CN109122315B - 一种利用矾根叶柄培育种苗的方法 - Google Patents

Abstract

一种利用矾根叶柄培育种苗的方法，以矾根无菌苗的叶柄诱导愈伤组织，再进行不定芽分化、增殖，诱导生根，获得矾根种苗，建立了矾根叶柄愈伤组织诱导及其不定芽分化的再生体系，本发明中，叶柄的愈伤组织诱导率在90％以上，诱导出的愈伤组织具有良好的分化能力，分化不定芽数多，可达6～18个，生根率高，根系健壮；培育的种苗与母株性状一致，本发明建立的矾根再生体系为矾根的遗传转化研究奠定了基础。

Description

一种利用矾根叶柄培育种苗的方法

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种利用矾根叶柄培育种苗的方法。

背景技术

矾根(Heuchera spp.)原产北美洲，是虎耳草科矾根属多年生常绿草本花卉，品种繁多，叶色丰富，是少有的彩叶阴生地被植物，被广泛应用于美国的园林景观中。

近年，矾根开始被我国园林工作者应用于花境、花坛、立体绿化，也有做盆花使用，具有独特的观赏性，又具有较强的耐寒性和耐旱性，被誉为‘花园的调色板’，除此之外，矾根还具有吸收重金属，改善生态环境的作用，逐渐受到市场的关注，矾根种苗需求逐渐增加。

但是，多数矾根品种只开花不结籽或不能自花授粉，矾根种子发芽慢，出苗不整齐或种苗一致性差，较少用于种苗生产；有性繁殖的方法不能保持矾根品种原有的特性；而分株繁殖又周期长、繁殖系数低，限制了其新品种的选育及推广，且很多矾根品种抗热性和抗湿性差，阻碍了矾根在国内市场的推广应用。

采用常规方法进行矾根的抗逆品种选育周期长、难度大，利用基因工程技术改良观赏植物性状较传统方法而言更为直接、快速，且具有针对性。利用组织培养技术进行植物的规模化繁育，可在较短时间内大量生产性状一致的组培苗，花卉植物的组培快繁已有较多成功的报道。虽然利用组织培养技术繁育矾根种苗的研究取得了一定的进展，但是，未见对于矾根离体再生体系的系统研究报道。

在现有技术中，利用组培技术开展矾根种苗快速繁殖研究时，多数采用茎尖、新芽、腋芽叶片、茎段或花序轴做外植体直接诱导无菌芽，然后进行继代增殖，这对解决矾根优良种苗资源不足问题具有较大意义。但是，这些方法容易破坏甚至毁灭母株材料，有些方法对外植体取材时期要求较高，不太适合母株材料稀少的新种质，也不适用矾根的转基因研究。

陈锦等(美洲矾根愈伤组织诱导及其快繁技术体系研究.湖北农业科学，2017，56(5)：973-975)以矾根(H.micrantha)叶柄为外植体诱导愈伤组织，发现叶柄在MS+6-BA0.5mg/L的培养基上愈伤组织诱导率仅为19％。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用矾根叶柄培育种苗的方法，克服了矾根花粉不育的问题，诱导愈伤组织，愈伤组织具有良好的分化能力，分化不定芽数多，可达6～18个，培育的矾根种苗与母株性状一致。本发明建立了有效的矾根叶柄离体培养再生体系，为后续的遗传转化提供良好的受体材料，为矾根的遗传转化研究奠定基础。

为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种利用矾根叶柄培育种苗的方法，包括以下步骤：

1)诱导培养

切取无菌苗叶片下方0.6～1.0cm长的叶柄作为外植体，接种于诱导培养基上，在黑暗条件下培养，诱导愈伤组织，培养温度为24±2℃，培养28～40d，诱导率为90％以上；

其中，所述诱导培养基以MS为基本培养基，并添加蔗糖20～40g/L，琼脂粉5～7g/L，6-BA 0.3～0.5mg/L，PIC 0.4～1.0mg/L；

2)分化培养

将诱导出的叶柄愈伤组织接种于分化培养基上，进行分化培养，培养20-30d，获得不定芽；

培养条件：培养温度为24±2℃，光照强度为30-35μmol·m^-2·s^-1，光照时间为10～14h/d；

3)生根培养

将步骤2)中的不定芽分割为单芽后接种于生根培养基，培养20-30d，获得矾根生根种苗；

培养条件：培养温度为24±2℃，光照强度为30～35μmol·m^-2·s^-1，光照时间为10～14h/d。

又，步骤2)分化培养基以MS为基本培养基，添加蔗糖20～40g/L，琼脂粉5～7g/L，6-BA 0.05～0.2mg/L，IAA 0.02～0.1mg/L。

进一步，分化培养后生根培养前，对不定芽进行继代增殖，增殖率6～10，继代周期为28～35d，培养3～4代；培养条件：培养温度为24±2℃，光照强度为30～35μmol·m^-2·s^-1，光照时间为10～14h/d。

又，所述继代增殖培养基以MS为基本培养基，添加蔗糖20～40g/L，琼脂粉5～7g/L，6-BA 0.1～0.3mg/L，KT 0.2～1.0mg/L，IAA0.1～0.2mg/L。

优选地，步骤4)中，所述生根培养基以1/2MS为基本培养基，添加蔗糖15～25g/L，琼脂粉5～6g/L，IBA 0.5～1.5mg/L。

又，本发明所述矾根为‘巴黎’或‘闪秋’

本发明以矾根无菌苗的幼嫩叶柄诱导愈伤组织，再进行不定芽分化、增殖，诱导不定芽生根，获得矾根种苗，建立了矾根叶柄愈伤组织诱导及其不定芽分化的再生体系。

本发明对矾根的叶柄进行诱导培养，在MS培养基中添加毒莠定PIC，配合6-BA，12d后叶柄切口开始膨大，有少量微小愈伤组织形成，20d后即有较高的愈伤诱导率，继续培养至30d，愈伤组织诱导率更高，叶柄培养时，愈伤诱导率均随PIC浓度的增加而呈现先增后降的趋势，由此说明，较低浓度的PIC比较适合矾根叶柄愈伤组织的诱导，较高浓度的PIC对矾根愈伤组织诱导有一定的抑制作用，PIC诱导愈伤组织的适宜浓度较窄，因此，需要选择合适的PIC浓度，在合适的浓度范围内，PIC浓度越高，愈伤组织形成的后效力越强。

在矾根的分化培养中，较高浓度的6-BA对不定芽分化具有抑制作用，若6-BA浓度过高，则不定芽分化率较低，芽少，较为细弱，且玻璃苗现象加重，甚至不分化，而合适的6-BA浓度下，不定芽分化率达80％以上，且芽生长良好，芽多，极少出现玻璃化。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明选用了合适的再生外植体，以叶柄作为外植体，配置添加了PIC和6-BA的诱导培养基，诱导愈伤组织，诱导率达90％以上，可不伤害或少伤害母株，适用于母株材料稀少的新种质的快速繁殖，还可应用于矾根的遗传转化研究。

本发明的分化培养中，愈伤组织的不定芽分化率在80％以上，大大提高了不定芽分化的数量和质量，在某种程度上决定了愈伤组织再生植株的效率，试管苗生根率可达100％，植株生长健壮，根系发达，为其后期的遗传转化研究奠定了基础。

附图说明

图1为本发明实施例中矾根叶柄诱导培养30d时的生长图。

图2为本发明实施例中对愈伤组织分化培养2d的愈伤组织。

图3为本发明实施例中对愈伤组织分化培养1周的愈伤组织。

图4为本发明实施例中对愈伤组织分化培养2周后形成的不定芽。

图5为本发明实施例中分化培养30d后形成的不定芽。

图6本发明实施例中矾根试管苗的生根情况。

图7本发明实施例中矾根试管苗的移栽情况。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。

实施例

1.1供试材料

矾根‘巴黎’(Heuchera‘Pairs’)无菌苗

1.2诱导愈伤组织

切取无菌苗叶片下方0.8cm的叶柄作为外植体，接种于诱导培养基上，在黑暗条件下培养，诱导愈伤组织，培养温度为24±2℃，培养28～40d。

所述诱导培养基以MS为基本培养基，添加6-BA 0.5mg/L，并分别添加毒莠定(Picloram,PIC)0.5mg/L，蔗糖30g/L，琼脂粉6g/L，常规灭菌后分装于培养皿中待用。

12d后叶柄切口开始膨大，有少量微小愈伤组织形成，分别于外植体接种20d、30d后统计愈伤组织数，20d后即有较高的愈伤诱导率，诱导率72.2％，培养至30d，愈伤组织诱导率96.3％，形态良好(参见图1)，由图1可见愈伤组织为黄绿色，形态致密；愈伤组织培养30d后统计分化有效不定芽的愈伤组织数。

诱导率＝形成愈伤组织的外植体数/接种的外植体数×100％；

分化率＝分化有效不定芽的愈伤组织数/接种的愈伤组织数×100％；

生根率＝生根试管苗数/接种试管苗数×100％。

在诱导培养基中，以PIC浓度为0.2mg/L和2.0mg/L作为对比例，进行叶柄诱导培养，结果显示，当PIC浓度为0.2mg/L时，愈伤诱导率为77.78％；PIC浓度为2.0mg/L时，愈伤诱导率仅为62.04％。

1.4分化培养

将愈伤组织接种于不同的分化培养基上进行分化培养，培养条件：培养温度为24±2℃，光照强度为30-35μmol·m^-2·s^-1，光照时间为12h/d。

所述分化培养基以MS为基本培养基，添加吲哚乙酸0.05mg/L，并添加6-苄氨基嘌呤(6-Benzyl-aminopurine,6-BA)0.05～0.2mg/L，蔗糖30g/L，琼脂粉6g/L。

培养结果显示，愈伤组织培养2d后即隐约转为淡绿色(图2)，1周后出现淡绿色芽点(图3)，2周后有不定芽形成(图4)，30d后即可形成大量不定芽(图5)。在本实施例的分化培养基上，矾根叶柄愈伤组织培养30d的不定芽分化率高达81.25％，且芽生长良好，芽多，极少出现玻璃化。

1.5生根培养

将不定芽分割为单芽后接种于生根培养基。培养条件：培养温度为24±2℃，光照强度为30～35μmol·m^-2·s^-1，光照时间为12h/d。

其中，所述生根培养基以1/2MS为基本培养基，添加吲哚丁酸0.5～1.5mg/L，添加蔗糖20g/L，琼脂粉5.8g/L。

培养结果显示，在IBA 1.0mg/L的培养基上，矾根生根率高达100％，单株生根数多，生根数在8～22条，且状态良好。

本发明的矾根试管苗根系发达且植株生长健壮(图6)，经炼苗假植后移栽，一般均能成活，且长势良好(图7)。

对比例

本发明人根据Hosoki Hosoki等((Shoot regeneration from petioles ofcoral bells(Heuchera sanguinea,Engelm.)cultured in vitro,and subsequentplanting and flowering ex vitro[J].In Vitro Cellular&Developmental BiologyPlant,2003,39(2)：135-138)等人的研究结果，将矾根‘巴黎’叶柄培养于MS+NAA0.04mg/L+6-BA1.0mg/L培养基上，结果愈伤组织诱导率仅为8.33％。

Claims (3)

1.一种利用矾根叶柄培育种苗的方法，包括以下步骤：

1)诱导培养

切取矾根‘巴黎’无菌苗叶片下方0.6~1.0cm长的叶柄作为外植体，接种于诱导培养基上，在黑暗条件下培养，诱导愈伤组织，培养温度为24±2℃，培养28~40d，诱导率为90%以上；

其中，所述诱导培养基以MS为基本培养基，并添加蔗糖20~40 g/L，琼脂粉5~7g/L，6-BA0.3~0.5mg/L，毒莠定 0.4~1.0mg/L；

2)分化培养

将诱导出的叶柄愈伤组织接种于分化培养基上，进行分化培养，培养20~30d，获得不定芽；

培养条件：培养温度为24±2℃，光照强度为30~35μmol·m^-2·s^-1，光照时间为10~14h/d；

所述分化培养基以MS 为基本培养基，添加蔗糖20~40 g/L，琼脂粉5~7g/L，6-BA 0.05~0.2mg/L，IAA 0.02~0.1 mg/L；

3)生根培养

将步骤2）中的不定芽分割为单芽后接种于生根培养基，培养20~30d，获得矾根‘巴黎’生根种苗；

培养条件：培养温度为24±2℃，光照强度为30~35μmol·m^-2·s^-1，光照时间为10~14h/d；

所述生根培养基以1/2MS为基本培养基，添加蔗糖15~25 g/L，琼脂粉5~6 g/L，IBA 0.5~1.5mg/L。

2.根据权利要求1所述利用矾根叶柄培育种苗的方法，其特征在于，分化培养后生根培养前，对不定芽进行继代增殖，增殖率6~10，继代周期为28~35d，培养3~4代；培养条件：培养温度为24±2℃，光照强度为30~35μmol·m^-2·s^-1，光照时间为10~14h/d。

3.根据权利要求2所述利用矾根叶柄培育种苗的方法，其特征在于，所述继代增殖的培养基以MS为基本培养基，添加蔗糖30g/L，琼脂粉6g/L，6-BA 0.1~0.3mg/L，KT 0.2~1.0mg/L，IAA0.1~0.2mg/L。

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