KR20170016489A

KR20170016489A - Pi3 델타 및 감마 단백질 키나제의 선택적 이중 저해제로서 치환된 크로멘 유도체

Info

Publication number: KR20170016489A
Application number: KR1020177000926A
Authority: KR
Inventors: 프라샨트 카쉬나쓰 바바르; 스와루프 쿠마르 벤카타 사티야 박칼란카
Original assignee: 리젠 파마슈티컬스 소시에떼 아노님
Priority date: 2014-06-27
Filing date: 2015-06-26
Publication date: 2017-02-13
Also published as: CL2016003328A1; JP2017526631A; CO2017000687A2; US9708329B2; CN106661029B; AU2015278699B2; WO2015198289A1; ES2708748T3; JP6557266B2; US20200199133A1; US20170204106A1; EA201692297A1; PH12016502572A1; IL249740A0; EP3160968A1; EA031135B1; US10179786B2; CA2951370A1; DK3160968T3; NZ727214A

Abstract

본 발명은 선택적 이중 델타(δ) 및 감마(γ) PI3K 단백질 키나제 조절제 (S)-N-(5-(4-아미노-1-(1-(5-플루오로-3-(3-플루오로페닐)-4-옥소-4H-크로멘-2-일)에틸)-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-3-일)-2-메톡시페닐) 메탄 설폰아마이드, 이들의 제조방법, 이들을 함유하는 약제학적 조성물 및 이들을 이용하는 PI3K 키나제 매개 질환 또는 장애의 치료, 예방 및/또는 개선 방법에 관한 것이다.

Description

PI3 델타 및 감마 단백질 키나제의 선택적 이중 저해제로서 치환된 크로멘 유도체{SUBSTITUTED CHROMENE DERIVATIVES AS SELECTIVE DUAL INHIBITORS OF PI3 DELTA AND GAMMA PROTEIN KINASES}

본 발명은 2014년 6월 27일자로 출원된 인도 특허 출원 제3144/CHE/2014호의 유익을 주장하며, 이 기초출원은 그의 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다.

본 발명의 기술분야

본 발명은 이중 델타(δ) 및 감마(γ) PI3K 단백질 키나제 조절제, 이들의 제조방법, 이들을 함유하는 약제학적 조성물 및 이들을 이용하는 PI3K 키나제 매개 질환 또는 장애의 치료, 예방 및/또는 개선 방법을 제공한다.

포스포이노시타이드-3 키나제(PI3K)는 지질 2차 전령을 생성하는 포스포이노시타이드 지질(PI)의 이노시톨 고리의 3번 위치 하이드록실기를 인산화하는 세포내 지질 키나제의 분류에 속한다. PI3K의 α 및 β 동형은 그들의 분포가 흔하지만, PI3K의 δ 및 γ 형태의 발현은 순환하는 혈행성 세포 및 내피세포로 제한된다. PI3Kα 또는 PI3Kβ와 달리, PI3Kδ 또는 PI3Kγ의 발현이 없는 마우스는 임의의 불리한 표현형을 나타내지 않는데, 이는 이들 특이적 동형의 표적화가 명백한 독성을 초래하지 않는다는 것을 나타낸다.

최근에, PI3K 경로의 표적화된 저해제는 면역조절제로서 제시되었다. 이런 관심은 PI3K 경로가 주로 막 결합 2차 전령인 포스파티딜이노시톨(3,4,5)-트리스포스페이트(PIP3)의 생성을 통해 면역 세포 신호전달에서 다양한 기능을 한다는 사실에 기인한다. PIP3은 단백질 키나제 및 GTP 분해효소를 포함하는 지질 이중층의 세포질 측에 대해 단백질을 동원하여, 면역 세포 접착, 이동, 및 세포-세포 연락의 조절에서 중요한 하류의 신호전달 캐스케이드의 복잡한 네트워크를 개시한다.

4종의 클래스 I PI3K 동형은 그들의 조직 분포가 상당히 다르다. PI3Kα 및 PI3Kβ는 흔하며, 수용체 타이로신 키나제(RTK)의 하류에서 활성화되는 반면, PI3Kδ 및 PI3Kγ는 조혈 및 내피세포로 주로 제한되며, 각각 RTK 및 G 단백질 결합 수용체(G protein coupled receptor: GPCR) 하류에서 활성화된다. 마우스 유전자 연구는 PI3Kα 및 PI3Kβ가 정상 발생에 필수적이라는 것을 나타낸 반면, PI3Kδ 및/또는 PI3Kγ의 상실은 선택적 면역 결핍을 지니면서 생존가능한 새끼를 얻는다.

PI3Kδ 및 PI3Kγ의 발현 패턴 및 기능은, 예를 들어, 류마티스 관절염, 알레르기, 천식, 만성 폐쇄성 폐질환 및 다발성 경화증을 포함하는 다수 질환의 치료를 위한 활성제로서 PI3Kδ/γ 저해제를 개발함에 있어서 많은 관심을 발생시켰다(Hirsch et al., Pharmacol . Ther ., 118, 192-205, 2008; Marone et al., Biochim. Biophys . Acta ., 1784, 159-185, 2008; Rommel et al., Nat. Rev. Immunol., 7, 191-201, 2007; Ruckle et al., Nat. Rev. Drug Discov ., 5, 903-918, 2006). 약학적 방법과 유전적 방법을 둘 다 이용하는 연구는 이들 2종의 동형이 서로 상승적 상호작용을 보여준다는 것을 나타내었다(Konrad et al., J. Biol . Chem., 283, 33296-33303, 2008; Laffargue et al., Immunity, 16, 441-451, 2002). 비만세포에서, 예를 들어, PI3Kδ가 Fc-수용체의 IgE 가교에 대한 반응에서 탈과립에 필수적인 반면(Ali et al., J. Immunol ., 180, 2538-2544, 2008), PI3Kγ는 반응을 증폭시킴에 있어서 중요한 역할을 한다(Laffargue et al., Immunity, 16, 441-451, 2002). PI3Kγ가 중요한 역할을 하며, PI3Kδ가 각각의 과정을 증폭시키는 림프구 귀소 및 호중구 호흡폭발을 포함하는 다른 세포기능에서 유사한 효과가 나타났다. PI3Kδ 및 PI3Kγ의 불필요하지 않지만 관련된 역할은 두 동형이(단독으로 또는 조합하여) 특정 염증 장애에서 가장 잘 표적화된다는 것을 결정하는 것을 어렵게 만든다.

PI3Kδ 및/또는 PI3Kγ가 없거나 또는 PI3Kδ 및 PI3Kγ의 키나제 사멸 변이체를 발현시키는 마우스를 이용하는 연구는 그들의 역할을 이해함에 있어서 가치있는 도구였다. 예를 들어, PI3Kδ 넉아웃 마우스는 감소된 호중구 주화성, 감소된 항체 생성(T 세포 의존적과 독립적 둘 다)(Jou et al., Mol . Cell. Biol ., 22, 8580-8591, 2002), 및 더 적은 수의 성숙 B 세포(Clayton et al., J. Exp . Med ., 196, 753-763, 2002; Jou et al., Mol . Cell. Biol ., 22, 8580-8591, 2002), 및 항-IgM에 대한 반응에서 그들의 증식 감소(Jou et al., Mol . Cell. Biol ., 22, 8580-8591, 2002)를 입증하였다. 이 표현형은 비만세포의 감소된 수 및 증식, 및 약화된 알레르기 반응과 더불어 PI3Kδ 키나제-사멸 변이체에서 그리고 PI3Kδ 선택적 저해제와 함께 복제된다. PI3Kγ 넉아웃(knochout)은 더 다수이지만, 더 적은 반응성의 호중구, 더 적은 수이며 덜 반응성인 대식세포를 함유하며, 수지상 세포는 감소된 비만세포 탈과립(Laffargue et al., Immunity, 16, 441-451, 2002), 더 높은 비의 CD4+ 대 CD8+ T 세포, 증가된 흉선세포 세포자멸사, 활성화된 T 세포 상에서 CXCR3의 감소된 유도 및 감소된 심수축성을 나타내었다. 심장 조직에 대한 이 후자의 효과는 PI3Kγ 저해제를 이용하는 환자의 만성 투약에 대한 문제였다. 그러나, PI3Kγ 키나제-사멸 변이체(단백질의 상실보다는 키나제의 저해를 더 양호하게 모방함)가 유사한 면역 세포 표현형을 나타내지만, 중요하게는 심장 결함을 갖지 않을 때, 이 문제는 크게 완화된다. 심장 효과는 이후에 PI3Kγ의 촉매적 활성보다는 스캐폴딩 효과에 기인하는 것으로 나타났다(문헌[Olusegon et al., Chemistry & Biology, 1, 123-134, 2010], 본 명세서에 인용된 참고문헌을 포함함). 이중 PI3Kδ/PI3Kγ 넉아웃은 생존가능하지만, T 세포 발생 및 흉선세포 생존에서 심각한 결함을 나타내었다. PI3Kγ 넉아웃/PI3Kδ 키나제-사멸 조합은 유사한 표현형을 생성하였는데, 이는 적어도 면역계 내에서, PI3Kδ의 역할이 촉매적 역할만일 가능성이 있다는 것을 시사한다. 넉아웃 및 키나제-사멸 마우스를 이용하는 연구의 해석은 이들 모델이 면역계 정상 상태(steady-state) 사진만을 제공하며, 일시적이고 용량 제한이 없으며, 역학적 면역 반응이 가역적 저해에 대해 반응하는 방법의 충분한 이해를 허용하지 않기 때문에 도전적일 수 있다. 다양한 프로파일을 지니는 선택적 저해제(PI3Kδ, PI3Kγ 및 PI3Kδ/γ)는 면역 세포 활성화에 대한 각각의 PI3K의 상대적 기여를 평가하기 위해 백혈구 신호전달 연구에 필수적이다(Olusegon et al., 상기 참조, 여기에 인용된 참고문헌을 포함).

δ/γ의 이중 저해는 기도 및 다른 자가면역 질환의 알레르기 및 비알레르기 염증에서의 개재 전략으로서 강하게 연루된다. 천식 및 만성 폐쇄성 폐질환(COPD)을 겪고 있는 다양한 세포 과정에서 PI3Kδ 및 PI3Kγ 연루에 대한 과학적 증거는 저해제 연구 및 유전자-표적화 접근으로부터 기인한다(William et.al Chemistry & Biology, 17, 123-134, 2010 및 Thompson, et al. Chemistry & Biology, 17:101-102, 2010). 또한, 몇몇 COPD 환자에서 코르티코스테로이드와 같은 통상적인 치료법에 대한 내성은 PI3K δ/γ 경로의 상향 조절에 기인하였다. 따라서, PI3Kδ/γ 신호전달의 붕괴는 면역-염증 반응에 대응하는 것을 목적으로 하는 신규한 전략을 제공한다. 염증 세포 기능성, 예컨대 백혈구 이동 및 활성화, 및 비만세포 탈과립을 매개함에 있어서 PI3Kδ 및 PI3Kγ에 의한 중추적 역할에 기인하여, 이들 동형을 차단시키는 것은 또한 마찬가지로 류마티스 관절염의 치료를 위한 효과적인 전략일 수 있다. 면역 감시에서 이들 동형의 확립된 임계성을 고려하면, PI3Kδ 및 PI3Kγ 동형을 특이적으로 표적화하는 저해제는 기도 염증 및 류마티스 관절염에서 접하는 면역 반응의 진행을 약화시킬 것으로 예상되었다(William et.al Chemistry & Biology, 17, 123-134, 2010 및 Thompson, et al. Chemistry & Biology, 17:101-102, 2010)

PI3K 및 관련된 단백질 키나제 경로에 관한 검토 및 연구는 문헌[Liu et al., Nature Reviews Drug Discovery, 8, 627-644, 2009); Nathan et. al., Mol Cancer Ther ., 8(1), 2009; Marone et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1784, 159-185, 2008 및 Markman et al., Annals of Oncology Advance Access, 2009년 8월 출판]에 의해 제공되었다. 유사하게는 PI3Kδ 및 PI3Kγ의 역할에 관한 검토 및 연구는 문헌[William et al., Chemistry & Biology, 17, 123-134, 2010 및 Timothy et al. J. Med . Chem ., 55 (20), 8559-8581, 2012]에 의해 제공되었다. 모든 이들 문헌 개시내용은 본 명세서에 그들의 전문이 참고로 포함된다.

IPI-145 및 CAL130과 같은 화합물은 Pi3K δ/γ의 이중 저해제로서 보고되었다(각각 WO2012/008302 및 WO2012/121953). IPI-145는 암, 천식 및 류마티스 관절염을 위한 임상 연구 하에 있다. IPI-45는 최대 내약 용량(maximum tolerated dose: MTD)이 75㎎ BID인 것으로 보고되었다(55th ASH(등록상표)Annual Meeting. New Orleans-LA, Dec 7-10, 2013). 임상 목적을 위해 연구 중인 CAL-130의 보고는 없다.

δ/γ PI3K 키나제-매개 사건과 관련된 질환 및 장애의 치료를 위한 이중 δ/γ PI3K 조절제에 대한 충족되지 않은 필요가 여전히 남아있다.

추가로 국제 특허 공개 WO 11/055215 및 WO 12/151525 및 미국 특허 공개 제2011/0118257호 및 제2012/0289496호를 참고로 하며, 이들 각각은 본 명세서에 그들의 전문이 참고로 포함된다.

본 발명은 PI3K 델타(δ) 및 감마(γ) 단백질 키나제의 선택적 이중 저해제에 관한 것이다. 이들 화합물은 PI3K 관련 질환, 장애 또는 병태, 예를 들어, 증식 질환, 예컨대 암의 치료를 위한 약제학적 조성물에서 사용하기에 적합하다. PI3Kδ와 PI3Kγ 단백질 키나제 둘 다의 저해는 특정 질환 및 장애의 치료에서 유리한 효과를 제공할 수 있다.

본 발명의 선택적 이중 저해제는 N-(5-(4-아미노-1-(1-(5-플루오로-3-(3-플루오로페닐)-4-옥소-4H-크로멘-2-일) 에틸)-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-3-일)-2-메톡시페닐)메탄설폰아마이드, 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 및 이들의 프로드러그를 포함한다. 예를 들어, 선택적 이중 저해제는 다음의 화합물, 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 및 이들의 프로드러그로부터 선택될 수 있다:

(RS)-N-(5-(4-아미노-1-(1-(5-플루오로-3-(3-플루오로페닐)-4-옥소-4H-크로멘-2-일) 에틸)-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-3-일)-2-메톡시페닐)메탄설폰아마이드 (화합물 A); 및

(S)-N-(5-(4-아미노-1-(1-(5-플루오로-3-(3-플루오로페닐)-4-옥소-4H-크로멘-2-일) 에틸)-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-3-일)-2-메톡시페닐)메탄설폰아마이드 (화합물 A1).

일 실시형태에서, 화합물 (S)-N-(5-(4-아미노-1-(1-(5-플루오로-3-(3-플루오로페닐)-4-옥소-4H-크로멘-2-일)에틸)-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-3-일)-2-메톡시페닐)메탄설폰아마이드 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 실질적으로 없거나(예를 들어, 약 10% 미만, 예컨대 약 5중량% 미만, 약 2.5중량% 미만, 약 1중량% 미만, 약 0.1중량% 미만을 함유함) 또는 (R)-N-(5-(4-아미노-1-(1-(5-플루오로-3-(3-플루오로페닐)-4-옥소-4H-크로멘-2-일) 에틸)-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-3-일)-2-메톡시페닐)메탄설폰아마이드 및 이의 약제학적으로 허용 가능한 염이 없다.

다른 실시형태에서, 화합물 (S)-N-(5-(4-아미노-1-(1-(5-플루오로-3-(3-플루오로페닐)-4-옥소-4H-크로멘-2-일)에틸)-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-3-일)-2-메톡시페닐)메탄설폰아마이드 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 약 90% 초과, 예컨대 약 91% 초과, 약 92% 초과, 약 93% 초과, 약 94% 초과, 약 95% 초과, 약 96% 초과, 약 97% 초과, 약 98% 초과, 약 99% 초과, 약 99.5% 초과, 약 99.9% 초과, 또는 약 99.99% 초과의 거울상이성질체 과잉률을 가진다.

일 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 화합물 (S)-N-(5-(4-아미노-1-(1-(5-플루오로-3-(3-플루오로페닐)-4-옥소-4H-크로멘-2-일) 에틸)-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-3-일)-2-메톡시페닐)메탄설폰아마이드(화합물 A1)에 관한 것이다.

다른 실시형태에서, 본 발명은 화합물 (S)-N-(5-(4-아미노-1-(1-(5-플루오로-3-(3-플루오로페닐)-4-옥소-4H-크로멘-2-일)에틸)-1H-피라졸로 [3,4-d]피리미딘-3-일)-2-메톡시페닐)메탄설폰아마이드 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다.

본 발명의 다른 실시형태는 (R)-N-(5-(4-아미노-1-(1-(5-플루오로-3-(3-플루오로페닐)-4-옥소-4H-크로멘-2-일) 에틸)-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-3-일)-2-메톡시페닐)메탄설폰아마이드(화합물 A2), 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 또는 이의 프로드러그이다. 화합물 A2는 PI3K 델타(δ) 단백질 키나제의 저해제이다. 이들 화합물은 PI3K 관련 질환, 장애 또는 병태, 예를 들어, 증식 질환, 예컨대 암의 치료를 위한 약제학적 조성물에서 사용하는데 적합하다.

N-(5-(4-아미노-1-(1-(5-플루오로-3-(3-플루오로페닐)-4-옥소-4H-크로멘-2-일) 에틸)-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-3-일)-2-메톡시페닐)메탄설폰아마이드, 화합물 A1 및 화합물 A2의 화학적 구조를 이하에 나타낸다.

본 발명은 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께 본 발명의 하나 이상의 화합물(예컨대 화합물 A1)을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 약제학적 조성물은 추가적인 활성제(예컨대 이하에 논의하는 항암제 및 활성제) 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 약제학적 조성물은 치료적 유효량의 본 발명의 하나 이상의 화합물을 포함한다.

본 발명의 다른 양상은 N-(5-(4-아미노-1-(1-(5-플루오로-3-(3-플루오로페닐)-4-옥소-4H-크로멘-2-일) 에틸)-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-3-일)-2-메톡시페닐)메탄설폰아마이드의 제조방법에 관한 것이다:

본 방법은 하기 단계들을 포함한다:

(a) 5-브로모-2-메톡시아닐린을

메탄 설폰일 클로라이드와 반응시켜 N-(5-브로모-2-메톡시페닐)메탄설폰아마이드(중간체 1)를 제공하는 단계:

(b) 중간체 1을 비스(피나콜라토)다이보론과, 예를 들어 아세트산칼륨의 존재 하에서 반응시켜, N-(2-메톡시-5-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-다이옥사보롤란-2-일)페닐)메탄설폰아마이드(중간체 2)를 제공하는 단계:

; 및

(c) 2-(1-(4-아미노-3-요오도-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-1-일)에틸)-5-플루오로-3-(3-플루오로페닐)-4H-크로멘-4-온을

염기(예를 들어, 탄산나트륨)의 존재 하에서 중간체 2와 반응시켜 목적으로 하는 화합물 N-(5-(4-아미노-1-(1-(5-플루오로-3-(3-플루오로페닐)-4-옥소-4H-크로멘-2-일) 에틸)-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-3-일)-2-메톡시페닐)메탄설폰아마이드를 제공하는 단계;

(d) 선택적으로 N-(5-(4-아미노-1-(1-(5-플루오로-3-(3-플루오로페닐)-4-옥소-4H-크로멘-2-일) 에틸)-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-3-일)-2-메톡시페닐)메탄설폰아마이드를 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 이의 프로드러그로 전환시키는 단계.

또 다른 실시형태는, 하기 단계들을 포함하는, 하기 화학식 (A1)의 화합물의 제조방법에 관한 것이다:

.

(a) 하기 (R)-5-플루오로-3-(3-플루오로페닐)-2-(1-하이드록시에틸)-4H-크로멘-4-온:

에 하기 3-(4-메톡시-3-나이트로페닐)-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-4-아민:

을 이용하여 (예를 들어, 트라이페닐포스핀 및 다이아이소프로필아조다이카복실레이트의 존재 하에) 미츠노부(Mitsunobu) 반응을 실시하여 하기 (S)-2-(1-(4-아미노-3-(4-메톡시-3-나이트로페닐)-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-1-일)에틸)-5-플루오로-3-(3-플루오로페닐)-4H-크로멘-4-온(중간체 3)을 제공하는 단계:

;

(b) 중간체 3을, 예를 들어 레이니(Raney) Ni과 같은 환원제를 이용하여 환원시켜, 하기 (S)-2-(1-(4-아미노-3-(3-아미노-4-메톡시페닐)-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-1-일)에틸)-5-플루오로-3-(3-플루오로페닐)-4H-크로멘-4-온(중간체 4)을 제공하는 단계:

;

(c) 중간체 4를 메탄설폰일 클로라이드로 처리하여 목적으로 하는 화학식 (A1)의 화합물을 제공하는 단계; 및

(d) 선택적으로 화합물 (A1)을 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 이의 프로드러그로 전환시키는 단계.

또 다른 실시형태는 본 발명의 화합물, 예컨대 (S)-2-(1-(4-아미노-3-(4-메톡시-3-나이트로페닐)-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-1-일)에틸)-5-플루오로-3-(3-플루오로페닐)-4H-크로멘-4-온, (S)-2-(1-(4-아미노-3-(3-아미노-4-메톡시페닐)-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-1-일)에틸)-5-플루오로-3-(3-플루오로페닐)-4H-크로멘-4-온, 및 이들의 염을 제조하는데 유용한 중간체이다.

본 발명의 또 다른 실시형태는 환자에게 유효량의 본 발명의 적어도 하나의 화합물을 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 PI3Kδ 및 PI3Kγ를 저해하는 방법이다.

본 발명의 또 다른 실시형태는 환자에게 유효량의 (R)-N-(5-(4-아미노-1-(1-(5-플루오로-3-(3-플루오로페닐)-4-옥소-4H-크로멘-2-일) 에틸)-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-3-일)-2-메톡시페닐)메탄설폰아마이드(화합물 A2), 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 또는 이의 프로드러그 중 적어도 하나를 투여하는 단계를 포함하는 환자에서 PI3Kδ를 저해하는 방법이다.

본 발명의 또 다른 실시형태는 환자에게 본 발명의 유효량의 적어도 하나의 화합물을 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 PI3K 단백질 키나제 매개 질환, 장애 또는 병태(예컨대 증식 질환 또는 장애, 예를 들어, 암)를 치료, 예방 및/또는 저해하는 방법이다.

본 발명의 또 다른 실시형태는 환자에게 유효량의 본 발명의 적어도 하나의 화합물을 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 PI3K, 특히 PI3Kδ 및 PI3Kγ를 저해하는 방법이다.

본 발명의 또 다른 실시형태는 염증, 자가면역 또는 증식 질환의 치료가 필요한 환자에게 유효량의 본 발명의 적어도 하나의 화합물을 투여하는 단계를 포함하는, 단백질 키나제(예컨대 PI3Kδ 및 PI3Kγ)의 조절을 통한 염증, 자가면역 또는 증식 질환을 치료하는 방법이다. 일 실시형태에서, 본 발명의 화합물은 PI3Kδ와 PI3Kγ를 둘 다 저해한다.

본 발명의 또 다른 실시형태는 염증, 자가면역 또는 증식 질환의 치료가 필요한 환자에게 유효량의 본 발명의 적어도 하나의 화합물을 적어도 하나의 다른 항-염증, 면역조절제 또는 항암제 또는 이들의 조합물과 병용하여(동시에 또는 순차적으로) 투여함으로써 단백질 키나제(예컨대 PI3Kδ 및 PI3Kγ)의 조절을 통해 염증, 자가면역 또는 증식 질환을 치료하는 방법이다. 일 실시형태에서, 본 발명의 화합물은 PI3Kδ와 PI3Kγ를 둘 다 저해한다.

본 발명의 화합물은 하기를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다양한 암의 치료에서 유용하다:

방광, 유방, 결장, 신장, 간, 폐(소세포 폐암을 포함), 식도, 쓸개, 난소, 췌장, 위, 자궁경부, 갑상선, 전립선 및 피부(소세포 암종을 포함)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 암종;

백혈병, 급성 림프성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, B-세포 림프종, T-세포 림프종, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 모발세포 림프종 및 버킷 림프종을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 림프 계통의 조혈 종양;

급성 및 만성 골수성 백혈병, 골수이형성 증후군 및 전골수성 백혈병을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 골수 계통의 조혈 종양;

섬유육종 및 횡문근육종을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 중간엽 유래 종양;

성상세포종, 신경아세포종, 신경교종 및 신경초종을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 중추 및 말초 신경계의 종양; 및

흑색종, 정상피종, 기형암종, 골육종, 색소성건피증, 각화극세포종, 갑상선 여포암 및 카포시 육종을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다른 종양.

일 실시형태에서, 유효량의 본 발명의 화합물은 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, B-세포 림프종, T-세포 림프종, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 모발세포 림프종, 버킷 림프종, 급성 및만성 골수성 백혈병, 골수이형성 증후군 또는 전골수성 백혈병을 치료하기 위해 투여된다.

일반적으로 세포 증식의 조절에서 단백질 키나제의 중요한 역할에 기인하여, 본 발명의 화합물은 가역적 세포정지제로서 작용할 수 있고, 따라서, 예를 들어, 전립선 비대증, 가족성 선종성 용종증, 신경섬유종, 죽상동맥경화증, 폐섬유증, 관절염, 건선, 사구체 신염, 혈관성형술 후 재협착 또는 혈관 수술, 비대성 흉터 형성, 염증성 장 질환, 이식 거부, 내독소 쇼크, 및 진균 감염과 같은 비정상 세포 증식을 특징으로 하는 임의의 질환 과정의 치료에서 유용할 수 있다.

세포자멸사의 조절제로서 본 발명의 화합물은 암(본 명세서에서 상기 언급한 유형의 것을 포함하지만, 이들로 제한되지 않음), 바이러스 감염(헤르페스 바이러스, 폭스바이러스, 엡스타인 바르 바이러스, 신드비스 바이러스 및 아데노바이러스를 포함하지만, 이들로 제한되지 않음), 자가면역 질환(전신성 홍반성 낭창, 자가면역 매개 사구체 신염, 류마티스 관절염, 건선, 염증성 장 질환, 및 자가면역 진성 당뇨병을 포함하지만, 이들로 제한되지 않음), 신경퇴행성 장애(알츠하이머병, AIDS-관련 치매, 파킨슨병, 근위축성측색 경화증, 망막 색소 변성증, 척수성 근위축증 및 소뇌 변성을 포함하지만, 이들로 제한되지 않음), 골수이형성 증후군, 재생불량성 빈혈, 심근경색증과 관련된 허혈손상, 뇌졸중 및 재관류 손상, 부정맥, 죽상동맥경화증, 독소-유발 또는 알코올 관련 간 질환, 혈액 질환(만성 빈혈 및 재생불량성 빈혈을 포함하지만, 이들로 제한되지 않음), 근골격계의 퇴행성 질환(골다공증 및 관절염을 포함하지만, 이들로 제한되지 않음) 아스피린-민감성 부비동염, 낭포성 섬유증, 다발성 경화증, 신장 질환 및 암 통증의 치료에서 유용하다. 본 발명의 화합물은 HIV-감염 개체에서 AIDS 발생의 예방, 저해 또는 억제에서 유용하다.

본 발명의 화합물은 세포 RNA 및 DNA 합성 수준을 조절할 수 있다. 따라서, 본 발명의 화합물은 HIV, 인유두종 바이러스, 헤르페스 바이러스, 폭스바이러스, 엡스타인-바르 바이러스, 신드비스 바이러스 및 아데노바이러스를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 바이러스 감염의 치료에서 유용하다.

본 발명의 화합물은 암의 화학적 암 예방에서 유용하다. 화학적 암 예방은 초기 돌연변이 유발 사건을 차단함으로써 또는 이미 발작으로 고통받은 전암성 세포의 진행을 차단함으로써 또는 종양 재발을 저해함으로써 침습성 암의 발생을 저해하는 것으로 본 명세서에서 정의된다. 본 발명의 화합물은 또한 종양 신생혈관 생성 및 전이를 저해함에 있어서 유용하다. 본 발명의 일 실시형태는 신생혈관 생성 또는 전이의 저해가 필요한 환자에서 유효량의 본 발명의 하나 이상의 화합물을 투여함으로써 신생혈관 생성 또는 전이를 저해하는 방법이다.

본 발명의 다른 실시형태는 면역계-관련 질환 또는 면역 장애(예를 들어, 자가면역 질환), 염증을 수반하는 질환 또는 장애(예를 들어, 천식, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 류마티스 관절염, 염증성 장 질환, 사구체 신염, 신경염증 질환, 다발성 경화증, 포도막염 및 면역계의 장애), 암 또는 기타 증식 질환, 간질환 또는 장애, 신장질환 또는 장애를 치료하는 방법이다. 상기 방법은 유효량의 본 발명의 하나 이상의 화합물을 투여하는 단계를 포함한다.

면역 장애의 예는 건선, 류마티스 관절염, 혈관염, 염증성 장 질환, 피부염, 골관절염, 천식, 염증성 근육 질환, 알레르기 비염, 질염, 간질성 방광염, 경피증, 골다공증, 습진, 동종이식 또는 이종이식(기관, 골수, 줄기세포 및 기타 세포 및 조직) 이식편 거부, 이식편대숙주병, 홍반성 낭창, 염증성 질환, I형 당뇨병, 폐섬유증, 피부근육염, 쇼그렌 증후군, 갑상선염(예를 들어, 하시모토 및 자가면역 갑상선염), 중증 근무력증, 자가면역용혈성 빈혈, 다발성 경화증, 낭포성 섬유증, 만성 재발 췌장염, 원발성 담즙성 간경변, 알레르기 결막염 및 아토피성 피부염을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.

일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 화합물은 이식편 거부, 동종이계 또는 이종성 이식 거부(기관, 골수, 줄기세포, 기타 세포 및 조직), 및 이식편대숙주병을 예방하기 위한 면역억제제로서 유용하다. 일 특정 실시형태에서, 이식편 거부는 조직 또는 기관 이식물로부터 초래된다. 추가 실시형태에서, 이식편대숙주병은 골수 또는 줄기 세포 이식으로부터 초래된다. 본 발명의 일 실시형태는 유효량의 본 발명의 하나 이상의 화합물을 투여하는 단계를 포함하는, 이식편 거부, 동종이계 또는 이종성 이식 거부(기관, 골수, 줄기세포, 기타 세포 및 조직) 또는 이식편대 숙주병의 위험을 예방 또는 감소시키는 방법이다.

본 발명의 화합물은 공지된 항암 치료, 예를 들어, 방사선 치료법과 병용하거나(함께 또는 순차적으로 투여됨) 또는 세포증식억제제 또는 세포독성제 또는 항암제, 예를 들어, DNA 상호작용제, 예컨대 시스플라틴 또는 독소루비신; 토포아이소머라제 II 저해제, 예컨대 에토포사이드; 토포아이소머라제 I 저해제, 예컨대 CPT-11 또는 토포테칸; 천연 유래 또는 합성의 튜불린 상호작용제, 예컨대, 파클리탁셀, 도세탁셀 또는 에포싸일론(예를 들어, 익사베필론); 호르몬제, 예컨대 타목시펜; 티미딜레이트 신타제 저해제, 예컨대 5-플루오로유라실; 및 항-대사물질, 예컨대, 메토트렉세이트, 기타 타이로신 키나제 저해제, 예컨대 이레사(Iressa) 및 OSI-774; 신생혈관 생성저해제; EGF 저해제; VEGF 저해제; CDK 저해제; SRC 저해제; c-Kit 저해제; 성장 인자 수용체에 대한 Her1/2 저해제 및 단클론성 항체, 예컨대 에르비툭스(erbitux: EGF) 및 허셉틴(Her2); BTK 저해제, 예컨대 이브루티닙; 및 기타 단백질 키나제 조절제, 및 이들의 임의의 조합물과 병용하는데 유용하다.

본 발명의 화합물은 또한 1종 이상의 스테로이드 항-염증 약물, 비-스테로이드 항-염증 약물(NSAID) 및 면역 선택적 항-염증 유도체(ImSAID), 및 이들의 임의의 조합물과 병용하는데(함께 또는 순착적으로 투여됨) 유용하다.

본 발명은 추가로 본 발명의 하나 이상의 화합물 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 약제학적 조성물은 1종 이상의 상기 동정한 활성 성분, 예컨대 다른 항암제를 추가로 포함할 수 있다.

또 다른 실시형태는 치료적 유효량의 본 발명의 화합물을 투여하는 단계를 포함하는, 백혈병의 치료가 필요한 환자의 치료방법이다. 일 실시형태에서, 백혈병은 만성 림프구성 백혈병(CLL), 비호지킨 림프종(NHL), 호지킨 림프종(HL), 급성 골수성 백혈병(AML), 다발성 골수종(MM), 소림프구 림프종(SLL), 및 지연성 비호지킨 림프종(I-NHL)으로부터 선택된다.

본 발명의 또 다른 실시형태는 치료적 유효량의 본 발명의 화합물을 투여하는 단계를 포함하는, 자가면역 장애의 치료가 필요한 환자에서 자가면역 장애를 치료하는 방법이다. 일 실시형태에서, 자가면역 장애는 천식, COPD, 류마티스 관절염, 건선, 낭창 및 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)으로부터 선택된다.

본 발명의 또 다른 실시형태는 치료적 유효량의 본 발명의 화합물을 투여하는 단계를 포함하는, 알레르기 비염의 치료가 필요한 환자에서 알레르기 비염을 치료하는 방법이다.

임의의 상기 언급한 방법에서, 본 발명의 화합물(들) 및 선택적 추가적인 활성제는 본 명세서에 기재된 바와 같은 약제학적 조성물의 형태로 투여될 수 있다.

도 1은 분석 7에 기재된 지질다당류 유도 폐 호중구증가증 모델에 따라 화합물 A1(po) 10㎎/㎏으로 처리한 암컷 위스타 래트로부터의 기관지 폐포 세척액(BALF) 중의 호중구 수의 막대 그래프를 도시한 도면.
도 2는 분석 8에 기재된 지질다당류-유도 래트 공기 공기 주머니 염증 모델에 따라 화합물 A1(po) 1, 3 및 10㎎/㎏으로 처리한 위스타 래트로부터의 복막투석액 중의 호중구 수의 막대 그래프를 도시한 도면.
도 3a 및 도 3b는 분석 11에서의 절차에 따라 대조군 또는 화합물 A1 10㎎/㎏/QD로 치료한 콜라겐 유도 관절염을 지니는 위스타 래트에서 뒷발 및 앞발에 대한 개개 임상 스코어 각각 및 임상 스코어에 대한 AUC의 선형 및 막대 그래프를 도시한 도면.
도 3c 및 도 3d는 분석 11에서의 절차에 따라 비히클 또는 화합물 A1 10㎎/㎏/QD로 치료한 콜라겐 유도 관절염을 지니는 위스타 래트에서 뒷발 및 앞발에 대한 개개 임상 스코어 각각의 선형 및 막대 그래프를 도시한 도면.
도 4a 및 도 4b는 분석 11에서의 절차에 따라 비히클 또는 화합물 A1 10㎎/㎏/QD로 치료한 콜라겐 유도 관절염을 지니는 위스타 래트에서 뒷발에 대한 용적 및 발 용적의 AUC의 선형 및 막대 그래프를 도시한 도면.
도 4c 및 도 4d는 분석 11에서의 절차에 따라 비히클 또는 화합물 A1 10㎎/㎏/QD로 치료한 콜라겐 유도 관절염을 지니는 위스타 래트에서 뒷발에 대한 발목 직경 및 발목 직경의 AUC에 대한 선형 및 막대 그래프를 도시한 도면.
도 4e 내지 도 4g는 분석 11에서의 절차에 따라 비히클 또는 화합물 A1 10㎎/㎏/QD로 치료한 콜라겐 유도 관절염을 지니는 위스타 래트에서 모든 뒷발 및 앞발의 염증, 연골 및 판누스(pannus)의 저해를 위한 조직병리학적 스코어 각각의 막대 그래프를 도시한 도면.
도 4h는 분석 11에서의 절차에 따라 비히클 또는 화합물 A1의 10㎎/㎏/QD로 치료한 콜라겐 유도 관절염을 지니는 위스타 래트에서 모든 뒷발 및 앞발의 총 조직병리학적 스코어의 막대 그래프를 도시한 도면.
도 5는 분석 11에서의 절차에 따라 비히클 또는 화합물 A1의 10㎎/㎏/QD로 치료한 콜라겐 유도 관절염을 지니는 위스타 래트에서 관절염 발생률의 백분율의 막대 그래프를 도시한 도면.
도 6a 및 도 6b는 분석 13에서의 절차에 따라 Balb/c 마우스에서 이미퀴모드 유도 건선에 대한 화합물 A1(3, 10, 30㎎/㎏)의 항건선 효과를 나타내는 막대 그래프를 도시한 도면.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 달리 표시되지 않는 한 다음의 정의가 적용될 것이다. 추가로, 본 명세서에 정의된 다수의 그룹은 선택적으로 치환될 수 있다. 정의에서 치환체의 열거는 예시적이며, 본 명세서의 다른 곳에 정의된 치환체를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.

특정의 본 명세서에 기재된 화합물은 하나 이상의 비대칭 중심을 함유하고, 따라서 절대 입체화학에 관해, (R)- 또는 (S)-로서 정의될 수 있는 거울상이성질체, 부분입체이성질체 및 기타 입체이성질체 형태가 생길 수 있다. 달리 구체화되지 않는 한, 본 화학적 독립체, 약제학적 조성물 및 방법은 라세미 혼합물, 선택적으로 순수한 형태 및 중간체 혼합물을 포함하는 모든 이러한 가능한 이성질체를 포함하는 것을 의미한다. 예를 들어, 중간체 혼합물의 비제한적 예는 10:90, 13:87, 17:83, 20:80, 또는 22:78의 비로 R: S 또는 S: R 이성질체의 혼합물을 포함한다. 광학 활성인 (R)- 및 (S)- 이성질체는 카이랄 신톤 또는 카이랄 시약을 이용하여 제조되거나, 또는 통상적인 기법을 이용하여 분해될 수 있다. 본 명세서에 기재된 화합물이 올레핀 이중 결합 또는 다른 기하학적 비대칭 중심을 함유할 때, 달리 구체화되지 않는 한, 화합물은 E와 Z 기하학적 이성질체를 둘 다 포함하는 것으로 의도된다.

용어 "호변 이성질체"는 평형상태에서 이성질체 형태의 상대적으로 용이한 상호전환을 특징으로 하는 화합물을 지칭한다. 이들 이성질체는 본 발명이 아우르는 것으로 의도된다. "호변 이성질체"는 호변 이성질체화에 의해 상호 전환되는 구조적으로 별개의 이성질체이다. "호변 이성질화"는 이성질화 형태이며, 산-염기 화학의 서브세트로 고려되는 양성자성 또는 양성자 이동 호변 이성질화를 포함한다. "양성자성 호변 이성질화" 또는 "양성자 이동 호변 이성질화"는 결합 차수의 변화, 종종 단일 결합의 인접한 이중 결합으로의 교환을 수반하는 양성자의 이동을 수반한다. 호변 이성질화가 (예를 들어, 용액 중에서) 가능한 경우, 호변 이성질체의 화학적 평형상태에 도달될 수 있다. 호변 이성질화의 예는 케토-엔올 호변 이성질화이다. 케토-엔올 호변 이성질화의 구체적의 구체적 예는 펜탄-2,4-다이온 및 4-하이드록시펜트-3-엔-2-온 호변 이성질체의 상호전환이다. 호변 이성질화의 다른 예는 페놀-케토 호변 이성질화이다. 페놀-케토 호변 이성질화의 구체적 예는 피리딘-4-올 및 피리딘-4(1H)-온 호변 이성질체의 상호전환이다.

용어 "프로드러그"는 정상 대사 과정에 의해 신체 내에서 활성 형태로 전환되는 화합물의 비활성 전구체인 화합물을 지칭한다. 프로드러그 설계는 일반적으로 문헌[Hardma, et al. (Eds.), Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th ed., pp. 11-16 (1996)]에서 논의된다. 문헌[Higuchi, et al., Prodrugs as Novel Delivery Systems, Vol. 14, ASCD Symposium Series], 및 문헌[Roche (ed.), Bioreversible Carriers in Drug Design, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press (1987)]에서 철저한 논의가 제공된다. 예시를 위해, 프로드러그는, 예를 들어, 에스터 또는 아마이드 결합의 가수분해를 통해 약학적으로 활성인 형태로 전환됨으로써, 얻어진 생성물 상의 작용기를 도입하거나 또는 노출할 수 있다. 프로드러그는 화합물의 약학적 특성, 예를 들어 증가된 순환 반감기를 추가로 향상시키는 수용성 컨쥬게이트를 형성하기 위해 내인성 화합물과 반응하도록 설계될 수 있다. 대안적으로, 프로드러그는, 예를 들어, 글루쿠론산, 황산염, 글루타티온, 아미노산 또는 아세트산염에 의해 작용기 상의 공유적 변형을 겪도록 설계될 수 있다. 얻어진 컨쥬게이트는 비활성화되고 소변으로 배설되거나 모 화합물보다 더 강력하게 제공될 수 있다. 고분자량 컨쥬게이트는 또한 담즙으로 배설되고, 효소적으로 절단되며, 다시 순환으로 방출됨으로써 본래 투여되는 화합물의 생물학적 반감기를 효과적으로 증가시킬 수 있다.

용어 "에스터"는 물의 제거와 함께 산과 알코올 사이의 반응에 의해 형성되는 화합물을 지칭한다. 에스터는 일반식 RCOOR'(여기서, R은 약물이고, R'은 화학기임)으로 표시될 수 있다.

이들 프로드러그 및 에스터는 본 발명의 범주 내에 포함되는 것으로 의도된다.

추가적으로, 본 발명은 또한 하나 이상의 동위원소적으로 풍부한 원자, 예를 들어 수소의 중수소 또는 삼중수소로의 대체, 또는 탄소의 ¹³C- 또는 ¹⁴C-풍부 탄소에 의한 대체의 존재 하에서만 상이한 화합물을 포함한다.

본 발명의 화합물은 또한 이러한 화합물을 구성하는 하나 이상의 원자에서 원자 동위원소의 비천연 비율을 함유할 수 있다. 예를 들어, 화합물은 방사성 동위원소, 예를 들어 삼중수소(³H), 요오드-125(¹²⁵I) 또는 탄소-14(¹⁴C)로 방사성 동위 원소 표지될 수 있다. 본 발명의 화합물의 모든 동위원소 변형은, 방사성이든 아니든, 본 발명의 범주 내에 포함된다.

본 발명의 부분을 형성하는 약제학적으로 허용 가능한 염은 무기 염기, 예컨대 Li, Na, K, Ca, Mg, Fe, Cu, Zn, 및 Mn으로부터 유래된 염; 유기 염기, 예컨대 N,N'-다이아세틸에틸렌다이아민, 글루카민, 트라이에틸아민, 콜린, 하이드록사이드, 다이사이클로헥실아민, 메트포르민, 벤질아민, 트라이알킬아민, 및 티아민의 염; 카이랄 염기, 예컨대 알킬페닐아민, 글리신올, 및 페닐 글리신올; 천연 아미노산의 염, 예컨대 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 노르류신, 타이로신, 시스틴, 시스테인, 메티오닌, 프롤린, 하이드록시 프롤린, 히스티딘, 오미틴, 라이신, 알기닌 및 세린; 본 발명의 화합물의 알킬 할로겐화물, 알킬 황산염, 예컨대 MeI 및 (Me)₂SO₄과의 4차 암모늄 염; 비천연 아미노산, 예컨대 D-이성질체 또는 치환된 아미노산; 구아니딘; 및 치환된 구아니딘을 포함하되, 치환체는 나이트로, 아미노, 알킬, 알켄일, 알킨일, 암모늄 또는 치환된 암모늄염 및 알루미늄염으로부터 선택된다. 염은 적절하다면 황산염, 질산염, 인산염, 과염소산염, 붕산염, 할로겐산염, 아세트산염, 타르타르산염, 말레산염, 시트르산염, 푸마르산염, 숙신산염, 파모산염, 메탄설폰산염, 벤조산염, 살리실산염, 벤젠설폰산염, 아스코르브산염, 글리세로인산염 및 케토글루타르산염일 수 있는 산 부가염을 포함할 수 있다.

범위를 본 명세서에서 물리적 특성, 예컨대 분자량 또는 화학식과 같은 화학적 특성에 대해 사용할 때, 범위의 모든 조합 및 하위조합 및 그것의 구체적 실시형태가 포함될 것으로 의도된다. 용어 "약"은 수 또는 수치적 범위에 대해 언급할 때, 언급되는 수 또는 수치적 범위는 실험적 가변성 내의(또는 통계적인 실험적 오차 내에서) 근삿값이라는 것을 의미하며, 따라서 수 또는 수치적 범위는, 예를 들어, 언급된 수 또는 수치적 범위의 1% 내지 15%에서 변할 수 있다. 용어 "포함하는" (및 관련된 용어, 예컨대 "포함하다(comprise)" 또는 "포함하다(comprises)" 또는 "갖는(having)" 또는 "포함하는(including)")은 해당 실시형태, 예를 들어 기재된 특징으로 "이루어진" 또는 "본질적으로 이루어진" 임의의 조성물 물질, 조성물, 방법 또는 공정 등의 실시형태를 포함한다.

다음의 약어 및 용어는 전체적으로 표시된 의미를 가진다: PI3-K = 포스포이노시타이드 3-키나제; PI = 포스파티딜이노시톨; AIDS = 후천성 면역결핍 증후군; HIV = 인간 면역 결핍 바이러스; MeI = 요오드화메틸; ND: 결정되지 않음.

본 명세서에서 사용되는 약어는 화학적 및 생물학적 분야 내의 그들의 통상적인 의미를 가진다.

용어 "세포 증식"은 분할 결과로서 세포 수가 변화된 현상을 지칭한다. 이 용어는 또한 세포 형태가 증식 신호와 일치되게 변한(예를 들어, 크기가 증가된) 세포 성장을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "공동 투여", "병용하여 투여되는" 및 그들의 문법적 동의어는 동물에 대한 2 이상의 제제의 투여를 포함하며, 따라서 제제 및/또는 그들의 대사물질은 동물에서 동시에 제공된다. 공동투여는 별개 조성물의 동시 투여, 별개 조성물의 상이한 시점의 투여 또는 제제가 둘 다 존재하는 조성물의 투여를 포함한다.

용어 "유효량" 또는 "치료적 유효량"은 이하에 정의되는 바와 같은 질환 치료를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 의도된 용도를 달성하는데 충분한 본 명세서에 기재된 화합물의 해당량을 지칭한다. 치료적 유효량은 의도된 용도(시험관내 또는 생체내), 또는 치료 중인 대상체 및 질환 병태, 예를 들어 대상체의 체중 및 연령, 질환 병태의 중증도, 투여방식 등에 따라서 다를 수 있다. 상기 용어는 또한 표적 세포에서의 특정 반응, 예를 들어 혈소판 접착 및/또는 세포 이동의 감소를 유도할 용량으로 적용된다. 구체적 용량은 선택되는 화합물, 이어질 투약 요법, 다른 화합물과 병용하여 투여되는지의 여부, 투여 시간, 그것이 투여되는 조직 및 그것이 운반되는 물리적 전달 시스템에 따라서 다를 것이다.

본 명세서에 사용되는 바와 같은 "치료", "치료하는" 또는 "개선시키는"은 상호호환적으로 사용된다. 이들 용어는 치료적 이점 및/또는 예방적 이점을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 유리하거나 또는 목적으로 하는 결과를 얻기 위한 접근을 지칭한다. 치료적 이점은 치료 중인 겪고 있는 장애의 근절 또는 개선이다. 또한, 환자가 겪고 있는 장애로 여전히 고통받고 있을 수도 있지만, 치료적 이점은 개선이 환자에서 관찰되도록 겪고 있는 장애와 관련된 생리적 증상 중 하나 이상의 근절 또는 개선에 의해 달성된다. 예방적 이점을 위해, 이들 질환의 진단이 이루어지지 않을 수도 있다고 해도, 조성물은 특정 질환이 발생할 위험에 있는 환자에게, 또는 질환의 생리적 증상 중 하나 이상을 보고한 환자에게 투여될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "치료적 효과"는 상기 기재한 바와 같은 치료적 이점 및/또는 예방적 이점을 포함한다. 예방적 효과는 질환 또는 병태의 출현을 지연 또는 제거하는 것, 질환 또는 병태의 개시를 지연 또는 제거하는 것, 질환 또는 병태의 진행을 늦추거나, 멈추거나 또는 반전시키는 것, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.

용어 "대상체" 또는 "환자"는 동물(예를 들어, 개, 고양이, 말 또는 돼지), 예컨대 포유류, 예를 들어 인간을 지칭한다. 본 명세서에 기재된 방법은 인간 치료 용도와 수의학적 용도 둘 다에서 유용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 환자는 포유류이다. 바람직한 실시형태에서, 환자는 인간이다.

"방사선 치료법"은 실행자에게 알려진 일상적인 방법 및 조성물을 이용하여 환자를 방사선 이미터, 예컨대 알파-입자 방출 방사성핵종(예를 들어, 악티늄 및 토륨 방사성핵종), 저 선에너지 전달(low linear energy transfer: LET) 방사선 이미터(즉, 베타 이미터), 전환 전자 이미터(예를 들어, 스트론튬-89 및 사마륨- 153-EDTMP), 또는 고에너지 방사선(x선, 감마선 및 중성자를 포함하지만 이들로 제한되지 않음)에 노출시키는 것을 의미한다.

"신호전달(Signal transduction)"은 자극 또는 저해적 신호가 세포내 반응을 유발하기 위해 세포 내로 그리고 세포 내에서 전달되는 동안의 과정이다. 신호 전달 경로의 조절자는 동일한 특정 신호 전달 경로에 대해 맵핑된 하나 이상의 세포 단백질의 활성을 조절하는 화합물을 지칭한다. 조절제는 신호전달 분자의 활성을 증강(효현제) 또는 억제(길항제)할 수 있다.

생물학적 활성제에 적용되는 바와 같은 용어 "선택적 저해" 또는 "선택적으로 저해하다"는 표적과의 직접적 또는 간접적 상호작용을 통해 표적을 벗어난 신호전달 활성에 비해 표적 신호전달 활성을 선택적으로 감소시키는 제제의 능력을 지칭한다.

용어 "약제학적으로 허용 가능한 담체" 또는 "약제학적으로 허용 가능한 부형제"는 임의의 그리고 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제, 1종 이상의 적합한 희석제, 충전제, 염, 붕괴제, 결합제, 윤활제, 활택제, 습윤제, 제어된 방출 기질, 착색제/향미제, 담체, 부형제, 완충제, 안정화제, 가용화제 및 이들의 조합물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 임의의 통상적인 매질 또는 제제가 활성 성분과 양립가능하지 않은 경우를 제외하고, 본 발명의 치료적 조성물에서 그의 용도가 상정된다. 보충적 활성 성분이 또한 조성물 내로 혼입될 수 있다.

다른 실시형태에서, 본 발명의 화합물은 시험관내 키나제 분석에서 측정하여 약 100nM 이하, 약 50nM 이하, 약 10nM 이하, 약 5nM 이하, 약 100pM 이하, 약 10pM 이하 또는 약 1pM 이하의 IC₅₀ 값을 지니는 I형 또는 클래스 I 포스파티딜이노시톨 3-키나제(PI3-키나제)의 하나 이상의 구성원을 선택적으로 저해한다.

또 다른 양상에서, I형 PI3-키나제의 하나 이상의 구성원을 선택적으로 저해하는 저해제, 또는 하나 이상의 I형 PI3-키나제 매개 신호전달 경로를 선택적으로 저해하는 저해제는 대안적으로 제공된 I형 PI3-키나제에 대해 50% 저해 농도(IC₅₀)를 나타내는, 즉, 다른 I형 PI3 -키나제의 나머지에 대한 저해제의 IC₅₀보다 적어도 10배 더 낮은, 적어도 20배 더 낮은, 적어도 50배 더 낮은, 적어도 100배 더 낮은, 또는 적어도 1000배 더 낮은 화합물을 지칭하는 것으로 이해될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같은, 용어 "이중 PI3-키나제 δ/γ 저해제" 및 "이중 PI3-키나제 δ/γ 선택적 저해제"는 PI3K 패밀리의 다른 아이소자임보다 더 효과적으로 PI3-키나제 δ와 γ 아이소자임 둘 다의 활성을 저해하는 화합물을 지칭한다. 따라서 이중 PI3-키나제 δ/γ 저해제는 비선택적 PI3K 저해제인 통상적인 PI3K 저해제, 예컨대 CAL-130, 보르트만닌(wortmannin) 및 LY294002보다 PI3-키나제 δ 및 γ에 대해 더 선택적이다.

PI3-키나제 δ 및 γ의 저해는 다양한 병태, 예를 들어 자가면역 질환, 알레르기 질환 및 관절염 질환을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 염증 반응을 특징으로 하는 병태의 치료에서 치료적 이점을 가질 수 있다. 중요하게는, PI3-키나제 δ 및 γ 기능의 저해는 생존도 및 생식력과 같은 생물학적 기능에 영향을 미치는 것으로 나타나지 않는다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "염증 반응"은 발적, 열, 종창 및 통증(즉, 염증)을 특징으로 하며, 전형적으로 조직 손상 또는 파괴를 수반한다. 염증 반응은 보통 손상을 주는 제제와 손상 조직을 둘 다 파괴하거나, 희석시키거나 또는 분할하는(격리시키는) 작용을 하는 조직의 손상 또는 파괴에 의해 유발되는 국소화된, 보호 반응이다. 염증 반응은 특히 백혈구의 유입 및/또는 백혈구(예를 들어, 호중구) 주화성과 관련된다. 염증 반응은 병원성 유기체 및 바이러스에 의한 감염, 비감염성 수단, 예컨대 외상 또는 심근경색증 또는 뇌졸중 후 재관류, 외래 항원에 대한 면역 반응, 및 자가면역 질환으로부터 초래될 수 있다. 본 발명에 따른 방법 및 화합물에 의해 치료될 수 있는 염증 반응은 특이적 방어 시스템의 반응과 관련된 병태뿐만 아니라 비특이적 방어 시스템의 반응과 관련된 병태를 포함한다.

본 발명의 치료 방법은 염증 세포 활성화와 관련된 병태의 개선을 위한 방법을 포함한다. "염증 세포 활성화"는 염증 세포(단핵구, 대식세포, T 림프구, B 림프구, 과립구(호중구, 호염구 및 호산구를 포함하는 다형핵 백혈구) 비만세포, 수지상 세포, 랑게르한스 세포 및 내피세포를 포함하지만, 이들로 제한되지 않음)에서 증식성 세포 반응, 가용성 매개체(사이토카인, 산소 라디칼, 효소, 포로스타노이드 또는 혈관작용성 아민을 포함하지만, 이들로 제한되지 않음)의 생성, 또는 새로운 또는 증가된 수의 매개체의 세포 표면 발현(주조직 적합성 항원 또는 세포 접착 분자를 포함하지만, 이들로 제한되지 않음)의 자극(사이토카인, 항원 또는 자가항원을 포함하지만, 이들로 제한되지 않음)에 의한 유도를 지칭한다. 이들 세포에서 이들 표현형의 하나 이상의 조합의 활성화는 염증 병태의 개시, 영구화 또는 악화에 기여할 수 있다는 것이 당업자에 의해 인식될 것이다.

본 명세서에 사용된 바와 같은 "자가면역 질환"은 조직 손상이 신체 자체의 구성성분에 대한 체액 또는 세포-매개 반응과 관련되는 장애의 임의의 그룹을 지칭한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "이식 거부"는 이식된 조직(이식된 그리고 주위에 있는 조직의 기능상실, 통증, 종창, 백혈구 증가증 및 혈소판 감소증을 특징으로 하는 기관 또는 세포(예를 들어, 골수)를 포함함)과 관련된 임의의 면역 반응을 지칭한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같은 "알레르기 질환"은 알레르기로부터 초래되는 임의의 증상, 조직 손상 또는 조직 기능의 상실을 지칭한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같은 "관절염 질환"은 다양한 병인에 기인할 수 있는 관절의 염증 병변을 특징으로 하는 임의의 질환을 지칭한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같은 "피부염"은 다양한 병인에 기인할 수 있는 피부의 염증을 특징으로 하는 피부 질환의 임의의 거대 패밀리를 지칭한다.

앞서 기재한 바와 같은 용어 "이중 PI3-키나제 δ/γ 선택적 저해제"는 일반적으로 PI3K 패밀리의 다른 아이소자임보다 더 효과적으로 PI3-키나제 δ 및 γ 아이소자임의 활성을 저해하는 화합물을 지칭한다. 효소 활성(또는 다른 생물학적 활성)의 저해제로서 화합물의 상대적 효능은 각각의 화합물이 활성을 사전결정된 정도로 저해하는 농도를 결정함으로써, 그리고 결과를 비교함으로써 확립될 수 있다. 전형적으로, 바람직한 결정은 생화학적 분석에서 활성의 50%를 저해하는 농도, 즉, 50% 저해 농도 또는 "IC₅₀"이다. IC₅₀ 결정은 당업계에 공지된 통상적인 기법을 이용하여 달성될 수 있다. 일반적으로, IC₅₀은 연구 하에서 저해제의 농도 범위의 존재 하에 주어진 효소의 활성을 측정함으로써 결정될 수 있다. 이어서, 효소 활성의 실험적으로 얻어진 값은 사용된 저해제 농도에 대해 플롯팅된다. (임의의 저해제가 없는 활성에 비교하여) 50% 효소 활성을 나타내는 저해제의 농도는 IC₅₀ 값으로서 취해진다. 유사하게, 다른 저해제 농도를 활성의 적절한 결정을 통해 정할 수 있다. 예를 들어, 일부 상황에서, 90% 저해 농도, 즉, IC₉₀ 등을 확립하는 것이 바람직할 수 있다.

따라서, 이중 PI3-키나제 δ/γ 선택적 저해제는 대안적으로 PI3-키나제 δ 및 γ에 대해 50% 저해 농도(IC₅₀)를 나타내는, 즉, 임의의 또는 모든 다른 클래스 I PI3K 패밀리 구성원에 대해 IC₅₀ 값보다 적어도 10배 더 낮은, 적어도 20배 더 낮은, 또는 적어도 30배 더 낮은 화합물을 지칭하는 것으로 이해될 수 있다. 본 발명의 대안의 실시형태에서, 용어 이중 PI3-키나제 δ/γ 선택적 저해제는 PI3-키나제 δ 및 γ에 대해 IC₅₀을 나타내는, 즉, 임의의 또는 모든 다른 클래스 I PI3K 패밀리 구성원에 대해 IC₅₀보다 적어도 30배 더 낮은, 적어도 50배 더 낮은, 적어도 100배 더 낮은, 적어도 200배 더 낮은 또는 적어도 500배 더 낮은 화합물을 지칭하는 것으로 이해될 수 있다. 이중 PI3-키나제 δ/γ 선택적 저해제는 전형적으로 상기 기재한 바와 같이 PI3-키나제 δ와 γ 활성을 둘 다 선택적으로 저해해는 양으로 투여된다.

특정 실시형태에서, 본 발명의 화합물은 PI3-키나제 δ와 γ 저해를 거의 동일하게(대략 1:1) 또는 최대비 1:5를 나타내며, 즉, 본 발명의 화합물은 PI3-키나제 δ와 γ 효소 둘 다에 대해 거의 동일한 IC₅₀ 값, 또는 둘 사이에 거의 3 내지 8배 차이를 나타낸다.

본 발명의 방법은 생체내 또는 생체밖에서 세포 집단에 적용될 수 있다. "생체내"는 동물 또는 인간 내에서 또는 대상체의 신체에서와 같은 살아있는 개체 내를 의미한다. 이 내용에서, 본 발명의 방법은 개체에서 치료적 또는 예방적으로 사용될 수 있다. "생체밖" 또는 "시험관내"는 살아있는 개체의 밖을 의미한다. 생체밖 세포 집단의 예는 개체로부터 얻은 유체 또는 조직 샘플을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 시험관내 세포 배양물 및 생물학적 샘플을 포함한다. 이러한 샘플은 당업계에 공지된 방법에 의해 얻을 수 있다. 예시적인 생물학적 유체 샘플은 혈액, 뇌척수액, 소변 및 타액을 포함한다. 예시적인 조직 샘플은 종양 및 이의 생검을 포함한다. 이와 관련하여, 본 발명은 치료적 및 실험적 목적을 포함하는 다양한 목적을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 주어진 적응증, 세포 유형, 개체 및 다른 매개변수에 대한 PI3-키나제 δ 선택적 저해제 투여의 최적의 스케줄 및/또는 투약을 결정하기 위해 생체밖 또는 시험관내에서 사용될 수 있다. 이러한 사용으로부터 얻은 정보는 실험적 또는 진단적 목적을 위해 또는 생체내 치료를 위한 프로토콜을 설정하기 위해 임상에서 사용될 수 있다. 본 발명이 적합할 수 있는 다른 생체밖 용도는 이하에 기재하며, 당업자에게 명확할 것이다.

본 발명의 화합물은 당업자에게 공지된 방법, 예컨대 국제 특허 출원 공개 WO 2011/055215, WO 2012/151525, 및 WO 2013/164801에 의해 제조될 수 있으며, 이들 각각은 그들의 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다.

약제학적 조성물

본 발명은 또한 본 발명의 하나 이상의 화합물 및 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 일 실시형태에서, 약제학적 조성물은 치료적 유효량의 본 발명의 하나 이상의 화합물을 포함한다. 약제학적 조성물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 추가적인 활성 성분을 포함할 수 있다.

약제학적 담체 및/또는 부형제는, 예를 들어, 희석제, 충전제, 염, 붕괴제, 결합제, 윤활제, 활택제, 습윤제, 제어 방출 기질, 착색제, 향미제, 완충제, 안정제, 가용화제 및 이들의 조합물로부터 선택될 수 있다.

일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 약 0.1㎎ 내지 약 1,000㎎, 예컨대 약 1㎎ 내지 약 1,000㎎, 약 20㎎ 내지 약 800㎎, 약 50㎎ 내지 약 600㎎ 또는 약 50㎎ 내지 약 600㎎의 본 발명의 하나 이상의 화합물을 함유한다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 약 100㎎ 내지 약 400㎎의 본 발명의 하나 이상의 화합물을 함유한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 단독으로 또는 하나 이상의 다른 활성제와 병용하여 투여될 수 있다. 요망되는 경우, 대상 화합물 및 다른 제제(들)는 제제에 혼합될 수 있거나 또는 성분 둘 다 그들을 별도로 또는 동시에 병용하여 사용하기 위한 별개의 제제로 제형화될 수 있다.

본 발명의 화합물 및 약제학적 조성물은 작용 부위에 대한 화합물의 전달을 가능하게 하는 임의의 경로, 예컨대 경구, 비강내, 국소(예를 들어, 경피), 십이지장내, 비경구(정맥내, 동맥내, 근육내, 혈관내, 복강내 또는 주사 또는 주입에 의해서를 포함), 진피내, 유방내, 척추강내, 안구내, 안구뒤, 폐내(예를 들어, 에어로졸화된 약물) 또는 피하(장기간 방출을 위한 데포 투여를 포함, 예를 들어, 지라 피막하, 뇌 또는 각막 내에 포매), 설하, 항문, 직장, 질 또는 수술적 이식에 의해(예를 들어, 지라 피막하, 뇌 또는 각막에 포매) 투여될 수 있다.

조성물은 고체, 반고체, 액체 또는 기체 형태로 투여될 수 있거나 또는 동결건조 형태와 같은 건조 분말일 수 있다. 약제학적 조성물은, 예를 들어, 캡슐, 사쉐, 젤라틴, 종이, 정제, 좌약, 펠렛, 알약, 트로키 및 로젠지와 같은 고체 제형을 포함하는, 전달에 편리한 형태로 패키징될 수 있다. 패키징 유형은 일반적으로 목적으로 하는 투여 경로에 의존할 것이다. 경피 제형과 같은 이식가능한 지속 방출 제형이 또한 상정된다.

치료 방법

투여될 화합물의 양은 치료 중인 포유류, 장애 또는 병태의 중증도, 투여 속도, 화합물의 기질 및 처방하는 의사의 재량에 의존한다. 그러나, 유효 투약량은 1일 당 약 0.001 내지 약 100㎎/㎏ 체중, 바람직하게는 약 1 내지 약 35㎎/㎏/일의 범위에서 단일 또는 분할된 용량이다. 70㎏ 인간에 대해, 이는 약 0.05 내지 약 7 g/일, 바람직하게는 약 0.05 내지 약 2.5g/일의 양일 것이다. 유효량의 본 발명의 화합물은 단일 또는 다회 용량(예를 들어, 1일 2회 또는 3회)으로 투여될 수 있다.

본 발명의 화합물은 1종 이상의 항암제(예를 들어, 화학치료제), 치료적 항체 및 방사선 치료와 병용하여 사용될 수 있다.

본 발명의 화합물은 염증 병태, 예컨대 뇌척수염, 천식, 및 본 명세서에 기재된 다른 질환의 증상을 완화하는 작용을 하는 다른 제제와 함께 제형화되거나 또는 투여될 수 있다. 이들 제제는 비스테로이드 항-염증 약물(NSAID)을 포함한다.

실시예

이하에 제공하는 실시예 및 제조는 본 발명의 화합물 및 이러한 화합물의 제조방법을 설명하고 예시한다. 본 발명의 범주는 다음의 실시예 및 제조의 범주에 의해 임의의 방법으로 제한되지 않는다. 다음의 실시예에서, 달리 언급되지 않는 한, 단일 카이랄 중심을 지니는 분자는 라세미 혼합물로서 존재한다. 2 이상의 카이랄 중심을 지니는 해당 분자는 달리 언급되지 않는 한, 부분입체이성질체의 라세미 혼합물로서 존재한다. 단일 거울상체/부분입체이성질체는 당업자에게 잘 공지된 방법에 의해 얻을 수 있다.

본 명세서에 기재된 중간체는 국제 특허 출원 공개 WO 11/055215 및 WO 12/151525에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있으며, 이들 둘 다는 본 명세서에 참고로 포함된다.

중간체 1: N-(5- 브로모 -2- 메톡시페닐 ) 메탄설폰아마이드 : 다이클로로메탄(10㎖) 중의 5-브로모-2-메톡시아닐린(1.00g, 4.94m㏖)의 용액에, 피리딘 0.800㎖, 9.89m㏖)을 첨가하고 나서, 0℃로 냉각시켰다. 메탄 설폰일 클로라이드(0.40㎖, 5.19m㏖)를 첨가하고 나서, 30분 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 물로 중단시키고 나서, 에틸 아세테이트로 추출하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고 나서, 감압 하에 농축시켰다. 조질의 생성물을 에틸 아세테이트:석유 에터를 이용하여 크로마토그래피하여 붉은색 고체로서 표제 화합물(1.20g, 87%)을 얻었다.

중간체 2: N-(2- 메톡시 -5-(4,4,5,5- 테트라메틸 -1,3,2- 다이옥사보롤란 -2-일)페닐)메탄설폰아마이드: 아세트산칼륨(0.841g, 8.57m㏖) 및 비스(피나콜라토)다이보론(1.190g, 4.71m㏖)을 다이옥산(17.5㎖) 중의 중간체 1(1.20g, 4.28m㏖) 용액에 첨가하고 나서, 용액을 30분 동안 탈기시켰다. [1,1'-비스(다이페닐포스피노)페로센]다이클로로 팔라듐(II). CH₂Cl₂(0.104g, 0.128m㏖)을 질소 분위기 하에 첨가하고 나서, 80℃로 가열하였다. 2시간 후에, 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과시키고, 농축시켰다. 조질의 생성물을 에틸 아세테이트:석유 에터를 이용하는 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 황색 고체로서 얻었다(1.00g, 71%). ¹H-NMR (δ ppm, CDCl₃, 400 MHz): 7. 91 (d, J = 1.2Hz, 1H), 7. 62 (dd, J = 8.1, 1.2Hz, 1H), 6. 92 (d, J = 8.1Hz, 1H), 6.73 (s, 1H), 3.91 (s, 3H), 2.98 (s, 3H), 1.32 (s, 12H).

중간체 3: ( S)-2-(1-(4-아미노-3-(4- 메톡시 -3- 나이트로페닐 )-1H- 피라졸로[3,4-d]피리미딘 -1-일)에틸)-5-플루오로-3-(3-플루오로페닐)-4H-크로멘-4-온: (S)-2-(1-(4-아미노-3-(4-메톡시-3-나이트로페닐)-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-1-일)에틸)-5-플루오로-3-(3-플루오로페닐)-4H-크로멘-4-온: THF(5㎖) 중의 (R)-5-플루오로-3-(3-플루오로페닐)-2-(1-하이드록시에틸)-4H-크로멘-4-온(0.500g, 1.64m㏖)의 용액에, 3-(4-메톡시-3-나이트로페닐)-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-4-아민 (0.564g, 1.97m㏖) 및 트라이페닐포스핀(0.649g, 2.47m㏖)을 첨가한 후 다이아이소프로필아조다이카복실레이트(0.50㎖, 2.47m㏖)를 첨가하였다. ((R)-5-플루오로-3-(3-플루오로페닐)-2-(1-하이드록시에틸)-4H-크로멘-4-온을 국제 특허 출원 공개 WO 2012/0151525의 중간체 23, 25 및 26에 대해 기재한 바와 같이 제조할 수 있음). 실온에서 4시간 후에, 혼합물을 농축시키고 나서, 잔사를 에틸 아세테이트:석유 에터를 이용하는 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 갈색 고체로서 표제 화합물(0.270g, 29%)을 얻었다. ¹H-NMR (δ ppm, DMSO-d6, 400 MHz): 8.04 (s, 1H), 7.83 (m, 1H), 7.63-7.50 (m, 3H), 7.29 (m, 2H), 7.06 (dt, J = 8.7,2.2Hz, 1H), 6.94 (m, 2H), 6.75 (dd, J = 8.1,2.1Hz, 1H), 5.95 (q, J = 7.0Hz, 1H), 4.98 (s, 2H), 3.81 (s, 3H), 1.86 (d, J = 7.0 Hz, 3H).

중간체 4: (S)-2-(1-(4-아미노-3-(3-아미노-4- 메톡시페닐 )-1H- 피라졸로[3,4-d]피리미딘 -1-일)에틸)-5-플루오로-3-(3-플루오로페닐)-4H-크로멘-4-온: (S)-2-(1-(4-아미노-3-(3-아미노-4-메톡시페닐)-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-1-일)에틸)-5-플루오로-3-(3-플루오로페닐)-4H-크로멘-4-온: 에탄올(5㎖) 중의 중간체 3(0.260g, 0.455m㏖)의 용액에, 레이니 Ni(0.130g)을 첨가하고 나서, 20psi에서 50℃로 24시간 동안 수소화하였다. 반응 혼합물을 셀라이트 패드를 통과시키고 나서, 농축시켜 갈색 고체로서 표제 화합물(0.150g, 60%)을 얻었다. 질량: 540.8 (M⁺).

실시예 A

N-(5-(4-아미노-1-(1-(5-플루오로-3-(3-플루오로페닐)-4-옥소-4H-크로멘-2-일)에틸)-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-3-일)-2-메톡시페닐)메탄설폰아마이드

DME(2.1㎖) 및 물(0.67㎖) 중의 2-(1-(4-아미노-3-요오도-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-1-일)에틸)-5-플루오로-3-(3-플루오로페닐)-4H-크로멘-4-온(0.200g, 0.366m㏖)의 용액에, 중간체 2(0.179g, 0.550m㏖) 및 탄산나트륨(0.116g, 1.10m㏖)을 첨가하고 나서, 시스템을 30분 동안 탈기시켰다. (2-(1-(4-아미노-3-요오도-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-1-일)에틸)-5-플루오로-3-(3-플루오로페닐)-4H-크로멘-4-온을 국제 특허 출원 공개 WO 2012/0151525의 중간체 23, 25 및 26에 대해 기재한 바와 같이 제조할 수 있다. 비스(다이페닐포스피노) 페로센]다이클로로팔라듐(II)(0.059g, 0.075m㏖)을 첨가하고 나서, 마이크로파 조사 하에서(마이크로파 전력 = 100W, 온도 = 100℃) 45분 동안 유지하였다. 반응 혼합물을 셀라이트 여과시키고, 농축시키고 나서, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층을 황산나트륨으로 건조시키고 나서, 감압하에 농축시켰다. 조질의 생성물을 메탄올: 다이클로로메탄을 이용하는 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 갈색 고체로서 표제 화합물(0.080g, 35%)을 얻었다. MP: 216-218℃. ¹H-NMR (δ ppm, CDCl₃, 400 MHz): 8.20 (s, 1H), 7.73 (s, 1H), 7.53 (m, 2H), 7.31 (m, 2H), 7.07-6.73 (m, 6H), 6.07 (q, J = 6.2 Hz, 1H), 3.98 (s, 3H), 3.14 (s, 3H), 2.01 (d, J = 6.0Hz, 3H).

실시예 A1 및 A2

방법 A

(S)-N-(5-(4-아미노-1-(1-(5-플루오로-3-(3-플루오로페닐)-4-옥소-4H-크로멘-2-일)에틸)-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-3-일)-2-메톡시페닐)메탄설폰아마이드

및 (R)-N-(5-(4-아미노-1-(1-(5-플루오로-3-(3-플루오로페닐)-4-옥소-4H-크로멘-2-일)에틸)-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-3-일)-2-메톡시페닐)메탄설폰아마이드

2개의 거울상체적으로 순수한 이성질체를 이동상으로서 메탄올:CO₂(55:45)를 이용하여 80g/분의 유속으로 키랄팩(CHIRALPAK) AS-H 칼럼(250 x 30㎜; 5㎛) 상에서 N-(5-(4-아미노-1-(1-(5-플루오로-3-(3-플루오로페닐)-4-옥소-4H-크로멘-2-일)에틸)-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-3-일)-2-메톡시페닐)메탄설폰아마이드 (0.500g)로부터 분취 SFC(초임계 유체) 조건에 의해 분리시켰다.

실시예 A1(S-이성질체): 갈색 고체(0.247g). 거울상이성질체 과잉률: 97.4%. 체류 시간: 2.14분. 질량: 619.1(M⁺+1). MP: 156-158℃.

실시예 A2 (R-이성질체): 갈색 고체(0.182g). 거울상이성질체 과잉률: 99.3%. 체류 t: 3.43분. 질량: 619.1 (M⁺+1). MP: 168-171℃.

방법 A1

(S)-N-(5-(4-아미노-1-(1-(5- 플루오로 -3-(3- 플루오로페닐 )-4-옥소-4H- 크로멘 -2-일)에틸)-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-3-일)-2-메톡시페닐)메탄설폰아마이드

2개의 거울상체적으로 순수한 이성질체를 이동상으로서 메탄올:CO₂(45:55)를 이용하여 120g/분의 유속으로 키랄팩(CHIRALPAK) AS-H 칼럼(250 x 20㎜; 5㎛) 상에서 N-(5-(4-아미노-1-(1-(5-플루오로-3-(3-플루오로페닐)-4-옥소-4H-크로멘-2-일)에틸)-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-3-일)-2-메톡시페닐) 메탄설폰아마이드 (15.0g)로부터의 분취 SFC(초임계 유체) 조건에 의해 분리시켰다.

실시예 A1(S-이성질체): 거울상이성질체 과잉률: 100%. 체류시간: 2.21분. 질량: 619.1 (M⁺+1). MP: 175-178℃ 비선광도(클로로폼 중에서 C=1, 25℃에서): [α]_D = + 147.16.

실시예 A2(R-이성질체): 거울상이성질체 과잉률: 99.3%. 체류 t: 3.72분. 질량: 619.1 (M⁺+1). MP: 154-157℃. 비선광도(클로로폼 중에서 C=1, 25℃에서): [α]_D = - 159.54.

방법 B

실시예 A1

0℃로 냉각시킨 다이클로로메탄(5㎖) 중의 중간체 4(0.500g, 0.923m㏖) 용액에, 피리딘(0.200㎖, 1.84m㏖)을 첨가하고 나서, 10분 동안 교반시켰다. 메탄설폰일 클로라이드(0.100㎖, 0.923m㏖)를 첨가하고 나서, 30분 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 물로 중단시키고 나서, 다이클로로메탄으로 추출하고, 황산나트륨으로 건조시켰다. 조질의 생성물을 메탄올:다이클로로메탄으로 칼럼크로마토그래피하여 회백색 고체로서 표제 화합물(0.240g, 42%)을 얻었다. MP: 211-213℃. ¹H-NMR (δ ppm, DMSO-d6, 400 MHz): 9.15 (s, 1H), 8.06 (s, 1H), 7.83 (m, 1H), 7.49 (m, 4H), 7.28 (m, 4H), 7.08 (dt, J = 8.6,1.7 Hz, 1H), 6.92 (s, 2H), 5.98 (q, J = 6.9 Hz, 1H), 3.88 (s, 3H), 2.99 (s, 3H), 1.88 (d, J = 7.0 Hz, 3H). 거울상이성질체 과잉률: 빠르게 용리하는 이성질체가 풍부한 카이랄팩 AS-3R 칼럼 상에서 HPLC에 의해 결정하여 85.4%(체류 시간 = 7.46분).

대사 안정성

대사 안정성 연구를 마우스, 래트, 개, 원숭이 및 인간 간 마이크로좀을 이용하여 WO 2012/151525의 화합물 A, A1, 및 A2뿐만 아니라 실시예 128에 대해 수행하였다. 마우스, 래트 및 인간 간 마이크로좀(모두 미국 BD 젠테스트사(BD Gentest))을 이용한 연구를 위한 프로토콜을 이하에 제공한다. 0.4㎎ 단백질을 15분 동안 37℃에서 인산염 완충제(pH 대략 7.4) 중에서 2mM NADPH(보조인자)와 함께 사전인큐베이션시키고, 이어서, 1μM 시험 항목과 함께 첨가하고 나서, 추가로 60분 동안 3회 인큐베이션시켰다. 반응 혼합물을 내부 표준을 함유하는 메탄올을 이용하여 종결시키고 나서, 원심분리시켜 LC-MS/MS에 의해 상청액 중에 남아있는 시험 항목을 추가로 분석하였다.　 남아있는 모 화합물 백분율을 0분에 종결시킨 유사한 샘플에 비교하여 계산하였다. 결과를 이하의 표 1에 제공한다.

화합물 A1에 대한 대사 안정성 데이터는 우수한 약동학적 프로파일을 나타낸다는 것을 나타낸다.

화합물	간 마이크로좀에서 대사 안정성
화합물	마우스	래트	개	원숭이	인간
WO 2012/151525의 실시예128	85.0	73.3	ND	ND	70.4
화합물 A	96	91	64.3	42.3	69.7
화합물 A1	85.9	94.2	83.5	78.8	95.7
화합물 A2	68.9	79.5	52.3	1.9	60.2
ND- 결정되지 않음

단백질 결합

이하는 (평형투석을 이용하여) 혈장 단백질 결합을 측정하기 위한 절차를 제공한다. 745㎕의 혈장을 2㎖ 마이크로원심분리관에 옮겼다. 해당 5㎕의 화합물에 A1(150μM)을 첨가하였다. 샘플을 2분 동안 테이블탑 교반기에서 혼합하였다. 50㎕ 혈장(n=2)을 0시간 샘플로서 처리한 사전 표지한 1.5㎖ 마이크로원심분리관에 옮겼다.

남아있는 650㎕ 혈장 샘플을 수욕에서 37℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 30분 인큐베이션 후에, 50㎕ 혈장(n=2)을 0.5시간 샘플로서 처리한 사전 표지한 1.5㎖ 마이크로원심분리관에서 제거하였다. 200㎕의 혈장 샘플(n=2)을 적색 동그라미로 표시한 샘플 챔버에 옮겼다. 적색 삽입물을 기저 플레이트에 넣고, 350㎕의 완충제를 챔버에 전달하였다. 플레이트를 오비탈 진탕기 상에서 37℃에서 또는 대략 100RPM에서 또는 업-앤드-다운 진탕기 상에서 20RPM에서 4시간 동안 인큐베이션시켰다. 완충제로부터의 50㎕의 투석 후 샘플 및 혈장 챔버를 사전표지한 마이크로 원심분리관에 옮겼다. 50㎕의 혈장을 완충제 샘플에 첨가하고 나서, 동일 용적의 완충제(KH₂PO₄ 완충제 pH 7.4)를 수집한 혈장 샘플에 첨가하였다. 내부 표준(톨부타마이드 250ng/㎖)을 함유하는 150㎕의 메탄올을 단백질 및 방출 화합물을 침전시키기 위해 첨가하였다. 샘플을 테이블탑 교반기에서 3분 동안 교반시키고 나서, 5분 동안 14,000RPM에서 원심분리시켰다. 상청액에 LC-MS/MS 분석을 실시하였다.

화합물 A1에 대한 혈장 단백질 결합 데이터를 이하의 표 2에 제공한다:

단백질 결합( % )
마우스	래트	개	원숭이	인간
97.61	99.04	95.85	94.71	97.24

약동학

화합물 A1(유리 염기)의 경구 생체이용가능성을 래트 및 마우스에서 평가하였다. 래트에서 약동학적 연구에 대한 프로토콜을 이하에 제공한다.

투약 전 모든 동물을 밤새(12시간) 금식시키고, 시험 항목의 투여 후 4.0시간 까지 계속하였다. 시험 제형을 1% 트윈(Tween) 80 및 99% 배지(0.5% 메틸 셀룰로스, 4000cPs, pH 2.2)에서 준비하였다. 혈액 샘플(각각의 동물로부터의 150㎕)을 안와동으로부터 수집하고 나서, 항응고제로서 2나트륨 EDTA를 함유하는 마이크로원심분리관 내로 배치시켰다. 혈액 샘플을 1000g의 속도로 10분 동안 4℃에서 즉시 원심분리시키고 나서, 분리한 혈장 샘플을 -80℃ 미만에서 냉동시키고, 분석까지 저장하였다. 모든 제형에서 시험 항목의 농도를 HPLC에 의해 분석하였다. 모든 샘플에서 시험 항목의 혈장 농도를 LC-MS/MS에 의해 분석하였다. 약동학적 매개변수(C_max, AUC₀ _-t, T_max 및 t_½)를 윈놀린(WinNonlin) 소프트웨어를 이용하여 추정하였다. 래트에서 화합물 A, A1 및 WO 2012/151525의 실시예 128에서 및 마우스에서 화합물 A1에 대한 결과를 표 3에 제공한다.

화합물	단위	WO 2012/151525의 실시예 128	화합물 A	화합물 A1	화합물 A1
동물		래트			마우스
경로		경구	경구	경구	경구
용량	mg/kg	10	10	10	10
N		2	2	4	3
C_max	μM	0.68	1.02	11.38	3.78
AUC₀ _-t	μM·hr	2.01	7.95	97.76	7.49
T_max	Hr	0.83	2.67	1.83	0.50
t_½	Hr	1.56	4.52	2.45	1.45

화합물 A 및 A1은 WO 2012/151525의 실시예 128에 비교한 우수한 약동학적 프로파일을 나타내었다. 예를 들어, 화합물 A는 WO 2012/151525의 실시예 128에 비해 C_max에서 대략 1.5배, AUC₀ _-t에서 대략 4배, 및 t_½의 대략 2.8배를 나타내었다. 화합물 A1은 WO 2012/151525의 실시예 128에 비해 C_max에서 대략 16배 증가, AUC₀ _-t에서 대략 48배, 및 t_½의 대략 1.6배 증가를 나타내었다.

생물학적 분석

본 명세서에 기재된 화합물의 약학적 특성은 이하에 예시하는 바와 같은 다수의 약학적 분석에 의해 확인할 수 있다.

분석 1: PI3 키나제 효소 활성의 형광 결정

포스포이노시타이드 3 키나제(PI3K)는 몇몇 중요한 세포 과정의 조절에서 중요한 역할을 하는 지질 키나제의 분류에 속한다. PI3K는 포스포이노시톨의 3-하이드록시 위치를 인산화함으로써 하류의 신호전달 사건에 수반된 2차 전령을 생성할 수 있다. 균질 시분해 형광(homogenous time resolved fluorescence: HTRF) 분석은 α, β, γ 또는 δ와 같은 PI3K 동형에 의한 포스포티딜이노시톨 4,5-바이포스페이트(PIP2)의 인산화의 결과로서 형성된 3,4,5-트라이포스페이트(PIP3)의 검출을 허용한다.

α, β, γ 또는 δ에 대한 PI3K 동형 활성을 변형과 PI3K 인간 HTRF(상표명) 분석 키트(매사추세츠주 빌러리카에 소재한 밀리포어(Millipore))를 이용하여 결정하였다. 모든 인큐베이션을 실온에서 수행하였다. 0.5㎕의 40X 저해제(100% DMSO 중) 또는 100% DMSO를 효소와 함께 또는 효소 없이 14.5㎕ 1X 반응 완충제/PIP2(10mM MgCl₂, 5mM DTT, 1.38μM PIP2) 혼합물 다음에 5㎕/웰의 400μM ATP를 함유하는 384-웰 백색 플레이트(노스캐롤라이나주 먼로에 소재한 그레이너 바이오원(Greiner Bio-One))의 각각의 웰에 첨가하였고, 추가 30분 동안 인큐베이션시켰다. 반응을 5㎕/웰 정지 용액(매사추세츠주 빌러리카에 소재한 밀리포어(Millipore))을 첨가함으로써 종결시켰다. 이어서, 5㎕의 검출 혼합물(매사추세츠주 빌러리카에 소재한 밀리포어)을 각각의 웰에 첨가하였고, 암실에서 6 내지 18시간 동안 인큐베이션시켰다. 50msec 지연을 계수화하는 통합 시간 400msec 통합 시간으로 HRTF 비를 여기 파장 337㎚ 및 방출 파장 665 및 615㎚로 마이크로플레이트 판독기(독일 BMG 랩테크(BMG Labtech)) 상에서 측정하였다. 화합물 A, A1 및 A2에 대한 결과를 이하의 표 4에 나타낸다. 화합물 A1에 대한 비교 데이터 및 WO2012/151525의 실시예 128을 이하의 표 5에 제공한다.

화합물	IC ₅₀ (nM)
화합물	Pi3Kδ	Pi3Kα	Pi3Kβ	Pi3Kγ
A	102.8	ND	ND	82.94
A1	30.46	> 10000	1359	48.72
A2	92.95	ND	ND	>10 μM
ND: 결정하지 않음

선택성 프로파일
분석	IC ₅₀ (nM)		선택성 배수
화합물	PI3Kδ	PI3Kγ	PI3Kα	PI3Kβ
WO 2012/151525의 실시예 128	76.01	70.70	NC (38.29*)	NC (51.04*)
화합물 A	102.8	82.94	ND	ND
화합물 A1	30.46	48.72	>329 (23.02**)	>45 (46.8*) (IC₅₀ = 1359 nM)
화합물 A2	92.95	>10000	ND	ND
* 1μM에서 저해%; ** 10μM에서 저해% ; NC-계산하지 않음 및 ND: 결정하지 않음

분석 2: 백혈병 세포주에서 시험관내 세포 증식 분석

10% FBS 보충 배지를 이용하여 성장 저해 분석을 수행하였다. 96웰 플레이트에서 5000 내지 20,000개 세포/웰의 농도로 세포를 파종하였다. 0.01 내지 10000 nM 범위의 농도에서 시험 화합물을 24시간 후에 첨가하였다. 0시간에(시험 화합물의 첨가 전) 그리고 시험 화합물의 첨가 후 72시간에 3-[4,5-다이메틸티아졸-2-일]-2,5-다이페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT) 염료 감소 시험을 이용하여 성장을 평가하였다. 흡광도를 450㎚ 파장에서 플루오스타 옵티마(Fluostar Optima)(독일에 소재한 BMG 랩테크) 상에서 판독하였다. 그래프패드 프리즘을 이용하여 데이터를 분석하였고, 그에 따라 시험 화합물에 기인하는 저해 백분율을 대조군에 비교하여 계산하였다.

화합물 A1은 시험한 용량 범위에 대해 T-림프종(MOLT-4, 주카트(Jurkat), CCRF-CEM, Hut-78 및 HuT-102) 세포 생존도의 감소를 야기하였으며, GI₅₀ 값은 2.5 내지 12.8μM 범위였다. 추가적으로, 화합물 A1은 72시간 인큐베이션 기간에 걸쳐 임의의 명확한 세포독성을 나타내지 않았다.

분석 3: 백혈병 세포주에서 AKT 인산화의 저해

MOLT-4, 주카트, CCRF-CEM 및 Hut-78 세포를 48시간 동안 목적으로 하는 농도의 화합물과 함께 인큐베이션시켰다. 세포를 용해시키고, pAKT를 웨스턴 블롯팅에 의해 결정하였다. 밴드를 이미지J(ImageJ)를 이용하여 정량화하고 나서, 액틴에 대해 정량화하였다.

화합물 A1는 T-림프종(MOLT-4, 주카트, CCRF-CEM 및 Hut-78) 세포주에서 pAKT 발현의 감소를 야기하였으며, EC₅₀ 값은 0.02 내지 1.6μM의 범위에 있었다.

분석 4: 인간 전혈로부터의 호염구에서 PI3K δ 및 γ

항-FcεR1 또는 fMLP 유도 CD63 발현의 변경에 의해 확인된 호염구 중의 PI3K δ 및 γ 신호전달은 플로우2캐스트(Flow2CAST)(등록상표) 키트(스위스 뷸만 래버러토리즈(Buhlmann Laboratories))를 이용하여 결정한 유용한 약동학적 마커이다. 시험 절차는 다음의 단계들을 수반한다:

정맥천자관을 몇 회 뒤집음으로써 항-응고 혈액 샘플을 혼합한다;

유세포 분석 측정에 적합한 새로운 그리고 무발열원의 3.5㎖ 폴리프로필렌 또는 폴리스타이렌 관을 준비한다;

49㎕의 환자의 전혈을 각각의 관에 첨가하였다;

1㎕의 10% DMSO(배경) 또는 시험 화합물(10% DMSO)을 할당된 관에 첨가하고, 부드럽게 혼합한다. 실온에서 15분 동안 인큐베이션시킨다;

50㎕의 자극 완충제(배경) 또는 항-FcεRI Ab 또는 fMLP를 각각의 관에 피펫팅한다;

100㎕의 자극 완충제를 각각의 관에 첨가하였다;

부드럽게 혼합한다. 20㎕의 염색 시약(FITC-CD63 및 PE-CCR3의 1:1 혼합물)을 각각의 관에 첨가하였다;

부드럽게 혼합하고 나서, 관을 덮고, 수욕 내에서 15분 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. (인큐베이터를 이용하여 덜 효율적인 열 전달에 기인하여 약 10분 더 긴 인큐베이션 시간을 취함);

각각의 관에 2㎖ 사전 가온된(18 내지 28℃) 용해 시약을 첨가하고, 부드럽게 혼합하였다;

5 내지 10분 동안 18 내지 28℃에서 인큐베이션시킨다;

관을 5분 동안 500 x g에서 원심분리시킨다;

블롯팅 페이퍼를 이용함으로써 상청액을 디캔팅하였다;

세포 펠렛을 300 내지 800㎕의 세척 완충제와 함께 재현탁시킨다; 그리고

부드럽게 교반시키고, 동일한 날에 유세포 분석기 상에서 데이터를 획득한다.

개폐 호염구 집단 내의 CD63 양성 세포%를 상이한 치료군에서 결정하고, 비히클 대조에 대해 정규화시켰다.

화합물 A1은 FcεR1(PI3Kδ)에 대해 30nM 미만의 EC₅₀ 및 fMLP(PI3Kγ)(n=1)에 대해 70nM 미만의 IC₅₀을 나타내었다.

분석 4A: PI3K 델타 및 PI3K 감마 동형에 대한 화합물 A1의 선택성을 입증하는 세포 활성

분석 4A1: 항- IgM 유도 B-세포 증식( PI3Kδ 선택성에 대해)

이 연구의 목적은 항-IgM 유도 인간 B-세포 증식에 대한 화합물 A1의 저해제 가능성을 평가하는 것이었다.

플레이팅 및 처리

단리된 B-세포를 ㎖ 당 1.0 x 10⁶개 세포로 재현탁시켰다. 100㎕의 세포 현탁액을 96웰 플레이트의 각각의 웰에 첨가하였다. 3회 중복에서 유지하였다.

50㎕의 약물 희석을 첨가하고 나서, 잘 혼합하였다. DMSO 블랭크 및 유도자 블랭크를 유지하였다.

처리한 플레이트를 37℃, 5% CO₂에서 30분 동안 인큐베이션시키고, 이어서, 50㎕의 4X 유도자를 첨가하고 나서, 피펫팅에 의해 혼합하였다.

플레이트를 37℃, 5% CO₂에서 72시간 동안 인큐베이션시켰다.

매질을 흡입하고 나서, 150㎕의 DMSO를 첨가하여 포마잔 결정을 용해시켰다.

흡광도를 A₅₆₀ 및 A₆₄₀㎚에서 판독하였다.

데이터는 인간 B-세포 증식의 PI3Kδ 매가 유도에 대한 화합물 A1의 저해 가능성을 입증한다. 예를 들어, 문헌[Baeker et al., Journal of Immunology, 134: 3532-3538, 1985] 참조.

분석 4A2: 3T3 섬유아세포에서 LPA 유도 AktS473 인산화 ( PI3K β 선택성에 대해)

본 연구의 목적은 3T3 섬유아세포에서 PI3Kβ 키나제 매개 LPA 유도 AktS473 인산화에 대한 화합물 A1의 효과를 결정하는 것이었다.

3T3 세포를 15분 동안 시험 화합물의 목적으로 하는 농도로 처리하였다. 최종 농도가 5μM 농도가 되도록 1㎖의 2X LPA를 첨가하고 나서, 5분 동안 인큐베이션시켰다.

배지를 폐기하고 나서, 1㎖의 빙냉 1X PBS로 세척하였다.

250㎕의 세포 용해 완충제를 첨가하고 나서, 30분 동안 얼음 상에서 인큐베이션시켰다.

샘플을 원심분리시키고 나서, 상청액을 분석까지 -80℃에서 유지하였다.

샘플을 1차 항체로서 pAKT(S473) 및 2차 항체로서 항-토끼 IgG-HRP를 이용하여 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다.

밴드의 강도를 이미지J 1.42q(NIH, USA)를 이용하여 결정하고 나서, 액틴(로딩 대조군)에 대해 정규화시켰다. 그래프패드 프리즘(버전 5.02)을 이용하여 데이터를 플롯팅하였다.

결과는 PI3K의 베타 동형 이상으로 화합물 A1의 선택성을 입증한다. 문헌[[Albuquerque et al., J. Biol . Chem., 278, 39830-39838, 2003] 참조.

분석 4A3: RAW 264.7 대식세포 ( PI3Kγ 선택성에 대해)에서 c5a 유도 AktS473 인산화

본 연구의 목적은 RAW 264.7 대식세포에서 PI3Kγ 키나제 매개 c5a 유도 AktS473 인산화에 대한 화합물 A1의 효과를 결정하는 것이었다.

RAW 264.7 세포를 15분 동안 시험 화합물의 목적으로 하는 농도로 처리하였다. 최종 농도가 50ng/㎖이 되도록 1㎖의 2X c5a를 첨가하고 나서, 15분 동안 인큐베이션시켰다.

배지를 폐기하고 나서, 1㎖의 빙냉 1X PBS로 세척하였다.

PI3Kγ 신호전달의 하류의 마커인 pAktS473의 저해는 c5a 유도 RAW 264.7 세포에서 Akt에 의해 조절되는 종양 발생 경로에서 화합물 A1에 대한 역할을 시사한다. 문헌[To et al., Am. J. Respir . Crit . Care Med ., 182, 897-904, 2010] 참조.

분석 4A4: 3T3 세포에서 PDGF 유도 Akt 인산화 ( PI3K α 선택성에 대해)

본 연구의 목적은 PDGF 유도 3T3 섬유아세포에서 PI3Kα 키나제 매개 AktS473 인산화에 대한 화합물 A1의 효과를 결정하는 것이었다.

3T3 세포를 15분 동안 시험 화합물의 목적으로 하는 농도로 처리하였다. 최종 농도가 20ng/㎖이 되도록 1㎖의 2X PDGF를 첨가하고 나서, 10분 동안 인큐베이션시켰다.

배지를 폐기하고 나서, 1㎖의 빙냉 1X PBS로 세척하였다.

10μM의 화합물 A1에서 저해는 관찰되지 않았는데, 이는 PI3K의 알파 동형 이상으로 화합물 A1의 선택성을 보여준다. 문헌[Albuquerque et al., J. Biol . Chem. 278, 39830-39838, 2003] 참조.

이하의 표 6은 분석 4A1 내지 4A4로부터의 결과를 요약한다.

PI3K δ 및 PI3K γ 동형에 대한 화합물 A1의 선택성을 입증하는 세포 활성
세포 IC₅₀ PI3K 알파(3T3 섬유아세포에서 PDGF 유도 pAKT)	>10000 nM
세포 IC₅₀ PI3K 베타(3T3 섬유아세포에서 LPA 유도 pAKT)	1324 nM
세포 IC₅₀ PI3K 델타(항-IgM 유도 인간 B-세포 증식)	11.03 nM
세포 IC₅₀ PI3K 감마(RAW 대식세포에서 c5a 유도 pAKT)	51.73 nM

분석 5: 백혈병 세포주에서 세포자멸사의 저해

백혈병 세포에서 세포자멸사를 이하에 약술하는 바와 같이 인시추 카스파제 3 키트(미국에 소재한 밀리포어)를 이용하여 결정하였다:

6웰 플레이트 중의 1X10⁶개 세포/웰의 밀도로 백혈병 세포를 파종한다

목적으로 하는 농도로 시험 화합물/DMSO를 첨가한다

5% CO₂ 인큐베이터에서 24시간 동안 37℃에서 플레이트를 인큐베이션한다

2㎖ 원심분리관에서 세포를 수집한다

1.6㎕의 새로 준비한 5X 플리카(FLICA) 시약을 첨가하고 나서, 관을 약하게 손가락으로 튀김으로써 세포를 혼합한다

1시간 동안 37℃에서 5% CO₂하에 관을 인큐베이션시킨다

2㎖의 1X 세척 완충제를 각각의 관에 첨가하고, 혼합한다

세포를 400 x g 미만에서 5분 동안 실온에서 원심분리시킨다.

상청액을 조심해서 제거하고 버리고 나서, 세포 펠렛을 부드럽게 교반시켜 임의의 세포 대 세포 응집을 폐기한다.

300㎕의 1X 세척 완충제 중에서 세포 펠렛을 재교반시켰다

검정색 마이크로타이터 플레이트의 각각의 2개 웰 내로 100㎕의 각각의 세포 현탁액을 넣는다. 버블 생성을 피한다.

여기 파장 490㎚ 및 방출 파장 520㎚을 이용하여 각각의 마이크로 웰의 흡광도를 판독한다.

대조군 블랭크에 비교한 형광의 증가에 의해 나타난 카스파제-3 활성의 증가%를 계산할 것이다.

분석 6A: 인간 PBMC에서의 사이토카인 분석

본 연구의 목적은 인간 PBMC에서 항원-유도 사이토카인 방출에 대한 화합물 A1의 저해 가능성을 평가하는 것이었다.

플레이팅 및 처리

헤파린화된 인간 전혈을 PBS를 이용하여 1:1로 희석시키고 나서, 백혈구 분리 배지에 놓고, 400g으로 40분 동안 원심분리시켰다.

완충제 층을 제거하고 나서, PBS로 세척하였다.

0.15*10⁶의 PBMC를 RPMI 배지에서 웰 당 100㎕로 플레이팅하고 나서, 2시간 동안 인큐베이션시켰다.

배지에서 50㎕의 3X 화합물 희석물을 첨가하고 나서, 15분 동안 인큐베이션시켰다.

TNFα - 최종 농도가 1㎍/㎖가 되도록 RPMI 중의 50㎕의 LPS를 이용하여 유도한다. 상청액을 6시간에 수집하였다.

IL-2 - 최종 농도가 20㎍/㎖가 되도록 RPMI 중의 50㎕의 PHA를 이용하여 유도한다. 상청액을 24시간에 수집하였다.

IL-4 - 최종 농도가 20㎍/㎖가 되도록 RPMI 중의 50㎕의 PHA를 이용하여 유도. 상청액을 48시간에 수집하였다.

이바이오사이언스(eBioscience)로부터의 키트를 사용하는 ELISA를 수행하였다.

그래프패드 프리즘 5(GraphPad Prism 5)를 이용하여 EC₅₀을 계산하였다.

2 내지 3회의 독립적 실험으로부터 EC₅₀ 값을 계산하였다. 화합물 A1은 항원 유도 TNFα, IL-2 및 IL-4을 저해하였고, EC₅₀은 각각 7.1, 9.5, 및 3.5nM이었다.

분석 6B: 인간 또는 마우스 전혈에서 LPS 유도 CD19 또는 CD45R의 저해

인간 또는 마우스 B-림프구의 B-세포 수용체(BCR)-활성화 증식을 조절함에 있어서 화합물 A1의 효과를 결정하였다. CD19는 B-세포 블라스트(blast)에 대한 발생 동안 가장 초기의 인식가능한 B-계통 세포로부터 B 세포 상에서 존재하는 단백질이지만, 그러나, 혈장 세포에 대한 성숙은 상실된다. LPS는 내독소이며, BCR 신호전달 경로를 통해 B-세포 상에 강한 유사분열촉진 활성을 지니는 환경 미생물의 주된 구성성분이다.

희석된 인간 전혈을 DMSO 또는 목적으로 하는 농도의 화합물 A1으로 처리하였다. 샘플을 화합물의 첨가 후 15분에 LPS를 이용하여 유도하고 나서, 37℃ 및 5% CO₂에서 72시간 동안 인큐베이션시켰다. CD45 및 CD19에 대해 양성인 세포를 유세포 분석기에 의해 결정하고 나서, 데이터를 총 집단에서 CD19 양성 세포 백분율로서 표현한다. 화합물 A1에 의한 처리는 CD19 발현의 감소에 의해 나타낸 LPS-유도 인간 전혈 B-세포 증식(EC₅₀ =117.7 nM)의 용량 의존적 저해를 야기하였다.

CD19와 유사하게, CD45R(B220)은 이어지는 초기 프로-B 단계로부터의 그들의 발생 내내 마우스 B-림프구 상에서 발현되며, 혈장 세포에 대한 마지막 분화 시 하향조절된다. 간략하게, 희석된 마우스 전혈을 DMSO 또는 목적으로 하는 농도의 화합물 A1으로 처리하였다. 화합물 첨가 후 15분에 샘플을 LPS를 이용하여 유도하고 나서, 72시간 동안 37℃ 및 5% CO₂에서 인큐베이션시켰다. CD45 및 CD45R에 대해 양성인 세포를 유세포 분석기에 의해 결정하였다. 데이터를 총 집단에서 백분율 CD45R 양성 세포로서 표현한다. CD19+ 세포 증식 데이터와 일치되게, 화합물 A1에 의한 처리는 CD45R 발현의 감소에 의해 확인된 LPS-유도 마우스 전혈 B-세포 증식(EC₅₀ = 128.2nM)의 용량-의존적 저해를 감소시켰다.

분석 6C: 단리된 마우스 비장세포에서 AKT 인산화의 저해

PI3K 경로는 세포 증식, 성장 및 생존과 같은 몇몇 종양형성 과정을 조절하는 세린-트레오닌 키나제인 AKT에 의해 하향조절된다. 비장은 방대한 양의 B- 및 T-림프구에 대한 레퍼토리이기 때문에, LPS-유도 AKT 인산화의 저해를 단리된 마우스 비장세포를 이용하여 생체밖에서 결정하였다. 세포를 플레이팅하고 나서, 목적으로 하는 농도의 화합물 A1과 함께 15분 동안 인큐베이션시킨 다음, LPS(20㎍/㎖)를 이용하여 30분 동안 유도하였다. 유도 후, 세포를 용해시키고 나서, pAKT를 pAKT^S473 포획/검출 항체 쌍 및 항-마우스-HRP 2차 항체를 이용하여 ELISA에 의해 결정하였다. 시험 샘플에서 pAKT의 저해%를 계산하기 위해 블랭크 차감 흡광도 값을 얻었다. 화합물 A1은 저농도로 하류의 마커인 AKR의 인산화에서 용량-의존적 감소(EC₅₀ = 347.4nM)를 야기함으로써 신호전달 경로를 설명하였다.

분석 7: 암컷 위스타 래트 모델에서 지질다당류 유도 폐 호중구증가증

호중구의 과도한 동원 및 후속적 활성화는 몇몇 천식, 만성 폐쇄성 폐질환, 낭포성 섬유증 및 급성 호흡곤란 증후군과 같은 기도 및 폐의 몇몇 염증 질환의 발생 및 과정에 중요하게 될 가능성이 있다. 호중구가 이들 질환에 기여하는 메커니즘은 단백질 가수분해 효소, 예컨대 호중구 엘라스타제 및 유리 산소 라디칼의 방출을 수반할 수 있다. 방출될 때, 이들 화합물은 기관지수축, 기관지 과민반응, 분비 과다, 상피 손상 및 기도의 조직 재구성을 야기할 수 있다.

검역기간 후에, 절식 동물을 무작위화하고 나서, 그들의 체중에 따라서 다양한 그룹으로 나누었다. 시험 화합물(화합물 A1)을 0.5% 메틸셀룰로스로 이루어진 비히클 중의 현탁액으로서 준비하며, 이때 트윈(Tween) 80이 현탁제이다. 화합물 또는 비히클을 10㎖/㎏의 용적으로 경구 위관영양법에 의해 투여하였다. 암컷 위스타 래트를 케타민으로 마취시키고 나서, LPS 용액을 1㎎/㎏ 용량의 화합물 투여 후 1시간에 기관내로 투여하였다. LPS 점적 후 6시간에, 동물을 마취 하에 방혈시키고, 이어서, 기관에 캐뉼라를 넣고 나서, 폐를 기관 캐뉼라를 통해 4회 5㎖ 분취액의 헤파린처리된 PBS(1 단위/㎖)로 세척하였다(총 20㎖). 총 세포 및 분화 백혈구 수에 대해 분석할 때까지 기관지폐포세척(Bronchoalveolar lavage: BAL) 유체를 2 내지 8℃에서 저장하였다. 기관지폐포 유체를 원심분리시키고(10분 동안 500㎍), 얻어진 세포 펠렛을 헤파린 처리한 식염수 0.5㎖ 중에서 재현탁시켰다. 백혈구의 총 수를 혈액 세포 계수기를 이용함으로써 BAL 유체 또는 혈액 중에서 결정하고, 1×10⁶개 세포/㎖로 조절하였다. 분화 세포 계수를 수동으로 계산하였다. 100 마이크로리터의 세포 현탁액을 사이토스핀 3을 이용하여 원심분리시켜 세포 도말을 준비하였다. 세포 도말을 분화를 위해 혈액 염색 용액을 이용하여 염색하고 나서, 슬라이드를 현미경으로 관찰하여 그들의 형태 특징에 따라 호산구를 동정하였다. 세포 도말 내 300개 백혈구 중의 각각의 세포 유형의 수를 결정하고 나서, 백분율로서 표현하였다. 각각의 BALf 또는 혈액 중의 호산구 수를 계산하였다.

화합물 A1은 대조군에 비해 10㎎/㎏에서 65.29%의 저해로 폐 내로의 호중구 침윤의 감소를 나타내었는데, 이는 염증 장애에서 치료적 역할을 시사한다. 결과를 도 1에 나타낸다.

분석 8: 염증의 지질다당류 -유도 래트 공기 주머니 모델

암컷 위스타 래트(175 내지 200g)를 실험 시작 전 7일 동안 적응시켰다. 동물을 그들의 체중을 기준으로 다양한 그룹으로 무작위 분포시켰다. 동물을 에터를 이용하여 마취시키고 나서, 견갑골 영역에서 피부 아래에 20㎖의 멸균 공기를 주입함으로써 피하 공기 주머니를 만들고 나서(제0일), 제4일에 멸균-여과 공기의 두 번째 10㎖로 유지하였다. 제6일에, PS 용액의 제6일 s.c. 주사에 의한 염증 유도 1시간 전에 경구 처리를 시작하였다. 멸균 식염수(100㎍/㎏) 중에 용해시킨 5㎖의 LPS 용액의 용적을 각각의 주머니에 주입하였다. 주머니 유체 샘플을 5㎖의 멸균 식염수를 지니는 주머니를 플러슁함으로써 그리고 4㎖ 유체를 회수함으로써 LPS의 투여 후 6시간에 취하였다. 주머니 유체 중에 존재하는 백혈구의 수를 혈구 계수기를 이용하여 현미경으로 결정하였다. 디프-퀵(Diff-Quik)을 이용하여 염색한 유체 도말의 현미경 시험에 의해 분할 세포 함량을 결정하였다.

화합물 A1은 2.65㎎/㎏의 ED₅₀으로 래트 공기 주머니 내로 호중구 이동의 용량-의존적 감소를 야기하였는데, 이는 류마티스 관절염의 치료적 역할을 시사한다. 결과를 도 2에 나타낸다.

분석 9: 수컷 기닉픽에서 오발부민 유도 폐 호산구증가증

검역기간 후에, 각각의 개개 동물로부터 0.3㎖의 혈액 샘플을 안구뒤 망상조직 방법에 의해 완와 정맥으로부터 수집하고 나서, 세포 분석기(ADVIA 2120, 지멘스(Siemens)) 상에서 분석하였다. 그들의 총 세포수를 기준으로, 기닉픽을 무작위화하고 나서, 다양한 그룹으로 나눈다. 식별을 위해 귓바퀴를 지워지지 않는 마킹펜을 이용하여 마킹한다. 제0일에, 체중을 기록하고 나서, 동물을 복강내로 50㎍의 오발부민(OVA) 및 10㎎의 명반 용액(1㎖)에 의해 민감화시킨다. 제7일 및 제14일에, 상기 민감화 프로토콜을 반복한다. 동물을 제19일까지 질병의 임의의 증상 또는 민감화에 대한 반응에 대해 관찰하고 나서, 만약에 있다면 기록한다. 제19일, 제20일 및 제21일에, 경구 위관영양법에 의해 시험 화합물로 처리 후, 30분 이후에 동물을 0.5% w/v, 0.5% 및 1% 오발부민 시험감염에 각각 노출시킨다. 대조군 및 모의 그룹 동물을 0.5% w/v 메틸 셀룰로스(비히클)로 처리한다. 모의 대조군을 제0일, 제7일 및 제14일에 10㎎의 명반으로 민감화시키고 나서, 제19일, 제20일 및 제21일에 동일한 분무 속도로 식염수 용액(SAL)에 노출시킨다. 마지막 OVA 시험감염 후 20시간에, 누적 용량의 메타콜린 시험감염(75, 100, 125 및 150㎍/㎖)에 대해 전혈 혈량계에 의해 기도 과민성을 측정한다. 기도 반응을 측정한 후에, 혈액 샘플 및 BAL 유체를 수집하였다. 현미경 하에 샘플을 노이바우어(neubuear) 챔버를 이용함으로써 총 세포수에 대해 분석하고, 분화 백혈구 계수화를 수동으로 행한다.

분석 10: 뮤린 천식 모델

검역기간 후에, 그들의 체중에 기반하여, 마우스를 무작위화하고 나서, 4개 그룹으로 나누었다(n=7). 식별을 위해 꼬리를 지워지지 않는 마킹펜으로 마킹하였다. 제0일에, 체중을 기록하고 나서, 동물을 복강내로 100㎍의 오발부민 및 10㎎의 명반 용액(0.2㎖)을 이용하여 민감화시켰다.

제7일 및 제14일에, 상기 민감화 프로토콜을 반복하였다. 동물을 제24일까지 질병의 임의의 증상 또는 민감화에 대한 반응에 대해 관찰하고 나서, 만약에 있다면 기록한다. 제24일, 제25일 및 제26일에, 경구 위관영양법에 의해 시험 화합물로 처리 후, 30분 이후에 동물을 10% 오발부민 시험감염에 각각 노출시킨다.

대조군 및 모의 그룹 동물을 0.5% w/v 메틸 셀룰로스(비히클)를 이용하여 처리하였다. 모의 대조군 그룹을 제0일, 제7일 및 제14일에 10㎎의 명반을 이용하여 민감화하고 나서, 제24일, 제25일 및 제26일에 동일한 분무 속도로 식염수 용액에 노출시켰다.

마지막 OVA 시험감염의 48시간 후에, 누적 용량의 메타콜린 시험감염(2.5, 10, 50 및 100㎍/㎖)에 대해 전혈 혈량계에 의해 기도 과민성을 측정한다. 기도 반응을 측정한 후에, 혈액 샘플 및 BAL 유체를 수집하였다. 현미경 하에 샘플을 노이바우어(neubuear) 챔버를 이용함으로써 총 세포수에 대해 분석하고, 분화 백혈구 계수화를 수동으로 행한다.

분석 11: 위스타 래트에서 콜라겐 유도 관절염(CIA)

암컷 위스타 래트를 실험 시작 전 7일 동안 적응시키고 나서, 그들의 체중을 기준으로 다양한 기준으로 무작위로 분포시켰다. 제0일에, 동물을 꼬리의 기저에서 전달된 MTB(4㎎/㎖)를 함유하는 완전 프로인트 보조제(IFA)를 이용하여 500㎍의 소 콜라겐 II형의 진피내 주사에 의해 처리하였다. 1차 면역화 후 제7일에, 동물을 꼬리의 기저에서 진피내 주사에 의해 불완전 프로인트 애주번트 중의 300㎍ CII의 부스터 주사에 의해 처리하였다. 발목 관절에서 관절염의 개시는 보통 제12일 내지 제14일에 시각적으로 명확하게 되었다. 동물을 관절염의 개시 후 해당 일로부터 시험 화합물 또는 비히클로 치료하고 나서(경구 투여), 9연속일 동안 치료를 계속하였다. 연구 기간 내내 정기적으로 관절 염증의 징후에 대한 육안 검사에 의해 관절염 스코어를 매겼다. 체중, 발 용적, 발 두께의 측정을 제0일, 제1일, 제3일, 제5일, 제7일, 제9일 및 제10일에 취하였다. 10일 치료 후에, 연구 마지막에, 괴사 시 혈액을 회수하고 나서, 혈청 또는 혈장으로 처리하고 나서, 모든 관절을 취하고, 각각의 관절로부터 작은 조각의 조직을 취한 후 조직병리 분석을 위해 앞발과 뒷발을 둘 다 10% 포말린 중에 고정시키고 나서, 조직 세포균질액 중에서 사이토카인 분석을 위해 -80℃에서 저장하였다. 앞발 및 뒷발에 대한 임상 스코어 기준: 0 = 정상; 1 = 병에 걸린 또는 최소 홍반 및 종창의 하나의 뒷발 또는 앞발 관절; 2 = 병에 걸린 또는 경증의 확산 홍반 및 종창의 2개의 뒷발 또는 앞발; 3 = 병에 걸린 또는 중등증의 확산 홍반 및 종창의 3개의 뒷발 또는 앞발; 4 = 현저한 확산 홍반 및 종창, 또는 = 병에 걸린 4개의 발가락 관절; 5 = 발가락을 굽힐 수 없는 중증의 확산 홍반 및 중증의 종창 전체 발.

래트 CIA 모델에서 치료적으로 투약된 화합물 A1은 예방적 발(도 3c)과 치료적 발(도 3d) 둘 다에서 관찰된 임상 스코어의 감소(도 3a 및 도 3b)에서 상당한 효능을 입증한다.

래트 CIA 모델에서 치료적으로 투약된 화합물 A1은 뒷발(도 4a 및 도 4b) 및 발목 직경(도 4c 및 도 4d) 둘 다의 평균 발 용적의 감소에 있어서 상당한 효능을 입증한다.

조직학적 분석: 래트 CIA 모델에서 치료적으로 투약된 화합물 A1은 모든 뒷발 및 앞발의 조직병리학에 의해 관찰된 염증 저해(58.3%, 도 4a 참조), 연골(46.51%, 도 4b 참조) 및 판누스(49.18%, 도 4c 참조)의 상당한 효능을 입증한다.

관절염의 발생률 및 진행은 대조군 동물에 비해 처리군에서 상당히 감소되었다(도 5).

분석 12: 수컷 Balb /c 마우스에서의 급성 담배 연기 유도 세포 침윤

동물(수컷 Balb/c 마우스)을 실험의 시작 전 7일 동안 적응시킨다. 이어서, 동물을 그들의 체중을 기준으로 다양한 그룹으로 무작위로 분포시킨다. 제1일에, 마우스에게 경구/비강내 경로에 의해 시험 화합물 또는 비히클을 투여하고, 1시간 후에, 시험 화합물 투여 동물을 전신 노출 박스에 둔다. 제1일 및 제2일에, 마우스를 6회 담배 연기, 제3일에 8회 담배연기 및 제4일에 10회 담배연기를 유지하도록 노출시킨다. 각각의 담배 연기에 대한 노출을 10분 동안 지속할 것이다. 담배는 처음 2분에 완전히 탈 것이고, 이어서, 동물 환기장치를 이용하여 공기를 유동시키고, 다음 20분에 새로운 실내 공기에 노출시킬 것이다. 모든 두 번째 담배 후에, 새로운 실내 공기에 노출시키면서 추가 20분 휴식을 수행하도록 한다. 대조군 동물을 실내 공기챔버에 노출시킨다. 제1일 내지 제4일에, 동물에 경구 또는 비강내 경로에 의해 시험 화합물을 투여할 것이다. 제5일에, 마지막 담배 연기(cigarate smoke: CS) 노출 후 24시간에, 동물을 마취 하에 방혈시키고, 기관에 캐뉼라를 넣고 나서, 폐를 기관 캐뉼라를 통해 4회 0.5㎖ 분취액의 헤파린처리된 PBS(1 단위/㎖)로 세척하였다(총 2㎖). 총 세포 및 분화 백혈구 수에 대해 분석할 때까지 기관지폐포세척(BAL) 유체를 2 내지 8℃에서 저장한다. 기관지폐포 유체를 원심분리시키고(10분 동안 500㎍), 얻어진 세포 펠렛을 헤파린 처리한 식염수 0.5㎖ 중에서 재현탁시킨다. 백혈구의 총 수를 혈액 세포 계수기를 이용하여 BAL 유체 또는 혈액 중에서 결정하고, 1×10⁶개 세포/㎖로 조절한다. 분화 세포 계수를 수동으로 계산한다. 40 마이크로리터의 세포 현탁액을 사이토스핀 3을 이용하여 원심분리시켜 세포 도말을 준비한다. 세포 도말을 분화를 위해 혈액 염색 용액을 이용하여 염색하고 나서, 현미경으로 관찰하여 그들의 형태 특징에 따라 호산구를 동정한다. 세포 도말 내 300개 백혈구 중의 각각의 세포 유형의 수를 결정하고 나서, 백분율로서 표현하고, 각각의 BAL 유체 중의 호중구 및 대식세포 수를 계산한다.

분석 13: Balb /c 마우스 모델에서 이미퀴모드 유도 판상형 건선

이미퀴모드(IMQ)는 본래 비흑색종 피부암의 치료를 위해 사용한 TLR7 및 TLR8에 대한 리간드이다. 마우스의 제모한 등 피부에 대한 IMQ의 국소 도포로 가시세포증, 착각화증 및 면역 세포의 침윤 및 IL23 / IL17 / IL22 경로의 연루를 포함하는 대부분의 인간 건선 병리 특징적 특징을 나타내는 건선 유사 피부 병태를 유도한다. 동물(수컷 Balb/c 마우스)을 실험 시작 전 7일 동안 적응시켰다. 동물을 그들의 체중을 기준으로 다양한 그룹으로 무작위로 분포시킨다. 제0일에, 마우스의 등 피부를 제모 크림의 국소 도포에 의해 제모하였다. 제1일에, 마우스에게 경구 경로에 의해 시험 화합물 또는 비히클을 투여하고 나서, 1시간 후 시험 화합물을 받은 마우스는 제모한 등 피부 상에 62.5㎎의 상업적으로 입수가능한 IMQ 크림(5%; 베셀나 크림(Beselna Cream); 일본 도쿄에 소재한 모치다 파마슈티칼스(Mochida Pharmaceuticals))의 국소 도포를 받았다. 마우스를 다음 5연속일 동안, 시험 화합물 또는 비히클 투여 후 1시간에 이미퀴모드의 국소 투여로 치료하였다. 매일 국소 도포 후 그들의 우리로 복귀시키기 전에 동물을 1시간 동안 건조시켰다. IMQ 크림의 최종 도포 후 4시간에, 마우스를 죽이고, 피부 샘플을 얻었다. 다이얼 두께 게이지를 이용하여 등 피부 두께를 측정하였다. 피부 두께를 측정한 후에, 피부 샘플을 10% 중성 완충 포말린 용액 중에서 고정시키고 나서, 파라핀 중에서 포매시켰다. 탈파라핀화된 부문을 헤마톡실린-에오신(HE)을 이용하여 염색하였다. 부문 당 5개의 독립적 장의 값을 평균화함으로써 표피 두께를 정량화하였다. 등 피부의 염증 중증도를 스코어링하기 위해, 인간 임상 건선 중증도 지수(Psoriasis Area and Severity Index: PASI)를 기준으로 객관적 스코어링 시스템을 사용하였다. 홍반, 벗겨짐 및 두께를 0 내지 4:0 = 없음; 1 = 약간; 2 = 보통; 3 = 현저함; 및 4 = 매우 현저함의 등급으로 독립적으로 스코어링하였다.

도 6A 및 도 6B에서 나타내는 바와 같이, 화합물 A1은 대조군 동물에 비해 등 피부 두께, 홍반 및 벗겨짐(조직병리학적 스코어에 의해 나타낸 바와 같음)이 감소되었다.

본 명세서의 발명을 특정 실시형태와 관련하여 기재하였지만, 이들 실시형태는 단지 본 발명의 원칙 및 적용분야의 예시라는 것이 이해되어야 한다. 따라서, 수많은 변형이 예시적 실시형태로 이루어질 수 있고, 다른 배열이 상기 기재한 바와 같은 본 발명의 정신과 범주로부터 벗어나는 일 없이 고안될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 첨부하는 청구범위는 본 발명의 범주를 정하며, 이에 의해 이들 청구범위 범주 내의 구조 및 이들의 동등물을 아우른다는 것이 의도된다.

본 출원에 인용된 모든 간행물 및 특허 및/또는 특허 출원은 각각의 개개 간행물 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 본 명세서에 참고로 포함되는 것과 동일한 정도로 참고로 포함된다.

Claims

N-(5-(4-아미노-1-(1-(5-플루오로-3-(3-플루오로페닐)-4-옥소-4H-크로멘-2-일)에틸)-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-3-일)-2-메톡시페닐)메탄설폰아마이드 및 이의 약제학적으로 허용 가능한 염으로부터 선택되는 화합물.
제1항에 있어서, 상기 화합물은,
(RS)-N-(5-(4-아미노-1-(1-(5-플루오로-3-(3-플루오로페닐)-4-옥소-4H-크로멘-2-일)에틸)-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-3-일)-2-메톡시페닐)메탄설폰아마이드;
(S)-N-(5-(4-아미노-1-(1-(5-플루오로-3-(3-플루오로페닐)-4-옥소-4H-크로멘-2-일)에틸)-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-3-일)-2-메톡시페닐)메탄설폰아마이드;
(R)-N-(5-(4-아미노-1-(1-(5-플루오로-3-(3-플루오로페닐)-4-옥소-4H-크로멘-2-일)에틸)-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-3-일)-2-메톡시페닐)메탄설폰아마이드;
및 이의 약제학적으로 허용 가능한 염로부터 선택되는, 화합물.
(S)-N-(5-(4-아미노-1-(1-(5-플루오로-3-(3-플루오로페닐)-4-옥소-4H-크로멘-2-일)에틸)-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-3-일)-2-메톡시페닐)메탄설폰아마이드 및 이의 약제학적으로 허용 가능한 염으로부터 선택되는 화합물.
제3항에 있어서, 상기 화합물은 (R)-N-(5-(4-아미노-1-(1-(5-플루오로-3-(3-플루오로페닐)-4-옥소-4H-크로멘-2-일)에틸)-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-3-일)-2-메톡시페닐)메탄설폰아마이드 및 이의 약제학적으로 허용 가능한 염이 실질적으로 없는, 화합물.
제3항에 있어서, 상기 화합물은 거울상이성질체 과잉률이 약 95% 초과인, 화합물.
(S)-N-(5-(4-아미노-1-(1-(5-플루오로-3-(3-플루오로페닐)-4-옥소-4H-크로멘-2-일)에틸)-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-3-일)-2-메톡시페닐)메탄설폰아마이드.
제6항에 있어서, 상기 화합물은 (R)-N-(5-(4-아미노-1-(1-(5-플루오로-3-(3-플루오로페닐)-4-옥소-4H-크로멘-2-일)에틸)-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-3-일)-2-메톡시페닐)메탄설폰아마이드가 실질적으로 없는, 화합물.
제6항에 있어서, 상기 화합물은 거울상이성질체 과잉률이 약 95% 초과인, 화합물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 화합물 및 적어도 1종의 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
세포에서 PI3δ 키나제의 촉매적 활성을 저해하는 방법으로서, 상기 세포를 유효량의 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 화합물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포에서 PI3δ 키나제의 촉매적 활성을 저해하는 방법.
세포에서 PI3γ 키나제의 촉매적 활성을 저해하는 방법으로서, 상기 세포를 유효량의 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 화합물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포에서 PI3γ 키나제의 촉매적 활성을 저해하는 방법.
세포에서 PI3δ 키나제 및 PI3γ 키나제의 촉매적 활성을 저해하는 방법으로서, 상기 세포를 유효량의 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 화합물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포에서 PI3δ 키나제 및 PI3γ 키나제의 촉매적 활성을 저해하는 방법.
제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 저해는 증식 질환, 뼈 장애, 염증 질환, 면역 질환, 신경계 질환, 대사 질환, 호흡 질환, 혈전증 및 심장 질환으로부터 선택되는 질환, 장애 또는 병태로 고통받고 있는 대상체에서 일어나는, 방법.
백혈병의 치료가 필요한 환자에서 상기 백혈병을 치료하는 방법으로서, 상기 환자에게 유효량의 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 화합물을 투여하는 단계를 포함하는, 백혈병을 치료하는 방법.
천식 또는 만성 폐쇄성 폐질환의 치료가 필요한 환자에서 상기 천식 또는 만성 폐쇄성 폐질환을 치료하는 방법으로서, 상기 환자에게 유효량의 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 화합물을 투여하는 단계를 포함하는, 천식 또는 만성 폐쇄성 폐질환을 치료하는 방법.
류마티스 관절염, 건선, 낭창 또는 실험적 자가면역뇌척수염(EAE)의 치료가 필요한 환자에서 상기 류마티스 관절염, 건선, 낭창 또는 실험적 자가면역뇌척수염(EAE)을 치료하는 방법으로서, 상기 환자에게 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 화합물을 투여하는 단계를 포함하는, 류마티스 관절염, 건선, 낭창 또는 실험적 자가면역뇌척수염을 치료하는 방법.
만성 림프구성 백혈병(CLL), 비호지킨 림프종(NHL), 호지킨 림프종(HL) 급성 골수성 백혈병(AML), 다발성 골수종(MM), 소림프구 림프종(SLL), 또는 지연성 비호지킨 림프종(I-NHL) 질환의 치료가 필요한 환자에서 상기 만성 림프구성 백혈병, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종 급성 골수성 백혈병 다발성 골수종, 소림프구 림프종 또는 지연성 비호지킨 림프종 질환을 치료하는 방법으로서, 상기 환자에게 유효량의 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 화합물을 투여하는 단계를 포함하는, 만성 림프구성 백혈병, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종 급성 골수성 백혈병 다발성 골수종, 소림프구 림프종 또는 지연성 비호지킨 림프종 질환을 치료하는 방법.
PI3 δ/γ 키나제의 촉매적 활성을 저해하는 것이 유리한 질환, 장애 또는 병태의 치료를 위한 의약의 제조에서, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 화합물의 용도.
PI3 δ/γ 키나제의 촉매적 활성을 저해하는 것이 유리한 질환, 장애 또는 병태의 치료를 위한 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 화합물의 용도.
PI3K 관련 질환, 장애 또는 병태의 치료방법으로서, 유효량의 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 화합물을 투여하는 단계를 포함하는, PI3K 관련 질환, 장애 또는 병태의 치료방법.
제20항에 있어서, 항암제, 항염증제, 면역억제제, 스테로이드, 비스테로이드 항염증제, 항히스타민제, 진통제 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 추가적인 활성제를 투여하는 단계를 더 포함하는, PI3K 관련 질환, 장애 또는 병태의 치료방법.
제20항에 있어서, 상기 PI3K 관련 질환, 장애 또는 병태는 면역계-관련 질환, 염증을 수반하는 질환 또는 장애, 암 또는 다른 증식 질환, 간질환 또는 장애, 또는 신장질환 또는 장애인, PI3K 관련 질환, 장애 또는 병태의 치료방법.
제20항에 있어서, 상기 PI3K 관련 질환, 장애 또는 병태는 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, B-세포 림프종, T-세포 림프종, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 모발세포 림프종, 버킷 림프종, 급성 및 만성 골수성 백혈병, 골수이형성 증후군 및 전골수성 백혈병, 건선, 류마티스 관절염, 골관절염, 천식, COPD, 알레르기 비염 및 홍반성 낭창으로부터 선택되는, PI3K 관련 질환, 장애 또는 병태의 치료방법.
(S)-2-(1-(4-아미노-3-(4-메톡시-3-나이트로페닐)-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-1-일)에틸)-5-플루오로-3-(3-플루오로페닐)-4H-크로멘-4-온,
(S)-2-(1-(4-아미노-3-(3-아미노-4-메톡시페닐)-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-1-일)에틸)-5-플루오로-3-(3-플루오로페닐)-4H-크로멘-4-온으로부터 선택되는 화합물,
및 이들의 염.
하기 단계들을 포함하는, 하기 화학식 (I)의 제조방법:

(a) 하기 5-브로모-2-메톡시아닐린:

을 메탄 설폰일 클로라이드와 반응시켜, 하기 N-(5-브로모-2-메톡시페닐)메탄설폰아마이드(중간체 1)를 제공하는 단계:

(b) 중간체 1을 비스(피나콜라토)다이보론과 반응시켜 하기 N-(2-메톡시-5-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-다이옥사보롤란-2-일)페닐)메탄설폰아마이드(중간체 2)를 제공하는 단계:

;
(c) 하기 2-(1-(4-아미노-3-요오도-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-1-일)에틸)-5-플루오로-3-(3-플루오로페닐)-4H-크로멘-4-온:

을 적합한 염기의 존재 하에 중간체 2와 반응시켜 화학식 (I)의 화합물을 제공하는 단계.
하기 단계들을 포함하는, 하기 화학식 (A1)의 화합물의 제조방법:

(a) 트라이페닐포스핀 및 다이아이소프로필아조다이카복실레이트를 이용하는 미츠노부 조건 하에서, 하기 (R)-5-플루오로-3-(3-플루오로페닐)-2-(1-하이드록시에틸)-4H-크로멘-4-온:

을 하기 3-(4-메톡시-3-나이트로페닐)-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-4-아민:

과 반응시켜 하기 (S)-2-(1-(4-아미노-3-(4-메톡시-3-나이트로페닐)-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-1-일)에틸)-5-플루오로-3-(3-플루오로페닐)-4H-크로멘-4-온(중간체 3)을 제공하는 단계:

;
(b) 중간체 3을 환원시켜 하기 (S)-2-(1-(4-아미노-3-(3-아미노-4-메톡시페닐)-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-1-일)에틸)-5-플루오로-3-(3-플루오로페닐)-4H-크로멘-4-온(중간체 4)을 제공하는 단계:

;
(c) 중간체 4를 메탄설폰일 클로라이드와 반응시켜 화학식 (A1)의 화합물을 반응시키는 단계.