CN101472487A - 甜菊双糖苷a组合物及其纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明之示范性实施方案包含一种纯化粗甜菊双糖苷A之方法。具体来说，此发明关于一种用于纯化包含自约40％至约95％甜菊双糖苷A纯度之粗甜菊双糖苷A组合物以自单一结晶步骤得到实质上纯的甜菊双糖苷A产物之方法。本发明亦揭示所形成之多晶型及非晶型之甜菊双糖苷A及自粗甜菊双糖苷A组合物及实质上纯的甜菊双糖苷A组合物制备多晶型及非晶型之甜菊双糖苷A之方法。
Description
技术领域
本发明大致上关于多晶型及非晶型之甜菊双糖苷A、纯化甜菊双糖苷A之方法及制备多晶型及非晶型之甜菊双糖苷A之方法。更具体地说，本发明关于多晶型及非晶型之甜菊双糖苷A，及以含水有机溶剂或有机溶剂纯化或结晶甜菊双糖苷A以获得高产量及高纯度之产物之方法。
背景技术
甜菊双糖苷A是高甜度之二萜糖苷甜味剂，其具有下列化学结构：
甜菊双糖苷A及其它甜菊醇糖苷是自甜菊植物(Stevia rebaudiana(Bertoni))(甜菊(Stevia))中分离及萃取，这些植物为栽种于日本、新加坡、台湾、马来西亚、南韩、中国、以色列、印度、巴西、澳洲及巴拉圭之经济作物。甜菊双糖苷A是替代性之无热量甜味剂，其功能及感观特性优于许多高效甜味剂。加工过之甜菊的甜度比糖高出70至400倍；然而，甜菊也含有苦味成分。存在甜菊之4种主要的二萜糖苷甜味剂中，甜菊双糖苷A被认为是苦味最少，持续余味最轻的一种。苦味通常因萃取物中之杂质而来。
甜菊双糖苷A之制备纯度通常≦80％。主要的杂质包括甜菊苷(stevioside)、甜菊醇二苷(steviolbioside)、甜菊双糖苷B、甜菊双糖苷C、甜菊双糖苷D、杜克苷A(dulcosideA)、甜菊双糖苷F及其它甜菊醇糖苷类。要提高高纯度之甜菊双糖苷A的回收率非常困难，因为甜菊双糖苷A及杂质有类似的水溶性。
先前的研究指出，自甜菊类双苷A与甜菊苷之混合物纯化甜菊双糖苷A需要经过多次重复纯化步骤。美国专利5,962,678号揭示利用无水甲醇溶液再结晶甜菊类双苷A以得到纯度80％之甜菊双糖苷A。以无水甲醇重复再结晶化数次，可将甜菊双糖苷A之纯度提高至超过95％。美国专利公开号2006/0083838揭示以包含乙醇及介于4至15％之水的溶剂再结晶化以纯化甜菊双糖苷A。日本专利申请案55-23756揭示一种纯化甜菊双糖苷A及甜菊苷之方法，其藉由自含水乙醇(>70％)结晶以得到80％纯度之甜菊双糖苷A。美国专利公开号2007/0082103揭示一种自含水乙醇再结晶以纯化甜菊双糖苷A之方法，其主张自粗甜菊双糖苷(60％)进行二步骤再结晶化导致形成纯度>98％且产量达97％之甜菊双糖苷。然而，这些先前技术之方法无法利用单一再结晶步骤提供实质上纯的甜菊双糖苷A组合物。
因此，我们需要一种简单、有效又经济之产制实质上纯的甜菊双糖苷A之方法。
发明内容
发明总结
本发明之示范性实施方案藉由提供实质上纯的甜菊双糖苷A、多晶型及非晶型之甜菊双糖苷A、纯化甜菊双糖苷A之方法及产制多晶型及非晶型之甜菊双糖苷A之方法来满足上述需求。
在特定之实施方案中，纯化甜菊双糖苷A之方法包含简单的结晶作用。在一实施方案中，纯化甜菊双糖苷A之方法包含组合粗甜菊双糖苷A与含水有机溶剂以形成甜菊双糖苷A溶液(该含水有机溶液包含其量自约10％至约25％之重量的水)，及在单一步骤中自该粗甜菊双糖苷A溶液结晶出纯度高于约95％干重之实质上纯的甜菊双糖苷A。
在其它特定实施方案中，本发明提供不同的多晶型及非晶型之甜菊双糖苷A及制备不同多晶型及非晶型之甜菊双糖苷A之方法。
本发明的其它目标、特色及益处将自下列详细说明、附图说明及权利要求中了解。除非另外定义，所有本发明所使用之技术及科学用语及缩写均与本发明相关领域之一般技术人士所通常了解之意义相同。虽然与本发明所描述之方法及组合物类似或相同之方法及组合物可被用于实施本发明，本发明所描述之适当方法及组合物并非用于令任何这类方法及组合物限制本发明。
附图说明：
图1是本发明之实施方案中纯化甜菊双糖苷A之方法的图示说明。
图2是本发明之实施方案中甜菊双糖苷A、多晶型及非晶型之甜菊双糖苷A之形成及转换图示。
图3是于本发明之实施方案中，以散射强度对散射角2θ作图比较4种甜菊双糖苷A多晶型(第1、2、3A及3B型)之粉末X光绕射扫描结果。
图4是于本发明之实施方案中，以散射强度对散射角2θ作图比较甜菊双糖苷A多晶型(第1及2型)之粉末X光绕射扫描结果。
图5是于本发明之实施方案中，以散射强度对散射角2θ作图比较甜菊双糖苷A多晶型(第3A及3B型)之粉末X光绕射扫描结果。
图6是于本发明之实施方案中，以散射强度对散射角2θ作图比较甜菊双糖苷A多晶型(第2、3A及3B型)之粉末X光绕射扫描结果。
图7是于本发明之实施方案中，以散射强度对散射角2θ作图显示甜菊双糖苷A多晶型第1型之粉末X光绕射扫描结果。
图8是于本发明之实施方案中，以散射强度对散射角2θ作图显示甜菊双糖苷A多晶型第2型之粉末X光绕射扫描结果。
图9是于本发明之实施方案中，以散射强度对散射角2θ作图显示甜菊双糖苷A多晶型第3A型之粉末X光绕射扫描结果。
图10是于本发明之实施方案中，以散射强度对散射角2θ作图显示甜菊双糖苷A多晶型第3B型之粉末X光绕射扫描结果。
图11是于本发明之实施方案中，以散射强度对散射角2θ作图显示甜菊双糖苷A非晶型第4型之粉末X光绕射扫描结果。
本发明之详细说明
甜菊双糖苷A是一种天然的高甜度甜味剂，通常以一般成本纯化可得到≦80％之纯度，只有高成本之纯化可得到>80％之纯度。甜菊双糖苷A之商用样品通常具有苦味，一般认为这是因杂质所造成。因此，我们需要实质上纯的甜菊双糖苷A，以及简单又经济之甜菊双糖苷A纯化方法，以获得适合作为天然高甜度甜味剂之实质上纯的甜菊双糖苷A。
本发明所使用之“实质上”或“实质上纯的”是指包括至少约85％干重之甜菊双糖苷A之甜菊双糖苷A组合物，另一实施方案至少约90％干重，另一实施方案自约95％至约98％干重及另一实施方案自约99％至约100％干重。
本发明之示范性实施方案藉由提供一种纯化粗甜菊双糖苷A成为实质上纯的甜菊双糖苷A之方法以满足这些需求，该法藉由自包含水(其量占重量之自约10％至约25％)之含水有机溶液中结晶粗甜菊双糖苷A且于至少一个步骤结晶实质上纯的甜菊双糖苷A。本发明之其它示范性实施方案包含实质上纯的甜菊双糖苷A之组合物及包含一种(或一种以上)多晶型之甜菊双糖苷A的组合物。本发明之其它示范性实施方案包含非晶型之甜菊双糖苷A及制备非晶型之甜菊双糖苷A的方法。另一实施方案提供将一种多晶型转换成另一种多晶型或非晶型之方法。以下详细说明本发明之示范性实施方案并以图1至11说明。
纯化粗甜菊双糖苷A混合物之方法
可自市面上购得之粗甜菊双糖苷A产品包含纯度自约40％至约95％重量，约60％至约85％重量，或约70％至约85％重量之甜菊双糖苷A。我们认为自甜菊植物萃取出之原始粗甜菊双糖苷A可经再结晶方式纯化。经高效液相层析法分析出的主要杂质为甜菊苷、甜菊双糖苷B、甜菊双糖苷C及甜菊双糖苷D。甜菊双糖苷D杂质可藉由增加含水有机再结晶溶剂中之水量加以移除；然而，结晶溶剂中水量过多将导致甜菊双糖苷A之回收率降低。甜菊双糖苷B杂质可藉由在有机溶剂或含水有机溶液中浆化粗甜菊双糖苷A或以阴离子交换树脂处理粗甜菊双糖苷A溶液而显著降低。因此，纯化方法将视存在于粗甜菊双糖苷A开始物质中之杂质而定。
如图1所示在纯化甜菊双糖苷A之方法110的示范性实施方案中，粗甜菊双糖苷A112可与含水有机溶液116组合114，以形成甜菊双糖苷A溶液118。该含水有机溶液116包含其量自约10％至约25％重量之水及至少一种有机溶剂。或者，该含水有机溶液116可包含其量自约15％至约20％重量之水及至少一种有机溶剂。
本发明所使用之含水有机溶剂是指水与至少一种有机溶剂之混合物。有机溶剂之非限制性实例包括醇、丙酮及乙腈。本发明所使用之醇是指任何直链、分支或环状之与至少一个羟基团连接之经取代或未经取代之烷基、炔基或烯基。醇之非限制性实例包括乙醇、甲醇、异丙醇、1-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、三级丁醇及异丁醇。
在示范性实施方案中，该含水有机溶液116包含水与至少一种有机溶剂之混合物。在另一示范性实施方案中，至少一种有机溶剂包含醇，该醇包含乙醇、甲醇或彼等之混合物。在其中该至少一种有机溶剂包含乙醇及甲醇之混合物的示范性实施方案中，该乙醇及甲醇可以介于约20份至约1份乙醇对约1份甲醇之重量比被组合于该含水有机溶剂中。在另一示范性实施方案中，该乙醇及甲醇可以介于约3份至约1份乙醇对约1份甲醇之重量比被组合于该含水有机溶剂中。
在示范性实施方案中，该甜菊双糖苷A溶液118包含含水有机溶剂116及粗甜菊双糖苷A112，其重量比是介于约10至约4份之含水有机溶剂对约1份之粗甜菊双糖苷A。在另一示范性实施方案中，该甜菊双糖苷A溶液118包含含水有机溶剂116及粗甜菊双糖苷A 112，其重量比是介于约5至约3份之含水有机溶剂对约1份之粗甜菊双糖苷A。
在示范性实施方案中，该方法110可于近室温下进行。在另一实施方案中，该方法110进一步包含加热120甜菊双糖苷A溶液118之步骤。在一实施方案中，加热120甜菊双糖苷A溶液118之步骤包含加热甜菊双糖苷A溶液至介于约20℃至约70℃、介于约20℃至约60℃、介于约20℃至约40℃、或介于约40℃至约60℃之温度。在另一实施方案中，加热120甜菊双糖苷A溶液118之步骤包含加热该甜菊双糖苷A溶液至约回流温度。加热120该甜菊双糖苷A溶液118之步骤包含加热甜菊双糖苷A溶液约0.25小时至约8小时。在其中该纯化甜菊双糖苷A之方法110包含加热120该甜菊双糖苷A溶液118之步骤的另一实施方案中，该法进一步包含冷却122该甜菊双糖苷A溶液之步骤。在一实施方案中，冷却122该甜菊双糖苷A溶液118之步骤包含冷却该甜菊双糖苷A溶液至介于约4℃至约25℃之温度。该冷却122该甜菊双糖苷A溶液118之步骤包含冷却该甜菊双糖苷A溶液约0.5小时至约24小时。
纯化甜菊双糖苷A之方法110进一步包含在单一步骤中自该甜菊双糖苷A溶液118结晶124实质上纯的甜菊双糖苷A组合物126之步骤，该组合物包含其量高于约85％干重、高于约90％干重、高于约95％干重、高于约97％干重、高于约98％干重或高于约99％干重之甜菊双糖苷A。在单一结晶步骤中，该甜菊双糖苷A溶液118可经搅拌或未经搅拌。
在示范性实施方案中，该方法110可进一步包含可任意选择之添加晶种步骤128，其在适当温度下添加足以促进该甜菊双糖苷A结晶以形成纯甜菊双糖苷A之实质上纯的甜菊双糖苷A晶体130至该甜菊双糖苷A溶液118中。足以促进结晶出实质上纯的甜菊双糖苷A 126之甜菊双糖苷A130的量包含介于约0.0001％至约1％之甜菊双糖苷A的量(按存在于该溶液中该甜菊双糖苷A之重量计)。在另一实施方案中，足以促进该甜菊双糖苷A结晶以形成实质上纯的甜菊双糖苷A组合物126之甜菊双糖苷A 130的量包含介于约0.01％至约1％重量之甜菊双糖苷A的量。添加晶种步骤128之适当温度包含介于约18℃至约35℃之温度。
在另一示范性实施方案中，该方法进一步包含分离132及清洗134该实质上纯的甜菊双糖苷A组合物126之步骤。该实质上纯的甜菊双糖苷A组合物126可藉由多种利用离心力之固液分离技术自含水有机溶液118中被分离，该技术包括但不限于立式及卧式多孔篮离心、固体转筒离心(solid bowl centrifuge)、倾析器离心(decanter centrifuge)、刮刀型离心(peeler type centrifuge)、活塞推料离心(pusher type centrifuge)、海音克尔式离心(Heinkeltype centrifuge)、盘片式离心(disc stack centrifuge)及旋风分离法(cyclone separation)。此外，可藉任何加压、真空、或重力过滤方法改善分离效果，这些方法包括但不限于使用带式(belt)、鼓式(drum)、那邱型(nutsche type)、叶片式、板式、罗森蒙德型(Rosenmundtype)、烟火型(sparkler type)及袋式过滤器及压滤机。甜菊双糖苷A固液分离之设备可以连续、半连续或分批模式操作。该实质上纯的甜菊双糖苷A组合物126亦可在分离机上利用各种含水有机溶剂136及彼等之混合物清洗134。该实质上纯的甜菊双糖苷A组合物126可在分离机上利用任何数目之气体(包括但不限于氮气或氩气)部份或完全干燥，以蒸发残余之液态溶剂136。该实质上纯的甜菊双糖苷A组合物126可利用液体、气体或机械方式将该固体溶解或维持该固体形式，以自动或被动地自分离设备上移除。
在另一示范性实施方案中，该方法110进一步包含干燥138该实质上纯的甜菊双糖苷A组合物126之步骤。这些方法为该领域之技术人员所熟知，包括但不限于使用旋转真空干燥器、液态床式干燥器、旋转隧道式干燥机、板式干燥机、盘式干燥机、诺它型干燥机(Nauta type dryer)、喷雾干燥机、瞬间气流干燥机(flash dryer)、微米干燥机(micron dryer)、圆盘干燥机、高速及低速浆叶干燥机(paddle dryer)与微波干燥机。在示范性实施方案中，该干燥步骤138包含利用氮气或氩气灌洗干燥该实质上纯的甜菊双糖苷A组合物126以移除残余溶剂120，其是于介于约40℃至约60℃之温度下灌洗约5小时至约100小时。
在其中该粗甜菊双糖苷A混合物112实质上不包含甜菊双糖苷D杂质之另一实施方案中，该方法110进一步包含在干燥138该实质上纯的甜菊双糖苷A组合物之前，以有机溶剂或含水有机溶剂142浆化140该实质上纯的甜菊双糖苷A组合物126之步骤。该浆液可为包含固体及含水有机溶剂或有机溶剂之混合物，其中该固体包含该实质上纯的甜菊双糖苷A组合物126且仅略溶(sparingly soluble)于该含水有机溶剂或有机溶剂142。在一实施方案中，该实质上纯的甜菊双糖苷A组合物126及含水有机溶剂或有机溶剂142可以介于约15至约1份含水有机溶剂对约1份实质上纯的甜菊双糖苷A组合物之重量比存在于浆液中。在一实施方案中，该浆液可维持于室温下。在另一实施方案中，该浆化步骤140包含加热该浆液至介于约20℃至约40℃之温度。该实质上纯的甜菊双糖苷A组合物126可被浆化约0.5小时至约24小时。
在另一示范性实施方案中，该方法进一步包含自该浆液之含水有机溶剂142中分离132该实质上纯的甜菊双糖苷A组合物126及清洗134该实质上纯的甜菊双糖苷A组合物之步骤，之后为干燥138该实质上纯的甜菊双糖苷A组合物之步骤。
如果想要进一步纯化，可重复本发明所述之纯化甜菊双糖苷A之方法110或可利用替代性纯化方法进一步纯化该实质上纯的甜菊双糖苷A组合物，诸如管柱层析法。
本发明所使用之纯度是指在未加工或纯化形式之甜菊双糖苷A组合物中所存有之甜菊双糖苷A的重量百分比。在一实施方案中，甜菊双糖苷A组合物包含特定纯度之甜菊双糖苷A，且该组合物之其余部份包含其它甜菊醇糖苷之混合物或任何非甜菊双糖苷A之成分。该组合物之纯度可利用具备该领域一般技术之人士所熟知之方法测定。这类方法之一包括高效液相层析法(HPLC)。具备该领域一般技术之人士亦应了解样品中之水分可影响纯度测量之准确性。因此，当测量纯度时该组合物应为实质上干燥。本发明所使用之实质上干的组合物包含最高约10％重量之水分。
甜菊双糖苷A多晶型及非晶型
利用上述方法纯化甜菊双糖苷A将导致形成至少三种不同多晶型之甜菊双糖苷A：第1型，甜菊双糖苷A水合物；第2型，无水甜菊双糖苷A；及第3型，甜菊双糖苷A溶剂化物。具备该领域一般技术之人士将了解到，本发明所描述之含水有机溶液及纯化方法之温度皆可影响该实质上纯的甜菊双糖苷A组合物所形成之多晶型。
多晶性被定义为物质以二或多种具有不同排列及/或构型之晶格分子的结晶状态存在之能力。约30％之有机化合物被认为具有多晶性(Zell，et al.，Tetrahedron 56(36)6603-16(2000))。多晶性对于调合医药剂、色素染料、甜味剂、炸药及农药上很重要。多晶性可导致物理性质诸如密度、熔点及溶解速度之改变。
甜菊双糖苷A之多晶性是利用粉末X光绕射(XRPD)分析样品确定，此技术为该领域之技术人员所熟知。图3至11是自本发明所述之纯化方法得到之实质上纯的甜菊双糖苷A组合物之XRPD扫描结果。甜菊双糖苷A多晶型之XRPD扫描是以散射强度对散射角2
θ作图产生。样品利用XRPD进行分析，检测仪器为以铜靶为辐射源之Shimadzu XRD-6000X光粉末绕射仪。此仪器配置长细焦距之X光射线管。射线管之电位及电流分别设定于40千伏及40毫安。发散及散射狭缝设定于1度，接收狭缝设定为0.15毫米。使用碘化钠闪烁检测器检测绕射辐射。以3°/分钟(0.4秒/0.02°步阶)自2.5至40°2θ进行θ-2θ连续扫瞄。分析硅标准物以校准仪器。利用XRD-60000v.4.1收集并分析资料。图谱显示反射之分辨率，表示样品是由晶体物质组成。
图3显示第1、2、3A(甲醇溶剂化物)及3B型(乙醇溶剂化物)之代表图谱。第2型之图谱(最上者)显著异于其它图谱。应注意的是在第1、2及3型之每个分类中可存在多种多晶型。
图4强调第1及2型之间的差异。此外，第2型之二种图谱显示在不同的再结晶多晶型之条件下产生不同多晶型之再现性。
图5显示第3A及3B型XRPD图谱之间存在显著相似性。本发明并不想限制在任何理论，但这些多晶型可能是等构造之溶剂化物，其中这些图谱之间的差异仅在于因溶剂特性改变导致特定高峰平移。若有需要，第3A及3B型之间的等构造关系可藉由指数化这些图谱加以证实。星号标示出第3A型图谱中平移至右侧约0.2度2θ之高峰。此外，第3B型中数个高峰相较于第3A型之对应高峰具有更高之强度。举例来说，第3B型中5.5、11.0、14.2及19.4度之高峰相较于第3A型具有较高之强度。
图6比较第2型与图5之第3A及3B型。第2型与第3A型之相似度高于其与第3B型之相似度。虽然在第2型之图谱中并未观察到图5中3B型强度高于3A型之高峰，第2型之图谱中至少有三个显示相反趋势(也就是存在第2型之高峰，于3A型中较小，3B型中较大)之高峰(在该图谱下以双星号标示)。最后，在第3B型中17.6度之大型高峰在第3A型中似乎稍移向右侧(17.9度)，且在第2型中移至更右(18.0度)。其它二组介于21及23度之间的高峰亦显示此平移。本发明并不希望被任何理论限制，但这些高峰之平移可能表示第3A型为部份去溶剂化，因此包含该溶剂化物及第2型晶体二者之混合物。
图7至10分别为得自上述纯化方法之实质上纯的甜菊双糖苷A组合物之第1、2、3A及3B个别多晶型的XRPD扫描。
如图2所示，所形成之多晶型的种类将由一些因素决定，诸如含水有机溶液之组合物、结晶步骤之温度及干燥步骤期间之温度。本发明并不希望被任何理论限制，但第1型及第3型被认为是于单一结晶步骤中形成，然而第2型被认为是于自第1型及第3型转换后的干燥步骤期间形成。
结晶步骤期间的低温(介于约20℃至约50℃)及含水有机溶剂中水对有机溶剂之低比率导致形成第3型。结晶步骤期间的高温(介于约50℃至约80℃)及含水有机溶剂中水对有机溶剂之高比率导致形成第1型。第1型可藉由在约室温下以无水溶剂浆化约2至约16小时，或藉由在约回流温度下以无水溶剂浆化约0.5至约3小时而被转换成第3型。第3型可藉由在约室温下以水浆化该多晶型约16小时或在约回流温度下浆化约2至约3小时而被转换成第1型。第3型可在干燥法中被转换成第2型；然而，提高实质上纯的甜菊双糖苷A组合物之干燥温度至约70℃以上或延长干燥时间可导致甜菊双糖苷A分解并增加实质上纯的甜菊双糖苷A组合物中剩余的甜菊双糖苷B杂质。第2型可藉由添加水而被转换成第1型。
除了至少三种多晶型之甜菊双糖苷A之外，纯化甜菊双糖苷A可导致形成如图11所示之甜菊双糖苷A之非晶型(第4型)。第4型具有宽广之非晶型环(amorphous halo)，以此确定组合物为非晶型。
本发明所使用之非晶型描述非晶态之固体物质。非晶型之甜菊双糖苷A(第4型)相较于多晶型之甜菊双糖苷A(第1、2或3型)具有改善之溶解速率。具备该领域一般技术之人士应了解到，甜味剂组合物之溶解速率对于固态及液态甜味组合物之调合上可能很重要，该甜味组合物之非限制性实例包括口香糖、烘焙产品及饮料。
如上所述，第4型可得自甜菊双糖苷A之初步纯化过程，或利用该领域一般技术人士所熟知之方法直接得自任何个别多晶型或多晶型之组合。此外，第4型可得自粗甜菊双糖苷A组合物或得自透过非上述之纯化方法获得之实质上纯的甜菊双糖苷A组合物。制备非晶型之甜菊双糖苷A之非限制性方法实例包括以球磨法、沉淀法、冻干法、冻磨法或喷雾干燥法制备甜菊双糖苷A组合物。
在特定实施方案中，上述甜菊双糖苷A之纯化导致包含第4型之非晶型甜菊双糖苷A之组合物。具该领域一般技术之人士应了解结晶方法之参数可被调整以提高第4型之形成。
在另一特定之实施方案中，第4型可藉由喷雾干燥该甜菊双糖苷A组合物之溶液而自甜菊双糖苷A组合物制备。简单地说，喷雾干燥通常需要透过进料泵吸取甜菊双糖苷A溶液至喷嘴喷雾器，以使该溶液在固定流量之氮气/空气的协助下被雾化成雾滴喷液。水分在干燥室中受控制的温度条件及气流条件下自雾滴中蒸发，导致形成非晶型甜菊双糖苷A之干燥颗粒。非晶型甜菊双糖苷A之纯度将视甜菊双糖苷A溶液之纯度而定。
在另一特定实施方案中，第4型可藉由辗磨甜菊双糖苷A之非-非晶型以自甜菊双糖苷A组合物制备。辗磨是一种机械方法，其被认为可产生局部能量以将甜菊双糖苷A之晶体形式转变成非晶型。示范性辗磨技术包括球磨法或气流喷射磨粉法，二者均为该领域一般技术人士所熟知。简单地说，非-非晶型之甜菊双糖苷A以可有效形成非晶型甜菊双糖苷A之时间及速度辗磨。这些参数可由该领域具一般技术人士决定。典型辗磨时间可介于约15分钟至约2小时，但亦可采用其它时间。
这三种甜菊双糖苷A多晶型及甜菊双糖苷A非晶型之物质特性摘列于下表：
表1：甜菊双糖苷A多晶型及非晶型
| 第1型多晶型 | 第2型多晶型 | 第3型多型 | 第4型非晶型 | |
| 25℃下于水中之溶解速率 | 非常低(60分钟内<0.2％) | 中(5分钟内<30％) | 高(5分钟内>30％) | 高(5分钟内>35％) |
| 醇含量 | <0.5％ | <1％ | 1-3％ | <0.05％ |
| 水分含量 | >5％ | <1％ | <3％ | <6％ |
上述之物质特性仅说明甜菊双糖苷A多晶型及非晶型之特定实施方案。具该领域一般技术者应了解无水甜菊双糖苷A多晶型(第2型)、甜菊双糖苷A溶剂化物多晶型及非晶型甜菊双糖苷A具吸湿性，且可吸收约10％干重之量的水分。
具该领域一般技术者应了解，甜菊双糖苷A组合物可能被修饰以得到所欲之甜菊双糖苷A多晶型及非晶型之混合物，视所欲之甜菊双糖苷A组合物之性质而定(例如溶解速度等)。在一实施方案中，实质上纯的甜菊双糖苷A组合物可包含其量介于约1％至约100％重量之特定多晶型或非晶型之甜菊双糖苷A。举例来说，实质上纯的甜菊双糖苷A组合物可包含重量高于约25％之量的多晶型或非晶型之甜菊双糖苷A，更适宜者高于50％之重量，更适宜者高于75％之重量，或甚至更适宜者高于约85％之重量。亦可使用这些范围内之适当量的甜菊双糖苷A多晶型或非晶型。在另一实施方案中，实质上纯的甜菊双糖苷A组合物可包含特定多晶型及/或非晶型之甜菊双糖苷A之组合。
本发明进一步由下列实施例说明，这些实施例在任何方面均不应被视为对本发明之范围的限制。相反的，应清楚的了解各种其它实施方案、修饰及彼等之相等物可具有不背离本发明之精神及/或所属权利要求之范围的方法，该领域一般技术人士在读完其中之描述后将可理解。除非另外说明，百分比(％s)是按重量计。
具体实施方式：
以下之实施例中所描述之甜菊双糖苷A组合物之纯度是由HPLC决定。进行HPLC分析之方法为具备该领域一般技术之人士所熟知。简单地说，HPLC分析是于30℃下利用ZORBAX NH2管柱(150×4.6毫米，5微米)进行。移动相为20％缓冲液(0.0125％醋酸及0.0125％醋酸铵)及80％乙腈之溶液，其流速为1.5毫升/分钟。取12微升之各样品重复注入二份，于210奈米处(4奈米频宽)利用紫外线检测器检测样品，参考物于260奈米处(100奈米频宽)检测。HPLC分析需要40至60分钟之执行时间。
0.0125％醋酸及0.0125％醋酸铵之缓冲液是由溶解0.125克之醋酸铵及125微升之冰醋酸于1公升之水中配制。甜菊双糖苷B之滞留时间是藉由改变醋酸铵对醋酸之比但仍维持二者总共为0.025％来加以调整。增加醋酸之量缩短甜菊双糖苷B之滞留时间。
移动相之制备是藉由混合缓冲溶液与乙腈以使甜菊双糖苷A之滞留时间到达7.0±0.5分钟。刚开始，此约为20％之缓冲液(缓冲液200毫升及乙腈800毫升)。增加1至2％之乙腈的量延长约1分钟之甜菊双糖苷A之滞留时间。
稀释溶液之制备是藉由混合750毫升之乙腈及250毫升之缓冲溶液。甜菊双糖苷A标准液之制备是以4毫升之稀释溶液稀释20.0±0.5毫克(纪录至最接近的0.1毫克)之甜菊双糖苷A标准物，以成为约5000毫克/升之标准溶液。取10.8、11.4、12.6及13.2微升之甜菊双糖苷A标准溶液注入。每次制备标准液时以卡氏水分分析仪测定水分含量，根据分析报告上之溶剂纯度进行校正。或者，甜菊双糖苷A标准液是藉由以4毫升之稀释溶液(水分及纯度经过校正)稀释个别含18、19、21及22(各±0.2)毫克之甜菊双糖苷A标准物之样品以制备。个别制备之样品以相同于样品之量(12微升)注入。
甜菊苷标准液之制备是以5毫升之稀释溶液稀释12.5±0.5毫克(纪录至最接近的0.1毫克)之甜菊苷标准物，以成为约2500毫克/升之标准溶液(贮存液A)(水分及纯度经过校正)。接着用10毫升之稀释液稀释1毫升之甜菊苷标准贮存液A，以产生250毫克/升之标准液(贮存液B)，且标准贮存液被稀释成介于2.5至50毫克/升之最终浓度。
甜菊双糖苷A组合物样品之制备是以25毫升之稀释溶液稀释125±2毫克(纪录至最接近的0.1毫克)之甜菊双糖苷A组合物，以成为约5000毫克/升之样品溶液(水分经校正)。若样品非立即进行分析，应以无瓶端空间储存于氮气中且加以干燥。
下表提供甜菊双糖苷A及其它甜菊醇糖苷滞留时间(RT)之指南。然而，具该领域一般技术人士应了解滞留时间可视需要调整。
表2：HPLC滞留指南
| 化合物 | 滞留时间(RT)(秒) |
| 甜菊苷 | 4.53 |
| 甜菊双糖苷C | 5.21 |
| 甜菊双糖苷F | 5.62 |
| 甜菊双糖苷A | 7.07 |
| 甜菊双糖苷D | 15.79 |
| 甜菊醇二苷 | 18.35 |
| 甜菊双糖苷B | 35.83 |
A组实施例
表3：实施例A1至3之总结
| 粗甜菊双糖苷A(克) | 乙醇(95％)(毫升) | 溶剂甲醇(99％)(毫升) | 水(毫升) | 加热温度(℃) | 干燥温度(℃) | 产量(克) | HPLC纯度(重量/重量％) | |
| A1 | 400 | 1200 | 400 | 320 | 50 | 50 | 130 | 98.9 |
| A2 | 100 | 320 | 120 | 50 | 30-40 | 60 | 72 | 98.3 |
| A3 | 50 | 160 | 60 | 25 | ～30 | 60 | 27.3 | 98.2 |
实施例A1
粗甜菊双糖苷A(77.4％纯度)混合物是得自商业来源。杂质(6.2％甜菊苷、5.6％甜菊双糖苷C、0.6％甜菊双糖苷F、1.0％其它甜菊醇糖苷、3.0％甜菊双糖苷D、4.9％甜菊双糖苷B、0.3％甜菊醇二苷)在干态下(水分含量4.7％)利用HPLC确认及定量。
组合粗甜菊双糖苷A(400克)、乙醇(95％，1200毫升)、甲醇(99％，400毫升)及水(320毫升)并加热至50℃ 10分钟。令该清澈溶液冷却至22℃ 16小时。过滤白色结晶并以乙醇清洗二次(2×200毫升，95％)，在真空烘箱中以低压(20毫米)50℃干燥16至24小时。
该实质上纯的甜菊双糖苷A之最终组合物(130克)包含98.91％甜菊双糖苷A、0.06％甜菊苷、0.03％甜菊双糖苷C、0.12％甜菊双糖苷F、0.13％其它甜菊醇糖苷、0.1％甜菊双糖苷D、0.49％甜菊双糖苷B及0.03％甜菊醇二苷，所有均以重量表示。
实施例A2
粗甜菊双糖苷A(80.37％纯度)是得自商业来源。杂质(6.22％甜菊苷、2.28％甜菊双糖苷C、0.35％杜克苷A、0.78％甜菊双糖苷F、0.72％其它甜菊醇糖苷、3.33％甜菊双糖苷B、0.07％甜菊醇二苷)在干态下(水分含量3.4％)利用HPLC确认及定量。
组合粗甜菊双糖苷A(100克)、乙醇(95％，320毫升)、甲醇(99％，120毫升)及水(50毫升)并加热至30至40℃ 10分钟。令该清澈溶液冷却至22℃ 16小时。过滤白色结晶并以乙醇清洗二次(2×50毫升，95％)。该潮湿滤饼(88克)在乙醇中(95％，1320毫升)浆化16小时、过滤、以乙醇清洗(95％，2×100毫升)，并于真空烘箱中以低压(20毫米)60℃干燥16至24小时。
该实质上纯的甜菊双糖苷A之最终组合物(72克)包含98.29％甜菊双糖苷A、0.03％甜菊苷、0.02％甜菊双糖苷C、0.17％甜菊双糖苷F、0.06％甜菊双糖苷D及1.09％甜菊双糖苷B。HPLC未检测到甜菊醇二苷。
实施例A3
粗甜菊双糖苷A(80.37％纯度)是得自商业来源。杂质(6.22％甜菊苷、2.28％甜菊双糖苷C、0.35％杜克苷A、0.78％甜菊双糖苷F、0.72％其它甜菊醇糖苷、3.33％甜菊双糖苷B、0.07％甜菊醇二苷)在干态下(水分含量3.4％)利用HPLC确认及定量。
组合粗甜菊双糖苷A(50克)、乙醇(95％，160毫升)、甲醇(99％，60毫升)及水(25毫升)并加热至约30℃ 10分钟。令该清澈溶液冷却至22℃ 16小时。过滤白色结晶并以乙醇清洗二次(2×25毫升，95％)。该潮湿滤饼(40克)在甲醇中(99％，600毫升)浆化16小时、过滤、以甲醇清洗(99％，2×25毫升)，并于真空烘箱中以低压(20毫米)60℃干燥16至24小时。
该实质上纯的甜菊双糖苷A之最终组合物(27.3克)包含98.22％甜菊双糖苷A、0.04％甜菊苷、0.04％甜菊双糖苷C、0.18％甜菊双糖苷F、0.08％甜菊双糖苷D及1.03％甜菊双糖苷B。HPLC未检测到甜菊醇二苷。
B组实施例
表4：实施例B1至19之总结
实施例B1
组合粗甜菊双糖苷A(77.4％纯度，5克)、乙醇(95％，16毫升)、甲醇(6毫升)及水(2毫升)并加热至回流温度10分钟。令该清澈溶液冷却至22℃16小时。过滤白色结晶产物，以乙醇：甲醇混合液(5毫升，4：1.5体积比)清洗二次，并于真空烘箱中以低压(20毫米)50℃干燥16至24小时，以产生3.2克之纯化产物(>97％以HPLC分析)。
实施例B2
组合粗甜菊双糖苷A(77.4％纯度，5克)、乙醇(95％，16毫升)、甲醇(4毫升)及水(2毫升)并加热至回流温度达10分钟。令该清澈溶液冷却至22℃16小时。过滤白色结晶产物，以乙醇：甲醇混合液(5毫升，4：1体积比)清洗二次，并于真空烘箱中以低压(20毫米)50℃干燥16至24小时，以产生3.1克之纯化产物(>97％以HPLC分析)。
实施例B3
组合粗甜菊双糖苷A(77.4％纯度，5克)、乙醇(95％，9.5毫升)、1-丁醇(9.5毫升)及水(1毫升)并加热至回流温度10分钟。令该清澈溶液冷却至22℃16小时。过滤白色结晶产物，以乙醇：1-丁醇混合液(5毫升，1：1体积比)清洗二次，并于真空烘箱中以低压(20毫米)50℃干燥16至24小时，以产生3.2克之纯化产物(>95％以HPLC分析)。
实施例B4
组合粗甜菊双糖苷A(80.37％纯度，5克)、乙醇(95％，9.5毫升)、甲醇(9毫升)及水(1毫升)并加热至回流温度10分钟。令该清澈溶液冷却至22℃ 16小时。过滤白色结晶产物，以乙醇：甲醇混合液(5毫升，1：1体积比)清洗二次，并于真空烘箱中以低压(20毫米)50℃干燥16至24小时，以产生3.5克之纯化产物(>96％以HPLC分析)。
实施例B5
组合粗甜菊双糖苷A(80.37％纯度，5克)、乙醇(95％，12.5毫升)、甲醇(6毫升)及水(2毫升)并加热至回流温度10分钟。令该清澈溶液冷却至22℃。添加10毫克之98％纯甜菊双糖苷A晶种至溶液中，令该混合液于22℃下静置16小时。过滤白色结晶产物，以乙醇：甲醇混合液(5毫升，4：1体积比)清洗二次，并于真空烘箱中以低压(20毫米)50℃干燥16至24小时，以产生3.3克之纯化产物(>97％以HPLC分析)。
实施例B6
组合粗甜菊双糖苷A(80.37％纯度，5克)、乙醇(95％，12.5毫升)、乙腈(6毫升)及水(1.5毫升)并加热至回流温度10分钟。令该清澈溶液冷却至22℃。添加10毫克之98％纯甜菊双糖苷A晶种至溶液中，令该混合液于22℃下静置16小时。过滤白色结晶产物，以乙醇：乙腈混合液(5毫升，6：3体积比)清洗二次，并于真空烘箱中以低压(20毫米)50℃干燥16至24小时，以产生3.4克之纯化产物(>95％以HPLC分析)。
实施例B7
组合粗甜菊双糖苷A(80.37％纯度，5克)、乙醇(95％，14.5毫升)、乙酸乙酯(4毫升)及水(1.5毫升)并加热至回流温度10分钟。令该清澈溶液冷却至22℃。添加10毫克之98％纯甜菊双糖苷A晶种至溶液中，令该混合液于22℃下静置16小时。过滤白色结晶产物，以乙醇：乙腈混合液(5毫升，7：2体积比)清洗二次，并于真空烘箱中以低压(20毫米)50℃干燥16至24小时，以产生3.4克之纯化产物(>95％以HPLC分析)。
实施例B8
组合粗甜菊双糖苷A(80.37％纯度，5克)、乙醇(95％，16毫升)、甲醇(6毫升)及水(2毫升)并加热至回流温度10分钟。令该清澈溶液冷却至22℃16小时。过滤白色结晶产物，以乙醇：甲醇混合液(5.5毫升，4：1.5体积比)清洗二次，并于真空烘箱中以低压(20毫米)50℃干燥16至24小时，以产生3.2克之纯化产物(>97％以HPLC分析)。
实施例B9
组合粗甜菊双糖苷A(80.37％纯度，5克)、乙醇(95％，16毫升)、甲醇(4毫升)及水(2毫升)并加热至回流温度10分钟。令该清澈溶液冷却至22℃16小时。过滤白色结晶产物，以乙醇：甲醇混合液(5.0毫升，4：1体积比)清洗二次，并于真空烘箱中以低压(20毫米)50℃干燥16至24小时，以产生3.1克之纯化产物(>97％以HPLC分析)。
实施例B10
组合粗甜菊双糖苷A(80.37％纯度，5克)、乙醇(95％，14.5毫升)、甲醇(4毫升)及水(1.5毫升)并加热至回流温度10分钟。令该清澈溶液冷却至22℃16小时。过滤白色结晶产物，以乙醇：甲醇混合液(5.0毫升，7：2体积比)清洗二次，并于真空烘箱中以低压(20毫米)50℃干燥16至24小时，以产生3.4克之纯化产物(>97％以HPLC分析)。
实施例B11
组合粗甜菊双糖苷A(80.37％纯度，5克)、乙醇(95％，16毫升)、甲醇(6毫升)及水(1.5毫升)并加热至回流温度10分钟。令该清澈溶液冷却至22℃16小时。过滤白色结晶产物，以乙醇：甲醇混合液(5.0毫升，8：3体积比)清洗二次，并于真空烘箱中以低压(20毫米)50℃干燥16至24小时，以产生3.2克之纯化产物(>97％以HPLC分析)。
实施例B12
组合粗甜菊双糖苷A(80.37％纯度，5克)、乙醇(95％，16毫升)、甲醇(6毫升)及水(2毫升)并加热至回流温度10分钟。令该清澈溶液冷却至22℃，并添加10毫克之纯甜菊双糖苷A晶种(>98％)。静置该混合液于室温下16小时。过滤白色结晶产物，以乙醇：甲醇混合液(5.0毫升，8：3体积比)清洗二次，并于真空烘箱中以低压(20毫米)50℃干燥16至24小时，以产生3.2克之纯化产物(>98％以HPLC分析)。
实施例B13
组合粗甜菊双糖苷A(80.37％纯度，5克)、乙醇(95％，16毫升)、甲醇(6毫升)及水(2毫升)并加热至回流温度10分钟。令该清澈溶液冷却至22℃，并添加10毫克之纯甜菊双糖苷A晶种(>98％)。于室温下搅拌该混合液16小时。过滤白色结晶产物，以乙醇：甲醇混合液(5.0毫升，8：3体积比)清洗二次，并于真空烘箱中以低压(20毫米)50℃干燥16至24小时，以产生3.4克之纯化产物(>96％以HPLC分析)。
实施例B14
组合粗甜菊双糖苷A(80.37％纯度，5克)、乙醇(95％，15毫升)、甲醇(5毫升)及水(2.5毫升)并加热至回流温度10分钟。在搅拌下令该清澈溶液冷却至22℃ 16小时。过滤白色结晶产物，以乙醇：甲醇混合液(5.0毫升，3：1体积比)清洗二次，并于真空烘箱中以低压(20毫米)50℃干燥16至24小时，以产生3.2克之纯化产物(>97％以HPLC分析)。
实施例B15
组合粗甜菊双糖苷A(80.37％纯度，5克)、乙醇(95％，15毫升)、甲醇(5毫升)及水(3.0毫升)并加热至回流温度10分钟。在搅拌下令该清澈溶液冷却至22℃ 16小时。过滤白色结晶产物，以乙醇：甲醇混合液(5.0毫升，3：1体积比)清洗二次，并于真空烘箱中以低压(20毫米)50℃干燥16至24小时，以产生2.7克之纯化产物(>97％以HPLC分析)。
实施例B16
组合粗甜菊双糖苷A(80.37％纯度，5克)、乙醇(95％，15毫升)、甲醇(5毫升)及水(3.5毫升)并加热至回流温度10分钟。在搅拌下令该清澈溶液冷却至22℃16小时。过滤白色结晶产物，以乙醇：甲醇混合液(5.0毫升，3：1体积比)清洗二次，并于真空烘箱中以低压(20毫米)50℃干燥16至24小时，以产生2.6克之纯化产物(>99％以HPLC分析)。
实施例B17
组合粗甜菊双糖苷A(80.37％纯度，5克)、乙醇(95％，15毫升)、甲醇(5毫升)及水(4.0毫升)并加热至回流温度10分钟。在搅拌下令该清澈溶液冷却至22℃ 16小时。过滤白色结晶产物，以乙醇：甲醇混合液(5.0毫升，3：1体积比)清洗二次，并于真空烘箱中以低压(20毫米)50℃干燥16至24小时，以产生2.3克之纯化产物(>99％以HPLC分析)。
实施例B18
组合粗甜菊双糖苷A(80.37％纯度，5克)、乙醇(95％，16毫升)、甲醇(6毫升)及水(2.5毫升)并加热至回流温度10分钟。令该清澈溶液冷却至22℃。于室温下搅拌该混合液15至30分钟，期间开始出现结晶。停止搅拌，静置该混合液于室温下16小时。过滤白色结晶产物，以乙醇：甲醇混合液(5.0毫升，8：3体积比)清洗二次，并于真空烘箱中以低压(20毫米)50℃干燥16至24小时，以产生3.0克之纯化产物(>97％以HPLC分析)。
实施例B19
组合粗甜菊双糖苷A(80.37％纯度，5克)、乙醇(95％，16毫升)、甲醇(6毫升)及水(2.5毫升)并加热至回流温度10分钟。令该清澈溶液冷却至22℃ 2小时。期间开始出现结晶。于室温下搅拌该混合液16小时。过滤白色结晶产物，以乙醇：甲醇混合液(5.0毫升，8：3体积比)清洗二次，并于真空烘箱中以低压(20毫米)50℃干燥16至24小时，以产生3.2克之纯化产物(>98％以HPLC分析)。
C组实施例
表5：实施例C1至9之总结
实施例C1
组合粗甜菊双糖苷A(80.37％纯度，5克)、甲醇(99％，9.5毫升)、异丙醇(9.5毫升)及水(1毫升)并加热至约40至50℃ 10分钟。令该清澈溶液冷却至22℃ 2小时，然后于室温下搅拌16小时。过滤白色结晶产物、以乙醇：甲醇混合液(5.0毫升，8：3体积比)清洗二次，并于真空烘箱中以低压(20毫米)50℃干燥16至24小时，以产生3.85克之纯化产物(>91.0％以HPLC分析)。
实施例C2
组合粗甜菊双糖苷A(80.37％纯度，5克)、甲醇(99％，9.5毫升)、二级丁醇(9.5毫升)及水(1毫升)并加热至约40至50℃ 10分钟。令该清澈溶液冷却至22℃ 2小时，然后于室温下搅拌16小时。过滤白色结晶产物、以甲醇：二级丁醇混合液(10.0毫升，1：1体积比)清洗二次，并于真空烘箱中以低压(20毫米)50℃干燥16至24小时，以产生4.0克之纯化产物(>91.0％以HPLC分析)。
实施例C3
组合粗甜菊双糖苷A(80.37％纯度，5克)、甲醇(99％，9.5毫升)、1-丙醇(9.5毫升)及水(1毫升)并加热至约40至50℃ 10分钟。令该清澈溶液冷却至22℃ 2小时，然后于室温下搅拌16小时。过滤白色结晶产物、以甲醇：1-丙醇混合液(10.0毫升，1：1体积比)清洗二次，并于真空烘箱中以低压(20毫米)50℃干燥16至24小时，以产生3.55克之纯化产物(>91.21％以HPLC分析)。
实施例C4
组合粗甜菊双糖苷A(80.37％纯度，5克)、乙醇(95％，9.5毫升)、1-丙醇(9.5毫升)及水(1毫升)并加热至约40至50℃ 10分钟。令该清澈溶液冷却至22℃ 2小时，然后于室温下搅拌16小时。过滤白色结晶产物、以乙醇：1-丙醇混合液(10.0毫升，1：1体积比)清洗二次，并于真空烘箱中以低压(20毫米)50℃干燥16至24小时，以产生2.5克之纯化产物(>94.0％以HPLC分析)。
实施例C5
组合粗甜菊双糖苷A(80.37％纯度，5克)、甲醇(99％，9.5毫升)、1-丁醇(9.5毫升)及水(1毫升)并加热至约40至50℃ 10分钟。令该清澈溶液冷却至22℃ 2小时，然后于室温下搅拌16小时。过滤白色结晶产物、以甲醇：1-丁醇混合液(10.0毫升，1：1体积比)清洗二次，并于真空烘箱中以低压(20毫米)50℃干燥16至24小时，以产生3.7克之纯化产物(>91.5％以HPLC分析)。
实施例C6
组合粗甜菊双糖苷A(80.37％纯度，5克)、乙醇(95％，9.5毫升)、2-丙醇(9.5毫升)及水(1毫升)并加热至约40至50℃ 10分钟。令该清澈溶液冷却至22℃ 2小时，然后于室温下搅拌16小时。过滤白色结晶产物、以乙醇：2-丙醇混合液(10.0毫升，1：1体积比)清洗二次，并于真空烘箱中以低压(20毫米)50℃干燥16至24小时，以产生2.4克之纯化产物(>93.5％以HPLC分析)。
实施例C7
组合粗甜菊双糖苷A(77.4％纯度，5克)、乙醇(95％，9.5毫升)、二级丁醇(9.5毫升)及水(1毫升)并加热至回流温度10分钟。令该清澈溶液冷却至22℃ 2小时，然后于室温下搅拌16小时。过滤白色结晶产物、以乙醇：二级丁醇混合液(10.0毫升，1：1体积比)清洗二次，并于真空烘箱中以低压(20毫米)50℃干燥16至24小时，以产生2.9克之纯化产物(>93.0％以HPLC分析)。
实施例C8
组合粗甜菊双糖苷A(77.4％纯度，5克)、甲醇(99％，9.5毫升)、三级丁醇(9.5毫升)及水(1毫升)并加热至约40至50℃ 10分钟。令该清澈溶液冷却至22℃ 2小时，然后于室温下搅拌16小时。过滤白色结晶产物、以甲醇(99％，7.0毫升)清洗二次，并于真空烘箱中以低压(20毫米)50℃干燥16至24小时，以产生3.9克之纯化产物(>83.0％以HPLC分析)。
实施例C9
组合粗甜菊双糖苷A(77.4％纯度，5克)、乙醇(95％，9.5毫升)、三级丁醇(9.5毫升)及水(1毫升)并加热至回流温度10分钟。令该清澈溶液冷却至22℃ 2小时，然后于室温下搅拌16小时。过滤白色结晶产物、以乙醇(95％，7.0毫升)清洗二次，并于真空烘箱中以低压(20毫米)50℃干燥16至24小时，以产生2.9克之纯化产物(>88.0％以HPLC分析)。
D组实施例
表6：实施例D1至12之总结
实施例D1
组合粗甜菊双糖苷A(77.4％纯度，50克)、甲醇(99％，180毫升)及水(20毫升)并加热至回流温度30分钟。令该混合液冷却至环境温度16至24小时。过滤白色结晶产物、以甲醇(99％，25毫升)清洗二次，并于真空烘箱中以低压(20毫米)60℃干燥16至24小时，以产生29.8克之纯化产物(96.2％以HPLC分析)。
实施例D2
组合粗甜菊双糖苷A(80.37％纯度，50克)、甲醇(99％，160毫升)及水(40毫升)并加热至回流温度30分钟。令该混合液冷却至环境温度1周。过滤白色结晶产物、以甲醇(99％，25毫升)清洗二次，并于真空烘箱中以低压(20毫米)60℃干燥16至24小时，以产生31.2克之纯化产物(95.5％以HPLC分析)。
实施例D3
组合粗甜菊双糖苷A(80.37％纯度，50克)、乙醇(95％，188毫升)及水(12毫升)并加热至回流温度30分钟。令该混合液冷却至环境温度16至24小时。过滤白色结晶产物、以乙醇(95％，25毫升)清洗二次，并于真空烘箱中以低压(20毫米)60℃干燥16至24小时，以产生37.3克之纯化产物(93.4％以HPLC分析)。
实施例D4
组合粗甜菊双糖苷A(80.37％纯度，50克)、乙醇(95％，184毫升)及水(16毫升)并加热至回流温度30分钟。令该混合液冷却至环境温度16至24小时。过滤白色结晶产物、以乙醇(95％，25毫升)清洗二次，并于真空烘箱中以低压(20毫米)60℃干燥16至24小时，以产生31.7克之纯化产物(95.3％以HPLC分析)。
实施例D5
组合粗甜菊双糖苷A(80.37％纯度，50克)、乙醇(95％，180毫升)及水(20毫升)并加热至回流温度30分钟。令该混合液冷却至环境温度16至24小时。过滤白色结晶产物、以乙醇(95％，25毫升)清洗二次，并于真空烘箱中以低压(20毫米)60℃干燥16至24小时，以产生35.7克之纯化产物(94.7％以HPLC分析)。
实施例D6
组合粗甜菊双糖苷A(80.37％纯度，50克)、乙醇(95％，176毫升)及水(24毫升)并加热至回流温度30分钟。令该混合液冷却至环境温度16至24小时。过滤白色结晶产物、以乙醇(95％，25毫升)清洗二次，并于真空烘箱中以低压(20毫米)60℃干燥16至24小时，以产生38.2克之纯化产物(97.3％以HPLC分析)。
实施例D7
组合粗甜菊双糖苷A(80.37％纯度，50克)、乙醇(95％，172毫升)及水(28毫升)并加热至回流温度30分钟。令该混合液冷却至环境温度16至24小时。过滤白色结晶产物、以乙醇(95％，25毫升)清洗二次，并于真空烘箱中以低压(20毫米)60℃干燥16至24小时，以产生32.0克之纯化产物(98.1％以HPLC分析)。
实施例D8
组合粗甜菊双糖苷A(80.37％纯度，50克)、乙醇(95％，160毫升)及水(40毫升)并加热至回流温度30分钟。令该混合液冷却至环境温度16至24小时。过滤白色结晶产物、以乙醇(95％，25毫升)清洗二次，并于真空烘箱中以低压(20毫米)60℃干燥16至24小时，以产生19.8克之纯化产物(99.5％以HPLC分析)。
实施例D9
组合粗甜菊双糖苷A(80.37％纯度，50克)、1-丙醇(180毫升)及水(20毫升)并加热至回流温度30分钟。令该混合液冷却至环境温度16至24小时。过滤白色结晶产物、以1-丙醇(25毫升)清洗二次，并于真空烘箱中以低压(20毫米)60℃干燥16至24小时，以产生27.0克之纯化产物(92.9％以HPLC分析)。
实施例D10
组合粗甜菊双糖苷A(80.37％纯度，50克)、2-丙醇(180毫升)及水(20毫升)并加热至回流温度30分钟。令该混合液冷却至环境温度16至24小时。过滤白色结晶产物、以2-丙醇(25毫升)清洗二次，并于真空烘箱中以低压(20毫米)60℃干燥16至24小时，以产生34.9克之纯化产物(91.4％以HPLC分析)。
实施例D11
组合粗甜菊双糖苷A(80.37％纯度，50克)、1-丁醇(180毫升)及水(20毫升)并加热至回流温度30分钟。令该混合液冷却至环境温度16至24小时。过滤白色结晶产物、以1-丁醇(25毫升)清洗二次，并于真空烘箱中以低压(20毫米)60℃干燥16至24小时，以产生40.6克之纯化产物(93.1％以HPLC分析)。
实施例D12
组合粗甜菊双糖苷A(80.37％纯度，50克)、2-丁醇(180毫升)及水(20毫升)并加热至回流温度30分钟。令该混合液冷却至环境温度16至24小时。过滤白色结晶产物、以2-丁醇(25毫升)清洗二次，并于真空烘箱中以低压(20毫米)60℃干燥16至24小时，以产生40.4克之纯化产物(90.5％以HPLC分析)。
E组实施例
表7：实施例E1至E3之总结
| 粗苷菊糖双苷A(克) | 乙醇(95％)(毫升) | 有机共溶剂(毫升) | 水(毫升) | 甲醇浆液(毫升) | 产量(克) | HPLC纯度(％) | |
| E1 | 50 | 160 | 甲醇(60) | 25 | 200 | 12.7 | >97 |
| E2 | 50 | 160 | 甲醇(60) | 25 | 300 | 18.6 | >97 |
| E3 | 50 | 160 | 甲醇(60) | 25 | 350 | 22.2 | >97 |
实施例E1
于22℃下藉搅拌组合粗甜菊双糖苷A(41％纯度，50克)、乙醇(95％，160毫升)、甲醇(99.8％，60毫升)及水(25毫升)。白色产物在5至20小时内结晶。继续搅拌该混合物48小时。过滤白色结晶产物，并以乙醇(95％，25毫升)清洗二次。接着令白色结晶产物之湿饼在甲醇中(99.8％，200毫升)浆化16小时、过滤、以甲醇(99.8％，25毫升)清洗二次，并于真空烘箱中以低压(20毫米)60℃干燥16至24小时，以产生12.7克之纯化产物(>97％以HPLC分析)。
实施例E2
于22℃下藉搅拌组合粗甜菊双糖苷A(48％纯度，50克)、乙醇(95％，160毫升)、甲醇(99.8％，60毫升)及水(25毫升)。白色产物在3至6小时内结晶。继续搅拌该混合物48小时。过滤白色结晶产物，并以乙醇(95％，25毫升)清洗二次。接着令白色结晶产物之湿饼在甲醇中(99.8％，300毫升)浆化16小时、过滤、以甲醇(99.8％，25毫升)清洗二次，并于真空烘箱中以低压(20毫米)60℃干燥16至24小时，以产生18.6克之纯化产物(>97％以HPLC分析)。
实施例E3
于22℃下藉搅拌组合粗甜菊双糖苷A(55％纯度，50克)、乙醇(95％，160毫升)、甲醇(99.8％，60毫升)及水(25毫升)。白色产物在15至30分钟内结晶。继续搅拌该混合物48小时。过滤白色结晶产物，并以乙醇(95％，25毫升)清洗二次。接着令白色结晶产物之湿饼在甲醇中(99.8％，350毫升)浆化16小时、过滤、以甲醇(99.8％，25毫升)清洗二次，并于真空烘箱中以低压(20毫米)60℃干燥16至24小时，以产生22.2克之纯化产物(>97％以HPLC分析)。
实施例F
利用上述纯化技术制备实质上纯的甜菊双糖苷A(>97％纯度，以HPLC分析)，取其加入双蒸馏水(12.5克于50毫升中，浓度25％)并于40℃下搅拌该混合物5分钟以配置溶液。立刻用Lab-Plant SD-04喷雾干燥器(Lab-Plant Ltd.，West Yorkshire，U.K.)将该清澈溶液喷雾干燥，以形成非晶型之甜菊双糖苷A。溶液透过进料泵被吸取至喷嘴喷雾器，使甜菊双糖苷A溶液在固定流量之氮气/空气的协助下被雾化成雾滴喷液。水分在干燥室受控制之温度条件(约90至约97℃)及气流条件下自雾滴中蒸发，导致形成干燥颗粒。此干燥粉末(11至12克，水分6.74％)被连续送出干燥室并收集于罐中。在室温下之溶水性经测定为>35.0％。
虽然本发明详细说明特定实施方案，应了解的是该领域之技术人士一旦理解前述内容将可轻易地构想出这些实施方案之改变、变化及相等物。因此，本发明之范围应被视为其权利要求及任何彼等相同物之范围。
Claims (42)
1.一种纯化甜菊双糖苷A之方法，该法包含下列步骤：
组合粗甜菊双糖苷A与含水有机溶剂以形成甜菊双糖苷A溶液，该含水有机溶液包含按重量计自约10％至约25％之量的水；及
在单一步骤中自甜菊双糖苷A溶液结晶出实质上纯的甜菊双糖苷A组合物，该组合物包含按干物质重量计纯度高于约95％之甜菊双糖苷A。
2.如权利要求1之方法，该法进一步包含加热该甜菊双糖苷A溶液之步骤。
3.如权利要求2之方法，该法进一步包含冷却该甜菊双糖苷A溶液之步骤。
4.如权利要求1之方法，其中在单一结晶步骤中之甜菊双糖苷A溶液系经搅拌或未经搅拌。
5.如权利要求1之方法，该法进一步包含在适当温度下添加足以促进甜菊双糖苷A结晶之量之甜菊双糖苷A至甜菊双糖苷A溶液中之添加晶种步骤(可选择)。
6.如权利要求1之方法，该法进一步包含分离及清洗该实质上纯的甜菊双糖苷A组合物之步骤。
7.如权利要求6之方法，该法进一步包含干燥该实质上纯的甜菊双糖苷A组合物之步骤。
8.如权利要求1之方法，其中该粗甜菊双糖苷A实质上不包含甜菊双糖苷D杂质，且该法进一步包含于含水有机溶剂或有机溶剂中浆化该实质上纯的甜菊双糖苷A组合物。
9.如权利要求8之方法，该法进一步包含分离及清洗该实质上纯的甜菊双糖苷A组合物之步骤。
10.如权利要求9之方法，该法进一步包含干燥该实质上纯的甜菊双糖苷A组合物之步骤。
11.如权利要求1之方法，其中该含水有机溶剂包含一种由至少一种有机溶剂与水组成之混合物。
12.如权利要求11之方法，其中至少一种有机溶剂包含一种醇。
13.如权利要求12之方法，其中该醇包含乙醇。
14.如权利要求12之方法，其中该醇包含甲醇。
15.如权利要求12之方法，其中该醇包含乙醇及甲醇之混合物。
16.如权利要求15之方法，其中该乙醇及甲醇系以自约20份至约1份乙醇对约1份甲醇之重量比存在于该含水有机溶液中。
17.如权利要求15之方法，其中该乙醇及甲醇系以自约3份至约1份乙醇对约1份甲醇之重量比存在于该含水有机溶液中。
18.如权利要求1之方法，其中该至少一种含水有机溶剂包含选自丙酮、乙腈、甲醇、乙醇、1-丙醇、异丙醇、1-丁醇、2-丁醇、三级丁醇及该等混合物之有机溶剂。
19.如权利要求1之方法，其中该含水有机溶剂及该粗甜菊双糖苷A系以自约4至约10份含水有机溶剂对约1份粗甜菊双糖苷A之重量比存在于该甜菊双糖苷A溶液中。
20.如权利要求1之方法，其中该含水有机溶剂及该粗甜菊双糖苷A系以自约3至约5份含水有机溶剂对约1份粗甜菊双糖苷A之重量比存在于该甜菊双糖苷A溶液中。
21.如权利要求1之方法，其中含水有机溶剂包含按重量计自约10％至约25％之量的水。
22.如权利要求1之方法，其中该粗甜菊双糖苷A混合物包含按重量计纯度自约40％至约95％之甜菊双糖苷A。
23.如权利要求1之方法，其中该粗甜菊双糖苷A混合物包含按重量计纯度自约60％至约85％之甜菊双糖苷A。
24.如权利要求1之方法，其中该粗甜菊双糖苷A混合物包含按重量计纯度自约70％至约85％之甜菊双糖苷A。
25.如权利要求1之方法，其中该法系于近室温下进行。
26.如权利要求2之方法，其中该加热甜菊双糖苷A溶液之步骤包含加热甜菊双糖苷A溶液至自约20℃至约40℃之温度范围内。
27.如权利要求2之方法，其中该加热甜菊双糖苷A溶液之步骤包含加热甜菊双糖苷A溶液至自约40℃至约60℃之温度范围内。
28.如权利要求2之方法，其中该加热甜菊双糖苷A溶液之步骤包含加热甜菊双糖苷A溶液至约回流温度。
29.如权利要求3之方法，其中该冷却甜菊双糖苷A溶液之步骤包含冷却甜菊双糖苷A溶液至自约4℃至约25℃之温度范围内。
30.如权利要求3之方法，其中该冷却甜菊双糖苷A溶液之步骤包含冷却甜菊双糖苷A溶液约0.5小时至约24小时之时间。
31.如权利要求1之方法，其中该实质上纯的甜菊双糖苷A产物包含按干物质重量计纯度高于约97％甜菊双糖苷A之甜菊双糖苷A。
32.如权利要求1之方法，其中该实质上纯的甜菊双糖苷A产物包含按干物质重量计纯度高于约98％甜菊双糖苷A之甜菊双糖苷A。
33.如权利要求1之方法，其中该实质上纯的甜菊双糖苷A产物包含按干物质重量计纯度高于约99％甜菊双糖苷A之甜菊双糖苷A。
34.如权利要求1之方法，该法进一步包含下列步骤：
加热甜菊双糖苷A含水有机溶剂混合物；
冷却甜菊双糖苷A溶液；
分离及清洗实质上纯的甜菊双糖苷A组合物；
及
干燥该实质上纯的甜菊双糖苷A组合物。
35.一种藉由权利要求1之方法所制备之实质上纯的甜菊双糖苷A组合物，其中该实质上纯的甜菊双糖苷A组合物包含其X光绕射模式实质上类似图7之多晶型。
36.一种藉由权利要求1之方法所制备之实质上纯的甜菊双糖苷A组合物，其中该实质上纯的甜菊双糖苷A组合物包含其X光绕射模式实质上类似图8之多晶型。
37.一种藉由权利要求1之方法所制备之实质上纯的甜菊双糖苷A组合物，其中该实质上纯的甜菊双糖苷A组合物包含其X光绕射模式实质上类似图9之多晶型。
38.一种藉由权利要求1之方法所制备之实质上纯的甜菊双糖苷A组合物，其中该实质上纯的甜菊双糖苷A组合物包含其X光绕射模式实质上类似图10之多晶型。
39.一种藉由权利要求1之方法所制备之实质上纯的甜菊双糖苷A组合物，其中该实质上纯的甜菊双糖苷A组合物包含其X光绕射模式实质上类似图11之非晶型。
40.如权利要求1之方法，该方法进一步包含形成实质上纯的甜菊双糖苷A组合物之非晶型之步骤。
41.如权利要求38之方法，其中该形成实质上纯的甜菊双糖苷A组合物之非晶型之步骤包含选自球磨法、沉淀法、冻干法、冻磨法及喷雾干燥法中之方法。
42.一种藉由权利要求1之方法所制备之实质上纯的甜菊双糖苷A组合物。
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