ES2709439T3

ES2709439T3 - Producción recombinante de glucósidos de esteviol

Info

Publication number: ES2709439T3
Application number: ES14857965T
Authority: ES
Inventors: Guohong Mao; Xiaodan Yu
Original assignee: Conagen Inc
Current assignee: Conagen Inc
Priority date: 2013-11-01
Filing date: 2014-10-03
Publication date: 2019-04-16
Anticipated expiration: 2034-10-03
Also published as: MX2016005677A; MX367771B; JP6530760B2; US10253344B2; US20160251635A1; AU2017254856A1; RU2019135831A; US10081826B2; RU2016120635A; JP2017500056A; CA2928940C; CN106103729B; AU2014342939B2; CN106103729A; US20170298404A1; WO2015065650A3; AU2014342939A1; RU2706789C2; EP3063286A2; US20170081691A1

Abstract

Un método para producir una composición de glucósido de esteviol o la síntesis de un compuesto de glucósido de esteviol, el método comprende incubar un sustrato con un polipéptido recombinante que es una UDP- glucosiltransferasa que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la glucosiltransferasa de HVI como se expone en la sec. con núm. de ident. :6 en presencia de UDP-glucosa como donante de glucosa.

Description

DESCRIPCION

Produccion recombinante de glucosidos de esteviol.

En la presente descripcion se proporciona un listado de secuencias. Este listado de secuencias consta de las secuencias con num. de ident.: 1 -12.

Antecedentes de la invencion

La presente descripcion se refiere generalmente a la biosmtesis de glucosidos de esteviol. En particular, la presente descripcion se refiere a un polipeptido recombinante que cataliza la produccion de glucosidos de esteviol tales como rebaudiosido D, rebaudiosido E y un nuevo rebaudiosido (rebaudiosidoZ).

Los glucosidos de esteviol son productos naturales aislados de las hojas de Stevia rebaudiana y se usan ampliamente como edulcorantes de alta intensidad y bajos en calonas. Los glucosidos de esteviol de origen natural tienen la misma estructura de base (esteviol) y difieren en el contenido de residuos de carbohidratos (por ejemplo, residuos de glucosa, ramnosa y xilosa) en las posiciones C13 y C19. Los glucosidos de esteviol con estructura conocida incluyen esteviosido, rebaudiosido A, rebaudiosido B, rebaudiosido C, rebaudiosido D, rebaudiosido E, rebaudiosido F y dulcosido A.

Sobre la base del peso seco, el esteviosido, el rebaudiosido A, el rebaudiosido C y el dulosido A representan 9,1, 3,8, 0,6 y 0,3 % del peso total de los glucosidos de esteviol en las hojas, respectivamente, mientras que los otros glucosidos de esteviol estan presentes en cantidades mucho menores. Los extractos de la planta de Stevia rebaudiana se encuentran disponibles comercialmente y contienen tfpicamente esteviosido y rebaudiosido A como compuestos primarios. Los otros glucosidos de esteviol tfpicamente estan presentes en el extracto de estevia como componentes menores. Por ejemplo, la cantidad de rebaudiosido A en preparaciones comerciales puede variar de aproximadamente 20 % a mas de 90 % del contenido total de glucosido de esteviol, mientras que la cantidad de rebaudiosido B puede ser de aproximadamente 1-2 %, la cantidad de rebaudiosido C puede ser de aproximadamente 7-15 %, y la cantidad de rebaudiosido D puede ser de aproximadamente 2 % del total de glucosidos de esteviol.

Como edulcorantes naturales, los diferentes glucosidos de esteviol tienen diferentes grados de dulzory sabor. La dulzura de los glucosidos de esteviol es significativamente mas alta que la de la sacarosa. Por ejemplo, el esteviosido es 100-150 veces mas dulce que la sacarosa con sabor amargo, mientras que el rebaudiosido A y E son 250-450 veces mas dulce que la sacarosa y el sabor es mucho mejor que el esteviosido. En consecuencia, el perfil de sabor de cualquier extracto de estevia se ve profundamente afectado por el contenido relativo de los glucosidos de esteviol en el extracto, que a su vez puede verse afectado por la fuente de la planta, los factores ambientales (como el contenido del suelo y el clima), y el proceso de extraccion. En particular, las variaciones de las condiciones de extraccion pueden llevar a composiciones inconsistentes de los glucosidos de esteviol en los extractos de estevia, de modo que el perfil de sabor vana entre diferentes lotes de productos de extraccion. El perfil de sabor de los extractos de estevia tambien puede verse afectado por contaminantes derivados de las plantas (como pigmentos, lfpidos, protemas, compuestos fenolicos y sacaridos) que permanecen en el producto despues del proceso de extraccion. Estos contaminantes tfpicamente tienen sabores desagradables indeseables para el uso del extracto de estevia como edulcorante.

La mayona de los glucosidos de esteviol estan formados por varias reacciones de glucosilacion del esteviol, que tfpicamente son catalizadas por las UDP-glucosiltransferasas (UGT) mediante el uso de uridina 5'-difosfoglucosa (UDP-glucosa) como donante del resto de azucar. En las plantas, las UGT son un grupo de enzimas muy divergentes que transfieren un residuo de glucosa de UDP-glucosa al esteviol. El esteviosido es un intermedio en la biosmtesis de compuestos rebaudiosido. Por ejemplo, la glucosilacion del C-3' de la C-13-O-glucosa del esteviosido produce el rebaudiosido A; y la glucosilacion del C-2' de la 19-O-glucosa del esteviosido produce rebaudiosido E. Ademas, la glucosilacion del rebaudiosido A (en 19-O-glucosa) o el rebaudiosido E (en C-13-O-glucosa) produce rebaudiosido D. (Figura 1).

Un enfoque practico para mejorar la calidad del sabor del extracto de estevia es aumentar el rendimiento de los compuestos de rebaudiosidos mediante la glucosilacion adicional del esteviosido. Las UGT con una actividad de glucosilacion de 1,2-19-O-glucosa son enzimas importantes para la produccion de rebaudiosidos D y E.

La sacarosa sintasa (SUS) cataliza la conversion de la UDP a UDP-glucosa en presencia de sacarosa. Por lo tanto, para una reaccion de glucosilacion que utiliza UDP-glucosa (como las catalizadas por los UGT), la SUS puede usarse para regenerar UDP-glucosa a partir de UDP, lo que mejora la eficiencia de dicha reaccion (Figura 2).

Por consiguiente, existe la necesidad de glucosidos de esteviol con un perfil de sabor consistente y menos sabor desagradable que los productos comerciales existentes. La entrada F2DT21_HORVV de Uniprot describe una protema glucosiltransferasa de Hordeum vulgare subsp. vulgar (cebada domesticada). El documento Us 2013/0171328 describe la produccion de glucosidos de esteviol en microorganismos. El documento WO 2013/022989 tambien describe la produccion recombinante de glucosidos de esteviol.

Como se describe en la presente descripcion, la presente descripcion proporciona un polipeptido recombinante util para preparar glucosidos de esteviol (tales como el rebaudiosido D y el rebaudiosido E). La presente descripcion tambien proporciona un metodo para producir una composicion de glucosido de esteviol (rebaudiosido Z) mediante el uso de dicho polipeptido recombinante.

Breve descripcion

La presente tecnologfa se refiere generalmente a polipeptidos recombinantes que tienen actividades de UDP-glucosiltransferasa, en particular, polipeptidos que tienen una actividad de glucosilacion de 1,2-19-0-glucosa en compuestos de glucosido de esteviol. La presente invencion proporciona el uso de un polipeptido recombinante que comprende una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 80 % de identidad con la sec. con num. ident.: 6 para producir un glucosido de esteviol. Mas particularmente, la presente invencion proporciona un metodo para producir un glucosido de esteviol o la smtesis de un compuesto de glucosido de esteviol, el metodo comprende incubar un sustrato con un polipeptido recombinante que es una UDP-glucosiltransferasa que comprende una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 80 % de identidad con la secuencia de aminoacidos de la glucosiltransferasa HVI como se expone en la sec. con num. de ident.: 6 en presencia de UDP-glucosa como donante de glucosa. En un aspecto ilustrativo, la secuencia de aminoacidos del polipeptido recombinante para tal uso tiene al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o incluso 100 % de identidad con la sec. con num. de ident.: 6.

En la presente descripcion tambien se describe un acido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido recombinante para dicho uso, en donde la secuencia de nucleotidos tiene al menos 80 % de identidad con la sec. con num. de ident.: 7. Tambien se describe un vector que comprende un acido nucleico de este tipo y una celula huesped que comprende el vector descrito en la presente descripcion. En una modalidad ilustrativa, la celula huesped de la presente tecnologfa se selecciona del grupo que consiste en bacterias, levaduras, hongos filamentosos, cianobacterias, algas y celulas vegetales.

En otro aspecto, la presente tecnologfa tambien se refiere a un metodo para producir una composicion de glucosido de esteviol, el metodo comprende incubar un sustrato (tal como esteviosido, rebaudiosido A, rebaudiosido E o una combinacion de los mismos) con un polipeptido recombinante que comprende una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 80 % de identidad con la sec. con num. de ident.: 6. En un aspecto ilustrativo, la secuencia de aminoacidos del polipeptido recombinante usado en el metodo descrito en la presente descripcion tiene al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o incluso 100 % de identidad con la sec. con num. de ident.:6.

En otro aspecto, la presente tecnologfa tambien se refiere a un metodo para producir una composicion de glucosido de esteviol, el metodo comprende incubar un sustrato (tal como esteviosido y rebaudiosido E) con un polipeptido recombinante que comprende una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 80 % de identidad con la sec. con num. de ident.:11. En un aspecto ilustrativo, la secuencia de aminoacidos del polipeptido recombinante usado en el metodo descrito en la presente descripcion tiene al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o incluso 100 % de identidad con la sec. con num. de ident.:11.

En una modalidad, el metodo comprende ademas incubar una sacarosa sintasa recombinante (tal como una con una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 80 % de identidad con la secuencia de aminoacidos de AtSUS1 como se indica en la sec. con num. de ident.: 9) con el sustrato y el polipeptido recombinante descrito en la presente descripcion. En otra modalidad, el metodo comprende ademas incubar una UDP-glucosiltransferasa recombinante (tal como una con una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 80 % de identidad con la secuencia de aminoacidos de UGT76G1 como se indica en la sec. con num. de ident.: 11) con la sacarosa sintasa recombinante, el sustrato y el polipeptido recombinante descritos en la presente descripcion. En otro aspecto, el metodo descrito en la presente descripcion comprende incubar el sustrato con una celula huesped que expresa el polipeptido recombinante.

La presente tecnologfa tambien se refiere a un nuevo glucosido de esteviol, denominado rebaudiosido Z, que se caracteriza por un tiempo de retencion de aproximadamente 6,68 minutos en una HPLC bajo las condiciones descritas en la presente descripcion. La presente tecnologfa tambien se refiere a un metodo para producir rebaudiosido Z descrito en la presente descripcion, el metodo comprende incubar un sustrato con un polipeptido recombinante que comprende una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 80 % de identidad con la sec. con num. de ident.: 6. Como se usa en la presente descripcion, los terminos "rebaudiosido Z" o "Reb Z" se refieren a una mezcla de compuestos, en particular, una mezcla de rebaudiosido Z1 ("Reb Z1") y rebaudiosido Z2 ("Reb Z2").

En una modalidad, la presente descripcion se dirige ademas a un metodo para sintetizar rebaudiosido Z a partir de rebaudiosido E. El metodo incluye: preparar una mezcla de reaccion que comprende rebaudiosido E, un sustrato seleccionado del grupo que consiste en sacarosa, difosfato de uridina (UDP) y uridina difosfato-glucosa (UDP-glucosa) y HV1, y sacarosa sintasa, incubar la mezcla de reaccion durante un tiempo suficiente para producir rebaudiosido Z, en donde una glucosa se acopla covalentemente al rebaudiosido E para producir rebaudiosido Z, una glucosa se acopla covalentemente a la C2'-13-O-glucosa del rebaudiosido E para producir rebaudiosido Z1, y una glucosa se acopla covalentemente a C2'-19-O-glucosa del rebaudiosido E para producir el rebaudiosido Z2.

En una modalidad, el compuesto rebaudiosido Z es rebaudiosido Z1 (Reb Z1) que tiene la estructura:

En una modalidad, el compuesto rebaudiosido Z es rebaudiosido Z2 (Reb Z2) que tiene la estructura:

Como se describe en la presente description, los polipeptidos recombinantes de la presente tecnologia se usan para desarrollar un metodo biosintetico para preparar glucosidos de esteviol que son tipicamente de baja abundancia en fuentes naturales, tales como el rebaudiosido Dyel rebaudiosido E. En consecuencia, la presente tecnologfa tambien proporciona una composition de glucosidos de esteviol producida por el metodo biosintetico descrito en la presente descripcion. Dicha composicion puede comprender un compuesto de glucosido de esteviol que se selecciona del grupo que consiste en rebaudiosido D, rebaudiosido E, un nuevo rebaudiosido(denominado en la presente descripcion "rebaudiosido Z" y "Reb Z") y sus combinaciones. Ademas, tambien se proporciona un edulcorante que comprende la composicion de glucosido de esteviol que se describe en la presente descripcion.

En una modalidad, la presente descripcion se dirige a un edulcorante que incluye un compuesto que tiene la estructura qrnmica:

En otra modalidad, el edulcorante incluye un compuesto quetiene la estructura qmmica:

La presente descripcion se refiere ademas al uso de edulcorantes en productos consumibles tales como bebidas, confitena, productos de panadena, galletas y chicles.

Breve descripcion de las figuras

La descripcion se comprendera mejor, y las caractensticas, aspectos y ventajas distintas de las expuestas anteriormente se haran evidentes cuando se considere la siguiente descripcion detallada de la misma. Dicha descripcion detallada hace referencia a las siguientes figuras, en donde:

La Figura 1 es un esquema que ilustra las rutas de biosmtesis de glucosidos de esteviol a partir de esteviosido. Como se describe en la presente descripcion, el polipeptido HV1 recombinante ("HV1") tiene una actividad de glucosilacion 1,2-19-O-glucosa que transfiere un segundo resto de azucar al C-2' de 19-O-glucosa de esteviosido para producir rebaudiosido E ("Reb E"), o de manera similar para producir rebaudiosido D ("Reb D") a partir de rebaudiosido A ("Reb A"). La Figura 1 tambien muestra que una enzima UGT76G1 recombinante ("UGT76G1", diferente del polipeptido HV1 recombinante) cataliza la reaccion que transfiere un resto de azucar a C-3' de la C-13-O-glucosa de esteviosido para producir rebaudiosido A, o de manera similar para producir rebaudiosido D a partir de rebaudiosido E.

La Figura 2 muestra un esquema ilustrativo de un sistema de reaccion de acoplamiento de UDP-glucosiltransferasa ("UGT") y sacarosa sintasa ("SUS"). La reaccion 1 muestra una reaccion catalizada por UGT que convierte el rebaudiosido A ("Reb A") en rebaudiosido D ("Reb D"), que usa UDP-glucosa como donante de glucosa y da como resultado la produccion de UDP. La reaccion 2 muestra una reaccion catalizada por SUS que convierte UDP en UDP-glucosa, que usa sacarosa como donante de glucosa. La reaccion 2 tambien muestra que la reaccion catalizada por SUS puede acoplarse a la reaccion catalizada por UGT.

La Figura 3 muestra la produccion in vitro de rebaudiosido D ("Reb D") a partir de rebaudiosido A ("Reb A") catalizada por un polipeptido HV1 recombinante (sec. con num. de ident.: 6) y un AtSUS1 recombinante (sec. con num. de ident.: 9) en un sistema de reaccion de acoplamiento HV1-AtSUS1 como se describio en la presente descripcion. La Figura 3Amuestra los estandares de esteviosido ("Ste"), rebaudiosido A ("Reb A") y rebaudiosido D ("Reb D"). Los resultados a las 6, 9, 12 y 24 horas se muestran en las Figuras 3B-E, respectivamente. Los resultados de la reaccion sin el AtSUS1 recombinante (es decir, una reaccion sin acoplamiento) a las 12 y 24 horas se muestran en las Figuras 3F y 3G, respectivamente.

La Figura 4 muestra la produccion in vitro de rebaudiosido E ("Reb E") a partir de esteviosido catalizada por un polipeptido HV1 recombinante (sec. con num. de ident.: 6) y un AtSUSI recombinante (sec. con num. de ident.: 9) en un sistema de reaccion de acoplamiento HV1-AtSUS1 como se describio en la presente descripcion. La Figura 4A muestra los estandares de esteviosido ("Ste"), rebaudiosido A ("Reb A") y rebaudiosido D ("Reb D"). El resultado a las 20 horas se muestra en las Figuras 4B, que incluye un compuesto rebaudiosido Z ("Reb Z").

La Figura 5 muestra la produccion in vitro de rebaudiosido D ("Reb D") a partir de esteviosido catalizada por una combinacion de un polipeptido HV1 recombinante (sec. con num. de ident.: 6), un UGT76G1 recombinante (sec. con num. de ident.: 11) y un A tsU sI recombinante (sec. con num. de ident.: 9). La Figura 5A muestra los estandares de esteviosido ("Ste"), rebaudiosido A ("Reb A") y rebaudiosido D ("Reb D"). Los resultados a las 6, 9, 12 y 24 horas se muestran en las Figuras 5BE, respectivamente.

La Figura 6 muestra el analisis de SDS-PAGE del polipeptido HV1 recombinante purificado.

La Figura 7 muestra el analisis de SDS-PAGE del polipeptido AtSUS1 recombinante purificado.

La Figura 8 muestra la produccion in vitro de rebaudiosido Z ("Reb Z") a partir de rebaudiosido E ("Reb E") catalizada por un polipeptido HV1 recombinante (sec. con num. de ident.: 6) y un AtSUS1 recombinante (sec. con num. de ident.: 9) en un sistema de reaccion de acoplamiento HV1-AtSUS1 como se describio en la presente descripcion. La Figura 8A muestra los estandares del rebaudiosido E ("Reb E"). El resultado a las 24 horas se muestra en las Figuras 8B, que incluye un compuesto rebaudiosido Z ("Reb Z").

La Figura 9 muestra el analisis de SDS-PAGE del polipeptido UGT76G1 recombinante purificado.

Figura 10: Estructuras de rebaudiosido Z (incluyendo Reb Z1 y Reb Z2) y rebaudiosido E.

Figura 11: Correlaciones principales de TOCSY y HMBC para Reb Z1 y Reb Z2.

Figura 12: muestra la produccion in vitro de rebaudiosido D ("Reb D") a partir de rebaudiosido E ("Reb E") catalizada por un UGT76G1 recombinante (sec. con num. de ident.: 11). La Figura 12A-12B muestra los estandares de rebaudiosido E ("Reb E"), rebaudiosido D ("Reb D"). Los resultados de la reaccion sin el AtSUS1 recombinante (Figura 12C) (es decir, una reaccion sin acoplamiento) y con el AtSUS1 recombinante (Figura 12D) (es decir, la reaccion de acoplamiento UGT-SUS) a las 6 horas se muestran respectivamente.

Si bien la descripcion es susceptible de diversas modificaciones y formas alternativas, sus modalidades espedficas se mostrado a manera de ejemplo en los dibujos y se describen en la presente descripcion a detalle mas abajo.

Descripcion Detallada

La presente tecnologfa proporciona el uso de un polipeptido recombinante que tiene actividades de UDP-glucosiltransferasa, mas particularmente actividad de glucosilacion de 1,2-19-O-glucosa y actividad de glucosilacion de 1,2-13-O-glucosa, para sintetizar glucosidos de esteviol. El polipeptido recombinante de la presente tecnologfa (que tambien puede denominarse "polipeptido HV1 recombinante" en lo sucesivo) es util para la biosmtesis de compuestos de glucosido de esteviol. En la presente descripcion, la UDP-glucosiltransferasa (UGT) se refiere a una enzima quetransfiere un residuo de azucar de una molecula donadora activada (tfpicamente UDP-glucosa) a una molecula aceptora. La actividad de la glucosilacion 1,2-19-O-glucosa se refiere a una actividad enzimatica que transfiere un resto de azucar al C-2' del resto 19-O-glucosa de esteviosido, rebaudiosido A o rebaudiosido E (Figura 1 y Figura 10). La actividad de la glucosilacion 1,2-13-O-glucosa se refiere a una actividad enzimatica que transfiere un resto azucar al C-2' del resto 13-O-glucosa del rebaudiosido E (Figura 10).

Los nombres de las enzimas UGT usadas en la presente descripcion son consistentes con el sistema de nomenclatura adoptado por el Comite de Nomenclatura UGT (Mackenzie y otros, "La superfamilia del gen de la glucosiltransferasa UDP: nomenclatura recomendada actualizada segun la divergencia evolutiva," Pharmacogenetics, 1997, vol. 7, pp. 255-269), que clasifica los genes UGT por la combinacion de un numero de familia, una letra que denota una subfamilia y un numero para un gen individual. Por ejemplo, el nombre "UGT76G1" se refiere a una enzima UGT codificada por un gen que pertenece a la familia de UGT numero 76 (que es de origen vegetal), subfamilia G y gen numero 1.

Existe una gran familia de genes UGT en las plantas. Sin embargo, las funciones biologicas de la mayona de estas UGT siguen desconociendose.

Definiciones

Como se usa en la presente descripcion, las formas en singular "un", "uno/una" y "el/la" incluyen las referencias en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

En la medida en que el termino "incluyen", "tienen" o similares se usan en la descripcion o las reivindicaciones, dicho termino se destina a ser inclusivo de una manera similar al termino "comprenden" tal como se interpreta el termino "comprenden" cuando se emplea como una palabra transicional en una reivindicacion.

La palabra "ilustrativo" se usa en la presente descripcion y significa "que sirve como un ejemplo, caso, o ilustracion." Cualquier modalidad descrita en la presente descripcion como "ilustrativa" no debe interpretarse necesariamente como preferida o ventajosa sobre otras modalidades.

El termino "complementario" debe recibir su significado comun y habitual para una persona con experiencia corriente en la tecnica, y se utiliza sin limitacion para describir la relacion entre las bases de nucleotidos que pueden hibridarse entre su Por ejemplo, con respecto al ADN, la adenosina es complementaria a la timina y la citosina es complementaria a la guanina. Por consiguiente, la presente tecnologfa tambien incluye fragmentos de acido nucleico aislados que son complementarios a las secuencias completas tal como se informa en el Listado de Secuencias que se acompana, asf como tambien aquellas secuencias de acido nucleico sustancialmente similares.

Los terminos "acido nucleico" y "nucleotido" deben recibir sus respectivos significados comunes y habituales para una persona con experiencia corriente en la tecnica, y se usan sin limitacion para referirse a los desoxirribonucleotidos o ribonucleotidos y sus polfmeros, ya sea en forma de cadena simple o doble. A menos que se limite espedficamente, el termino abarca acidos nucleicos que contienen analogos conocidos de nucleotidos naturales que tienen propiedades de union similares al acido nucleico de referencia y se metabolizan de manera similar a los nucleotidos de origen natural. A menos que se indique de otra forma, una secuencia de acido nucleico particular implfcitamente tambien abarca las variantes redundantes o modificadas de forma conservadora de estos (por ejemplo, las sustituciones de codones redundantes) y las secuencias complementarias, asf como tambien la secuencia que se indica explfcitamente.

El termino "aislado" debe recibir su significado comun y habitual para una persona con experiencia corriente en la tecnica, y cuando se usa en el contexto de un acido nucleico aislado o un polipeptido aislado, se usa sin limitacion para referirse a un acido nucleico o polipeptido que, de la mano del hombre, existe aparte de su entorno nativo y, por lo tanto, no es un producto de la naturaleza. Un acido nucleico o polipeptido aislado puede existir en una forma purificada o puede existir en un entorno no nativo tal como, por ejemplo, en una celula huesped transgenica.

Los terminos "incubar" e "incubacion", como se usan en la presente descripcion, significan un proceso de mezclar dos o mas entidades qmmicas o biologicas (como un compuesto qmmico y una enzima) y permitirles interactuar en condiciones favorables para producir una composicion de glucosido de esteviol.

El termino "variante redundante" se refiere a una secuencia de acido nucleico que tiene una secuencia de residuos que difiere de una secuencia de acido nucleico de referencia en una o mas sustituciones de codones redundantes. Las sustituciones de codones redundantes pueden lograrse mediante la generacion de secuencias en las cuales la tercera posicion de uno o mas (o todos) codones seleccionados se sustituye con residuos con base mezclada y/o desoxiinosina. Una secuencia de acido nucleico y todas sus variantes degeneradas expresaran el mismo aminoacido o polipeptido.

Los terminos "polipeptido", "protema" y "peptido" deben recibir sus respectivos significados ordinarios y habituales para una persona con experiencia ordinaria en la tecnica; los tres terminos a veces se usan indistintamente, y se usan sin limitacion para referirse a un polfmero de aminoacidos, o analogos de aminoacidos, independientemente de su tamano o funcion. Aunque la "protema" se usa a menudo en referencia a polipeptidos relativamente grandes, y el "peptido" se usa a menudo en referencia a polipeptidos pequenos, el uso de estos terminos en la tecnica se solapa y vana. El termino "polipeptido" como se usa en la presente descripcion se refiere a peptidos, polipeptidos y protemas, a menos que se indique lo contrario. Los terminos "protema", "polipeptido" y "peptido" se usan indistintamente en la presente descripcion cuando se hace referencia a un producto polinucleotidico. Asf, los ejemplos de polipeptidos incluyen productos polinucleotfdicos, protemas naturales, homologos, ortologos, paralogos, fragmentos y otros equivalentes, variantes y analogos de los anteriores.

A los terminos "fragmento de polipeptido" y "fragmento", cuando se usan en referencia a un polipeptido de referencia, se les debe otorgar sus significados comunes y habituales a una persona con experiencia corriente en la tecnica, y se usan sin limitacion para referirse a un polipeptido en el cual se eliminan residuos de aminoacidos en comparacion con el propio polipeptido de referencia, pero donde la secuencia de aminoacidos restante es generalmente identica a las posiciones correspondientes en el polipeptido de referencia. Dichas eliminaciones pueden ocurriren el extremo amino o en el extremo carboxilo del polipeptido de referencia, o alternativamente ambos.

El termino "fragmento funcional" de un polipeptido o protema se refiere a un fragmento peptfdico que es una porcion del polipeptido o protema de longitud completa, y tiene sustancialmente la misma actividad biologica, o desempena sustancialmente la misma funcion que el polipeptido o protema de longitud completa (por ejemplo, al realizar la misma reaccion enzimatica).

Los terminos "polipeptido variante", "secuencia de aminoacidos modificada" o "polipeptido modificado", que se usan indistintamente, se refieren a una secuencia de aminoacidos que es diferente del polipeptido de referencia por uno o mas aminoacidos, por ejemplo, por uno o mas Sustituciones, supresiones y/o adiciones de aminoacidos. En un aspecto, una variante es una "variante funcional" que conserva parte o toda la capacidad del polipeptido de referencia.

El termino "variante funcional" incluye ademas variantes con sustituciones conservativas. El termino "variante sustituida de forma conservativa" se refiere a un peptido que tiene una secuencia de aminoacidos que difiere de un peptido de referencia en una o mas sustituciones de aminoacidos conservativas, y mantiene parte o toda la actividad del peptido de referencia. Una "sustitucion conservativa de aminoacidos" es una sustitucion de un residuo de aminoacido con un residuo funcionalmente similar. Ejemplos de sustituciones conservativas incluyen la sustitucion de un residuo no polar (hidrofobico) tal como isoleucina, valina, leucina o metionina por otro similar, la sustitucion de un residuo polar o cargado (hidrofflico) por otro similar tal como de entre arginina y lisina, entre glutamina y asparagina, entre treonina y serina; la sustitucion de un residuo basico tal como lisina o arginina por otro; o la sustitucion de un residuo acido, tal como acido aspartico o acido glutamico por otro; o la sustitucion de un residuo aromatico, tal como fenilalanina, tirosina o triptofano por otro. Se espera que tales sustituciones tengan poco o ningun efecto sobre el peso molecular aparente o el punto isoelectrico de la protema o polipeptido. La frase "variante sustituida de forma conservativa" tambien incluye peptidos en donde un residuo se reemplaza con un residuo derivado qmmicamente, siempre y cuando el peptido resultante mantenga parte o toda la actividad del peptido de referencia como se describe en la presente descripcion.

El termino "variante", en relacion con los polipeptidos de la presente tecnologfa, incluye ademas un polipeptido funcionalmente activo que tiene una secuencia de aminoacidos al menos 75 %, al menos 76 %, al menos 77 %, al menos 78 %, al menos 79 %. %, al menos 80 %, al menos 81 %, al menos 82 %, al menos 83 %, al menos 84 %, al menos 85 %, al menos 86 %, al menos 87 %, al menos 88 %, al menos 89 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, e incluso 100 % identico a la secuencia de aminoacidos de un polipeptido de referencia.

El termino "homologo" en todas sus formas gramaticales y variaciones ortograficas se refiere a la relacion entre polinucleotidos o polipeptidos que poseen un "origen evolutivo comun", incluidos los polinucleotidos o polipeptidos de superfamilias y polinucleotidos o protemas homologas de diferentes especies (Reeck y otros, Cell 50: 667, 1987). Dichos polinucleotidos o polipeptidos tienen homologfa de secuencia, como se refleja por su similitud de secuencia, ya sea en terminos de por ciento de identidad o la presencia de aminoacidos espedficos o motivos en posiciones conservadas. Por ejemplo, dos polipeptidos homologos pueden tener secuencias de aminoacidos que son al menos 75 %, al menos 76 %, al menos 77 %, al menos 78 %, al menos 79 %, al menos 80 %, al menos 81 %, al menos 82 %, al menos 83 %, al menos 84 %, al menos 85 %, al menos 86 %, al menos 87 %, al menos 88 %, al menos 89 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % e incluso 100 % identicos.

"Por ciento (%) de identidad de secuencia de aminoacidos" con respecto a las secuencias de polipeptido variante de la presente tecnologfa se define como el por ciento de residuos de aminoacidos en una secuencia candidato que son identicos con los residuos de aminoacidos del polipeptido de referencia (como tal, por ejemplo, la sec. con num. de ident.:6), despues de alinear las secuencias e introducir interrupciones, si fuera necesario, para obtener el por ciento maximo de identidad de secuencia, y sin considerar cualquiera de las sustituciones conservativas como parte de la secuencia de identidad.

El alineamiento para fines de determinar el por ciento de identidad de la secuencia de aminoacidos puede lograrse de varias maneras que estan dentro del conocimiento en la tecnica, por ejemplo, usando programas computarizados publicamente disponibles tales como los programas BLAST, BLAST-2, ALIGN-2 o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la tecnica pueden determinar los parametros adecuados para medir el alineamiento, que incluye cualquiera de los algoritmos necesarios para lograr el alineamiento maximo sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan. Por ejemplo, el % de identidad de secuencia de aminoacidos puede determinarse utilizando el programa de comparacion de secuencias NCBI-BLAST2. El programa de comparacion de secuencias NCBI-BLAST2 puede descargarse de ncbi.nlm.nih.gov. El NCBI-BLAST2 usa varios parametros de busqueda, en donde todos esos parametros de busqueda se fijan para valores predeterminados que incluyen, por ejemplo, desenmascarar sf, cadena = todos, eventos esperados = 10, longitud minima de baja complejidad = 15/5, valor-e multipaso = 0,01, constante de multipaso = 25, cafda para alineacion con espacios final = 25 y la matriz de puntuacion = BLOSUM62. En situaciones donde se emplea NCBI-BLAST2 para las comparaciones de secuencias de aminoacidos, el % de identidad de secuencia de aminoacidos de una secuencia dada de aminoacidos A para, con, o contra una secuencia dada de aminoacidos B (que puede expresarse alternativamente como una secuencia dada de aminoacidos A que tiene o comprende un cierto % de identidad de secuencia de aminoacidos para, con, o contra una secuencia dada de aminoacidos B) se calcula como sigue: 100 veces la fraccion X/Y donde X es el numero de residuos de aminoacidos acumulados como coincidencias identicas por el programa de alineamiento de secuencias NCBI-BLAST2 en ese alineamiento del programa de A y B, y donde Y es el numero total de residuos de aminoacidos en B. Se apreciara que cuando la longitud de la secuencia de aminoacidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoacidos B, el % de identidad de secuencia de aminoacidos de A a B no sera igual al % de identidad de secuencia de aminoacidos de B a A.

En este sentido, las tecnicas para determinar la "similitud" de la secuencia de aminoacidos se conocen bien en la tecnica. En general, "similitud" significa la comparacion exacta de aminoacido a aminoacido de dos o mas polipeptidos en el lugar apropiado, donde los aminoacidos son identicos o poseen propiedades qmmicas y/o ffsicas similares, como la carga o la hidrofobicidad. Un denominado "por ciento de similitud" puede entonces determinarse entre las secuencias polipeptidicas comparadas. Las tecnicas para determinar la identidad de la secuencia de aminoacidos y acidos nucleicos tambien son bien conocidas en la tecnica e incluyen la determinacion de la secuencia de nucleotidos del ARNm para ese gen (generalmente a traves de un intermedio de ADNc) y la determinacion de la secuencia de aminoacidos codificada en el mismo, y comparando esto con un segunda secuencia de aminoacidos. En general, "identidad" se refiere a una correspondencia exacta de nucleotido a nucleotido o de aminoacido a aminoacido de dos secuencias polinucleotfdicas o polipeptfdicas, respectivamente. Pueden compararse dos o mas secuencias de polinucleotidos determinando su "por ciento de identidad", al igual que dos o mas secuencias de aminoacidos. Los programas disponibles en el Paquete de Analisis de Secuencias de Wisconsin, Version 8 (disponible de Genetics Computer Group, Madison, WI), por ejemplo, el programa GAP, son capaces de calcular tanto la identidad entre dos polinucleotidos como la identidad y similitud entre dos secuencias de polipeptidos, respectivamente. Los expertos en la tecnica conocen otros programas para calcular la identidad o similitud entre secuencias.

Una posicion de aminoacido "correspondiente a" una posicion de referencia es una posicion que se alinea con una secuencia de referencia, como se identifica al alinear las secuencias de aminoacidos. Dichos alineamientos pueden hacerse a mano o utilizando programas de alineamiento de secuencias bien conocidos, como ClustalW2, Blast 2, etcetera.

A menos que se especifique de cualquier otra manera, el por ciento de identidad de dos secuencias polipeptfdicas o polinucleotfdicas se refiere al por ciento de residuos de aminoacidos o nucleotidos identicos en toda la longitud de la mas corta de las dos secuencias.

La "secuencia codificante" debe otorgar a un experto en la tecnica su significado comun y habitual, y se utiliza sin limitacion para referirse a una secuencia de ADN que codifica una secuencia de aminoacidos espedfica.

"Secuencias reguladoras adecuadas" deben recibir su significado ordinario y habitual para un experrto en la tecnica y se usan sin limitacion para referirse a secuencias de nucleotidos ubicadas aguas arriba (secuencias no codificantes en 5'), dentro, o aguas abajo (secuencias no codificantes en 3') de una secuencia codificante, y que influyen en la transcripcion, el procesamiento o estabilidad del ARN, o la traduccion de la secuencia codificante asociada. Las secuencias reguladoras pueden incluir promotores, secuencias lfder de traduccion, intrones, y secuencias de reconocimiento de poliadenilacion.

Al promotor se le debe otorgar su significado comun y habitual para una persona con experiencia corriente en la tecnica, y se usa sin limitacion para referirse a una secuencia de ADN capaz de controlar la expresion de una secuencia codificante o ARN funcional. En general, una secuencia codificante se ubica hacia el 3' de una secuencia promotora. Los promotores pueden derivarse en su totalidad de un gen nativo o pueden estar compuestos de diferentes elementos derivados de diferentes promotores que se encuentran en la naturaleza, o incluso comprender segmentos sinteticos de ADN. Se entiende por los expertos en la tecnica que diferentes promotores pueden dirigir la expresion de un gen en diferentes tejidos o tipos de celulas o en diferentes etapas del desarrollo o en respuesta a diferentes condiciones ambientales. Los promotores, que hacen que un gen se exprese en la mayona de los tipos de celulas en la mayona de los casos, se conocen comunmente como "promotores constitutivos." Se reconoce ademas que, dado que en la mayona de los casos los lfmites exactos de las secuencias reguladoras no se han definido completamente, los fragmentos de ADN de diferentes longitudes pueden tener una actividad promotora identica.

El termino "unido operativamente" se refiere a la asociacion de secuencias de acido nucleico en un solo fragmento de acido nucleico de manera que la funcion de una se afecta por la otra. Por ejemplo, un promotor esta unido operativamente con una secuencia codificante cuando es capaz de afectar la expresion de esa secuencia codificante (es decir, que la secuencia codificante esta bajo el control transcripcional del promotor). Las secuencias codificantes pueden estar unidas operativamente a secuencias reguladoras en orientacion sentido o antisentido.

El termino "expresion", como se usa en la presente descripcion, debe otorgar a un experto en la tecnica su significado comun y habitual, y se usa sin limitacion para referirse a la transcripcion y acumulacion estable de sentido (ARNm) o ARN antisentido derivado a partir del fragmento de acido nucleico de la presente tecnologfa. "Sobreexpresion" se refiere a la produccion de un producto genico en organismos transgenicos o recombinantes que excede los niveles de produccion en organismos normales o no transformados.

"Transformacion" debe recibir su significado ordinario y habitual para una persona con experiencia corriente en la tecnica, y se usa sin limitacion para referirse a la transferencia de un polinucleotido a una celula objetivo. El polinucleotido transferido puede incorporarse al genoma o al ADN cromosomico de una celula objetivo, lo que resulta en una herencia geneticamente estable, o puede replicarse independientemente del cromosoma del huesped. Los organismos huesped que contienen los fragmentos de acido nucleico transformados se denominan organismos "transgenicos" o "recombinantes" o "transformados".

Los terminos "transformado", "transgenico" y "recombinante", cuando se usan en la presente descripcion en relacion con las celulas huesped, deben recibir sus respectivos significados comunes y habituales para una persona con experiencia corriente en la tecnica, y se usan sin limitacion para referirse a una celula de un organismo huesped, como una planta o celula microbiana, en la que se ha introducido una molecula de acido nucleico heterologa. La molecula de acido nucleico puede integrarse de manera estable en el genoma de la celula huesped, o la molecula de acido nucleico puede estar presente como una molecula extracromosomica. Dicha molecula extracromosomica puede ser autoreplicante. Se entiende que las celulas, tejidos o sujetos transformados abarcan no solo el producto final de un proceso de transformacion, sino tambien su progenie transgenica.

Los terminos "recombinante", "heterologo" y "exogeno", cuando se usan en la presente descripcion en relacion con polinucleotidos, deben otorgar sus significados comunes y habituales a una persona con experiencia corriente en la tecnica, y se usan sin limitacion para referirse a un polinucleotido (por ejemplo, una secuencia de ADN o un gen) que se origina en una fuente extrana a la celula huesped en particular o, si es de la misma fuente, se modifica de su forma original. Por lotanto, un gen heterologo en una celula huesped incluye un gen que es endogeno respecto de la celula huesped en particular pero se ha modificado, por ejemplo, mediante el uso de mutagenesis sitio dirigida u otras tecnicas recombinantes. Los terminos incluyen ademas multiples copias de origen no natural de una secuencia de ADN de origen natural. Por lo tanto, los terminos se refieren a un segmento de ADN que es foraneo o heterologo a la celula, u homologo a la celula pero en una posicion o forma dentro de la celula huesped en la que el elemento no se encuentra normalmente. De manera similar, los terminos "recombinante", "heterologo" y "exogeno", cuando se usan en la presente descripcion en relacion con un polipeptido o secuencia de aminoacidos, significa un polipeptido o secuencia de aminoacidos que se origina en una fuente extrana a la celula huesped particular o, si de la misma fuente, se modifica de su forma original. Por lo tanto, los segmentos de ADN recombinante pueden expresarse en una celula huesped para producir un polipeptido recombinante.

Los terminos "plasmido", "vector" y "casete" deben recibir sus respectivos significados comunes y habituales para una persona con experiencia corriente en la tecnica, y se usan sin limitacion para referirse a un elemento cromosomico adicional que a menudo lleva genes que no son parte del metabolismo central de la celula, y generalmente en forma de moleculas de ADN de doble cadena circular. Dichos elementos pueden ser secuencias de replicacion autonoma, secuencias de integracion al genoma, secuencias de fagos o nucleotidos, lineales o circulares, de un ADN o ARN de cadena simple o doble, derivados de cualquier fuente, en la que se hayan unido o recombinado varias secuencias de nucleotidos en una construccion unica que es capaz de introducir un fragmento de un promotor y una secuencia de ADN para un producto genico seleccionado junto con la secuencia 3' no traducible apropiada en una celula. "Casete de transformacion" se refiere a un vector espedfico que contiene un gen extrano y que tiene elementos ademas del gen extrano que facilita la transformacion de una celula huesped en particular. "Casete de expresion" se refiere a un vector espedfico que contiene un gen extrano y que tiene elementos ademas del gen extrano que permite una expresion mejorada de ese gen en un huesped extrano.

Las tecnicas de recombinacion estandar de ADN y de clonacion molecular usadas en la presente desripcion se conocen bien en la tecnica y se describen, por ejemplo, por Sambrook, J., Fritsch, E. F. y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2da ed.; Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY, 1989 (en adelante, "Maniatis"); y por Silhavy, TJ, Bennan, ML y Enquist, LW Experiments with Gene Fusions; Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, n Y, 1984; y por Ausubel, Fm y otros, In Current Protocols in Molecular Biology, publicado por Greene Publishing y Wiley-Interscience, 1987.

A menos que se defina de cualquier otra manera, todos los terminos tecnicos y cientfficos usados en la presente descripcion tienen el mismo significado que el comprendido comunmente por el experto en la tecnica a la que pertenece esta descripcion. Si bien los metodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente descripcion pueden usarse en la practica o en la prueba de la presente descripcion, los materiales y metodos preferidos se describen a continuacion.

La descripcion se comprendera mas completamente despues de considerar los siguientes ejemplos no limitantes. Debe entenderse que estos ejemplos, aunque indican modalidades preferidas de la presente tecnologfa, se dan solo a modo de ilustracion.

Polipeptidos recombinantes

En un aspecto, la presente descripcion se refiere a un polipeptido recombinante que tiene una secuencia de aminoacidos que tiene al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % e incluso 100 % de identidad con la secuencia de aminoacidos expuesta en la sec. con num. de ident.: 6. Adecuadamente, la secuencia de aminoacidos del polipeptido recombinante tiene al menos 80 % de identidad con la sec. con num. de ident.: 6. Mas adecuadamente, la secuencia de aminoacidos del polipeptido recombinante tiene al menos 85 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %. %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % e incluso 100 % de identidad con la sec. con num. de ident.: 6. En un aspecto ilustrativo, la secuencia de aminoacidos del polipeptido recombinante consiste en la sec. con num. de ident.: 6. En consecuencia, el polipeptido recombinante descrito en la presente descripcion incluye fragmentos funcionales de la sec. con num. de ident.: 6, variantes funcionales de la sec. con num. de ident.: 6 y otros polipeptidos homologos que tienen, por ejemplo, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % e incluso 100 % identidad de secuencia a sec. con num. de ident.: 6.

En otro aspecto, la presente descripcion se refiere a un acido nucleico aislado que tiene una secuencia de nucleotidos que codifica el polipeptido recombinante descrito en la presente descripcion. Por ejemplo, el acido nucleico aislado puede incluir una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % e incluso 100 % de identidad con el amino secuencia acida expuesta en la sec. con num. de ident.: 6. Adecuadamente, el acido nucleico aislado incluye una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos que es al menos 80 % de identidad con la secuencia de aminoacidos expuesta en la sec. con num. de ident.: 6. Mas adecuadamente, el acido nucleico aislado incluye una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 85 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, e incluso 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoacidos establecida en la sec. con num. de ident.: 6. El acido nucleico aislado, por lo tanto, incluye aquellos que codifican fragmentos funcionales de la sec. con num. de ident.: 6, variantes funcionales de la sec. con num. de ident.: 6 u otros polipeptidos homologos que tienen, por ejemplo, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %., al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % e incluso 100 % identidad de secuencia con la sec. con num. de ident.: 6.

En un aspecto, la presente descripcion se refiere a un acido nucleico aislado que tiene una secuencia de nucleotidos que tiene al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % e incluso 100 % de identidad con la secuencia de nucleotidos expuesta en sec. con num. de ident.: 7. Adecuadamente, el acido nucleico aislado incluye una secuencia de nucleotidos que tiene al menos 80 % de identidad con la secuencia de nucleotidos expuesta en la sec. con num. de ident.: 7. Mas adecuadamente, el acido nucleico aislado incluye una secuencia de nucleotidos que tiene al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos El 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, e incluso 100 % de identidad con la secuencia de acido nucleico expuesta en la sec. con num. de ident.: 7.

En otro aspecto, la presente tecnologfa se refiere a un vector que tiene los acidos nucleicos descritos en la presente descripcion, y a una celula huesped que tiene el vector descrito en la presente descripcion. En algunos aspectos, la presente descripcion se refiere a un vector de expresion que incluye al menos un polinucleotido de la presente tecnologfa y en el que el vector de expresion, tras la transfeccion en una celula huesped, es capaz de expresar al menos un polipeptido HV1 recombinante descrito en la presente descripcion. En un aspecto, el vector de expresion incluye una secuencia de nucleotidos expuesta en la sec. con num. de ident.: 7 o una variante de esta.

El diseno del vector de expresion depende de factores tales como la eleccion de la celula huesped a transformar, el nivel de expresion de la protema deseada y similares. Los vectores de expresion pueden introducirse en la celula huesped para producir asf el polipeptido recombinante de la presente tecnologfa, tal como el polipeptido HV1 recombinante que tiene una secuencia de aminoacidos de la sec. con num. de ident.: 6 o una variante de la misma.

La expresion de protemas en procariotas se realiza con mayor frecuencia en una celula huesped bacteriana con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresion de protemas de fusion o no de fusion. Los vectores de fusion agregan una cantidad de aminoacidos a una protema codificada en ellos, generalmente hacia el extremo amino de la protema recombinante. Tales vectores de fusion tfpicamente sirven para tres propositos: 1) para aumentar la expresion de protema recombinante; 2) aumentar la solubilidad de la protema recombinante; y 3) para ayudar en la purificacion de la protema recombinante actuando como un ligando en la purificacion por afinidad. A menudo, se introduce un sitio de escision proteolttica en la union del resto de fusion y la protema recombinante para permitir la separacion de la protema recombinante del resto de fusion despues de la purificacion de la protema de fusion. Tales vectores estan dentro del alcance de la presente descripcion.

En un aspecto, el vector de expresion incluye aquellos elementos geneticos para la expresion del polipeptido recombinante en celulas bacterianas. Los elementos para latranscripcion ytraduccion en la celula bacteriana pueden incluir un promotor, una region codificante para el complejo de protemas y un terminador de la transcripcion.

En un aspecto, los vectores de expresion de la presente tecnologfa incluyen vectores de expresion bacterianos, por ejemplo, ADN de bacteriofago recombinante, ADN plasmido o ADN cosmido, vectores de expresion de levadura, por ejemplo, vectores de expresion de levadura recombinante, vectores para expresion en celulas de insecto, por ejemplo, vectores de expresion de virus recombinante, por ejemplo, baculovirus, o vectores para la expresion en celulas vegetales, por ejemplo, vectores de expresion de virus recombinantes tales como virus del mosaico de la coliflor (CaMV), virus del mosaico del tabaco (TMV), o vectores de expresion de plasmidos recombinantes tales como plasmidos Ti.

En un aspecto, el vector incluye un vector de expresion bacteriano. En otro aspecto, el vector de expresion incluye un vector de expresion de alto numero de copias; alternativamente, el vector de expresion incluye un vector de expresion de bajo numero de copias, por ejemplo, un plasmido Mini-F.

Un experto en la tecnica conocera las tecnicas de biologfa molecular disponibles para la preparacion de vectores de expresion. El polinucleotido usado para la incorporacion en el vector de expresion de la presente tecnologfa, como se describe anteriormente, puede prepararse mediante tecnicas rutinarias como la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR).

Se han desarrollado varias tecnicas de biologfa molecular para vincular operativamente el ADN a vectores a traves de extremos cohesivos complementarios. En un aspecto, pueden anadirse tractos homopolfmeros complementarios a la molecula de acido nucleico para insertarse en el vector ADN. El vector y la molecula de acido nucleico luego se unen mediante enlaces de hidrogeno entre las colas homopolimericas complementarias para formar moleculas de ADN recombinante.

En un aspecto alternativo, los enlazadores sinteticos que contienen uno o mas sitios de restriccion proporcionados se usan para enlazar operativamente el polinucleotido de la presente tecnologfa al vector de expresion. En un aspecto, el polinucleotido se genera por digestion con endonucleasas de restriccion. En un aspecto, la molecula de acido nucleico se trata con ADN polimerasa del bacteriofago T4 o ADN polimerasa I de E. coli, enzimas que eliminan los extremos 3' monocatenarios sobresalientes con sus actividades 3'-5'-exonucleolfticas, y rellenan los extremos 3' con sus actividades de polimerizacion, generan segmentos de ADN de extremos romos. Los segmentos de extremos romos se incuban luego con un gran exceso molar de moleculas enlazadoras en presencia de una enzima que es capaz de catalizar la ligacion de las moleculas de ADN de extremos romos, como la ligasa de ADN del bacteriofago T4. Por lo tanto, el producto de la reaccion es un polinucleotido que lleva secuencias enlazadoras polimericas en sus extremos. Estos polinucleotidos se escinden luego con la enzima de restriccion apropiada y se ligan a un vector de expresion que se ha escindido con una enzima que produce extremos compatibles con los del polinucleotido.

Alternativamente, puede emplearse un vector que tenga sitios de clonacion independientes de la ligacion (LIC). El polinucleotido amplificado por PCR requerido puede luego clonarse en el vector LIC sin digestion de restriccion o ligacion (Aslanidis y de Jong, Nucl. Acid. Res. 18, 6069-6074, (1990), Haun, y otros, Biotechniques 13, 515-518 (1992)).

En un aspecto, para aislary/o modificarel polinucleotido de interes para la insercion en el plasmido elegido, es adecuado usar PCR. Pueden disenarse cebadores apropiados para usar en la preparacion de PCR de la secuencia para aislar la region codificante requerida de la molecula de acido nucleico, agregar endonucleasas de restriccion o sitios LIC, colocar la region codificante en el marco de lectura deseado.

En un aspecto, se prepara un polinucleotido para su incorporacion en un vector de expresion de la presente tecnologfa mediante el uso de PCR y cebadores oligonucleotidicos apropiados. La region codificante se amplifica, mientras que los propios cebadores se incorporan al producto de secuencia amplificada. En un aspecto, los cebadores de amplificacion contienen sitios de reconocimiento de endonucleasas de restriccion, que permiten que el producto de secuencia amplificada se clone en un vector apropiado.

En un aspecto, el polinucleotido de sec. con num. de ident.: 7 o una variante de la misma se obtiene por PCR y se introduce en un vector de expresion usando la digestion y la ligacion con endonucleasas de restriccion de acuerdo con tecnicas que se conocen bien en la tecnica.

La presente descripcion se refiere ademas a una celula huesped que comprende el vector de expresion descrito en la presente descripcion. Los huesped adecuados de la presente tecnologfa incluyen tipicamente huesped microbianos o huesped de plantas. Por ejemplo, la celula huesped de la presente tecnologfa se selecciona del grupo que consiste en bacterias, levaduras, hongos filamentosos, algas cianobacterias y celulas vegetales.

Los huesped microbianos pueden incluir cualquier organismo capaz de expresar el polinucleotido (tal como la sec. con num. de ident.: 7) para producir el polipeptido HV1 recombinante descrito en la presente descripcion. Los microorganismos utiles en la presente tecnologfa incluyen bacterias, tales como las bacterias entericas (Escherichia y Salmonella por ejemplo), asf como Bacillus, Acinetobacter, Actinomycetes como Streptomyces, Corynebacterium, Methanotrophs, tales como Methylosinus, Methylomonas, Rhodococcus y Pseudomona; Cianobacterias, tales como Rhodobacter y Synechocystis; levaduras, tales como Saccharomyces, Zygosaccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Hansenula, Debaryomyces, Mucor, Pichia y Torulopsis; y hongos filamentosos, tales como Aspergillus y Arthrobotrys, y algas, y Escherichia, Klebsiella, Pantoea, Salmonella Corynebacterium, Clostridium y Clostridium acetobutylicum, por ejemplo. Preferentemente, el huesped microbiano es una bacteria (como Escherichia) o una levadura (como Saccharomyces). Los vectores de expresion pueden incorporarse en estos y otros huesped microbianos para preparar grandes cantidades comercialmente utiles de glucosidos de esteviol.

En un aspecto, el polipeptido recombinante puede expresarse en una celula huesped que es una celula vegetal. Como se usa en la presente descripcion, el termino "celula vegetal" se entiende que significa cualquier celula derivada de una planta monocotiledonea o dicotiledonea y capaz de constituir tejidos no diferenciados tales como callos, tejidos diferenciados tales como embriones, porciones de plantas monocotiledoneas, plantas monocotiledoneas o semillas. El termino "planta" se entiende que significa cualquier organismo multicelular diferenciado capaz de la fotosmtesis, incluyendo monocotiledoneas y dicotiledoneas. En algunos aspectos, la celula vegetal puede ser una celula vegetal de Arabidopsis, una celula vegetal de tabaco, una celula vegetal de soya, una celula vegetal de petunia o una celula de otro cultivo de semillas oleaginosas que incluye, entre otros, una celula vegetal de canola, una celula vegetal de colza, una celula vegetal de palma, una celula vegetal de girasol, una celula vegetal de algodon, una celula vegetal de mafz, una celula vegetal de cacahuete, una celula vegetal de lino y una celula vegetal de sesamo.

Los huesped de plantas utiles pueden incluir cualquier planta que soporte la produccion de los polipeptidos recombinantes de la presente tecnologfa. Las plantas verdes adecuadas para usar como huesped incluyen, pero no se limitan a, soya, colza (Brassica napus, B. campestris), girasol (Helianthus annus), algodon (Gossypium hirsutum), mafz, tabaco (Nicotiana tabacum), alfalfa (Medicago sativa), trigo (Triticum sp), cebada (Hordeum vulgare), avena (Avena sativa), sorgo (Sorghum bicolor), arroz (Oryza sativa), Arabidopsis, vegetales crudferos (brocoli, coliflor, col, parsnips, etc.), melones, zanahorias, apio, perejil, tomates, papas, fresas, cacahuetes, uvas, cultivos de semillas de hierba, remolacha azucarera, cana de azucar, frijoles, guisantes, centeno, lino, arboles de madera dura, arboles de madera blanda y pastos forrajeros. Las especies de algas incluyen, pero no se limitan a, huesped comercialmente significativos, como la espirulina, Haemotacoccus y Dunaliella. Las plantas adecuadas para el metodo de la presente tecnologfa tambien incluyen biocombustible, biomasa y cultivos bioenergeticos. Las plantas ilustrativas incluyen Arabidopsis thaliana, arroz (Oryza sativa), Hordeum vulgare, pasto varilla (Panicum vigratum), Brachypodium spp, Brassica spp. y Crambe abyssinica.

En algunos aspectos, la presente descripcion incluye celulas huesped transgenicas o huesped que se han transformado con uno o mas de los vectores descritos en la presente descripcion.

Alternativamente, las celulas huesped pueden ser aquellas adecuadas para la produccion de biosmtesis, que incluyen organismos de una sola celula, microorganismos, organismos multicelulares, plantas, hongos, bacterias, algas, cultivos cultivados, cultivos no cultivados y/o similares.

Los vectores de expresion pueden introducirse en celulas huuesped microbianas o de plantas mediante tecnicas convencionales de transformacion o transfeccion. La transformacion de las celulas apropiadas con un vector de expresion de la presente tecnologfa se realiza mediante metodos conocidos en la tecnica y tfpicamente depende tanto del tipo de vector como de la celula. Las tecnicas adecuadas incluyen coprecipitacion con fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfeccion mediada por DEAE-dextrano, lipofeccion, quimioporacion o electroporacion.

Las celulas transformadas con exito, es decir, aquellas celulas que contienen el vector de expresion, pueden identificarse mediante tecnicas bien conocidas en la tecnica. Por ejemplo, las celulas transfectadas con un vector de expresion de la presente tecnologfa pueden cultivarse para producir polipeptidos descritos en la presente descripcion. Las celulas pueden examinarse para determinar la presencia del ADN del vector de expresion mediante tecnicas bien conocidas en la tecnica. Las celulas huesped pueden contener una sola copia del vector de expresion descrito anteriormente, o alternativamente, copias multiples del vector de expresion.

En algunos aspectos, la celula transformada es una celula animal, una celula de insecto, una celula vegetal, una celula de algas, una celula fungica o una celula de levadura. En algunos aspectos, la celula es una celula vegetal seleccionada del grupo que consiste en: celula vegetal de canola, una celula vegetal de colza, una celula vegetal de palma, una celula vegetal de girasol, una celula vegetal de algodon, una celula vegetal de mafz, una celula vegetal de mam, una celula vegetal de lino, una celula vegetal de sesamo, una celula vegetal de soya y una celula vegetal de petunia.

Los expertos en la tecnica conocen bien los sistemas de expresion de la celula huesped microbiana y los vectores de expresion que contienen secuencias reguladoras que dirigen un alto nivel de expresion de protemas exogenas. Cualquiera de estos podna usarse para construir vectores para la expresion del polipeptido recombinante de la presente tecnologfa en una celula huesped microbiana. Estos vectores podnan introducirse despues en microorganismos apropiados mediante transformacion para permitir una expresion de alto nivel del polipeptido recombinante de la presente tecnologfa.

Los vectores o casetes utiles para la transformacion de celulas huesped microbianas adecuadas se conocen bien en la tecnica. Tfpicamente, el vector o casete contiene secuencias que dirigen la transcripcion y traduccion del polinucleotido relevante, un marcador seleccionable, y secuencias que permiten la replicacion autonoma o la integracion cromosomica. Los vectores adecuados comprenden una region 5' del polinucleotido que alberga controles del inicio de la transcripcion y una region 3' del fragmento de ADN que controla la terminacion de la transcripcion. Se prefiere que ambas regiones de control se deriven de genes homologos de la celula huesped transformada, aunque debe entenderse que tales regiones de control no necesitan derivarse de los genes nativos de las especies espedficas elegidas como huesped.

Las regiones de control del inicio o los promotores, que son utiles para dirigir la expresion del polipeptido recombinante en la celula huesped microbiana deseada, son numerosos y comunes para los expertos en la tecnica. Practicamente cualquier promotor capaz de conducir estos genes es adecuado para la presente tecnologfa, incluidos, entre otros, CYC1, HIS3, GAL1, GAL10, ADH1, PGK, PHO5, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO, TPI (util para la expresion en Saccharomyces); AOX1 (util para la expresion en Pichia); y lac, trp, IPL, IPR, T7, tac y trc (utiles para la expresion en Escherichia coli).

Las regiones de control de terminacion tambien pueden derivarse de diversos genes nativos de los huesped microbianos. Opcionalmente, puede incluirse un sitio de terminacion para los huesped microbianos descritos en la presente descripcion.

En celulas vegetales, los vectores de expresion de la presente tecnologfa pueden incluir una region codificante unida operativamente a promotores capaces de dirigir la expresion del polipeptido recombinante de la presente tecnologfa en los tejidos deseados en la etapa deseada de desarrollo. Por razones de conveniencia, los polinucleotidos a expresar pueden comprender secuencias promotoras y secuencias lfder de traduccion derivadas del mismo polinucleotido. Las secuencias 3' no codificantes que codifican las senales de terminacion de la transcripcion tambien deben estar presentes. Los vectores de expresion tambien pueden comprender uno o mas intrones para facilitar la expresion de polinucleotidos.

Para las celulas huesped vegetales, cualquier combinacion de cualquier promotor y cualquier terminador capaz de inducir la expresion de una region codificante puede usarse en las secuencias de vectores de la presente tecnologfa. Algunos ejemplos adecuados de promotores y terminadores incluyen los de los genes de la nopalina sintasa (nos), la octopina sintasa (ocs) y el virus del mosaico de la coliflor (CaMV). Un tipo de promotor de plantas eficiente que puede usarse es un promotor de plantas de alto nivel. Dichos promotores, en un enlace operable con un vector de expresion de la presente tecnologfa, debenan ser capaces de promover la expresion del vector. Los promotores de plantas de alto nivel que pueden usarse en la presente tecnologfa incluyen el promotor de la subunidad pequena de la ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa (ss), por ejemplo, de la soya (Berry-Lowe y otros, J. Molecular y App. Gen., 1: 483498 (1982)), y el promotor de la protema de union a clorofila a/b. Se conoce que estos dos promotores son inducidos por la luz en celulas vegetales (ver, por ejemplo, Genetic Engineering of Plants, una Perspectiva Agncola, A. Cashmore, Plenum, NY (1983), paginas 29 38; Coruzzi, G. y otros, The Journal of Biological Chemistry, 258: 1399 (1983), y Dunsmuir, P. y otros, Journal of Molecular and Applied Genetics, 2: 285 (1983)).

La eleccion del vector plasirndico depende del metodo que se utilizara para transformar las plantas huesped. El experto en la tecnica conoce bien los elementos geneticos que deben estar presentes en el vector plasirndico para transformar, seleccionar y propagar con exito las celulas huesped que contienen el polinucleotido quimerico. El experto en la tecnica tambien reconocera que diferentes eventos de transformacion independientes daran lugar a diferentes niveles y patrones de expresion (Jones y otros, EMBO J. 4: 2411 2418 (1985); De Almeida y otros, Mol. Gen. Genetics 218: 7886 (1989)), y por lo tanto, deben analizarse multiples eventos para obtener lmeas que muestren el nivel de expresion y el patron deseados. Dicha seleccion puede realizarse mediante el analisis Southern de las transferencias de ADN, el analisis Northern de la expresion del ARNm, el analisis Western de la expresion de protemas o el analisis fenotfpico.

La introduccion del vector de expresion de la presente tecnologfa en una celula vegetal puede realizarse mediante una variedad de metodos conocidos por los expertos en la tecnica, incluida la insercion de una secuencia de acido nucleico de interes en un plasmido de Agrobacterium rhizogenes Ri o Agrobacterium tumefaciens Ti. Microinyeccion, electroporacion o precipitacion directa. A modo de ejemplo, en algunos aspectos, la expresion transitoria de un polinucleotido de interes puede realizarse mediante metodos de infiltracion. En este sentido, una suspension de Agrobacterium tumefaciens que contiene un polinucleotido de interes puede cultivarse y luego inyectarse en una planta colocando la punta de una jeringa contra el lado inferior de una hoja mientras se aplica una contrapresion suave en el otro lado de la hoja. La solucion de Agrobacterium luego se inyecta en los espacios aereos dentro de la hoja a traves de los estomas. Una vez dentro de la hoja, el Agrobacterium transforma el gen de interes en una porcion de las celulas de la planta donde el gen se expresa de forma transitoria.

Como otro ejemplo, la transformacion de un plasmido de interes en una celula vegetal puede realizarse mediante tecnicas de bombardeo con pistola de partmulas (es decir, biolfstica). Con respecto a esto, una suspension de embriones de plantas puede crecer en cultivo lfquido y luego bombardearse con plasmidos o polinucleotidos que estan unidos a partmulas de oro, en donde las partmulas de oro unidas al plasmido o al acido nucleico de interes pueden ser propulsadas a traves de las membranas de tejidos vegetales, como el tejido embrionario. Despues del bombardeo, los embriones transformados pueden seleccionarse usando un antibiotico apropiado para generar nuevos cultivos de suspension embriogenicos transformados, propagados clonalmente.

Las celulas huesped pueden ser celulas o lmeas celulares no modificadas, o lmeas celulares modificadas geneticamente. En algunos aspectos, la celula huesped es una lmea celular que se ha modificado para permitir el crecimiento en condiciones deseadas, como a una temperatura mas baja.

Pueden usarse metodologfas estandar de ADN recombinante para obtener un acido nucleico que codifica un polipeptido recombinante descrito en la presente descripcion, incorporar el acido nucleico en un vector de expresion e introducir el vector en una celula huesped, como las descritas en Sambrook, y otros (edicion) Molecular Cloning; A Laboratory Manual, tercera edicion, Cold Spring Harbor, (2001); y Ausubel, F. M. y otros (eds) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley Sons (1995). Un acido nucleico que codifica un polipeptido puede insertarse en un vector o vectores de expresion de manera que los acidos nucleicos esten unidos operativamente a secuencias de control de transcripcion y traduccion (como una secuencia promotora, una secuencia de terminacion de la transcripcion, etcetera). Las secuencias del vector de expresion y control de expresion se eligen generalmente para ser compatibles con la celula huesped de expresion que se usa.

La expresion del polipeptido en un huesped descrito en la presente descripcion puede mejorarse adicionalmente mediante la optimizacion de codones. Por ejemplo, la modificacion de un codon menos comun con un codon mas comun puede afectar la vida media del ARNm o alterar su estructura mediante la introduccion de una estructura secundaria que interfiere con la traduccion del mensaje. Puede optimizarse toda o una parte de una region codificante. En algunos casos, la modulacion de la expresion deseada se logra optimizando esencialmente todo el gen. En otros casos, la modulacion deseada se lograra optimizando parte de la secuencia del gen, pero no la totalidad.

El uso del codon de cualquier secuencia codificante puede ajustarse para lograr una propiedad deseada, por ejemplo, altos niveles de expresion en un tipo de celula espedfico. El punto de partida para tal optimizacion puede ser una secuencia codificante con 100 % de codones comunes, o una secuencia codificante que contenga una mezcla de codones comunes y no comunes.

Pueden generarse y probar dos o mas secuencias candidatas que difieren en su uso de codones para determinar si poseen la propiedad deseada. Las secuencias candidatas pueden evaluarse usando un ordenador para buscar la presencia de elementos regulatorios, como silenciadores o potenciadores, y para buscar la presencia de regiones de secuencia codificante que podnan convertirse en dichos elementos regulatorios mediante una alteracion en el uso del codon. Los criterios adicionales pueden incluir el enriquecimiento de nucleotidos particulares, por ejemplo.

A, C, G o U, preferencia codonica para un aminoacido particular, o la presencia o ausencia de una estructura secundaria o terciaria de ARNm particular. El ajuste a la secuencia candidata puede realizarse en funcion de una serie de criterios de este tipo.

En ciertos aspectos, la secuencia de acido nucleico optimizada en codones puede expresar su protema, a un nivel que es aproximadamente 110 %, aproximadamente 150 %, aproximadamente 200 %, aproximadamente 250 %, aproximadamente 300 %, aproximadamente 350 %, aproximadamente 400 %, aproximadamente 450 %, o aproximadamente el 500 %, de la expresada por una secuencia de acido nucleico que no ha sido optimizada por codones.

Ademas del acido nucleico que codifica el polipeptido recombinante de la presente tecnologfa, el vector de expresion de la presente tecnologfa puede llevar adicionalmente secuencias reguladoras que controlan la expresion de la protema en una celula huesped, como promotores, potenciadores u otros elementos de control de la expresion que controlan la transcripcion o traduccion de los acidos nucleicos. Tales secuencias reguladoras son conocidas en latecnica. Los expertos en la tecnica apreciaran que el diseno del vector de expresion, incluida la seleccion de secuencias reguladoras, puede depender de factores tales como la eleccion de la celula huesped que se va a transformar, el nivel de expresion de la protema deseada, etcetera. Ademas, los vectores de expresion recombinantes de la presente tecnologfa pueden llevar secuencias adicionales, como secuencias que regulan la replicacion del vector en las celulas huesped (por ejemplo, ongenes de replicacion) y genes marcadores de seleccion.

Biosmtesis de los glucosidos de esteviol

Como se describe en la presente descripcion, los polipeptidos recombinantes de la presente tecnologfa tienen actividades de UDP-glucosiltransferasa, que incluyen mas particularmente una actividad de glucosilacion de 1,2-19-O-glucosa, y son utiles para desarrollar metodos biosinteticos para preparar glucosidos de esteviol que son tfpicamente de baja abundancia en fuentes naturales, como el rebaudiosido D y el rebaudiosido E. Los polipeptidos recombinantes de la presente tecnologfa tienen actividades de UDP-glucosiltransferasa, son utiles para desarrollar metodos biosinteticos para preparar nuevos glucosidos de esteviol, como el rebaudiosido Z1 y el rebaudiosido Z2.

En consecuencia, en un aspecto, la presente invencion proporciona un metodo para producir una composicion de glucosido de esteviol, incluyendo el metodo de incubar un sustrato con un polipeptido recombinante que comprende una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 80 % de identidad con la sec. con num. de ident.: 6.

El sustrato puede ser cualquier compuesto natural o sintetico capaz de convertirse en un compuesto de glucosido de esteviol en una reaccion catalizada por una o mas UDP-glucosiltransferasas. Por ejemplo, el sustrato puede ser extracto de estevia natural, esteviol, esteviol-13-O-glucosido, esteviol-19-O-glucosido, esteviol-1,2-biosido, rubusosido, esteviosido, rebaudiosido A, rebaudiosido G o rebaudiosido E. El sustrato puede ser un compuesto puro o una mezcla de diferentes compuestos. Preferentemente, el sustrato incluye un compuesto que se selecciona del grupo que consiste en rubusosido, esteviosido, rebaudiosido A, rebaudiosido E y sus combinaciones.

El metodo descrito en la presente descripcion tambien proporciona un sistema de reaccion de acoplamiento en el que los peptidos recombinantes descritos en la presente descripcion pueden funcionar en combinacion con una o mas enzimas adicionales para mejorar la eficiencia o modificar el resultado de la biosmtesis global de compuestos de glucosido de esteviol. Por ejemplo, la enzima adicional puede regenerar la UDP-glucosa necesaria para la reaccion de glucosilacion convirtiendo el UDP producido a partir de la reaccion de glucosilacion de nuevo a UDP-glucosa (usando, por ejemplo, sacarosa como donante del residuo de glucosa), mejorando asf la eficacia de la reaccion de glucosilacion. En otro ejemplo, el polipeptido recombinante de la presente tecnologfa puede producir un producto de glucosido de esteviol intermedio (por ejemplo, rebaudiosido E), que se convierte adicionalmente en otro glucosido de esteviol (por ejemplo, rebaudiosido D) en una reaccion catalizada por otra UDP-glucosiltransferasa, tal como UGT76G1. En otro ejemplo, el polipeptido recombinante de la presente tecnologfa puede producir un producto de glucosido de esteviol intermedio (por ejemplo, rebaudiosido E), que se convierte adicionalmente en otro glucosido de esteviol (por ejemplo, rebaudiosido Z1 y rebaudiosido Z2) en una reaccion catalizada por UDP-glucosiltransferasa, como HV1.

En consecuencia, en una modalidad, el metodo de la presente tecnologfa incluye ademas incubar una sacarosa sintasa (SUS) recombinante con el sustrato y el polipeptido recombinante descrito en la presente descripcion. La sacarosa sintasa recombinante convierte UDP en UDp-glucosa usando la sacarosa como fuente de glucosa. La sacarosa sintasa adecuada incluye aquellos genes SUS derivados de Arabidopsis thaliana y Vigna radiate, o de cualquier gen que codifique un homologo funcional de la sacarosa sintasa codificada por la secuencia SUS1 de Arabidopsis thaliana y Vigna radiate, o los homologos funcionales de la misma. La sacarosa sintasa adecuada puede ser, por ejemplo, una sacarosa sintasa 1 de Arabidopsis; una sacarosa sintasa 3 de Arabidopsis; y una sacarosa sintasa de Vigna radiate. Una sacarosa sintasa particularmente adecuada puede ser, por ejemplo, sacarosa sintasa 1 de Arabidopsis. Por ejemplo, el SUS recombinante incluye una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, a al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o incluso 100 % de identidad con la secuencia de aminoacidos de AtSUSI expuesta en la sec. con num. de ident.: 9. Preferentemente, la SUS recombinante de la presente tecnologfa incluye una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 80 % de identidad con la secuencia de aminoacidos de AtSUS1 expuesta en la sec. con num. de ident.: 9.

La sacarosa sintasa recombinante de la presente tecnologfa puede obtenerse mediante la expresion de un acido nucleico que tiene una secuencia de nucleotidos que codifica una secuencia de aminoacidos de interes (por ejemplo, una que tiene al menos 80 % de identidad con la secuencia de aminoacidos expuesta en la sec. con num. de ident.: 9) en una celula huesped como se describio anteriormente. Por ejemplo, un vector que incluye una secuencia de nucleotidos expuesta en la sec. con num. de ident.: 10 puede introducirse en un huesped microbiano (como E. coli) mediante tecnicas de transformacion convencionales para producir la sacarosa sintasa recombinante.

En otra modalidad, el metodo de la presente tecnologfa incluye ademas incubar una UDP-glucosiltransferasa recombinante con la sacarosa sintasa recombinante, el sustrato y el polipeptido recombinante descrito en la presente descripcion. La UDP-glucosiltransferasa recombinante puede catalizar una reaccion de glucosilacion diferente a la catalizada por el polipeptido recombinante de la presente tecnologfa. Por ejemplo, la UDP-glucosiltransferasa recombinante puede catalizar la reaccion que transfiere un resto de azucar al C-3' de la C-13-O-glucosa de esteviosido para producir rebaudiosido A (o de manera similar para producir rebaudiosido D a partir de rebaudiosido E), mientras que el polipeptido recombinante de la presente tecnologfa transfiere un segundo resto de azucar al C-2' de 19-O-glucosa de esteviosido para producir rebaudiosido E (o de manera similar para producir rebaudiosido D a partir de rebaudiosido A).

La UDP-glucosiltransferasa adecuada incluye cualquier UGT conocida en la tecnica que capaz de catalizar una o mas reacciones en la biosmtesis de compuestos de glucosido de esteviol, tales como UGT85C2, UGT74G1, UGT76G1, o los homologos funcionales de los mismos. Por ejemplo, la UDP-glucosiltransferasa como se describe en la presente descripcion puede incluir una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o incluso 100 % de identidad con la secuencia de aminoacidos de UGT76G1 establecido en la sec. con num. de ident.: 11. Preferentemente, la UDP-glucosiltransferasa incluye una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 80 % de identidad con la secuencia de aminoacidos de UGT76G1 expuesta en la sec. con num. de ident.: 11.

La UDP-glucosiltransferasa recombinante puede obtenerse expresando un acido nucleico que tiene una secuencia de nucleotidos que codifica una secuencia de aminoacidos de interes (por ejemplo, una que tiene al menos 80 % de identidad con la secuencia de aminoacidos expuesta en la sec. con num. de ident.: 11) en una celula huesped como se describio anteriormente. Por ejemplo, un vector que incluye una secuencia de nucleotidos expuesta en la sec. con num. de ident.: 12 puede introducirse en un huesped microbiano (como E. coli) mediante tecnicas de transformacion convencionales para producir la UDP-glucosiltransferasa recombinante de la presente tecnologfa.

Tanto la produccion in vitro como in vivo de compuestos de glucosidos de esteviol son abarcadas por la presente tecnologfa.

Por ejemplo, la incubacion puede ser un proceso in vitro, en el que se permite que un sustrato interactue con un polipeptido recombinante de la presente tecnologfa. Preferentemente, en un proceso in vitro, el polipeptido recombinante se purifica antes de incubarse con el sustrato. En los metodos de la presente tecnologfa se incluyen tecnicas de purificacion de polipeptidos convencionales, tales como centrifugacion, lisado celular y cromatograffa. Por ejemplo, el acido nucleico que codifica el polipeptido recombinante de la presente tecnologfa puede clonarse en un vector de expresion con una etiqueta de histidina, de modo que el polipeptido recombinante expresado pueda purificarse mediante cromatograffa de afinidad en columna.

El metodo in vitro de la presente tecnologfa incluye cualquier sistema tampon que sea adecuado para la produccion de glucosidos de esteviol utilizando uno o mas polipeptidos recombinantes de la presente tecnologfa. Tfpicamente, el sistema de tampon es una solucion acuosa, como el tampon Tris, el tampon HEPES, el tampon MOPS, el tampon fosfato, con un pH de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 8,0. Mas adecuadamente, el pH es de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 7,5. Aun mas adecuadamente, el pH es de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 7,5.

Normalmente, en el metodo in vitro de la presente tecnologfa, el sustrato esta presente en el tampon a una concentracion de aproximadamente 0,2 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, preferentemente de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 2 mg/ml, mas preferentemente de aproximadamente 0,7 mg/ml a aproximadamente 1,5 mg/ml.

Normalmente, en el metodo in vitro de la presente tecnologfa, se incluye UDP-Glucosa en el tampon a una concentracion de aproximadamente 0,2 mM a aproximadamente 5 mM, preferentemente de aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 2 mM, mas preferentemente de aproximadamente 0,7 mM a alrededor de 1,5 mM. En un aspecto, cuando se incluye una sacarosa sintasa recombinante en la reaccion, tambien se incluye sacarosa en el tampon a una concentracion de aproximadamente 100 mM a aproximadamente 500 mM, preferentemente de aproximadamente 200 mM a aproximadamente 400 mM, con mayor preferencia de aproximadamente 250 mM a aproximadamente 350 mM.

Tfpicamente, en el metodo in vitro de la presente tecnologfa, la relacion en peso del polipeptido recombinante al sustrato, sobre una base en peso seco, es de aproximadamente 1:100 a aproximadamente 1:5, preferentemente de aproximadamente 1:50 a aproximadamente 1:10, mas preferentemente de aproximadamente 1:25 a aproximadamente 1:15.

Tfpicamente, la temperatura de reaccion del metodo in vitro es de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 40,°C, adecuadamente de 25,°C a aproximadamente 37,°C, mas adecuadamente de 28,°C a aproximadamente 32,°C.

La presente descripcion tambien proporciona una composicion de glucosido de esteviol producida por el metodo biosintetico descrito en la presente descripcion. La naturaleza exacta de la composicion de glucosido de esteviol producida usando el metodo descrito en la presente descripcion, como los tipos de especies moleculares y su contenido porcentual en el producto final, depende del sustrato utilizado, las condiciones de incubacion y las actividades enzimaticas incluidas en el sistema de reaccion. Por ejemplo, cuando se usa esteviosido como sustrato, la composicion de glucosido de esteviol producida puede incluir rebaudiosido A, rebaudiosido D, rebaudiosido E, rebaudiosido Z1 y rebaudiosido Z2 y sus combinaciones.

La presente tecnologfa proporciona un metodo para convertir las especies predominantes de glucosidos de esteviol (es decir, esteviosido y rebaudiosido A) en el extracto de estevia natural en rebaudiosido D y rebaudiosido E, que de otro modo son de baja abundancia en el extracto natural. En consecuencia, la presente tecnologfa tambien proporciona un metodo para enriquecer el contenido de uno o mas glucosidos de esteviol espedficos (como el rebaudiosido D y el rebaudiosido E), el metodo incluye la incubacion de un sustrato (como un extracto de estevia natural) con un polipeptido recombinante que comprende un secuencia de aminoacidos que tiene al menos 80 % de identidad con la sec. con num. de ident.: 6. Por ejemplo, cuando se usa el extracto de estevia natural como sustrato, la composicion de glucosido de esteviol producida puede enriquecerse con rebaudiosido D y/o rebaudiosido E, que son de baja abundancia en el extracto de estevia natural.

Un experto en la tecnica reconocera que la composicion de glucosido de esteviol producida por el metodo descrito en la presente descripcion puede purificarse adicionalmente y mezclarse con otros glucosidos, sabores o edulcorantes de esteviol para obtener un sabor o una composicion edulcorante deseada. Por ejemplo, una composicion enriquecida con rebaudiosido D producida como se describe en la presente descripcion puede mezclarse con un extracto de estevia natural que contiene rebaudiosido A como el glucosido de esteviol predominante, o con otros productos de glucosido de esteviol sinteticos o naturales para obtener una composicion edulcorante deseada. Alternativamente, un glucosido de esteviol sustancialmente purificado (por ejemplo, rebaudiosido D) obtenido a partir de la composicion de glucosido de esteviol descrita en la presente descripcion puede combinarse con otros edulcorantes, como sacarosa, maltodextrina, aspartamo, sucralosa, neotamo, acesulfamo de potasio y sacarina. La cantidad de glucosido de esteviol con relacion a otros edulcorantes puede ajustarse para obtener un sabor deseado, como se conoce en la tecnica. La composicion de glucosido de esteviol descrita en la presente descripcion (incluyendo rebaudiosido D, rebaudiosido E, rebaudiosido Z1, rebaudiosido Z2 o una combinacion de los mismos) puede incluirse en productos alimenticios (como bebidas, refrescos, helados, productos lacteos, confitena, cereales, chicles, productos horneados, etcetera), suplementos dieteticos, nutricion medica, asf como tambien productos farmaceuticos.

EJEMPLOS

EJEMPLO 1: Seleccion de genes UGT candidatos

Se utilizaron analisis filogeneticos y BLAST de protemas para identificar 7 genes candidatos que pertenecen a la subfamilia UGT91 para la actividad de glucosilacion de 1,2-19-O-glucosa (Tabla 1).

Tabla 1: Lista de genes candidatos UGT

Nombre Descripcion Acceso Identidad de secuencia

BD1 PREDICHO: Tipo UDP-glucosiltransferasa 91C1 XP_003560664.1 sec. con num. de ident.: 1

[Brachypodium distachyon]

BD2 PREDICHO: Tipo UDP-glucosiltransferasa 91C1 XP_003560669.1 sec. con num. de ident.: 2

[Brachypodium distachyon]

BD3 PREDICHO: PROTEfNA DE BAJA CALIDAD: Tipo XP_003581636.1 sec. con num. de ident.: 3 UDP-glucosiltransferasa 91C1 [Brachypodium

distachyon]

BD4 PREDICHO: Tipo UDP-glucosiltransferasa 91C1 XP_003580515.1 sec. con num. de ident.: 4

[Brachypodium distachyon]

BD5 PREDICHO: PROTEfNA DE BAJA CALIDAD: Tipo XP sec. con num. de ident.: 5 UDP-glucosiltransferasa 91B1 [Brachypodium 003559500.1

distachyon]

HV1 protema predicha [Hordeum vulgare subsp. vulgare] BAJ98242.1 sec. con num. de ident.: 6

HV2 protema predicha [Hordeum vulgare subsp. vulgare] BAJ93155.1 sec. con num. de ident.: 8

Ejemplo 2: Cribado de la actividad enzimatica de los genes UGT candidates

Los fragmented de ADN de longitud completa de todos los genes UGT candidatos se sintetizaron comercialmente. Casi todos los codones del ADNc se cambiaron a los preferidos para E. coli (Genscript, NJ). El ADN sintetizado se clono en un vector de expresion bacteriano pETite N-His SUMO Kan Vector (Lucigen).

Cada construccion de expresion se transformo en E. coli BL21 (DE3), que subsecuentemente se cultivo en medio LB que contema 50 pg/ml de kanamicina a 37 °C hasta alcanzar una OD600 de 0,8-1,0. La expresion de la protema se indujo mediante la adicion de 1 mM de isopropil p-D-1-tiogalactopiranosido (IPTG) y el cultivo se cultivo a l6 °C durante 22 h. Las celulas se colectaron por centrifugacion (3.000 xg; 10 min; 4 °C). Los sedimentos celulares se colectaron y se usaron inmediatamente o se almacenaron a -80 °C.

Los sedimentos celulares tipicamente se resuspendieron en tampon de lisis (tampon de fosfato de potasio 50 mM, pH 7,2, lisozima 25 ml/ml, DNasa I 5 ml/ml, imidazol 20 mM, NaCl 500 mM, glicerol al l0 % y 0,4% Triton X-100). Las celulas se rompieron por sonicacion a 4 °C, y el debris celular se clarifico por centrifugacion (18,000 x g; 30 min). El sobrenadante se cargo en un equilibrado (tampon de equilibrio: Tampon de fosfato de potasio 50 mM, pH 7,2, imidazol 20 mM, NaCl 500 mM, glicerol al 10 %) en la columna de afinidad Ni-NTA (Qiagen). Despues de cargar la muestra de protema, la columna se lavo con tampon de equilibrio para eliminar las protemas contaminantes no unidas. Los polipeptidos UGT recombinantes etiquetados con His se eluyeron mediante un tampon de equilibrio que contema imidazol 250 mM.

Los polipeptidos recombinantes UGT candidatos purificados se analizaron para determinar la actividad de la glucosilacion 1,2-19-O-glucosa utilizando esteviosido o Reb A como sustrato (Figura 1). Normalmente, el polipeptido recombinante (10 pg) se probo en un sistema de reaccion in vitro de 200 pl. El sistema de reaccion contiene un tampon de fosfato de potasio 50 mM, pH 7,2, MgCl23 mM, 1 mg/ml de esteviosido o rebaudiosido A, UDP-glucosa 1 mM. La reaccion se realizo a 30 °C y se termino agregando 200 pL de 1-butanol. Las muestras se extrajeron tres veces con 200 pL de 1-butanol. La fraccion combinada se seco y se disolvio en 70 pl de metanol al 80 % para un analisis de cromatograffa lfquida de alto rendimiento (HPLC). El extracto de estevia (Blue California, CA), que contema 95 % de esteviosido, se uso como sustrato de esteviosido. El rebaudiosido A (pureza 99 %) tambien fue suministrado por Blue California.

La reaccion de glucosilacion catalizada por UGT se acoplo a una reaccion generadora de UDP-glucosa catalizada por una sacarosa sintasa (tal como AtSUS1 de la sec. con num. de ident.: 9). En este metodo, la UDP-glucosa se genero a partir de sacarosa y UDP (Figura 2), de manera que puede omitirse la adicion extra de UDP-glucosa. Secuencia AtSUS1 (Bieniawska y otros, Plant J. 2007, 49: 810-828) se sintetizo e inserto en un vector de expresion bacteriano. La protema AtSUS1 recombinante se expreso y purifico por cromatograffa de afinidad. El polipeptido AtSUS1 recombinante purificado se analizo mediante SDS-PAGE (peso molecular: 106,3 kD, Figura 7).

En consecuencia, las actividades de los polipeptidos UGT recombinantes se probaron sin el acoplamiento AtSUS1 (tampon fosfato potasico 50 mM, pH 7,2, MgCh 3 mM, esteviosido o rebaudiosido A 1 mM, UDP 1 mM) o con acoplamiento AtSUS (tampon fosfato potasico 50 mM, pH 7,2, MgCh 3 mM, 1 mg/ml de esteviosido o rebaudiosido A, UDP 1 mM y sacarosa 285 mM). Tfpicamente, se usaron 10 pg de AtSUS1 para una reaccion in vitro de 200 pl. La reaccion in vitro se incubo a 30 °C y se detuvo por extraccion utilizando 1-butonal.

El analisis de HPLC se realizo despues con el uso de un sistema Dionex UPLC ultimate 3000 (Sunnyvale, CA), que incluye una bomba cuaternaria, un compartimento de columna de temperatura controlada, un muestreador automatico y un detector de absorbancia de UV. Se uso Phenomenex Luna n H2 con columna protectora para la caracterizacion de glucosidos de esteviol. El acetonitrilo en agua se uso para la elucion isocratica en el analisis de HPLC. Los productos de rebaudiosido D, rebaudiosido E, rebaudiosido Z se identificaron mediante analisis de RMN.

El polipeptido recombinante (sec. con num. de ident.: 6) codificado por la sec. con num. de ident.: 7 mostro una actividad de glucosilacion de 1,2-19-O-glucosa, y se sometio a analisis adicional. El gen se derivo de Hordeum vulgare subsp. vulgare (abreviado como "HV1" en la presente descripcion). El polipeptido HV1 recombinante purificado se analizo mediante SDS-PAGE (Figura 6). Como se muestra en la Figura 6, la protema HV1 recombinante (peso molecular: 61,4 kD) se purifico por cromatograffa de afinidad. Los polipeptidos codificados por otros genes candidatos (Tabla 1) no mostraron ninguna actividad detectable en los ensayos descritos en la presente descripcion, aunque comparten una identidad de secuencia de aproximadamente 62-74 % con el polipeptido HV1 recombinante.

Como se describe en la presente descripcion, el polipeptido recombinante de HV1 transfirio un resto de azucar al rebaudiosido A para producir rebaudiosido D en todas las condiciones de reaccion con o sin AtSUS 1. El rebaudiosido A se convirtio completamente en rebaudiosido D mediante el polipeptido HV1 recombinante en un sistema de reaccion de acoplamiento u GT-SUS (Figura 3B-E). Sin embargo, solo el rebaudiosido A parcial se convirtio en rebaudiosido D despues de 24 horas por el polipeptido HV1 recombinante solo sin estar acoplado a AtSUSI (Figura 3F-G). Por lo tanto, el polipeptido HV1 recombinante mostro una actividad de glucosilacion 1,2-19-O-glucosa para producir rebaudiosido D a partir de rebaudiosido A y AtSUS 1 mejoro la eficiencia de conversion en el sistema de acoplamiento UGT-SUS.

Ademas, el polipeptido HV1 recombinante acoplado con AtSUS1 (sec. con num. de ident.: 9) convirtio el esteviosido en rebaudiosido E in vitro (Figura 4). Se produjo un compuesto inesperado ("Reb Z") con un tiempo de retencion de HPLC de 6.68 minutos (ver Figura 4) que era distintivo de los rebaudiosidos D y E. Este compuesto representa un nuevo glucosido de esteviol, y se denomina "rebaudiosido Z" ("Reb Z"). Para confirmar la conversion de Reb E en Reb Z, se incubo el sustrato Reb E (0,5 mg/ml) con el polipeptido HV1 recombinante (20 |jg) y AtSUS1 (20 |jg) en un sistema de reaccion de acoplamiento UGT-SUS (200 jL ) bajo Condiciones similares a las utilizadas en los ejemplos anteriores. Como se muestra en la Figura 8, Reb Z se produjo mediante la combinacion del polipeptido HV1 recombinante y AtSUS1. Estos resultados indicaron que HV1 puede transferir el resto de glucosa a Reb E para formar Reb Z.

EJEMPLO 3: Biosmtesis de glucosidos de esteviol usando el polipeptido HV1 recombinante

Como se muestra en la Figura 1, el rebaudiosido D tambien puede formarse por glucosilacion del C-3' de la C-13-O-glucosa del rebaudiosido E. Por lo tanto, el rebaudiosido D se puede producir por diferentes rutas biosinteticas (por ejemplo, atraves del rebaudiosido A versus rebaudiosido E), en dependencia del orden en que se producen las reacciones de glucosilacion. Por ejemplo, la glucosilacion en el C-3' de la C-13-O-glucosa del esteviosido puede ocurrir primero para producir el rebaudiosido A intermedio, seguido de la glucosilacion en el C-2' de la 19-O-glucosa del rebaudiosido A para producir rebaudiosido D. Hasta ahora, la UGT76G1 (sec. con num. de ident.: 11) de la estevia se ha identificado como una enzima que transfiere un residuo de azucar al C-3' de la C-13-O-glucosa del esteviosido para formar el rebaudiosido A.

El ADNc de la UGT76G1 optimizado por codones se inserto en un vector de expresion bacteriano, y la protema UGT76G1 recombinante se expreso y purifico mediante cromatograffa de afinidad. El polipeptido UGT76G1 recombinante purificado se analizo mediante SDS-PAGE (peso molecular: 65,4 kD, Figura 9). El sustrato rebaudiosido E se incubo con la UGT76G1 recombinante, con o sin AtSUS1, en condiciones similares a las usadas en los ejemplos anteriores. Los productos fueron analizados por HPLC. Como se muestra en la Figura 12, el rebaudiosido D fue producido por la UGT76G1 recombinante. La adicion de AtSUS recombinante en la reaccion mejoro la eficiencia de conversion en el sistema de acoplamiento UGT-SUS. Por lo tanto, el polipeptido UGT76G1 recombinante mostro una actividad de glucosilacion de 1,3-13-0-glucosa para producir Reb D a partir de Reb E.

En consecuencia, la actividad catalttica del polipeptido HV1 recombinante para la biosmtesis de glucosidos de esteviol (por ejemplo, la produccion de rebaudiosido D) se determino ademas en combinacion con la UGT76G1. El sustrato de esteviosido se incubo con el polipeptido HV1 recombinante (10 jg), UGT76G1 (10 jg ) y AtSUS1 (10 jg ) en un sistema de reaccion de acoplamiento UGT-SUS (200 jL ) en condiciones similares a las utilizadas en los ejemplos anteriores. Los productos se analizaron por HPLC. Como se muestra en la Figura 5, el rebaudiosido D se produjo mediante la combinacion del polipeptido HV1 recombinante, UGT76G1 y AtSUS1. Por lo tanto, el polipeptido HV1 recombinante, que mostro al menos una actividad de glucosilacion de 1,2-19-0-glucosa, puede usarse en combinacion con otras enzimas UGT (tal como UGT76G1) para la compleja biosmtesis de multiples etapas de glucosidos de esteviol.

Ejemplo 4: Analisis de la estructura de Reb Z por NRM.

El material usado para la caracterizacion del rebaudiosido Z (Reb Z) se produjo usando la conversion enzimatica del rebaudiosido E y se purifico por HPLC.

Los datos HRMS se generaron con un instrumento LTQ Orbitrap Discovery HRMS, con su resolucion establecida en 30k; datos escaneados de m/z 150 a 1500 en modo de electropulverizacion de iones positivos. El voltaje de la aguja se ajusto a 4 kV; las otras condiciones de la fuente fueron gas de impulsion = 25, gas auxiliar = 0, gas de barrido = 5 (todos los flujos de gas en unidades arbitrarias), voltaje capilar = 30 V, temperatura capilar = 300 °C y voltaje de la lente del tubo = 75. La muestra se diluyo con acetonitrilo:metanol:agua 2:2:1 (igual que el eluyente de infusion) y se inyectaron 50 microlitros.

Los espectros de NMR se adquirieron en instrumented Bruker Avance DRX 500 MHz o Varian INOVA 600 MHz usando secuencias de pulsos estandar. Los espectros de NMR ID (1H y 13C) y 2D (COSY, TOCSY, HMQC y HMBC) se realizaron en C⁵D⁵N.

El Compuesto Reb Z, que se muestra como una mezcla de Reb Z1 y Reb Z2, se muestra en la Figura 10. La formula molecular del compuesto Reb Z se dedujo como C50H80O28 en base a su espectro de masas de alta resolucion positiva (HR), que mostro iones aductos correspondientes a [M+Na]+ en m/z 1151.4713; esta composicion fue soportada por los datos de espectro NMR de 13C. Los datos del espectro NMR 1H del Reb Z mostraron la presencia de una mezcla de dos compuestos (Reb Z1 y Reb Z2) en la relacion entre 60:40 y 70:30. Por lo tanto, los datos del espectro NMR de 1H y 13C de Reb Z mostraron un conjunto de picos para cada proton y carbono presentes en su estructura. La hidrolisis acida de Reb Z con 5 % de H2SO4 produjo D-glucosa que se identifico por comparacion directa con una muestra autentica por TLC. La hidrolisis enzimatica de Reb Z proporciono una aglicona, que se identifico como esteviol por comparacion entre 1H NMR y co-TLC con un compuesto estandar. Los valores de n Rm de 1H y 13C para el compuesto Reb Z se asignaron en base a los datos TOCSY, HMQC y HMBC. Las altas constantes de acoplamiento observadas para los cinco protones anomericos de los restos de glucosa, sugirieron su orientacion p segun lo informado para los glucosidos de esteviol.

Tabla 2. Datos del espectro NMR de 1H y 13C (cambios qmmicos y constantes de acoplamiento) para rebaudiosido Z ("Reb Z") y rebaudiosido E a-c.

Posicion Reb Z Rebaudiosido E

1H NMR 13C NMR 1H NMR 13C NMR

1 0,74 t (12,7), 1,65 m 41,2 0,73 t (13,2), 1,68 m 41,0

2 1,45 m, 2,12 m 20,6 1,46 m, 2,13 m 20,6

3 1,13 m, 38,2 1,12 m, 2,78 d (12,8) 38,2

2,922 d (13,2)/2,79 d (12,8)

4 --- 44,9/44,8 --- 44,8

5 0,99 m 58,1 0,97 d (11,8) 57,9

6 1,87 m, 2,14 m 22,6 1,85 m, 2,09 m 22,6

7 1,24 m, 1,68 m 42,2 1,27 m, 1,63 m 42,1

8 — 43,2/43,1 ^—43,0

9 0,88 brs 54,5 0,88 brs 54,5

10 ^—40,2 ^—40,2

11 1,68m 21,1 1,65m 21,1

12 1,92 m, 2,28 m 37,8 1,96 m, 2,16 m 37,8

13 ^—86,6 ^—86,6

14 1,72 m, 2,48 d (10,8) 44,9/44,8 1,74 d (11,4), 2,54 d (11,0) 44,8

15 1,92 m, 2,14 m 48,5 2,04 m, 2,12 m 48,5

16 ^—155,2/155,0 --- 154,9

17 5,09/5,12 s, 5,68/5,74 s 105,4/105,2 5,09 s, 5,76 s 105,4

18 1,43/1,49 s 29,9 1,43 s 29,8

19 --- 176,3/176,1 --- 176,2

20 1,09 s 17,3 1,10s 17,2

1' 6,30 d (7,9)/6,35 d (7,8) 93,9/93,6 6,30 d (7,9) 93,9

2' 4,38 m 81,8 4,38 m 81,7

3' 4,27 m 78,5 4,26 m 78,4

4' 4,24 m 71,8 4,22 m 71,8

5' 3,94 m 79,6 3,92 m 79,5

6' 4,33 m, 4,46 m 62,6 4,33 m, 4,43 m 62,6

1'' 5,12 d (7,4)/ 98,4/98,2 5,16 d (7,5) 98,4

5,14 d (7,4)/

2'' 4,18 m 84,9 4,17 m 84,9

3'' 4,29 m 78,6 4,32 m 78,5

4'' 4,20 m 72,1 4,22 m 72,1

5'' 3,74 m 78,5 3,72 m 78,2

6'' 4,32 m, 4,38 m 62,8 4,26 m, 4,35 m 62,9

I'" 5,33 d (7,8)/ 106,7/104,5 5,32 d (7,5) 107,2

5,46 d (7,8)/

2'" 4,14 t (8,4) 85,7/77,7 4,15 t (8,4) 77,7

3''' 4,25 m 78,7 4,26 m 78,6

4''' 4,34 m 72,1/71,5 4,36 m 72,3

5''' 3,88 m 79,1 3,96 m 79,0

6''' 4,43 m, 4,56 m 63,1 4,46 m, 4,56 m 63,2

I"" 5,48 d (7,9)/ 106,3/104,4 5,48 d (7,9) 106,2

5,40 d (7,6)

2"" 4,04 t (7,9) 85,6/77,3 4,06 t (7,9) 76,8

3'''' 4,22 m 78,8 4,25 m 78,7

4"" 4,38 m 71,4/71,0 4,31 m 71,2

5'''' 3,96 m 79,1 4,02 m 79,1

6'''' 4,38 m, 4,57 m 63,4 4,42 m, 4,54 m 63,4

1... 5,29 d (7,5)/ 107,1

5,34 d (7,5)/

2... 4,02 m 77,0

3... 4,21 m 78,6

4... 4,25 m 71,6/71,2

5... 3,98 m 79,1

6... 4,34 m, 4,48 m 63,3

aasignaciones hechas sobre la base de las correlaciones TOCSY, HMQC y HMBC; los valores

de desplazamiento qmmico estan en 8 (ppm);

cconstantes de acoplamiento estan en Hz,

Con base en los resultados de los datos del espectro de NRM y los experimentos de hidrolisis de Reb Z, y una comparacion cercana de los valores de NRM de 1H y 13C de Reb Z con rebaudiosido E sugirio que la mezcla de dos compuestos producidos por la conversion enzimatica se dedujo como 13-[(2-O-p-D-glucopiranosil-2-O-p-D-glucopiranosil-p-D-glucopiranosil)oxi]acido enf-kaur-16-en-19-oico-2-O-p-D-glucopiranosilo-p-D-glucopiranosil ester (Reb Z1) o 13-[(2-O-p

Claims

Reivindicaciones

1. Un metodo para producir una composicion de glucosido de esteviol o la smtesis de un compuesto de glucosido de esteviol, el metodo comprende incubar un sustrato con un polipeptido recombinante que es una UDP-glucosiltransferasa que comprende una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 80 % de identidad con la secuencia de aminoacidos de la glucosiltransferasa de HVI como se expone en la sec. con num. de ident. :6 en presencia de UDP-glucosa como donante de glucosa.

2. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde dicha secuencia de aminoacidos tiene:

(a) al menos 90 % de identidad con la sec. con num. de ident.:6;

(b) al menos 95 % de identidad con la sec. con num. de ident.: 6; o

(c) consiste en la secuencia de aminoacidos de la glucosiltransferasa HVI de la sec. con num. de ident.:6.

3. Un metodo como se reivindica en la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en donde dicho polipeptido recombinante se expresa por una celula huesped que se incuba con el sustrato.

4. Un metodo como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para producir una composicion de glucosido de esteviol, en donde el sustrato se selecciona del grupo que consiste en esteviosido, rebaudiosido A, rebaudiosido E y sus combinaciones.

5. Un metodo como se reivindica en la reivindicacion 4, en donde el rebaudiosido E se convierte en rebaudiosido Z mediante dicha UDP-glucosiltransferasa, opcionalmente, dicha composicion de glucosido de esteviol comprende ademas un compuesto de glucosido de esteviol seleccionado de rebaudiosido D, rebaudiosido E y sus combinaciones.

6. Un metodo como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para producir una composicion de glucosido de esteviol que comprende ademas proporcionar un edulcorante que comprende la composicion de glucosido de esteviol.

7. Un metodo para sintetizar un compuesto de glucosido de esteviol como se reivindico en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde se proporciona un compuesto seleccionado de rubusosido, esteviosido, rebaudiosido A o rebaudiosido E se proporciona como un sustrato para dicha UDP-glucosiltransferasa.

8. Un metodo como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende ademas incubar una sacarosa sintasa recombinante con dicho sustrato y el polipeptido recombinante; opcionalmente, en donde la sacarosa sintasa recombinante comprende una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 80 % de identidad con la secuencia de aminoacidos de la sacarosa sintasa 1 de Arabidopsis thaliana como se expone en la sec. con num. de ident.:9.

9. Un metodo como se reivindica en la reivindicacion 8, que comprende ademas incubar una segunda UDP-glucosiltransferasa recombinante con la sacarosa sintasa, dicho sustrato y dicho polipeptido recombinante; opcionalmente, en donde tambien se emplea una UDP-glucosiltransferasa recombinante que comprende una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 80 % de identidad con la secuencia de aminoacidos de la UGT76G1 como se expone en la sec. con num. de ident.:11

10. Un metodo como se reivindica en la reivindicacion 7 para sintetizar rebaudiosido Z1 y rebaudiosido Z2 a partir de rebaudiosido E, el metodo comprende:

proporcionar una mezcla de reaccion que comprende rebaudiosido E y

(A) una UDP-glucosiltransferasa recombinante que comprende una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 80 % de identidad con la sec. con num. de ident.:6 y la UDP-glucosa como un sustrato, o

(B) sacarosa, UDP y UDP-glucosa como sustratos y una UDP-glucosiltransferasa que comprende una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 80 % de identidad con la sec. con num. de ident.:6 junto con una sacarosa sintasa; e

incubar la mezcla de reaccion de manera que una glucosa se acopla covalentemente al C2' de la 13-O-glucosa del rebaudiosido E para producir rebaudiosido Z1 y una glucosa se acopla covalentemente al C2' de la 19-O-glucosa del rebaudiosido E para producir rebaudiosido Z2.

11. Un metodo como se reivindica en la reivindicacion 10, en donde se emplea una sacarosa sintasa seleccionada del grupo que consiste en una sacarosa sintasa 1 de Arabidopsis, una sacarosa sintasa 3 de Arabidopsis, una sacarosa sintasa de Vigna radiate y homologos funcionales de las mismas.

12. Un metodo como se reivindica en la reivindicacion 11, en donde dicha sacarosa sintasa tiene al menos 80 % de identidad con la secuencia de aminoacidos de la sacarosa sintasa 1 de Arabidopsis thaliana como se expone en la sec. con num. de ident.: 9.

13. Un metodo como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, que comprende ademas producir rebaudiosido Z como una mezcla de rebaudiosido Z1 y rebaudiosido Z2 a partir de la mezcla de reaccion.

14. Un compuesto rebaudiosido Z que es

(a) rebaudiosido Z1 que tiene la estructura:

o

(b) rebaudiosido Z2 que tiene la estructura:

y mezclas de estos.

15. Un edulcorante que comprende rebaudiosido Z1 y/o rebaudiosido Z2 como se reivindica en la reivindicacion 14, que comprende opcionalmente ademas al menos un relleno, un agente de carga o un agente antiaglomerante.

16. Un producto consumible que comprende una cantidad edulcorante de un edulcorante como se reivindica en la reivindicacion 15, opcionalmente en donde el producto consumible se selecciona del grupo que consiste en bebidas, productos de confiterla, productos de panaderla, galletas y gomas de mascar.