CN102198139B

CN102198139B - 具有抗肿瘤作用的药物组合物及其应用

Info

Publication number: CN102198139B
Application number: CN 201010133844
Authority: CN
Inventors: 刘秀均; 甄永苏; 郑艳波; 李毅; 吴淑英
Original assignee: ZHEJIANG APELOA KANGYU PHARMACEUTICAL CO Ltd; Institute of Medicinal Biotechnology of CAMS
Current assignee: ZHEJIANG APELOA KANGYU PHARMACEUTICAL CO Ltd; Institute of Medicinal Biotechnology of CAMS
Priority date: 2010-03-26
Filing date: 2010-03-26
Publication date: 2013-08-21
Anticipated expiration: 2030-03-26
Also published as: CN102198139A

Abstract

本发明公开了一种具有抗肿瘤作用的药物组合物及其应用，所述药物组合物，含有A、B或C中的两种以上，所述A包括双嘧达莫、双嘧达莫在药学上可接受的衍生物或双嘧达莫在药学上可接受的类似物或其药学上可接受的盐；所述B包括乌苯美司、乌苯美司在药学上可接受的衍生物或乌苯美司在药学上可接受的类似物或其药学上可接受的盐；所述C包括地塞米松、地塞米松在药学上可接受的衍生物或地塞米松在药学上可接受的类似物。本发明的优点与积极效果在于：本发明涉及的抗肿瘤药物新组合主要通过作用于肿瘤微环境达到有效治疗肿瘤的目的。调节肿瘤微环境药物的特点是作用于多靶点、多通路；由细胞毒类药物引起的毒副作用可望减轻。

Description

具有抗肿瘤作用的药物组合物及其应用

技术领域

本发明涉及一种抗肿瘤药物，尤其涉及一种包含双嘧达莫、乌苯美司与地塞米松的药物及其在抗肿瘤方面的应用。

背景技术

恶性肿瘤是严重威胁人类健康的一种常见病。当今世界，人们对抗肿瘤药物的需求迫切。据2007的资料，全球新诊断的癌症患者1200万人，因癌症死亡760万人。据2007年我国城乡居民前十位疾病死亡率及死亡原因构成的资料表明：恶性肿瘤在我国城市和农村的死亡原因构成分别为28.5％和24.8％，均居于死亡原因的第一位.WHO资料表明：癌症是主要的导致死亡的疾病，癌症患者将持续增加。癌症作为死亡原因，于2008占13.8％，2015将占15.2％，2030将占17.6％。抗肿瘤药物则是销售额增长最快的药物，近几年在10类药物中其增长率居第一位，预计2010年将达到600亿美元。癌症治疗受到更大关注，将进一步推动抗肿瘤药物研发。

当今中国社会抗肿瘤新药研发面临较好的机遇：生物医药科学的发展，为研制新型抗肿瘤药物提供重要的理论基础与技术支持；医疗卫生事业的发展，对治疗重大疾病药物提出更高的要求；国内和国际市场的持续增长需求，可能带来巨大的经济效益；国家设立“重大新药创制”重大专项，将大大促进我国新药研究与开发。

目前研制抗肿瘤新药的策略包括二方面：1.作用于肿瘤细胞的药物：主要通过抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡，诱导肿瘤细胞分化起作用。2.调节肿瘤微环境的药物：主要通过以下几个方面起作用：(1)抑制肿瘤血管新生成或干扰肿瘤血管网络；(2)调节肿瘤内浸润的免疫细胞及相关细胞因子；(3)调节生长因子分泌与生长因子受体表达；(4)抑制特定酶的分泌与调节相应抑制因子；(5)干扰肿瘤细胞内与细胞外的物质传输、摄取与外排。

目前临床应用的抗肿瘤药物，其毒性是困扰肿瘤化疗的一个突出问题。寻找自身低毒，作用于肿瘤微环境的特定环节或分子靶点，以提高抗肿瘤效果或降低其毒性，成为研究抗肿瘤药物的一个新途径，也是临床治疗肿瘤的迫切需要。

双嘧达莫(Dipyridamole，DPM)及其药学上可接受的衍生物或类似物如单哌潘生丁(mopidamole)、BIBW22BS、RA25或其药学上可接受的盐为非硝酸酯类冠状动脉扩张剂，具有扩张冠状血管、促进侧支循环形成的作用。双嘧达莫还具有抑制血小板凝聚，预防血栓形成的作用。

双嘧达莫化学名为：2，2′，2″，2″′-[(4，8-二哌啶基嘧啶并[5，4，-d]嘧啶-2，6-二基)双次氮基]-四乙醇，分子式为C₂₄H₄₀N₈O₄，分子量为504.63，化学结构式如下所示：

双嘧达莫是一种有效的核苷转运抑制剂，通过阻断平衡型核苷转运蛋白hENT1(NatMed，1997，3：89-93)和hENT2(Biochem.J，1997，328：739-43)而抑制核苷转运。核苷酸是构成DNA和RNA大分子的亚单位，控制核苷酸的生物合成可影响细胞增殖。核苷酸的生物合成有两条途径，即从头合成和核苷补救。目前用于肿瘤化疗的抗代谢药可抑制“从头合成”，但不能阻断“核苷补救”。因此，控制“核苷补救”途径在肿瘤化疗中具有重要意义。核苷转运是指细胞外核苷通过细胞膜进入细胞内的过程，是“核苷补救”的第一步。抑制核苷转运将可能阻断“核苷补救”。本研究组的研究首次证明：双嘧达莫作为核苷转运抑制剂可增强抗代谢药acivicin对肿瘤细胞的杀伤作用。阻断核苷合成的补救途径是抗肿瘤药物的策略之一，能对抗外源性核苷对于抗代谢类药的抵消作用。

肿瘤治疗方面，双嘧达莫能够增强多种抗肿瘤药物如5-氟尿嘧啶、甲氨喋呤、阿霉素、依托泊苷、长春花碱、顺铂等的细胞毒活性。分子机理研究表明双嘧达莫一方面通过抑制“核苷补救”途径增强核苷类药物的抗癌效果；另一方面，双嘧达莫通过抑制P糖蛋白的活性，增加了P糖蛋白依赖的药物在细胞内的积累，从而增强了抗肿瘤药物的生物活性(Cancer Res，1993，53：1974-7)。

乌苯美司(Ubenimex，Bestatin，BEN)及其药学上可接受的衍生物或类似物包括AHPA-Val、Bestatin Hydrochloride等。乌苯美司是1976年由日本学者Umezawa等从橄榄网状链霉菌(Streptomyces olivoreticuli)的发酵液中分离得到的小分子二肽化合物，能竞争性抑制多种氨肽酶活性，通过促进机体的免疫功能和直接作用于肿瘤组织而发挥双重抗肿瘤作用。1987年，作为具有免疫调节功能的抗癌新药在日本上市。

乌苯美司化学名为：N-[(2S，3R)-4-苯基-3-氨基-2-羟基丁酰]-L-亮氨酸，分子式为C₁₆H₂₄N₂O₄，分子量为308.38，结构式为：

乌苯美司显示出多方面的免疫活性，不仅能够增强淋巴细胞的功能，而且能够激活单核巨噬细胞，使NK细胞的杀伤活力增强。分子机理研究表明其作用靶点是位于免疫细胞表面的亮氨酸氨肽酶(Leu-AP)及氨肽酶B(AP-B)，这两种酶可以催化底物氨基端的裂解，使抗原分子灭活。乌苯美司通过与酶活性中心的锌离子螯合，抑制了氨肽酶的活性。由于具有免疫增强功能，乌苯美司常用于肿瘤化疗、放疗及手术后的辅助治疗，可配合化疗、放疗及联合用于白血病、多发性骨髓瘤以及肺癌、乳腺癌等实体瘤的治疗。

乌苯美司还能通过直接作用于肿瘤组织而发挥抗肿瘤活性。氨肽酶N(CD13)在肿瘤新生血管内皮细胞高表达，通过降解细胞外基质、促进内皮细胞的侵袭及调节某些生长因子和细胞因子的活性，促进肿瘤血管的形成(Int J Cancer，1993，54：137-43)。某些肿瘤细胞如人纤维肉瘤HT-1080细胞氨肽酶N也呈现高表达，与肿瘤细胞的侵袭转移密切相关(Int J Cancer，1993，54：137-43)。乌苯美司能够抑制氨肽酶N的活性，从而有效的抑制肿瘤血管的形成及预防肿瘤细胞的转移。此外，乌苯美司还能够直接诱导肿瘤细胞的凋亡(Biomed Pharmacother.1996；50：283-9)，从而发挥抗肿瘤作用。

糖皮质激素，如地塞米松(Dexamethason，DEX)及其药学上可接受的衍生物或类似物，如醋酸地塞米松、地塞米松磷酸钠、地塞米松棕榈酸钠、氢化可的松、可的松、强的松、强的松龙、甲基强的松龙、去炎松、倍他米松等具有消炎、免疫抑制、抗毒素、抗休克等药理作用。至今，上市的地塞米松衍生物已达12种以上。地塞米松广泛应用于多种疾病的治疗，如自身免疫性疾病、过敏、炎症、哮喘及皮肤科、眼科疾病等。

地塞米松化学名为：9-氟-11，17，21-三羟基-16-甲基(11β，16α)-孕甾-1，4-二烯-3，20-二酮，分子式为C₂₂H₂₉FO₅，分子量为392.46，结构式如下图所示：

糖皮质激素的基本结构特征包括肾上腺皮质激素所具有的C3的羰基、Δ4和17β酮醇侧链以及糖皮质激素独有的17α-OH和11β-OH。目前糖皮质激素这个概念不仅包括具有上述特征和活性的内源性物质，还包括很多经过结构优化的具有类似结构和活性的人工合成药物，目前糖皮质激素类药物是临床应用较多的一类药物。分子药理学研究表明，地塞米松主要通过细胞内的糖皮质激素受体(Glucocorticoid Receptor，GR)发挥作用。激素与受体的结合导致分子伴侣(如hsp90)从GR解离，GR活化；活化的GR进入核内，通过与糖皮质激素应答元件或其他转录因子如NF-kB相互作用调节基因的转录。糖皮质激素-受体复合物位于炎症调节网络的顶端，能够抑制多条炎症通路。以前列腺素的合成为例，糖皮质激素通过诱导和激活Annexin I，诱导MKP-1以及抑制COX-2的转录，抑制前列腺素的合成，控制炎症反应。近来的研究表明糖皮质激素-受体复合物还能通过非转录途径快速的调节炎症反应(Nat Med，2002，8：473-9)。肿瘤与炎症关系密切，炎症的发生促进了肿瘤的发生发展。地塞米松通过多条通路控制炎症反应，抑制肿瘤的发展。

地塞米松还能够抑制肿瘤血管的生成，Yano A等运用前列腺癌进行的研究显示地塞米松能够抑制肿瘤血管(Clin Cancer Res，2006，12：3003-9)及淋巴管的生成(Clin Cancer Res，2006，12：6012-7)，Wilson C等的研究显示地塞米松能够增强多西紫杉醇抗肿瘤血管生成的活性(Br J Cancer，2008，99：2054-64)。

在肿瘤治疗方面，地塞米松可减轻癌症患者化疗时的某些副作用，减轻化疗后的恶心呕吐症状。地塞米松也常用于一些恶性血液病的治疗，有方案将地塞米松与沙利度胺(thalidomide)联合(thal/dex)用于新确诊的多发性骨髓瘤的治疗(M.D.Anderson Cancer Center)，也有方案将地塞米松与环磷酰胺、长春新碱和阿霉素联合(Hyper-CVAD)用于难治复发性急性淋巴细胞白血病的治疗(M.D.Anderson Cancer Center)。脑肿瘤治疗方面，地塞米松常用来抑制肿瘤相关的血管的通透性，以减轻水肿的发展。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有抗肿瘤作用的药物组合物及其应用，以克服现有技术存在的上述缺陷，以满足临床应用的需要。

本发明的抗肿瘤药物，含有A、B或C中的两种以上；

所述A包括双嘧达莫、双嘧达莫在药学上可接受的衍生物或双嘧达莫在药学上可接受的类似物，所述双嘧达莫在药学上可接受的衍生物包括单哌潘生丁(mopidamole)、BIBW22BS或RA25等或双嘧达莫药学上可接受的盐等；

所述B包括乌苯美司、乌苯美司在药学上可接受的衍生物或乌苯美司在药学上可接受的类似物或其药学上可接受的盐，所述乌苯美司在药学上可接受的衍生物包括AHPA-Val或Bestatin Hydrochloride等；

所述C包括地塞米松、地塞米松在药学上可接受的衍生物或地塞米松在药学上可接受的类似物，所述地塞米松在药学上可接受的衍生物或类似物如醋酸地塞米松、地塞米松磷酸钠、地塞米松棕榈酸钠、氢化可的松、可的松、强的松、强的松龙、甲基强的松龙、去炎松或倍他米松等糖皮质激素。

优选的，本发明的抗肿瘤药物，含有A和B，重量比为：A∶B＝0.001～200∶1；

特别优选的为：A∶B＝0.025～22.5∶1；

优选的，本发明的抗肿瘤药物，含有B和C，重量比为：B∶C＝0.001～3000∶1；

特别优选的为：B∶C＝0.5～450∶1；

优选的，本发明的抗肿瘤药物组合物，含有A和C，优选的重量比为：A∶C＝1∶0.00001～100；

特别优选的为：A∶C＝1∶0.0005～0.05；

进一步优选的，本发明的抗肿瘤药物，含有A、B和C，重量比为：A∶B∶C＝1∶0.00001～32000∶0.00001～1600；

特别优选的为：A∶B∶C＝1∶0.001～1000∶0.0001～10；

最优选的重量比为：A∶B∶C＝50～150∶20∶1；

最优选的重量比为：A∶B∶C＝100∶10～40∶1；

最优选的重量比为：A∶B∶C＝200∶40∶1～3；

最优选的重量比为：A∶B∶C＝100～400∶20～80∶1～3；

本发明的抗肿瘤药物的制备方法，为常规的物理混合的方法，将所述的A、B或C中的两种以上混合即可。本发明采用克隆形成法检测药物的体外细胞毒性，使用小鼠肿瘤模型和人体癌瘤裸鼠移植模型，观察药物的体内实验疗效。同时使用细胞学和分子生物学方法，研究有效药物的作用机制，用病理组织学方法研究其毒性作用特点。动物试验证明，本发明的抗肿瘤药物，在动物体内具有显著的抗肿瘤活性，三者显示出协同增效作用，且系统毒性低，可望成为一种具有抗肿瘤活性的新药物。

所述的肿瘤，包括但不限于肝癌、鳞癌或肺癌等。

本发明的具有抗肿瘤作用的药物组合物，可以组合物的形式，通过口服施加于需要治疗的患者，剂量一般为100～500mg/人/天，具体可根据患者的年龄、体重、病情等，由医师决定。

所述组合物，包括治疗有效量的所述的抗肿瘤药物和医学上可接受的载体；

优选的，所述组合物中，所述抗肿瘤药物的重量含量为0.5～99.9％；

所述医学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，如稀释剂、赋形剂如水等，填充剂，如淀粉、蔗糖等，粘合剂，如纤维素衍生物明胶、聚乙烯吡咯烷酮等，润滑剂，如滑石粉等。

本发明所述的组合物，可以采用药学领域常规的方法进行制备；

本发明的优点与积极效果在于：本发明涉及的抗肿瘤药物新组合主要通过作用于肿瘤微环境达到有效治疗肿瘤的目的。调节肿瘤微环境药物的特点是作用于多靶点、多通路；由细胞毒类药物引起的毒副作用可望减轻。

附图说明

图1双嘧达莫、乌苯美司及地塞米松合用对小鼠肝癌H₂₂的肿瘤生长抑制作用。

图2双嘧达莫、乌苯美司与地塞米松合用对裸鼠移植人肝癌BEL-7402的肿瘤生长抑制作用。

图3双嘧达莫、乌苯美司与地塞米松合用对裸鼠移植人鳞癌A431的肿瘤生长抑制作用。

图4双嘧达莫、乌苯美司与地塞米松合用对裸鼠移植人肺癌PG的肿瘤生长抑制作用。

图5双嘧达莫、乌苯美司与地塞米松合用对荷肝癌H₂₂小鼠骨髓的影响(骨髓的病理组织检查)。

具体实施方式

以下所列实施例仅为帮助本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1

配方：双嘧达莫分别为1mg、5mg、50mg、100mg、200mg、400mg、800mg或1600mg，乌苯美司分别为1mg、10mg、50mg、100mg、200mg、400mg、800mg、1600mg或3200mg，将双嘧达莫和乌苯美司搅拌混合，即可。

实施例2

配方：双嘧达莫分别为1mg、5mg、50mg、100mg、200mg、400mg、800mg或1600mg，地塞米松分别为0.1mg、1mg、10mg、20mg、40mg、80mg或160mg。将双嘧达莫和地塞米松搅拌混合，即可。

实施例3

配方：乌苯美司分别为1mg、10mg、50mg、100mg、200mg、400mg、800mg、1600mg或3200mg，地塞米松分别为0.1mg、1mg、10mg、20mg、40mg、80mg或160mg。将乌苯美司和地塞米松搅拌混合，即可。

实施例4

配方：双嘧达莫分别为1mg、5mg、50mg、100mg、200mg、400mg、800mg或1600mg，乌苯美司分别为1mg、10mg、50mg、100mg、200mg、400mg、800mg、1600mg或3200mg，地塞米松分别为0.1mg、1mg、10mg、20mg、40mg、80mg或160mg，将三种药物搅拌混合，即可。

实施例5：药物的体外细胞毒性实验：

1.材料与方法：

1.1药品与试剂：双嘧达莫：标准品，购自中国药品生物制品检定所；乌苯美司：原料药，浙江普洛康裕制药有限公司；地塞米松：标准品，购自中国药品生物制品检定所；

1.2实验细胞：肝癌BEL-7402细胞，购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心

1.3受试药物：实施例1～4的药物

1.4实验方法：采用克隆形成法检测。取对数生长期的BEL-7402细胞，按每孔50个细胞/0.2ml加入96孔板，培养24h。加入不同浓度待测样品，每个浓度设三个平行孔，每孔50ul，无药对照孔加50μl无血清1640，继续培养7-10天，镜下记数细胞集落，以大于等于30个细胞计为一个克隆，数出每孔克隆数，计算克隆形成百分率及IC₅₀

2.结果：

体外实验结果表明：单独使用BEN及DEX对细胞克隆形成的IC₅₀均大于100μM，未显示细胞毒作用。单独使用DPM的IC₅₀为13.34μM，有一定的细胞毒作用。实施例4的药物对肿瘤细胞有一定的抑制作用。检测结果见表1。

表1药物的体外细胞毒性实验

实施例6：药物的体内抗肿瘤活性研究-对小鼠肿瘤生长的抑制作用

1材料与方法：

1.1药品与试剂：双嘧达莫：标准品，购自中国药品生物制品检定所；乌苯美司：原料药，浙江普洛康裕制药有限公司；地塞米松：标准品，购自中国药品生物制品检定所；双嘧达莫片：山西亚宝药业集团股份有限公司生产；醋酸地塞米松片：天津力生制药股份有限公司生产；乌苯美司(百士欣)胶囊：浙江普洛康裕制药有限公司生产；小鼠肝癌H₂₂细胞以腹水形式在昆明小鼠体内传代。

1.2动物：昆明小鼠(清洁II级)为雌性，6～8周龄，体重18～22g，由军事医学科学院实验动物中心提供，许可证编号SCXK(军)2007-004。

1.3实验方法：

1.3.1根据剂量初筛结果，设计动物实验治疗的给药方式和剂量。取体重为18-22g的昆明种小鼠，随机分组，每组10只。取小鼠肝癌H₂₂腹水，以生理盐水稀释成细胞数为7.5×10⁶个/ml的悬液，0.2ml/只，接种于小鼠腋窝皮下。接种肿瘤后第3天开始治疗，每天灌胃给药共10次，给药方案以“qd×10”表示。对照组给予生理盐水，其余各组分别给予相应实施例中的药物。短期观察的实验于第14天处死小鼠称体重，分离肿瘤称瘤重，计算抑制率。

1.3.2长期观察的实验期间，每周测量2次肿瘤的长径a和短径b，并记录动物体重。以公式V＝ab²/2计算瘤体积，绘制肿瘤生长曲线，计算抑瘤率，采用Student’s t检验比较组间差异。观察动物死亡情况，绘制动物生存曲线，并以Kaplan-Meier法求出中位生存时间。

2.结果：

结果见表2～10和图1。

2.1不同剂量的双嘧达莫与乌苯美司合用用于治疗小鼠肝癌H₂₂，实验结果表明：二者合用对小鼠肝癌H₂₂肿瘤生长有中度抑瘤作用。结果见表2。

表2不同剂量的双嘧达莫与乌苯美司对小鼠肝癌H₂₂肿瘤生长抑制作用

注：与对照组比较*P＜0.01；与相应的DPM比较△P＜0.05，△△P＜0.01；与BEN比较▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

2.2不同剂量的乌苯美司与地塞米松合用用于治疗小鼠肝癌H₂₂，实验结果表明：二者合用对小鼠肝癌H₂₂肿瘤生长有较好抑瘤作用。结果见表3。

表3不同剂量的乌苯美司和地塞米松对小鼠肝癌H₂₂肿瘤生长抑制作用

注：与对照组比较*P＜0.01；与相应的BEN比较△P＜0.01；与DEX比较▲P＜0.01。

2.3不同剂量的双嘧达莫与地塞米松合用用于治疗小鼠肝癌H₂₂，实验结果表明：二者合用对小鼠肝癌H₂₂肿瘤生长有较好抑瘤作用。结果见表4。

表4双嘧达莫与不同剂量的地塞米松合用对小鼠肝癌H₂₂肿瘤生长抑制作用

注：与对照组比较*P＜0.01；与相应的DEX比较△P＜0.01；与DPM比较▲P＜0.01。

2.4双嘧达莫、乌苯美司与地塞米松合用用于治疗小鼠肝癌H₂₂，实验结果表明：三者合用对小鼠肝癌H₂₂肿瘤生长有显著抑瘤作用。结果见表5。

表5双嘧达莫、乌苯美司与地塞米松合用对小鼠肝癌H₂₂的肿瘤生长抑制作用

与对照组比较*P＜0.01

2.5不同剂量的双嘧达莫与乌苯美司和地塞米松合用用于治疗小鼠肝癌H₂₂，实验结果表明：三者合用对小鼠肝癌H₂₂肿瘤生长有显著抑瘤作用，此作用比不同剂量的双嘧达莫以及乌苯美司和地塞米松合用都强。结果见表6。

表6不同剂量的双嘧达莫与乌苯美司和地塞米松合用对小鼠肝癌H₂₂的生长抑制作用

与对照组比较*P＜0.01；与相对应的DPM比较△P＜0.01；与BEN+DEX比较▲P＜0.01。

2.6不同剂量的乌苯美司与双嘧达莫和地塞米松合用用于治疗小鼠肝癌H₂₂，实验结果表明：三者合用对小鼠肝癌H₂₂肿瘤生长有显著抑瘤作用，此作用比不同剂量的乌苯美司以及双嘧达莫和地塞米松合用都强。结果见表7。

表7不同剂量的乌苯美司与双嘧达莫和地塞米松合用对小鼠肝癌H₂₂的生长抑制作用

与对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与相对应的BEN比较△P＜0.01；与DPM+DEX比较▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

2.7不同剂量的地塞米松与双嘧达莫和乌苯美司合用用于治疗小鼠肝癌H₂₂，实验结果表明：三者合用对小鼠肝癌H₂₂肿瘤生长有显著抑瘤作用，此作用比不同剂量的地塞米松以及双嘧达莫和乌苯美司合用都强。结果见表8。

表8不同剂量的地塞米松与双嘧达莫和乌苯美司合用对小鼠肝癌H₂₂的生长抑制作用

与对照组比较*P＜0.01；与相对应的DEX比较△P＜0.01；与DPM+BEN比较▲P＜0.01。

2.8长期观察双嘧达莫、乌苯美司及地塞米松合用对小鼠肝癌H₂₂的生长抑制作用，实验结果表明：三者合用对小鼠肝癌H₂₂有非常显著的抑瘤作用，且呈明显的量效关系，此作用比单药DPM、BEN、DEX以及二种药DPM+BEN、DPM+DEX、BEN+DEX都强；体内实验结果表明：三者合用可明显延长荷肝癌H₂₂的小鼠平均生存时间，此作用比单药DPM、BEN、DEX以及二种药DPM+BEN、DPM+DEX、BEN+DEX都强。结果见表9、表10，图1。

表9双嘧达莫、乌苯美司及地塞米松合用对小鼠肝癌H₂₂的生长抑制作用(13d)

接种3d给药，每天一次，共10次。观察肿瘤生长情况以及动物生存时间。

与对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与相对应的DPM比较△P＜0.01；与相对应的BEN比较▲P＜0.05；与相对应的DEX比较☆P＜0.01；与相对应的DPM+DEX比较★P＜0.05；与相对应的DPM+BEN比较◇P＜0.05，◇◇P＜0.01；与相对应的BEN+DEX比较◆P＜0.01；与DPM200+BEN40+DEX 1比较□P＜0.01。

图1为双嘧达莫、乌苯美司及地塞米松合用对小鼠肝癌H₂₂的肿瘤生长抑制作用。

表10双嘧达莫、乌苯美司及地塞米松合用对荷肝癌H₂₂的小鼠平均生存时间的影响

与对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与相对应的DPM比较△P＜0.01；与相对应的BEN比较▲P＜0.01；与相对应的DEX比较☆P＜0.05，☆☆P＜0.01；与相对应的DPM+DEX比较★P＜0.01；与相对应的DPM+BEN比较◇P＜0.01；与相对应的DEX+BEN比较◆P＜0.01。

实施例7：药物的体内抗肿瘤活性研究-对裸鼠移植的人肿瘤的生长抑制作用

1材料与方法

1.1药品与试剂：双嘧达莫：标准品，购自中国药品生物制品检定所；乌苯美司：原料药，浙江普洛康裕制药有限公司；地塞米松：标准品，购自中国药品生物制品检定所；双嘧达莫片：山西亚宝药业集团股份有限公司生产；醋酸地塞米松片：天津力生制药股份有限公司生产；乌苯美司(百士欣)胶囊：浙江普洛康裕制药有限公司生产；人肝癌BEL-7402，人鳞癌A431，人肺癌PG细胞，常规体外细胞培养。

1.2动物：NIH nu/nu裸小鼠为雌性，6～8周龄，体重18～22g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证编号SCXK(京)2006-0009。

1.3实验方法：取体外培养的人肿瘤细胞，接种于NIH nu/nu裸小鼠一侧腋窝皮下，传2-3代后，取腋下传代肿瘤，切成1.5mm³左右的小块，接种于裸小鼠一侧腋窝皮下，待肿瘤生长至100～300mm³后根据肿瘤大小随机分组，并开始口服灌胃给药，每天一次共10次。对照组给予生理盐水，其余各组分别给予相应实施例中的药物。

1.3.1短期观察的实验于第17天处死裸鼠称体重，分离肿瘤称瘤重，计算抑制率。

1.3.2长期观察的实验期间，每周测量2次肿瘤的长径a和短径b，并记录动物体重。以公式V＝ab²/2计算瘤体积，绘制肿瘤生长曲线，计算抑瘤率。

2.结果：结果见表11～14。图2～4。

2.1短期观察：双嘧达莫、乌苯美司与地塞米松合用用于治疗裸鼠移植的人肝癌BEL-7402，实验结果表明：三者合用对裸鼠移植的人肝癌BEL-7402肿瘤生长有显著抑瘤作用，且呈明显的量效关系。结果见表11。

表11双嘧达莫、乌苯美司与地塞米松合用对裸鼠移植的人肝癌BEL-7402的生长抑制作用

接种7d给药，每天一次，共10次，17天处死。与对照组比较*P＜0.01。

2.2长期观察：双嘧达莫、乌苯美司与地塞米松合用用于治疗裸鼠移植的人肝癌BEL-7402，实验结果表明：三者合用对裸鼠移植的人肝癌BEL-7402肿瘤生长有非常显著抑制作用，且呈明显的量效关系。作用持久，对实验动物体重无影响。结果见表12，图2。

表12双嘧达莫、乌苯美司与地塞米松合用对裸鼠移植人肝癌BEL-7402的生长抑制作用(17d)

接种7d给药，每天一次，共10次，观察60天处死。N＝6，60天时各组动物未有死亡。与对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与DPM200+BEN40+DEX1比较◇P＜0.05，◇◇P＜0.01；与DPM300+BEN60+DEX1.5比较◆P＜0.05。

图2为双嘧达莫、乌苯美司与地塞米松合用对裸鼠移植人肝癌BEL-7402的肿瘤生长抑制作用。

2.3长期观察：双嘧达莫、乌苯美司与地塞米松合用用于治疗裸鼠移植的人鳞癌A431，实验结果表明：三者合用对裸鼠移植的人鳞癌A431肿瘤生长有非常显著抑制作用，且呈明显的量效关系，其效果与吉非替尼(Gefitinib，Iressa)相当。作用持久，对实验动物体重无影响。结果见表13，图3。

表13双嘧达莫、乌苯美司与地塞米松合用对裸鼠移植人鳞癌A431的生长抑制作用(17d)

接种7d给药，每天给药一次，共10次。观察至35天。N＝6，60天时各组动物未有死亡。与对照组比较*P＜0.05

图3双嘧达莫、乌苯美司与地塞米松合用对裸鼠移植入鳞癌A431的肿瘤生长抑制作用。

2.4长期观察：双嘧达莫、乌苯美司与地塞米松合用用于治疗裸鼠移植的人肺癌PG，实验结果表明：三者合用对裸鼠移植的人肺癌PG肿瘤生长有非常显著抑制作用，且呈明显的量效关系，其效果优于吉西他滨。结果见表14，图4。

表14双嘧达莫、乌苯美司与地塞米松合用对裸鼠移植人肺癌PG的肿瘤生长抑制作用(17d)

接种7d给药，每天给药一次，共10次，吉西他滨分别于第7，10，13天给药共3次。观察至35天。N＝6，60天时各组动物未有死亡。与对照组比较*P＜0.05，与吉西他滨比较◇P＜0.05

实施例8病理组织检查

使用对小鼠肝癌H₂₂肿瘤生长有显著抑制作用的双嘧达莫、乌苯美司与地塞米松合用剂量(抑瘤率85.5％)，取主要脏器进行病理组织检查，并对小鼠骨髓有核细胞进行计数。结果表明，心肝肺肾等主要脏器未见明显的病理学改变，骨髓有核细胞相对于未接种肿瘤的正常小鼠数量相当，无显著差异。由此可见：双嘧达莫、乌苯美司与地塞米松合用未导致出现细胞毒类药物的毒性变化，结果见表15，图5。

表15双嘧达莫、乌苯美司与地塞米松合用对荷肝癌H₂₂小鼠骨髓的有核细胞的影响(病理组织检查，每个视野平均细胞数)

图5双嘧达莫、乌苯美司与地塞米松合用对荷肝癌H₂₂小鼠骨髓的影响(骨髓的病理组织检查)，其中，图5A为正常小鼠组，图5B为肝癌H₂₂对照组，图5C为DPM+BEN+DEX组。

实施例9本发明的抗肿瘤作用的机制研究

Western blot检测肿瘤组织蛋白的表达变化

1.蛋白样品的制备

取小鼠肝癌H₂₂新鲜瘤组织，对照组以及双嘧达莫、乌苯美司与地塞米松合用组各5份，生理盐水洗去血迹，-70℃冻存。提取蛋白时，取瘤组织按1∶9加入裂解液(50mMTris·Cl(pH 8.0)，150mM NaCl，0.1％SDS，1％NP-40，0.5％去氧胆酸钠，100μg/mlPMSF，1μg/ml Aprotinin，0.02％叠氮钠)，低温匀浆，4℃裂解1h后，10000rpm 4℃离心15min，收集上清液，用BCA试剂盒定量，与适量5×上样缓冲液混合，沸水浴5min变性蛋白，-70℃存放。

2.Western检测肿瘤组织蛋白的表达变化

配制10％的分离胶和5％的浓缩胶，灌制胶板。将给药组和对照组各5只的蛋白等量混合，以50μg的总蛋白量上样，进行SDS-PAGE电泳分析。电泳完后进行转膜，一抗孵育2h，碱性磷酸酶标记的二抗孵育1h，NBT/BCIP显色。

结果显示FLK1和NOS3的表达下降，其他检测的蛋白：EGF，VEGF，TGF，Bcl-2，k-Ras，P27，P21，NF-kB变化不明显。FLK1与血管生成密切相关，NOS3与炎症有密切的关系，说明双嘧达莫、乌苯美司与地塞米松这一药物组合物可能影响了肿瘤的血管生成且与炎症反应相关。

实施例10：双嘧达莫、乌苯美司与地塞米松组成的抗肿瘤新组合物的小鼠急性毒性试验

1材料与方法

1.1药品与试剂：双嘧达莫：标准品，购自中国药品生物制品检定所；乌苯美司：原料药，浙江普洛康裕制药有限公司；地塞米松：标准品，购自中国药品生物制品检定所

1.2动物：雌雄各半，6～8周龄，体重18～22g，由军事医学科学院实验动物中心提供，许可证编号SCXK(军)2007-004。给药前驯养观察2天，观察动物的一般状态，行为活动，毛色。测定体重等检查均未见明显异常。

1.3实验方法：昆明种小鼠60只，分3个剂量组，每组20只，雌雄各半。各组差比为0.8，一次口服给药，给药剂量2.0g/kg，1.6g/kg，1.28g/kg，灌胃给药后观察14天并记录毒性反应包括一般指标、死亡情况、体重变化，测定小鼠的毒性反应、死亡情况及计算半数致死量等，实验结束时进行病理学检查。

2.结果：小鼠未出的中毒表现，一般指标均正常，未出现死亡、体重减轻及其他症状。给药后第14天处死前体重增长至28～38克左右，外观健康。实验结束时进行病理学检查，动物的肝、肾、肺等主要脏器未见有明显病理变化。结果表明，抗肿瘤新组合物毒性很低，尤其是口服给药毒性小，雌雄动物不存在显著差异。小鼠口服的LD50(半数致死量)为大于2g/kg。通过急毒性试验，证明在很高的剂量下(小鼠2.0g/kg)，口服给药未见动物死亡，动物也未见消瘦或其他症状，动物各项指示均未见异常，可见其口服给药是安全的。

Claims

1.具有抗肿瘤作用的药物组合物，其特征在于，含有A、B和C，所述A包括双嘧达莫、双嘧达莫在药学上可接受的衍生物或其药学上可接受的盐；

所述B包括乌苯美司、乌苯美司在药学上可接受的衍生物或其药学上可接受的盐；

所述C包括地塞米松、地塞米松在药学上可接受的衍生物。

2.根据权利要求1所述的具有抗肿瘤作用的药物组合物，其特征在于，所述双嘧达莫在药学上可接受的衍生物包括单哌潘生丁(mopidamole)、BIBW22BS或RA25。

3.根据权利要求1所述的具有抗肿瘤作用的药物组合物，其特征在于，所述乌苯美司在药学上可接受的衍生物包括AHPA-Val或Bestatin Hydrochloride。

4.根据权利要求1所述的具有抗肿瘤作用的药物组合物，其特征在于，所述地塞米松在药学上可接受的衍生物为醋酸地塞米松、地塞米松磷酸钠、地塞米松棕榈酸钠、氢化可的松、可的松、强的松、强的松龙、甲基强的松龙、去炎松、倍他米松。

5.根据权利要求1所述的具有抗肿瘤作用的药物组合物，其特征在于，重量比为：A∶B∶C＝1∶0.00001～32000∶0.00001～1600。

6.根据权利要求1所述的具有抗肿瘤作用的药物组合物，其特征在于，重量比为：A∶B∶C＝1∶0.001～1000∶0.0001～10。

7.根据权利要求1所述的具有抗肿瘤作用的药物组合物，其特征在于，重量比为：A∶B∶C＝50～150∶20∶1；

8.根据权利要求1所述的具有抗肿瘤作用的药物组合物，其特征在于，重量比为：A∶B∶C＝100∶10～40∶1。

9.根据权利要求1所述的具有抗肿瘤作用的药物组合物，其特征在于，重量比为：A∶B∶C＝200∶40∶1～3。

10.根据权利要求1所述的具有抗肿瘤作用的药物组合物，其特征在于，重量比为：A∶B∶C＝100～400∶20～80∶1～3。

11.根据权利要求1～10任一项所述的具有抗肿瘤作用的药物组合物在制备治疗抗肿瘤药物中的应用。

12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤为肝癌、鳞癌或肺癌。