EA031135B1

EA031135B1 - Замещенные производные хромена как селективные двойные ингибиторы протеинкиназ pi3 дельта и гамма

Info

Publication number: EA031135B1
Application number: EA201692297A
Authority: EA
Inventors: Прашант Кашинат Бхавар; Сваруп Кумар Венката Сатья Ваккаланка
Original assignee: Ризен Фармасьютикалз Са
Priority date: 2014-06-27
Filing date: 2015-06-26
Publication date: 2018-11-30
Also published as: CL2016003328A1; JP2017526631A; CO2017000687A2; US9708329B2; CN106661029B; AU2015278699B2; WO2015198289A1; ES2708748T3; JP6557266B2; US20200199133A1; US20170204106A1; EA201692297A1; PH12016502572A1; IL249740A0; EP3160968A1; US10179786B2; CA2951370A1; DK3160968T3; NZ727214A; KR20170016489A

Abstract

Изобретение относится к селективному двойному модулятору протеинкиназ PI3K дельта (δ) и гамма (γ) - (S)-N-(5-(4-амино-1-(1-(5-фтор-3-(3-фторфенил)-4-оксо-4H-хромен-2-ил)этил)-1H-пиразоло[3,4-d]пиримидин-3-ил)-2-метоксифенил)метансульфонамиду, способам его получения, фармацевтическим композициям, содержащим его, и способам лечения, профилактики и/или облегчения заболеваний или расстройств, опосредованных киназой PI3K, с его использованием.

Description

Изобретение относится к селективному двойному модулятору протеинкиназ PI3K дельта (δ) и гамма (у) - (8)-М-(5-(4-амино-1-(1-(5-фтор-3-(3-фторфенил)-4-оксо-4Н-хромен-2-ил)этил)-1Нпиразоло[3,4-<1]пиримидин-3-ил)-2-метоксифенил)метансульфонамиду, способам его получения, фармацевтическим композициям, содержащим его, и способам лечения, профилактики и/или облегчения заболеваний или расстройств, опосредованных киназой ΡΙ3Κ, с его использованием.

031135 Bl

В патенте заявляется приоритет по заявке на патент Индии № 3144/CHE/2014, поданной 27 июня 2014 г., которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки.

Область изобретения

В настоящем изобретении предложены двойные модуляторы протеинкиназ PI3K дельта (δ) и гамма (γ), способы их получения, фармацевтические композиции, содержащие их, и способы лечения, профилактики и/или ослабления заболеваний или расстройств, опосредованных киназой PI3K, с их использованием.

Уровень техники

Фосфоинозитид-3-киназа (PI3K) относится к классу внутриклеточных липидкиназ, которые фосфорилируют фосфоинозитидные липиды (PI) по гидрокси-группе в положении 3 инозитольного кольца, образуя вторичный липидный мессенджер. Тогда как α- и β-изоформы PI3K повсеместно распространены, экспрессия δ- и γ-форм PI3K ограничена находящимися в кровотоке кроветворными клетками и эндотелиальными клетками. В отличие от PI3Ka или PI3K3 у мышей с недостатком экспрессии PI3I<fS или PI3K',' не наблюдалось каких-либо побочных фенотипных проявлений, указывая на то, что воздействие на эти конкретные изоформы не будет приводить к возникновению острой токсичности.

Недавно в качестве иммуномодулирующих агентов были предложены селективные ингибиторы пути PI3K. Интерес обусловлен тем фактом, что сигнальный путь PI3K осуществляет большое количество функций при передаче сигнала в иммунных клетках, главным образом путем образования фосфатидилинозитол-(3,4,5)-трифосфата (PIP3), мембраносвязанного вторичного мессенджера. PIP3 рекрутирует белки к цитоплазматической стороне липидного бислоя, в том числе протеинкиназы и ГТФазы, запуская сложную сеть последующих сигнальных каскадов, важных для регуляции адгезии, миграции и межклеточного взаимодействия иммунных клеток.

Четыре изоформы PI3K класса I существенно различаются по распределению в тканях. PI3Ka и PI3K3 широко распространены и активируются рецепторными тирозинкиназами (РТК), тогда как PI3KS и PI3K',' ограничены главным образом кроветворными и эндотелиальными клетками и активируются РТК и рецепторами, сопряженными с G-белком (GPCR), соответственно. В генетических исследованиях на мышах обнаружено, что PI3Ka и PI3K3 необходимы для нормального развития, тогда как отсутствие PI3K<3 и/или PI3Ky приводит к жизнеспособному потомству с определенным иммунным дефицитом.

Особенности экспрессии и функции PI3K<3 и PI3Ky вызывают большой интерес при разработке ингибиторов PI3I<i3/Y в качестве активных агентов для лечения многих заболеваний, в том числе, например, ревматоидного артрита, аллергий, астмы, хронической обструктивной болезни легких и рассеянного склероза (Hirsch et al., Pharmacol. Ther., 118, 192-205, 2008; Marone et al., Biochim. Biophys. Acta., 1784, 159-185, 2008; Rommel et al., Nat. Rev. Immunol, 7, 191-201, 2007; Ruckle et al., Nat. Rev. DrugDiscov., 5, 903-918, 2006). Исследования с использованием как фармакологических, так и генетических методов показали, что эти две изоформы часто проявляют синергическое взаимодействие друг с другом (Konrad et al., J. Biol. Chem., 283, 33296-33303, 2008; Laffargue et al., Immunity, 16, 441-451, 2002). Например, в тучных клетках PI3I<i3 необходима для дегрануляции в ответ на сшивание IgE с Fc-рецепторами (АН et al., J. Immunol, 180, 2538-2544, 2008), тогда как PI3K',' играет важную роль в усилении отклика (Laffargue et al., Immunity, 16, 441-451, 2002). Подобные эффекты были обнаружены для других клеточных функций, включая хоминг лимфоцитов и окислительный всплеск нейтрофилов, где PI3K',' играет ключевую роль, a PI3I<i3 усиливает каждый процесс. Не дублирующие друг друга, но взаимосвязанные роли PI3K<3 и PI3K',' усложняют определение того, на какую из двух изоформ (отдельно или в комбинации) лучше воздействовать при конкретном воспалительном расстройстве.

Исследования на мышах с недостатком PI3K<3 и/или PI3Ky, или у которых экспрессируются неактивные варианты PI3K<3 и PI3Ky, являются ценным инструментом для понимания роли этих киназ. Например, мыши, нокаутные по PI3K<3, продемонстрировали уменьшение хемотаксиса нейтрофилов, уменьшение выработки антител (как зависимых, так и независимых от Т-клеток) (Jou et al., Mol Cell. Biol, 22, 8580-8591, 2002) и снижение количества зрелых В-клеток (Clayton et al., J. Exp. Med., 196, 753763, 2002; Jou et al., Mol. Cell. Biol, 22, 8580-8591, 2002) и уменьшение их пролиферации в ответ на антиIgM (Jou et al., Mol. Cell. Biol, 22, 8580-8591, 2002). Этот фенотип был воспроизведен в случае неактивного варианта киназы PI3IK3 и в присутствии ингибиторов, селективных к PI3K<3. вместе с уменьшением количества и пролиферации тучных клеток и слабой аллергической реакцией. Для мышей, нокаутных по PI3K','. наблюдалось большее количество, но медленнее реагирующих, нейтрофилов, меньшее количество и медленнее реагирующих макрофагов и дендритные клетки, отражающие уменьшение дегрануляции тучных клеток (Laffargue et al., Immunity, 16, 441-451, 2002), более высокое отношение CD4+ к CD8+ Тклеткам, усиление апоптоза тимоцитов, уменьшение выработки CXCR3 на активированных Т -клетках и снижение сократительной способности сердца. Такое влияние на ткань сердца вызывало беспокойство, если пациенту постоянно вводят ингибиторы киназы PI3K','. Однако эта проблема была в значительной степени устранена, когда мыши с неактивным вариантом киназы PI3Ky (который лучше имитирует ингибирование киназы по сравнению с недостатком белка) продемонстрировали подобные фенотипы им

- 1 031135 мунных клеток, но что важно, у них не наблюдалось нарушений работы сердца. Позже было показано, что влияние на сердце было связано с эффектом носителя, а не каталитической активностью ΡΙ3Κγ (Olusegon et al., Chemistry & Biology, 1, 123-134, 2010, в том числе цитируемые там ссылки). Животные, нокаутные и по ΡΙ3Κδ, и по ΡΙ3Κγ, жизнеспособны, но у них наблюдаются серьезные нарушения развития Т-клеток и выживания тимоцитов. Комбинация нокаут Р13К-,'/неактивная киназа ΡΙ3Κδ приводила к подобному фенотипу, указывая на то, что по меньшей мере в пределах иммунной системы роль ΡΙ3Κδ, вероятно, только каталитическая. Объяснение результатов исследований с использованием нокаутных мышей и мышей с неактивной киназой может быть сложной задачей, поскольку эти модели дают только стационарную картину иммунной системы, не учитывая влияние времени и дозы, и не дают полного представления о том, как динамический отклик иммунной системы будет реагировать на обратимое ингибирование. Для исследования передачи сигнала в лейкоцитах необходимы селективные ингибиторы с различающимися профилями (ΡΙ3Κδ, ΡΙ3Κγ и ΡΙ3Κδ/γ) для того, чтобы оценить относительные вклады каждой ΡΙ3Κ в активацию иммунных клеток (Olusegon et al., supra, в том числе цитируемые там ссылки).

Подразумевается, что двойное ингибирование δ/γ в значительной степени вовлечено в аллергическое и неаллергическое воспаление дыхательных путей и другие аутоиммунные заболевания. Научные доказательства вовлечения ΡΙ3Κδ и ΡΙ3Κγ в различные клеточные процессы, лежащие в основе астмы и хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ), основаны на исследованиях ингибиторов и методов нацеливания на ген (William et al., Chemistry & Biology, 17, 123-134, 2010 и Thompson, et al., Chemistry & Biology, 17:101-102, 2010). Устойчивость к традиционной терапии, такой как с использованием кортикостероидов, у нескольких пациентов с ХОБЛ также отнесли к активации пути ΡΙ3Κδ/γ. Следовательно, нарушение передачи сигнала ΡΙ3Κδ/γ обеспечивает новую стратегию, направленную на противодействие иммуно-воспалительной реакции. Вследствие ключевой роли ΡΙ3Κδ и ΡΙ3Κγ в опосредовании функций воспалительных клеток, таких как миграция и активация лейкоцитов и дегрануляция тучных клеток, блокирование этих изоформ также может быть эффективной стратегией для лечения ревматоидного артрита. Учитывая установленную важность этих изоформ в иммунном надзоре, ожидается, что ингибиторы, которые специфически нацелены на изоформы ΡΙ3Κδ и ΡΙ3Κγ, будут ослаблять развитие иммунной реакции, наблюдаемой при воспалении дыхательных путей и ревматоидном артрите (William et al., Chemistry & Biology, 17, 123-134, 2010 и Thompson, et al., Chemistry & Biology, 17:101-102,2010).

Обзор и исследования касательно сигнальных путей ΡΙ3Κ и родственных протеинкиназ даны в Liu et al., Nature Reviews Drug Discovery, 8, 627-644, 2009); Nathan et al., Mol Cancer Ther., 8(1), 2009; Marone et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1784, 159-185, 2008 и Markman et al., Annals of Oncology Advance Access, опубликованной в августе 2009 г. Аналогично обзор и исследования касательно роли ΡΙ3Κδ и ΡΙ3Κγ даны в William et al., Chemistry & Biology, 17, 123-134, 2010 и Timothy et al., J. Med. Chem., 55 (20), 85598581, 2012. Все представленные литературные источники включены в данный документ в полном объеме посредством ссылки.

В качестве двойных ингибиторов ΡΙ3Κδ/γ описаны такие соединения, как ΙΡΙ-145 и CAL130 (WO2012/008302 и WO2012/121953, соответственно). ΙΡΙ-145 находится на стадии клинических исследований для лечения рака, астмы и ревматоидного артрита. Сообщалось, что ΙΡΙ-45 имеет максимально переносимую дозу (МПД) 75 мг дважды в сутки (55^th ASH® Annual Meeting. New Orleans-LA, Dec 7-10, 2013). Нет данных об исследовании CAL-130 в клинических целях.

До сих пор существует неудовлетворенная потребность в двойных модуляторах ΡΙ3Κδ/γ для лечения заболеваний и расстройств, связанных с явлениями, опосредованными киназами ΡΙ3Κδ/γ.

Дополнительно, в данном документе ссылаются на международные публикации № WO 11/055215 и WO 12/151525 и публикации патентов США № 2011/0118257 и 2012/0289496, каждая из которых включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к селективным двойным ингибиторам протеинкиназ ΡΙ3Κ дельта (δ) и гамма (γ). Эти соединения пригодны для применения в фармацевтической композиции для лечения заболеваний, расстройств или патологических состояний, связанных с ΡΙ3Κ, например пролиферативного заболевания, такого как рак. Одновременное ингибирование протеинкиназ ΡΙ3Κδ и ΡΙ3Κγ может обеспечивать полезный эффект при лечении некоторых заболеваний или расстройств.

Селективные двойные ингибиторы по настоящему изобретению включают №(5-(4-амино-1-(1-(5фтор-3-(3-фторфенил)-4-оксо-4Н-хромен-2-ил)этил)-1Н-пиразоло[3,4^]пиримидин-3-ил)-2метоксифенил)метансульфонамид, его фармацевтически приемлемые соли и его пролекарства. Например, селективный двойной ингибитор может быть выбран из следующих соединений, их фармацевтически приемлемых солей и их пролекарств:

(RS)-N-(5-(4-амино-1-( 1 -(5 -фтор-3 -(3 -фторфенил)-4-оксо-4Н-хромен-2-ил)этил)-1Н-пиразоло [3,4-d] пиримидин-3-ил)-2-метоксифенил)метансульфонамида (соединение А); и

^)-Л-(5-(4-амино-1-(1-(5-фтор-3-(3-фторфенил)-4-оксо-4Н-хромен-2-ил)этил)-1Н-пиразоло[3,4Щ] пиримидин-3-ил)-2-метоксифенил)метансульфонамида (соединение А1).

- 2 031135

В одном варианте реализации изобретения соединение (8)-К-(5-(4-амино-1-(1-(5-фтор-3-(3-фторфенил)-4-оксо-4Н-хромен-2-ил)этил)-1Н-пиразоло[3,4-б] пиримидин-3-ил)-2-метоксифенил)метансульфонамид или его фармацевтически приемлемая соль практически свободны от (например, содержит менее около 10%, например, менее около 5%, менее около 2,5%, менее около 1%, менее около 0,1% по массе) или полностью свободны от (К)-М-(5-(4-амино-1-(1(5-фтор-3-(3-фторфенил)-4-оксо-4H-хромен-2-ил)этил)-1H-пиразоло[3,4-d]пиримидин-3-ил)-2-метоксифенил)метансульфонамида или его фармацевтически приемлемых солей.

В другом варианте реализации изобретения соединение (Б)-К-(5-(4-амино-1-(1-(5-фтор-3-(3-фторфенил)-4-оксо-4H-хромен-2-ил)этил)-1H-пиразоло[3,4-d]пиримидин-3-ил)-2-метоксифенил)метансульфонамид или его фармацевтически приемлемая соль обладает энантиомерной чистотой более чем около 90%, такой как более чем около 91%, более чем около 92%, более чем около 93%, более чем около 94%, более чем около 95%, более чем около 96%, более чем около 97%, более чем около 98%, более чем около 99%, более чем около 99,5%, более чем около 99,9% или более чем около 99,99%.

В одном предпочтительном варианте реализации настоящее изобретение относится к соединению (S)-N-(5-(4-амино-1-(1-(5-фтор-3-(3-фторфенил)-4-оксо-4H-хромен-2-ил)этил)-1H-пиразоло[3,4-d]пиримидин-3-ил)-2-метоксифенил)метансульфонамиду (соединение А1).

В другом предпочтительном варианте реализации настоящее изобретение относится к соединению (S)-N-(5-(4-амино-1-(1-(5-фтор-3-(3-фторфенил)-4-оксо-4H-хромен-2-ил)этил)-1H-пиразоло[3,4-d]пиримидин-3-ил)-2-метоксифенил)метансульфонамиду или его фармацевтически приемлемой соли.

Другой вариант реализации настоящего изобретения представляет собой (Я)-К-(5-(4-амино-1-(1-(5фтор-3-(3-фторфенил)-4-оксо-4H-хромен-2-ил)этил)-1H-пиразоло[3,4-d]пиримидин-3-ил)-2-метоксифенил)метансульфонамид (соединение А2), его фармацевтически приемлемую соль или его пролекарство. Соединение А2 является ингибитором протеинкиназы PI3K дельта (δ). Эти соединения пригодны для применения в фармацевтической композиции для лечения заболеваний, расстройств или патологических состояний, связанных с PI3K, например, пролиферативного заболевания, такого как рак.

Химические структуры

N-(5-(4-Амино-1-(1-(5-фтор-3-(3-фторфенил)-4-оксо-4H-хромен-2-ил)этил)-1H-пиразоло[3,4-б]пиримидин-3-ил)-2-метоксифенил)метансульфонамида, соединения А1 и соединения А2 представлены ниже.

В настоящем изобретении дополнительно предложена фармацевтически приемлемая композиция, содержащая одно или более соединений по настоящему изобретению (таких как соединение А1) вместе с фармацевтически приемлемым носителем. Фармацевтическая композиция может дополнительно содержать один или более дополнительных активных агентов (таких как противоопухолевые агенты или активные агенты, описанные ниже). В одном варианте реализации изобретения фармацевтическая композиция включает терапевтически эффективное количество одного или более соединений по настоящему изобретению.

Другой аспект настоящего изобретения относится к способу получения К-(5-(4-амино-1-(1-(5-фтор3-(3-фторфенил)-4-оксо-4H-хромен-2-ил)этил)-1H-пиразоло[3,4-d]пиримидин-3-ил)-2-метоксифенил) метансульфонамида:

Способ включает следующие стадии, в которых:

(а) обеспечивают взаимодействие 5-бром-2-метоксианилина

- 3 031135

с метансульфонилхлоридом, чтобы получить ^(5-бром-2-метоксифенил)метансульфонамид (промежуточное соединение 1):

(b) обеспечивают взаимодействие промежуточного соединения 1 с бис(пинаколато)дибором, например, в присутствии ацетата калия, чтобы получить ^(2-метокси-5-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2диоксаборолан-2-ил) фенил)метансульфонамид (промежуточное соединение 2):

И (с) обеспечивают взаимодействие 2-(1-(4-амино-3-иод-Ш-пиразоло[3,4-б]пиримидин-1-ил)этил)5-фтор-3-(3-фторфенил)-4H-хромен-4-она

с промежуточным соединением 2 в присутствии основания (такого как, например, карбонат натрия), чтобы получить целевое соединение N-(5-(4-амино-1-(1-(5-фтор-3-(3-фторфенил)-4-оксо-4Hхромен-2-ил)этил)-Ш-пиразоло[3,4-б]пиримидин-3-ил)-2-метоксифенил)метансульфонамид;

(d) необязательно превращают N-(5-(4-амино-1-(1-(5-фтор-3-(3-фторфенил)-4-оксо-4H-хромен-2ил)этил)-Ш-пиразоло[3,4-б]пиримидин-3-ил)-2-метоксифенил)метансульфонамид в его фармацевтически приемлемую соль или пролекарство.

Еще один вариант реализации изобретения относится к способу получения соединения формулы (А1):

(а) вводят (R)-5-фтор-3-(3-фторфенил)-2-(1-гидроксиэтил)-4H-хромен-4-он:

в реакцию Мицунобу с 3-(4-метокси-3-нитрофенил)-1Н-пиразоло[3,4-б]пиримидин-4-амином:

(например, в присутствии трифенилфосфина и диизопропилазодикарбоксилата), чтобы получить (S)-2-( 1 -(4-амино-3 -(4-метокси-3 -нитрофенил)-1 H-пиразоло [3,4-б]пиримидин-1 -ил)этил)-5 -фтор-3 -(3

- 4 031135 фторфенил)-4Н-хромен-4-он (промежуточное соединение 3):

(b) восстанавливают промежуточное соединение 3, например, с использованием такого восстанавливающего агента, как никель Ренея, чтобы получить (Б)-2-(1-(4-амино-3-(3-амино-4-метоксифенил)-Шпиразоло[3,4-d]пиримидин-1 -ил)этил)-5-фтор-3 -(3-фторфенил)-4H-хромен-4-он (промежуточное соединение 4):

(c) обрабатывают промежуточное соединение 4 метансульфонилхлоридом, чтобы получить целевое соединение формулы (А1); и (d) необязательно превращают соединение (А1) в его фармацевтически приемлемую соль или его пролекарство.

Другие варианты реализации изобретения представляют собой промежуточные соединения, пригодные для получения соединений по настоящему изобретению, такие как (S)-2-( 1 -(4-амино-3 -(4-метокси-3 -нитрофенил)-1 H-пиразоло [3,4-d] пиримидин-1 -ил)этил)-5-фтор-3 (3 -фторфенил)-4H-хромен-4-он, (S)-2-( 1 -(4-амино-3 -(3 -амино-4-метоксифенил)-1 H-пиразоло [3,4-d] пиримидин-1 -ил)этил)-5-фтор-3 (3-фторфенил)-4H-хромен-4-он или их соли.

Еще один вариант реализации настоящего изобретения представляет собой способ ингибирования PI3K5 и PI3Ky у пациента, включающий введение пациенту эффективного количества по меньшей мере одного соединения по настоящему изобретению.

Еще один вариант реализации настоящего изобретения представляет собой способ ингибирования PI3K5 у пациента, включающий введение пациенту эффективного количества по меньшей мере одного из (R)-N-(5 -(4-амино-1-(1 -(5 -фтор-3 -(3 -фторфенил)-4-оксо-4H-хромен-2-ил)этил)-1 H-пиразоло [3,4-d] пиримидин-3-ил)-2-метоксифенил)метансульфонамида (соединение А2), его фармацевтически приемлемой соли или его пролекарства.

Еще один вариант реализации настоящего изобретения представляет собой способ лечения, профилактики и/или ингибирования заболевания, расстройства или патологического состояния, опосредованного протеинкиназой PI3K (такого как пролиферативное заболевание или расстройство, например рак), у пациента, включающий введение пациенту эффективного количества по меньшей мере одного из соединений по настоящему изобретению.

Еще один вариант реализации настоящего изобретения представляет собой способ ингибирования PI3K, в частности PI3K5 и PI3Ky, у пациента, включающий введение пациенту эффективного количества по меньшей мере одного соединения по настоящему изобретению.

Еще один вариант реализации настоящего изобретения представляет собой способ лечения воспалительного, аутоиммунного или пролиферативного заболевания посредством модулирования протеинкиназы (такой как PI3K5 и PI3Ky), включающий введение пациенту, которому необходимо такое лечение, эффективного количества по меньшей мере одного соединения по настоящему изобретению. В одном варианте реализации изобретения соединение по настоящему изобретению ингибирует как PI3K5, так и PI3Ky.

Еще один вариант реализации настоящего изобретения представляет собой способ лечения воспалительного, аутоиммунного или пролиферативного заболевания посредством модулирования протеинкиназы (такой как PI3K5 и PI3Ky) путем введения пациенту, которому необходимо такое лечение, эффективного количества по меньшей мере одного соединения по настоящему изобретению в комбинации

- 5 031135 (одновременно или последовательно) с по меньшей мере одним другим противовоспалительным, иммуномодулирующим или противоопухолевым агентом или их комбинацией. В одном варианте реализации изобретения соединение по настоящему изобретению ингибирует как PI3K5, так и PI3Ky.

Соединения по настоящему изобретению пригодны для лечения различных типов рака, включая, но не ограничиваясь ими:

карциному, включая, но не ограничиваясь ими, карциному мочевого пузыря, молочной железы, толстой кишки, почки, печени, легкого, в том числе мелкоклеточный рак легкого, пищевода, желчного пузыря, яичников, поджелудочной железы, желудка, шейки матки, щитовидной железы, предстательной железы и кожи, в том числе плоскоклеточную карциному;

гемобластоз лимфатических клеток, включая, но не ограничиваясь ими, лейкоз, острый лимфоцитарный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, В-клеточную лимфому, Т-клеточную лимфому, лимфому Ходжкина, не-ходжкинскую лимфому, волосатоклеточную лимфому и лимфому Буркетта;

гемобластоз миелоидного ростка, включая, но не ограничиваясь ими, острый и хронический миелобластный лейкоз, миелодиспластический синдром и промиелоцитарный лейкоз;

опухоли мезенхимального происхождения, включая, но не ограничиваясь ими, фибросаркому и рабдомиосаркому;

опухоли центральной и периферической нервной системы, включая, но не ограничиваясь ими, астроцитому, нейробластому, глиому и шванномы; и другие опухоли, включая, но не ограничиваясь ими, меланому, семиному, тератокарциному, остеогенную саркому, пигментную ксеродерму, кератоакантому, фолликулярный рак щитовидной железы и саркому Капоши.

В одном варианте реализации изобретения эффективное количество соединения по настоящему изобретению вводят для лечения лейкоза, острого лимфоцитарного лейкоза, острого лимфобластного лейкоза, В-клеточной лимфомы, Т-клеточной лимфомы, лимфомы Ходжкина, неходжкинской лимфомы, волосатоклеточной лимфомы, лимфомы Буркетта, острого и хронического миелобластного лейкоза, миелодиспластического синдрома или промиелоцитарного лейкоза.

Вследствие ключевой роли протеинкиназы в регулировании пролиферации клеток в целом, соединения по настоящему изобретению могут действовать как обратимые цитостатические агенты, а следовательно, могут применяться при лечении любого болезненного процесса, который включает аномальную пролиферацию клеток, такого как, например, доброкачественная гиперплазия предстательной железы, семейный аденоматоз толстой кишки, нейрофиброматоз, атеросклероз, фиброз легких, артрит, псориаз, гломерулонефрит, рестеноз после пластики сосудов или сосудистой хирургии, образование гипертрофических рубцов, воспалительное заболевание кишечника, отторжение трансплантата, эндотоксический шок и грибковые инфекции.

Соединения по настоящему изобретению в качестве модуляторов апоптоза пригодны для лечения рака (в том числе, но не ограничиваясь ими, типов рака, упомянутых выше в данном документе), вирусных инфекций (в том числе, но не ограничиваясь ими, вируса герпеса, поксвируса, вируса ЭпштейнаБарра, вируса Синдбиса и аденовируса), аутоиммунных заболеваний (в том числе, но не ограничиваясь ими, системной красной волчанки, аутоиммунного гломерулонефрита, ревматоидного артрита, псориаза, воспалительного заболевания кишечника и аутоиммунного сахарного диабета), нейродегенеративных расстройств (в том числе, но не ограничиваясь ими, болезни Альцгеймера, СПИД-ассоциированной деменции, болезни Паркинсона, бокового амиотрофического склероза, пигментной дистрофии сетчатки, спинальной мышечной атрофии и церебеллярной дегенерации), миелодиспластического синдрома, апластической анемии, ишемического повреждения, связанного с инфарктом миокарда, инсультом и реперфузионного повреждения, аритмии, атеросклероза, заболеваний печени, вызванных токсинами или связанными с употреблением алкоголя, гематологических заболеваний (включая, но не ограничиваясь ими, хроническую анемию и апластическую анемию), дегенеративных заболеваний опорно-двигательного аппарата (включая, но не ограничиваясь ими, остеопороз и артрит), риносинусита, чувствительного к аспирину, муковисцидоза, рассеянного склероза, заболеваний почек и боли при раковых заболеваниях. Соединения по настоящему изобретению также пригодны для профилактики, замедления или подавления развития СПИД у ВИЧ-инфицированных индивидов.

Соединения по настоящему изобретению могут модулировать уровень синтеза РНК и ДНК в клетке. Следовательно, соединения по настоящему изобретению пригодны для лечения вирусных инфекций, включая, но не ограничиваясь ими, ВИЧ, вирус папилломы человека, вирус герпеса, поксвирус, вирус Эпштейна-Барра, вирус Синдбис и аденовирус.

Соединения по настоящему изобретению пригодны для химиопрофилактики рака. Химиопрофилактику в данном документе определяют как ингибирование развития инвазивного рака или путем блокирования начала процесса мутагенеза, или путем блокирования развития предраковых клеток, которые уже были поражены, или путем ингибирования рецидива опухоли. Соединения по настоящему изобретению также пригодны для ингибирования ангиогенеза и метастазирования опухолей. Один вариант реализации настоящего изобретения представляет собой способ ингибирования ангиогенеза и метастазирования опухолей у пациента, нуждающегося в этом, путем введения эффективного количества одного или

- 6 031135 более соединений по настоящему изобретению.

Другой вариант реализации настоящего изобретения представляет собой способ лечения заболевания, связанного с иммунной системой, или иммунного расстройства (например, аутоиммунного заболевания), заболевания или расстройства, включающего воспаление (например, астмы, хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ), ревматоидного артрита, воспалительного заболевания кишечника, гломерулонефрита, нейровоспалительных заболеваний, рассеянного склероза, увеита и расстройств иммунной системы), рака или других пролиферативных заболеваний, болезни или расстройства печени, болезни или расстройства почек. Способ включает введение эффективного количества одного или более соединений по настоящему изобретению.

Примеры иммунных расстройств включают, но не ограничиваясь ими, псориаз, ревматоидный артрит, васкулит, воспалительное заболевание кишечника, дерматит, остеоартрит, астму, воспалительное заболевание мышц, аллергический ринит, вагинит, интерстициальный цистит, склеродермию, остеопороз, экзему, аллогенную или ксеногенную трансплантацию (органа, костного мозга, стволовых клеток и других клеток и тканей), отторжение трансплантата, реакцию трансплантат против хозяина, красную волчанку, воспалительное заболевание, диабет I типа, фиброз легких, дерматомиозит, синдром Шегрена, тиреоидит (например, тиреоидит Хашимото и аутоиммунный тиреоидит), миастению гравис, аутоиммунную гемолитическую анемию, рассеянный склероз, муковисцидоз, хронический рецидивирующий гепатит, первичный биллиарный цирроз, аллергический конъюнктивит и атопический дерматит.

В одном варианте реализации изобретения соединения, описанные в данном документе, пригодны в качестве иммунодепрессантов для профилактики отторжения трансплантата, отторжения при аллогенной или ксеногенной трансплантации (органа, костного мозга, стволовых клеток, других клеток и тканей) и при реакции трансплантат против хозяина. В одном конкретном варианте реализации изобретения отторжение трансплантата возникает при пересадке ткани или органа. В дополнительных вариантах реализации изобретения реакция трансплантат против хозяина возникает вследствие пересадки костного мозга или стволовых клеток. Один вариант реализации настоящего изобретения представляет собой способ профилактики или уменьшения риска отторжения трансплантата, отторжения при аллогенной или ксеногенной трансплантации (органа, костного мозга, стволовых клеток, других клеток и тканей) или возникновения реакции трансплантат против хозяина, включающий введение эффективного количества одного или более соединений по настоящему изобретению.

Соединения по настоящему изобретению также пригодны в комбинации (вводят вместе или последовательно) с известными противоопухолевыми терапиями, такими как, например, лучевая терапия, или с цитостатическими, или цитотоксическими, или противоопухолевыми агентами, такими как, например, агенты, взаимодействующие с ДНК, такие как цисплатин или доксорубицин; ингибиторы топоизомеразы II, такие как этопозид; ингибиторы топоизомеразы I, такие как СРТ-11 или топотекан; агенты, взаимодействующие с тубулином, такие как паклитаксел, доцетаксел или эпотилоны (например, иксабепилон), или встречающиеся в природе, или синтетические; гормональные агенты, такие как тамоксифен; ингибиторы тимидилатсинтазы, такие как 5-фторурацил; и антиметаболиты, такие как метотрексат, другие ингибиторы тирозинкиназы, такие как пресса и OSI-774; ингибиторы ангиогенеза; ингибиторы EGF; ингибиторы VEGF; ингибиторы CDK; ингибиторы SRC; ингибиторы c-Kit; ингибиторы Her1/2 и моноклональные антитела, направленные против рецепторов факторов роста, такие как эрбитукс (EGF) и герцептин (Her2); ингибиторы ВТК, такие как ибрутиниб; и другие модуляторы протеинкиназ, и их любые комбинации.

Соединения по настоящему изобретению также пригодны в комбинации (вводят вместе или последовательно) с одним или более стероидными противовоспалительными лекарственными средствами, нестероидными противовоспалительными средствами (НПВС) и иммуноселективными противовоспалительными производными (ImSAIDs) и любой их комбинацией.

В настоящем изобретении дополнительно предложена фармацевтическая композиция, содержащая одно или более соединений по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтическая композиция может дополнительно содержать один или более активных ингредиентов, указанных выше, таких как противоопухолевые агенты.

Еще один вариант реализации изобретения представляет собой способ лечения лейкоза у пациента, нуждающегося в этом, включающий введение терапевтически эффективного количества соединения по настоящему изобретению. В одном варианте реализации изобретения лейкоз выбран из хронического лимфоцитарного лейкоза (ХЛЛ), неходжкинской лимфомы (НХЛ), лимфомы Ходжкина (ХЛ), острого миелолейкоза (ОМЛ), множественной миеломы (ММ), мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы (МЛЛ) и медленно растущей неходжкинской лимфомы (медленно растущей НХЛ).

Еще один вариант реализации настоящего изобретения представляет собой способ лечения аутоиммунного расстройства у пациента, нуждающегося в этом, включающий введение терапевтически эффективного количества соединения по настоящему изобретению. В одном варианте реализации изобретения аутоиммунное расстройство выбрано из астмы, ХОБЛ, ревматоидного артрита, псориаза, волчанки и экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЭАЭ).

Еще один вариант реализации настоящего изобретения представляет собой способ лечения аллер

- 7 031135 гического ринита у пациента, нуждающегося в этом, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества соединения по настоящему изобретению.

В любом из вышеупомянутых способов соединение(-я) по настоящему изобретению и необязательные дополнительные активные агенты можно вводить в форме фармацевтической композиции, как описано в данном документе.

Краткое описание графических материалов

Фиг. 1 изображает гистограмму количества нейтрофилов в жидкости, полученной при бронхоальвеолярном лаваже (жидкость БАЛ), у самок крыс линии Вистар, которым вводили 10 мг/кг соединения А1 (перорально), в соответствии с моделью легочной нейтрофилии, вызванной липополисахаридом, описанной в испытании 7.

Фиг. 2 изображает гистограмму количества нейтрофилов в жидкости, полученной при перитонеальном лаваже, у крыс линии Вистар, которым вводили 1, 3 и 10 мг/кг соединения А1 (перорально), в соответствии с моделью воспаления в воздушных мешочках крыс, вызванного липополисахаридом, которая описана в испытании 8.

Фиг. 3А и 3В изображают линейный график и гистограмму индивидуальных клинических оценок для задних и передних лап и AUC для клинической оценки, соответственно, для крыс линии Вистар с коллаген-индуцированным артритом, которых лечили контрольным препаратом или 10 мг/кг/сутки соединения А1 в соответствии с процедурой, описанной в испытании 11.

Фиг. 3С и 3D изображают линейный график и гистограмму индивидуальных клинических оценок для задних и передних лап, соответственно, для крыс линии Вистар с коллаген-индуцированным артритом, которых лечили носителем или 10 мг/кг/сутки соединения А1 в соответствии с процедурой, описанной в испытании 11.

Фиг. 4А и 4В изображают линейный график и гистограмму объема задних лап и AUC для объема лапы, соответственно, у крыс линии Вистар с коллаген-индуцированным артритом, которых лечили носителем или 10 мг/кг/сутки соединения А1 в соответствии с процедурой, описанной в испытании 11.

Фиг. 4С и 4D изображают линейный график и гистограмму диаметра голеностопного сустава задних лап и AUC для диаметра голеностопного сустава, соответственно, у крыс линии Вистар с коллагениндуцированным артритом, которых лечили носителем или 10 мг/кг/сутки соединения А1 в соответствии с процедурой, описанной в испытании 11.

Фиг. 4E-4G изображают гистограммы гистопатологических оценок для ингибирования воспаления, заболевания хряща и паннуса, соответственно, во всех задних и передних лапах крыс линии Вистар с коллаген-индуцированным артритом, которых лечили носителем или 10 мг/кг/сутки соединения А1 в соответствии с процедурой, описанной в испытании 11.

Фиг. 4Н изображает гистограмму общей гистопатологической оценки для всех задних и передних лап у крыс линии Вистар с коллаген-индуцированным артритом, которых лечили носителем или 10 мг/кг/сутки соединения А1 в соответствии с процедурой, описанной в испытании 11.

Фиг. 5 изображает гистограмму частоты возникновения артрита (в процентах) у крыс линии Вистар с коллаген-индуцированным артритом, которых лечили носителем или 10 мг/кг/сутки соединения А1 в соответствии с процедурой, описанной в испытании 11.

Фиг. 6А и 6В изображают гистограммы, демонстрирующие антипсориатическое действие соединения А1 (3, 10, 30 мг/кг) на псориаз, вызванный имиквимодом, у мышей Balb/c, в соответствии с процедурой, описанной в испытании 13.

Подробное описание сущности изобретения

При использовании в данном документе, если не указано иное, необходимо использовать следующие определения. Много групп, описанных в данном документе, могут быть дополнительно необязательно замещены. Перечень заместителей в определении является иллюстративным, и его не следует рассматривать, как ограничивающий заместители, представленные в другом месте в описании.

Некоторые из соединений, описанных в данном документе, содержат один или более асимметрических центров, что может приводить к возникновению энантиомеров, диастереомеров и других стереоизомерных форм, которые можно описать в рамках абсолютной стереохимии как (R)- или (S)-. Если не указано иное, подразумевается, что химические структурные единицы, фармацевтические композиции и способы по настоящему изобретению включают все такие возможные изомеры, в том числе рацемические смеси, оптически чистые формы и смеси промежуточных соединений. Например, неограничивающий пример смесей промежуточных соединений включает смесь изомеров R: S или S: R в соотношении 10:90, 13:87, 17:83, 20:80 или 22:78. Оптически активные (R)- и (Ъ)-изомеры можно получить с использованием хиральных синтонов или хиральных реагентов или разделить с использованием традиционных способов. Когда соединения, описанные в данном документе, содержат олефиновые двойные связи или другие центры геометрической асимметрии, и если не указано иное, предполагается, что соединения включают как Е, так и Z геометрические изомеры.

Термин таутомеры относится к соединениям, которые характеризуются относительно легким взаимопревращением изомерных форм при равновесии. Предполагается, что эти изомеры охвачены данным изобретением. Таутомеры представляют собой структурно различные изомеры, которые взаимопре

- 8 031135 вращаются при таутомеризации. Таутомеризация представляет собой форму изомеризации и включает прототропную таутомеризацию или таутомеризацию за счет миграции протона, что считается подклассом кислотно-основной химии. Прототропная таутомеризация или таутомеризация за счет миграции протона включает миграцию протона, сопровождающуюся изменениями кратности связи, как правило, обменом местами одинарной связи с соседней двойной связью. Если таутомеризация возможна (например, в растворе), может быть достигнуто химическое равновесие таутомеров. Примером таутомеризации является кето-енольная таутомеризация. Конкретный пример кето-енольной таутомеризации представляет собой взаимное превращение таутомеров пентан-2,4-диона и 4-гидроксипент-3-ен-2-она. Другим примером таутомеризации является кето-фенольная таутомеризация. Конкретный пример кето-фенольной таутомеризации представляет собой взаимное превращение таутомеров пиридин-4-ола и пиридин-4(1H)она.

Термин пролекарство относится к соединению, которое является неактивным предшественником соединения, которое превращается в свою активную форму в организме в процессе обычных метаболических процессов. Структура пролекарств в общем обсуждается в Hardma, et al., (Eds.), Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9^th ed., pp. 11-16 (1996). Всестороннее обсуждение представлено в Higuchi, et al., Prodrugs as Novel Delivery Systems, Vol. 14, ASCD Symposium Series и в Roche (ed.), Bioreversible Carriers in Drug Design, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press (1987). В качестве иллюстрации пролекарства могут быть превращены в фармакологически активную форму посредством гидролиза, например, сложноэфирной или амидной связи, таким образом вводя или освобождая функциональную группу в получаемом продукте. Пролекарства могут быть разработаны так, что они реагируют с эндогенными соединениями с образованием водорастворимого конъюгата, который дополнительно усиливает фармакологические свойства соединения, например, увеличивает время полужизни в кровотоке. В альтернативном варианте пролекарства могут быть разработаны так, что они подвергаются ковалентной модификации по функциональной группе с, например, глюкуроновой кислотой, сульфатом, глутатионом, аминокислотами или ацетатом. Полученный конъюгат может быть инактивированным и выводиться с мочой или проявлять большую активность, чем исходное соединение. Высокомолекулярные конъюгаты также могут выводиться с желчью, подвергаться ферментному расщеплению и высвобождаться назад в кровоток, таким образом значительно увеличивая биологическое время полужизни изначально введенного соединения.

Термин сложный эфир относится к соединению, которое образуется по реакции между кислотой и спиртом с отщеплением воды. Сложный эфир может быть представлен общей формулой RCOOR' (где R представляет собой лекарственное вещество, a R' представляет собой химическую группу).

Предполагается, что эти пролекарства и сложные эфиры включены в объем настоящего изобретения.

Дополнительно, настоящее изобретение также включает соединения, которые отличаются только присутствием одного или более атомов, обогащенных изотопами, например, замещение водорода дейтерием или тритием или замещение углерода углеродом, обогащенным ¹³С или ¹⁴С.

Соединения по настоящему изобретению могут также содержать не встречающиеся в природе количества изотопов атомов для одного или более атомов, которые составляют такие соединения. Например, соединения могут быть радиомечены радиоактивными изотопами, такими как, например, тритий (³Н), йод-125 (¹²⁵I) или углерод-14 (¹⁴С). Все изотопные варианты соединений по настоящему изобретению, независимо от того, радиоактивные они или нет, включены в объем настоящего изобретения.

Фармацевтически приемлемые соли, образующие часть данного изобретения, включают соли, полученные из неорганических оснований, таких как основания Li, Na, K, Ca, Mg, Fe, Cu, Zn и Mn; солей органических оснований, таких как N.N'-диацетилэтилендиамин. глюкамин, триэтиламин, холин (гидроксид), дициклогексиламин, метформин, бензиламин, триалкиламин и тиамин; хиральных оснований, таких как алкилфениламин, глицинол и фенилглицинол; соли природных аминокислот, таких как глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, норлейцин, тирозин, цистин, цистеин, метионин, пролин, гидроксипролин, гистидин, орнитин, лизин, аргинин и серии; четвертичные аммониевые соли соединений по данному изобретению с алкилгалогенидами, алкилсульфатами, такими как MeI и (Me)₂SO₄; соли неприродных аминокислот, таких как D-изомеры или замещенные аминокислоты; гуанидина; и замещенного гуанидина, причем заместители выбраны из нитро, амино, алкил, алкенил, алкинил; соли аммония или замещенные соли аммония и соли алюминия. Соли могут включать соли присоединения кислоты, где возможно, которые могут представлять собой сульфаты, нитраты, фосфаты, перхлораты, бораты, гидрогалогениды, ацетаты, тартраты, малеаты, цитраты, фумараты, сукцинаты, памоат, метансульфонаты, бензоаты, салицилаты, бензолсульфонаты, аскорбаты, глицерофосфаты и кетоглутараты.

При использовании в данном документе интервалов для физических свойств, таких как молярная масса, или химических свойств, таких как химическая формула, подразумевается, что учтены все комбинации и подкомбинации интервалов и их конкретные варианты реализации. Термин около, когда относится к числу или численному интервалу, означает, что число или численный интервал, к которому термин относится, представляет собой приближение в пределах экспериментальных колебаний (или в пределах статистической экспериментальной ошибки), и, таким образом, число или численный интервал

- 9 031135 может изменяться, например, от 1 до 15% от заданного числа или численного интервала. Термин содержащий (и связанные с ним термины, такие как содержать, или содержит, или имеющий, или включающий) включает те варианты реализации, например вариант реализации любого химического соединения, композиции, способа, или процесса, или тому подобного, которые состоят из или в основном состоят из описанных признаков.

Следующие аббревиатуры и термины имеют указанные значения везде в данном документе: PI3-K = фосфоинозитид-3-киназа; PI = фосфатидилинозитол; СПИД = синдром приобретенного иммунодефицита; ВИЧ = вирус иммунодефицита человека; MeI = метилиодид; НО: не определяли.

Аббревиатуры, используемые в данном документе, имеют свое традиционное значение в области химии и биологии.

Термин пролиферация клеток относится к явлению, при котором количество клеток изменяется в результате деления. Термин также охватывает рост клеток, при котором изменяется морфология клеток (например, происходит увеличение в размере) в соответствии с пролиферативным сигналом.

Термины совместное введение, введение в комбинации с и их грамматические эквиваленты, при использовании в данном документе, охватывают введение животному двух или более агентов, так что оба агента и/или их метаболиты присутствуют в организме животного в одно и то же время. Совместное введение включает одновременное введение в отдельных композициях, введение в различное время в отдельных композициях или введение композиции, в которой присутствуют оба агента.

Термин эффективное количество или терапевтически эффективное количество относится к количеству соединения, описанного в данном документе, которого достаточного для осуществления предполагаемого применения, включая, но не ограничиваясь этим, лечение заболевания, как указано ниже. Терапевтически эффективное количество может изменяться в зависимости от предполагаемого применения (in vitro или in vivo) или состояния субъекта и заболевания, которое подвергают лечению, например массы и возраста субъекта, тяжести заболевания, способа введения и тому подобного, что легко может быть определено специалистом в данной области техники. Термин также применяют к дозе, которая вызывает конкретный отклик в целевых клетках, например уменьшение слипания тромбоцитов и/или миграции клеток. Конкретная доза будет зависеть от конкретного выбранного соединения, режима дозирования, которого необходимо придерживаться, от того, вводят ли ее в комбинации с другими соединениями, времени введения, ткани, в которую ее вводят, и физической системы доставки, в которую она заключена.

В данном документе лечение, лечить или ослабление используются взаимозаменяемо. Эти термины относятся к подходу для получения полезных или желаемых результатов, включая, но не ограничиваясь ими, терапевтическую пользу и/или профилактическую пользу. Под терапевтической пользой понимают устранение или ослабление лежащего в основе расстройства, которое подвергают лечению. Терапевтическая польза также достигается при устранении или ослаблении одного или более физиологических симптомов, связанных с лежащим в основе расстройством, так что у пациента наблюдается улучшение, несмотря на то, что пациент все еще может быть поражен лежащим в основе расстройством. Для получения профилактической пользы композиции можно вводить пациенту, подверженному риску развития конкретного заболевания, или пациенту, у которого наблюдается один или более физиологических симптомов заболевания, даже если данное заболевание не было диагностировано.

Терапевтический эффект, как термин, используемый в данном документе, охватывает терапевтическую пользу и/или профилактическую пользу, как описано выше. Профилактический эффект включает задержку или устранение возникновения заболевания или патологического состояния, задержку или устранение появления симптомов заболевания или патологического состояния, замедление, остановку или обратное развитие заболевания или патологического состояния или любую их комбинацию.

Термин субъект или пациент относится к животному (например, собаке, кошке, лошади или свинье), такому как млекопитающее, например человек. Способы, описанные в данном документе, могут использоваться и как терапевтические средства для людей, и для ветеринарного применения. В некоторых вариантах реализации изобретения пациент представляет собой млекопитающее. В предпочтительном варианте реализации изобретения пациент представляет собой человека.

Лучевая терапия означает воздействие на пациента с использованием обычных способов и композиций, известных практикующему врачу, источников радиоактивного излучения, таких как радионуклиды, излучающие альфа-частицы (например, радионуклиды актиния и тория), источники радиоактивного излучения с низкой линейной передачей энергии (ЛПЭ) (т. е. бета-излучатели), источники конверсионных электронов (например, стронций-89 и самарий-153-EDTMP) или источники высокоэнергетического излучения, в том числе, но не ограничиваясь ими, рентгеновского излучения, гамма-излучения и нейтронов.

Трансдукция сигнала представляет собой процесс, при котором стимулирующие или подавляющие сигналы передаются в клетку и по клетке для получения внутриклеточного отклика. Модулятор пути сигнальной трансдукции относится к соединению, которое модулирует активность одного или более белков клетки, относящихся к тому же конкретному пути сигнальной трансдукции. Модулятор может усиливать (агонист) или подавлять (антагонист) активность сигнальной молекулы.

- 10 031135

Термин селективное ингибирование или селективно ингибировать при применении к биологически активному агенту относится к способности агента селективно уменьшать целевую сигнальную активность по сравнению с нецелевой сигнальной активностью посредством прямого или непрямого взаимодействия с мишенью.

Термин фармацевтически приемлемый носитель или фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество включает, но не ограничиваясь ими, любые растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, агенты, обеспечивающие изотоничность, и агенты, замедляющие всасывание, один или более пригодных разбавителей, наполнителей, солей, разрыхлителей, связующих веществ, смазывающих веществ, веществ, способствующих скольжению, смачивающих агентов, матриц с контролируемым высвобождением, красителей/ароматизаторов, носителей, вспомогательных веществ, буферных агентов, стабилизаторов, агентов, увеличивающих растворимость, и их комбинаций. Кроме случаев, когда какие-либо традиционные среды или агенты несовместимы с активным ингредиентом, предполагается их использование в терапевтических композициях по данному изобретению. Дополнительные активные ингредиенты также можно включать в композиции.

В других вариантах реализации изобретения соединения по настоящему изобретению селективно ингибируют один или более членов фосфатидилинозитол-3-киназ (ИЗ-киназ) типа I или класса I со значением IC₅₀, составляющим около 100 нМ или менее, около 50 нМ или менее, около 10 нМ или менее, около 5 нМ или менее, около 100 пМ или менее, около 10 пМ или менее, около 1 пМ или менее, что определено в in vitro исследовании киназной активности.

Еще в одном аспекте изобретения полагают, что ингибитор, который селективно ингибирует один или более членов Р13-киназ типа I, или ингибитор, который селективно ингибирует сигнальные пути, опосредованные одной или более РП-киназами типа I, в альтернативном варианте относится к соединению, которое характеризуется концентрацией 50 %-ого ингибирования (IC₅₀) по отношению в заданной РП-киназе типа I, которая по меньшей мере в 10 раз ниже, по меньшей мере в 20 раз ниже, по меньшей мере в 50 раз ниже, по меньшей мере в 100 раз ниже или по меньшей мере в 1000 раз ниже, чем IC₅₀ ингибитора по отношению к оставшимся РП-киназам типа I.

При использовании в данном документе, термин двойной ингибитор РП-киназы δ/γ и двойной селективный ингибитор РП-киназы δ/γ относится к соединению, которое ингибирует активность как δ-, так и γ-изофермента РП-киназы более эффективно, чем других изоферментов семейства РПК. Следовательно, двойной ингибитор РП-киназы δ/γ более селективный к РП-киназам δ и γ, чем традиционные РПК-ингибиторы, такие как CAL-130, вортманнин и LY294002, которые являются неселективными РКК-ингибиторами.

Ингибирование РП-киназ δ и γ может давать терапевтическую пользу при лечении различных патологических состояний, например, патологических состояний, которые характеризуются воспалительной реакцией, включая, но не ограничиваясь этим, аутоиммунные заболевания, аллергические заболевания или артритические заболевания. Важно, что ингибирование функции РП-киназ δ и γ, по видимому, не влияет на биологические функции, такие как жизнеспособность и фертильность.

Воспалительная реакция при использовании в данном документе характеризуется покраснением, повышением температуры, отеком и болью (т. е. воспалением) и, как правило, включает повреждение или разрушение ткани. Воспалительная реакция обычно представляет собой локализованную защитную реакцию, вызванную повреждением или разрушением тканей, которая служит для разрушения, ослабления или отделения (изолирования) как повреждающего агента, так и поврежденной ткани. Воспалительные реакции, в частности, связаны с притоком лейкоцитов и/или хемотаксисом лейкоцитов (например, нейтрофилов). Воспалительные реакции могут возникать в результате инфицирования патогенными организмами и вирусами, неинфекционным способом, таким как повреждение или реперфузия после инфаркта миокарда или инсульта, в результате иммунных ответов чужеродным антигенам и аутоиммунных заболеваний. Воспалительные реакции, восприимчивые к лечению в соответствии со способами и соединениями по данному изобретению, охватывают патологические состояния, связанные с реакциями специфической защитной системы, а также с патологическими состояниями, связанными с реакциями неспецифической защитной системы.

Терапевтические способы по данному изобретению включают способы ослабления патологических состояний, связанных с воспалительной активацией клеток. Воспалительная активация клеток относится к вызыванию посредством раздражителя (включая, но не ограничиваясь ими, цитокины, антигены или аутоантитела) пролиферативной клеточной реакции, выработке растворимых медиаторов (включая, но не ограничиваясь ими, цитокины, радикалы кислорода, ферменты, простаноиды или вазоактивные амины) или экспрессии поверхностью клеток новых медиаторов или большого количества медиаторов (включая, но не ограничиваясь ими, антигены главного комплекса гистосовместимости или молекулы клеточной адгезии) в клетках воспаления (в том числе, но не ограничиваясь ими, моноцитах, макрофагах, Тлимфоцитах, В-лимфоцитах, гранулоцитах (полиморфоядерных лейкоцитах, включая нейтрофилы, базофилы и эозинофилы), тучных клетках, дендритных клетках, клетках Лангерганса и эндотелиальных клетках). Специалистам в данной области техники необходимо учитывать, что активация одного или комби

- 11 031135 нации этих фенотипов в таких клетках может давать вклад в возникновение, сохранение или обострение воспалительного патологического состояния.

Аутоиммунное заболевание, при использовании в данном документе, относится к любой группе расстройств, в которой повреждение ткани связано с гуморальными или опосредованными клетками реакциями на собственные компоненты организма.

Отторжение трансплантата, при использовании в данном документе, относится к любой иммунной реакции, направленной против пересаженной ткани (включая органы или клетки (например, костный мозг)), которая характеризуется потерей функции пересаженных или окружающих тканей, болью, отеком, лейкоцитозом и тромбоцитопенией.

Аллергическое заболевание, при использовании в данном документе, относится к любым симптомам, повреждению ткани или утрате функции ткани, возникающим вследствие аллергии.

Артритическое заболевание, при использовании в данном документе, относится к любому заболеванию, которое характеризуется воспалительными поражениями суставов, обусловленными различными причинами.

Дерматит, при использовании в данном документе, относится к большой группе заболеваний кожи, которые характеризуются воспалением кожи, обусловленным различными причинами.

Как описано ранее, термин двойной ингибитор РП-киназы δ/γ, как правило, относится к соединению, которое ингибирует активность δ и γ-изоферментов Р13-киназы более эффективно, чем другие изоферменты семейства PI3K. Относительную эффективность соединений, как ингибиторов ферментной активности (или другой биологической активности), можно установить путем определения концентраций, при которых каждое соединение ингибирует активность с предварительно заданной степенью ингибирования, а затем сравнения результатов. Как правило, предпочтительное определение представляет собой концентрацию, при которой происходит ингибирование 50% активности в биохимическом анализе, т. е. концентрацию 50%-ого ингибирования или IC₅₀. Определение IC₅₀ можно осуществить с использованием традиционных способов, известных в данной области техники. В общем IC₅₀ можно определить путем измерения активности данного фермента в присутствии исследуемого ингибитора в различных концентрациях. Затем строят зависимость экспериментально полученных значений ферментной активности от используемых концентраций ингибитора. Концентрацию ингибитора, при которой наблюдается 50%-ая ферментная активность (по сравнению с активностью в отсутствие какого-либо ингибитора), обозначают как IC₅₀. Аналогично посредством соответствующего определения активности можно установить другие концентрации ингибитора. Например, в некоторых условиях может быть желательно определять концентрацию 90 %-ого ингибирования, т. е. IC₉₀ и т. д.

Следовательно, считают, что двойной селективный ингибитор РП-киназы δ/γ в альтернативном варианте может относиться к соединению, которое характеризуется концентрацией 50%-ого ингибирования (IC₅₀) по отношению к РП-киназе δ и γ, которая по меньшей мере в 10 раз ниже, по меньшей мере в 20 раз ниже или по меньшей мере в 30 раз ниже, чем значение IC₅₀ по отношению к любому или всем членам семейства PI3K класса I. В альтернативном варианте реализации изобретения считают, что термин двойной селективный ингибитор РП-киназы δ/γ может относится к соединению, которое характеризуется IC₅₀ по отношению к РП-киназе δ и γ, которая по меньшей мере в 30 раз ниже, по меньшей мере в 50 раз ниже, по меньшей мере в 100 раз ниже, по меньшей мере в 200 раз ниже или по меньшей мере в 500 раз ниже, чем значение IC₅₀ по отношению к любому или всем членам семейства РОК класса I. Двойной селективный ингибитор РП-киназы δ/γ, как правило, вводят в таком количестве, что он селективно ингибирует активность как δ, так и γ РП-киназы, как описано выше.

В некоторых вариантах реализации изобретения соединения по настоящему изобретению демонстрируют практически равное (~1:1) ингибирование РП-киназы δ и γ или с максимальным соотношением 1:5, т. е. соединение по настоящему изобретению демонстрирует практически равные значения IC₅₀ для обоих ферментов РП-киназы δ и γ или различающиеся не более чем в 3-8 раз.

Способы по данному изобретению можно применять к популяциям клеток in vivo или ex vivo. In vivo означает внутри живого организма, например внутри животного или человека или в организме субъекта. В этом контексте способы по данному изобретению можно применять с терапевтической или профилактической целью для индивида. Ex vivo или in vitro означает вне живого организма. Примеры ex vivo клеточных популяций включают in vitro клеточные культуры и биологические образцы, в том числе, но не ограничиваясь ими, образцы жидкостей или тканей, полученные от индивидов. Такие образцы могут быть получены с помощью способов, известных в данной области техники. Типовые образцы биологических жидкостей включают кровь, спинномозговую жидкость, мочу и слюну. Типовые образцы тканей включают опухоли и их биопсии. В этом контексте изобретение можно использовать для различных целей, включая терапевтические и экспериментальные цели. Например, изобретение можно применять ex vivo или in vitro для определения оптимального режима и/или дозировок при введении ингибитора, селективного к РП-киназе δ, для данного показания, типа клеток, индивида и других параметров. Информация, собранная при таком применении, может быть использована для экспериментальных или диагностических целей или в лечебных учреждениях для составления протоколов in vivo лечения. Дру

- 12 031135 гие ex vivo применения, для которых может быть пригодно изобретение, описаны ниже или будут очевидны специалистам в данной области техники.

Соединения по настоящему изобретению можно получить с помощью способов, известных в данной области техники, таких как те, которые описаны в международных публикациях № WO 2011/055215, WO 2012/151525 и WO 2013/164801, каждая из которых включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки.

Фармацевтические композиции

В настоящем изобретении также предложена фармацевтическая композиция, содержащая одно или более соединений по настоящему изобретению и один или более фармацевтически приемлемых носителей или вспомогательных веществ. В одном варианте реализации изобретения фармацевтическая композиция включает терапевтически эффективное количество одного или более соединений по настоящему изобретению. Фармацевтическая композиция может содержать один или более дополнительных активных ингредиентов, как описано в данном документе.

Фармацевтические носители и/или вспомогательные вещества могут быть выбраны, например, из разбавителей, наполнителей, солей, разрыхлителей, связующих веществ, смазывающих веществ, веществ, способствующих скольжению, увлажняющих агентов, матриц с контролируемым высвобождением, красителей, ароматизаторов, буферных агентов, стабилизаторов, агентов, повышающих растворимость и их комбинаций.

В одном варианте реализации изобретения фармацевтические композиции, описанные в данном документе, содержат от около 0,1 мг до около 1000 мг, например от около 1 мг до около 1000 мг, от около 20 мг до около 800 мг, от около 50 мг до около 600 мг или от около 50 мг до около 600 мг одного или более соединений по настоящему изобретению. В другом варианте реализации изобретения фармацевтические композиции, описанные в данном документе, содержат от около 100 мг до около 400 мг одного или более соединений по данному изобретению.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно вводить отдельно или в комбинации с одним или более другими активными агентами. Если необходимо, рассматриваемые соединения и другой(-ие) агент(-ы) можно смешивать в препарат, или каждый из компонентов может входить в состав отдельных препаратов, применяемых в комбинации по отдельности или в одно и то же время.

Соединения или фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно вводить любым путем, который делает возможной доставку соединений к месту действия, таким как пероральный, интраназальный, местный (например, трансдермальный), интрадуоденальный, парентеральный (в том числе внутривенный, внутриартериальный, внутримышечный, внутрисосудистый, внутрибрюшинный или путем инъекции или инфузии), внутрикожный, внутригрудной, интратекальный, интраокулярный, ретробульбарный, внутрилегочный (например, лекарственные средства в виде аэрозоля) или подкожный (включая введение лекарственных препаратов длительного высвобождения, например помещение в капсулу селезенки, мозг или роговую оболочку), сублингвальный, анальный, ректальный, вагинальный, или путем хирургической имплантации (например, помещение в капсулу селезенки, мозг или роговую оболочку).

Композиции можно вводить в твердой, полутвердой, жидкой или газообразной формах или в виде высушенного порошка, например в лиофилизированной форме. Фармацевтические композиции можно помещать в формы, удобные для доставки, в том числе, например, твердые лекарственные формы, такие как капсулы, саше, крахмальные капсулы, желатиновые контейнеры, бумажные контейнеры, таблетки, суппозитории, пеллеты, драже, пастилки и таблетки для рассасывания. Тип формы в общем будет зависеть от желаемого пути введения. Также предполагаются имплантируемые составы с замедленным высвобождением как составы для трансдермального введения.

Способы лечения

Количество соединения, которое необходимо вводить, зависит от млекопитающего, которое подвергают лечению, тяжести расстройства или патологического состояния, дозировки, характеристик соединения и мнения лечащего врача. Однако эффективная дозировка представляет собой интервал от около 0,001 до около 100 мг/кг массы тела в сутки, предпочтительно - от около 1 до около 35 мг/кг/сутки в одной или дробных дозах. Для человека массой 70 кг это количество будет составлять от около 0,05 до около 7 г/сутки, предпочтительно - от около 0,05 до около 2,5 г/сутки. Эффективное количество соединения по данному изобретению можно вводить или в виде однократной дозы, или в виде нескольких доз (например, два или три раза в сутки).

Соединения по настоящему изобретению можно использовать в комбинации с одним или более противоопухолевыми агентами (например, химиотерапевтическими агентами), лекарственными средствами на основе антител и лучевой терапией.

Соединения по данному изобретению могут быть в составе или могут быть введены совместно с другими агентами, которые ослабляют симптомы воспалительных патологических состояний, таких как энцефаломиелит, астма и другие заболевания, описанные в данном документе. Эти агенты включают нестероидные противовоспалительные средства (НПВС).

- 13 031135

Примеры

Примеры и препараты, представленные ниже, дополнительно иллюстрируют и поясняют соединения по настоящему изобретению и способы получения таких соединений. Необходимо понимать, что объем настоящего изобретения никоим образом не ограничен объемом следующих примеров и препаратов. В нижеупомянутых примерах молекулы с единственным хиральным центром существуют в виде рацемической смеси, если не указано иное. Молекулы с двумя или более хиральными центрами существуют в виде рацемической смеси диастереомеров, если не указано иное. Чистые энантиомеры/диастереомеры можно получить с помощью способов, известных специалистам в данной области техники.

Промежуточные соединения, описанные в данном документе, можно получить с помощью способов, описанных в международных публикациях № WO 11/055215 и WO 12/151525, каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки.

Промежуточное соединение 1. Ы-(5-Бром-2-метоксифенил)метансульфонамид.

К раствору 5-бром-2-метоксианилина (1,00 г, 4,94 ммоль) в дихлорметане (10 мл) добавляли пиридин (0,800 мл, 9,89 ммоль) и охлаждали до 0°C. Добавляли метансульфонилхлорид (0,40 мл, 5,19 ммоль) и перемешивали в течение 30 мин. Реакционную смесь гасили водой, экстрагировали этилацетатом, сушили над безводным сульфатом натрия и концентрировали при пониженном давлении. Неочищенный продукт хроматографировали с использованием смеси этилацетат/петролейный эфир, что давало целевое соединение в виде красноватого твердого вещества (1,20 г, 87%).

Промежуточное соединение 2. Ы-(2-Метокси-5-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)фенил)метансульфонамид.

К раствору промежуточного соединения 1 (1,20 г, 4,28 ммоль) в диоксане (17,5 мл) добавляли ацетат калия (0,841 г, 8,57 ммоль) и бис(пинаколато)дибор (1,190 г, 4,71 ммоль), раствор дегазировали в течение 30 мин. В атмосфере азота добавляли [1,1'-бис(дифенилфосфино)ферроцен]дихлорпалладий(П) CH₂Cl₂ (0,104 г, 0,128 ммоль) и нагревали до 80°C. Через 2 ч реакционную смесь фильтровали через целит и концентрировали. Сырой продукт очищали с помощью колоночной хроматографии с использованием смеси этилацетат/петролейный эфир, что давало целевое соединение в виде желтого твердого вещества (1,00 г, 71%). ’H-ЯМР (δ м. д., CDCl₃, 400 МГц): 7,91 (д, J = 1,2 Гц, 1H), 7,62 (дд, J = 8,1, 1,2 Гц, 1H), 6,92 (д, J= 8,1 Гц, 1H), 6,73 (с, 1H), 3,91 (с, 3Н), 2,98 (с, 3Н), 1,32 (с, 12Н).

Промежуточное соединение 3. (S)-2-(1-(4-Амино-3-(4-метокси-3-нитрофенил)-1H-пиразоло[3,4-d] пиримидин-1 -ил)этил)-5 -фтор-3 -(3 -фторфенил)-4H-хромен-4-он.

(S)-2-(1-(4-Амино-3-(4-метокси-3-нитрофенил)-1H-пиразоло[3,4-d]пиримидин-1-и л)этил)-5-фтор-3(3-фторфенил)-4H-хромен-4-он: к раствору (R)-5-фтор-3-(3-фторфенил)-2-(1-гидроксиэтил)-4H-хромен4-она (0,500 г, 1,64 ммоль) в ТГФ (5 мл) добавляли 3-(4-метокси-3-нитрофенил)-1H-пиразоло[3,4-d]пиримидин-4-амин (0,564 г, 1,97 ммоль) и трифенилфосфин (0,649 г, 2,47 ммоль), а затем диизопропилазодикарбоксилат (0,50 мл, 2,47 ммоль). ((R)-5-фтор-3-(3-фторфенил)-2-(1-гидроксиэтил)-4H-хромен-4-он можно получить, как описано для промежуточных соединений 23, 25 и 26 в международной публикации № WO 2012/0151525.). Через 4 ч при комнатной температуре смесь концентрировали, а остаток очищали с помощью колоночной хроматографии с использованием смеси этилацетат/петролейный эфир, что давало целевое соединение в виде коричневого твердого вещества (0,270 г, 29 %). ’H-ЯМР (δ м. д., ДМСОd₆, 400 МГц): 8,04 (с, 1H), 7,83 (м, 1H), 7,63-7,50 (м, 3Н), 7,29 (м, 2Н), 7,06 (дт, J = 8,7, 2,2 Гц, 1H), 6,94 (м, 2Н), 6,75 (дд, J = 8,1, 2,1 Гц, 1H), 5,95 (кв, J = 7,0 Гц, 1H), 4,98 (с, 2Н), 3,81 (с, 3Н), 1,86 (д, J = 7,0 Гц, 3Н).

Промежуточное соединение 4. (Б)-2-(1-(4-Амино-3-(3-амино-4-метоксифенил)-Ш-пиразоло[3,4^] пиримидин-1 -ил)этил)-5 -фтор-3 -(3 -фторфенил)-4H-хромен-4-он.

(Б)-2-(1-(4-Амино-3-(3-амино-4-метоксифенил)-1Н-пиразоло[3,4^]пиримидин-1-ил)этил)-5-фтор-3(3-фторфенил)-4H-хромен-4-он: к раствору промежуточного соединения 3 (0,260 г, 0,455 ммоль) в этаноле (5 мл) добавляли Ni Ренея (0,130 г) и гидрировали при 20 фунтах на квадратный дюйм и 50°C в течение 24 ч. Реакционную смесь пропускали через слой целита и концентрировали, что давало целевое соединение в виде коричневого твердого вещества (0,150 г, 60 %). Масса: 540,8 (М⁺).

Пример А. N-(5-(4-Амино-1-(1-(5-фтор-3-фторфенил)-4-оксо-4H-хромен-2-ил)этил-1H-пиразоло [3,4^]пиримидин-3-ил)-2-метоксифенил)метансульфонамид.

К раствору 2-(1 -(4-амино-3 -иодо-Ш-пиразоло [3,4^]пиримидин-1-ил)этил)-5-фтор-3 -(3 -фторфенил^ШхроменЧ-она (0,200 г, 0,366 ммоль) в ДМЭ (2,1 мл) и воде (0,67 мл) добавляли промежуточное соединение 2 (0,179 г, 0,550 ммоль) и карбонат натрия (0,116 г, 1,10 ммоль), и систему дегазировали в течение 30 мин. (2-(1-(4-амино-3-иодо-Ш-пиразоло[3,4^]пиримидин-1-ил)этил)-5-фтор-3-(3-фторфенил^ШхроменЧ-он можно получить, как описано для промежуточных соединений 23, 25 и 26 в международной публикации № WO 2012/0151525). Добавляли [бис(дифенилфосфино)ферроцен]дихлорпалладий(11) (0,059 г, 0,075 ммоль) и воздействовали микроволновым излучением (микроволновая мощность = 100 Вт, температура =100°C) в течение 45 мин. Реакционную смесь фильтровали через целит, концентрировали и экстрагировали этилацетатом. Органический слой сушили над сульфатом натрия и концентрировали при пониженном давлении. Сырой продукт очищали с помощью колоночной хромато

- 14 031135 графии с использованием смеси метанол/дихлорметан, что давало целевое соединение в виде коричневого твердого вещества (0,080 г, 35 %). Точка плавления: 216-218°C. Ή-ЯМР (δ м. д., CDCl₃, 400 МГц): 8,20 (с, 1H), 7,73 (с, 1H), 7,53 (м, 2Н), 7,31 (м, 2Н), 7,07-6,73 (м, 6Н), 6,07 (кв, J= 6,2 Гц, 1H), 3,98 (с, 3Н), 3,14 (с, 3Н), 2,01 (д, J = 6,0 Гц, 3Н).

Пример А1 и А2.

Способ А. (S)-N-(5-(4-Амино-1-(1-(5-фтор-3-(3-фторфенил)-4-оксо-4H-хромен-2-ил)этил)-1H-пиразоло[3,4^]пиримидин-3-ил)-2-метоксифенил)метансульфонамид и (К)-Ы-(5-(4-амино-1-(1-(5-фтор-3-(3фторфенил)-4-оксо-4H-хромен-2-ил)этил)-1H-пиразоло[3,4-d]пиримидин-3-ил)-2-метоксифенил)метансульфонамид

Два энантиомерно чистых изомера разделяли с помощью препаративной СФХ (сверхкритический флюид) из N-(5-(4-амино-1-(1-(5-фтор-3 -(3-фторфенил)-4-оксо-4H-хромен-2-ил)этил)- Ш-пиразоло [3,4d]пиримидин-3-ил)-2-метоксифенил)метансульфонамида (0,500 г) на колонке CHIRALPAK AS-H (250x30 мм; 5 мкм) с использованием смеси метанол : CO₂ (55:45) в качестве подвижной фазы при скорости потока 80 г/мин.

Пример А1 (S-изомер): коричневое твердое вещество (0,247 г). Энантиомерная чистота: 97,4 %. Время удерживания: 2,14 мин. Масса: 619,1 (М⁺+1). Точка плавления: 156-158°C.

Пример А2 (R-изомер): коричневое твердое вещество (0,182 г). Энантиомерная чистота: 99,3 %. Время удерживания: 3,43 мин. Масса: 619,1 (М⁺+1). Точка плавления: 168-171°C.

Способ А1.

(S)-N-(5 -(4-амино-1-(1 -(5 -фтор-3 -(3-фторфенил)-4-оксо-4H-хромен-2-ил)этил-1 H-пиразоло [3,4-d] пиримидин-3-ил)-2-метоксифенил)метансульфонамид и (Г)-У-(5-(4-амино-1-(1-(5-фтор-3-(3-фторфенил)4-оксо-4H-хромен-2-ил)этил-1H-пиразоло[3,4-d]пиримидин-3-ил)-2-метоксифенил)метансульфонамид

F F

Два энантиомерно чистых изомера разделяли с помощью препаративной СФХ (сверхкритический флюид) из N-(5-(4-амино-1-(1-(5-фтор-3 -(3-фторфенил)-4-оксо-4H-хромен-2-ил)этил)- Ш-пиразоло [3,4d]пиримидин-3-ил)-2-метоксифенил)метансульфонамида (15,0 г) на колонке CHIRALPAK AS-H (250x30 мм; 5 мкм) с использованием смеси метанол : CO₂ (45:55) в качестве подвижной фазы при скорости потока 120 г/мин.

Пример А1 (S-изомер). Энантиомерная чистота: 100%. Время удерживания: 2,21 мин. Масса: 619,1 (М⁺+1). Точка плавления: 175-178°C. Удельное оптическое вращение (С =1 в хлороформе при 25°C): [a]D = + 147,16.

Пример А2 (R-изомер). Энантиомерная чистота: 99,3%. Время удерживания: 3,72 мин. Масса: 619,1 (М⁺+1). Точка плавления: 154-157°C. Удельное оптическое вращение (С = 1 в хлороформе при 25°C): [a]D = - 159,54.

Способ В Пример А1.

(S)-N-(5-(4-амино-1-(1-(5-фтор-3-(3-фторфенил)-4-оксо-4H-хромен-2-ил)этил)-1H-пиразоло[3,4-d] пиримидин-3-ил)-2-метоксифенил)метансульфонамид.

К раствору промежуточного соединения 4 (0,500 г, 0,923 ммоль) в дихлорметане (5 мл), охлажденному до 0°C, добавляли пиридин (0,200 мл, 1,84 ммоль) и перемешивали в течение 10 мин. Добавляли метансульфонилхлорид (0,100 мл, 0,923 ммоль) и перемешивали в течение 30 мин. Реакционную смесь гасили водой, экстрагировали дихлорметаном и сушили над сульфатом натрия. Сырой продукт очищали с помощью колоночной хроматографии с использованием смеси метанол : дихлорметан, что давало целевое соединение в виде желтоватого твердого вещества (0,240 г, 42 %). Точка плавления: 211-213°C. ¹НЯМР (δ м. д., ДМСО^6, 400 МГц): 9,15 (с, 1H), 8,06 (с, 1H), 7,83 (м, 1H), 7,49 (м, 4Н), 7,28 (м, 4Н), 7,08 (дт, J = 8,6, 1,7 Гц, 1H), 6,92 (с, 2Н), 5,98 (кв, J = 6,9 Гц, 1H), 3,88 (с, 3Н), 2,99 (с, 3Н), 1,88 (д, J= 7,0 Гц, 3Н). Энантиомерная чистота: 85,4 %, что определено с помощью ВЭЖХ на колонке Chiralpak AS-3R,

- 15 031135 обогащен быстро элюирующимся изомером (время удерживания = 7,46 мин.).

Метаболическая стабильность

Изучение метаболической стабильности проводили для соединений А, А1 и А2, а также для соединения примера 128 WO 2012/151525 с использованием микросом печени мыши, крысы, собаки, обезьяны и человека. Протоколы исследований с использованием микросом печени мыши, крысы и человека (все производства BD Gentest, США) представлены ниже. 0,4 мг белка предварительно инкубировали с 2 мМ НАДФН (кофактор) в фосфатном буферном растворе (рН ~ 7,4) в течение 15 мин при 37°C, а затем добавляли 1 мкМ исследуемого соединения и инкубировали дополнительно в течение 60 мин в трех повторениях. Реакцию останавливали метанолом, содержащим внутренний стандарт, и дополнительно центрифугировали для определения исследуемого соединения, оставшегося в надосадочной жидкости с помощью ЖХ/МС/МС. Процентное содержание оставшегося исходного соединения рассчитывали, сравнивая с аналогичными образцами, реакцию в которых останавливали через 0 мин. Результаты представлены в табл. 1 ниже.

Данные о метаболической стабильности для соединения А1 указывают на то, что оно демонстрирует превосходный фармакокинетический профиль.

Таблица 1

Соединение	Метаболическая стабильность в микросомах печени
Мышь	Крыса	Собака	Обезьяна	Человек
Пример 128 в WO 2012/151525	85,0	73,3	НО	НО	70,4
Соединение А	96	91	64,3	42,3	69,7
Соединение А1	85,9	94,2	83,5	78,8	95,7
Соединение А2	68,9	79,5	52,3	1,9	60,2
НО - Не определяли

Связывание с белками

Ниже представлена процедура для измерения связывания с белками плазмы (с использованием метода равновесного диализа). 745 мкл плазмы помещали в микроцентрифужную пробирку емкостью 2 мл. Туда добавляли 5 мкл соединения А1 (150 мкМ). Образцы перемешивали на настольной вихревой мешалке в течение 2 мин. 50 мкл плазмы (n=2) переносили в заранее помеченную микроцентрифужную пробирку емкостью 1,5 мл, которую рассматривали как образец при 0 ч.

Оставшиеся 650 мкл образца плазмы инкубировали в течение 30 мин при 37°C на водяной бане. После 30 мин инкубации, 50 мкл плазмы (n=2) отбирали в заранее помеченную микроцентрифужную пробирку емкостью 1,5 мл, которую рассматривали как образец при 0,5 ч. 200 мкл образца плазмы (n=2) переносили в камеру для проб, которая была обозначена красным кольцом. Красный вкладыш помещали на базисную пластинку, а 350 мкл буферного раствора помещали в камеру для буфера. Пластинки инкубировали при 37°C при приблизительно 100 об/мин на орбитальном встряхивателе или 20 об/мин на возвратно-поступательном встряхивателе в течение 4 ч. 50 мкл образца после диализа из камер для буфера и для плазмы переносили в заранее помеченные микроцентрифужные пробирки. К образцам буферного раствора добавляли 50 мкл плазмы, а к полученным образцам плазмы - равный объем буферного раствора (буферный раствор KH₂PO₄ с рН 7,4). Для осаждения белка и высвобождения соединения добавляли 150 мкл метанола, содержащего внутренний стандарт (толбутамид, 250 нг/мл). Образцы перемешивали на настольной вихревой мешалке в течение 3 мин и центрифугировали в течение 5 мин при 14000 об/мин. Надосадочную жидкость подвергали ЖХ/МС/МС-анализу.

Данные о связывании с белками плазмы для соединения А1 приведены в табл. 2 ниже:

Таблица 2

Связывание с белками (%)
Мышь	Крыса	Собака	Обезьяна	Человек
97,61	99,04	95,85	94,71	97,24

Фармакокинетика

Биодоступность соединения А1 (свободное основание) при пероральном введении оценивали у крыс и мышей. Протокол исследований фармакокинетики на крысах представлен ниже.

Все животные не принимали пищу в течение ночи (12 ч) до введения дозы и в течение 4,0 ч после введения исследуемого соединения. Составы исследуемых соединений готовили в твине 80 (1 %) и среде (99 %) (0,5 % метилцеллюлозы, 4000 сП, рН 2,2). Образцы крови (150 мкл от каждого животного) забирали через глазничную полость и помещали в микроцентрифужную пробирку, содержащую ЭДТА ди- 16 031135 натрия в качестве антикоагулянта. Образцы крови сразу же центрифугировали при скорости 1000g в течение 10 мин при 4°C, и отделенные образцы плазмы замораживали при температуре, составляющей менее -80°C, и хранили до проведения анализа. Концентрации исследуемого соединения во всех составах определяли с помощью ВЭЖХ. Концентрации исследуемого соединения в плазме во всех образцах определяли с помощью ЖХ/МС/МС. Фармакокинетические параметры (C_max, AUC_0-t, T_max и t_1/2) оценивали с помощью программного обеспечения WinNonlin. Результаты приведены в табл. 3 для соединения А, А1 и соединения из примера 128 в WO 2012/151525 для крыс и соединения А1 для мышей.

Таблица 3

Соединение	Единиц ы	Пр. 128 в WO 2012/151525
Животное
Путь введения		Пероральный
Доза	мг/кг	10
N		2
Стах	мкМ	0,68
AUCo-t	мкМч	2,01
Tmax	ч	0,83
tl/2	ч	1,56

Соединение А	Соединение А1	Соединение А1
Крыса	Мышь
Пероральный	Пероральный	Пероральный
10	10	10
2	4	3
1,02	11,38	3,78
7,95	97,76	7,49
2,67	1,83	0,50
4,52	2,45	1,45

Соединения А и A1 продемонстрировали превосходный фармакокинетический профиль по сравнению с соединением из примера 128 в WO 2012/151525. Например, для соединения А наблюдалось увеличение C_max в ~1,5 раза, увеличение AUC_0-t в ~4 раза и увеличение t_1/2 в ~ 2,8 раз по сравнению с соединением из примера 128 в WO 2012/151525. Для соединения А1 наблюдалось увеличение C_max в ~16 раз, увеличение AUC_0-t в ~48 раз и увеличение t_1/2 в ~1,6 раз по сравнению с соединением из примера 128 в WO 2012/151525.

Биологические тесты

Фармакологические свойства соединений, описанных в данном документе, можно подтвердить рядом фармакологических испытаний, как представлено ниже.

Испытание 1. Определение ферментной активности И3-киназы флуоресцентным методом.

Фосфоинозитид-3-киназы (PI3K) относятся к классу липидкиназ, которые играют решающую роль в регулировании нескольких ключевых клеточных процессов. PI3K способны фосфорилировать фосфоинозитолы по 3-гидрокси-положению, посредством этого образуя вторичные мессенджеры, вовлеченные в дальнейшую передачу сигнала. Г омогенная флуоресценция с временным разрешением (HTRF) позволяет обнаружить 3,4,5-трифосфат (PIP3), образующийся в результате фосфорилирования фосфотидилинозитол-4,5-бифосфата (PIP2) изоформами PI3K, такими как α, β, γ или δ.

Активность α, β, γ или δ-изоформ PI3K определяли с использованием набора для анализа PI3K человека HTRF™ (Millipore, Биллерика, Массачусетс) с модификациями. Все инкубации проводили при комнатной температуре. 0,5 мкл ингибитора (40Х, в 100% ДМСО) или 100% ДМСО добавляли к каждой лунке 384-луночного белого планшета (Greiner Bio-One, Монро, Северная Каролина), содержащей 14,5 мкл неразбавленной смеси реакционного буферного раствора/PIP2 (10 мМ MgCl₂, 5 мМ ДТТ, 1,38 мкМ PIP2) с ферментом или без него, затем добавляли 5 мкл/лунка АТФ с концентрацией 400 мкМ и дополнительно инкубировали в течение еще 30 мин. Реакцию останавливали добавлением 5 мкл/лунка стопреагента (Millipore, Биллерика, Массачусетс). Затем в каждую лунку добавляли 5 мкл смеси для обнаружения (Millipore, Биллерика, Массачусетс) и инкубировали в течение 6-18 ч в темноте. Отношение HRTF измеряли с помощью ридера для микропланшетов (BMG Labtech., Германия) при длине волны возбуждения 337 нм и длинах волн испускания 665 и 615 нм с временем интегрирования 400 мс и задержкой отсчета 50 мс. Результаты для соединений А, А1 и А2 представлены в табл. 4 ниже. Сравнительные данные для соединения А1 и соединения из примера 128 в WO2012/151525 приведены в табл. 5 ниже.

Таблица 4

Соединение	ICso (нМ)
Ρί3Κδ	Ρί3Κα	Ρί3Κβ	Ρί3Κγ
А	102,8	НО	но	82,94
А1	30,46	>10000	1359	48,72
А2	92,95	но	НО	>10 мкМ
НО: не определяли

- 17 031135

Таблица 5

Профиль селективности
Испытание	IC50 (нМ)	Кратная селективность
Соединение	PI3K6	ΡΙ3Κγ	ΡΙ3Κα	ΡΙ3Κβ
Пример 128 в WO 2012/151525	76,01	70,70	HP (38,29*)	HP (51,04*)
Соединение А	102,8	82,94	НО	НО
Соединение А1	30,46	48,72	>329 (23,02**)	>45 (46,8*) (ICso = 1359 нМ)
Соединение А2	92,95	>10000	НО	НО
* ингибирование в % при 1 мкМ; ** ингибирование в % при 10 мкМ; HP - не рассчитывали и НО: не определяли

Испытание 2. Исследование пролиферации клеток in vitro в линиях лейкозных клеток.

Исследования ингибирования роста проводили в среде с добавлением 10% ФБС. Клетки высеивали в концентрации 5000-20000 клеток/лунка в 96-луночном планшете. Через 24 ч добавляли исследуемые соединения в интервале концентраций от 0,01 до 10000 нМ. Рост оценивали с использованием теста восстановления красителя 3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия бромида (МТТ) при 0 ч (до добавления исследуемого соединения) и через 72 ч после добавления исследуемого соединения. Поглощение измеряли на Fluostar Optima (BMG Labtech, Германия) при длине волны 450 нм. Данные анализировали с использованием GraphPad Prism, и с учетом этого рассчитывали ингибирование (в процентах), вызванное исследуемым соединением по сравнению с контрольным.

Соединение А1 вызывало уменьшение выживаемости Т-клеток лимфомы (MOLT-4, Jurkat, CCRFCEM, Hut-78 и HuT-102) со значениями GI₅₀ в интервале 2,5-12,8 мкМ для исследуемого интервала доз. Дополнительно, соединение А1 не продемонстрировало какой-либо видимой цитотоксичности в течение инкубационного периода, составляющего 72 ч.

Испытание 3. Ингибирование фосфорилирования АКТ в линиях лейкозных клеток. Клетки MOLT4, Jurkat, CCRF-CEM и Hut-78 инкубировали с соединением в желаемых концентрациях в течение 48 ч. Клетки подвергали лизису, и определяли рАКТ с помощью вестерн-блоттинга. Полосы количественно оценивали с использованием ImageJ и нормализовали к актину.

Соединение А1 вызывало уменьшение экспрессии рАКТ в линиях Т-клеток лимфомы (MOLT-4, Jurkat, CCRF-CEM и Hut-78) со значениями EC₅₀ в интервале 0,02-1,6 мкМ для исследуемого интервала доз.

Испытание 4. Ингибирование передачи сигнала PI3K δ и γ в базофилах, полученных из цельной крови человека.

Передача сигнала PI3K δ и γ в базофилах, которая проявляется в изменении експрессии CD63, вызванной анти-FcεR1 или fMLP, является ценным фармакодинамическим маркером, который определяют с использованием набора Flow2CAST® (Buhlmann Laboratories, Швейцария). Процедура теста включает следующие стадии:

Перемешать образец некоагулированной крови, переворачивая несколько раз пробирку для венепункции.

Приготовить свежие и апирогенные пробирки из полипропилена или полистирола емкостью 3,5 мл, пригодные для измерений методом проточной цитометрии.

Добавить 49 мкл цельной крови пациента в каждую пробирку.

Добавить 1 мкл 10% ДМСО (фон) или исследуемого соединения (10% ДМСО) в предназначенные для этого пробирки и слегка перемешать. Инкубировать при комнатной температуре в течение 15 мин.

Добавить пипеткой 50 мкл стимулирующего буферного раствора (фон) или анти-FcsRI Ab или fMLP в каждую пробирку.

Добавить 100 мкл стимулирующего буферного раствора в каждую пробирку.

Слегка перемешать. Добавить 20 мкл окрашивающего реагента (смесь 1:1 FITC-CD63 и PE-CCR3) в каждую пробирку.

Слегка перемешать, закрыть пробирки и инкубировать в течение 15 мин при 37°C на водяной бане (при использовании инкубатора инкубация будет длиться на 10 мин дольше вследствие менее эффективной передачи тепла).

Добавить 2 мл предварительно нагретого (18-28°C) лизирующего реагента в каждую пробирку, слегка перемешать.

Инкубировать в течение 5-10 мин при 18-28°C;

Центрифугировать пробирки в течение 5 мин при 500 xg.

Слить надосадочную жидкость с использованием фильтровальной бумаги.

- 18 031135

Ресуспендировать клеточную массу в 300-800 мкл промывного буферного раствора; и слегка встряхнуть и получить данные на проточном цитометре в тот же день. Долю CD63положительных клеток в выбранной популяции базофилов определяли в различных лечебных группах и нормализовали относительно контроля с использованием носителя.

Соединение А1 характеризовалось EC₅₀ < 30 нМ для FceR1 (PI3^) и IC₅₀ < 70 нМ для fMLP (PI3Ky) (n=1).

Испытание 4А. Клеточная активность, демонстрирующая селективность соединения А1 по отношению к изоформам PI3K и PI3Ky.

Испытание 4А1. Пролиферация В-клеток, вызванная анти-IgM (для селективности к PI3^).

Целью данного исследования являлось оценить способность соединения А1 ингибировать пролиферацию В-клеток человека, вызванную анти-IgM.

Посев и обработка

Изолированные В-клетки ресуспендировали так, чтобы концентрация составляла 1,0х10⁶ клеток в миллилитре. 100 мкл суспензии клеток вносили в каждую лунку на 96-луночном планшете. Выполняли три повторения.

Добавляли 50 мкл разбавленного лекарственного средства и хорошо перемешивали. Готовили контрольный образец с ДМСО и контрольный образец с индуктором.

Обработанный планшет инкубировали в течение 30 мин при 37°C, 5% CO₂, а затем добавляли 50 мкл индуктора (4Х) и перемешивали, капая из пипетки.

Планшет инкубировали при 37°C, 5% CO₂ в течение 72 ч.

Среду удаляли и добавляли 150 мкл ДМСО, чтобы растворились кристаллы формазана. Поглощение считывали при А₅₆₀ и А₆₄₀ нм.

Данные демонстрируют способность соединения А1 ингибировать опосредованную PI3^ пролиферацию В-клеток человека. См., например, Baeker et al., Journal of Immunology, 134: 3532-3538, 1985.

Испытание 4А2. Фосфорилирование AktS473. вызванное LPA. в фибробластах 3T3 (для селективности к PI3K3).

Целью данного исследования являлось определить влияние соединения А1 на опосредованное киназой PI3K3, вызванное LPA фосфорилирование в фибробластах 3T3.

Клетки 3T3 обрабатывали исследуемым соединением в желаемых концентрациях в течение 15 мин. Добавляли 1 мл LPA (2X) так, чтобы конечная концентрация составляла 5 мкМ, и инкубировали в течение 5 мин.

Среду удаляли и промывали 1 мл ледяного ФСБ (1X).

Добавляли 250 мкл буферного раствора для лизиса клеток и инкубировали на льду в течение 30 мин.

Образцы центрифугировали, а надосадочную жидкость хранили при -80°C до анализа.

Образцы анализировали с помощью вестерн-блоттинга с использованием рАКТ (S473) в качестве первичных, а антител против IgG-HRP кролика в качестве вторичных антител.

Интенсивность полос определяли с использованием ImageJ 1.42q (NIH, США) и нормализовали к актину (контроль загрузки). Данные наносили на график с использованием GraphPad Prism (версии 5.02).

Результаты демонстрируют селективность соединения А1 по отношению к бета-изоформе PI3K См. Albuquerque et al., J. Biol. Chem., 278, 39830-39838, 2003.

Испытание 4А3. Фосфорилирование AktS473. вызванное с5а в макрофагах RAW 264.7 (для селективности к PI3Ky).

Целью данного исследования являлось определить влияние соединения А1 на опосредованное киназой PI3Ky, вызванное с5а фосфорилирование в макрофагах RAW 264.7.

Клетки RAW 264.7 обрабатывали исследуемым соединением в желаемых концентрациях в течение 15 мин. Добавляли 1 мл с5а (2Х) так, чтобы конечная концентрация составляла 50 нг/мл, и инкубировали в течение 15 мин.

Ингибирование pAktS473, нижерасположенного маркера передачи сигнала PI3Ky, указывает на участие соединения А1 в каскадах онкогенных реакций, которые регулируются фосфорилированием Akt, вызванным с5а, в клетках RAW 264.7. См. То et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 182, 897-904, 2010.

Испытание 4А4. Фосфорилирование Akt, вызванное PDGF, в клетках 3T3 (для селективности к PI3Ka).

- 19 031135

Целью данного исследования являлось определить влияние соединения А1 на опосредованное киназой PI3Ka, вызванное PDGF фосфорилирование в фибробластах 3T3.

Клетки 3T3 обрабатывали исследуемым соединением в желаемых концентрациях в течение 15 мин. Добавляли 1 мл PDGF (2X) так, чтобы конечная концентрация составляла 20 нг/мл, и инкубировали в течение 10 мин.

Образцы центрифугировали, надосадочную жидкость собирали и хранили при -80°C до анализа.

Не наблюдалось ингибирования при 10 мкМ соединения А1, что указывает на селективность соединения А1 по отношению к альфа-изоформе PI3K. См. Albuquerque et al., J. Biol. Chem. 278, 39830-39838, 2003.

В табл. 6 ниже обобщены результаты испытаний 4А1-4А4.

Таблица 6

КЛЕТОЧНАЯ АКТИВНОСТЬ, ДЕМОНСТРИРУЮЩАЯ СЕЛЕКТИВНОСТЬ СОЕДИНЕНИЯ А1 ПО ОТНОШЕНИЮ К ИЗОФОРМАМ PI3K5 И ΡΙ3Κγ
Клеточная IC50 PI3K альфа (вызванное PDGF рАКТ в фибробластах ЗТЗ)	>10000 нМ
Клеточная IC50 PI3K бета (вызванное LPA рАКТ в фибробластах ЗТЗ)	1324 нМ
Клеточная IC50 PI3K дельта (пролиферация В-клеток человека, вызванная анти-IgM)	11,03 нМ
Клеточная IC50 PI3K гамма (вызванное с5а рАКТ в макрофагах RAW)	51,73 нМ

Испытание 5. Ингибирование апоптоза в линиях лейкозных клеток.

Апоптоз лейкозных клеток определяли in situ с использованием набора Caspase 3 (Millipore, США), как изложено ниже.

Произвести посев лейкозных клеток на 6-луночный планшет так, чтобы плотность составляла 1х10⁶клеток/лунка.

Добавить исследуемое соединение/ДМСО в необходимых концентрациях.

Инкубировать планшет в течение 24 ч при 37°C в 5 % CO₂-инкубаторе.

Собрать клетки в пробирку для центрифугирования емкостью 2 мл.

Добавить 1,6 мкл свежеприготовленного реагента FLICA (5X) и перемешать клетки, слегка ударяя по пробиркам.

Инкубировать пробирки в течение 1 ч при 37°C в 5 % CO₂.

Добавить 2 мл промывного буфера (1X) в каждую пробирку и перемешать.

Центрифугировать клетки при < 400xg в течение 5 мин при комнатной температуре.

Осторожно удалить и отбросить надосадочную жидкость и слегка встряхнуть клеточную массу, чтобы предотвратить агрегацию клеток.

Ресуспендировать клеточную массу в 300 мкл промывного буферного раствора (1X).

Поместить 100 мкл каждой суспензии клеток в каждую из двух ячеек черного микропланшета. Избегать образования пузырьков.

Измерить поглощение в каждой микролунке при длине волны возбуждения 490 нм и длине волны испускания 520 нм.

Рассчитать относительное увеличение активности каспазы-3, которое обнаруживают по увеличению флуоресценции по сравнению с контрольным образцом.

Испытание 6А. Определение цитокинов в МКПК человека.

Целью данного исследования являлось оценить способность соединения А1 ингибировать вызванное антигенами высвобождение цитокинов в МКПК человека. Посев и обработка.

Гепаринизированную цельную кровь человека разбавляли 1:1 ФСБ, помещали в среду для отделения лейкоцитов и центрифугировали при 400g в течение 40 мин.

Желтый слой удаляли и промывали ФСБ.

0,15х10⁶ МКПК высевали в среду RPMI в количестве 100 мкл/лунка и инкубировали в течение 2 ч.

Добавляли 50 мкл раствора соединения, разбавленного в 3 раза средой, и инкубировали в течение 15 мин.

Выработку ФНОа вызывали 50 мкл ЛПС в RPMI так, чтобы конечная концентрация составляла 1 мкг/мл. Надосадочную жидкость собирали через 6 ч.

- 20 031135

Выработку ИЛ-2 вызывали 50 мкл ФГА в RPMI так, чтобы конечная концентрация составляла 20 мкг/мл. Надосадочную жидкость собирали через 24 ч.

Выработку ИЛ-4 вызывали 50 мкл ФГА в RPMI так, чтобы конечная концентрация составляла 20 мкг/мл. Надосадочную жидкость собирали через 48 ч.

С использованием наборов производства eBioscience выполняли ИФА.

С помощью GraphPad Prism 5 рассчитывали EC₅₀.

Значения EC₅₀ рассчитывали из 2-3 независимых экспериментов. Соединение А1 ингибировало вызванную антигеном выработку ФНОа, ИЛ-2 и ИЛ-4 с EC₅₀, составляющими 7,1, 9,5 и 3,5 нМ, соответственно.

Испытание 6В. Ингибирование вызванной ЛПС выработки CD19 или CD45R в цельной крови человека или мыши.

Определяли влияние соединения А1 на модулирование пролиферации В-лимфоцитов человека или мыши, активированной рецепторами В-клеток (BCR). CD19 представляет собой белок, который присутствует на В-клетках на самых ранних различимых стадиях дифференцировки В-клеток при развитии бластных клеток, однако теряется при созревании в плазматические клетки. ЛПС представляет собой эндотоксин и основной компонент микробов окружающей среды с возможной митогенной активностью по отношению к В-клеткам посредством сигнального пути BCR.

Разбавленную цельную кровь человека обрабатывали ДМСО или соединением А1 в желаемых концентрациях. Образцы стимулировали с помощью ЛПС через 15 мин после добавления соединения и инкубировали в течение 72 ч при 37°C и 5% CO₂. Клетки, положительные по CD45 и CD19, определяли с помощью проточной цитометрии, а данные выражали в виде процентного содержания клеток, положительных по CD19, в общей популяции. Обработка соединением А1 приводила к зависимому от дозы ингибированию вызванной ЛПС пролиферации В-клеток в цельной крови человека (EC₅₀ = 117,7 нМ), которую обнаруживают по уменьшению экспрессии CD 19.

Подобно CD19 CD45R (В220) экспрессируются на В-лимфоцитах мыши при их развитии от ранних стадий про-В-клеток далее и подавляются при конечной дифференцировке в плазмоциты. Кратко, разбавленную цельную кровь мыши обрабатывали ДМСО или соединением А1 в желаемых концентрациях. Образцы стимулировали с помощью ЛПС через 15 мин после добавления соединения и инкубировали в течение 72 ч при 37°C и 5% CO₂. Клетки, положительные по CD45 и CD45R, определяли с помощью проточной цитометрии. Данные выражали в виде процентного содержания клеток, положительных по CD45R, в общей популяции. В соответствии с данными о пролиферации клеток CD19+ обработка соединением А1 приводила к зависимому от дозы ингибированию пролиферации В-клеток, вызванной ЛПС, в цельной крови человека (EC50 = 128,2 нМ), которую обнаруживают по уменьшению экспрессии CD45R

Испытание 6С. Ингибирование фосфорилирования АКТ в изолированных спленоцитах мыши.

Путь PI3K регулируется с помощью АКТ, серин-треониновой киназы, которая модулирует несколько онкогенных процессов, таких как пролиферация, рост и выживание клеток. Поскольку селезенка представляет собой иммунный репертуар больших количеств В- и Т-лимфоцитов, ингибирование фосфорилирования АКТ, вызванного ЛПС, определяли ex vivo с использованием изолированных спленоцитов мышей. Клетки высевали и инкубировали с соединением А1 в желаемых концентрациях в течение 15 мин с последующей стимуляцией ЛПС (20 мкг/мл) в течение 30 мин. После стимуляции клетки подвергали лизису, а рАКТ определяли с помощью ИФА с использованием захвата pAKT^S473/образования пары с детекторным антителом и вторичного антимышиного антитела, конъюгированного с HRP. Для расчета ингибирования (%) рАКТ в исследуемых образцах использовали значения поглощения, из которых вычитали значения для контрольного образца. Соединение А1 вызывало зависимое от дозы уменьшение (EC₅₀ = 347,4 нМ) фосфорилирования нисходящего маркера, АКТ, при низких концентрациях, таким образом выявляя сигнальный путь.

Испытание 7. Легочная нейтрофилия. вызванная липополисахаридами. в модели на самках крыс линии Вистар.

Чрезмерное увеличение численности и последующая активация нейтрофилов, возможно, является важным фактором для развития и течения нескольких воспалительных заболеваний в дыхательных путях и легких, таких как тяжелая астма, хроническая обструктивная болезнь легких, муковисцидоз и острый респираторный дистресс-синдром. Механизм, согласно которому нейтрофил участвует в этих заболеваниях, может включать высвобождение протеолитических ферментов, таких как эластаза нейтрофилов, и свободных радикалов кислорода. После высвобождения эти соединения могут вызывать бронхостеноз, гиперактивность бронхов, повышенную секрецию, повреждение эпителия и изменение ткани в дыхательных путях.

После карантинного периода животных, не принимавших пищу, случайным образом распределяли в различные группы в зависимости от массы тела. Исследуемое соединение (соединение А1) готовили в виде суспензии в носителе, содержащем 0,5% метилцеллюлозы, в которой твин 80 выступал в качестве суспендирующего агента. Соединение или среду вводили перорально через зонд в объеме 10 мл/кг. Самкам крыс линии Вистар давали анестезию с использованием кетамина, и вводили раствор ЛПС внутритрахеально через 1 ч после введения соединения в дозе 1 мг/кг. Через 6 ч после инстилляции ЛПС жи- 21 031135 вотных обескровливали под анестезией, а затем вводили катетер в трахею, и легкие четыре раза промывали аликвотами по 5 мл гепаринизированного ФСБ (1 ед./мл) через катетер в трахее (общий объем 20 мл). Жидкость, полученную при бронхоальвеолярном лаваже (БАЛ), хранили при 2-8°C до проведения анализа на общее количество клеток и количество различных лейкоцитов. Бронхоальвеолярную жидкость центрифугировали (500xg в течение 10 мин), а полученную клеточную массу ресуспендировали в 0,5 мл гепаринизированного физиологического раствора. В жидкости, полученной при БАЛ, или в крови определяли общее количество лейкоцитов с использованием счетчика форменных элементов крови и корректировали на 1 х 10⁶ клеток/мл. Количество других клеток подсчитывали вручную. Сто микролитров суспензии клеток центрифугировали с использованием цитоцентрифуги Cytospin 3 для приготовления цитологического мазка. Цитологический мазок окрашивали окрашивающим раствором для крови для дифференцировки, и препарат осматривали при помощи микроскопа для определения эозинофилов в соответствии с их морфологическими характеристиками. В цитологическом мазке определяли количество клеток каждого типа среди 300 лейкоцитов, и выражали его в виде процентного содержания. Рассчитывали количество эозинофилов как в жидкости после БАЛ, так и в крови.

Соединение А1 продемонстрировало уменьшение инфильтрации нейтрофилов в легкие, причем ингибирование составляло 65,29% при 10 мг/кг по сравнению с контрольной группой, что указывает на его терапевтическую роль в воспалительных расстройствах. Результаты показаны на фиг. 1.

Испытание 8. Модель воспаления в воздушных мешочках крыс, которое вызвано липополисахаридом.

Самок крыс линии Вистар (175-200 г) акклиматизировали в течение семи дней до начала эксперимента. Животных случайным образом распределяли в различные группы на основании массы тела. Животным давали анестезию с использованием диэтилового эфира, создавали подкожные мешочки воздуха путем введения 20 мл стерильного воздуха под кожу в межлопаточную область (день 0) и поддерживали путем второй инъекции 10 мл стерилизованного фильтрованием воздуха в 4 день. На 6 день начинали пероральное введение за 1 ч до вызывания воспаления путем подкожной инъекции раствора ЛПС. 5 мл раствора ЛПС, приготовленного в стерильном физиологическом растворе (100 мкг/кг), инъецировали в каждый мешочек. Образцы жидкости из мешочков отбирали через 6 ч после введения ЛПС путем промывания мешочка 5 мл стерильного физиологического раствора и забора 4 мл жидкости. Количество лейкоцитов, присутствующее в жидкости мешочка, определяли при помощи микроскопа с использованием гемоцитометра. Содержание других клеток было установлено при микроскопическом изучении мазков жидкости, окрашенных Diff-Quik.

Соединение А1 вызывало зависимое от дозы уменьшение миграции нейтрофилов в воздушный мешочек крыс с ED₅₀, которое составляло 2,65 мг/кг, что указывает на терапевтическое действие при ревматоидном артрите. Результаты приведены на фиг. 2.

Испытание 9. Легочная эозинофилия. вызванная яичным альбумином, у самцов морских свинок.

После карантинного периода отбирают образцы крови по 0,3 мл из глазничной вены из ретроорбитального сплетения у каждого отдельного животного и анализируют с помощью анализатора клеток (ADVIA 2120, Siemens). На основании общего количества клеток морских свинок случайным образом распределяют в различные группы. Для идентификации наружное ухо помечают несмываемой маркировочной ручкой. В день 0 записывают массы, и животных сенсибилизируют 50 мкг яичного альбумина (OVA) и 10 мг раствора алюминия (1 мл) внутрибрюшинно. В день 7 и день 14 вышеприведенный протокол сенсибилизации повторяют. Животных осматривают для выявления любых признаков заболевания или реакции на сенсибилизацию до дня 19, и если что-либо обнаруживают, то записывают. В день 19, 20 и 21 через 30 мин после лечения исследуемым соединением с использованием зонда для перорального введения животным проводят провокационную пробу с 0,5% (мас./об.), 0,5% и 1% раствором яичного белка, соответственно. Контрольной группе животных и группе животных, получающих плацебо, дают 0,5% (мас./об.) раствором метилцеллюлозы (носитель). Контрольные группы, получающие плацебо, сенсибилизируют 10 мг раствора алюминия в 0, 7 и 14 день и воздействуют физиологическим раствором (SAL) с той же скорость распыления в дни 19, 20 и 21. Через двадцать часов после последней провокационной пробы с OVA измеряют гиперчувствительность дыхательных путей с помощью плетизмографии всего тела в зависимости от накопленных доз метахолина при проведении провокационной пробы (75, 100, 125 и 150 мкг/мл). После измерения реакции дыхательных путей отбирают образцы крови и жидкость после БАЛ. Образцы анализируют для определения общего количества клеток с использованием камеры Нейбауэра под микроскопом, подсчет различных лейкоцитов выполняют вручную.

Испытание 10. Модель астмы на мышах.

После периода карантина на основании массы тела мышей случайным образом распределяли в четыре группы (n=7). Для идентификации хвосты помечали несмываемой маркировочной ручкой. В день 0 записывали массы, и животных сенсибилизировали 100 мкг яичного альбумина (OVA) и 10 мг раствора алюминия (0,2 мл) внутрибрюшинно.

В день 7 и день 14 вышеприведенный протокол сенсибилизации повторяли. Животных осматривали для выявления любых признаков заболевания или реакции на сенсибилизацию до дня 24, и если что-либо

- 22 031135 обнаруживали, то записывали. В день 24, 25 и 26 через 30 мин после лечения исследуемым соединением с использованием зонда для перорального введения животных подвергали провокационной пробе с 10% (масса/объем) раствором яичного белка.

Контрольной группе животных и группе животных, получающих плацебо, давали 0,5% (масса/объем) раствора метилцеллюлозы (носитель). Контрольные группы, получающие плацебо, сенсибилизировали 10 мг раствора алюминия в 0, 7 и 14 день и воздействовали физиологическим раствором с той же скорость распыления в дни 24, 25 и 26.

Через сорок часов после последней провокационной пробы с OVA измеряют гиперчувствительность дыхательных путей с помощью плетизмографии всего тела в зависимости от накопленных доз метахолина при проведении провокационной пробы (2,5, 10, 50 и 100 мг/мл). После измерения реакции дыхательных путей отбирали образцы крови и жидкость после БАЛ. Образцы анализировали для определения общего количества клеток с использованием камеры Нейбауэра под микроскопом, подсчет различных лейкоцитов выполняли вручную.

Испытание 11. Коллаген-индуцированный артрит (КИА) у крыс линии Вистар.

Самок крыс линии Вистар акклиматизировали в течение семи дней до начала эксперимента и случайным образом распределяли в различные группы на основании массы тела. В день 0 животным в основание хвоста вводили внутрикожные инъекции 500 мкг бычьего коллагена II типа, эмульгированного с полным адъювантом Фрейнда (ПАФ), содержащим МБТ (4 мг/мл). На 7 день после первичной сенсибилизации животным вводили вторичную инъекцию 300 мкг СП в неполном адъюванте Фрейнда путем внутрикожной инъекции в основание хвоста. Возникновение артрита в голеностопных суставах, как правило, становится заметным между 12 и 14 днем. Животным вводили исследуемое соединение или носитель (пероральное введение) от дня после начала артрита, и лечение продолжали в течение следующих 9 дней подряд. Оценку артрита проводили при регулярном визуальном определении признаков воспаления суставов в течение периода исследования. Измерения массы тела, объема лап и толщины лап выполняли в дни 0, 1, 3, 5, 7, 9 и 10. После десяти дней лечения в конце исследования при вскрытии забирали образцы крови, из которых получали сыворотку или плазму, и забирали все суставы, как передние, так и задние лапы консервировали в 10% формалине для гистопатологических исследований после изъятия небольшого куска ткани из каждого сустава и хранили при -80°C для анализа на цитокины гомогената ткани. Клинические оценочные критерии для передних и задних лап: 0 = нормально; 1 = поражен один сустав задних или передних лап или незначительная диффузная эритема и отек; 2 = поражены два сустава задних или передних лап или диффузная эритема и отек легкой степени; 3 = поражены три сустава задних или передних лап или диффузная эритема и отек средней степени; 4 = значительная диффузная эритема и отек, или = поражены четыре сустава пальца; 5 = тяжелая диффузная эритема и тяжелый отек всей лапы, неспособность согнуть палец.

Соединение А1, которое вводили терапевтическими дозами крысам с КИА, демонстрирует значительную эффективность уменьшения клинической оценки (фиг. 3А и 3В), наблюдаемой как в лапах, подвергаемых профилактическому воздействию (фиг. 3С), так и в лапах, подвергаемых терапевтическому воздействию (фиг. 3D).

Соединение А1, которое вводили терапевтическими дозами крысам с КИА, демонстрирует значительную эффективность уменьшения среднего объема обеих задних лап (фиг. 4А и 4В) и диаметра голеностопного сустава обеих задних лап (фиг. 4С и 4D).

Гистологический анализ: соединение А1, которое вводили терапевтическими дозами крысам с КИА, демонстрирует значительную эффективность ингибирования воспаления (58,3%, см. фиг. 4А), заболевания хрящей (46,51%, см. фиг. 4В) и паннуса (49,18%, см. фиг. 4С), наблюдаемую при гистопатологическом анализе всех задних и передних лап.

Частота возникновения и развитие артрита значительно уменьшались в лечебных группах по сравнению с контрольной группой животных (фиг. 5).

Испытание 12. Острая инфильтрация клеток, вызванная сигаретным дымом, у самцов мышей Balb/c.

Животных (самцов мышей Balb/c) акклиматизируют в течение семи дней до начала эксперимента. Затем животных случайным образом распределяют в различные группы на основании массы тела. В 1 день мышам вводят исследуемое соединение или носитель перорально/интраназально, а через 1 ч животных, которым вводили исследуемое соединение, помещают в камеру воздействия на весь организм. В день 1 и день 2 мышей подвергают воздействию дыма, который непосредственно вдыхает курильщик, от 6 сигарет, от 8 сигарет в 3 день и от 10 сигарет в 4 день. Воздействие дыма каждой сигареты должно длиться в течение 10 мин. Сигареты должны полностью сгорать в первые две минуты, затем через респиратор животного продувают воздух и следующие 20 мин воздействуют свежим воздухом из комнаты. После каждой второй сигареты необходимо дополнительно 20 мин воздействовать свежим воздухом комнаты. Контрольных животных необходимо подвергать воздействию воздуха комнаты. С 1 дня до 4 дня животным вводят исследуемое соединение или перорально, или интраназально. В 5 день через 24 ч после воздействия дыма последней сигареты (СД) животных обескровливают под анестезией, а затем вводят катетер в трахею, и легкие промывают четыре раза аликвотами по 0,5 мл гепаринизированного

- 23 031135

ФСБ (1 ед/мл) через катетер в трахее (общий объем 2 мл). Жидкость, полученную при бронхоальвеолярном лаваже (БАЛ), необходимо хранить при 2-8°C до проведения анализа на общее количество клеток и количество различных лейкоцитов. Бронхоальвеолярную жидкость центрифугируют (500xg в течение 10 мин), а полученную клеточную массу ресуспендируют в 0,5 мл гепаринизированного физиологического раствора. Общее количество лейкоцитов определяют в жидкости, полученной при БАЛ, или в крови с использованием счетчика форменных элементов крови и корректируют на 1х10⁶ клеток/мл. Количество других клеток подсчитывают вручную. Сорок микролитров суспензии клеток центрифугируют с использованием цитоцентрифуги Cytospin 3 для приготовления цитологического мазка. Цитологический мазок окрашивают окрашивающим раствором для крови для дифференцировки, и препарат осматривают при помощи микроскопа для определения эозинофилов в соответствии с их морфологическими характеристиками. В цитологическом мазке определяют количество клеток каждого типа среди 300 лейкоцитов и выражают в виде процентного содержания, и подсчитывают количество нейтрофилов и макрофагов в жидкости после БАЛ.

Испытание 13. Пятнистый псориаз, вызванный имиквимодом, в модели на мышах Balb/c.

Имиквимод (IMQ) представляет собой лиганд к TLR7 и TLR8, который изначально использовали при лечении немеланомного рака кожи. Местное нанесение IMQ на обритую кожу спины мыши вызывает патологическое состояние кожи, подобное псориазу, которое обладает большинством патологических характерных черт псориаза человека, включая акантоз, паракератоз, и инфильтрацию иммунных клеток, и вовлечение пути ИЛ23/ИЛ17/ИЛ22. Животных (самцов мышей Balb/c) акклиматизировали в течение семи дней до начала эксперимента. Животных случайным образом распределяли в различные группы на основании массы тела. В день 0 с кожи спины мышей удаляли шерсть путем местного нанесения крема для удаления волос. В день 1 мышам вводили исследуемое соединение или носитель перорально, и через 1 ч мышам, которые получали исследуемое соединение, на кожу спины без шерсти местно наносили 62,5 мг имеющегося в продаже крема, содержащего IMQ (5%; крем Beselna; Mochida Pharmaceuticals, Токио, Япония). Мышам местно наносили имиквимод в течение следующих 5 дней подряд через один час после введения исследуемого соединения или носителя. Животным давали высохнуть в течение одного часа до возвращения в их клетки каждый день после местного нанесения. Через четыре часа после последнего нанесения крема, содержащего IMQ, мышей умерщвляли и получали образцы кожи. Измеряли толщину кожи на спине с использованием толщиномера с циферблатным индикатором. После измерения толщины кожи, образцы консервировали в 10 %-ом нейтральном буферном растворе формалина и заключали в парафин. Депарафинизированные срезы окрашивали гематоксилин-эозином (ГЭ). Толщину эпидермы определяли количественно путем усреднения значений пяти независимых участков среза. Для оценки тяжести воспаления на коже спины использовали объективную систему оценивания, которая основана на клиническом индексе тяжести поражения псориазом (PASI) у людей. Эритему, шелушение и утолщение оценивали независимо по шкале от 0 до 4: 0 = нет; 1 = легкое; 2 = среднее; 3 = заметное; и 4 = очень заметное.

Как показано на фиг. 6А и 6В, соединение А1 уменьшает толщину, эритему и шелушение кожи спины (как видно из гистопатологической оценки) по сравнению с контрольной группой животных.

Хотя изобретение было описано в данном документе на основании конкретных вариантов реализации изобретения, понятно, что эти варианты реализации изобретения только иллюстрируют принципы и применение настоящего изобретения. Поэтому понятно, что можно осуществить большое количество модификаций иллюстративных вариантов реализации изобретения, и что можно разработать другие схемы без отклонения от сущности и объема настоящего изобретения, как описано выше. Подразумевается, что прилагаемая формула изобретения определяет объем изобретения, и что способы и структуры в рамках объема этой формулы изобретения и их эквиваленты охвачены изобретением.

Все публикации, и патенты, и/или заявки на патент, цитируемые в этой заявке, включены в данный документ посредством ссылки в той же степени, как если бы было указано, что каждая индивидуальная публикация или заявка на патент прямо и в отдельности включена в данный документ посредством ссылки.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Соединение, выбранное из (RS)-N-(5-(4-амино-1-( 1 -(5 -фтор-3 -(3 -фторфенил)-4-оксо-4Ы-хромен-2-ил)этил)-1И-пиразоло [3,4-d] пиримидин-3-ил)-2-метоксифенил)метансульфонамида;

(R)-N-(5-(4-амино-1-(1-(5-фтор-3-(3-фторфенил)-4-оксо-4H-хромен-2-ил)этил)-1H-пиразоло[3,4-d] пиримидин-3-ил)-2-метоксифенил)метансульфонамида;

и их фармацевтически приемлемых солей.
2. Соединение, представляющее собой (S)-N-(5-(4-амино-1-(1-(5-фтор-3-(3-фторфенил)-4-оксо-4Hхромен-2-ил)этил)-1И-пиразоло[3,4^]пиримидин-3-ил)-2-метоксифенил)метансульфонамид или его фармацевтически приемлемую соль.
3. Соединение по п.2, отличающееся тем, что практически свободно от ^)-Ы-(5-(4-амино-1-(1-(5

- 24 031135 фтор-3-(3-фторфенил)-4-оксо-4H-хромен-2-ил)этил)-1Н-пиразоло[3,4-d]пиримидин-3-ил)-2-метоксифенил)метансульфонамида и его фармацевтически приемлемой соли.
4. Соединение по п.2, отличающееся тем, что имеет энантиомерную чистоту около 95% и более.
5. Фармацевтическая композиция для лечения болезни, расстройства или состояния, связанного с PI3K, содержащая соединение по любому из пп.1-4 и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель.
6. Способ лечения заболевания, расстройства или состояния, при котором будет полезным ингибирование каталитической активности PB-киназы δ/γ, включающий обеспечение взаимодействия клетки с эффективным количеством соединения по любому из пп.1-4 или фармацевтической композиции по п.5.
7. Способ лечения заболевания, расстройства или патологических состояний, связанных с PI3K, включающий этап, на котором субъекту, нуждающемуся в этом, вводят эффективное количество соединения по любому из пп.1-4 или фармацевтической композиции по п.5.
8. Способ по п.6, отличающийся тем, что заболевание, расстройство или патологическое состояние, при котором будет полезным ингибирование каталитической активности PB-киназы δ/γ, представляет собой рак.
9. Способ по п.6 или 7, отличающийся тем, что заболевание, расстройство или патологическое состояние выбраны из астмы, хронической обструктивной болезни лёгких (ХОБЛ), ревматоидного артрита, нейровоспалительных заболеваний, рассеянного склероза и псориаза.
10. Соединение, выбранное из ^)-2-(1-(4-амино-3-(4-метокси-3-нитрофенил)-1Н-пиразоло[3,4^]пиримидин-1-ил)этил)-5-фтор-3- (3-фторфенил)-4Н-хромен-4-она, (S)-2-( 1 -(4-амино-3-(3-амино-4-метоксифенил)-1Н-пиразоло[3,4^]пиримидин-1 -ил)этил)-5-фтор-3(3-фторфенил)-4Н-хромен-4-она и их солей.
11. Способ получения соединения формулы (I) включающий следующие стадии:

(а) обеспечение взаимодействия 5-бром-2-метоксианилина с метансульфонилхлоридом с получением К-(5-бром-2-метоксифенил)метансульфонамида (промежуточное соединение 1) (b) обеспечение взаимодействия промежуточного соединения 1 с бис(пинаколато)дибором с получением К-(2-метокси-5-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)фенил)метансульфонамида (промежуточное соединение 2) (с) обеспечение взаимодействия 2-(1-(4-амино-3-иод-1Н-пиразоло[3,4^]пиримидин-1-ил)этил)-5фтор-3-(3-фторфенил)-4Н-хромен-4-она

- 25 031135 с промежуточным соединением 2 в присутствии подходящего основания с получением соединения формулы (I).
12. Способ получения соединения формулы (А1) включающий следующие стадии:

(а) обеспечение взаимодействия (К)-5-фтор-3-(3-фторфенил)-2-(1-гидроксиэтил)-4И-хромен-4-она с 3 -(4-метокси-3 -нитрофенил)- Ш-пиразоло [3,4-d] пиримидин-4-амином в условиях реакции Мицунобу с использованием трифенилфосфина и диизопропилазодикарбоксилата с получением (8)-2-(1-(4-амино-3-(4-метокси-3-нитрофенил)-1И-пиразоло[3,4^]пиримидин-1-ил) этил)-5-фтор-3-(3-фторфенил)-4И-хромен-4-она (промежуточное соединение 3) (b) восстановление промежуточного соединения 3 с получением (8)-2-(1-(4-амино-3-(3-амино-4метоксифенил)- 1И-пиразоло [3,4-d] пиримидин-1 -ил)этил)-5-фтор-3 -(3 -фторфенил)-4И-хромен-4-она (промежуточное соединение 4) (с) обеспечение взаимодействия промежуточного соединения 4 с метансульфонилхлоридом с получением соединения формулы (А1).

- 26 031135

Легочная нейтрофилия, вызванная

ЛПС, у крыс линии Вистар (/г = 6)

Воспаление воздушных мешочков, вызванное ЛПС, у крыс линии Вистар

Фиг. 2

Клиническая оценка

Дни

Фиг. 3A

- 27 031135

Фиг. 4B

- 28 031135

Дни

Фиг. 4C

Фиг. 4F

Фиг. 4G

- 29 031135

Фиг. 4H

Фиг. 5

Фиг. 6B