有指导外来蛋白质的高水平表达的调控序列的微生物宿主细胞表达系统和表达载体是本领域技术人员众所周知的。这些中的任一种都可以用于构建用于在微生物宿主细胞中表达主题技术的重组多肽的载体。这些载体然后可以经由转化引入适当的微生物内，以允许主题技术的重组多肽的高水平表达。

可用于转化合适的微生物宿主细胞的载体或盒是本领域众所周知的。通常，载体或盒含有指导有关多核苷酸的转录和翻译的序列、可检测标记物、以及允许自主复制或染色体整合的序列。合适的载体包含含有转录起始控制的多核苷酸5'的区域、以及控制转录终止的DNA片段3'的区域。在一些实施方案中，优选两个控制区均衍生自与所转化的宿主细胞同源的基因，尽管应理解这种控制区无需衍生自对于选择作为宿主的特定物种天然的基因。

可用于驱动重组多肽在所需的微生物宿主细胞中的表达的起始控制区或启动子是众多的以及本领域技术人员所熟悉的。实际上，能够驱动这些基因的任何启动子都适合于主题技术，包括但不限于CYCI、HIS3、GALI、GALIO、ADHI、PGK、PH05、GAPDH、ADCI、TRPI、URA3、LEU2、ENO、TPI(可用于酵母属中的表达)；AOXI(可用于毕赤酵母属中的表达)；以及lac、trp、JPL、IPR、T7、tac和trc(可用于大肠杆菌中的表达)。

终止控制区还可以衍生自对于微生物宿主天然的各种基因。对于本文所述的微生物宿主，可以任选地包括终止位点。

在植物细胞中，主题技术的表达载体可以包括与启动子可操作地连接的编码区，所述启动子能够指导主题技术的重组多肽在所需发育阶段下在所需组织中的表达。出于方便的原因，待表达的多核苷酸可以包含衍生自相同多核苷酸的启动子序列和翻译前导序列。还应该存在编码转录终止信号的3'非编码序列。表达载体还可以包含一个或多个内含子，以促进多核苷酸表达。

对于植物宿主细胞，能够诱导编码区表达的任何启动子和任何终止子的任何组合可以用于主题技术的载体序列中。启动子和终止子的一些合适实例包括来自胭脂碱合酶(nos)、章鱼碱合酶(ocs)和花椰菜花叶病毒(CaMV)基因的那些启动子和终止子。可以使用的一类有效的植物启动子是高水平植物启动子。与主题技术的表达载体可操作连接的这种启动子应该能够促进载体的表达。可以用于主题技术中的高水平的植物启动子包括例如来自大豆的核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶的小亚基(ss)的启动子(Berry-Lowe等人，J.MOLECULAR AND APP. GEN.，1:483 498(1982)，其全部内容在此并入本文至它与此一致的程度)，以及叶绿素a/b结合蛋白的启动子。已知这两种启动子在植物细胞中是光诱导的(参见例如，GENETIC ENGINEERING OF PLANTS，AN AGRICULTURAL PERSPECTIVE，A. Cashmore，Plenum，N.Y.(1983)，第29-38页；Coruzzi，G.等人，The Journal of BiologicalChemistry，258: 1399(1983)，以及Dunsmuir，P.等人，Journal of Molec. Appl. Gen.，2:285(1983)，所述参考文献各自在此通过引用并入本文至它们与此一致的程度。

口服消费产品

使用本文所述的任何一种方法生产的莱鲍迪甙(例如莱鲍迪甙R6-1、R6-2A、R6-2B、R6-4A、R6-4B和R7-2)可以用作甜味剂。本公开内容的其它方面提供了例如选自饮料产品和消费产品的、具有增甜量的莱鲍迪甙R6-1、莱鲍迪甙R6-2A、莱鲍迪甙R6-2B、莱鲍迪甙R6-4A、莱鲍迪甙R6-4B和/或莱鲍迪甙R7-2的口服消费产品。

任何一种口服消费产品可以具有等价于约1%(w/v-%)至约4%(w/v-%)蔗糖溶液的甜味强度。

任何一种口服消费产品可以具有约5 ppm至约100 ppm的莱鲍迪甙R6-1。任何一种口服消费产品可以具有约5 ppm至约100 ppm的莱鲍迪甙R6-2A。任何一种口服消费产品可以具有约5 ppm至约100 ppm的莱鲍迪甙R6-2B。任何一种口服消费产品可以具有约5 ppm至约100 ppm的莱鲍迪甙R6-4A。任何一种口服消费产品可以具有约5 ppm至约100 ppm的莱鲍迪甙R6-4B。任何一种口服消费产品可以具有约5 ppm至约100 ppm的莱鲍迪甙R7-2。

莱鲍迪甙R6-1可以是口服消费产品中唯一的甜味剂。莱鲍迪甙R6-2A可以是口服消费产品中唯一的甜味剂。莱鲍迪甙R6-2B可以是口服消费产品中唯一的甜味剂。莱鲍迪甙R6-4A可以是口服消费产品中唯一的甜味剂。莱鲍迪甙R6-4B可以是口服消费产品中唯一的甜味剂。莱鲍迪甙R7-2可以是口服消费产品中唯一的甜味剂。

任何一种口服消费产品还可以具有至少一种另外的甜味剂。至少一种另外的甜味剂可以是例如天然的高强度甜味剂。另外的甜味剂可以选自甜菊提取物、甜菊醇糖苷、甜菊糖苷、莱鲍迪甙A、莱鲍迪甙B、莱鲍迪甙C、莱鲍迪甙D、莱鲍迪甙D2、莱鲍迪甙E、莱鲍迪甙F、莱鲍迪甙M、莱鲍迪甙V、莱鲍迪甙W、莱鲍迪甙Z1、莱鲍迪甙Z2、莱鲍迪甙D3、杜克甙A、甜茶苷、甜菊醇双糖苷、蔗糖、高果糖玉米糖浆、果糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、赤藓糖醇、木糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、AceK、阿斯巴甜、纽甜、三氯蔗糖、糖精、柚皮苷二氢查耳酮(NarDHC)、新橙皮苷二氢查耳酮(NDHC)、甜茶苷、罗汉果苷IV、赛门苷I、罗汉果苷V、莫纳甜、索马甜、应乐果甜蛋白、甜味蛋白、L-丙氨酸、甘氨酸、罗汉果、hernandulcin、叶甜素、三叶苷及其组合。

任何一种口服消费产品还可以具有至少一种添加剂。添加剂可以是例如碳水化合物、多元醇、氨基酸或其盐、聚氨基酸或其盐、糖酸或其盐、核苷酸、有机酸、无机酸、有机盐、有机酸盐、有机碱盐、无机盐、苦味化合物、食用香料、调味成分、收敛剂化合物、蛋白质、蛋白质水解物、表面活性剂、乳化剂、类黄酮、醇、聚合物及其组合。

在一些实施方案中，本公开内容提供了包含增甜量的莱鲍迪甙R6-1的饮料产品。在一些实施方案中，本公开内容提供了包含增甜量的莱鲍迪甙R6-2A的饮料产品。在一些实施方案中，本公开内容提供了包含增甜量的莱鲍迪甙R6-2B的饮料产品。在一些实施方案中，本公开内容提供了包含增甜量的莱鲍迪甙R6-4A的饮料产品。在一些实施方案中，本公开内容提供了包含增甜量的莱鲍迪甙R6-4B的饮料产品。在一些实施方案中，本公开内容提供了包含增甜量的莱鲍迪甙R7-2的饮料产品。

任何一种饮料产品可以是例如碳酸饮料产品和非碳酸饮料产品。任何一种饮料产品还可以是例如软饮料、喷泉饮料、冷冻饮料；即饮饮料；冷冻即饮饮料、咖啡、茶、乳饮料、粉末状软饮料、浓缩液、调味水、强化水、果汁、果汁调味饮料、运动饮料和能量饮料。

在一些实施方案中，本公开内容的任何一种饮料产品可以包括一种或多种饮料成分，例如酸化剂、果汁和/或蔬菜汁、果肉等、调味剂、着色剂、防腐剂、维生素、矿物质、电解质、赤藓糖醇、塔格糖、丙三醇和二氧化碳。这种饮料产品可以以任何合适的形式提供，例如饮料浓缩物和碳酸即饮饮料。

在某些实施方案中，本公开内容的任何一种饮料产品可以具有众多不同的特定配方或构成中的任一种。本公开内容的饮料产品的配方可以在一定程度上变化，这取决于此类因素如产品的预期市场细分、其所需的营养特征、风味特性等等。例如，在某些实施方案中，一般可以选择将进一步的成分加入特定饮料产品的配方中。例如，可以添加另外的(即，更多和/或其它)甜味剂，通常可以将调味剂、电解质、维生素、果汁或其它水果制品、增味剂(tastent)、掩蔽剂等等、风味增强剂和/或碳酸化加入任何此类制剂中，以改变味道、口感、营养特征等。在实施方案中，任何一种饮料产品可以是可乐饮料，其含有水、约5 ppm至约100 ppm莱鲍迪甙R6-1、酸化剂和调味剂。在实施方案中，任何一种饮料产品可以是可乐饮料，其含有水、约5 ppm至约100 ppm莱鲍迪甙R6-2A、酸化剂和调味剂。在实施方案中，任何一种饮料产品可以是可乐饮料，其含有水、约5 ppm至约100 ppm莱鲍迪甙R6-2B、酸化剂和调味剂。在实施方案中，任何一种饮料产品可以是可乐饮料，其含有水、约5 ppm至约100ppm莱鲍迪甙R6-4A、酸化剂和调味剂。在实施方案中，任何一种饮料产品可以是可乐饮料，其含有水、约5 ppm至约100 ppm莱鲍迪甙R6-4B、酸化剂和调味剂。在实施方案中，任何一种饮料产品可以是可乐饮料，其含有水、约5 ppm至约100 ppm莱鲍迪甙R7-2、酸化剂和调味剂。

示例性调味剂可以是例如可乐调味剂、柑橘调味剂和香料调味剂。在一些实施方案中，可以加入二氧化碳形式的碳酸化以用于泡腾。在其它实施方案中，可以添加防腐剂，这取决于其它成分、生产技术、所需的贮存期限等。在某些实施方案中，可以添加咖啡因。在一些实施方案中，饮料产品可以是可乐风味的碳酸饮料，其特征性地含有碳酸水、甜味剂、可乐果提取物和/或其它调味剂、焦糖色素、一种或多种酸和任选地其它成分。

存在于饮料产品中的莱鲍迪甙R6-1、莱鲍迪甙R6-2A、莱鲍迪甙R6-2B、莱鲍迪甙R6-4A、莱鲍迪甙R6-4B或莱鲍迪甙R7-2的合适量可以是例如约5 ppm至约100 ppm。在一些实施方案中，低浓度的莱鲍迪甙R6-1、莱鲍迪甙R6-2A、莱鲍迪甙R6-2B、莱鲍迪甙R6-4A、莱鲍迪甙R6-4B或莱鲍迪甙R7-2例如小于100 ppm，并具有与浓度在10,000 ppm至30,000 ppm之间的蔗糖溶液等价的甜度。最终浓度范围为约5 ppm至约100 ppm、约5 ppm至约95 ppm、约5 ppm至约90 ppm、约5 ppm至约85 ppm、约5 ppm至约80 ppm、约5 ppm至约75 ppm、约5ppm至约70 ppm、约5 ppm至约65 ppm、约5 ppm至约60 ppm、约5 ppm至约55 ppm、约5 ppm至约50 ppm、约5 ppm至约45 ppm、约5 ppm至约40 ppm、约5 ppm至约35 ppm、约5 ppm至约30ppm、约5 ppm至约25 ppm、约5 ppm至约20 ppm、约5 ppm至约15 ppm、或约5 ppm至约10ppm。可替代地，莱鲍迪甙R6-1、莱鲍迪甙R6-2A、莱鲍迪甙R6-2B、莱鲍迪甙R6-4A、莱鲍迪甙R6-4B或莱鲍迪甙R7-2可以存在于本公开内容的饮料产品中，其最终浓度范围为约5 ppm至约100 ppm、约10 ppm至约100 ppm、约15 ppm至约100 ppm、约20 ppm至约100 ppm、约25ppm至约100 ppm、约30 ppm至约100 ppm、约35 ppm至约100 ppm、约40 ppm至约100 ppm、约45 ppm至约100 ppm、约50 ppm至约100 ppm、约55 ppm至约100 ppm、约60 ppm至约100ppm、约65 ppm至约100 ppm、约70 ppm至约100 ppm、约75 ppm至约100 ppm、约80 ppm至约100 ppm、约85 ppm至约100 ppm、约90 ppm至约100 ppm、或约95 ppm至约100 ppm。

在一些实施方案中，本公开内容提供了包含增甜量的莱鲍迪甙R6-1的消费品。在一些实施方案中，本公开内容提供了包含增甜量的莱鲍迪甙R6-2A的消费品。在一些实施方案中，本公开内容提供了包含增甜量的莱鲍迪甙R6-2B的消费品。在一些实施方案中，本公开内容提供了包含增甜量的莱鲍迪甙R6-4A的消费品。在一些实施方案中，本公开内容提供了包含增甜量的莱鲍迪甙R6-4B的消费品。在一些实施方案中，本公开内容提供了包含增甜量的莱鲍迪甙R7-2的消费品。消费品可以是例如食物产品、营养制品、药物、膳食补充剂、牙科卫生组合物、可食用凝胶组合物、化妆品和桌面调味剂。

如本文使用的，“膳食补充剂”指这样的化合物，其预期补充饮食，并且提供在饮食中可能缺失或可能未以足够数量消费的营养素，例如维生素、矿物质、纤维、脂肪酸、氨基酸等。可以使用本领域已知的任何合适的膳食补充剂。合适的膳食补充剂的实例可以是例如营养素、维生素、矿物质、纤维、脂肪酸、草药、植物制剂(botanical)、氨基酸和代谢物。

如本文使用的，“营养制品”指这样的化合物，其包括可能提供药用或健康益处的任何食物或食物的部分，所述药用或健康益处包括预防和/或治疗疾病或病症(例如疲劳、失眠、衰老的影响、记忆力减退、情绪障碍、心血管疾病和血液中高水平的胆固醇、糖尿病、骨质疏松症、炎症、自身免疫性病症等)。可以使用本领域已知的任何合适的营养制品。在一些实施方案中，营养制品可以用作食物和饮料的补充剂以及用作用于肠内或胃肠外施用的药物制剂，其可以是固体制剂，例如胶囊或片剂，或液体制剂，例如溶液剂或混悬剂。

在一些实施方案中，膳食补充剂和营养制品可以进一步含有保护性水胶体(例如树胶、蛋白质、改性淀粉)、粘合剂、成膜剂、包封剂/材料、壁/壳材料、基质化合物、包衣、乳化剂、表面活性剂、增溶剂(油、脂肪、蜡、卵磷脂等)、吸附剂、载体、填料、共化合物(co-compound)、分散剂、润湿剂、加工助剂(溶剂)、流动剂、掩味剂、增重剂、胶冻剂(jellyfyingagent)、凝胶形成剂、抗氧化剂和抗微生物剂。

如本文使用的，“凝胶”指胶体系统，其中颗粒网络跨越液体介质的体积。尽管凝胶主要由液体组成，并且因此显示出与液体相似的密度，但由于跨越液体介质的颗粒网络，凝胶具有固体的结构内聚力。出于这个原因，凝胶一般看起来是固体的果冻样材料。凝胶可以用于多种应用中。例如，凝胶可以用于食物、油漆和胶粘剂中。可以食用的凝胶被称为“可食用凝胶组合物”。可食用凝胶组合物通常作为零食、甜点、主食的部分或连同主食一起食用。合适的可食用凝胶组合物的实例可以是例如凝胶甜点、布丁、果酱、果冻、糊状物、乳脂松糕(trifles)、肉冻、棉花糖、软糖等等。在一些实施方案中，可食用凝胶混合物一般是粉末状或颗粒状固体，可以向其中添加流体以形成可食用凝胶组合物。合适流体的实例可以是例如水、乳流体、乳类似物流体、果汁、酒精、酒精饮料及其组合。合适的乳流体的实例可以是例如乳、酸乳(cultured milk)、奶油、流体乳清及其混合物。合适的乳类似物流体的实例可以是例如豆浆和非乳咖啡增白剂。

如本文使用的，术语“胶凝成分”指可在液体介质内形成胶体系统的任何材料。合适的胶凝成分的实例可以是例如明胶、海藻酸盐、角叉菜胶、树胶、果胶、魔芋、琼脂、食物酸、凝乳酶、淀粉、淀粉衍生物及其组合。本领域技术人员众所周知的是，在可食用凝胶混合物或可食用凝胶组合物中使用的胶凝成分的量可以根据许多因素而显著变化，所述因素例如所使用的特定胶凝成分、所使用的特定流体基质以及所需的凝胶性质。

本公开内容的凝胶混合物和凝胶组合物可以通过本领域已知的任何合适的方法进行制备。在一些实施方案中，本公开内容的可食用凝胶混合物和可食用凝胶组合物可以使用除胶凝剂之外的其它成分进行制备。其它合适成分的实例可以是例如食物酸、食物酸的盐、缓冲系统、填充剂、螯合剂、交联剂、一种或多种调料、一种或多种色素及其组合。

还提供了包含本文提供的任何一种莱鲍迪甙的药物组合物。在某些实施方案中，本公开内容的任何一种药物组合物可以含有约5 ppm至约100 ppm的莱鲍迪甙R6-1、以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。在某些实施方案中，本公开内容的任何一种药物组合物可以含有约5 ppm至约100 ppm的莱鲍迪甙R6-2A、以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。在某些实施方案中，本公开内容的任何一种药物组合物可以含有约5 ppm至约100 ppm的莱鲍迪甙R6-2B、以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。在某些实施方案中，本公开内容的任何一种药物组合物可以含有约5 ppm至约100 ppm的莱鲍迪甙R6-4A、以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。在某些实施方案中，本公开内容的任何一种药物组合物可以含有约5ppm至约100 ppm的莱鲍迪甙R6-4B、以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。在某些实施方案中，本公开内容的任何一种药物组合物可以含有约5 ppm至约100 ppm的莱鲍迪甙R7-2、以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，本公开内容的任何一种药物组合物可以用于配制含有发挥生物效应的一种或多种活性剂的药物。相应地，在一些实施方案中，本公开内容的任何一种药物组合物可以含有发挥生物效应的一种或多种活性剂。合适的活性剂是本领域众所周知的(例如，Physician's Desk Reference)。这种组合物可以根据本领域众所周知的程序进行制备，所述程序例如如Remington’s PharmaceuticalSciences，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，USA中所述的。

莱鲍迪甙R6-1、莱鲍迪甙R6-2A、莱鲍迪甙R6-2B、莱鲍迪甙R6-4A、莱鲍迪甙R6-4B或莱鲍迪甙R7-2可以与本领域已知的任何合适的牙科和口腔卫生组合物一起使用。合适的牙科和口腔卫生组合物的实例可以是例如牙膏、牙齿抛光剂、牙线、漱口水、漱口液、洁牙剂、口腔喷雾剂、口腔清新剂、牙菌斑含漱液、牙齿镇痛剂等等。还提供了包含本文提供的任何一种莱鲍迪甙的牙科和口腔卫生组合物。

存在于本文提供的任何一种组合物例如消费品中的莱鲍迪甙R6-1、莱鲍迪甙R6-2A、莱鲍迪甙R6-2B、莱鲍迪甙R6-4A、莱鲍迪甙R6-4B或莱鲍迪甙R7-2的合适量可以是例如约百万分之5(ppm)至约百万分之100(ppm)。在所提供的任何一种组合物的一些实施方案中，例如小于100 ppm的莱鲍迪甙R6-1、莱鲍迪甙R6-2A、莱鲍迪甙R6-2B、莱鲍迪甙R6-4A、莱鲍迪甙R6-4B或莱鲍迪甙R7-2的低浓度，具有与浓度在10,000 ppm至30,000 ppm之间的蔗糖溶液等价的甜度。最终浓度范围可以为约5 ppm至约100 ppm、约5 ppm至约95 ppm、约5ppm至约90 ppm、约5 ppm至约85 ppm、约5 ppm至约80 ppm、约5 ppm至约75 ppm、约5 ppm至约70 ppm、约5 ppm至约65 ppm、约5 ppm至约60 ppm、约5 ppm至约55 ppm、约5 ppm至约50ppm、约5 ppm至约45 ppm、约5 ppm至约40 ppm、约5 ppm至约35 ppm、约5 ppm至约30 ppm、约5 ppm至约25 ppm、约5 ppm至约20 ppm、约5 ppm至约15 ppm、或约5 ppm至约10 ppm。可替代地，莱鲍迪甙R6-1、莱鲍迪甙R6-2A、莱鲍迪甙R6-2B、莱鲍迪甙R6-4A、莱鲍迪甙R6-4B或莱鲍迪甙R7-2可以存在于所提供的任何一种组合物，例如本公开内容的任何一种消费产品中，其最终浓度范围为约5 ppm至约100 ppm、约10 ppm至约100 ppm、约15 ppm至约100ppm、约20 ppm至约100 ppm、约25 ppm至约100 ppm、约30 ppm至约100 ppm、约35 ppm至约100 ppm、约40 ppm至约100 ppm、约45 ppm至约100 ppm、约50 ppm至约100 ppm、约55 ppm至约100 ppm、约60 ppm至约100 ppm、约65 ppm至约100 ppm、约70 ppm至约100 ppm、约75ppm至约100 ppm、约80 ppm至约100 ppm、约85 ppm至约100 ppm、约90 ppm至约100 ppm、或约95 ppm至约100 ppm。

在某些实施方案中，约5 ppm至约100 ppm的莱鲍迪甙R6-1、莱鲍迪甙R6-2A、莱鲍迪甙R6-2B、莱鲍迪甙R6-4A、莱鲍迪甙R6-4B或莱鲍迪甙R7-2存在于食物产品组合物。还提供了此类组合物。如本文使用的，“食物产品组合物”指可以但无需具有营养价值，并且预期用于由人和动物消费的任何固体或液体可摄入材料。

合适的食物产品组合物的实例可以是例如糖果点心组合物，例如糖果、薄荷糖、水果味滴剂、可可制品、巧克力等等；调味品，例如番茄酱、芥末、蛋黄酱等等；口香糖；谷物组合物；烘焙食物，例如面包、蛋糕、馅饼、饼干等等；乳制品，例如乳、干酪、奶油、冰淇淋、酸奶油、酸奶、果子露等等；桌面甜味剂组合物；汤；炖菜；方便食物；肉类，例如火腿、培根、香肠、肉干等等；明胶和明胶样制品，例如果酱、果冻、蜜饯等等；水果；蔬菜；蛋制品；糖霜；糖浆包括糖蜜；零食；果仁和坚果制品；以及动物饲料。

食物产品组合物还可以是草药、香料和调味料、天然和合成调料、以及风味增强剂例如味精。在一些实施方案中，任何一种食物产品组合物可以是例如制备的包装产品，例如饮食甜味剂、液体甜味剂、颗粒状调料混合物、宠物食物、牲畜饲料、烟草和用于烘焙应用的材料，例如用于制备面包、饼干、蛋糕、煎饼、甜甜圈等等的粉末状烘焙混合物。在其它实施方案中，任何一种食物产品组合物还可以是含有很少的蔗糖或不含蔗糖的饮食以及低热量食物和饮料。

在可以与任何一个前述实施方案组合或不组合的某些实施方案中，莱鲍迪甙R6-1、莱鲍迪甙R6-2A、莱鲍迪甙R6-2B、莱鲍迪甙R6-4A、莱鲍迪甙R6-4B或莱鲍迪甙R7-2是唯一的甜味剂，并且产品具有等价于约1%至约4%(w/v-%)蔗糖溶液的甜味强度。在可以与任何一个前述实施方案组合或不组合的某些实施方案中，消费产品和饮料产品可以进一步包括另外的甜味剂，其中产品具有等价于约1%至约10%(w/v-%)蔗糖溶液的甜味强度。在可以与任何一个前述实施方案组合或不组合的某些实施方案中，产品中的每一种甜味成分都是高强度甜味剂。在可以与任何一个前述实施方案组合或不组合的某些实施方案中，产品中的每一种甜味成分都可以是天然的高强度甜味剂。在可以与任何一个前述实施方案组合或不组合的某些实施方案中，另外的甜味剂含有选自以下的一种或多种甜味剂：甜菊提取物、甜菊醇糖苷、甜菊糖苷、莱鲍迪甙A、莱鲍迪甙B、莱鲍迪甙C、莱鲍迪甙D、莱鲍迪甙D2、莱鲍迪甙F、莱鲍迪甙D3、莱鲍迪甙Z1、莱鲍迪甙Z2、莱鲍迪甙M、莱鲍迪甙W、莱鲍迪甙V、杜克甙A、甜茶苷、甜菊醇双糖苷、蔗糖、高果糖玉米糖浆、果糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、赤藓糖醇、木糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、AceK、阿斯巴甜、纽甜、三氯蔗糖、糖精、柚皮苷二氢查耳酮(NarDHC)、新橙皮苷二氢查耳酮(NDHC)、甜茶苷、罗汉果苷IV、赛门苷I、罗汉果苷V、莫纳甜、索马甜、应乐果甜蛋白、甜味蛋白、L-丙氨酸、甘氨酸、罗汉果、hernandulcin、叶甜素、三叶苷及其组合。在可以与任何一个前述实施方案组合或不组合的某些实施方案中，消费产品和饮料产品可以进一步包括选自以下的一种或多种添加剂：碳水化合物、多元醇、氨基酸或其盐、聚氨基酸或其盐、糖酸或其盐、核苷酸、有机酸、无机酸、有机盐、有机酸盐、有机碱盐、无机盐、苦味化合物、食用香料、调味成分、收敛剂化合物、蛋白质、蛋白质水解物、表面活性剂、乳化剂、类黄酮、醇、聚合物及其组合。在可以与任何一个前述实施方案组合或不组合的某些实施方案中，莱鲍迪甙R6-1、莱鲍迪甙R6-2A、莱鲍迪甙R6-2B、莱鲍迪甙R6-4A、莱鲍迪甙R6-4B或莱鲍迪甙R7-2在将其加入产品中之前，具有按重量计约50%至约100%的纯度。

实施例

实施例1：通过酶促生物转化生产新型甜菊醇糖苷R6-2和R7-2

根据本发明，所有候选的UDP-葡萄糖基转移酶(UGT)基因的全长DNA片段是商业合成的。几乎所有的cDNA密码子都改变为大肠杆菌优选的密码子(Genscript，NJ)。将合成的DNA克隆到细菌表达载体pETite N-His SUMO Kan Vector(Lucigen)内。

将每个表达构建体转化到大肠杆菌BL21(DE3)内，所述大肠杆菌随后在含有50 μg/mL卡那霉素的LB培养基中，在37℃下生长直至达到0.8-1.0的OD600。通过添加1 mM异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白质表达，并且使培养物在16℃下进一步生长22小时。通过离心(3,000 x g；10分钟；4℃)来收获细胞。收集细胞沉淀并立即使用或贮存于-80℃下。

通常将细胞沉淀重悬浮于裂解缓冲液(50 mM磷酸钾缓冲液 pH 7.2、25ug/ml溶菌酶、5ug/ml DNA酶I、20 mM咪唑、500 mM NaCl、10%甘油和0.4% Triton X-100)中。通过在4℃下的超声处理来破碎细胞，并且通过离心(18,000 x g；30分钟)使细胞碎片澄清。将上清液加载到平衡的(平衡缓冲液：50 mM磷酸钾缓冲液 pH 7.2、20 mM咪唑、500 mM NaCl、10%甘油)Ni-NTA(Qiagen)亲和柱上。在蛋白质样品加载后，用平衡缓冲液洗涤柱，以去除未结合的污染蛋白质。加上His标签的UGT重组多肽通过含有250mM咪唑的平衡缓冲液进行洗脱。

通过使用莱鲍迪甙D3(Reb D3)作为底物，测定纯化的候选UGT重组多肽的糖基化活性。通常，重组多肽(10-50 µg)在200 µl体外反应系统中进行测试。反应系统含有50 mM磷酸钾缓冲液pH 7.2、3 mM MgCl₂、1 mg/ml Reb D3底物、1 mM UDP-葡萄糖或UDP和/或蔗糖合酶(SUS)和250mM蔗糖。反应在30-37℃下执行，并且通过在不同时间点加入200 µL 1-丁醇来终止50 ul反应。样品用200 µL 1-丁醇提取3次。使合并的级分干燥，并且溶解于100µL 80%甲醇中，用于高效液相层析(HPLC)分析。

然后使用Dionex UPLC ultimate 3000系统(Sunnyvale，CA)执行HPLC分析，所述系统包括四元泵、温控柱区室、自动进样器和UV吸光度检测器。具有保护柱的SynergiHydro-RP柱(Phenomenex)用于表征合并样品中的甜菊醇糖苷。乙腈的水溶液用于HPLC分析中的等度洗脱。HPLC分析中使用的检测波长为210nm。

在活性筛选后，发现UGT76G1(SEQ ID NO: 1)具有产生R6-2和R7-2甜菊醇糖苷的强活性(图2)。

如图3中所示，UGT76G1可以将Reb D3转化为R6-2，并且所产生的R6-2可以随同(continentally)转化为R7-2。R6-2和R7-2在较早的反应时间(2小时，图3，小图B)产生。产生的R6-2可以在稍后的时间点(4小时，图3，小图C)转化为R7-2。最终，所有Reb D3和产生的R6-2可以完全转化为R7-2化合物(19小时，图3，小图D)。

实施例2：经由LC-MS分析鉴定R6-2和R7-2产生

为了确认所产生的化合物，所产生的化合物通过与标准品比较的LC-MS分析进行分析，并且确认其身份。

使用Synergy Hydro-RP柱，通过LC-MS分析来自上述酶促生物转化的相同样品。流动相A为0.1%甲酸的水溶液，而流动相B为0.1%甲酸的乙腈溶液。流速为0.6 ml/分钟。在QExactive Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer(Thermo FisherScientific)上，用以正离子模式的优化方法，完成样品的质谱法分析。

化合物R6-2的分子式已基于其正高分辨率(HR)质谱推导为C₅₆H₉₀O₃₃，所述质谱显示在m/z 1291.5401下对应于[M+ H]⁺的加合物离子(图4)。R6-2的预测结构呈现于图2中。

化合物R7-2的分子式已基于其正高分辨率(HR)质谱推导为C₆₂H₁₀₀O₃₈，所述质谱显示在m/z 1453.5921下对应于[M+ H]⁺的加合物离子(图5)。R7-2的预测结构呈现于图2、6和7中。

实施例3：通过NMR分析R7-2的结构：

所产生的R7-2化合物通过如上所述的半制备型层析进行纯化。

HRMS数据用LTQ Orbitrap Discovery HRMS仪器生成，其分辨率设定为30k。在正离子电喷雾模式下从m/z 150到1500扫描数据。针电压设定为4 kV；其它源条件为鞘气 =25，辅助气 = 0，吹扫气 = 5(所有气体流量均为任意单位)，毛细管电压 = 30V，毛细管温度 = 300℃以及管透镜电压 = 75。样品用吡啶稀释并注入50微升。

NMR光谱在Bruker Avance DRX 500 MHz或Varian INOVA 600 MHz仪器上使用标准脉冲序列获得。1D(¹H和¹³C)和2D(TOCSY、HSQC、ROESY和HMBC) NMR光谱在C₅D₅N中执行。

化合物R7-2的分子式已基于其正高分辨率(HR)质谱推导为C₆₂H₁₀₀O₃₈，所述质谱显示在m/z 1470.6222下对应于[M+ NH₄]⁺以及在m/z 1475.5774下对应于[M+Na]⁺的加合物离子；这一组成得到¹³C NMR和HSQC光谱数据支持。R7-2的¹H NMR光谱显示了存在在δ 1.33和1.39处的两个sp3甲基单峰；作为环外双键的在δ 5.00和5.74处的单峰的两个烯属质子；对于较早从甜菊属中分离的对映-贝壳杉烷二萜特征性的、在δ 0.75-2.74之间的9个sp3亚甲基和两个sp3次甲基质子。R7-2的酶促水解提供了化合物，基于NMR光谱数据发现所述化合物与甜菊醇等同(Ohtani等人，1992)。R7-2的¹H NMR光谱还显示了在δ 4.99、5.05、5.35、5.38、5.43、5.82和6.40处共振的异头质子的存在，提示了在其分子结构中的七个糖单元。R7-2用5% H₂SO₄的酸水解得到D-葡萄糖，其通过TLC与真实样品的直接比较进行鉴定，提示了在其分子结构中存在六个吡喃葡萄糖基部分(Bedir等人，2001；Chaturvedula等人，2003；以及Huan等人，1998)。进一步地，通过用L-半胱氨酸甲酯和邻甲苯基异硫氰酸酯制备其相应的硫代氨基甲酰基-噻唑烷羧酸酯衍生物，并且如文献比较(Tanaka等人，2007)中所述的比较其与标准糖的保留时间，来鉴定D-葡萄糖的构型。基于来自R7-2的NMR光谱数据的结果，得出结论，在其结构中存在与甜菊醇部分附着的七个D-葡萄糖基单元。R7-2中甜菊醇的基础骨架得到TOCSY (H-1/H-2；H-2/H-3；H-5/H-6；H-6/H-7；H-9/H-11；H-11/H-12)和HMBC (H-1/C-2、C-10；H-3/C-1、C-2、C-4、C-5、C-18、C-19；H-5/C-4、C-6、C-7、C-9、C-10、C-18、C-19、C-20；H-9/C-8、C-10、C-11、C-12、C-14、C-15； H-14/C-8、C-9、C-13、C-15、C-16和H-17/C-13、C-15、C-16)相关性的支持。

关于R7-2中的所有质子和碳的¹H和¹³C NMR值基于TOCSY、HMQC和HMBC相关性进行分配，并且在表1中给出。

R7-2与莱鲍迪甙D3(Mao等人2017)的¹H和¹³C NMR光谱的密切比较提示了，该化合物也是甜菊醇糖苷，其具有作为在C-13羟基处附着的四个葡萄糖基部分，其中三个作为2,3-支链的葡萄糖三糖基取代基以醚的形式附着；以及作为酯在C-19处的另一个2,3-支链的葡萄糖三糖基部分。上述数据解释了R7-2的分子结构中的六个葡萄糖基单元，留下在C-13位置处的2,3-支链的葡萄糖三糖基取代基上的另外葡萄糖基部分的鉴定。基于图8中所示的关键TOCSY和HMBC相关性，第七个葡萄糖基部分的放置已分配在糖II的C-6位置处，如莱鲍迪甙D3中。

对于在δ 4.99(d，J=7.6 Hz)、5.05(d，J=7.4 Hz)、5.35(d，J=8.1 Hz)、5.38(d，J=7.7 Hz)、5.43(d，J=7.7 Hz)、5.82(d，J=6.6 Hz)和6.40(d，J=8.1 Hz)处的葡萄糖基部分的所有七个异头质子观察到的大偶合常数，提示了其如对于甜菊醇糖苷报告的β-取向。

基于NMR和HR质谱数据以及水解研究，通过莱鲍迪甙D3的酶促转化产生的R7-2的结构推导为13-[(2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-6-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]对映-贝壳杉-16-烯-19-酸-[(2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基 -β-D-吡喃葡萄糖基)酯。

通过将pH维持在4.5下，将R7-2(500 μg)溶解于5.0 ml 0.1 M乙酸钠缓冲液中，并且加入100 uL来自黑曲霉(Aspergillus niger)的粗制果胶酶(Sigma-Aldrich)。将混合物在50℃下搅拌96小时，并且过滤在反应过程中沉淀出的产物，然后固化。通过比较其¹H NMR光谱数据，将获得的所得到的产物鉴定为甜菊醇。

将R7-2(1 mg)溶解于MeOH(8 ml)中，并且加入5% H₂SO₄(25 mL)。使混合物回流16小时，冷却至室温，然后用饱和碳酸钠中和。水相用乙酸乙酯(EtOAc，2 x 25 ml)提取，并且将水层浓缩，并且使用TLC系统EtOAc/正丁醇/水(2:7:1)和CH₂Cl₂/MeOH/水(10:6:1)(Bedir等人，2001；Chaturvedula等人，2003；Huan等人，1998)，与标准糖进行比较；R7-2中的糖被鉴定为D-葡萄糖。

R7-2(1 mg)用0.5 M HCl(1.5 mL)水解1.5小时。在冷却后，使混合物通过Amberlite IRA400柱，并且使洗脱物冻干。将残渣溶解于吡啶(0.75 mL)中，并且与L-半胱氨酸甲酯HCl(7.5 mg)一起在60℃下加热1.5小时，然后将邻甲苯异硫氰酸酯(30 uL)加入混合物中，并且在60ºC下加热另外1.5小时。反应混合物的HPLC分析通过Phenomenex Luna柱[C18，150 x 4.6 mm(5u)]，使用流动相25%乙腈-0.2% TFA水，1 mL/分钟在250 nm的UV检测下执行。糖被鉴定为D-葡萄糖(tR，12.72)[真实样品，D-葡萄糖(tR，12.64)和L-葡萄糖(tR，11.48分钟)](Tanaka等人，2007)。

命名为R7-2的化合物得自莱鲍迪甙D3的酶促生物转化。R7-2的结构说明和完整的NMR光谱分配(¹H和¹³C)在广泛的1D和2D NMR以及高分辨率质谱数据和水解研究的基础上进行，这将结构提示为13-[(2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-6-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]对映-贝壳杉-16-烯-19-酸-[(2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基 -β-D-吡喃葡萄糖基)酯(图6)。

实施例5：通过酶促生物转化生产新型甜菊醇糖苷R6-1：

所有候选的UDP-葡萄糖基转移酶(UGT)基因的全长DNA片段是商业合成的。几乎所有的cDNA密码子都改变为大肠杆菌优选的密码子(Genscript，NJ)。将合成的DNA克隆到细菌表达载体pETite N-His SUMO Kan Vector(Lucigen)内。

将每个表达构建体转化到大肠杆菌BL21(DE3)内，所述大肠杆菌随后在含有50 μg/mL卡那霉素的LB培养基中，在37℃下生长直至达到0.8-1.0的OD₆₀₀。通过添加1 mM异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白质表达，并且使培养物在16℃下进一步生长22小时。通过离心(3,000 x g；10分钟；4℃)来收获细胞。收集细胞沉淀并立即使用或贮存于-80℃下。

通过使用莱鲍迪甙D(Reb D)作为底物，测定纯化的候选UGT重组多肽的糖基化活性。通常，重组多肽(50-100 µg)在200 µl体外反应系统中进行测试。反应系统含有50 mM磷酸钾缓冲液pH 7.2、3 mM MgCl₂、0.5 mg/ml Reb D底物、1 mM UDP-葡萄糖或UDP和/或蔗糖合酶(SUS)和250mM蔗糖。反应在30-37℃下执行，并且通过在不同时间点加入200 µL 1-丁醇来终止50 ul反应。样品用200 µL 1-丁醇提取3次。使合并的级分干燥，并且溶解于100 µL 80%甲醇中，用于高效液相层析(HPLC)分析。

然后使用Dionex UPLC ultimate 3000系统(Sunnyvale，CA)执行HPLC分析，所述系统包括四元泵、温控柱区室、自动进样器和UV吸光度检测器。具有保护柱的SynergiHydro-RP柱(Phenomenex)用于表征合并样品中的甜菊醇糖苷。流动相A为水，而流动相B为乙腈。HPLC分析中使用的检测波长为210nm。

在活性筛选后，发现HV1(SEQ ID NO: 3)具有产生R6-1甜菊醇糖苷的强活性(图9)。如图10中所示，HV1可以将Reb D转化为R6-1。在较长的反应时间(24小时，图10，小图C)后，可以产生更多的R6-1。

实施例6：通过LC-MS分析鉴定R6-1产生

化合物R6-1的分子式已基于其正高分辨率(HR)质谱推导为C₅₆H₉₀O₃₃，所述质谱显示在m/z 1291.5430下对应于[M+ H]⁺以及在m/z 1313.5245下对应于[M+ Na]⁺的加合物离子(图11)。R6-1的预测结构呈现于图9和12中。

实施例7：通过NMR分析R6-1的结构：

所产生的R6-1化合物通过如上所述的半制备型层析进行纯化。

高分辨率质谱数据用LTQ Orbitrap Discovery HRMS仪器生成，其分辨率设定为30k。在正离子电喷雾模式下从m/z 150到1500扫描数据。针电压设定为4 kV；其它源条件为鞘气 = 25，辅助气 = 0，吹扫气 = 5(所有气体流量均为任意单位)，毛细管电压 = 30V，毛细管温度 = 300℃以及管透镜电压 = 75。样品用吡啶稀释并注入50微升。

NMR光谱在Bruker Avance DRX 500 MHz或Varian INOVA 600 MHz仪器上使用标准脉冲序列获得。1D(¹H和¹³C)和2D(TOCSY、HSQC、ROESY和HMBC)NMR光谱在C₅D₅N中执行。

R6-1的分子式已基于其正高分辨率(HR)质谱推导为C₅₆H₉₀O₃₃，所述质谱显示在m/z1308.5693和1313.5236处分别对应于[M+ NH₄]⁺和[M+Na]⁺离子的加合物；这一组成得到¹³CNMR光谱数据的支持。R6-1的¹H NMR光谱显示了存在在δ 1.12和1.48处的两个sp3甲基单峰；作为环外双键的在δ 5.01和5.64处的单峰的两个烯属质子；对于较早从甜菊属中分离的对映-贝壳杉烷二萜特征性的、在δ 0.74-2.87之间的9个sp3亚甲基和两个sp3次甲基质子。对映-贝壳杉烷二萜的基础骨架得到TOCSY(H-1/H-2；H-2/H-3；H-5/H-6；H-6/H-7；H-9/H-11；H-11/H-12)和HMBC(H-1/C-2、C-10；H-3/C-1、C-2、C-4、C-5、C-18、C-19；H-5/C-4、C-6、C-7、C-9、C-10、C-18、C-19、C-20；H-9/C-8、C-10、C-11、C-12、C-14、C-15； H-14/C-8、C-9、C-13、C-15、C-16和H-17/C-13、C-15、C-16)相关性的支持。

R6-1用5% H₂SO₄的酸水解得到D-葡萄糖，其通过TLC与真实样品的直接比较进行鉴定，提示了在其分子结构中存在六个吡喃葡萄糖基部分(Bedir等人，2001；Chaturvedula等人，2003；以及Huan等人，1998)。R6-1的酶促水解提供了化合物，基于NMR光谱数据发现所述化合物与甜菊醇等同(Ohtani等人，1992)。通过用L-半胱氨酸甲酯和邻甲苯基异硫氰酸酯制备其相应的硫代氨基甲酰基-噻唑烷羧酸酯衍生物，并且如文献比较(Tanaka等人，2007)中所述的比较其与标准糖的保留时间，来鉴定D-葡萄糖的构型。基于来自R6-1的NMR光谱数据的结果，得出结论，在其结构中存在六个葡萄糖基单元，这得到R6-1的¹H NMR光谱的支持，所述光谱显示了在δ 5.04、5.05、5.24、5.37、5.57和6.36处共振的异头质子的存在；提示了在其分子结构中的六个糖单元。¹H和¹³C NMR光谱与莱鲍迪甙D的密切比较提示了，化合物R6-1也是甜菊醇糖苷，其具有作为醚作为2,3-支链的葡萄糖三糖基取代基在C-13羟基处附着的三个葡萄糖残基、以及作为酯在C-19处的2-取代的葡萄糖二糖基(glucobiosyl)部分，留下另外的葡萄糖基部分的分配。图13中显示的关键TOCSY和HMBC相关性提示了第六个葡萄糖基部分在糖V的C-2位置处的放置。

对于在δ 5.04(d，J=7.6 Hz)、5.05(d，J=7.4 Hz)、5.24(d，J=7.6 Hz)、5.37(d，J=7.4 Hz)、5.57(d，J=7.7 Hz)和6.36(d，J=7.6 Hz)处的葡萄糖部分的六个异头质子观察到的大偶合常数，提示了其如对于甜菊醇糖苷报告的β-取向。

关于R6-1中的所有质子和碳的¹H和¹³C NMR值基于TOCSY、HMQC和HMBC相关性进行分配，并且在表2中给出。

基于NMR和HR质谱数据以及水解研究的结果，通过莱鲍迪甙D的酶促转化产生的R6-1的结构推导为13-[(2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]对映-贝壳杉-16-烯-19-酸-[(2-O-{2-O-β-D-吡喃葡萄糖基}-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)酯(图12)。

通过将pH维持在4.5下，将R6-1(250 μg)溶解于2.5 ml 0.1 M乙酸钠缓冲液中，并且加入50 uL来自黑曲霉的粗制果胶酶(Sigma-Aldrich)。将混合物在50℃下搅拌48小时，并且过滤在反应过程中沉淀出的产物，然后结晶。通过比较其¹H NMR光谱数据，将获得的所得到的产物鉴定为甜菊醇(Ohtani等人，1992)。

将R6-1(500 μg)溶解于MeOH(3 ml)中，并且加入5% H₂SO₄(10 mL)。使混合物回流16小时，冷却至室温，然后用饱和碳酸钠中和。水相用乙酸乙酯(EtOAc，2 x 15 ml)提取，并且将水层浓缩，并且使用TLC系统EtOAc/正丁醇/水(2:7:1)和CH₂Cl₂/MeOH/水(10:6:1)(Bedir等人，2001；Chaturvedula等人，2003；Huan等人，1998)，与标准糖进行比较；R6-1中的糖被鉴定为D-葡萄糖。

R6-1(500 μg)用0.5 M HCl(0.5 mL)水解1.5小时。在冷却后，使混合物通过Amberlite IRA400柱，并且使洗脱物冻干。将残渣溶解于吡啶(0.25 mL)中，并且与L-半胱氨酸甲酯HCl(2.5 mg)一起在60℃下加热1.5小时，然后将邻甲苯异硫氰酸酯(12.5 uL)加入混合物中，并且在60ºC下加热另外1.5小时。反应混合物的HPLC分析通过PhenomenexLuna柱[C18，150 x 4.6 mm(5u)]，使用流动相25%乙腈-0.2% TFA水，1 mL/分钟在250 nm的UV检测下执行。糖被鉴定为D-葡萄糖(tR，12.64)[真实样品，D-葡萄糖(tR，12.54)和L-葡萄糖(tR，11.42分钟)](Tanaka等人，2007)。

R6-1的完整的¹H和¹³C NMR光谱分配在广泛的1D和2D NMR以及高分辨率质谱数据和水解的基础上进行，这将结构提示为13-[(2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]对映-贝壳杉-16-烯-19-酸-[(2-O-{2-O-β-D-吡喃葡萄糖基}-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)酯(图12)。

实施例8：通过酶促生物转化生产甜菊醇糖苷莱鲍迪甙R6-4A和莱鲍迪甙R6-4B。

通过使用莱鲍迪甙Z(Reb Z1和Reb Z2的混合物)作为底物，测定纯化的候选UGT重组多肽的糖基化活性。通常，重组多肽(10-50 µg)在200 µl体外反应系统中进行测试。反应系统含有50 mM磷酸钾缓冲液pH 7.2、3 mM MgCl₂、1 mg/ml Reb Z底物、1 mM UDP-葡萄糖或UDP和/或蔗糖合酶(SUS)和250mM蔗糖。反应在30-37℃下执行，并且通过在不同时间点加入200 µL 1-丁醇来终止50 ul反应。样品用200 µL 1-丁醇提取3次。使合并的级分干燥，并且溶解于100 µL 80%甲醇中，用于高效液相层析(HPLC)分析。

然后使用Dionex UPLC ultimate 3000系统(Sunnyvale，CA)执行HPLC分析，所述系统包括四元泵、温控柱区室、自动进样器和UV吸光度检测器。具有保护柱的SynergiHydro-RP柱(Phenomenex)用于表征合并样品中的甜菊醇糖苷。乙腈和水用于HPLC分析中的流动溶液。HPLC分析中使用的检测波长为210nm。

在活性筛选后，发现HV1(SEQ ID NO: 3)具有产生R6-4甜菊醇糖苷的强活性(图14)。如图15中所示，HV1可以将Reb Z转化为R6-4。更多的R6-4可以在稍后的反应时间产生(图15，小图C)。

实施例9：通过LC-MS分析鉴定R6-4产生

化合物R6-4的分子式已基于其正高分辨率(HR)质谱推导为C₅₆H₉₀O₃₃，所述质谱显示在m/z 1313.5242下对应于[M+ Na]+的加合物离子(图16)。R6-4A和R6-4B的预测结构呈现于图14和17中。

实施例10：通过NMR分析R6-4的结构：

所产生的R6-4化合物通过如上所述的半制备型层析进行纯化。

R6-4化合物的分子式已基于其正高分辨率(HR)质谱推导为C₅₆H₉₀O₃₃，所述质谱显示在m/z 1308.5692和1313.5237下分别对应于[M+ NH₄]⁺和[M+Na]⁺离子的加合物，并且这一组成得到¹³C NMR光谱数据的支持。R6-4的NMR光谱数据和HPLC指示了，该化合物是比率约70:30的两种主要化合物R6-4A和R6-4B的混合物，因此R6-4的¹H和¹³C NMR光谱数据显示了关于其分子结构中存在的大多数质子和碳的两个峰。R6-4的¹H NMR光谱显示了存在两个sp3甲基单峰，作为环外双键的单峰的两个烯属质子，对于较早从甜菊属中分离的对映-贝壳杉烷二萜特征性的、在之间的9个sp3亚甲基和两个sp3次甲基质子。R6-4的酶促水解提供了化合物，基于NMR光谱数据发现所述化合物与甜菊醇等同(Ohtani等人，1992)。R6-4用5%H₂SO₄的酸水解得到D-葡萄糖，其通过TLC与真实样品的直接比较进行鉴定，提示了在其分子结构中存在六个吡喃葡萄糖基部分(Bedir等人，2001；Chaturvedula等人，2003；以及Huan等人，1998)。通过用L-半胱氨酸甲酯和邻甲苯基异硫氰酸酯制备其相应的硫代氨基甲酰基-噻唑烷羧酸酯衍生物，并且如文献比较(Tanaka等人，2007)中所述的比较其与标准糖的保留时间，来鉴定D-葡萄糖的构型。基于来自NMR光谱数据和水解研究的结果，得出结论，在R6-4的分子结构中存在六个葡萄糖基单元，这得到¹H NMR光谱的支持，所述光谱显示了在δ5.03-6.44之间共振的六个异头质子。进一步地，对于葡萄糖基部分的所有六个异头质子观察到的大偶合常数，提示了其如对于甜菊醇糖苷报告的β-取向。

关于化合物R6-4A和R6-4B的所有质子和碳的¹H和¹³C NMR值基于TOCSY、HMQC、HMBC和ROESY相关性进行分配，并且在表3中给出。

与莱鲍迪甙Z(Reb Z1和Reb Z2的混合物)的¹H和¹³C NMR光谱以及来自关键的TOCSY、ROESY和HMBC相关性的密切比较，提示了R6-4化合物是两种甜菊醇糖苷的混合物，其中主要化合物具有作为醚在C-13羟基处附着的三个糖基单元以及作为酯在C-19处的另外三个糖基单元，如R6-4A中所示，而次要化合物具有在R6-4B中表示的、作为醚在C-13羟基处附着的两个糖基单元以及作为酯在C-19处的四个糖基单元。

基于NMR和HR质谱数据以及水解研究的结果，通过莱鲍迪甙Z(其为两种主要化合物的混合物)的酶促转化产生的R6-4的结构推导为13-[(2-O-{2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基}-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]对映-贝壳杉-16-烯-19-酸-[(2-O-{2-O-β-D-吡喃葡萄糖基}-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)酯(R6-4A)、或13-[(2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]对映-贝壳杉-16-烯-19-酸-[(2-O-[(2-O-{2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基}-β-D-吡喃葡萄糖基)-β-D-吡喃葡萄糖基)酯(R6-4B)(图17)。

通过将pH维持在4.5下，将R6-4化合物(1 mg)溶解于10 ml 0.1 M乙酸钠缓冲液中，并且加入250 uL来自黑曲霉的粗制果胶酶(Sigma-Aldrich)。将混合物在50℃下搅拌48小时，并且过滤在反应过程中沉淀出的产物，然后固化。通过比较其¹H NMR光谱数据和共TLC，将获得的所得到的产物鉴定为甜菊醇(Ohtani等人，1992)。

将R6-4化合物(500 μg)溶解于MeOH(5 ml)中，并且加入5% H₂SO₄(15 mL)。使混合物回流24小时，冷却至室温，然后用饱和碳酸钠中和。水相用乙酸乙酯(EtOAc，2 x 25 ml)提取，并且将水层浓缩，并且使用TLC系统EtOAc/正丁醇/水(2:7:1)和CH₂Cl₂/MeOH/水(10:6:1)(Bedir等人，2001；Chaturvedula等人，2003；Huan等人，1998)，与标准糖进行比较；R6-4中的糖被鉴定为D-葡萄糖。

R6-4化合物(1 mg)用0.5 M HCl(2 mL)水解1.5小时。在冷却后，使混合物通过Amberlite IRA400柱，并且使洗脱物冻干。将残渣溶解于吡啶(0.75 mL)中，并且与L-半胱氨酸甲酯HCl(5 mg)一起在60℃下加热1.5小时，然后将邻甲苯异硫氰酸酯(30 μL)加入混合物中，并且在60ºC下加热另外1.5小时。反应混合物的HPLC分析通过Phenomenex Luna柱[C18，150 x 4.6 mm(5u)]，使用流动相25%乙腈-0.2% TFA水，1 mL/分钟在250 nm的UV检测下执行。糖被鉴定为D-葡萄糖(tR，12.38)[真实样品，D-葡萄糖(tR，12.44)和L-葡萄糖(tR，11.30分钟)](Tanaka等人，2007)。

序列：

UGT76G1：氨基酸序列(SEQ ID NO: 1)

MENKTETTVRRRRRIILFPVPFQGHINPILQLANVLYSKGFSITIFHTNFNKPKTSNYPHFTFRFILDNDPQDERISNLPTHGPLAGMRIPIINEHGADELRRELELLMLASEEDEEVSCLITDALWYFAQSVADSLNLRRLVLMTSSLFNFHAHVSLPQFDELGYLDPDDKTRLEEQASGFPMLKVKDIKSAYSNWQILKEILGKMIKQTKASSGVIWNSFKELEESELETVIREIPAPSFLIPLPKHLTASSSSLLDHDRTVFQWLDQQPPSSVLYVSFGSTSEVDEKDFLEIARGLVDSKQSFLWVVRPGFVKGSTWVEPLPDGFLGERGRIVKWVPQQEVLAHGAIGAFWTHSGWNSTLESVCEGVPMIFSDFGLDQPLNARYMSDVLKVGVYLENGWERGEIANAIRRVMVDEEGEYIRQNARVLKQKADVSLMKGGSSYESLESLVSYISSL

UGT76G1：DNA序列(SEQ ID NO: 2)

ATGGAGAATAAGACAGAAACAACCGTAAGACGGAGGCGGAGGATTATCTTGTTCCCTGTACCATTTCAGGGCCATATTAATCCGATCCTCCAATTAGCAAACGTCCTCTACTCCAAGGGATTTTCAATAACAATCTTCCATACTAACTTTAACAAGCCTAAAACGAGTAATTATCCTCACTTTACATTCAGGTTCATTCTAGACAACGACCCTCAGGATGAGCGTATCTCAAATTTACCTACGCATGGCCCCTTGGCAGGTATGCGAATACCAATAATCAATGAGCATGGAGCCGATGAACTCCGTCGCGAGTTAGAGCTTCTCATGCTCGCAAGTGAGGAAGACGAGGAAGTTTCGTGCCTAATAACTGATGCGCTTTGGTACTTCGCCCAATCAGTCGCAGACTCACTGAATCTACGCCGTTTGGTCCTTATGACAAGTTCATTATTCAACTTTCACGCACATGTATCACTGCCGCAATTTGACGAGTTGGGTTACCTGGACCCGGATGACAAAACGCGATTGGAGGAACAAGCGTCGGGCTTCCCCATGCTGAAAGTCAAAGATATTAAGAGCGCTTATAGTAATTGGCAAATTCTGAAAGAAATTCTCGGAAAAATGATAAAGCAAACCAAAGCGTCCTCTGGAGTAATCTGGAACTCCTTCAAGGAGTTAGAGGAATCTGAACTTGAAACGGTCATCAGAGAAATCCCCGCTCCCTCGTTCTTAATTCCACTACCCAAGCACCTTACTGCAAGTAGCAGTTCCCTCCTAGATCATGACCGAACCGTGTTTCAGTGGCTGGATCAGCAACCCCCGTCGTCAGTTCTATATGTAAGCTTTGGGAGTACTTCGGAAGTGGATGAAAAGGACTTCTTAGAGATTGCGCGAGGGCTCGTGGATAGCAAACAGAGCTTCCTGTGGGTAGTGAGACCGGGATTCGTTAAGGGCTCGACGTGGGTCGAGCCGTTGCCAGATGGTTTTCTAGGGGAGAGAGGGAGAATCGTGAAATGGGTTCCACAGCAAGAGGTTTTGGCTCACGGAGCTATAGGGGCCTTTTGGACCCACTCTGGTTGGAATTCTACTCTTGAAAGTGTCTGTGAAGGCGTTCCAATGATATTTTCTGATTTTGGGCTTGACCAGCCTCTAAACGCTCGCTATATGTCTGATGTGTTGAAGGTTGGCGTGTACCTGGAGAATGGTTGGGAAAGGGGGGAAATTGCCAACGCCATACGCCGGGTAATGGTGGACGAGGAAGGTGAGTACATACGTCAGAACGCTCGGGTTTTAAAACAAAAAGCGGACGTCAGCCTTATGAAGGGAGGTAGCTCCTATGAATCCCTAGAATCCTTGGTAAGCTATATATCTTCGTTATAA

HV1 UDP-糖基转移酶：氨基酸序列(SEQ ID NO: 3)

MDGNSSSSPLHVVICPWLALGHLLPCLDIAERLASRGHRVSFVSTPRNIARLPPLRPAVAPLVDFVALPLPHVDGLPEGAESTNDVPYDKFELHRKAFDGLAAPFSEFLRAACAEGAGSRPDWLIVDTFHHWAAAAAVENKVPCVMLLLGAATVIAGFARGVSEHAAAAVGKERPAAEAPSFETERRKLMTTQNASGMTVAERYFLTLMRSDLVAIRSCAEWEPESVAALTTLAGKPVVPLGLLPPSPEGGRGVSKEDAAVRWLDAQPAKSVVYVALGSEVPLRAEQVHELALGLELSGARFLWALRKPTDAPDAAVLPPGFEERTRGRGLVVTGWVPQIGVLAHGAVAAFLTHCGWNSTIEGLLFGHPLIMLPISSDQGPNARLMEGRKVGMQVPRDESDGSFRREDVAATVRAVAVEEDGRRVFTANAKKMQEIVADGACHERCIDGFIQQLRSYKA

HV1 UDP-糖基转移酶：DNA序列(SEQ ID NO：4)

ATGGATGGTAACTCCTCCTCCTCGCCGCTGCATGTGGTCATTTGTCCGTGGCTGGCTCTGGGTCACCTGCTGCCGTGTCTGGATATTGCTGAACGTCTGGCGTCACGCGGCCATCGTGTCAGTTTTGTGTCCACCCCGCGCAACATTGCCCGTCTGCCGCCGCTGCGTCCGGCTGTTGCACCGCTGGTTGATTTCGTCGCACTGCCGCTGCCGCATGTTGACGGTCTGCCGGAGGGTGCGGAATCGACCAATGATGTGCCGTATGACAAATTTGAACTGCACCGTAAGGCGTTCGATGGTCTGGCGGCCCCGTTTAGCGAATTTCTGCGTGCAGCTTGCGCAGAAGGTGCAGGTTCTCGCCCGGATTGGCTGATTGTGGACACCTTTCATCACTGGGCGGCGGCGGCGGCGGTGGAAAACAAAGTGCCGTGTGTTATGCTGCTGCTGGGTGCAGCAACGGTGATCGCTGGTTTCGCGCGTGGTGTTAGCGAACATGCGGCGGCGGCGGTGGGTAAAGAACGTCCGGCTGCGGAAGCCCCGAGTTTTGAAACCGAACGTCGCAAGCTGATGACCACGCAGAATGCCTCCGGCATGACCGTGGCAGAACGCTATTTCCTGACGCTGATGCGTAGCGATCTGGTTGCCATCCGCTCTTGCGCAGAATGGGAACCGGAAAGCGTGGCAGCACTGACCACGCTGGCAGGTAAACCGGTGGTTCCGCTGGGTCTGCTGCCGCCGAGTCCGGAAGGCGGTCGTGGCGTTTCCAAAGAAGATGCTGCGGTCCGTTGGCTGGACGCACAGCCGGCAAAGTCAGTCGTGTACGTCGCACTGGGTTCGGAAGTGCCGCTGCGTGCGGAACAAGTTCACGAACTGGCACTGGGCCTGGAACTGAGCGGTGCTCGCTTTCTGTGGGCGCTGCGTAAACCGACCGATGCACCGGACGCCGCAGTGCTGCCGCCGGGTTTCGAAGAACGTACCCGCGGCCGTGGTCTGGTTGTCACGGGTTGGGTGCCGCAGATTGGCGTTCTGGCTCATGGTGCGGTGGCTGCGTTTCTGACCCACTGTGGCTGGAACTCTACGATCGAAGGCCTGCTGTTCGGTCATCCGCTGATTATGCTGCCGATCAGCTCTGATCAGGGTCCGAATGCGCGCCTGATGGAAGGCCGTAAAGTCGGTATGCAAGTGCCGCGTGATGAATCAGACGGCTCGTTTCGTCGCGAAGATGTTGCCGCAACCGTCCGCGCCGTGGCAGTTGAAGAAGACGGTCGTCGCGTCTTCACGGCTAACGCGAAAAAGATGCAAGAAATTGTGGCCGATGGCGCATGCCACGAACGTTGTATTGACGGTTTTATCCAGCAACTGCGCAGTTACAAGGCGTAA

UGT76G1-蔗糖合酶(SUS)融合酶：氨基酸序列(SEQ ID NO：5)

MENKTETTVRRRRRIILFPVPFQGHINPILQLANVLYSKGFSITIFHTNFNKPKTSNYPHFTFRFILDNDPQDERISNLPTHGPLAGMRIPIINEHGADELRRELELLMLASEEDEEVSCLITDALWYFAQSVADSLNLRRLVLMTSSLFNFHAHVSLPQFDELGYLDPDDKTRLEEQASGFPMLKVKDIKSAYSNWQILKEILGKMIKQTKASSGVIWNSFKELEESELETVIREIPAPSFLIPLPKHLTASSSSLLDHDRTVFQWLDQQPPSSVLYVSFGSTSEVDEKDFLEIARGLVDSKQSFLWVVRPGFVKGSTWVEPLPDGFLGERGRIVKWVPQQEVLAHGAIGAFWTHSGWNSTLESVCEGVPMIFSDFGLDQPLNARYMSDVLKVGVYLENGWERGEIANAIRRVMVDEEGEYIRQNARVLKQKADVSLMKGGSSYESLESLVSYISSLGSGANAERMITRVHSQRERLNETLVSERNEVLALLSRVEAKGKGILQQNQIIAEFEALPEQTRKKLEGGPFFDLLKSTQEAIVLPPWVALAVRPRPGVWEYLRVNLHALVVEELQPAEFLHFKEELVDGVKNGNFTLELDFEPFNASIPRPTLHKYIGNGVDFLNRHLSAKLFHDKESLLPLLKFLRLHSHQGKNLMLSEKIQNLNTLQHTLRKAEEYLAELKSETLYEEFEAKFEEIGLERGWGDNAERVLDMIRLLLDLLEAPDPCTLETFLGRVPMVFNVVILSPHGYFAQDNVLGYPDTGGQVVYILDQVRALEIEMLQRIKQQGLNIKPRILILTRLLPDAVGTTCGERLERVYDSEYCDILRVPFRTEKGIVRKWISRFEVWPYLETYTEDAAVELSKELNGKPDLIIGNYSDGNLVASLLAHKLGVTQCTIAHALEKTKYPDSDIYWKKLDDKYHFSCQFTADIFAMNHTDFIITSTFQEIAGSKETVGQYESHTAFTLPGLYRVVHGIDVFDPKFNIVSPGADMSIYFPYTEEKRRLTKFHSEIEELLYSDVENKEHLCVLKDKKKPILFTMARLDRVKNLSGLVEWYGKNTRLRELANLVVVGGDRRKESKDNEEKAEMKKMYDLIEEYKLNGQFRWISSQMDRVRNGELYRYICDTKGAFVQPALYEAFGLTVVEAMTCGLPTFATCKGGPAEIIVHGKSGFHIDPYHGDQAADTLADFFTKCKEDPSHWDEISKGGLQRIEEKYTWQIYSQRLLTLTGVYGFWKHVSNLDRLEARRYLEMFYALKYRPLAQAVPLAQDD

UGT76G1-蔗糖合酶(SUS)融合酶：DNA序列(SEQ ID NO：6)

ATGGAGAATAAGACAGAAACAACCGTAAGACGGAGGCGGAGGATTATCTTGTTCCCTGTACCATTTCAGGGCCATATTAATCCGATCCTCCAATTAGCAAACGTCCTCTACTCCAAGGGATTTTCAATAACAATCTTCCATACTAACTTTAACAAGCCTAAAACGAGTAATTATCCTCACTTTACATTCAGGTTCATTCTAGACAACGACCCTCAGGATGAGCGTATCTCAAATTTACCTACGCATGGCCCCTTGGCAGGTATGCGAATACCAATAATCAATGAGCATGGAGCCGATGAACTCCGTCGCGAGTTAGAGCTTCTCATGCTCGCAAGTGAGGAAGACGAGGAAGTTTCGTGCCTAATAACTGATGCGCTTTGGTACTTCGCCCAATCAGTCGCAGACTCACTGAATCTACGCCGTTTGGTCCTTATGACAAGTTCATTATTCAACTTTCACGCACATGTATCACTGCCGCAATTTGACGAGTTGGGTTACCTGGACCCGGATGACAAAACGCGATTGGAGGAACAAGCGTCGGGCTTCCCCATGCTGAAAGTCAAAGATATTAAGAGCGCTTATAGTAATTGGCAAATTCTGAAAGAAATTCTCGGAAAAATGATAAAGCAAACCAAAGCGTCCTCTGGAGTAATCTGGAACTCCTTCAAGGAGTTAGAGGAATCTGAACTTGAAACGGTCATCAGAGAAATCCCCGCTCCCTCGTTCTTAATTCCACTACCCAAGCACCTTACTGCAAGTAGCAGTTCCCTCCTAGATCATGACCGAACCGTGTTTCAGTGGCTGGATCAGCAACCCCCGTCGTCAGTTCTATATGTAAGCTTTGGGAGTACTTCGGAAGTGGATGAAAAGGACTTCTTAGAGATTGCGCGAGGGCTCGTGGATAGCAAACAGAGCTTCCTGTGGGTAGTGAGACCGGGATTCGTTAAGGGCTCGACGTGGGTCGAGCCGTTGCCAGATGGTTTTCTAGGGGAGAGAGGGAGAATCGTGAAATGGGTTCCACAGCAAGAGGTTTTGGCTCACGGAGCTATAGGGGCCTTTTGGACCCACTCTGGTTGGAATTCTACTCTTGAAAGTGTCTGTGAAGGCGTTCCAATGATATTTTCTGATTTTGGGCTTGACCAGCCTCTAAACGCTCGCTATATGTCTGATGTGTTGAAGGTTGGCGTGTACCTGGAGAATGGTTGGGAAAGGGGGGAAATTGCCAACGCCATACGCCGGGTAATGGTGGACGAGGAAGGTGAGTACATACGTCAGAACGCTCGGGTTTTAAAACAAAAAGCGGACGTCAGCCTTATGAAGGGAGGTAGCTCCTATGAATCCCTAGAATCCTTGGTAAGCTATATATCTTCGTTAGGTTCTGGTGCAAACGCTGAACGTATGATAACGCGCGTCCACAGCCAACGTGAGCGTTTGAACGAAACGCTTGTTTCTGAGAGAAACGAAGTCCTTGCCTTGCTTTCCAGGGTTGAAGCCAAAGGTAAAGGTATTTTACAACAAAACCAGATCATTGCTGAATTCGAAGCTTTGCCTGAACAAACCCGGAAGAAACTTGAAGGTGGTCCTTTCTTTGACCTTCTCAAATCCACTCAGGAAGCAATTGTGTTGCCACCATGGGTTGCTCTAGCTGTGAGGCCAAGGCCTGGTGTTTGGGAATACTTACGAGTCAATCTCCATGCTCTTGTCGTTGAAGAACTCCAACCTGCTGAGTTTCTTCATTTCAAGGAAGAACTCGTTGATGGAGTTAAGAATGGTAATTTCACTCTTGAGCTTGATTTCGAGCCATTCAATGCGTCTATCCCTCGTCCAACACTCCACAAATACATTGGAAATGGTGTTGACTTCCTTAACCGTCATTTATCGGCTAAGCTCTTCCATGACAAGGAGAGTTTGCTTCCATTGCTTAAGTTCCTTCGTCTTCACAGCCACCAGGGCAAGAACCTGATGTTGAGCGAGAAGATTCAGAACCTCAACACTCTGCAACACACCTTGAGGAAAGCAGAAGAGTATCTAGCAGAGCTTAAGTCCGAAACACTGTATGAAGAGTTTGAGGCCAAGTTTGAGGAGATTGGTCTTGAGAGGGGATGGGGAGACAATGCAGAGCGTGTCCTTGACATGATACGTCTTCTTTTGGACCTTCTTGAGGCGCCTGATCCTTGCACTCTTGAGACTTTTCTTGGAAGAGTACCAATGGTGTTCAACGTTGTGATCCTCTCTCCACATGGTTACTTTGCTCAGGACAATGTTCTTGGTTACCCTGACACTGGTGGACAGGTTGTTTACATTCTTGATCAAGTTCGTGCTCTGGAGATAGAGATGCTTCAACGTATTAAGCAACAAGGACTCAACATTAAACCAAGGATTCTCATTCTAACTCGACTTCTACCTGATGCGGTAGGAACTACATGCGGTGAACGTCTCGAGAGAGTTTATGATTCTGAGTACTGTGATATTCTTCGTGTGCCCTTCAGAACAGAGAAGGGTATTGTTCGCAAATGGATCTCAAGGTTCGAAGTCTGGCCATATCTAGAGACTTACACCGAGGATGCTGCGGTTGAGCTATCGAAAGAATTGAATGGCAAGCCTGACCTTATCATTGGTAACTACAGTGATGGAAATCTTGTTGCTTCTTTATTGGCTCACAAACTTGGTGTCACTCAGTGTACCATTGCTCATGCTCTTGAGAAAACAAAGTACCCGGATTCTGATATCTACTGGAAGAAGCTTGACGACAAGTACCATTTCTCATGCCAGTTCACTGCGGATATTTTCGCAATGAACCACACTGATTTCATCATCACTAGTACTTTCCAAGAAATTGCTGGAAGCAAAGAAACTGTTGGGCAGTATGAAAGCCACACAGCCTTTACTCTTCCCGGATTGTATCGAGTTGTTCACGGGATTGATGTGTTTGATCCCAAGTTCAACATTGTCTCTCCTGGTGCTGATATGAGCATCTACTTCCCTTACACAGAGGAGAAGCGTAGATTGACTAAGTTCCACTCTGAGATCGAGGAGCTCCTCTACAGCGATGTTGAGAACAAAGAGCACTTATGTGTGCTCAAGGACAAGAAGAAGCCGATTCTCTTCACAATGGCTAGGCTTGATCGTGTCAAGAACTTGTCAGGTCTTGTTGAGTGGTACGGGAAGAACACCCGCTTGCGTGAGCTAGCTAACTTGGTTGTTGTTGGAGGAGACAGGAGGAAAGAGTCAAAGGACAATGAAGAGAAAGCAGAGATGAAGAAAATGTATGATCTCATTGAGGAATACAAGCTAAACGGTCAGTTCAGGTGGATCTCCTCTCAGATGGACCGGGTAAGGAACGGTGAGCTGTACCGGTACATCTGTGACACCAAGGGTGCTTTTGTCCAACCTGCATTATATGAAGCCTTTGGGTTAACTGTTGTGGAGGCTATGACTTGTGGTTTACCGACTTTCGCCACTTGCAAAGGTGGTCCAGCTGAGATCATTGTGCACGGTAAATCGGGTTTCCACATTGACCCTTACCATGGTGATCAGGCTGCTGATACTCTTGCTGATTTCTTCACCAAGTGTAAGGAGGATCCATCTCACTGGGATGAGATCTCAAAAGGAGGGCTTCAGAGGATTGAGGAGAAATACACTTGGCAAATCTATTCACAGAGGCTCTTGACATTGACTGGTGTGTATGGATTCTGGAAGCATGTCTCGAACCTTGACCGTCTTGAGGCTCGCCGTTACCTTGAAATGTTCTATGCATTGAAGTATCGCCCATTGGCTCAGGCTGTTCCTCTTGCACAAGATGATTGA

HV1-SUS融合酶：氨基酸序列(SEQ ID NO：7)

MDGNSSSSPLHVVICPWLALGHLLPCLDIAERLASRGHRVSFVSTPRNIARLPPLRPAVAPLVDFVALPLPHVDGLPEGAESTNDVPYDKFELHRKAFDGLAAPFSEFLRAACAEGAGSRPDWLIVDTFHHWAAAAAVENKVPCVMLLLGAATVIAGFARGVSEHAAAAVGKERPAAEAPSFETERRKLMTTQNASGMTVAERYFLTLMRSDLVAIRSCAEWEPESVAALTTLAGKPVVPLGLLPPSPEGGRGVSKEDAAVRWLDAQPAKSVVYVALGSEVPLRAEQVHELALGLELSGARFLWALRKPTDAPDAAVLPPGFEERTRGRGLVVTGWVPQIGVLAHGAVAAFLTHCGWNSTIEGLLFGHPLIMLPISSDQGPNARLMEGRKVGMQVPRDESDGSFRREDVAATVRAVAVEEDGRRVFTANAKKMQEIVADGACHERCIDGFIQQLRSYKAGSGANAERMITRVHSQRERLNETLVSERNEVLALLSRVEAKGKGILQQNQIIAEFEALPEQTRKKLEGGPFFDLLKSTQEAIVLPPWVALAVRPRPGVWEYLRVNLHALVVEELQPAEFLHFKEELVDGVKNGNFTLELDFEPFNASIPRPTLHKYIGNGVDFLNRHLSAKLFHDKESLLPLLKFLRLHSHQGKNLMLSEKIQNLNTLQHTLRKAEEYLAELKSETLYEEFEAKFEEIGLERGWGDNAERVLDMIRLLLDLLEAPDPCTLETFLGRVPMVFNVVILSPHGYFAQDNVLGYPDTGGQVVYILDQVRALEIEMLQRIKQQGLNIKPRILILTRLLPDAVGTTCGERLERVYDSEYCDILRVPFRTEKGIVRKWISRFEVWPYLETYTEDAAVELSKELNGKPDLIIGNYSDGNLVASLLAHKLGVTQCTIAHALEKTKYPDSDIYWKKLDDKYHFSCQFTADIFAMNHTDFIITSTFQEIAGSKETVGQYESHTAFTLPGLYRVVHGIDVFDPKFNIVSPGADMSIYFPYTEEKRRLTKFHSEIEELLYSDVENKEHLCVLKDKKKPILFTMARLDRVKNLSGLVEWYGKNTRLRELANLVVVGGDRRKESKDNEEKAEMKKMYDLIEEYKLNGQFRWISSQMDRVRNGELYRYICDTKGAFVQPALYEAFGLTVVEAMTCGLPTFATCKGGPAEIIVHGKSGFHIDPYHGDQAADTLADFFTKCKEDPSHWDEISKGGLQRIEEKYTWQIYSQRLLTLTGVYGFWKHVSNLDRLEARRYLEMFYALKYRPLAQAVPLAQDD

HV1-SUS融合酶：DNA序列(SEQ ID NO：8)

ATGGATGGTAACTCCTCCTCCTCGCCGCTGCATGTGGTCATTTGTCCGTGGCTGGCTCTGGGTCACCTGCTGCCGTGTCTGGATATTGCTGAACGTCTGGCGTCACGCGGCCATCGTGTCAGTTTTGTGTCCACCCCGCGCAACATTGCCCGTCTGCCGCCGCTGCGTCCGGCTGTTGCACCGCTGGTTGATTTCGTCGCACTGCCGCTGCCGCATGTTGACGGTCTGCCGGAGGGTGCGGAATCGACCAATGATGTGCCGTATGACAAATTTGAACTGCACCGTAAGGCGTTCGATGGTCTGGCGGCCCCGTTTAGCGAATTTCTGCGTGCAGCTTGCGCAGAAGGTGCAGGTTCTCGCCCGGATTGGCTGATTGTGGACACCTTTCATCACTGGGCGGCGGCGGCGGCGGTGGAAAACAAAGTGCCGTGTGTTATGCTGCTGCTGGGTGCAGCAACGGTGATCGCTGGTTTCGCGCGTGGTGTTAGCGAACATGCGGCGGCGGCGGTGGGTAAAGAACGTCCGGCTGCGGAAGCCCCGAGTTTTGAAACCGAACGTCGCAAGCTGATGACCACGCAGAATGCCTCCGGCATGACCGTGGCAGAACGCTATTTCCTGACGCTGATGCGTAGCGATCTGGTTGCCATCCGCTCTTGCGCAGAATGGGAACCGGAAAGCGTGGCAGCACTGACCACGCTGGCAGGTAAACCGGTGGTTCCGCTGGGTCTGCTGCCGCCGAGTCCGGAAGGCGGTCGTGGCGTTTCCAAAGAAGATGCTGCGGTCCGTTGGCTGGACGCACAGCCGGCAAAGTCAGTCGTGTACGTCGCACTGGGTTCGGAAGTGCCGCTGCGTGCGGAACAAGTTCACGAACTGGCACTGGGCCTGGAACTGAGCGGTGCTCGCTTTCTGTGGGCGCTGCGTAAACCGACCGATGCACCGGACGCCGCAGTGCTGCCGCCGGGTTTCGAAGAACGTACCCGCGGCCGTGGTCTGGTTGTCACGGGTTGGGTGCCGCAGATTGGCGTTCTGGCTCATGGTGCGGTGGCTGCGTTTCTGACCCACTGTGGCTGGAACTCTACGATCGAAGGCCTGCTGTTCGGTCATCCGCTGATTATGCTGCCGATCAGCTCTGATCAGGGTCCGAATGCGCGCCTGATGGAAGGCCGTAAAGTCGGTATGCAAGTGCCGCGTGATGAATCAGACGGCTCGTTTCGTCGCGAAGATGTTGCCGCAACCGTCCGCGCCGTGGCAGTTGAAGAAGACGGTCGTCGCGTCTTCACGGCTAACGCGAAAAAGATGCAAGAAATTGTGGCCGATGGCGCATGCCACGAACGTTGTATTGACGGTTTTATCCAGCAACTGCGCAGTTACAAGGCGGGTTCTGGTGCAAACGCTGAACGTATGATAACGCGCGTCCACAGCCAACGTGAGCGTTTGAACGAAACGCTTGTTTCTGAGAGAAACGAAGTCCTTGCCTTGCTTTCCAGGGTTGAAGCCAAAGGTAAAGGTATTTTACAACAAAACCAGATCATTGCTGAATTCGAAGCTTTGCCTGAACAAACCCGGAAGAAACTTGAAGGTGGTCCTTTCTTTGACCTTCTCAAATCCACTCAGGAAGCAATTGTGTTGCCACCATGGGTTGCTCTAGCTGTGAGGCCAAGGCCTGGTGTTTGGGAATACTTACGAGTCAATCTCCATGCTCTTGTCGTTGAAGAACTCCAACCTGCTGAGTTTCTTCATTTCAAGGAAGAACTCGTTGATGGAGTTAAGAATGGTAATTTCACTCTTGAGCTTGATTTCGAGCCATTCAATGCGTCTATCCCTCGTCCAACACTCCACAAATACATTGGAAATGGTGTTGACTTCCTTAACCGTCATTTATCGGCTAAGCTCTTCCATGACAAGGAGAGTTTGCTTCCATTGCTTAAGTTCCTTCGTCTTCACAGCCACCAGGGCAAGAACCTGATGTTGAGCGAGAAGATTCAGAACCTCAACACTCTGCAACACACCTTGAGGAAAGCAGAAGAGTATCTAGCAGAGCTTAAGTCCGAAACACTGTATGAAGAGTTTGAGGCCAAGTTTGAGGAGATTGGTCTTGAGAGGGGATGGGGAGACAATGCAGAGCGTGTCCTTGACATGATACGTCTTCTTTTGGACCTTCTTGAGGCGCCTGATCCTTGCACTCTTGAGACTTTTCTTGGAAGAGTACCAATGGTGTTCAACGTTGTGATCCTCTCTCCACATGGTTACTTTGCTCAGGACAATGTTCTTGGTTACCCTGACACTGGTGGACAGGTTGTTTACATTCTTGATCAAGTTCGTGCTCTGGAGATAGAGATGCTTCAACGTATTAAGCAACAAGGACTCAACATTAAACCAAGGATTCTCATTCTAACTCGACTTCTACCTGATGCGGTAGGAACTACATGCGGTGAACGTCTCGAGAGAGTTTATGATTCTGAGTACTGTGATATTCTTCGTGTGCCCTTCAGAACAGAGAAGGGTATTGTTCGCAAATGGATCTCAAGGTTCGAAGTCTGGCCATATCTAGAGACTTACACCGAGGATGCTGCGGTTGAGCTATCGAAAGAATTGAATGGCAAGCCTGACCTTATCATTGGTAACTACAGTGATGGAAATCTTGTTGCTTCTTTATTGGCTCACAAACTTGGTGTCACTCAGTGTACCATTGCTCATGCTCTTGAGAAAACAAAGTACCCGGATTCTGATATCTACTGGAAGAAGCTTGACGACAAGTACCATTTCTCATGCCAGTTCACTGCGGATATTTTCGCAATGAACCACACTGATTTCATCATCACTAGTACTTTCCAAGAAATTGCTGGAAGCAAAGAAACTGTTGGGCAGTATGAAAGCCACACAGCCTTTACTCTTCCCGGATTGTATCGAGTTGTTCACGGGATTGATGTGTTTGATCCCAAGTTCAACATTGTCTCTCCTGGTGCTGATATGAGCATCTACTTCCCTTACACAGAGGAGAAGCGTAGATTGACTAAGTTCCACTCTGAGATCGAGGAGCTCCTCTACAGCGATGTTGAGAACAAAGAGCACTTATGTGTGCTCAAGGACAAGAAGAAGCCGATTCTCTTCACAATGGCTAGGCTTGATCGTGTCAAGAACTTGTCAGGTCTTGTTGAGTGGTACGGGAAGAACACCCGCTTGCGTGAGCTAGCTAACTTGGTTGTTGTTGGAGGAGACAGGAGGAAAGAGTCAAAGGACAATGAAGAGAAAGCAGAGATGAAGAAAATGTATGATCTCATTGAGGAATACAAGCTAAACGGTCAGTTCAGGTGGATCTCCTCTCAGATGGACCGGGTAAGGAACGGTGAGCTGTACCGGTACATCTGTGACACCAAGGGTGCTTTTGTCCAACCTGCATTATATGAAGCCTTTGGGTTAACTGTTGTGGAGGCTATGACTTGTGGTTTACCGACTTTCGCCACTTGCAAAGGTGGTCCAGCTGAGATCATTGTGCACGGTAAATCGGGTTTCCACATTGACCCTTACCATGGTGATCAGGCTGCTGATACTCTTGCTGATTTCTTCACCAAGTGTAAGGAGGATCCATCTCACTGGGATGAGATCTCAAAAGGAGGGCTTCAGAGGATTGAGGAGAAATACACTTGGCAAATCTATTCACAGAGGCTCTTGACATTGACTGGTGTGTATGGATTCTGGAAGCATGTCTCGAACCTTGACCGTCTTGAGGCTCGCCGTTACCTTGAAATGTTCTATGCATTGAAGTATCGCCCATTGGCTCAGGCTGTTCCTCTTGCACAAGATGATTAA

拟南芥蔗糖合酶I：氨基酸序列(SEQ ID NO：9)

MANAERMITRVHSQRERLNETLVSERNEVLALLSRVEAKGKGILQQNQIIAEFEALPEQTRKKLEGGPFFDLLKSTQEAIVLPPWVALAVRPRPGVWEYLRVNLHALVVEELQPAEFLHFKEELVDGVKNGNFTLELDFEPFNASIPRPTLHKYIGNGVDFLNRHLSAKLFHDKESLLPLLKFLRLHSHQGKNLMLSEKIQNLNTLQHTLRKAEEYLAELKSETLYEEFEAKFEEIGLERGWGDNAERVLDMIRLLLDLLEAPDPCTLETFLGRVPMVFNVVILSPHGYFAQDNVLGYPDTGGQVVYILDQVRALEIEMLQRIKQQGLNIKPRILILTRLLPDAVGTTCGERLERVYDSEYCDILRVPFRTEKGIVRKWISRFEVWPYLETYTEDAAVELSKELNGKPDLIIGNYSDGNLVASLLAHKLGVTQCTIAHALEKTKYPDSDIYWKKLDDKYHFSCQFTADIFAMNHTDFIITSTFQEIAGSKETVGQYESHTAFTLPGLYRVVHGIDVFDPKFNIVSPGADMSIYFPYTEEKRRLTKFHSEIEELLYSDVENKEHLCVLKDKKKPILFTMARLDRVKNLSGLVEWYGKNTRLRELANLVVVGGDRRKESKDNEEKAEMKKMYDLIEEYKLNGQFRWISSQMDRVRNGELYRYICDTKGAFVQPALYEAFGLTVVEAMTCGLPTFATCKGGPAEIIVHGKSGFHIDPYHGDQAADTLADFFTKCKEDPSHWDEISKGGLQRIEEKYTWQIYSQRLLTLTGVYGFWKHVSNLDRLEARRYLEMFYALKYRPLAQAVPLAQDD

拟南芥蔗糖合酶I：DNA序列(SEQ ID NO：10)

ATGGCAAACGCTGAACGTATGATTACCCGTGTCCACTCCCAACGCGAACGCCTGAACGAAACCCTGGTGTCGGAACGCAACGAAGTTCTGGCACTGCTGAGCCGTGTGGAAGCTAAGGGCAAAGGTATTCTGCAGCAAAACCAGATTATCGCGGAATTTGAAGCCCTGCCGGAACAAACCCGCAAAAAGCTGGAAGGCGGTCCGTTTTTCGATCTGCTGAAATCTACGCAGGAAGCGATCGTTCTGCCGCCGTGGGTCGCACTGGCAGTGCGTCCGCGTCCGGGCGTTTGGGAATATCTGCGTGTCAACCTGCATGCACTGGTGGTTGAAGAACTGCAGCCGGCTGAATTTCTGCACTTCAAGGAAGAACTGGTTGACGGCGTCAAAAACGGTAATTTTACCCTGGAACTGGATTTTGAACCGTTCAATGCCAGTATCCCGCGTCCGACGCTGCATAAATATATTGGCAACGGTGTGGACTTTCTGAATCGCCATCTGAGCGCAAAGCTGTTCCACGATAAAGAATCTCTGCTGCCGCTGCTGAAATTCCTGCGTCTGCATAGTCACCAGGGCAAGAACCTGATGCTGTCCGAAAAAATTCAGAACCTGAATACCCTGCAACACACGCTGCGCAAGGCGGAAGAATACCTGGCCGAACTGAAAAGTGAAACCCTGTACGAAGAATTCGAAGCAAAGTTCGAAGAAATTGGCCTGGAACGTGGCTGGGGTGACAATGCTGAACGTGTTCTGGATATGATCCGTCTGCTGCTGGACCTGCTGGAAGCACCGGACCCGTGCACCCTGGAAACGTTTCTGGGTCGCGTGCCGATGGTTTTCAACGTCGTGATTCTGTCCCCGCATGGCTATTTTGCACAGGACAATGTGCTGGGTTACCCGGATACCGGCGGTCAGGTTGTCTATATTCTGGATCAAGTTCGTGCGCTGGAAATTGAAATGCTGCAGCGCATCAAGCAGCAAGGCCTGAACATCAAACCGCGTATTCTGATCCTGACCCGTCTGCTGCCGGATGCAGTTGGTACCACGTGCGGTGAACGTCTGGAACGCGTCTATGACAGCGAATACTGTGATATTCTGCGTGTCCCGTTTCGCACCGAAAAGGGTATTGTGCGTAAATGGATCAGTCGCTTCGAAGTTTGGCCGTATCTGGAAACCTACACGGAAGATGCGGCCGTGGAACTGTCCAAGGAACTGAATGGCAAACCGGACCTGATTATCGGCAACTATAGCGATGGTAATCTGGTCGCATCTCTGCTGGCTCATAAACTGGGTGTGACCCAGTGCACGATTGCACACGCTCTGGAAAAGACCAAATATCCGGATTCAGACATCTACTGGAAAAAGCTGGATGACAAATATCATTTTTCGTGTCAGTTCACCGCGGACATTTTTGCCATGAACCACACGGATTTTATTATCACCAGTACGTTCCAGGAAATCGCGGGCTCCAAAGAAACCGTGGGTCAATACGAATCACATACCGCCTTCACGCTGCCGGGCCTGTATCGTGTGGTTCACGGTATCGATGTTTTTGACCCGAAATTCAATATTGTCAGTCCGGGCGCGGATATGTCCATCTATTTTCCGTACACCGAAGAAAAGCGTCGCCTGACGAAATTCCATTCAGAAATTGAAGAACTGCTGTACTCGGACGTGGAAAACAAGGAACACCTGTGTGTTCTGAAAGATAAAAAGAAACCGATCCTGTTTACCATGGCCCGTCTGGATCGCGTGAAGAATCTGTCAGGCCTGGTTGAATGGTATGGTAAAAACACGCGTCTGCGCGAACTGGCAAATCTGGTCGTGGTTGGCGGTGACCGTCGCAAGGAATCGAAAGATAACGAAGAAAAGGCTGAAATGAAGAAAATGTACGATCTGATCGAAGAATACAAGCTGAACGGCCAGTTTCGTTGGATCAGCTCTCAAATGGACCGTGTGCGCAATGGCGAACTGTATCGCTACATTTGCGATACCAAGGGTGCGTTTGTTCAGCCGGCACTGTACGAAGCTTTCGGCCTGACCGTCGTGGAAGCCATGACGTGCGGTCTGCCGACCTTTGCGACGTGTAAAGGCGGTCCGGCCGAAATTATCGTGCATGGCAAATCTGGTTTCCATATCGATCCGTATCACGGTGATCAGGCAGCTGACACCCTGGCGGATTTCTTTACGAAGTGTAAAGAAGACCCGTCACACTGGGATGAAATTTCGAAGGGCGGTCTGCAACGTATCGAAGAAAAATATACCTGGCAGATTTACAGCCAACGCCTGCTGACCCTGACGGGCGTCTACGGTTTTTGGAAACATGTGTCTAATCTGGATCGCCTGGAAGCCCGTCGCTATCTGGAAATGTTTTACGCACTGAAGTATCGCCCGCTGGCACAAGCCGTTCCGCTGGCACAGGACGACTAA

表1. R7-2化合物的¹H和¹³C NMR光谱数据(化学位移和偶合常数)^a-c.

位置	<sup>1</sup>H NMR	<sup>13</sup>C NMR
			1	0.75 t(12.8)，1.78 m	40.0
2	1.65 m，2.02 m	19.8
			3	1.08 m，2.27 m	38.7
4	---	44.5
			5	1.06 d(13.2)	57.6
6	2.27 m，2.42 m	23.7
			7	1.42 m，1.76 m	42.8
8	---	41.4
			9	0.91 d(7.7)	54.5
10	---	40.5
			11	1.66 m，1.74 m	20.4
12	2.26 m，2.74 d(13.3)	38.7
			13	---	87.6
14	2.02 m，2.72 m	43.9
			15	1.88 m，2.02 m	46.6
16	---	153.2
			17	5.00 s，5.74 s	105.5
18	1.33 s	28.4
			19	---	177.2
20	1.39 s	17.0
			1′	6.40 d(8.1)	95.2
2′	4.45 m	76.8
			3′	5.16 m	88.7
4′	4.14 m	70.3
			5′	4.16 m	77.7
6′	4.04 m，4.28 m	62.3
			1′′	5.43 d(7.7)	96.2
2′′	3.98 m	81.4
			3′′	4.96 m	87.9
4′′	4.12 m	70.4
			5′′	3.92 m	78.1
6′′	4.24 m，4.58 m	69.8
			1′′′	5.35 d(8.1)	103.9
2′′′	4.14 m	75.8
			3′′′	4.16 m	78.6
4′′′	3.96 m	73.4
			5′′′	3.73 ddd(2.8，6.3，9.2)	78.2
6′′′	4.33 m，4.53 m	64.2
			1′′′′	5.38 dd(7.7，4.2)	104.2
2′′′′	3.91 m	75.9
			3′′′′	4.04 m	78.1
4′′′′	4.10 m	71.9
			5′′′′	3.88 m	78.6
6′′′′	4.15 m，4.27 m	63.0
			1′′′′′	5.05 d(7.4)	106.2
2′′′′′	3.92 m	75.6
			3′′′′′	4.06 m	78.0
4′′′′′	4.16 m	73.8
			5′′′′′	3.89 m	78.0
6′′′′′	4.18 m，4.48 m	62.5
			1′′′′′′	5.82 d(6.3)	104.3
2′′′′′′	4.01 m	75.7
			3′′′′′′	4.18 m	78.3
4′′′′′′	4.20 m	71.6
			5′′′′′′	3.96 m	78.7
6′′′′′′	4.06 m，4.32 m	62.0
			1′′′′′′′	4.99 d(7.6)	106.2
2′′′′′′′	4.01 m	77.1
			3′′′′′′′	4.17 m	78.1
4′′′′′′′	4.23 m	71.4
			5′′′′′′′	3.92 m	78.7
6′′′′′′′	4.03 m，4.28 m	64.2

^a分配基于TOCSY、HSQC、ROESY和HMBC相关性进行；^b化学位移值以δ(ppm)计；^c偶合常数以Hz计。

表2. 通过酶促生物转化产生的R6-1的¹H和¹³C NMR光谱数据(化学位移和偶合常数)^a-c.

位置	<sup>1</sup>H NMR	<sup>13</sup>C NMR
			1	0.74 t(12.4)，1.85 m	40.4
2	1.45 m，2.18 m	19.8
			3	1.09 m，2.16 m	37.4
4	---	42.1
			5	0.98 d(12.4)	57.2
6	1.90 m，2.14 m	21.8
			7	1.73 m，2.48 m	43.9
8	---	41.5
			9	0.88 d(6.3)	53.7
10	---	37.4
			11	1.66 m，2.12 m	20.4
12	1.90 m，2.87 d(12.3)	39.5
			13	---	86.2
14	1.73 d(11.1)，2.48 d(10.7)	44.1
			15	2.08 m，2.11 m	47.5
16	---	153.9
			17	5.01 s，5.64 s	104.5
18	1.48 s	29.0
			19	---	175.5
20	1.12 s	16.7
			1′	6.36 d(7.6)	92.8
2′	4.15 m	82.0
			3′	4.54 m	78.2
4′	4.14 m	71.7
			5′	4.16 m	78.8
6′	4.18 m，4.35 m	61.3
			1′′	5.04 d(7.6)	97.8
2′′	4.23 m	80.4
			3′′	4.05 m	85.2
4′′	4.04 m	70.8
			5′′	3.96 m	77.8
6′′	4.22 m，4.36 m	61.9
			1′′′	5.05 d(7.4)	104.4
2′′′	4.08 m	76.1
			3′′′	4.12 m	78.9
4′′′	4.02 m	69.6
			5′′′	3.66 ddd(2.8，6.4，9.4)	77.6
6′′′	4.32 m，4.54 m	62.7
			1′′′′	5.24 d(7.6)	106.0
2′′′′	4.04 m	76.4
			3′′′′	4.40 m	77.3
4′′′′	4.19 m	71.3
			5′′′′	4.00 m	77.2
6′′′′	4.20 m，4.32 m	62.5
			1′′′′′	5.37 t(7.4)	103.6
2′′′′′	4.28 m	87.7
			3′′′′′	4.35 m	77.0
4′′′′′	4.24 m	74.9
			5′′′′′	3.92 ddd(2.8，6.4，9.9)	77.8
6′′′′′	4.26 m，4.51 m	62.1
			1′′′′′′	5.57 d(7.7)	104.6
2′′′′′′	4.03 m	77.1
			3′′′′′′	4.38 m	78.8
4′′′′′′	4.26 m	71.2
			5′′′′′′	3.96 ddd(2.1，6.4，9.4)	77.8
6′′′′′′	4.06 m，4.36 m	62.0

表3. R6-4(R6-4A/R6-4B)化合物的¹H和¹³C NMR光谱数据(化学位移和偶合常数)^a-c。

工业适用性/技术领域声明

本公开内容在食物、饲料、饮料和药理学工业中具有适用性。本公开内容一般涉及经由酶和/或修饰的微生物菌株，生物合成生产某些甜菊醇糖苷的方法，以及其作为用于食物产品和饮料的甜味剂的潜在用途以及有关组合物。

参考文献：

1. Bedir, E.等人，(2001), A new dammarane type triterpene glycoside from Polyscias fulva. J. Natural Products, (64):95–97.

2. Brandle, J. E.等人，(1998). Stevia Rebaudiana: Its Agricultural, Biological, and Chemical Properties, Canadian J. Plant Science. 78 (4): 527–36.

3. Ceunen, S.和J.M. C. Geuns, Steviol Glycosides: Chemical Diversity, Metabolism, and Function, J. Nat. Prod., 2013, 76 (6), pp 1201–28 (2013).

4. Chaturvedula, V.S.P.等人，(2003), New cytotoxic oleanane saponis from the infructescences of Polyscias amplifolia from the Madagascar rainforest. Planta Medica, (69): 440–44.

5. Daugherty, A.B.等人，Structural and Functional Consequences of Circular Permutation on the Active Site of Old Yellow Enzyme, ACS Catal.(2015) 5:892−99.

6. Du J等人，(2011), Engineering microbial factories for synthesis of value-added products, J Ind Microbiol. Biotechnol. 38: 873-90.

7. GRAS Notices, USA Food and Drug Administration, United StatesHealth & Human Services. (2016) (与甜菊醇糖苷和多糖苷相关的).

8. Huan, V.D.等人， (1998). Oleanane saponins from Polyscias fructicosa. Phytochemistry, (47):451–57.

9. Häusler A和Münch T., (1997), Microbial Production of Natural Flavors, ASM News (63): 551-59.

10. Mao, G.等人，(2017), Enzymatic Synthesis and Structural Characterization of Rebaudioside D3, a Minor Steviol Glycoside of Stevia rebaudiana Bertoni, Amer. J. Plant Sciences, (8): 441-50.

11. Ohtani, K.等人，(1992). Minor diterpene glycosides from sweet leaves of Rubus Suavissimus, Phytochemistry, (31): 1553-59.

12. Prakash I.等人; Isolation and Characterization of a Novel Rebaudioside M Isomer from a Bio conversion Reaction of Rebaudioside A and NMR Comparison Studies of Rebaudioside M Isolated from Stevia rebaudiana Bertoni and Stevia rebaudiana Morita, Biomolecules, 2014 Jun; 4(2): 374–89.(在线出版2014年3月31日. 2014).

13. Prakash I.等人，Development of Next Generation Stevia Sweetener: Rebaudioside M, Foods, (2014), 3:162-175.

14. Qian, Z.等人，Improving the catalytic activity of Candida antarctica lipase B by circular permutation, J. of the American ChemicalSociety. (2005) 127(39): 13466–13467.

15. Richman A.等人，Functional genomics uncovers three glucosyltransferases involved in the synthesis of the major sweet glucosides of Stevia rebaudiana, Plant J. (2005) Jan;41(1):56-67.

16. Shockey J.M.等人，(2003), Arabidopsis contains a large superfamily of acyl-activating enzymes: phylogenetic and biochemical analysis reveals a new class of acyl-coenzyme A synthetases. Plant Physiol. 132 1065–76.

17. Tanaka, T.等人，(2007), Facile discrimination of aldose enantiomers by reversed-phase HPLC, Chem. Pharm. Bull., (55): 899-901.

18. Topell, S.等人，Circularly permuted variants of the green fluorescent protein, FEBS Letters. (1999) 457(2): 283–89.

19. Wang J.等人，Pathway mining-based integration of critical enzyme parts for de novo biosynthesis of steviol glycosides sweetener in Escherichia coli, Cell Research (2016) 26:258–61。

本文例如在背景技术、发明内容、具体实施方式、实施例和/或参考文献节段中提到的所有出版物、专利、专利申请、公布和数据库条目(例如，序列数据库条目)，在此通过引用以其整体并入，如同每个个别出版物、专利、专利申请、专利申请公布和数据库条目明确地且个别地通过引用并入本文。在冲突的情况下，以本申请(包括本文的任何定义)为准。

Claims

1.一种生产莱鲍迪甙R6-2A和/或R6-2B的方法，所述方法包括：

(I)制备包含以下的反应混合物：

(i)莱鲍迪甙D3；

(iii)选自以下的酶：

(a)UDP-糖基转移酶(UGT)；

(b)分开加入反应混合物中的UDP-糖基转移酶和蔗糖合酶；和

(II)使所述反应混合物温育足够的时间，以产生莱鲍迪甙R6-2A和/或R6-2B；

其中所述莱鲍迪甙D3具有以下的结构：

；

所述莱鲍迪甙R6-2A具有以下的结构：

；和

所述莱鲍迪甙R6-2B具有以下的结构：

。

2.一种生产莱鲍迪甙R7-2的方法，所述方法包括：

(I)制备包含以下的反应混合物：

(iii)选自以下的酶：

(a)UDP-糖基转移酶(UGT)；

(b)分开加入反应混合物中的UDP-糖基转移酶和蔗糖合酶；和

(II)使所述反应混合物温育足够的时间，以产生莱鲍迪甙R7-2；

其中所述莱鲍迪甙D3具有以下的结构：

；

所述莱鲍迪甙R6-2A具有以下的结构：

；

所述莱鲍迪甙R6-2B具有以下的结构：

；和

所述莱鲍迪甙R7-2具有以下的结构：

。

3.权利要求1或权利要求2的方法，其中所述蔗糖合酶或蔗糖合酶结构域选自拟南芥属蔗糖合酶I、拟南芥属蔗糖合酶3和绿豆蔗糖合酶。

4.权利要求3的方法，其中所述蔗糖合酶或蔗糖合酶结构域是拟南芥蔗糖合酶I。

5.权利要求4的方法，其中所述蔗糖合酶或蔗糖合酶结构域与SEQ ID NO: 9的氨基酸序列具有至少80%同一性。

6.权利要求5的方法，其中所述蔗糖合酶或蔗糖合酶结构域包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列。

7.权利要求1-6中任一项的方法，其中葡萄糖通过所述酶与莱鲍迪甙D3共价偶联，以产生莱鲍迪甙R6-2A和/或R6-2B。

8.权利要求7的方法，其中所述葡萄糖通过所述酶与莱鲍迪甙D3的糖I共价偶联，以产生莱鲍迪甙R6-2A。

9.权利要求7的方法，其中所述葡萄糖通过所述酶与莱鲍迪甙D3的糖II共价偶联，以产生莱鲍迪甙R6-2B。

10.权利要求2-6中任一项的方法，其中两个葡萄糖通过所述酶与莱鲍迪甙D3共价偶联，以产生莱鲍迪甙R7-2。

11.权利要求10的方法，其中所述两个葡萄糖通过所述酶与莱鲍迪甙D3的糖I和糖II共价偶联，以产生莱鲍迪甙R7-2。

12.权利要求1-11中任一项的方法，其中所述UDP-糖基转移酶与SEQ ID NO: 1的氨基酸序列具有至少80%同一性。

13.权利要求12的方法，其中所述UDP-糖基转移酶包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列。

14.权利要求1-11中任一项的方法，其中所述UDP-糖基转移酶融合酶与SEQ ID NO: 5的氨基酸序列具有至少80%同一性。

15.权利要求14的方法，其中所述UDP-糖基转移酶融合酶包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列。

16.权利要求1-15中任一项的方法，其进一步包括通过使莱鲍迪甙E与UDP-糖基转移酶以及选自蔗糖、UDP、UDP-葡萄糖及其组合的底物一起温育，来生产莱鲍迪甙D3。

17.一种生产莱鲍迪甙R6-4A和/或莱鲍迪甙R6-4B的方法，所述方法包括：

(I)制备包含以下的反应混合物：

(i)莱鲍迪甙Z1和莱鲍迪甙Z2中的至少一种；

(iii)选自以下的酶：

(a)UDP-糖基转移酶(UGT)；

(b)分开加入反应混合物中的UDP-糖基转移酶和蔗糖合酶；和

(II)使所述反应混合物温育足够的时间，以产生莱鲍迪甙R6-4A和/或莱鲍迪甙R6-4B；

其中所述莱鲍迪甙Z1具有以下的结构：

；

所述莱鲍迪甙Z2具有以下的结构：

；

所述莱鲍迪甙R6-4A具有以下的结构：

；和

所述莱鲍迪甙R6-4B具有以下的结构：

。

18.权利要求17的方法，其中所述蔗糖合酶或蔗糖合酶结构域选自拟南芥属蔗糖合酶I、拟南芥属蔗糖合酶3和绿豆蔗糖合酶。

19.权利要求18的方法，其中所述蔗糖合酶或蔗糖合酶结构域是拟南芥蔗糖合酶I。

20.权利要求19的方法，其中所述蔗糖合酶或蔗糖合酶结构域与SEQ ID NO: 9的氨基酸序列具有至少80%同一性。

21.权利要求20的方法，其中所述蔗糖合酶或蔗糖合酶结构域包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列。

22.权利要求17-21中任一项的方法，其中葡萄糖通过所述酶与莱鲍迪甙Z1或莱鲍迪甙Z2共价偶联，以产生莱鲍迪甙R6-4A。

23.权利要求22的方法，其中所述葡萄糖通过所述酶与莱鲍迪甙Z1的糖IV共价偶联，以产生莱鲍迪甙R6-4A。

24.权利要求22的方法，其中所述葡萄糖通过所述酶与莱鲍迪甙Z2的糖III共价偶联，以产生莱鲍迪甙R6-4A。

25.权利要求17-21中任一项的方法，其中所述葡萄糖通过所述酶与莱鲍迪甙Z2共价偶联，以产生莱鲍迪甙R6-4B。

26.权利要求25的方法，其中所述葡萄糖通过所述酶与莱鲍迪甙Z2的糖V共价偶联，以产生莱鲍迪甙R6-4B。

27.权利要求17-26中任一项的方法，其中所述UDP-糖基转移酶与SEQ ID NO: 3的氨基酸序列具有至少80%同一性。

28.权利要求27的方法，其中所述UDP-糖基转移酶包含SEQ ID NO: 3的氨基酸序列。

29.权利要求17-26中任一项的方法，其中所述UDP-糖基转移酶融合酶与SEQ ID NO: 7的氨基酸序列具有至少80%同一性。

30.权利要求29的方法，其中所述UDP-糖基转移酶融合酶包含SEQ ID NO: 7的氨基酸序列。

31.权利要求17-30中任一项的方法，其进一步包括通过使莱鲍迪甙E与UDP-糖基转移酶以及选自蔗糖、UDP、UDP-葡萄糖及其组合的底物一起温育，来生产莱鲍迪甙Z1或莱鲍迪甙Z2。

32.一种生产莱鲍迪甙R6-1的方法，所述方法包括：

(I)制备包含以下的反应混合物：

(i)莱鲍迪甙D；

(iii)选自以下的酶：

(a)UDP-糖基转移酶(UGT)；

(b)分开加入反应混合物中的UDP-糖基转移酶和蔗糖合酶；和

(II)使所述反应混合物温育足够的时间，以产生莱鲍迪甙R6-1；

其中所述莱鲍迪甙D具有以下的结构：

；和

所述莱鲍迪甙R6-1具有以下的结构：

。

33.权利要求32的方法，其中所述蔗糖合酶或蔗糖合酶结构域选自拟南芥属蔗糖合酶I、拟南芥属蔗糖合酶3和绿豆蔗糖合酶。

34.权利要求33的方法，其中所述蔗糖合酶或蔗糖合酶结构域是拟南芥蔗糖合酶I。

35.权利要求34的方法，其中所述蔗糖合酶或蔗糖合酶结构域与SEQ ID NO: 9的氨基酸序列具有至少80%同一性。

36.权利要求35的方法，其中所述蔗糖合酶或蔗糖合酶结构域包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列。

37.权利要求33-36中任一项的方法，其中葡萄糖通过所述酶与莱鲍迪甙D共价偶联，以产生莱鲍迪甙R6-1。

38.权利要求37的方法，其中所述葡萄糖通过所述酶与莱鲍迪甙D的糖V共价偶联，以产生莱鲍迪甙R6-1。

39.权利要求33-39中任一项的方法，其中所述UDP-糖基转移酶与SEQ ID NO: 3的氨基酸序列具有至少80%同一性。

40.权利要求39的方法，其中所述UDP-糖基转移酶包含SEQ ID NO: 3的氨基酸序列。

41.权利要求32-38中任一项的方法，其中所述UDP-糖基转移酶融合酶与SEQ ID NO: 7的氨基酸序列具有至少80%同一性。

42.权利要求41的方法，其中所述UDP-糖基转移酶融合酶包含SEQ ID NO: 7的氨基酸序列。

43.权利要求33-43中任一项的方法，其进一步包括通过使莱鲍迪甙E与UDP-糖基转移酶以及选自蔗糖、UDP、UDP-葡萄糖及其组合的底物一起温育，来生产莱鲍迪甙D。

44.权利要求33-43中任一项的方法，其进一步包括通过使莱鲍迪甙A与UDP-糖基转移酶以及选自蔗糖、UDP、UDP-葡萄糖及其组合的底物一起温育，来生产莱鲍迪甙D。

45.权利要求1-44中任一项的方法，其中所述反应混合物是在体外的。

46.权利要求1-44中任一项的方法，其中所述反应混合物是基于细胞的反应混合物。

47.权利要求46的方法，其中所述细胞选自酵母、非甜菊醇糖苷生产植物、藻类、真菌和细菌。

48.一种合成莱鲍迪甙，其选自：

(i)具有以下结构的莱鲍迪甙R6-2A：

；

(ii)具有以下结构的莱鲍迪甙R6-2B：

；

(iii)具有以下结构的莱鲍迪甙R7-2：

；

(iv)具有以下结构的莱鲍迪甙R6-4A：

(v)具有以下结构的莱鲍迪甙R6-4B：

；和

(vi)具有以下结构的莱鲍迪甙R6-1：

。

49.一种组合物，其包含权利要求48的合成莱鲍迪甙。

50.权利要求48的合成莱鲍迪甙，其用作甜味剂。

51.一种口服消费产品，其包含增甜量的选自莱鲍迪甙R6-2A、R6-2B、R7-2、R6-4A、R6-4B和/或R6-1的甜味剂，其中所述口服消费产品选自饮料产品和消费产品。

52.权利要求51的口服消费产品，其中所述甜味剂是唯一的甜味剂。

53.权利要求51或权利要求52的口服消费产品，其包含约5 ppm至100 ppm的莱鲍迪甙。

54.权利要求51-53中任一项的口服消费产品，其中所述口服消费产品具有等价于约1%(w/v-%)至约4%(w/v-%)蔗糖溶液的甜味强度。

55.权利要求51-54中任一项的口服消费产品，其进一步包含至少一种另外的甜味剂。

56.权利要求55的口服消费产品，其中所述至少一种另外的甜味剂选自甜菊提取物、甜菊醇糖苷、甜菊糖苷、莱鲍迪甙A、莱鲍迪甙B、莱鲍迪甙C、莱鲍迪甙D、衍生自重组微生物生物合成的莱鲍迪甙E、莱鲍迪甙F、杜克甙A、莱鲍迪甙M、莱鲍迪甙V、莱鲍迪甙W、莱鲍迪甙D3、莱鲍迪甙Z1、莱鲍迪甙Z2、甜茶苷、甜菊醇双糖苷、蔗糖、高果糖玉米糖浆、果糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、赤藓糖醇、木糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、AceK、阿斯巴甜、纽甜、三氯蔗糖、糖精、柚皮苷二氢查耳酮(NarDHC)、新橙皮苷二氢查耳酮(NDHC)、甜茶苷、罗汉果苷IV、赛门苷I、罗汉果苷V、莫纳甜、索马甜、应乐果甜蛋白、甜味蛋白、L-丙氨酸、甘氨酸、罗汉果、hernandulcin、叶甜素、三叶苷及其组合。

57.权利要求51-56中任一项的口服消费产品，其进一步包含选自以下的至少一种添加剂：碳水化合物、多元醇、氨基酸或其盐、聚氨基酸或其盐、糖酸或其盐、核苷酸、有机酸、无机酸、有机盐、有机酸盐、有机碱盐、无机盐、苦味化合物、食用香料、调味成分、收敛剂化合物、蛋白质、蛋白质水解物、表面活性剂、乳化剂、类黄酮、醇、聚合物及其组合。

58.权利要求51-57中任一项的口服消费产品，其中所述消费产品选自食物产品、营养制品、药物、膳食补充剂、牙科卫生组合物、可食用凝胶组合物、化妆品和桌面调味剂。

59.权利要求51-57中任一项的口服消费产品，其中所述饮料产品选自碳酸饮料产品和非碳酸饮料产品。

60.权利要求59的饮料产品，其中所述饮料产品选自软饮料、喷泉饮料、冷冻饮料；即饮饮料；冷冻即饮饮料、咖啡、茶、乳饮料、粉末状软饮料、浓缩液、调味水、强化水、果汁、果汁调味饮料、运动饮料和能量饮料。