CN110302221B

CN110302221B - 臭椿根皮总生物碱及制备方法和应用

Info

Publication number: CN110302221B
Application number: CN201910195770.9A
Authority: CN
Inventors: 宋少江; 黄肖霄; 段治康; 王雨曦; 鄢志扬
Original assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Current assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Priority date: 2019-03-15
Filing date: 2019-03-15
Publication date: 2021-07-09
Anticipated expiration: 2039-03-15
Also published as: CN110302221A

Abstract

本发明属于医药技术领域，涉及从植物臭椿的根皮中提取得到的臭椿根皮总生物碱及其制备方法，是将臭椿干燥根皮用甲醇或者乙醇提取，将所得提取物用乳酸溶解，通过离子交换树脂得到粗提物，用甲酸溶解粗提物后，用NaOH调PH为10～12，最后用氯仿萃取，减压回收溶剂，干燥，得到含量较高的臭椿根皮总生物碱。本发明提供的总生物碱具有良好的抗肝癌活性，可以开发成一种新的抗肿瘤药物。本方法设计合理，具有过程工艺简单，可工业化生产的特点。

Description

臭椿根皮总生物碱及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及植物医药技术领域，涉及臭椿根皮总生物碱及制备方法和应用，尤其涉及药用植物臭椿的根皮中具有抗肝癌活性总生物碱的制备方法。

背景技术

肝癌已经成为我国严重的健康问题。所以寻找肝癌特效的治疗药物成为亟需解决的问题。臭椿(Altissima)为苦木科(Simaroubaceae)臭椿属(Ailanthus)植物。由于其树皮和树叶具有苦味且小叶基部腺挥发出特殊臭味而得名为臭椿。我国除黑龙江、吉林、新疆、青海、宁夏、甘肃和海南外，各地均有分布。椿根皮，又称椿白皮、樗白皮，为臭椿的干燥根皮或干皮，是中国的传统中草药。中国药典中对其药用功效描述为清热燥湿、收涩止带、止泻、止血，用于治疗赤白带下、湿热泻痢、久泻久痢、便血及崩漏。椿皮的主要化学成分主要含苦木苦味素、三萜、生物碱及挥发性成分。研究报道椿皮抗肿瘤成分多集中在苦木苦味素类化合物，四环三萜类成分也具有一定的抗肿瘤活性。在本发明前，未见有臭椿根皮总生物碱抗肝癌活性的报道。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种臭椿根皮中总生物碱，所述的总生物碱具有明显的抗肝癌活性，可以用于制备抗肿瘤药物。

本发明的目的之二是提供所述的臭椿根皮总生物碱的制备方法。

本发明提供了一种臭椿根皮中总生物碱，并通过以下方法制备：

将臭椿干燥根皮用甲醇或者乙醇提取，所得浸膏用乳酸溶液溶解后，通过离子交换树脂得到粗提物，然后再用甲酸溶解，用NaOH调PH为10～12，最后用氯仿萃取，得到含量较高的臭椿根皮总生物碱。

进一步地，本发明通过如下方法制备：

(1)将臭椿根皮粉碎成粗粉，用75～85％的甲醇或乙醇提取3～5次，减压浓缩得到臭椿根皮提取物；

(2)将所得的臭椿根皮提取物用PH＝3～5的乳酸溶液溶解，过滤，得到0.8g/ml的溶液；

(3)将过滤所得的酸液分别选用一种阳离子交换树脂(Amberlite IR-116、Dowex50×1、Diaion SK-103)动态吸附，使用4～6％的氨水洗脱4～6个保留体积后，用PH＝2～3，浓度为60～80％的乙醇洗脱4～6个保留体积，回收溶剂得到臭椿根皮总生物碱粗提物；

(4)将所得的臭椿根皮总生物碱粗提物用PH＝2～3的甲酸溶液溶解，过滤，除去残渣，制成0.8～1.2g/ml的溶液后，使用NaOH溶液调PH＝10～12；

(5)使用氯仿对所得碱液萃取，回收氯仿，得到最终的臭椿根皮总生物碱。

按照此方法制备的臭椿根皮总生物碱含量以canthin-6-one计，在415nm波长出测定吸光度，检测结果表示臭椿根皮总生物碱含量可以达到75％以上。

本专利的目的之三是提供臭椿根皮总生物碱在制备抗肝癌药物中的新用途。所述的臭椿根皮总生物碱具有比臭椿根皮总提物更强的肿瘤增殖抑制活性，并且可以抑制裸鼠移植Hep3B肿瘤的生长。

采用MTT法测试臭椿根皮总生物碱对人肝癌MHCC97H细胞株,SMCC7721细胞株,HepG2细胞株,Hep3B细胞株的体外抗肿瘤作用。试验结果表明臭椿根皮总生物碱在体外对上述四种细胞株具有显著的细胞增殖抑制活性，IC₅₀值分别为15.37μg/ml，17.92μg/ml，21.93μg/ml，24.37μg/ml。

采用移植肝癌Hep3B细胞的裸鼠模型对臭椿根皮总生物碱的体内抗肝癌活性进行测试。结果表明，臭椿根皮总生物碱能够抑制肝癌细胞的增殖抑制人肝癌Hep3B裸鼠移植瘤的生长。因此，本发明所述的臭椿根皮总生物碱具有制备临床抗肝癌预防和治疗药物的前景。

本发明还提供了一种药物组合物，该组合物包含所述的臭椿根皮总生物碱，且具有明显的抗肝癌作用。可以用于制备抗肝癌药物。

附图说明

图1为实施例5中人肝癌Hep3B裸鼠肿瘤体积。

具体实施方式

本发明结合具体实施例作进一步的说明。

实施例1

取干燥臭椿根皮1kg，将其粉碎成粗粉，用75～85％甲醇或乙醇提取3～5次，减压浓缩得到臭椿根皮提取物；将所得的臭椿根皮提取物用PH＝3～5的乳酸溶液溶解，过滤，得到0.8g/ml的溶液；将所得的酸液使用阳离子交换树脂Amberlite IR-116动态吸附，使用4～6％的氨水洗脱4～6个4保留体积后，用PH＝2～3，浓度为60～80％的乙醇洗脱4～6个保留体积，回收溶剂得到臭椿根皮总生物碱粗提物；将所得的臭椿根皮总生物碱粗提物用PH＝2～3的甲酸溶液溶解，过滤，除去残渣，制成0.8～1.2g/ml的溶液后，使用NaOH溶液调PH＝10～12；使用氯仿对所得碱液萃取，回收氯仿，得到4.16g臭椿根皮总生物碱。利用紫外-可见光分光光度法，以canthin-6-one为对照品，在415nm的波长处测定吸光度，检测结果显示所得臭椿根皮总生物碱含量为82.6％。

实施例2

取干燥臭椿根皮1kg，将其粉碎成粗粉，用75～85％甲醇或乙醇提取3～5次，减压浓缩得到臭椿根皮提取物；将所得的臭椿根皮提取物用PH＝3～5的乳酸溶液溶解，过滤，得到0.8g/ml的溶液；将所得的酸液使用阳离子交换树脂Dowex50×1动态吸附，使用4～6％的氨水洗脱4～6个4保留体积后，用PH＝2～3，浓度为60～80％的乙醇洗脱4～6个保留体积，回收溶剂得到臭椿根皮总生物碱粗提物；将所得的臭椿根皮总生物碱粗提物用PH＝2～3的甲酸溶液溶解，过滤，除去残渣，制成0.8～1.2g/ml的溶液后，使用NaOH溶液调PH＝10～12；使用氯仿对所得碱液萃取，回收氯仿，得到4.54g臭椿根皮总生物碱。利用紫外-可见光分光光度法，以canthin-6-one为对照品，在415nm的波长处测定吸光度，检测结果显示所得臭椿根皮总生物碱含量为79.6％。

实施例3

取干燥臭椿根皮1kg，将其粉碎成粗粉，用75～85％甲醇或乙醇提取3～5次，减压浓缩得到臭椿根皮提取物；将所得的臭椿根皮提取物用PH＝3～5的乳酸溶液溶解，过滤，得到0.8g/ml的溶液；将所得的酸液使用阳离子交换树脂Diaion SK-103动态吸附，使用4～6％的氨水洗脱4～6个4保留体积后，用PH＝2～3，浓度为60～80％的乙醇洗脱4～6个保留体积，回收溶剂得到臭椿根皮总生物碱粗提物；将所得的臭椿根皮总生物碱粗提物用PH＝2～3的甲酸溶液溶解，过滤，除去残渣，制成0.8～1.2g/ml的溶液后，使用NaOH溶液调PH＝10～12；使用氯仿对所得碱液萃取，回收氯仿，得到3.92g臭椿根皮总生物碱。利用紫外-可见光分光光度法，以canthin-6-one为对照品，在415nm的波长处测定吸光度，检测结果显示所得臭椿根皮总生物碱含量为83.8％。

实施例4

用实施例1～3制备得到的臭椿根皮总生物碱，对人肝癌MHCC97H,SMCC7721,HepG2,Hep3B细胞增殖均有明显的抑制作用。

采用改良MTT法：将融合为单层的MHCC97H,SMCC7721,HepG2和Hep3B肿瘤细胞消化为单细胞悬浮液，加入96孔培养板中，90μL/孔。在37℃、5％CO₂培养箱中孵育24h后，加入一定浓度的受试样品，10μL/孔。受试样品组设置3个复孔。阴性对照为等体积的PBS，阳性对照为顺铂(DDP)，继续孵育48小时后，每孔加入10μl的MTT溶液5mg/ml，10μL/孔，避光37℃孵育2-4h；每孔加入100μl的MTT溶解buffer(20％SDS，1M HCl)，37℃孵育至结晶完全溶解；利用全自动酶标仪读取570nm及490nm处的吸光度，计算OD(570)-OD(490)的数值作为每孔的OD值；根据以下公式计算计算相对抑制率：细胞相对抑制率(％)＝100％-(实验组OD值/对照组平均OD值)×100％。用SPSS12.0软件计算各样品的IC₅₀值，结果见表1。

表1本发明臭椿根皮总生物碱对人肝癌细胞增殖的抑制作用

实施例5

用实施案列1～3制备得到的臭椿根皮总生物碱，对人肝癌Hep3B裸鼠移植瘤的生长具有明显的抑制作用。

常规培养人肝癌Hep3B细胞至对数生长期，0.25％胰酶消化，离心收集细胞，PBS重悬细胞并离心，弃上清，用无血清DMEM制成细胞悬液并调整细胞密度为5×10⁵/mL。

裸鼠于SPF环境下正常饲养5天以适应实验室环境，并实时观察裸鼠生存情况，保证接种肿瘤细胞时无异常病态反应。无菌条件下，用1mL胰岛素针向每只裸鼠背部右后侧皮下注射Hep3B单细胞悬液0.2mL。注射完毕后，每日观察裸鼠状况及皮下肿瘤生长情况，待裸鼠皮下出现粟粒大小结节时表示裸鼠模型构建成功。

将成功建立人肝癌Hep3B移植瘤模型的裸鼠随机分为三组，每组6只，分别为空白对照组、臭椿根皮总生物碱低剂量组、臭椿根皮总生物碱高剂量组。当移植瘤体积生长至约为100mm³时开始给药，对照组腹腔注射0.2mL载体溶剂，低剂量组与高剂量组分别腹腔注射0.2mL剂量分别为5mg/kg/d、10mg/kg/d的臭椿根皮总生物碱，每2天给药一次，连续给药2周。

裸鼠每次给药前观察并记录各组裸鼠摄食、饮水、大便形态、精神状态、活动能力、反应及接种部位的移植瘤组织生长情况的变化。给药期间，每天用游标卡尺测量裸鼠体重、肿瘤长径(L)和短径(W)，肿瘤体积按公式：V＝0.5236×L×W²计算，并分别计算三组肿瘤的平均体积，数据表示为mean±SD，然后绘制成肿瘤生长随时间变化曲线，如图1。

Claims

1.臭椿根皮总生物碱，其特征在于，通过如下方法制备：

将臭椿干燥根皮用甲醇或者乙醇提取，所得浸膏用乳酸溶液溶解后，过滤，将过滤所得的酸液使用阳离子交换树脂动态吸附，使用4 ~ 6%的氨水洗脱4 ~ 6个保留体积后，用pH =2~3，浓度为60~80%的乙醇洗脱4 ~ 6个保留体积，回收溶剂得到臭椿根皮总生物碱粗提物，然后再用甲酸溶解，用NaOH调pH为10~12，最后用氯仿萃取，得到臭椿根皮总生物碱。

2.如权利要求1所述的臭椿根皮总生物碱的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）将臭椿根皮粉碎成粗粉，用甲醇或乙醇提取，减压浓缩得到臭椿根皮提取物；

（2）将所得的臭椿根皮提取物用pH = 3 ~ 5的乳酸溶液溶解，过滤；

（3）将过滤所得的酸液使用阳离子交换树脂动态吸附，使用4 ~ 6%的氨水洗脱4 ~ 6个保留体积后，用pH = 2~3，浓度为60~80%的乙醇洗脱4 ~ 6个保留体积，回收溶剂得到臭椿根皮总生物碱粗提物；

（4）将所得的臭椿根皮总生物碱粗提物用pH = 2 ~ 3 的甲酸溶液溶解，过滤，除去残渣，使用NaOH溶液调pH = 10 ~ 12；

（5）使用氯仿对所得碱液萃取，回收氯仿，得到最终的臭椿根皮总生物碱。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中甲醇或乙醇的体积浓度为：75%~85%，提取次数为：3~5次。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）、（4）中，将臭椿根皮提取物溶解后，得到0.8~1.2g/ml的溶液。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所用阳离子交换树脂为Amberlite IR-116、Dowex 50×1、Diaion SK-103型强酸性阳离子交换树脂中的一种。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，制备的臭椿根皮总生物碱含量在75%以上。

7.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的臭椿根皮总生物碱和药学上可接受的载体或赋形剂。

8.权利要求1所述的臭椿根皮总生物碱或权利要求7所述的药物组合物在制备抗癌药物中的应用，其特征在于，所述的癌症为肝癌。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的肝癌的癌症细胞为MHCC97H细胞株,SMCC7721细胞株, HepG2细胞株, Hep3B细胞株。

10.权利要求9所述的应用，其特征在于，臭椿根皮总生物碱显著抑制裸鼠移值Hep3B肿瘤的生长。