CN106661029B - 作为PI3δ和γ蛋白激酶的选择性双重抑制剂的取代色烯衍生物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及选择性双重delta(δ)和gamma(γ)PI3K蛋白质激酶调节剂(S)‑N‑(5‑(4‑氨基‑1‑(1‑(5‑氟‑3‑(3‑氟苯基)‑4‑氧代‑4H‑色烯‑2‑基)乙基)‑1H‑吡唑并[3，4‑d]嘧啶‑3‑基)‑2‑甲氧基苯基)甲基磺酰胺，其制备方法，包含其的药物组合物以及使用其治疗、预防和/或改善PI3K激酶介导的疾病或病症的方法。

Description

作为PI3δ和γ蛋白激酶的选择性双重抑制剂的取代色烯衍 生物

本专利申请要求于2014年6月27日提交的印度专利申请号3144/CH E/2014的利益，所述印度专利申请以引用的方式在此全文并入。

技术领域

本发明提供了双重delta(δ)和gamma(γ)PI3K蛋白质激酶调节剂，其制备方法，包含其的药物组合物以及使用其治疗、预防和/或改善PI3K激酶介导的疾病或病症的方法。

背景技术

磷酸肌醇-3激酶(PI3K)属于一类细胞内脂质激酶，其使磷酸肌醇脂质(PI)的肌醇环的3-位羟基磷酸化，生成脂质第二信使。虽然PI3K的α和β同种型在其分布中是遍在的，但PI3K的δ和γ形式的表达局限于循环造血细胞和内皮细胞。与PI3Kα或PI3Kβ不同，缺乏PI3Kδ或PI3Kγ的表达的小鼠未显示任何不利表型，指示靶向这些特异性同种型将不导致明显毒性。

近来，PI3K途径的靶向抑制剂已提出作为免疫调节剂。这个兴趣起源于下述事实：PI3K途径在免疫细胞信号传导中发挥多重功能，主要是通过磷脂酰肌醇(3，4，5)-三磷酸盐(PIP3)的生成，所述PIP3是膜结合的第二信使。PIP3将蛋白质召募至脂质双层的细胞质侧，包括蛋白质激酶和GTP酶，起始在免疫细胞粘附、迁移和细胞间通信的调节中重要的下游信号传导级联的复杂网络。

四种I类PI3K同种型在其组织分布中显著不同。PI3Kα和PI3Kβ是遍在的且在受体酪氨酸激酶(RTK)的下游活化，而PI3Kδ和PI3Kγ主要限制于造血细胞和内皮细胞，并且分别在RTK和G蛋白偶联受体(GPCR)的下游活化。小鼠遗传研究已揭示PI3Kα和PI3Kβ是正常发育必需的，而PI3Kδ和/或PI3Kγ的丧失获得具有选择性免疫缺陷(deficit)的活后代。

PI3Kδ和PI3Kγ的表达模式和功能已生成了开发PI3Kδ/γ抑制剂作为用于治疗许多疾病的活性剂的很大兴趣，所述许多疾病包括例如类风湿性关节炎、过敏、哮喘、慢性阻塞性肺病和多发性硬化(Hirsch等人，Pharmacol.Ther.，118，192-205，2008；Marone等人，Biochim.Biophys.Acta.，1784，159-185，2008；Rommel等人，Nat.Rev.Immunol.，7，191-201，2007；Ruckle等人，Nat.Rev.Drug Discov.，5，903-918，2006)。使用药理学和遗传方法两者的研究已显示这两种同种型通常证实与彼此的协同相互作用(Konrad等人，J.Biol.Chem.，283，33296-33303，2008；Laffargue等人，Immunity，16，441-451，2002)。在肥大细胞中，例如，PI3Kδ是响应Fc受体的IgE交联的脱颗粒必需的(Ali等人，J.Immunol.，180，2538-2544，2008)，而PI3Kγ在放大应答中起重要作用(Laffargue等人，Immunity，16，441-451，2002)。类似效应已在其他细胞功能中看到，包括淋巴细胞归巢和嗜中性粒细胞呼吸爆发，其中PI3Kγ起关键作用，并且PI3Kδ放大每个过程。PI3Kδ和PI3Kγ的非冗余但相关作用已使得难以确定两种同种型中的哪种(单独或组合)在特定炎症病症中最佳靶向。

使用缺乏PI3Kδ和/或PI3Kγ或表达PI3Kδ和PI3Kγ的激酶死亡变体的小鼠的研究在理解其作用中是有价值的工具。例如，PI3Kδ敲除小鼠证实减少的嗜中性粒细胞趋化性，减少的抗体生产(T细胞依赖性和不依赖性两者)(Jou等人，Mol.Cell.Biol.，22，8580-8591，2002)，以及更低数目的成熟B细胞(Clayton等人，J.Exp.Med.，196，753-763，2002；Jou等人，Mol.Cell.Biol.，22，8580-8591，2002)，以及其响应抗IgM的增殖中的减少(Jou等人，Mol.Cell.Biol.，22，8580-8591，2002)。这种表型在PI3Kδ激酶死亡变体中复制，并且使用PI3Kδ选择性抑制剂连同肥大细胞的数目和增殖减少，以及减弱的变应性应答。PI3Kγ敲除含有更高数目但更少应答性的嗜中性粒细胞，更低数目和更少应答性的巨噬细胞，以及展示减少的肥大细胞脱颗粒的树突状细胞(Laffargue等人，Immunity，16，441-451，2002)，CD4+与CD8+T细胞的更高比率，增加的胸腺细胞凋亡，CXCR3对活化T细胞的减少诱导和减少的心脏收缩性。对心脏组织的这种后面一种作用是关于患者用PI3Kγ抑制剂的长期给药的关注。然而，当PI3Kγ激酶死亡变体(其更佳地模拟激酶的抑制而不是蛋白质的丧失)显示相似的免疫细胞表型，但重要的是没有心脏缺陷时，这种关注在很大程度上减轻。心脏效应随后显示是由于支架效应而不是PI3Kγ的催化活性(Olusegon等人，Chemistry&Biology，1，123-134，2010，包括其中引用的参考文献)。双重PI3Kδ/PI3Kγ敲除是可行的，但显示出在T细胞发育和胸腺细胞存活中的严重缺陷。PI3Kγ敲除/PI3Kδ激酶死亡组合产生相似表型，提示至少在免疫系统内，PI3Kδ的作用可能仅是催化作用。使用敲除和激酶死亡小鼠的研究的解释可能是挑战性的，因为这些模型仅提供了免疫系统的稳态图像，缺乏瞬时和剂量控制，并且不允许完全理解动态免疫应答如何反应以逆转抑制。具有不同概况(PI3Kδ、PI3Kγ和PI3Kδ/γ)的选择性抑制剂是白细胞信号传导的研究必要的，以便评价每种PI3K对免疫细胞活化的相对贡献(Olusegon等人，同上，包括其中引用的参考文献)。

δ/γ的双重抑制强烈牵涉作为气道的变应性和非变应性炎症及其他自身免疫疾病中的干预策略。关于哮喘和慢性阻塞性肺疾病(COPD)潜在的各种细胞过程中的PI3Kδ和PI3Kγ牵涉的科学证据起源于抑制剂研究和基因靶向方法(William等人Chemistry&Biology，17，123-134，2010和Thompson等人Chemistry＆Biology，17：101-102，2010)。另外，在几个COPD患者中对常规疗法例如皮质类固醇的抗性已归于PI3K δ/γ途径的上调。PI3Kδ/γ信号传导的破坏因此提供了旨在抵抗免疫-炎症应答的新型策略。由于通过PI3Kδ和PI3Kγ在介导炎症细胞功能性(例如白细胞迁移和活化、以及肥大细胞脱颗粒)中发挥的关键作用，阻断这些同种型同样还可以是用于治疗类风湿性关节炎的有效策略。考虑到这些同种型在免疫监督中确定的关键性，特异性靶向PI3Kδ和PI3Kγ同种型的抑制剂将预期减弱在气道炎症和类风湿性关节炎中遇到的免疫应答的进展(William等人Chemistry&Biology，17，123-134，2010和Thompson等人Chemistry&Biology，17：101-102，2010)。

关于PI3K和相关蛋白质激酶途径的综述和研究已由Liu等人，Nature ReviewsDrug Discovery，8，627-644，2009)；Nathan等人，Mol Cancer Ther.，8(1)，2009；Marone等人，Biochimica et Biophysica Acta，1784，159-185，2008和2009年8月公开的Markman等人，Annals of Oncology Advance Access给出。类似地，关于PI3Kδ和PI3Kγ的作用的综述和研究已由William等人，Chemistry&Biology，17，123-134，2010和Timothy等人J.Med.Chem.，55(20)，8559-8581，2012给出。所有这些文献公开内容以引用的方式在此全文并入。

化合物例如IPI-145和CAL130已作为Pi3K δ/γ的双重抑制剂报道(分别为WO2012/008302&WO2012/121953)。IPI-145处于关于癌症、哮喘和类风湿性关节炎的临床研究下。IPI-45据报道具有75mg BID的最大耐受剂量(MTD)(55thAnnual Meeting.NewOrleans-LA，Dec 7-10，2013)。不存在CAL-130就临床目的研究的报道。

仍存在关于用于治疗与δ/γPI3K激酶介导事件相关的疾病和病症的双重δ/γPI3K调节剂的未满足的需要。

本文进一步参考国际公开号WO 11/055215和WO 12/151525以及美国公开号2011/0118257和2012/0289496，所述公开号各自以引用的方式全文并入本文。

发明内容

本发明涉及PI3K delta(δ)和gamma(γ)蛋白质激酶的选择性双重抑制剂。这些化合物适用于用于治疗PI3K相关疾病、病症或状况，例如增殖性疾病例如癌症的药物组合物中。PI3Kδ和PI3Kγ蛋白质激酶两者的抑制均可在某些疾病和病症的治疗中提供有益效应。

本发明的选择性双重抑制剂包括N-(5-(4-氨基-1-(1-(5-氟-3-(3-氟苯基)-4-氧代-4H-色烯-2-基)乙基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基)-2-甲氧基苯基)甲基磺酰胺、其药学可接受的盐及其药物前体。例如，选择性双重抑制剂可选自下述化合物、其药学可接受的盐及其药物前体：

(RS)-N-(5-(4-氨基-1-(1-(5-氟-3-(3-氟苯基)-4-氧代-4H-色烯-2-基)乙基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基)-2-甲氧基苯基)甲基磺酰胺(化合物A)；和

(S)-N-(5-(4-氨基-1-(1-(5-氟-3-(3-氟苯基)-4-氧代-4H-色烯-2-基)乙基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基)-2-甲氧基苯基)甲基磺酰胺(化合物A1)。

在一个实施例中，化合物(S)-N-(5-(4-氨基-1-(1-(5-氟-3-(3-氟苯基)-4-氧代-4H-色烯-2-基)乙基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基)-2-甲氧基苯基)甲基磺酰胺或其药学可接受的盐基本上不含(例如含有按重量计小于约10％，例如小于约5％、小于约2.5％、小于约1％、小于约0.1％)或不含(R)-N-(5-(4-氨基-1-(1-(5-氟-3-(3-氟苯基)-4-氧代-4H-色烯-2-基)乙基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基)-2-甲氧基苯基)甲基磺酰胺及其药学可接受的盐。

在另一个实施例中，化合物(S)-N-(5-(4-氨基-1-(1-(5-氟-3-(3-氟苯基)-4-氧代-4H-色烯-2-基)乙基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基)-2-甲氧基苯基)甲基磺酰胺或其药学可接受的盐具有大于约90％，例如大于约91％、大于约92％、大于约93％、大于约94％、大于约95％、大于约96％、大于约97％、大于约98％、大于约99％、大于约99.5％、大于约99.9％、或大于约99.99％的对映体过量。

在一个优选实施例中，本发明涉及化合物(S)-N-(5-(4-氨基-1-(1-(5-氟-3-(3-氟苯基)-4-氧代-4H-色烯-2-基)乙基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基)-2-甲氧基苯基)甲基磺酰胺(化合物A1)。

在另一个实施例中，本发明涉及化合物(S)-N-(5-(4-氨基-1-(1-(5-氟-3-(3-氟苯基)-4-氧代-4H-色烯-2-基)乙基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基)-2-甲氧基苯基)甲基磺酰胺或其药学可接受的盐。

本发明的另一个实施例是(R)-N-(5-(4-氨基-1-(1-(5-氟-3-(3-氟苯基)-4-氧代-4H-色烯-2-基)乙基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基)-2-甲氧基苯基)甲基磺酰胺(化合物A2)、其药学可接受的盐或其药物前体。化合物A2是PI3K delta(δ)蛋白质激酶的抑制剂。这些化合物适用于用于治疗PI3K相关疾病、病症或状况，例如增殖性疾病例如癌症的药物组合物中。

N-(5-(4-氨基-1-(1-(5-氟-3-(3-氟苯基)-4-氧代-4H-色烯-2-基)乙基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基)-2-甲氧基苯基)甲基磺酰胺、化合物A1和化合物A2的化学结构显示于下文。

本发明还提供了包含本发明的一种或多种化合物(例如化合物A1)连同药学可接受的载体的药物组合物。药物组合物还可包含另外的活性剂(例如抗癌剂和下文讨论的活性剂)中的一种或多种。在一个实施例中，药物组合物包括治疗有效量的本发明的一种或多种化合物。

本发明的另一个方面涉及用于制备N-(5-(4-氨基-1-(1-(5-氟-3-(3-氟苯基)-4-氧代-4H-色烯-2-基)乙基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基)-2-甲氧基苯基)甲基磺酰胺的方法：

该方法包括下述步骤：

(a)使5-溴-2-甲氧基苯胺

与甲磺酰氯反应，以获得N-(5-溴-2-甲氧基苯基)甲基磺酰胺(中间产物1)：

(b)例如在乙酸钾的存在下，使中间产物1与双(戊酰)二硼反应，以获得N-(2-甲氧基-5-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂硼烷-2-基)苯基)甲基磺酰胺(中间产物2)：

(c)在碱(例如碳酸钠)的存在下使2-(1-(4-氨基-3-碘代-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)乙基)-5-氟-3-(3-氟苯基)-4H-色烯-4-酮

与中间产物2反应，以获得所需化合物N-(5-(4-氨基-1-(1-(5-氟-3-(3-氟苯基)-4-氧代-4H-色烯-2-基)乙基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基)-2-甲氧基苯基)甲基磺酰胺；

(d)任选地将N-(5-(4-氨基-1-(1-(5-氟-3-(3-氟苯基)-4-氧代-4H-色烯-2-基)乙基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基)-2-甲氧基苯基)甲基磺酰胺转换为其药学可接受的盐或其药物前体。

另外一个实施例涉及用于制备式(A1)的化合物的方法：

该方法包括下述步骤：

(a)使用3-(4-甲氧基-3-硝基苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-胺，使(R)-5-氟-3-(3-氟苯基)-2-(1-羟乙基)-4H-色烯-4-酮经历Mitsunobu反应

(例如，在三苯基膦和偶氮二羧酸二异丙酯的存在下)，以获得(S)-2-(1-(4-氨基-3-(4-甲氧基-3-硝基苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)乙基)-5-氟-3-(3-氟苯基)-4H-色烯-4-酮(中间产物3)：

(b)例如用还原剂例如Raney Ni使中间产物3还原，以获得(S)-2-(1-(4-氨基-3-(3-氨基-4-甲氧基苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)乙基)-5-氟-3-(3-氟苯基)-4H-色烯-4-酮(中间产物4)：

(c)用甲磺酰氯处理中间产物4，以获得所需式(A1)的化合物；和

(d)任选地将化合物(A1)转换为其药学可接受的盐或其药物前体。

另外一个实施例是可用于制备本发明的化合物例如(S)-2-(1-(4-氨基-3-(4-甲氧基-3-硝基苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)乙基)-5-氟-3-(3-氟苯基)-4H-色烯-4-酮、(S)-2-(1-(4-氨基-3-(3-氨基-4-甲氧基苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)乙基)-5-氟-3-(3-氟苯基)-4H-色烯-4-酮及其盐的中间产物。

本发明的另外一个实施例是抑制患者中的PI3Kδ和PI3Kγ的方法，所述方法包括给患者施用有效量的本发明的至少一种化合物。

本发明的另外一个实施例是抑制患者中的PI3Kδ的方法，所述方法包括给患者施用有效量的(R)-N-(5-(4-氨基-1-(1-(5-氟-3-(3-氟苯基)-4-氧代-4H-色烯-2-基)乙基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基)-2-甲氧基苯基)甲基磺酰胺(化合物A2)、其药学可接受的盐或其药物前体中的至少一种。

本发明的另外一个实施例是治疗、预防和/或抑制患者中的PI3K蛋白质激酶介导的疾病、病症或状况(例如增殖性疾病或病症，例如癌症)的方法，所述方法包括给患者施用有效量的本发明的至少一种化合物。

本发明的另外一个实施例是用于抑制患者中的PI3K特别是PI3Kδ和PI3Kγ的方法，所述方法包括给患者施用有效量的本发明的至少一种化合物。

本发明的另外一个实施例是经由蛋白质激酶(例如PI3Kδ和PI3Kγ)的调节用于治疗炎性疾病、自身免疫疾病或增殖性疾病的方法，所述方法包括给需要此类治疗的患者施用有效量的本发明的至少一种化合物。在一个实施例中，本发明的化合物抑制PI3Kδ和PI3Kγ两者。

本发明的另外一个实施例是通过给需要此类治疗的患者施用有效量的本发明的至少一种化合物，与至少一种其他抗炎剂、免疫调节剂或抗癌剂或其组合相组合(同时或序贯)，经由蛋白质激酶(例如PI3Kδ和PI3Kγ)的调节用于治疗炎性疾病、自身免疫疾病或增殖性疾病的方法。在一个实施例中，本发明的化合物抑制PI3Kδ和PI3Kγ两者。

本发明的化合物可用于治疗各种癌症，包括但不限于：

癌，包括但不限于膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、肝癌、肺癌包括小细胞肺癌、食道癌、胆囊癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、子宫颈癌、甲状腺癌、前列腺癌和皮肤癌包括鳞状细胞癌；

淋巴谱系的造血肿瘤，包括但不限于白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、毛细胞淋巴瘤和伯基特氏淋巴瘤；

骨髓谱系的造血肿瘤，包括但不限于急性和慢性骨髓性白血病、骨髓增生异常综合征和前髓细胞性白血病；

间充质起源的肿瘤，包括但不限于纤维肉瘤和横纹肌肉瘤；

中枢和周围神经系统的肿瘤，包括但不限于星形细胞瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤和神经鞘瘤；和

其他肿瘤，包括但不限于黑素瘤、精原细胞瘤、畸胎癌、骨肉瘤、着色性干皮病、角化棘皮瘤、甲状腺滤泡癌和卡波西氏肉瘤。

在一个实施例中，施用有效量的本发明的化合物，以治疗白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、毛细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、急性和慢性髓性白血病、骨髓增生异常综合征或前髓细胞性白血病。

由于蛋白质激酶在一般而言的细胞增殖的调节中的关键作用，本发明的化合物可以充当可逆细胞抑制剂，并且因此可用于治疗特征在于异常细胞增殖的任何疾病过程，例如良性前列腺增生症、家族性腺瘤性息肉病、神经纤维瘤病、动脉粥样硬化、肺纤维化、关节炎、银屑病、肾小球肾炎、血管成形术或血管手术后再狭窄、肥厚性瘢痕形成、炎性肠病、移植排斥、内毒素休克和真菌感染。

作为细胞凋亡调节剂的本发明的化合物可用于治疗癌症(包括但不限于本文上文提及的那些类型)、病毒感染(包括但不限于疱疹病毒、痘病毒、EB病毒、辛德比斯病毒和腺病毒)、自身免疫疾病(包括但不限于系统性红斑狼疮、自身免疫介导的肾小球肾炎、类风湿性关节炎、银屑病、炎性肠病和自身免疫性糖尿病)、神经变性病症(包括但不限于阿尔茨海默氏病、AIDS相关痴呆、帕金森氏病、肌萎缩侧索硬化、色素性视网膜炎、脊髓性肌萎缩和小脑变性)、骨髓增生异常综合征、再生障碍性贫血、与心肌梗死相关的缺血性损伤、中风和再灌注损伤、心律不齐、动脉粥样硬化、毒素诱导的或酒精相关的肝疾病、血液病(包括但不限于慢性贫血和再生障碍性贫血)、肌肉骨骼系统的退行性疾病(包括但不限于骨质疏松症和关节炎)、阿司匹林敏感性鼻窦炎、囊性纤维化、多发性硬化、肾脏疾病和癌症疼痛。本发明的化合物还可用于预防、抑制或压制HIV感染个体中的AIDS发展。

本发明的化合物可调节细胞RNA和DNA合成的水平。本发明的化合物因此可用于治疗病毒感染，包括但不限于HIV、人乳头状瘤病毒、疱疹病毒、痘病毒、EB病毒、辛德比斯病毒和腺病毒。

本发明的化合物可用于癌症的化学预防。化学预防在本文中定义为通过阻断起始诱变事件或通过阻断已经患有损伤的恶化前细胞的进展或抑制肿瘤复发，来抑制侵袭性癌症的发展。本发明的化合物还可用于抑制肿瘤血管生成和转移。本发明的一个实施例是通过施用有效量的本发明的一种或多种化合物，抑制有此需要的患者中的肿瘤血管生成或转移的方法。

本发明的另一个实施例是治疗免疫系统相关疾病或免疫病症(例如自身免疫疾病)、涉及炎症的疾病或病症(例如哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、类风湿性关节炎、炎性肠病、肾小球肾炎、神经炎症性疾病、多发性硬化、葡萄膜炎和免疫系统病症)、癌症或其他增殖性疾病、肝脏疾病或病症、肾脏疾病或病症的方法。该方法包括施用有效量的本发明的一种或多种化合物。

免疫病症的例子包括但不限于银屑病、类风湿性关节炎、血管炎、炎性肠病、皮炎、骨关节炎、哮喘、炎性肌肉疾病、变应性鼻炎、阴道炎、间质性膀胱炎、硬皮病、骨质疏松症、湿疹、同种异体移植或异种移植(器官、骨髓、干细胞及其他细胞和组织)移植物排斥、移植物抗宿主病、红斑狼疮、炎性疾病、I型糖尿病、肺纤维化、皮肌炎、干燥综合征、甲状腺炎(例如桥本氏甲状腺炎和自身免疫性甲状腺炎)、重症肌无力、自身免疫性溶血性贫血、多发性硬化、囊性纤维化、慢性复发性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、变应性结膜炎和特应性皮炎。

在一个实施例中，本文描述的化合物可用作免疫抑制剂，以预防移植物排斥、同种异体或异种移植排斥(器官、骨髓、干细胞、其他细胞和组织)和移植物抗宿主病。在一个特定实施例中，移植物排斥起因于组织或器官移植物。在进一步的实施例中，移植物抗宿主病起因于骨髓或干细胞移植。本发明的一个实施例是预防或减少移植物排斥、同种异体或异种移植排斥(器官、骨髓、干细胞、其他细胞和组织)或移植物抗宿主病的危险的方法，所述方法包括施用有效量的本发明的一种或多种化合物。

本发明的化合物还可与下述组合使用(一起或序贯施用)：已知的抗癌治疗例如放射疗法或者细胞抑制剂或细胞毒性剂或抗癌剂，例如DNA相互作用剂，例如顺铂或多柔比星；拓扑异构酶II抑制剂，例如依托泊苷；拓扑异构酶I抑制剂如CPT-11或拓扑替康；天然存在的或合成的微管蛋白相互作用剂，例如紫杉醇、多西他赛或埃博霉素(例如伊沙匹隆)；激素试剂，例如他莫昔芬；胸苷酸合酶抑制剂，例如5-氟尿嘧啶；和抗代谢物，例如甲氨蝶呤，其他酪氨酸激酶抑制剂，例如Iressa和OSI-774；血管生成抑制剂；EGF抑制剂；VEGF抑制剂；CDK抑制剂；SRC抑制剂；c-Kit抑制剂；Her1/2抑制剂和针对生长因子受体的单克隆抗体例如爱必妥(EGF)和赫赛汀(Her2)；BTK抑制剂，例如依鲁替尼；和其他蛋白质激酶调节剂，及其任何组合。

本发明的化合物还可与一种或多种甾体抗炎药、非甾体抗炎药(NSAID)和免疫选择性抗炎衍生物(ImSAID)及其任何组合相组合使用(一起或序贯施用)。

本发明还提供了包含本发明的一种或多种化合物和药学可接受的载体的药物组合物。药物组合物还可包含上文鉴定的活性成分中的一种或多种，例如其他抗癌剂。

另外一个实施例是治疗有此需要的患者中的白血病的方法，所述方法包括施用治疗有效量的本发明的化合物。在一个实施例中，白血病选自慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、霍奇金淋巴瘤(HL)、急性髓性白血病(AML)、多发性骨髓瘤(MM)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)和惰性非霍奇金淋巴瘤(I-NHL)。

本发明的另外一个实施例是治疗有此需要的患者中的自身免疫病症的方法，所述方法包括施用治疗有效量的本发明的化合物。在一个实施例中，自身免疫病症选自哮喘、COPD、类风湿性关节炎、银屑病、狼疮和实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)。

本发明的另外一个实施例是治疗有此需要的患者中的变应性鼻炎的方法，所述方法包括给患者施用治疗有效量的本发明的化合物。

在上述方法的任一种中，本发明的化合物和任选的另外的活性剂可以如本文描述的药物组合物的形式施用。

附图说明

图1描述了根据测定7中所述的脂多糖诱导的肺嗜中性粒细胞增多症模型，来自用10mg/kg化合物A1(po)处理的雌性Wistar大鼠的支气管肺泡灌洗液(BALF)中的嗜中性粒细胞计数的条形图。

图2描述了根据测定8中所述的脂多糖诱导的大鼠空气袋炎症模型，来自用1、3和10mg/kg化合物A1(po)处理的Wistar大鼠的腹膜灌洗液中的嗜中性粒细胞计数的条形图。

图3A和3B分别描述了根据测定11中的程序，在用对照或10mg/kg/QD化合物A1处理的具有胶原诱导的关节炎的Wistar大鼠中，关于后爪和前爪的个别临床得分和关于临床得分的AUC的线和条形图。

图3C和3D分别描述了根据测定11中的程序，在用媒介物或10mg/kg/QD化合物A1处理的具有胶原诱导的关节炎的Wistar大鼠中，关于后爪和前爪的个别临床得分的线和条形图。

图4A和4B分别描述了根据测定11中的程序，在用媒介物或10mg/kg/QD化合物A1处理的具有胶原诱导的关节炎的Wistar大鼠中，关于后爪的体积和爪体积的AUC的线和条形图。

图4C和4D分别描述了根据测定11中的程序，在用媒介物或10mg/kg/QD化合物A1处理的具有胶原诱导的关节炎的Wistar大鼠中，关于后爪的踝直径和踝直径的AUC的线和条形图。

图4E至4G分别描述了根据测定11中的程序，在用媒介物或10mg/kg/QD化合物A1处理的具有胶原诱导的关节炎的Wistar大鼠中，所有后爪和前爪的炎症抑制、软骨和血管翳的组织病理学得分的条形图。

图4H描述了根据测定11中的程序，在用媒介物或10mg/kg/QD化合物A1处理的具有胶原诱导的关节炎的Wistar大鼠中，所有后爪和前爪的总组织病理学得分的条形图。

图5描述了根据测定11中的程序，在用媒介物或10mg/kg/QD化合物A1处理的具有胶原诱导的关节炎的Wistar大鼠中，关节炎的发病率百分比的条形图。

图6A和6B描述了条形图，显示根据测定13中的程序，化合物A1(3、10、30mg/kg)对Balb/c小鼠中的咪喹莫特诱导的银屑病的抗银屑病作用。

具体实施方式

如本文使用的，除非另有说明，否则应该应用下述定义。此外，本文定义的基团中的许多可为任选取代的。定义中的取代基列表是示例性的，并且不应解释为限制说明书中其他地方定义的取代基。

本文描述的化合物中的某些含有一个或多个不对称中心，并且因此可产生对映体、非对映体及其他立体异构形式，其可根据绝对立体化学定义为(R)-或(S)-。除非另有说明，否则本文的化学实体、药物组合物和方法意欲包括所有此类可能的异构体，包括外消旋混合物，任选的纯形式和中间产物混合物。例如，中间产物混合物的非限制性例子包括以10∶90、13∶87、17∶83、20∶80、或22∶78比率的R∶S或S∶R异构体的混合物。光学活性的(R)-和(S)-异构体可使用手性合成子或手性试剂进行制备，或使用常规技术进行分解。当本文描述的化合物含有烯属双键或其他几何不对称中心时，并且除非另有说明，否则预期化合物包括E和Z几何异构体两者。

术语“互变异构体”指特征在于处于平衡的异构体形式的相对容易的互换的化合物。这些异构体预期由本发明涵盖。“互变异构体”是通过互变异构化互换的结构上不同的异构体。“互变异构化”是异构化形式，并且包括质子转移或质子移位互变异构化，其视为酸碱化学的子集。“质子转移互变异构化”或“质子移位互变异构化”涉及质子的迁移，伴随键级的变化，通常为单键与邻近双键的互换。当互变异构化是可能的(例如在溶液中)时，可实现互变异构体的化学平衡。互变异构化的例子是酮-烯醇互变异构化。酮-烯醇互变异构化的具体例子是戊烷-2，4-二酮和4-羟基戊-3-烯-2-酮互变异构体的互换。互变异构化的另一个例子是酚-酮互变异构化。酚-酮互变异构化的具体例子是吡啶-4-醇和吡啶-4(1H)-酮互变异构体的互换。

术语“药物前体”指其为化合物的失活前体的化合物，所述化合物通过正常代谢过程在体内转换成其活性形式。药物前体设计一般在Hardma等人(编辑)，Goodman andGilman′s The Pharmacological Basis of Therapeutics，第9版，第11-16页(1996)中讨论。深入讨论在Higuchi等人，Prodrugs as Novel Delivery Systems，第14卷，ASCDSymposium Series，以及Roche(编辑)，Bioreversible Carriers in Drug Design，American Pharmaceutical Association and Pergamon Press(1987)中提供。为了举例说明，药物前体可通过例如酯键或酰胺键的水解转换成药理学活性形式，由此引入官能团或暴露在所得的产物上的官能团。药物前体可设计为与内源化合物反应，以形成水溶性缀合物，其还增强化合物的药理性质，例如增加的循环半衰期。可替代地，药物前体可设计为经历用例如葡萄糖醛酸、硫酸盐、谷胱甘肽、氨基酸或乙酸盐的官能团上的共价修饰。所得到的缀合物可为失活的且在尿中排泄，或致使比母体化合物更有效。高分子量缀合物还可排泄到胆汁内，经历酶促切割，并且释放回循环内，由此有效增加原始施用的化合物的生物半衰期。

术语“酯”指通过酸和醇之间的反应形成的化合物，伴随水的消除。酯可由通式RCOOR′(其中R是药物，并且R’是化学基团)表示。

这些药物前体和酯预期涵盖在本发明的范围内。

另外，本发明还包括区别仅在于一种或多种同位素富集原子的存在的化合物，例如氢由氘或氚替换，或碳由¹³C-或¹⁴C-富集的碳替换。

本发明的化合物还可含有在一个或多个原子处非天然比例的原子同位素，所述原子构成此类化合物。例如，化合物可用放射性同位素例如氚(³H)、碘-125(¹²⁵I)或碳-14(¹⁴C)进行放射性标记。本发明的化合物的所有同位素变化，无论是放射性的还是并非放射性的，均包含在本发明的范围内。

形成本发明的部分的药学可接受的盐包括来源于无机碱例如Li、Na、K、Ca、Mg、Fe、Cu、Zn和Mn的盐；有机碱例如N，N′-二乙酰基乙二胺、葡糖胺、三乙胺、胆碱、氢氧化物、二环己胺、二甲双胍、苄胺、三烷基胺和硫胺素的盐；手性碱例如烷基苯基胺、甘氨醇和苯基甘氨醇；天然氨基酸例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、酪氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、羟基脯氨酸、组氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、精氨酸和丝氨酸的盐；本发明的化合物与烷基卤化物的季铵盐，烷基硫酸盐例如MeI和(Me)₂SO₄；非天然氨基酸例如D-异构体或取代氨基酸；胍；以及取代胍，其中取代基选自硝基、氨基、烷基、烯基、炔基、铵或取代的铵盐和铝盐。盐可包括适当的酸加成盐，所述酸加成盐可为硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐、高氯酸盐、硼酸盐、氢卤酸盐、乙酸盐、酒石酸盐、马来酸盐、柠檬酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、扑酸盐(palmoate)、甲磺酸盐、苯甲酸盐、水杨酸盐、苯磺酸盐、抗坏血酸盐、甘油磷酸盐和酮戊二酸盐。

当范围在本文中用于物理性质例如分子量或化学性质例如化学式时，预期包括范围以及其中的具体实施例的所有组合和子组合。当指数目或数目范围时，术语“约”意指数目或数目范围指的是实验变异性内(或统计实验误差内)的近似值，并且因此数目或数目范围可例如在所述数目或数目范围的1％至15％之间变化。术语“包含(comprising)”(和相关术语例如“包含(comprise)”或“包含(comprises)”或“具有”或“包括”)包括“由所述特征组成”或“基本上由所述特征组成”的那些实施例，例如任何物质组成、组合物、方法或过程等等的实施例。

下述缩写和术语自始至终具有所示含义：PI3-K＝磷酸肌醇3-激酶；PI＝磷脂酰肌醇；AIDS＝获得性免疫缺陷综合征；HIV＝人免疫缺陷病毒；MeI＝碘代甲烷；ND：未测定。

本文使用的缩写具有其在化学领域和生物学领域内的常规含义。

术语“细胞增殖”指通过其细胞数目由于分裂而改变的现象。该术语还包含通过其细胞形态已与增殖信号一致改变(例如大小增加)的细胞生长。

如本文使用的，术语“共施用”、“与......组合施用”及其语法等价物包含两种或更多种试剂对动物的施用，使得两种试剂和/或其代谢产物同时存在于动物中。共施用包括在分开组合物中的同时施用，在分开组合物中在不同时间的施用，或在其中存在两种试剂的组合物中的施用。

术语“有效量”或“治疗有效量”指本文描述的化合物的量，所述量足以实现预期应用包括但不限于疾病治疗，如下文定义的。治疗有效量可取决于预期应用(体外或体内)、或被治疗的受试者和疾病状况例如受试者的重量和年龄、疾病状况的严重性、施用方式等等而改变，所述治疗有效量可由本领域普通技术人员容易地确定。该术语还应用于在靶细胞中诱导特定应答的剂量，所述特定应答例如血小板粘附和/或细胞迁移的减少。取决于所选的特定化合物、待遵循的给药方案(无论它是否与其他化合物组合施用)、施用时机、它施用于其的组织、以及它在其中携带的物理递送系统，具体剂量将改变。

如本文使用的，“治疗”、“处理”或“改善”可互换使用。这些术语指用于获得有益或所需结果的方法，所述有益或所需结果包括但不限于治疗利益和/或预防利益。治疗利益意指被治疗的潜在病症的根除或改善。另外，治疗利益伴随与潜在病症相关的生理学症状中的一种或多种的根除或改善实现，使得在患者中观察到改善，尽管患者可能仍患有潜在病症。对于预防利益，组合物可施用于处于发展特定疾病的危险中的患者，或报告疾病的生理学症状中的一种或多种的患者，即使可能仍未作出疾病的诊断。

如该术语在本文中使用的，“疗效”包含如上文所述的治疗利益和/或预防利益。预防效应包括延迟或消除疾病或状况的出现，延迟或消除疾病或状况的症状的发作，减慢、停止或逆转疾病或状况的进展，或其任何组合。

术语“受试者”或“患者”指动物(例如犬、猫、马或猪)，例如哺乳动物例如人。本文描述的方法可用于人治疗学和兽医学应用中。在一些实施例中，患者是哺乳动物。在一个优选实施例中，患者是人。

“放射疗法”意指使用从业者已知的常规方法和组合物，使患者暴露于辐射发射器例如α粒子发射放射性核素(例如锕和钍放射性核素)，低线性能量转移(LET)辐射发射器(即β发射器)，转换电子发射器(例如锶-89和钐-153-EDTMP)，或高能辐射包括但不限于x-射线、γ射线和中子。

“信号转导”是在其期间刺激或抑制信号被传递进入细胞且在细胞内，以引发细胞内应答的过程。信号转导途径的调节剂指调节对相同特异性信号转导途径映射的一种或多种细胞蛋白质的活性的化合物。调节剂可增强(激动剂)或压制(拮抗剂)信号传导分子的活性。

如应用于生物学活性剂，术语“选择性抑制”或“选择性地抑制”指与脱靶信号传导活性相比较，经由与靶的直接或间接相互作用，试剂选择性地减少靶信号传导活性的能力。

术语“药学可接受的载体”或“药学可接受的赋形剂”包括但不限于任何和所有溶剂、分散介质、涂层、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、一种或多种合适的稀释剂、填料、盐、崩解剂、粘合剂、润滑剂、助流剂、湿润剂、控制释放基质、着色剂/调味料、载体、赋形剂、缓冲剂、稳定剂、增溶剂及其组合。除非任何常规介质或试剂与活性成分不相容，否则考虑其在本发明的治疗组合物中的使用。补充性活性成分也可掺入组合物内。

在其他实施例中，如体外激酶测定中测量的，本发明的化合物以约100nM或更少、约50nM或更少、约10nM或更少、约5nM或更少、约100pM或更少、约10pM或更少、或约1pM或更少的IC₅₀值选择性地抑制I型或I类磷脂酰肌醇3-激酶(PI3激酶)的一个或多个成员。

在另外一个方面，选择性地抑制I型PI3激酶的一个或多个成员的抑制剂，或选择性地抑制一个或多个I型PI3激酶介导的信号传导途径的抑制剂，可替代地可理解为指就给定I型PI3激酶而言显示出50％抑制浓度(IC₅₀)的化合物，所述IC₅₀是就其他I型PI3激酶的剩余部分而言的抑制剂的IC₅₀的至少10倍低、至少20倍低、至少50倍低、至少100倍低、或至少1000倍低。

如本文使用的，术语“双重PI3激酶δ/γ抑制剂”和“双重PI3激酶δ/γ选择性抑制剂”指比PI3K家族的其他同工酶更有效地抑制PI3激酶δ和γ同工酶两者的活性的化合物。双重PI3激酶δ/γ抑制剂因此对于PI3激酶δ和γ比常规PI3K抑制剂(例如其为非选择性PI3K抑制剂的CAL-130、渥曼青霉素和LY294002)更选择性。

PI3激酶δ和γ的抑制可能在各种状况的治疗中具有治疗利益，所述各种状况例如特征在于炎症应答的状况，包括但不限于自身免疫性疾病、过敏性疾病和关节炎疾病。重要的是，PI3激酶δ和γ功能的抑制看起来不影响生物学功能例如活力和能育性。

如本文使用的，“炎症应答”的特征在于发红、热、肿胀和疼痛(即炎症)，并且通常涉及组织损伤或破坏。炎症应答通常为通过组织的损伤或破坏引发的局限性、保护性应答，所述保护性应答作用于破坏、稀释或隔开(隔离)有害剂和受伤组织两者。炎症应答与白细胞的流入和/或白细胞(例如嗜中性粒细胞)趋化性显著相关。炎症应答可起因于由致病性生物和病毒的感染，非传染性方式例如在心肌梗死或中风后的创伤或再灌注、对外来抗原的免疫应答和自身免疫疾病。顺应用根据本发明的方法和化合物的治疗的炎症应答包含与特异性防御系统的反应相关的状况，以及与非特异性防御系统的反应相关的状况。

本发明的治疗方法包括用于改善与炎症细胞活化相关的状况的方法。“炎症细胞活化”指通过增殖性细胞应答的刺激(包括但不限于细胞因子、抗原或自身抗体)的诱导、可溶性介质(包括但不限于细胞因子、氧自由基、酶、前列腺素类或血管活性胺)的产生、或炎症细胞(包括但不限于单核细胞、巨噬细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、粒细胞(多形核白细胞包括嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞)、肥大细胞、树突状细胞、朗格汉斯细胞和内皮细胞)中新的或增加数目的介质(包括但不限于主要组织相容性抗原或细胞粘附分子)的细胞表面表达。本领域技术人员应了解在这些细胞中的这些表型之一或组合的活化可促成炎症状况的起始、持续或恶化。

如本文使用的，“自身免疫疾病”指其中组织损伤与体液或细胞介导的对机体自身组成成分的应答的任何病症组。

如本文使用的，“移植排斥”指针对移植组织(包括器官或细胞(例如骨髓)，特征在于移植和周围组织的功能丧失、疼痛、肿胀、白细胞增多症和血小板减少症)的任何免疫应答。

如本文使用的，“过敏性疾病”指起因于过敏反应的任何症状、组织损害、或组织功能的丧失。

如本文使用的，“关节炎疾病”指特征在于可归于各种病因学的关节炎性病变的任何疾病。

如本文使用的，“皮肌炎”指特征在于可归于各种病因学的皮肤炎症的皮肤疾病大家族中的任一种。

如先前描述的，术语“双重PI3激酶δ/γ选择性抑制剂”一般指比PI3K家族的其他同工酶更有效地抑制PI3激酶δ和γ同工酶的活性的化合物。化合物作为酶活性(或其他生物活性)的抑制剂的相对功效可通过下述进行确定：测定在其下每种化合物抑制活性至预定程度的浓度且随后比较结果。通常，优选组合是在生物化学测定中抑制50％活性的浓度，即50％抑制浓度或″IC₅₀″。IC₅₀测定可使用本领域已知的常规技术来完成。一般而言，IC₅₀可通过测量在处于研究下的抑制剂的浓度范围的存在下给定酶的活性进行测定。实验获得的酶活性的值随后针对使用的抑制剂浓度进行标绘。显示50％酶活性(与在不存在任何抑制剂的情况下的活性相比较)的抑制剂浓度视为IC₅₀值。类似地，其他抑制浓度可通过活性的适当测定进行定义。例如，在一些设置下，可期望确定90％抑制浓度，即IC₉₀等。

相应地，双重PI3激酶δ/γ选择性抑制剂可替代地可理解为指就PI3激酶δ和γ而言显示出50％抑制浓度(IC₅₀)的化合物，所述IC₅₀是就其他I类PI3K家族成员中的任一种或全部而言的IC₅₀值至少10倍低、至少20倍低、或至少30倍低。在本发明的一个替代实施例中，术语双重PI3激酶δ/γ选择性抑制剂可理解为指就PI3激酶δ和γ而言显示出IC₅₀的化合物，所述IC₅₀是就其他PI3K I类家族成员中的任一种或全部而言的IC₅₀至少30倍低、至少50倍低、至少100倍低、至少200倍低、或至少500倍低。双重PI3激酶δ/γ选择性抑制剂通常以这样的量施用，使得它选择性地抑制PI3激酶δ和γ活性两者，如上所述。

在某些实施例中，本发明的化合物显示出几乎相等(～1∶1)或以1∶5的最大比的PI3激酶δ和γ抑制，即本发明的化合物对于PI3激酶δ和γ酶两者显示出几乎相等的IC₅₀值，或两者之间的至多3至8倍差异。

本发明的方法可应用于体内或离体细胞群体。“在体内”意指在活个体内，如在动物或人内或者受试者体内。在这个背景下，本发明的方法可在个体中治疗或预防使用。“离体”或“在体外”意指活个体的外部。离体细胞群体的例子包括体外细胞培养和生物样品，包括但不限于得自个体的流体或组织样品。此类样品可通过本领域已知的方法获得。示例性生物学流体样品包括血液、脑脊髓液、尿和唾液。示例性组织样品包括肿瘤及其活组织检查。在这个背景下，本发明可用于各种目的，包括治疗和实验目的。例如，本发明可离体或在体外用于测定PI3激酶δ选择性抑制剂对于给定适应症、细胞类型、个体及其他参数的最佳施用时间表和/或给药。由此类使用收集的信息可用于实验或诊断目的或者用于临床中，以设置用于体内治疗的方案。本发明可能适合于其的其他离体用途在下文描述或对于本领域技术人员将变得显而易见。

本发明的化合物可通过本领域已知的方法进行制备，所述方法例如国际公开号WO2011/055215、WO 2012/151525和WO 2013/164801中所述的那些，所述国际公开号各自以引用的方式在此全文并入。

药物组合物

本发明还提供了包含本发明的一种或多种化合物和一种或多种药学可接受的载体或赋形剂的药物组合物。在一个实施例中，药物组合物包括治疗有效量的本发明的一种或多种化合物。药物组合物可包括如本文描述的一种或多种另外的活性成分。

药学载体和/或赋形剂可选自例如稀释剂、填料、盐、崩解剂、粘合剂、润滑剂、助流剂、湿润剂、控制释放基质、着色剂、调味料、缓冲剂、稳定剂、增溶剂及其组合。

在一个实施例中，本文描述的药物组合物含有约0.1mg至约1,000mg，例如约1mg至约1,000mg、约20mg至约800mg、约50mg至约600mg、或约50mg至约600mg的本发明的一种或多种化合物。在另一个实施例中，本文描述的药物组合物含有约100mg至约400mg的本发明的一种或多种化合物。

本发明的药物组合物可单独或与一种或多种其他活性剂组合施用。需要时，主题化合物及其他试剂可混合到制剂内，或两种组分可配制成分开的制剂，以分开或同时组合使用它们。

本发明的化合物和药物组合物可通过任何途径进行施用，所述任何途径允许化合物递送至作用部位，例如经口、鼻内、局部(例如经皮)、十二指肠内、肠胃外(包括静脉内、动脉内、肌内、血管内、腹膜内或者通过注射或输注)、皮内、通过乳房内、鞘内、眼内、眼球后、肺内(例如气雾化药物)或皮下(包括用于长期释放的贮库施用，例如嵌入脾囊下、脑或角膜中)、舌下、肛门、直肠、阴道或通过手术植入(例如嵌入脾囊下、脑或角膜中)。

组合物可以固体、半固体、液体或气体形式施用，或可在干粉中，例如冻干形式。药物组合物可以对于递送方便的方式进行包装，包括例如固体剂型例如胶囊、小药囊、扁囊剂、明胶、纸、片剂、栓剂、丹剂、丸剂、锭剂和糖锭剂。包装类型一般取决于所需施用途径。还考虑了可植入的持续释放制剂，如经皮制剂。

治疗方法

待施用的化合物的量取决于被治疗的哺乳动物、病症或状况的严重性、施用速率、化合物的处置和开处方医生的判断。然而，有效剂量在单一或分份剂量中约0.001至约100mg/kg体重/天，优选约1至约35mg/kg/天的范围内。对于70kg人，这将总计达到约0.05至约7g/天，优选约0.05至约2.5g/天。本发明的化合物的有效量可在单一或多重剂量中施用(例如每天两次或三次)。

本发明的化合物可与抗癌剂(例如化学治疗剂)、治疗抗体和辐射治疗中的一种或多种组合使用。

本发明的化合物可与其他试剂结合配制或施用，所述其他试剂作用于减轻炎性状况例如脑脊髓炎、哮喘以及本文描述的其他疾病的症状。这些试剂包括非甾体抗炎药(NSAID)。

实例

下文提供的实例和制剂还示出且例证了本发明的化合物和制备此类化合物的方法。应理解本发明的范围决不受下述实例和制剂的范围限制。在下述实例中，除非另有说明，否则具有单一手性中心的分子作为外消旋混合物存在。除非另有说明，否则具有两个或更多个手性中心的那些分子作为非对映体的外消旋混合物存在。单一对映体/非对映体可通过本领域技术人员已知的方法获得。

本文描述的中间产物可通过国际公开号WO 11/055215和WO 12/151525中所述的方法进行制备，所述两个国际公开号均以引用的方式在此并入。

中间产物1：N-(5-溴-2-甲氧基苯基)甲基磺酰胺：向5-溴-2-甲氧基苯胺(1.00g，4.94mmol)的二氯甲烷(10ml)溶液中，加入吡啶(0.800ml，9.89mmol)且冷却至0℃。加入甲磺酰氯(0.40ml，5.19mmol)且搅拌30分钟。反应混合物用水淬灭，用乙酸乙酯提取，在无水硫酸钠上干燥，并且在减压下浓缩。粗产物用乙酸乙酯：石油醚进行层析，以提供作为淡红色固体的标题化合物(1.20g，87％)。

中间产物2：N-(2-甲氧基-5-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂硼烷-2-基)苯基)甲基磺酰胺：将乙酸钾(0.841g，8.57mmol)和双(戊酰)二硼(1.190g，4.71mmol)加入中间产物1(1.20g，4.28mmol)的二噁烷(17.5ml)溶液中，并且使溶液除气30分钟。在氮大气下加入[1，1’-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯钯(II).CH₂Cl₂(0.104g，0.128mmol)，并且加热至80℃。在2小时后，使反应混合物通过硅藻土过滤且浓缩。粗产物通过用乙酸乙酯：石油醚的柱层析进行纯化，以提供作为黄色固体的标题化合物(1.00g，71％)。¹H-NMR(δppm，CDCl₃，400MHz)：7.91(d，J＝1.2Hz，1H)，7.62(dd，J＝8.1，1.2Hz，1H)，6.92(d，J＝8.1Hz，1H)，6.73(s，1H)，3.91(s，3H)，2.98(s，3H)，1.32(s，12H).

中间产物3：(S)-2-(1-(4-氨基-3-(4-甲氧基-3-硝基苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)乙基)-5-氟-3-(3-氟苯基)-4H-色烯-4-酮：(S)-2-(1-(4-氨基-3-(4-甲氧基-3-硝基苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)乙基)-5-氟-3-(3-氟苯基)-4H-色烯-4-酮：向(R)-5-氟-3-(3-氟苯基)-2-(1-羟乙基)-4H-色烯-4-酮(0.500g，1.64mmol)的THF(5ml)溶液中，加入3-(4-甲氧基-3-硝基苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-胺(0.564g，1.97mmol)和三苯基膦(0.649g，2.47mmol)，随后加入偶氮二羧酸二异丙酯(0.50ml，2.47mmol)。((R)-5-氟-3-(3-氟苯基)-2-(1-羟乙基)-4H-色烯-4-酮可如国际公开号WO 2012/0151525中对于中间产物23、25和26中所述进行制备。)。在室温下4小时后，使混合物浓缩且通过用乙酸乙酯：石油醚的柱层析纯化残渣，以提供作为褐色固体的标题化合物(0.270g，29％)。¹H-NMR(δppm，DMSO-d6，400MHz)：8.04(s，1H)，7.83(m，1H)，7.63-7.50(m，3H)，7.29(m，2H)，7.06(dt，J＝8.7，2.2Hz，1H)，6.94(m，2H)，6.75(dd，J＝8.1，2.1Hz，1H)，5.95(q，J＝7.0Hz，1H)，4.98(s，2H)，3.81(s，3H)，1.86(d，J＝7.0Hz，3H).

中间产物4：(S)-2-(1-(4-氨基-3-(3-氨基-4-甲氧基苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)乙基)-5-氟-3-(3-氟苯基)-4H-色烯-4-酮：(S)-2-(1-(4-氨基-3-(3-氨基-4-甲氧基苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)乙基)-5-氟-3-(3-氟苯基)-4H-色烯-4-酮：向中间产物3(0.260g，0.455mmol)的乙醇(5ml)的溶液中，加入RaneyNi(0.130g)且在20psi下在50℃下氢化24小时。使反应混合物穿过硅藻土垫且浓缩，以提供作为褐色固体的标题化合物(0.150g，60％)。质量：540.8(M⁺)。

实例A

N-(5-(4-氨基-1-(1-(5-氟-3-(3-氟苯基)-4-氧代-4H-色烯-2-基)乙基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基)-2-甲氧基苯基)甲基磺酰胺

向2-(1-(4-氨基-3-碘代-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)乙基)-5-氟-3-(3-氟苯基)-4H-色烯-4-酮(0.200g，0.366mmol)在DME(2.1ml)和水(0.67ml)中的溶液中，加入中间产物2(0.179g，0.550mmol)和碳酸钠(0.116g，1.10mmol)，并且使系统除气30分钟。(2-(1-(4-氨基-3-碘代-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)乙基)-5-氟-3-(3-氟苯基)-4H-色烯-4-酮可如国际公开号WO 2012/0151525中对于中间产物23、25和26中所述进行制备)。加入双(二苯基膦基)二茂铁]二氯钯(II)(0.059g，0.075mmol)，并且在微波辐射下(微波功率＝100W，温度＝100℃)保持45分钟。使反应混合物硅藻土过滤，浓缩且用乙酸乙酯提取。有机层在硫酸钠上干燥且在减压下浓缩。粗产物通过用甲醇：二氯甲烷的柱层析进行纯化，以提供作为褐色固体的标题化合物(0.080g，35％)。MP：216-218℃。¹H-NMR(δppm，CDCl₃，400MHz)：8.20(s，1H)，7.73(s，1H)，7.53(m，2H)，7.31(m，2H)，7.07-6.73(m，6H)，6.07(q，J＝6.2Hz，1H)，3.98(s，3H)，3.14(s，3H)，2.01(d，J＝6.0Hz，3H)。

实例A1和A2

方法A

(S)-N-(5-(4-氨基-1-(1-(5-氟-3-(3-氟苯基)-4-氧代-4H-色烯-2-基)乙基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基)-2-甲氧基苯基)甲基磺酰胺

和(R)-N-(5-(4-氨基-1-(1-(5-氟-3-(3-氟苯基)-4-氧代-4H-色烯-2-基)乙基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基)-2-甲氧基苯基)甲基磺酰胺

两种对映体纯的异构体通过在CHIRALPAK AS-H柱(250x 30mm；5μm)上的制备型SFC(超临界流体)条件由N-(5-(4-氨基-1-(1-(5-氟-3-(3-氟苯基)-4-氧代-4H-色烯-2-基)乙基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基)-2-甲氧基苯基)甲基磺酰胺(0.500g)分开，使用甲醇：CO₂(55∶45)作为以80g/分钟的流速的移动相。

实例A1(S异构体)：褐色固体(0.247g)。对映体过量：97.4％。保留时间：2.14分钟。质量：619.1(M⁺+1)。MP：156-158℃。

实例A2(R异构体)：褐色固体(0.182g)。对映体过量：99.3％。保留时间：3.43分钟。质量：619.1(M⁺+1)。MP：168-171℃。

方法A1

(S)-N-(5-(4-氨基-1-(1-(5-氟-3-(3-氟苯基)-4-氧代-4H-色烯-2-基)乙基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基)-2-甲氧基苯基)甲基磺酰胺

和(R)-N-(5-(4-氨基-1-(1-(5-氟-3-(3-氟苯基)-4-氧代-4H-色烯-2-基)乙基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基)-2-甲氧基苯基)甲基磺酰胺

两种对映体纯的异构体通过在CHIRALPAK AS-H柱(250x 20mm；5μm)上的制备型SFC(超临界流体)条件由N-(5-(4-氨基-1-(1-(5-氟-3-(3-氟苯基)-4-氧代-4H-色烯-2-基)乙基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基)-2-甲氧基苯基)甲基磺酰胺(15.0g)分开，使用甲醇：CO₂(45∶55)作为以120g/分钟的流速的移动相。

实例A1(S异构体)：对映体过量：100％。保留时间：2.21分钟。质量：619.1(M⁺+1)。MP：175-178℃。比旋光度(C＝1在氯仿中，在25℃下)：[α]_D＝+147.16。

实例A2(R异构体)：对映体过量：99.3％。保留时间：3.72分钟。质量：619.1(M⁺+1)。MP：154-157℃。比旋光度(C＝1在氯仿中，在25℃下)：[α]_D＝-159.54。

方法B

实例A1

(S)-N-(5-(4-氨基-1-(1-(5-氟-3-(3-氟苯基)-4-氧代-4H-色烯-2-基)乙基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基)-2-甲氧基苯基)甲基磺酰胺

向冷却至0℃的中间产物4(0.500g，0.923mmol)的二氯甲烷溶液(5ml)中，加入吡啶(0.200ml，1.84mmol)且搅拌10分钟。加入甲磺酰氯(0.100ml，0.923mmol)，搅拌30分钟。反应混合物用水淬灭，用二氯甲烷提取且在硫酸钠上干燥。粗产物用甲醇：二氯甲烷进行柱层析，以提供作为灰白色固体的标题化合物(0.240g，42％)。MP：211-213℃。¹H-NMR(δppm，DMSO-d6，400MHz)：9.15(s，1H)，8.06(s，1H)，7.83(m，1H)，7.49(m，4H)，7.28(m，4H)，7.08(dt，J＝8.6，1.7Hz，1H)，6.92(s，2H)，5.98(q，J＝6.9Hz，1H)，3.88(s，3H)，2.99(s，3H)，1.88(d，J＝7.0Hz，3H)。对映体过量：85.4％，如通过HPLC在chiralpak AS-3R柱上测定的，富含快速洗脱异构体(保留时间＝7.46分钟)。

代谢稳定性

使用小鼠、大鼠、犬、猴和人肝微粒体，对化合物A、A1和A2以及WO 2012/151525的实例128进行代谢稳定性研究。关于用小鼠、大鼠和人肝微粒体(全部来自BD Gentest，USA)的研究方案在下文提供。0.4mg蛋白质与2mM NADPH(辅因子)一起在磷酸盐缓冲液(pH～7.4)中在37℃下预温育15分钟，并且随后加入1μM测试项目且一式三份进一步温育60分钟。反应混合物用含有甲醇的内部标准终止且进一步离心，以通过LC-MS/MS分析在上清液中剩余的测试项目。剩余的母体化合物百分比与在0分钟时终止的相似样品比较进行计算。结果在下表1中提供。

关于化合物A1的代谢稳定性数据指示它显示出优良的药物代谢动力学概况。

表1

蛋白质结合

下文提供的是用于测量血浆蛋白质结合的程序(使用平衡透析方法)。将745μL血浆转移到2ml微量离心管内。向其中加入5μL化合物A1(150μM)。样品在台面涡流器中混合2分钟。50μL血浆(n＝2)转移至作为0小时样品处理的预标记的1.5mL微量离心管中。

剩余650μL血浆样品在37℃下在水浴中温育30分钟。在30分钟温育后，50μL血浆(n＝2)在作为0.5小时样品处理的预标记的1.5mL微量离心管中取出。将200μL血浆样品(n＝2)转移到通过红色环指示的样品室内。将红色插入物置于基板内，并且将350μL缓冲液转移到缓冲液室内。板在37℃下以大约100RPM在定轨振荡器上或以20RPM在上下振荡器上温育4小时。来自缓冲液和血浆室的50μL透析后样品转移到预标记的微量离心管内。将50μL血浆加入缓冲液样品中，并且将等体积的缓冲液(KH₂PO₄缓冲液pH 7.4)加入收集的血浆样品中。加入150μL含有甲醇的内部标准(甲苯磺丁脲250ng/ml)，以沉淀蛋白质且释放化合物。使样品在台面涡流器中涡旋3分钟，并且以14,000RPM离心5分钟。对上清液实施LC-MS/MS分析。

关于化合物A1的血浆蛋白质结合数据在下表2中提供。

表2

药物代谢动力学

化合物A1(游离碱)的经口生物利用度在大鼠和小鼠中进行评估。关于大鼠中的药物代谢动力学研究的方案在下文提供。

所有动物均在给药前禁食过夜(12小时)且继续直至测试项目施用后4.0小时。测试项目制剂在1％Tween 80和99％培养基(0.5％甲基纤维素，4000cPs，pH 2.2)中进行制备。血样(来自每只动物150μL)由眶窦进行收集，且置于含有EDTA二钠作为抗凝血剂的微量离心管内。血样立即用1000g的速度在4℃下离心10分钟，并且分开的血浆样品在-80℃以下冷冻且贮存直至分析时。所有制剂中的测试项目的浓度通过HPLC进行分析。所有样品中的测试项目的血浆浓度通过LC-MS/MS进行分析。药物代谢动力学参数(C_max、AUC_0-t、T_max和t_1/2)通过使用WinNonlin软件进行估计。关于大鼠中的化合物A、A1和WO 2012/151525的实例128以及小鼠中的化合物A1的结果在表3中提供。

表3

与WO 2012/151525的实例128相比较，化合物A和A1显示了优良的药物代谢动力学概况。例如，与WO 2012/151525的实例128相比较，化合物A显示C_max中的～1.5倍增加、AUC_0-t中的～4倍增加、以及t_1/2中的～2.8倍增加。与WO 2012/151525的实例128相比较，化合物A1显示C_max中的～16倍增加、AUC_0-t中的48倍增加、以及t_1/2中的～1.6倍增加。

生物测定

本文描述的化合物的药理性质可通过如下文例证的多种药理学测定加以证实。

测定1：PI3激酶活性的荧光测定

磷酸肌醇3激酶(PI3K)属于一类脂质激酶，所述脂质激酶在几种关键细胞过程的调节中起关键作用。PI3K能够使磷酸肌醇的3-羟基位置磷酸化，由此生成涉及下游信号传导事件的第二信使。均匀时间分辨荧光(HTRF)测定允许检测由于磷脂酰肌醇4，5-二磷酸盐(PIP2)通过PI3K同种型例如α、β、γ或δ的磷酸化而形成的3，4，5-三磷酸盐(PIP3)。

关于α、β、γ或δ的PI3K同种型活性使用PI3K人HTRF^TM Assay Kit(Millipore，Billerica，MA)伴随修饰进行测定。所有温育均在室温下进行。将0.5μl 40X抑制剂(在100％DMSO中)或100％DMSO加入384孔白色板(Greiner Bio-One，Monroe，NC)的每个孔中，所述孔含有连同或不连同酶的14.5μl 1X反应缓冲液/PIP2(10mM MgCl₂，5mM DTT，1.38μMPIP2)混合物，随后为5μl/孔的400μM ATP，且温育另外30分钟。反应通过加入5μl/孔的停止溶液(Millipore，Billerica，MA)得到终止。随后将5μl检测混合物(Millipore，Billerica，MA)加入每个孔中，并且在黑暗中温育6-18小时。HRTF比率在微板阅读器(BMG Labtech.，德国)上在337nm的激发波长以及665和615nm的发射波长处进行测量，伴随50msec的400msec计数延迟的积分时间。关于化合物A、A1和A2的结果显示于下表4中。关于化合物A1和WO2012/151525的实例128的比较数据在下表5中提供。

表4

表5

测定2：在白血病细胞系中的体外细胞增殖测定

使用10％FBS补充培养基进行生长抑制测定。细胞以5000-20,000个细胞/孔的浓度种植在96孔板中。在24小时后加入以范围为0.01至10000nM的浓度的测试化合物。在0小时(在测试化合物添加之前)和测试化合物添加后72小时，使用3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基溴化四唑(MTT)染料还原测试评价生长。吸光度在Fluostar Optima(BMGLabtech，德国)上在450nm的波长处进行读数。使用GraphPad Prism分析数据，并且相应地计算与对照相比较由于测试化合物的抑制百分比。

化合物A1引起T淋巴瘤(MOLT-4、Jurkat、CCRF-CEM、Hut-78和HuT-102)细胞活力中的减少，其中对于测试的剂量范围GI₅₀值范围为2.5-12.8μM。另外，化合物A1经过72小时温育期不展示任何明显的细胞毒性。

测定3：在白血病细胞系中的AKT磷酸化的抑制

MOLT-4、Jurkat、CCRF-CEM和Hut-78细胞与所需浓度的化合物一起温育48小时。使细胞裂解，并且通过蛋白质印迹测定pAKT。使用ImageJ定量条带且针对肌动蛋白进行标准化。

化合物A1引起T淋巴瘤(MOLT-4、Jurkat、CCRF-CEM和Hut-78)细胞系中的pAKT表达的减少，其中对于测试的剂量范围EC₅₀值范围为0.02-1.6μM。

测定4：来自人全血的嗜碱性粒细胞中的PI3Kδ和γ信号传导的抑制

通过抗FcεR1或fMLP诱导的CD63表达的改变体现的嗜碱性粒细胞中的PI3Kδ和γ信号传导是使用试剂盒(Buhlmann Laboratories，瑞士)测定的有用的药效学标记物。测试程序涉及下述步骤：

·通过将静脉穿刺管颠倒几次混合抗凝血样；

·制备适合于流式细胞术测量的新鲜和无热原的3.5ml聚丙烯或聚苯乙烯管；

·将49μl患者的全血加入每个管中；

·将1μl 10％DMSO(本底)或测试化合物(10％DMSO)加入指定管中，并且轻轻混合。在室温下温育15分钟；

·将50μl刺激缓冲液(本底)或抗FcgRI Ab或fMLP移液到每个管；

·将100μl刺激缓冲液加入每个管中；

·轻轻混合。将20μl染色试剂(FITC-CD63和PE-CCR3的1∶1混合物)加入每个管中；

·轻轻混合，覆盖管且在37℃下在水浴中温育15分钟(由于较不有效的热转移，使用培养箱将花费长10分钟的温育时间)；

·将2ml预温的(18-28℃)裂解试剂加入每个管中，轻轻混合；

·在18-28℃下温育5-10分钟；

·将管以500xg离心5分钟；

·通过使用吸墨纸倾析上清液；

·用300-800μl洗涤缓冲液使细胞团块重悬浮；和

·轻轻涡旋且在相同天内在流式细胞仪上获得数据。

在门控的嗜碱性粒细胞群体内的CD63阳性细胞百分比在不同处理组中进行测定，并且针对媒介物对照进行标准化。

化合物A1显示出关于FcεR1(PI3K δ)＜30nM的EC₅₀和关于fMLP(PI3Kγ)＜70nM的IC₅₀(n＝1)。

测定4A：细胞活性证实化合物A1针对PI3Kδ和PI3Kγ同种型的选择性

测定4A1：抗IgM诱导的B细胞增殖(对于PI3Kδ选择性)

该研究的目的是评价化合物A1对抗IgM诱导的人B细胞增殖的抑制潜力。

铺平板和处理

·将经分离的B细胞重悬浮至1.0x 10⁶个细胞/ml。将100μl细胞悬浮液加入96孔板的每个孔中。维持一式三份。

·加入50μl药物稀释物且充分混合。维持DMSO空白对照和诱导剂空白对照。

·经处理的板在37℃、5％CO₂下温育30分钟，并且随后加入50μl 4X诱导剂且通过抽吸混合。

·板在37℃、5％CO₂下温育72小时。

·吸出培养基，并且加入150μl DMSO以溶解甲晶体。

·吸光度在A₅₆₀和A₆₄₀nm处进行读数。

数据证实化合物A1对PI3Kδ介导的人B细胞增殖的诱导的抑制潜力。参见例如，Baeker等人，Journal of Immunology，134：3532-3538，1985。

测定4A2：LPA在3T3成纤维细胞中诱导AktS473磷酸化(对于PI3Kβ选择性)

该研究的目的是测定化合物A1对3T3成纤维细胞中PI3Kβ激酶介导的LPA诱导的AktS473磷酸化的作用。

·3T3细胞用所需浓度的测试化合物处理15分钟。加入1ml 2X LPA，使得最终浓度为5μM且温育5分钟。

·弃去培养基且用1ml冰冷的1X PBS洗涤。

·加入250μl细胞裂解缓冲液且在冰上温育30分钟。

·将样品离心且使上清液维持在-80℃下直至分析时。

·样品使用pAKT(S473)作为一抗和抗兔IgG-HRP作为二抗通过蛋白质印迹进行分析。

·条带的强度使用ImageJ 1.42q(NIH，USA)进行测定，并且针对肌动蛋白(上样对照)进行标准化。数据使用GraphPad Prism(版本5.02)进行标绘。

结果证实化合物A1超过PI3K的β同种型的选择性。参见Albuquerque等人，J.Biol.Chem.，278，39830-39838，2003。

测定4A3：c5a在RAW 2647巨噬细胞中诱导AktS473磷酸化(对于PI3Kγ选择性)

该研究的目的是测定化合物A1对RAW 264.7巨噬细胞中PI3Kγ激酶介导的c5a诱导的AktS473磷酸化的作用。

·RAW 264.7细胞用所需浓度的测试化合物处理15分钟。加入1ml 2Xc5a，使得最终浓度为50ng/ml且温育15分钟。

·弃去培养基且用1ml冰冷的1X PBS洗涤。

·加入250μl细胞裂解缓冲液且在冰上温育30分钟。

·将样品离心且使上清液贮存于-80℃下直至分析时。

·样品使用pAKT(S473)作为一抗和抗兔IgG-HRP作为二抗通过蛋白质印迹进行分析。

·条带的强度使用ImageJ 1.42q(NIH，USA)进行测定，并且针对肌动蛋白(上样对照)进行标准化。数据使用GraphPad Prism(版本5.02)进行标绘。

pAktS473(PI3Kγ信号传导的下游标记物)的抑制提示化合物A1在c5a诱导的RAW264.7细胞中由Akt调节的致癌途径中的作用。参见To等人，Am.J.Respir.Crit.Care Med.，182，897-904，2010。

测定4A4：PDGF存3T3细胞中诱导Akt磷酸化(对干PI3K α选择性)

该研究的目的是测定化合物A1对PDGF诱导的3T3成纤维细胞中PI3Kα激酶介导的AktS473磷酸化的作用。

·3T3细胞用所需浓度的测试化合物处理15分钟。加入1ml 2X PDGF，使得最终浓度为20ng/ml且温育10分钟。

·弃去培养基且用1ml冰冷的1X PBS洗涤。

·加入250μl细胞裂解缓冲液且在冰上温育30分钟。

·将样品离心并且将上清液收集且贮存于-80℃下直至分析时。

·样品使用pAKT(S473)作为一抗和抗兔IgG-HRP作为二抗通过蛋白质印迹进行分析。

·条带的强度使用ImageJ 1.42q(NIH，USA)进行测定，并且针对肌动蛋白(上样对照)进行标准化。数据使用GraphPad Prism(版本5.02)进行标绘。

在10μM化合物A1时未观察到抑制，证实化合物A1超过PI3K的α同种型的选择性。参见Albuquerque等人，J.Biol.Chem.278，39830-39838，2003。

下表6概括了来自测定4A1-4A4的结果。

表6

测定5：白血病细胞系中的细胞凋亡的抑制

白血病细胞中的细胞凋亡使用原位Caspase 3试剂盒(Millipore，US)如下文概述的进行测定：

·将白血病细胞以1X10⁶个细胞/孔的密度种植在6孔板中

·加入以所需浓度的测试化合物/DMSO

·使板在37℃下在5％CO₂培养箱中温育24小时

·将细胞收集在2ml离心管中

·加入1.6μL新鲜制备的5X FLICA试剂且通过稍微轻弹管混合细胞

·使管在37℃下在5％CO₂下温育1小时

·将2ml 1X洗涤缓冲液加入每个管中且混合

·使细胞以＜400x g在室温下离心5分钟。

·小心取出且弃去上清液，并且使细胞团块轻轻涡旋，以破坏任何细胞间聚集。

·将细胞团块重悬浮于300ul 1X洗涤缓冲液中

·将100μL每种细胞悬浮液置于空白微量滴定板的两个孔各自内。避免产生气泡。

·使用490nm的激发波长和520nm的发射波长读取每个微孔的吸光度。

·计算通过与对照空白相比较荧光中的增加体现的半胱天冬酶-3活性中的增加百分比。

测定6A：人PBMC中的细胞因子测定

该研究的目的是评价化合物A1对人PBMC中抗原诱导的细胞因子释放的抑制潜力。

铺平板和处理

·肝素化的人全血用PBS进行1∶1稀释，覆盖在白细胞分离培养基上，且以400g离心40分钟。

·取出血沉棕黄层且用PBS洗涤。

·将0.15*10⁶个PBMC以100μl/孔在RPMI培养基中铺平板且温育2小时。

·加入50μl在培养基中的3X化合物稀释物且温育15分钟。

·TNFα-用50μl在RPMI中的LPS诱导，使得最终浓度为1μg/ml。在6小时时收集上清液。

·IL-2-用50μl在RPMI中的PHA诱导，使得最终浓度为20μg/ml。在24小时时收集上清液。

·IL-4-用50μl在RPMI中的PHA诱导，使得最终浓度为20μg/ml。在48小时时收集上清液。

·使用来自eBioscience的试剂盒执行ELISA。

·使用GraphPad Prism 5计算EC₅₀。

EC₅₀值由2-3次独立实验进行计算。化合物A1分别以7.1、9.5和3.5nM的EC₅₀抑制抗原诱导的TNFα、IL-2和IL-4。

测定6B：在人或小鼠全血中LPS诱导的CD19或CD45R的抑制

测定化合物A1对调节人或小鼠B淋巴细胞的B细胞受体(BCR)活化的增殖的作用。CD19是存在于在发育至B细胞胚细胞的期间来自可最早识别的B谱系细胞的B细胞上的蛋白质，然而，在成熟为浆细胞时丧失。LPS是内毒素和环境微生物的主要组分，经由BCR信号传导途径对B细胞具有有力的促有丝分裂活性。

稀释的人全血用DMSO或所需浓度的化合物A1进行处理。样品在化合物添加后用LPS诱导15分钟，并且在37℃和5％CO₂下温育72小时。对于CD45和CD19阳性的细胞通过流式细胞术进行测定，并且数据表示为总群体中的CD19阳性细胞百分比。用化合物A1处理导致通过CD19表达中的减少体现的，LPS诱导的人全血B细胞增殖的剂量依赖性抑制(EC₅₀＝117.7nM)。

类似于CD19，CD45R(B220)在其从早期前B阶段开始的发育自始至终在小鼠B淋巴细胞上表达，并且在终末分化为浆细胞后下调。简言之，稀释的小鼠全血用DMSO或所需浓度的化合物A1进行处理。样品在化合物添加后用LPS诱导15分钟，并且在37℃和5％CO₂下温育72小时。对于CD45和CD45R阳性的细胞通过流式细胞术进行测定。数据表示为总群体中的CD45R阳性细胞百分比。与CD19+细胞增殖数据一致，用化合物A1处理导致通过CD45R表达中的减少体现的，LPS诱导的小鼠全血B细胞增殖的剂量依赖性抑制(EC₅₀＝128.2nM)。

测定6C：在经分离的小鼠脾细胞中的AKT磷酸化的抑制

PI3K途径通过AKT下游调节，所述AKT是调节几种致癌过程例如细胞增殖、生长和存活的丝氨酸-苏氨酸激酶。因为脾是大量B淋巴细胞和T淋巴细胞的储库，所以LPS诱导的AKT磷酸化的抑制使用经分离的小鼠脾细胞进行离体测定。将细胞铺平板且与所需浓度的化合物A1一起温育15分钟，随后与LPS(20μg/mL)一起温育30分钟。在诱导后，使细胞裂解且通过ELISA使用pAKT^S473捕获/检测抗体对和抗小鼠HRP二抗测定pAKT。获得扣除空白的吸光度值，以计算测试样品中的pAKT的抑制百分此。化合物A1在低浓度时引起下游标记物AKT的磷酸化中的剂量依赖性减少(EC₅₀＝347.4nM)，由此阐明信号传导途径。

测定7：在雌性Wistar大鼠模型中脂多糖诱导的肺嗜中性粒细胞增多症

嗜中性粒细胞的过多召募和后续活化很可能对于气道和肺中的几种炎性疾病的发展和过程是重要的，所述炎性疾病例如严重哮喘、慢性阻塞性肺疾病、囊性纤维化和急性呼吸窘迫综合征。嗜中性粒细胞通过其促成这些疾病的机制可涉及蛋白水解酶例如嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和游离氧自由基的释放。当释放时，这些化合物可引起支气管收缩、支气管高反应性、分泌过多、上皮损伤和气道中的组织重塑。

在隔离期后，将禁食动物随机化且取决于其体重分成不同组。测试化合物(化合物A1)制备为在媒介物中的悬浮液，所述媒介物由其中Tween 80作为悬浮剂的0.5％甲基纤维素组成。化合物或媒介物通过经口管饲以10mL/kg的体积施用。雌性Wistar大鼠用氯胺酮进行麻醉，并且在化合物施用后一小时，以1mg/kg的剂量气管内施用LPS溶液。在LPS滴注后6小时，动物在麻醉下放血，并且随后将气管插入插管并且肺通过气管插管用5ml肝素化PBS(1单位/ml)的等分试样灌洗四次(总体积20mL)。支气管肺泡灌洗(BAL)液贮存于2-8℃下，直至测定总细胞和差异白细胞计数时。将支气管肺泡液离心(500×g共10分钟)，并且将所得到的细胞团块重悬浮于0.5ml肝素化盐水中。白血细胞的总数目通过使用血细胞计数器在BAL液或血液中进行测定，并且调整至1×10⁶个细胞/ml。手动计算差异细胞计数。使用Cytospin 3离心一百微升细胞悬浮液，以制备细胞涂片。细胞涂片用血液染色液进行染色用于区分，并且载玻片用显微镜进行观察，以根据其形态特征鉴定嗜酸性粒细胞。测定在细胞涂片中的300个白血细胞中的每个细胞类型数目且表示为百分比。计算每种BALf或血液中的嗜酸性粒细胞数目。

化合物A1显示与对照组相比较浸润到肺内的嗜中性粒细胞的减少，伴随在10mg/kg时的65.29％抑制，提示在炎症病症中的治疗作用。结果显示于图1中。

测定8：脂多糖诱导的大鼠空气袋炎症模型

雌性Wistar大鼠(175-200g)在实验开始前适应环境七天。动物基于其体重随机分布至不同组。动物用醚进行麻醉，并且皮下空气袋通过在肩胛间区中的皮肤下注射20ml无菌空气进行制备(第0天)，且在第4天时用无菌过滤空气的第二次10ml注射维持。在第6天时，经口处理通过在第6天时LPS溶液的s.c注射在炎症诱导之前1小时开始。在无菌盐水(100μg/kg)中溶解的5ml LPS溶液体积注射到每个袋内。通过用5ml无菌盐水冲洗袋且抽取4ml流体，在LPS施用后6小时获取袋流体的样品。使用血球计用显微镜测定袋流体中存在的白细胞数目。通过用Diff-Quik染色流体涂片的显微镜检查测定差异细胞含量。

化合物A1引起嗜中性粒细胞迁移到大鼠空气袋内的剂量依赖性减少，具有2.65mg/kg的ED₅₀，提示在类风湿性关节炎中的治疗作用。结果显示于图2中。

测定9：在雄性豚鼠中的卵白蛋白诱导的肺嗜酸性粒细胞增多症

在隔离期后，通过眼眶丛方法从每只个别动物的眶静脉收集0.3ml血样，并且在细胞分析器(ADVIA 2120，Siemens)上进行分析。基于其总细胞计数，将豚鼠随机化且分成不同组。耳廓用不能拭除的标记笔进行标记用于鉴定。在第0天时，记录重量，并且腹膜内使用50μg卵白蛋白(OVA)和10mg明矾溶液(1ml)使动物致敏。在第7天和第14天时，重复上述致敏方案。动物就任何病体征或对致敏的反应观察直至第19天时，且如果存在的话进行记录。在第19、20和21天时，在通过经口管饲用测试化合物处理后，30分钟后，使动物分别暴露于0.5％w/v、0.5％和1％卵白蛋白攻击。对照和假组动物用0.5％w/v甲基纤维素(媒介物)进行处理。假对照组在第0、7和14天时用10mg明矾进行致敏，并且在第19、20和21天时，暴露于具有相同雾化率的盐水溶液(SAL)。在最后一次OVA攻击后二十小时，气道高反应性通过全身体积描记器针对乙酰甲胆碱攻击的累积剂量(75、100、125和150μg/ml)进行测量。在测量气道应答后，收集血样和BAL液。通过使用neubuear室在显微镜下就总细胞计数分析样品，并且手动完成差异白细胞计数。

测定10：鼠哮喘模型

在隔离期后，基于其体重，将小鼠随机化且分成四组(n＝7)。尾部用不能拭除的标记笔进行标记用于鉴定。在第0天时，记录重量，并且腹膜内使用100μg卵白蛋白和10mg明矾溶液(0.2ml)使动物致敏。

在第7天和第14天时，重复上述致敏方案。动物就任何病体征或对致敏的反应观察直至第24天时，且如果存在的话进行记录。在第24、25和26天时，在通过经口管饲用测试化合物处理后，30分钟后，使动物暴露于10％w/v卵白蛋白攻击。

对照和假组动物用0.5％w/v甲基纤维素(媒介物)进行处理。假对照组在第0、7和14天时用10mg明矾进行致敏，并且在第24、25和26天时，暴露于具有相同雾化率的盐水溶液。

在最后一次OVA攻击后四十八小时，气道高反应性通过全身体积描记器针对乙酰甲胆碱攻击的累积剂量(2.5、10、50和100mg/ml)进行测量。在测量气道应答后，收集血样和BAL液。通过使用neubuear室在显微镜下就总细胞计数分析样品，并且手动完成差异白细胞计数。

测定11：Wistar大鼠中的胶原诱导的关节炎(CIA)

雌性wistar大鼠在实验开始前适应环境七天，并且基于其体重随机分布至不同组。在第0天时，动物通过在尾基部处递送的用含有MTB(4mg/mL)的完全弗氏佐剂(IFA)乳化的500μg牛胶原II型的皮内注射进行处理。在初次免疫接种后第7天时，动物通过在尾基部处的皮内注射，通过在不完全弗氏佐剂中的300μg CII的加强注射进行处理。在踝关节中的关节炎发作通常在第12和14天之间变得视觉可见。动物从关节炎发作后的第二天用测试化合物或媒介物(经口施用)进行处理，并且处理继续直至接下来连续9天。关节炎得分通过在研究期自始至终定期的关节炎症体征的目视检查获取。体重、爪体积和爪厚度的测量在第0、1、3、5、7、9和10天时获取。在十天处理后，在研究结束时，血液在尸检时抽取且加工为血清或血浆，并且获取所有关节，并且在从每个关节获取小片组织后，前爪和后爪两者均在10％福尔马林中固定用于组织病理学分析，且贮存于-80℃下用于组织匀浆物中的细胞因子分析。关于前爪和后爪的临床评分标准：0＝正常；1＝一个后爪或前爪关节受累或最低限度弥漫性红斑和肿胀；2＝两个后爪或前爪关节受累或轻度弥漫性红斑和肿胀；3＝三个后爪或前爪关节受累或中度弥漫性红斑和肿胀；4＝明显弥漫性红斑和肿胀，或＝四个指关节受累；5＝全爪严重弥漫性红斑和严重肿胀，无法屈指。

在大鼠CIA模型中治疗给药的化合物A1证实在预防爪(图3C)和治疗爪(图3D)两者中观察到的临床得分(图3A和3B)减少中的显著功效。

在大鼠CIA模型中治疗给药的化合物A1证实减少后爪的平均爪体积(图4A和4B)和踝直径(图4C和4D)两者中的显著功效。

组织学分析：通过所有后爪和前爪的组织病理学观察到的，在大鼠CIA模型中治疗给药的化合物A1证实在炎症抑制(58.3％，参见图4A)、软骨(46.51％，参见图4B)和血管翳(49.18％，参见图4C)中的显著功效。

与对照组动物相比较，关节炎的发病率和进展在处理组中显著减少(图5)。

测定12：雄性Balb/c小鼠中的急性香烟烟气诱导的细胞浸润

动物(雄性Balb/c小鼠)在实验开始前适应环境七天。动物随后基于其体重随机分布至不同组。在第1天时，小鼠通过经口/鼻内途径施用测试化合物或媒介物，并且在1小时后，施用测试化合物的动物置于全身暴露箱中。在第1天和第2天时，小鼠暴露于6根香烟的主流烟气，在第3天时暴露于8根香烟的主流烟气，并且在第4天时暴露于10根香烟的主流烟气。对每根香烟的烟气的暴露将持续10分钟。香烟在前两分钟内完全燃烧，随后为用动物呼吸机的空气流动，并且接下来20分钟将暴露于新鲜的室内空气。在每第二根香烟后，进行暴露于新鲜的室内空气20分钟的另外休息。对照动物暴露于室内空气室。从第1天到第4天，动物通过经口或鼻内途径施用测试化合物。在第5天时，在最后一次香烟烟气(CS)暴露后24小时，动物在麻醉下放血，并且将气管插入插管并且肺通过气管插管用0.5-ml肝素化PBS(1单位/ml)的等分试样灌洗四次(总体积2mL)。收集的支气管肺泡(BAL)贮存于2-8℃下，直至测定总细胞和差异白细胞计数时。将BAL液离心(500×g共10分钟)，并且将所得到的细胞团块重悬浮于0.5ml肝素化盐水中。白血细胞的总数目使用血细胞计数器在BAL液或血液中进行测定，并且调整至1×10⁶个细胞/ml。手动计算差异细胞计数。使用Cytospin 3离心四十微升细胞悬浮液，以制备细胞涂片。细胞涂片用血液染色液进行染色用于区分，并且用显微镜进行观察，以根据其形态特征鉴定嗜酸性粒细胞。测定在细胞涂片中的300个白血细胞中的每个细胞类型数目且表示为百分比，并且计算每种BAL液中的嗜中性粒细胞和巨噬细胞数目。

测定13：Balb/c小鼠模型中的咪喹莫特诱导的斑块状银屑病

咪喹莫特(IMQ)是关于TLR7和TLR8的配体，最初用于治疗非黑素瘤皮肤癌。IMQ对小鼠剃光的背部皮肤的局部应用诱导银屑病样皮肤状况，显示出人银屑病病理学特有特征中的大多数，包括棘皮症、角化不全和免疫细胞浸润和IL23/IL17/IL22途径的牵涉。动物(雄性Balb/c小鼠)在实验开始前适应环境七天。动物基于其体重随机分布至不同组。在第0天时，通过毛发去除乳膏的局部应用剃光小鼠的背部皮肤。在第1天时，小鼠通过经口途径施用测试化合物或媒介物，并且在1小时后，接受测试化合物的小鼠接受在剃光的背部皮肤上的62.5mg商购可得的IMQ乳膏(5％；Beselna Cream；Mochida Pharmaceuticals，Tokyo，日本)的局部应用。小鼠用咪喹莫特的局部应用处理接下来连续5天，在测试化合物或媒介物施用后一小时。在每天时的局部应用后，允许动物在回到其笼之前干燥一小时。在IMQ乳膏的最后一次应用后四小时，将小鼠杀死且获得皮肤样品。使用表盘厚度计测量背部皮肤厚度。在测量皮肤厚度后，皮肤样品在10％中性缓冲福尔马林溶液中固定且在石蜡中包埋。脱石蜡的切片用苏木精-伊红(HE)进行染色。表皮厚度通过将每个切片的五个独立视野的值求平均值进行定量。为了评分背部皮肤的炎症的严重性，使用基于人临床银屑病面积和严重性指数(PASI)的客观评分系统。红斑、结痂和增厚在0至4的量表上独立地进行评分：0＝无；1＝轻微；2＝中度；3＝明显；和4＝非常明显。

如图6A和6B中所示，与对照组动物相比较，化合物A1减少背部皮肤厚度、红斑和结痂(如通过组织病理学得分显示的)。

尽管本发明在本文中已就特定实施例而言进行描述，但应理解这些实施例仅是本发明的原理和应用的举例说明。因此应理解可对举例说明性实施例作出众多修饰，并且可设计其他排列，而不背离如上所述的本发明的精神和范围。预期所附权利要求限定本发明的范围，并且由此涵盖在这些权利要求及其等价物范围内的方法和结构。

在本专利申请中引用的所有出版物和专利和/或专利申请以引用的方式并人本文，至每个个别出版物或专利申请特别且个别指出以引用的方式并入本文的相同程度。

Claims (22)

1.一种选自(S)-N-(5-(4-氨基-1-(1-(5-氟-3-(3-氟苯基)-4-氧代-4H-色烯-2-基)乙基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基)-2-甲氧基苯基)甲基磺酰胺及其药学可接受的盐的化合物。

2.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物基本上不含(R)-N-(5-(4-氨基-1-(1-(5-氟-3-(3-氟苯基)-4-氧代-4H-色烯-2-基)乙基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基)-2-甲氧基苯基)甲基磺酰胺及其药学可接受的盐。

3.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物具有大于约95％的对映体过量。

4.(S)-N-(5-(4-氨基-1-(1-(5-氟-3-(3-氟苯基)-4-氧代-4H-色烯-2-基)乙基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基)-2-甲氧基苯基)甲基磺酰胺。

5.根据权利要求4所述的化合物，其中所述化合物基本上不含(R)-N-(5-(4-氨基-1-(1-(5-氟-3-(3-氟苯基)-4-氧代-4H-色烯-2-基)乙基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基)-2-甲氧基苯基)甲基磺酰胺。

6.根据权利要求4所述的化合物，其中所述化合物具有大于约95％的对映体过量。

7.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1-6中任一项所述的化合物和至少一种药学可接受的载体。

8.根据权利要求1-6中任一项所述的化合物在制造用于抑制细胞中的PI3δ激酶的催化活性的药剂中的用途。

9.根据权利要求1-6中任一项所述的化合物在制造用于抑制细胞中的PI3γ激酶的催化活性的药剂中的用途。

10.根据权利要求1-6中任一项所述的化合物在制造用于抑制细胞中的P13δ激酶和PI3γ激酶的催化活性的药剂中的用途。

11.根据权利要求8-10中任一项所述的用途，其中所述抑制在患有疾病、病症或状况的受试者中发生，所述疾病、病症或状况选自增殖性疾病、骨病症、炎性疾病、免疫疾病、神经系统疾病、代谢疾病、呼吸系统疾病、血栓形成和心脏病。

12.根据权利要求1-6中任一项所述的化合物在制造用于治疗有此需要的患者中的白血病的药剂中的用途。

13.根据权利要求1-6中任一项所述的化合物在制造用于治疗有此需要的患者中的哮喘或慢性阻塞性肺疾病的药剂中的用途。

14.根据权利要求1-6中任一项所述的化合物在制造用于治疗有此需要的患者中的类风湿性关节炎、银屑病、狼疮或实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的药剂中的用途。

15.根据权利要求1-6中任一项所述的化合物在制造用于治疗有此需要的患者中的慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、霍奇金淋巴瘤(HL)、急性髓性白血病(AML)、多发性骨髓瘤(MM)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)或惰性非霍奇金淋巴瘤(I-NHL)疾病的药剂中的用途。

16.根据权利要求1-6中任一项所述的化合物在制造用于治疗疾病、病症或状况的药剂中的用途，所述疾病、病症或状况将获益于抑制PI3 δ/γ激酶的催化活性。

17.根据权利要求1-6中任一项所述的化合物在制造用于治疗PI3K相关疾病、病症或状况的药剂中的用途。

18.根据权利要求17所述的用途，所述治疗还包括施用选自抗癌剂、抗炎剂、免疫抑制剂、甾体、非甾体抗炎药、抗组胺药、镇痛药及其混合物的另外的活性剂。

19.根据权利要求17所述的用途，其中所述PI3K相关疾病、病症或状况是免疫系统相关疾病、涉及炎症的疾病或病症、癌症或其他增殖性疾病、肝脏疾病或病症、或者肾脏疾病或病症。

20.根据权利要求17所述的用途，其中所述PI3K相关疾病、病症或状况选自白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、毛细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、急性和慢性髓性白血病、骨髓增生异常综合征和前髓细胞性白血病、银屑病、类风湿性关节炎、骨关节炎、哮喘、COPD、变应性鼻炎和红斑狼疮。

21.一种选自

(S)-2-(1-(4-氨基-3-(4-甲氧基-3-硝基苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)乙基)-5-氟-3-(3-氟苯基)-4H-色烯-4-酮，

(S)-2-(1-(4-氨基-3-(3-氨基-4-甲氧基苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)乙基)-5-氟-3-(3-氟苯基)-4H-色烯-4-酮，

及其盐的化合物。

22.一种用于制备式(A1)的化合物的方法，

所述方法包括下述步骤：

(a)在Mitsunobu条件下，使用三苯基膦和偶氮二羧酸二异丙酯，使(R)-5-氟-3-(3-氟苯基)-2-(1-羟乙基)-4H-色烯-4-酮

与3-(4-甲氧基-3-硝基苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-胺反应，

以获得(S)-2-(1-(4-氨基-3-(4-甲氧基-3-硝基苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)乙基)-5-氟-3-(3-氟苯基)-4H-色烯-4-酮(中间产物3)

(b)使中间产物3还原，以获得(S)-2-(1-(4-氨基-3-(3-氨基-4-甲氧基苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)乙基)-5-氟-3-(3-氟苯基)-4H-色烯-4-酮(中间产物4)

(c)使中间产物4与甲磺酰氯反应，以获得式(A1)的化合物。