JP6557266B2 - Ｐｉ３デルタ及びガンマタンパク質キナーゼの選択的二重阻害剤としての置換クロメン誘導体 - Google Patents

Description

本出願は、その全体として参照により本明細書に組み込まれる、２０１４年６月２７日に出願されたインド特許出願第３１４４／ＣＨＥ／２０１４号の利益を主張する。

本発明は、二重デルタ（δ）及びガンマ（γ）ＰＩ３Ｋタンパク質キナーゼ調節剤、それらを調製する方法、それらを含有する薬学的組成物、ならびにそれらを使用してＰＩ３Ｋキナーゼ媒介疾患または障害を治療、予防、及び／または寛解する方法を提供する。

ホスホイノシチド−３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）は、ホスホイノシチド脂質（ＰＩ）のイノシトール環３位のヒドロキシル基をリン酸化して脂質セカンドメッセンジャーを産生する、細胞内脂質キナーゼのクラスに属する。ＰＩ３Ｋのα及びβアイソフォームがそれらの分布において遍在性である一方で、ＰＩ３Ｋのδ及びγ形態の発現は、循環する血行性細胞及び内皮細胞に限定される。ＰＩ３ＫαまたはＰＩ３Ｋβとは異なり、ＰＩ３ＫδまたはＰＩ３Ｋγの発現が欠如するマウスは、これらの特異的アイソフォームの標的化が明らかな毒性をもたらさないであろうということを示す、いかなる有害な表現型も示さない。

近年、ＰＩ３Ｋ経路の標的化阻害剤が、免疫調節剤として提唱されている。この関心は、ＰＩ３Ｋ経路が、主に膜結合セカンドメッセンジャーであるホスファチジルイノシトール（３，４，５）−三リン酸（ＰＩＰ３）の生成を通して、免疫細胞における複数の機能を果たすという事実に由来する。ＰＩＰ３は、タンパク質キナーゼ及びＧＴＰアーゼを含むタンパク質を脂質二重層の細胞質側に対して動員し、免疫細胞接着、遊走、及び細胞間情報伝達の制御において重要な下流のシグナル伝達カスケードの複雑なネットワークを開始する。

４つのクラスＩ ＰＩ３Ｋアイソフォームは、それらの組織分布において著しく異なる。ＰＩ３Ｋα及びＰＩ３Ｋβは、遍在性であり、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の下流で活性化される一方で、ＰＩ３Ｋδ及びＰＩ３Ｋγは、主に造血性及び内皮細胞に限定され、それぞれＲＴＫの下流及びＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）の下流で活性化される。マウス遺伝子研究は、ＰＩ３Ｋα及びＰＩ３Ｋβが、正常な発達のために必須である一方で、ＰＩ３Ｋδ及び／またはＰＩ３Ｋγの喪失が、選択的免疫欠損を有する生存可能な子孫をもたらすことを明らかにしている。

ＰＩ３Ｋδ及びＰＩ３Ｋγの発現パターン及び機能は、例えば、リウマチ性関節炎、アレルギー、喘息、慢性閉塞性肺疾患、及び多発性硬化症を含む多くの疾患のための薬剤としての、ＰＩ３Ｋδ／γ阻害剤の開発において大きな関心を生み出している（Ｈｉｒｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１１８，１９２−２０５，２００８；Ｍａｒｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１７８４，１５９−１８５，２００８；Ｒｏｍｍｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７，１９１−２０１，２００７；Ｒｕｃｋｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．，５，９０３−９１８，２００６）。薬理的及び遺伝子的方法の両方を使用する研究は、これらの２つのアイソフォームが、しばしば互いとの相乗的な相互作用を実証することを示している（Ｋｏｎｒａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８３，３３２９６−３３３０３，２００８；Ｌａｆｆａｒｇｕｅ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１６，４４１−４５１，２００２）。例えば、マスト細胞において、ＰＩ３ＫδはＦｃ受容体のＩｇＥ架橋に反応する脱顆粒のために必須である（Ａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８０，２５３８−２５４４，２００８）が、ＰＩ３Ｋγは、反応を増幅するうえで、重要な役割を果たす（Ｌａｆｆａｒｇｕｅ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１６，４４１−４５１，２００２）。同様の効果が、ＰＩ３Ｋγが重要な役割を果たし、ＰＩ３Ｋδが各プロセスを増幅する、リンパ球ホーミング及び好中球呼吸バーストを含む他の細胞機能において見られている。ＰＩ３Ｋδ及びＰＩ３Ｋγの非冗長性であるが関連する役割は、２つのアイソフォームのうちのどちら（単独または組み合わせ）が特定の炎症性障害において最良に標的化されるかを判定することを困難にしている。

ＰＩ３Ｋδ及び／またはＰＩ３Ｋγが欠如するか、またはＰＩ３Ｋδ及びＰＩ３Ｋγのキナーゼ死変異体を発現するマウスを使用する研究は、それらの役割を理解することにおいて貴重な手段となっている。例えば、ＰＩ３Ｋδノックアウトマウスは、減少した好中球走化性、減少した抗体生成（Ｔ細胞依存及び非依存の両方）（Ｊｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２２，８５８０−８５９１，２００２）、及びより少ない数の成熟Ｂ細胞（Ｃｌａｙｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９６，７５３−７６３，２００２；Ｊｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２２，８５８０−８５９１，２００２）、及びそれらの抗ＩｇＭに反応する増殖における減少（Ｊｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２２，８５８０−８５９１，２００２）を実証した。この表現型は、ＰＩ３Ｋδキナーゼ死変異体において、ＰＩ３Ｋδ選択的阻害剤及び減弱したアレルギー反応とともに、減少した数のマスト細胞及びマスト細胞の増殖を伴って、複製された。ＰＩ３Ｋγノックアウトは、より多い数の、しかしより反応性でない好中球、より少ない数かつより反応性でないマクロファージを含有し、樹状細胞は、減少したマスト細胞脱顆粒（Ｌａｆｆａｒｇｕｅ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１６，４４１−４５１，２００２）、より高い割合のＣＤ４＋〜ＣＤ８＋Ｔ細胞、増加した胸腺細胞アポトーシス、活性化Ｔ細胞上へのＣＸＣＲ３の減少した誘導、及び減少した心臓収縮力を示した。心臓組織に対するこの後者の効果は、ＰＩ３Ｋγ阻害剤を有する患者の慢性投薬に対する懸念であった。しかしながら、この懸念は、（タンパク質の喪失よりもむしろキナーゼの阻害をより良く模倣する）ＰＩ３Ｋγキナーゼ死変異体が同様の免疫細胞表現型を示したが、重要なことに心臓異常を有しなかったとき、大きく軽減された。心臓効果は、その後ＰＩ３Ｋγの触媒活性よりもむしろ足場効果によるものであることが示された（Ｏｌｕｓｅｇｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１，１２３−１３４，２０１０、その中に引用される参照文献を含む）。二重ＰＩ３Ｋδ／ＰＩ３Ｋγノックアウトは生存可能であったが、Ｔ細胞の発達及び胸腺細胞の生存において深刻な異常を呈した。ＰＩ３Ｋγノックアウト／ＰＩ３Ｋδキナーゼ死の組み合わせは、少なくとも免疫系において、ＰＩ３Ｋδの役割が触媒的なもののみである可能性が高いことを示唆する、同様の表現型を生成した。ノックアウト及びキナーゼ死マウスを使用する研究の解釈は、これらのモデルは免疫系の定常状態の描写のみを提供し、一次的及び用量制御が欠如し、動的免疫反応が可逆的阻害に対してどのように反応するのかについての完全な理解を可能にしないため、困難であり得る。異なるプロファイル（ＰＩ３Ｋδ、ＰＩ３Ｋγ、及びＰＩ３Ｋδ／γ）を有する選択的阻害剤は、免疫細胞活性化に対する各ＰＩ３Ｋの相対的な寄与を評価するために、白血球シグナル伝達の研究に必要である（Ｏｌｕｓｅｇｏｎ ｅｔ ａｌ．、上記、その中で引用される参照文献を含む）。

δ／γの二重阻害は、気道のアレルギー性炎症及び非アレルギー性炎症、ならびに他の自己免疫疾患における介入計画と強く関係付けられる。喘息及び慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の根底にある、種々の細胞プロセスにおけるＰＩ３Ｋδ及びγガンマの関与の科学的根拠は、阻害剤研究及び遺伝子標的化アプローチに由来する。（Ｗｉｌｌｉａｍ ｅｔ．ａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１７，１２３−１３４，２０１０、及びＴｈｏｍｐｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１７：１０１−１０２，２０１０）。また、いくらかのＣＯＰＤ患者におけるコルチコステロイド等の従来の治療法に対する抵抗は、ＰＩ３Ｋδ／γ経路の上方制御に起因している。したがって、ＰＩ３Ｋ−δ／γシグナル伝達の破壊は、免疫炎症反応に対抗することを目的とする新規の戦略を提供する。白血球遊走及び活性化等の炎症性細胞の機能性を媒介することにおける、ＰＩ３Ｋ−δ及びγによって果たされる中心的な役割、ならびにマスト細胞脱顆粒により、これらのアイソフォームを遮断することもまた、リウマチ性関節炎の治療のための有効な戦略であり得る。免疫監視におけるこれらのアイソフォームの確立された重要性を考慮すると、ＰＩ３Ｋδ及びＰＩ３Ｋγアイソフォームを特異的に標的化する阻害剤は、気道炎症及びリウマチ性関節炎において遭遇される免疫反応の進行を減弱することが期待される（Ｗｉｌｌｉａｍ ｅｔ．ａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１７，１２３−１３４，２０１０ ａｎｄ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１７：１０１−１０２，２０１０）

ＰＩ３Ｋ及び関連するタンパク質キナーゼ経路に関する再考察及び研究は、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，８，６２７−６４４，２００９）；Ｎａｔｈａｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．，８（１），２００９；Ｍａｒｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１７８４，１５９−１８５，２００８、及び２００９年８月に公開されたＭａｒｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ａｄｖａｎｃｅ Ａｃｃｅｓｓによって示されている。同様に、ＰＩ３Ｋδ及びγの役割に関する再考察及び研究は、Ｗｉｌｌｉａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１７，１２３−１３４，２０１０ ａｎｄ Ｔｉｍｏｔｈｙ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，５５（２０），８５５９−８５８１，２０１２によって示されている。これらの文献開示の全ては、それらの全体として参照により本明細書に組み込まれる。

ＩＰＩ−１４５及びＣＡＬ１３０等の化合物は、ＰＩ３Ｋδ／γの二重阻害剤として報告されている（それぞれ第ＷＯ２０１２／００８３０２号及び第ＷＯ２０１２／１２１９５３号）。ＩＰＩ−１４５は、癌、喘息、及びリウマチ性関節炎の臨床研究下にある。ＩＰＩ−４５は、７５ｍｇのＢＩＤの最大許容用量（ＭＴＤ）を有すると報告されている（５５ｔｈ ＡＳＨ（登録商標）Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ．Ｎｅｗ Ｏｒｌｅａｎｓ−ＬＡ，Ｄｅｃ ７−１０，２０１３）。ＣＡＬ−１３０が臨床目的のために研究されているという報告は存在しない。

δ／γＰＩ３Ｋキナーゼ媒介事象に関連する疾患及び障害の治療のための、二重δγＰＩ３Ｋ調節剤の満たされていない必要性が依然として存在する。

本明細書において、国際公開第ＷＯ １１／０５５２１５号及び第ＷＯ １２／１５１５２５号、ならびに米国公開第２０１１／０１１８２５７号及び第２０１２／０２８９４９６号が更に参照され、これらの各々は、それらの全体として参照により本明細書に組み込まれる。

インド特許出願第３１４４／ＣＨＥ／２０１４号 第ＷＯ２０１２／００８３０２号 第ＷＯ２０１２／１２１９５３号 国際公開第ＷＯ １１／０５５２１５号 第ＷＯ １２／１５１５２５号 米国公開第２０１１／０１１８２５７号 米国公開第２０１２／０２８９４９６号

Ｈｉｒｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１１８，１９２−２０５，２００８ Ｍａｒｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１７８４，１５９−１８５，２００８ Ｒｏｍｍｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７，１９１−２０１，２００７ Ｒｕｃｋｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．，５，９０３−９１８，２００６ Ｋｏｎｒａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８３，３３２９６−３３３０３，２００８ Ｌａｆｆａｒｇｕｅ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１６，４４１−４５１，２００２ Ａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８０，２５３８−２５４４，２００８ Ｊｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２２，８５８０−８５９１，２００２ Ｃｌａｙｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９６，７５３−７６３，２００２ Ｏｌｕｓｅｇｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１，１２３−１３４，２０１０ Ｗｉｌｌｉａｍ ｅｔ．ａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１７，１２３−１３４，２０１０ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１７：１０１−１０２，２０１０ Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，８，６２７−６４４，２００９ Ｎａｔｈａｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．，８（１），２００９ ２００９年８月に公開されたＭａｒｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ａｄｖａｎｃｅ Ａｃｃｅｓｓ Ｔｉｍｏｔｈｙ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，５５（２０），８５５９−８５８１，２０１２

本発明は、ＰＩ３Ｋデルタ（δ）及びガンマ（γ）タンパク質キナーゼの選択的二重阻害を対象とする。これらの化合物は、ＰＩ３Ｋ関連疾患、障害、または病態、例えば、癌等の増殖性疾患の治療のための薬学的組成物における使用のために好適である。ＰＩ３Ｋδ及びＰＩ３Ｋγタンパク質キナーゼの両方の阻害は、ある疾患及び障害の治療において有益な効果を提供し得る。

本発明の選択的二重阻害剤は、Ｎ−（５−（４−アミノ−１−（１−（５−フルオロ−３−（３−フルオロフェニル）−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−２−イル）エチル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）−２−メトキシフェニル）メタンスルホンアミドと、その薬学的に許容可能な塩と、そのプロドラッグと、を含む。例えば、選択的二重阻害剤は、以下の化合物、その薬学的に許容可能な塩、及びそのプロドラッグから選択され得る。
（ＲＳ）−Ｎ−（５−（４−アミノ−１−（１−（５−フルオロ−３−（３−フルオロフェニル）−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−２−イル）エチル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）−２−メトキシフェニル）メタンスルホンアミド（化合物Ａ）；及び
（Ｓ）−Ｎ−（５−（４−アミノ−１−（１−（５−フルオロ−３−（３−フルオロフェニル）−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−２−イル）エチル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）−２−メトキシフェニル）メタンスルホンアミド（化合物Ａ１）。

一実施形態において、化合物（Ｓ）−Ｎ−（５−（４−アミノ−１−（１−（５−フルオロ−３−（３−フルオロフェニル）−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−２−イル）エチル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）−２−メトキシフェニル）メタンスルホンアミド、またはその薬学的に許容可能な塩は、（Ｒ）−Ｎ−（５−（４−アミノ−１−（１−（５−フルオロ−３−（３−フルオロフェニル）−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−２−イル）エチル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）−２−メトキシフェニル）メタンスルホンアミド、及びその薬学的に許容可能な塩を、実質的に含まない（例えば、約５重量％未満、約２．５重量％未満、約１重量％未満、約０．１重量％未満等の約１０重量％未満を含有する）か、または含まない。

別の実施形態において、化合物（Ｓ）−Ｎ−（５−（４−アミノ−１−（１−（５−フルオロ−３−（３−フルオロフェニル）−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−２−イル）エチル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）−２−メトキシフェニル）メタンスルホンアミド、またはその薬学的に許容可能な塩は、約９１％超、約９２％超、約９３％超、約９４％超、約９５％超、約９６％超、約９７％超、約９８％超、約９９％超、約９９．５％超、約９９．９％超、約９９．９９％超等の約９０％超の鏡像体過剰率を有する。

１つの好ましい実施形態において、本発明は、化合物（Ｓ）−Ｎ−（５−（４−アミノ−１−（１−（５−フルオロ−３−（３−フルオロフェニル）−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−２−イル）エチル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）−２−メトキシフェニル）メタンスルホンアミド（化合物Ａ１）に関する。

別の実施形態において、本発明は、化合物（Ｓ）−Ｎ−（５−（４−アミノ−１−（１−（５−フルオロ−３−（３−フルオロフェニル）−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−２−イル）エチル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）−２−メトキシフェニル）メタンスルホンアミド、またはその薬学的に許容可能な塩に関する。

本発明の別の実施形態は、（Ｒ）−Ｎ−（５−（４−アミノ−１−（１−（５−フルオロ−３−（３−フルオロフェニル）−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−２−イル）エチル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）−２−メトキシフェニル）メタンスルホンアミド（化合物Ａ２）、その薬学的に許容可能な塩、またはそのプロドラッグに関する。化合物Ａ２は、ＰＩ３Ｋデルタ（δ）タンパク質キナーゼの阻害剤である。これらの化合物は、ＰＩ３Ｋ関連疾患、障害、または病態、例えば、癌等の増殖性疾患の治療のための薬学的組成物における使用のために好適である。

Ｎ−（５−（４−アミノ−１−（１−（５−フルオロ−３−（３−フルオロフェニル）−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−２−イル）エチル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）−２−メトキシフェニル）メタンスルホンアミド、化合物Ａ１、及び化合物Ａ２の化学構造を以下に示す。

本発明は、薬学的に許容可能な担体とともに、本発明の１つ以上の化合物（化合物Ａ１等）を含む薬学的組成物を更に提供する。薬学的組成物は、追加の活性剤（以下で述べられる抗癌剤及び活性剤等）のうちの１つ以上を更に含み得る。一実施形態において、薬学的組成物は、治療有効量の本発明の１つ以上の化合物を含む。

本発明の別の態様は、Ｎ−（５−（４−アミノ−１−（１−（５−フルオロ−３−（３−フルオロフェニル）−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−２−イル）エチル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）−２−メトキシフェニル）メタンスルホンアミドの調製のためのプロセスに関する。

該プロセスは、
（ａ）５−ブロモ−２−メトキシアニリンを、

メタンスルホニルクロリドと反応させて、Ｎ−（５−ブロモ−２−メトキシフェニル）メタンスルホンアミド（中間体１）を得るステップと、

（ｂ）中間体１を、ビス（ピナコラート）ジボロンと、例えば、酢酸カリウムの存在下で反応させて、Ｎ−（２−メトキシ−５−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）フェニル）メタンスルホンアミド（中間体２）を得るステップと、

（ｃ）２−（１−（４−アミノ−３−ヨード−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル）エチル）−５−フルオロ−３−（３−フルオロフェニル）−４Ｈ−クロメン−４−オンを、

中間体２と、塩基（例えば、炭酸ナトリウム等）の存在下で反応させて、所望の化合物Ｎ−（５−（４−アミノ−１−（１−（５−フルオロ−３−（３−フルオロフェニル）−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−２−イル）エチル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）−２−メトキシフェニル）メタンスルホンアミドを得るステップと、
（ｄ）任意に、Ｎ−（５−（４−アミノ−１−（１−（５−フルオロ−３−（３−フルオロフェニル）−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−２−イル）エチル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）−２−メトキシフェニル）メタンスルホンアミドを、その薬学的に許容可能な塩またはそのプロドラッグに変換するステップと、を含む。

なお別の実施形態は、式（Ａ１）の化合物の調製のためのプロセスに関する。

該プロセスは、
（ａ）（Ｒ）−５−フルオロ−３−（３−フルオロフェニル）−２−（１−ヒドロキシエチル）−４Ｈ−クロメン−４−オンを、

３−（４−メトキシ−３−ニトロフェニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−アミンとのＭｉｔｓｕｎｏｂｕ反応に供して、

（例えば、トリフェニルホスフィン及びジイソプロピラゾジカルボキシレートの存在下で）、（Ｓ）−２−（１−（４−アミノ−３−（４−メトキシ−３−ニトロフェニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル）エチル）−５−フルオロ−３−（３−フルオロフェニル）−４Ｈ−クロメン−４−オン（中間体３）を得るステップと、

（ｂ）中間体３を、例えば、Ｒａｎｅｙ Ｎｉ等の還元剤を用いて還元して、（Ｓ）−２−（１−（４−アミノ−３−（３−アミノ−４−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル）エチル）−５−フルオロ−３−（３−フルオロフェニル）−４Ｈ−クロメン−４−オン（中間体４）を得るステップと、

（ｃ）中間体４をメタンスルホニルクロリドで処理して、式（Ａ１）の所望の化合物を得るステップと、
（ｄ）任意に、化合物（Ａ１）を、その薬学的に許容可能な塩またはそのプロドラッグに変換するステップと、を含む。

なお別の実施形態は、（Ｓ）−２−（１−（４−アミノ−３−（４−メトキシ−３−ニトロフェニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル）エチル）−５−フルオロ−３−（３−フルオロフェニル）−４Ｈ−クロメン−４−オン，（Ｓ）−２−（１−（４−アミノ−３−（３−アミノ−４−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル）エチル）−５−フルオロ−３−（３−フルオロフェニル）−４Ｈ−クロメン−４−オン、及びその塩等の本発明の化合物を調製するために有用な中間体である。

本発明のなお別の実施形態は、患者においてＰＩ３Ｋδ及びＰＩ３Ｋγを阻害する方法であって、患者に有効量の少なくとも１つの本発明の化合物を投与することを含む、方法である。

本発明のなお別の実施形態は、患者においてＰＩ３Ｋδを阻害する方法であって、患者に、有効量の（Ｒ）−Ｎ−（５−（４−アミノ−１−（１−（５−フルオロ−３−（３−フルオロフェニル）−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−２−イル）エチル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）−２−メトキシフェニル）メタンスルホンアミド（化合物Ａ２）、その薬学的に許容可能な塩、またはそのプロドラッグのうちの少なくとも１つを投与することを含む、方法である。

本発明のなお別の実施形態は、患者においてＰＩ３Ｋタンパク質キナーゼ媒介疾患、障害、または病態（増殖性疾患もしくは障害、例えば、癌等）を治療、予防、及び／または阻害する方法であって、患者に有効量の本発明の少なくとも１つの化合物を投与することを含む、方法である。

本発明のなお別の実施形態は、患者においてＰＩ３Ｋ、特に、ＰＩ３Ｋδ及びＰＩ３Ｋγを阻害する方法であって、患者に有効量の本発明の少なくとも１つの化合物を投与することを含む、方法である。

本発明のなお別の実施形態は、タンパク質キナーゼ（ＰＩ３Ｋδ及びＰＩ３Ｋγ等）の調節を介して、炎症性、自己免疫、または増殖性疾患を治療する方法であって、かかる治療を必要とする患者に、有効量の本発明の少なくとも１つの化合物を投与することを含む、方法である。一実施形態において、本発明の化合物は、ＰＩ３Ｋδ及びＰＩ３Ｋγの両方を阻害する。

本発明のなお別の実施形態は、かかる治療を必要とする患者に、有効量の本発明の少なくとも１つの化合物を、（同時もしくは連続的に）少なくとも１つ他の抗炎症剤、免疫調節剤、もしくは抗癌剤、またはこれらの組み合わせを投与することによって、タンパク質キナーゼ（ＰＩ３Ｋδ及びＰＩ３Ｋγ等）の調節を介して、炎症性、自己免疫、または増殖性疾患を治療する方法である。一実施形態において、本発明の化合物は、ＰＩ３Ｋδ及びＰＩ３Ｋγの両方を阻害する。

本発明の化合物は、
膀胱癌腫、乳癌腫、結腸癌腫、腎臓癌腫、肝臓癌腫、小細胞肺癌を含む肺癌腫、食道癌腫、胆嚢癌腫、卵巣癌腫、膵臓癌腫、胃癌腫、子宮頸癌腫、甲状腺癌腫、前立腺癌腫、及び扁平上皮細胞癌を含む皮膚癌腫、を含むが、これに限定されない癌腫；
白血病、急性リンパ球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、有毛細胞リンパ腫、及びバーキットリンパ腫を含むが、これに限定されないリンパ球系統の造血性腫瘍；
急性及び慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、及び前骨髄球性白血病を含むが、これに限定されない骨髄系統の造血性腫瘍；
線維肉腫及び横紋筋肉腫を含むが、これに限定されない間葉起源の腫瘍；
星状細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、及び神経鞘腫を含むが、これに限定されない中央及び抹消神経系の腫瘍；ならびに
黒色腫、精上皮腫、奇形癌、骨肉腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、甲状腺濾胞癌、及びカポジ肉腫を含むが、これに限定されない他の腫瘍、を含むが、これに限定されない様々な癌の治療において有用である。

一実施形態において、有効量の本発明の化合物は、白血病、急性リンパ球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、有毛細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、急性及び慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、または前骨髄球性白血病を治療するために投与される。

一般的に、細胞増殖の制御におけるタンパク質キナーゼの重要な役割により、本発明の化合物は、可逆的細胞増殖抑制剤として作用し得、したがって、例えば、前立腺肥大症、家族性大腸腺腫症、神経線維腫症、アテローム性動脈硬化症、肺線維症、関節炎、乾癬、糸球体腎炎、血管形成または血管手術後の再狭窄、肥厚性瘢痕形成、炎症性腸疾患、移植片拒絶、内毒素ショック、及び真菌感染症等の異常な細胞増殖を特徴とする任意の疾患プロセスの治療において有用であり得る。

アポトーシスの調節剤としての本発明の化合物は、（本明細書に上述の型を含むが、これに限定されない）癌、（ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、エプスタイン−バーウイルス、シンドビスウイルス、及びアデノウイルスを含むが、これに限定されない）ウイルス性感染症、（全身性ループス、エリテマトーデス、自己免疫媒介糸球体腎炎、リウマチ性関節炎、乾癬、炎症性腸疾患、及び自己免疫真性糖尿病を含むが、これに限定されない）自己免疫疾患、（アルツハイマー病、ＡＩＤＳ関連認知症、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、網膜色素変性、脊髄性筋萎縮症、及び小脳変性症を含むが、これに限定されない）神経変性障害、骨髄異形成症候群、再生不良性貧血、心筋梗塞、脳卒中、及び再灌流損傷に関連する虚血損傷、不整脈、アテローム性動脈硬化症、毒素誘導またはアルコール関連肝臓疾患、（慢性貧血及び再生不良性貧血を含むが、これに限定されない）血液病、（骨粗鬆症及び関節炎を含むが、これに限定されない）筋骨格系の変性疾患、アスピリン敏感副鼻腔炎、嚢胞性線維症、多発性硬化症、腎臓疾患、ならびに癌性疼痛の治療において有用である。本発明の化合物はまた、ＨＩＶに感染した個体におけるＡＩＤＳ発症の予防、阻害、または抑制において有用である。

本発明の化合物は、細胞ＲＮＡ及びＤＮＡ合成のレベルを調節し得る。したがって、本発明の化合物は、ＨＩＶ、ヒトパピローマウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、エプスタイン−バーウイル、スシンドビスウイルス、及びアデノウイルスを含むが、これに限定されない、ウイルス性感染症の治療において有用である。

本発明の化合物は、癌の化学予防において有用である。化学予防は、開始する変異原性事象を遮断すること、あるいは、既に侵襲を患っている前悪性細胞の進行を遮断すること、または腫瘍再発を阻害することのいずれかによって、浸潤性癌の発達を阻害することとして、本明細書において定義される。本発明の化合物はまた、腫瘍の血管形成及び転移の阻害において有用である。本発明の一実施形態は、有効量の本発明の１つ以上の化合物を投与することによって、それを必要とする患者において、腫瘍の血管形成または転移を阻害する方法である。

本発明の別の実施形態は、免疫系関連疾患または免疫障害（例えば、自己免疫疾患）、炎症を伴う疾患または障害（例えば、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、リウマチ性関節炎、炎症性腸疾患、糸球体腎炎、神経炎症性疾患、多発性硬化症、ブドウ膜炎、及び免疫系の障害）、癌または他の増殖性疾患、肝臓疾患または障害、腎臓疾患または障害を治療する方法である。本方法は、有効量の本発明の１つ以上の化合物を投与することを含む。

免疫障害の例は、乾癬、リウマチ性関節炎、脈管炎、炎症性腸疾患、皮膚炎、骨関節炎、喘息、炎症性筋肉疾患、アレルギー性鼻炎、腟炎、間質性膀胱炎、強皮症、骨粗鬆症、湿疹、同種または異種移植片（器官、骨髄、幹細胞、ならびに他の細胞及び組織）拒絶、移植片対宿主病、ループスエリテマトーデス、炎症性疾患、Ｉ型糖尿病、肺線維症、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、甲状腺炎（例えば、橋本甲状腺炎及び自己免疫甲状腺炎）、重症筋無力症、自己免疫溶血性貧血、多発性硬化症、嚢胞性線維症、慢性再発肝炎、原発性胆汁性肝硬変、アレルギー性結膜炎ならびにアトピー性皮膚炎を含むが、これに限定されない。

一実施形態において、本明細書において説明される化合物は、移植片拒絶、同種または異種移植片拒絶（器官、骨髄、幹細胞、ならびに他の細胞及び組織）、及び移植片対宿生疾患を予防するための免疫抑制剤として有用である。１つの特定の実施形態において、移植片拒絶は、組織または器官移植に起因する。更なる実施形態において、移植片対宿主疾患は、骨髄または幹細胞移植に起因する。一実施形態は、移植片拒絶、同種もしくは異種移植片拒絶（器官、骨髄、幹細胞、他の細胞及び組織）、または移植片対宿生疾患のリスクを予防または減少させる方法であって、有効量の本発明の１つ以上の化合物を投与することを含む、方法である。

本発明の化合物はまた、放射線治療法等の既知の抗癌治療、あるいは、例えば、シスプラチンまたはドキソルビシン等のＤＮＡ相互作用剤；エトポシド等のトポイソメラーゼＩＩ阻害剤；ＣＰＴ−１１またはトポテカン等のトポイソメラーゼＩ阻害剤；天然に存在する、または合成のいずれかのパクリタキセル、ドセタキセル、またはエポチロン（例えば、イクサベピロン）等のチューブリン相互作用剤；タモキシフェン等のホルモン剤；５−フルオロウラシル等のチミジル酸合成酵素阻害剤；メトトレキサート等の代謝拮抗薬、ならびにイレッサ及びＯＳＩ−７７４等の他のチロシンキナーゼ阻害剤；血管形成阻害剤；ＥＧＦ阻害剤；ＶＥＧＦ阻害剤；ＣＤＫ阻害剤；ＳＲＣ阻害剤；ｃ−ｋｉｔ阻害剤；Ｈｅｒ１／２阻害剤；及びアービタックス（ＥＧＦ）及びハーセプチン（Ｈｅｒ２）；イブルチニブ等のＢＴＫ阻害剤；ならびに他のタンパク質キナーゼ調節剤、ならびにこれらの任意の組み合わせ等の、細胞増殖抑制剤または細胞毒性剤または抗癌剤との組み合わせ（ともにまたは連続的に投与される）において有用である。

本発明の化合物はまた、本発明の化合物はまた、１つ以上のステロイド性抗炎症性薬物、非ステロイド性抗炎症性薬物（ＮＳＡＩＤ）、及び免疫選択的抗炎症性誘導体（ＩｍＳＡＩＤ）、及びこれらの任意の組み合わせとの組み合わせ（ともにまたは連続的に投与される）において有用である。

本発明は、本発明の１つ以上の化合物と、薬学的に許容可能な担体と、を含む、薬学的組成物を更に提供する。薬学的組成物は、他の抗癌剤等の、上記に特定される活性成分のうちの１つ以上を更に含み得る。

なお別の実施形態は、治療有効量の本発明の化合物を投与することを含む、それを必要とする患者において白血病を治療する方法である。一実施形態において、白血病は、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、及び緩徐進行性非ホジキンリンパ腫（Ｉ−ＮＨＬ）から選択される。

本発明のなお別の実施形態は、治療有効量の化合物を投与することを含む、それを必要とする患者において自己免疫障害を治療する方法である。一実施形態において、自己免疫障害は、喘息、ＣＯＰＤ、リウマチ性関節炎、乾癬、ループス、及び実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）から選択される。

本発明のなお別の実施形態は、患者に、治療有効量の化合物を投与することを含む、それを必要とする患者においてアレルギー性鼻炎を治療する方法である。

前述の方法のうちのいずれかにおいて、本発明の化合物（複数を含む）及び任意の追加の活性剤は、本明細書において説明されるような薬学的組成物の形態で投与することができる。

アッセイ７に説明されるリポ多糖誘導肺好中球増加症モデルに従う、１０ｍｇ／ｋｇの化合物Ａ１（経口）で処理した雌のウィスターラットからの、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）中の好中球数の棒グラフを描写する。 アッセイ８に説明されるリポ多糖誘導ラット空気嚢炎症モデルに従う、１、３、及び１０ｍｇ／ｋｇの化合物Ａ１（経口）で処理したウィスターラットからの、腹膜洗浄液中の好中球数の棒グラフを描写する。 アッセイ１１の手順に従って、対照、または１０ｍｇ／ｋｇ／ＱＤの化合物Ａ１で処理したコラーゲン誘導関節炎を有するウィスターラットにおける、それぞれ、後及び前肢に対する個々の臨床スコア、ならびに臨床スコアに対するＡＵＣの線及び棒グラフを描写する。 アッセイ１１の手順に従って、対照、または１０ｍｇ／ｋｇ／ＱＤの化合物Ａ１で処理したコラーゲン誘導関節炎を有するウィスターラットにおける、それぞれ、後及び前肢に対する個々の臨床スコア、ならびに臨床スコアに対するＡＵＣの線及び棒グラフを描写する。 アッセイ１１の手順に従って、ビヒクル、または１０ｍｇ／ｋｇ／ＱＤの化合物Ａ１で処理したコラーゲン誘導関節炎を有するウィスターラットにおける、それぞれ、後及び前肢に対する個々の臨床スコアの線及び棒グラフを描写する。 アッセイ１１の手順に従って、ビヒクル、または１０ｍｇ／ｋｇ／ＱＤの化合物Ａ１で処理したコラーゲン誘導関節炎を有するウィスターラットにおける、それぞれ、後及び前肢に対する個々の臨床スコアの線及び棒グラフを描写する。 アッセイ１１の手順に従って、ビヒクル、または１０ｍｇ／ｋｇ／ＱＤの化合物Ａ１で処理したコラーゲン誘導関節炎を有するウィスターラットにおける、それぞれ、後肢に対する体積及び肢体積のＡＵＣの線及び棒グラフを描写する。 アッセイ１１の手順に従って、ビヒクル、または１０ｍｇ／ｋｇ／ＱＤの化合物Ａ１で処理したコラーゲン誘導関節炎を有するウィスターラットにおける、それぞれ、後肢に対する体積及び肢体積のＡＵＣの線及び棒グラフを描写する。 アッセイ１１の手順に従って、ビヒクル、または１０ｍｇ／ｋｇ／ＱＤの化合物Ａ１で処理したコラーゲン誘導関節炎を有するウィスターラットにおける、それぞれ、後肢に対する足首直径及び足首直径のＡＵＣの線及び棒グラフを描写する。 アッセイ１１の手順に従って、ビヒクル、または１０ｍｇ／ｋｇ／ＱＤの化合物Ａ１で処理したコラーゲン誘導関節炎を有するウィスターラットにおける、それぞれ、後肢に対する足首直径及び足首直径のＡＵＣの線及び棒グラフを描写する。 アッセイ１１の手順に従って、ビヒクル、または１０ｍｇ／ｋｇ／ＱＤの化合物Ａ１で処理したコラーゲン誘導関節炎を有するウィスターラットにおける、後及び前肢の全ての、それぞれ、炎症、軟骨、及びパンヌスの阻害に関する組織病理学的スコアの棒グラフを描写する。 アッセイ１１の手順に従って、ビヒクル、または１０ｍｇ／ｋｇ／ＱＤの化合物Ａ１で処理したコラーゲン誘導関節炎を有するウィスターラットにおける、後及び前肢の全ての、それぞれ、炎症、軟骨、及びパンヌスの阻害に関する組織病理学的スコアの棒グラフを描写する。 アッセイ１１の手順に従って、ビヒクル、または１０ｍｇ／ｋｇ／ＱＤの化合物Ａ１で処理したコラーゲン誘導関節炎を有するウィスターラットにおける、後及び前肢の全ての、それぞれ、炎症、軟骨、及びパンヌスの阻害に関する組織病理学的スコアの棒グラフを描写する。 アッセイ１１の手順に従って、ビヒクル、または１０ｍｇ／ｋｇ／ＱＤの化合物Ａ１で処理したコラーゲン誘導関節炎を有するウィスターラットにおける、後及び前肢の全ての全組織病理学的スコアの棒グラフを描写する。 アッセイ１１の手順に従って、ビヒクル、または１０ｍｇ／ｋｇ／ＱＤの化合物Ａ１で処理したコラーゲン誘導関節炎を有するウィスターラットにおける、関節炎の発症割合（％）の棒グラフを描写する。 アッセイ１３の手順に従って、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるイミキモド誘導乾癬への化合物Ａ１（３、１０、３０ｍｇ／ｋｇ）の抗乾癬（ａｎｔｉｐｓｏｒａｔｉｃ）効果を示す棒グラフを描写する。 アッセイ１３の手順に従って、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるイミキモド誘導乾癬への化合物Ａ１（３、１０、３０ｍｇ／ｋｇ）の抗乾癬（ａｎｔｉｐｓｏｒａｔｉｃ）効果を示す棒グラフを描写する。

本明細書で使用される際、別途示されない限り以下の定義が適用されるものとする。更に、本明細書に定義される基のうちの多くは、任意に置換され得る。本定義における置換基の一覧表は例示的なものであり、本明細書の他で定義される置換基を限定すると解釈されるべきではない。

本明細書に説明される特定の化合物は、１つ以上の不斉中心を含み、したがってエナンチオマー、ジアステレオマー、及び絶対立体化学の観点で（Ｒ）−または（Ｓ）−と定義され得る他の立体異性形態を生じさせ得る。別途指定されない限り、本化学実体、薬学的組成物、及び方法は、ラセミ混合物、任意で純粋形態及び中間体混合物を含む、全てのそのような可能性のある異性体を含むことが意図される。例えば、中間体混合物の非限定な例は、１０：９０、１３：８７、１７：８３、２０：８０、または２２：７８の割合のＲ：ＳまたはＳ：Ｒ異性体の混合物を含む。光学活性（Ｒ）−及び（Ｓ）−異性体は、キラル合成素子またはキラル試薬を使用して調製され得、または従来技術を使用して分離され得る。本明細書に説明される化合物が、オレフィン性二重結合または他の幾何的不斉の中心を含有するとき、かつ別途指定されない限り、化合物がＥ及びＺ幾何的異性体の両方を含むことが意図される。

「互変異性体（ｔａｕｔｏｍｅｒ）」という用語は、平衡での異性体形態の相対的に容易な相互変換を特徴とする化合物を指す。これらの異性体は、本発明によって網羅されることが意図される。「互変異性体（ｔａｕｔｏｍｅｒ）」は、互変異性化によって相互変換する構造的に異なる異性体である。「互変異性化（ｔａｕｔｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）」は、異性体化の形態であり、酸塩基化学のサブセットであると見なされるプロトトロピーまたはプロトン移動互変異性化を含む。「プロトトロピー互変異性化（ｐｒｏｔｏｔｒｏｐｉｃ ｔａｕｔｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）」または「プロトン移動互変異性化（ｐｒｏｔｏｎ−ｓｈｉｆｔ ｔａｕｔｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）」は、結合次数の変化、しばしば単結合の隣接する二重結合との相互交換を伴うプロトンの遊走を伴う。互変異性化が可能である場合（例えば、溶液中）、互変異性体の化学平衡が達成され得る。互変異性体化の例は、ケト−エノール互変異性化である。ケト−エノール互変異性化の具体的な例は、ペンタン−２，４−ジオン及び４−ヒドロキシペント−３−エン−２−オン互変異性体の相互変換である。互変異性化の別の例は、フェノール−ケト互変異性化である。フェノール−ケト互変異性化の具体的な例は、ピリジン−４−オール及びピリジン−４（１Ｈ）−オン互変異性体の相互変換である。

「プロドラッグ（ｐｒｏｄｒｕｇ）」という用語は、正常な代謝性プロセスによって体内でその活性形態に変換される化合物の不活性前駆体である化合物を指す。プロドラッグの設計は、Ｈａｒｄｍａ，ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｓ．），Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，９ｔｈ ｅｄ．，ｐｐ．１１−１６（１９９６）において概述される。完全な考察は、Ｈｉｇｕｃｈｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｄｒｕｇｓ ａｓ Ｎｏｖｅｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｖｏｌ．１４，ＡＳＣＤ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ、及びＲｏｃｈｅ（ｅｄ．），Ｂｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ（１９８７）に提供される。例解すると、プロドラッグは、例えば、エステルまたはアミド連鎖の加水分解により、得られた生成物上に官能基を導入または曝露することを通して、薬理的に活性な形態に変換され得る。プロドラッグは、内因性化合物と反応して、化合物の薬理的特性、例えば、増大した循環半減期を更に強化する水溶性接合体を形成するように設計され得る。代替的に、プロドラッグは、例えば、グルクロン酸、硫酸、グルタチオン、アミノ酸、または酢酸を有する官能基上での共有結合的修飾を受けるように設計され得る。得られた共役体は、尿中に非活性化及び排出され得る、または親化合物より強力になり得る。高分子量共役体はまた、胆汁中に排出され、酵素切断に供され、循環中に再放出され得、これにより最初に投与された化合物の生物学的半減期を効果的に増大させる。

「エステル（ｅｓｔｅｒ）」という用語は、酸とアルコールとの間の水の排除を有する反応によって形成される化合物を指す。エステルは、一般式ＲＣＯＯＲ’（式中、Ｒは薬物であり、Ｒ’は化学基である）によって表され得る。

これらのプロドラッグ及びエステルは、本発明の範囲内に網羅されることが意図される。

更に、本発明はまた、例えば、水素の重水素またはトリチウムとの置換、あるいは炭素の^１３Ｃまたは^１４Ｃ濃縮炭素による置換等の、１つ以上の同位体濃縮原子の存在においてのみ異なる化合物を含む。

本発明の化合物はまた、そのような化合物を構成する１つ以上の原子で非天然の比率の原子同位体を含有し得る。例えば、化合物は、例えば、トリチウム（^３Ｈ）、ヨウ素１２５（^１２５Ｉ）、または炭素１４（^１４Ｃ）等の放出性同位体で放出性標識され得る。放出性であるか、そうでないかに関わらず、本発明の化合物の全ての同位体の変種は、本発明の範囲内に包含される。

本発明の一部を形成する薬学的に許容可能な塩は、Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｃａ、Ｍｇ、Ｆｅ、Ｃｕ、Ｚｎ、及びＭｎ等の無機基に由来する塩；Ｎ，Ｎ’−ジアセチルエチレンジアミン、グルカミン、トリエチルアミン、コリン、水酸化物、ジシクロヘキシルアミン、メトホルミン、ベンジルアミン、トリアルキルアミン、及びチアミン等の機基の塩；アルキルフェニルアミン、グリシノール、フェニルグリシノール等のキラル基；グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、チロシン、シスチン、システイン、メチオニン、プロリン、ヒドロキシプロリン、ヒスチジン、オミチン、リジン、アルギニン、及びセリン等の天然アミノ酸の塩；Ｍｅｌ及び（Ｍｅ）_２ＳＯ_４等のハロゲン化アルキル、硫酸アルキルを有する本発明の化合物の四級アンモニウム塩；Ｄ異性体または置換アミノ酸等の非天然アミノ酸；グアニジン；ならびに置換基が、ニトロ、アミノ、アルキル、アルケニル、アンモニウム、または置換アンモニウム塩及アルミニウム塩から選択される、置換グアニジンを含む。塩は、適切な場合、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、過塩素酸塩、ホウ酸塩、ハロゲン化水素酸塩、酢酸塩、酒石酸塩、マレイン酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、パルモ酸塩、メタンスルホン酸塩、安息香酸塩、サリチル酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、アスコルビン酸塩、グリセロリン酸塩、及びケトグルタル酸塩であり得る酸付加塩を含み得る。

分子量等の物理的特性、または化学式等の化学的特性について本明細書で範囲が使用される場合、その中の範囲及び特定の実施形態の全ての組み合わせ及び部分的組み合わせが含まれることが意図される。数または数の範囲に言及する場合の「約（ａｂｏｕｔ）」という用語は、言及される数または数の範囲が、実験のばらつき内（または統計的な実験誤差内）の近似値であり、したがって、数または数の範囲が、例えば、記載される数または数の範囲の１％〜１５％変動し得ることを意味する。「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語（及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「有している（ｈａｖｉｎｇ）」または「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」等の関連する用語）は、説明される特徴から「なる」または「本質的になる」実施形態、例えば、任意の組成物、組成、方法、またはプロセス等の実施形態を含む。

以下の略語及び用語は、本明細書を通して示された意味を有する：ＰＩ３−Ｋ＝ホスホイノシチド３−キナーゼ、ＰＩ＝ホスファチジルイノシトール、ＡＩＤＳ＝後天性免疫不全症候群、ＨＩＶ＝ヒト免疫不全ウイルス、ＭｅＩ＝ヨウ化メチル、ＮＤ：判定せず。

本明細書で使用される略語は、化学及び生物学分野内でのそれらの従来の意味を有するものとする。

「細胞増殖（ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）」という用語は、分裂の結果として細胞数が変化する現象を指す。この用語はまた、増殖シグナルと一致して、それによって細胞形態が変化している（例えば、サイズにおいて増大している）細胞増殖を包含する。

本明細書で使用される場合、「同時投与（ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」、「との組み合わせで投与される（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ）」という用語、及びそれらの文法的等価物は、薬剤及び／またはそれらの代謝物の両方が同時に動物内に存在するための、２つ以上の薬剤の動物に対する投与を包含する。同時投与は、別個の組成物における同時投与、別個の組成物における異なる時間の投与、または両方の薬剤が存在する組成物における投与を含む。

「有効量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」または「治療有効量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」という用語は、後に定義されるような疾患の治療に限定されないが、疾患の治療を含む意図する用途を達成するのに十分な、本明細書に説明される化合物の量を指す。治療有効量は、意図する用途（インビトロもしくはインビボ）、または治療を受ける対象及び病態、例えば、対象の体重及び年齢、病態の重症度、及び投与様式等に応じて変化してもよく、それは当業者によって容易に判定され得る。またこの用語は、標的細胞における特定の反応、例えば、血小板粘着及び／または細胞遊走の低減を誘導する用量にも適用される。特定の用量は、選択される具体的な化合物、従うべき投与計画、他の化合物と併用投与されるかどうか、投与のタイミング、投与される組織、及び運ばれる物理的な送達系に応じて変化する。

本明細書で使用される場合、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、または「寛解する（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｎｇ）」は、同義的に使用される。これらの用語は、治療的有用性及び／または予防的有用性を含むが、これに限定されない、有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチを指す。治療的有用性とは、治療される基礎疾患の根絶または寛解を意味する。また、治療的有用性は、基礎疾患に関連する生理的症状のうちの１つ以上の根絶または寛解によって得られるため、患者が依然として基礎疾患に苦しめられている場合でも、その患者において改善が観察される。予防的有用性の場合、たとえこの疾患の診断が下されていない場合であっても、特定の疾患を発症するリスクのある患者、または疾患の生理的症状のうちの１つ以上を報告する患者に、組成物を投与することができる。

本明細書で使用される場合の「治療効果（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔ）」は、前述の治療的有用性及び／または予防的有用性を包含する。予防効果は、疾患もしくは状態の出現を遅延させるもしくは排除すること、疾患もしくは状態の症状の発現を遅延させるもしくは排除すること、疾患もしくは状態の進行を遅らせる、停止する、もしくは逆転させること、またはこれらの任意の組み合わせを含む。

「対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）」または「患者（ｐａｔｉｅｎｔ）」という用語は、哺乳類等の動物（例えば、イヌ、ネコ、ウマ、またはブタ）、例えば、ヒトを指す。本明細書に説明される方法は、ヒトの治療用途及び獣医学的用途の両方において有用であり得る。一部の実施形態において、患者は、哺乳類である。好ましい実施形態において、患者は、ヒトである。

「放射線治療法（ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ）」とは、当業者に既知である通例の方法及び組成物を使用して、アルファ粒子放出放射性核種（例えば、アクチニウム及びトリウム放射性核種）、低線エネルギー付与（ＬＥＴ）放射線放出体（すなわち、ベータ放出体）等の放射線放出体、変換電子放出体（例えば、ストロンチウム８９及びサマリウム１５３−ＥＤＴＭＰ）、またはＸ線、ガンマ線、及び中性子を無制限に含む高エネルギー放射線に患者を暴露することを意味する。

「シグナル伝達（ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）」は、細胞内反応を誘発するために、刺激的または阻害的シグナルが細胞の中へ、及び細胞内で伝達される間のプロセスである。シグナル伝達経路の調節剤は、同一の特定のシグナル伝達経路にマッピングされる１つ以上の細胞タンパク質の活性を調節する化合物を指す。調節剤は、シグナル伝達分子の活性を増強（作用薬）または抑制（拮抗薬）し得る。

生物学的に活性な薬剤に対して適用される「選択的阻害（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）」または「選択的に阻害する（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔ）」という用語は、標的との直接的または間接的な相互作用を介して、非特異的なシグナル伝達活性と比較して標的シグナル伝達活性を選択的に低減させる薬剤の能力を指す。

「薬学的に許容可能な担体（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ ｃａｒｒｉｅｒ）」または「薬学的に許容可能な賦形剤（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）」という用語は、任意の及び全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張及び吸収遅延剤、１つ以上の好適な希釈剤、充填剤、塩、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、流動促進剤、湿潤剤、制御放出マトリックス、着色剤／香味剤、担体、賦形剤、緩衝剤、安定剤、可溶化剤、及びこれらの組み合わせを含むが、これに限定されない。あらゆる従来の培地または薬剤が活性成分と適合しない場合を除いて、本発明の治療組成物におけるその使用が企図される。補足的活性成分はまた、本組成物中に組み込まれ得る。

他の実施形態において、本発明の化合物は、インビトロキナーゼアッセイにおいて測定される、約１００ｎＭ以下、約５０ｎＭ以下、約１０ｎＭ以下、約５ｎＭ以下、約１００ｐＭ以下、約１０ｐＭ以下、または約１ｐＭ以下のＩＣ_５０値を有するＩ型またはクラスＩホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３キナーゼ）の１つ以上のメンバーを選択的に阻害する。

なお別のにおいて、Ｉ型ＰＩ３−キナーゼのうちの１つ以上のメンバーを選択的に阻害する阻害剤、または１つ以上のＩ型ＰＩ３−キナーゼ媒介シグナル伝達経路を選択的に阻害する阻害剤は、代替的に、残りの他のＩ型ＰＩ３−キナーゼに関する、阻害剤のＩＣ_５０より少なくとも１０倍低い、少なくとも２０倍低い、少なくとも５０倍低い、少なくとも１００倍低い、少なくとも１０００倍低い、所与のＩ型ＰＩ３−キナーゼに関して５０％の阻害濃度（ＩＣ_５０）を呈する化合物を指すと理解され得る。

本明細書で使用される際、「二重ＰＩ３−キナーゼδ／γ阻害剤（ｄｕａｌ ＰＩ３−ｋｉｎａｓｅ δ／γ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）」及び「二重ＰＩ３−キナーゼδ／γ選択的阻害剤（ｄｕａｌ ＰＩ３−ｋｉｎａｓｅ δ／γ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）」という用語は、ＰＩ３キナーゼδ及びγアイソザイムの両方の活性をＰＩ３Ｋファミリーの他のアイソザイムよりも効果的に阻害する化合物を指す。したがって、二重ＰＩ３−キナーゼδ／γ阻害剤は、非選択的ＰＩ３Ｋ阻害剤であるＣＡＬ−１３０、ワートマニン、及びＬＹ２９４００２等の従来のＰＩ３Ｋ阻害剤よりもＰＩ３−キナーゼδ及びγに対してより選択的である。

ＰＩ３−キナーゼδ及びγの阻害は、種々の病態、例えば、自己免疫疾患、アレルギー性疾患、及び関節炎疾患を含むが、これに限定されない炎症反応を特徴とする病態の治療において、治療的に有用であり得る。重要なことに、ＰＩ３−キナーゼδ及びγ機能の阻害は、生存能及び受精能等の生物学的機能に影響を及ぼさないようである。

「炎症反応（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）」は、本明細書で使用される場合、赤み、熱、腫脹、及び疼痛（すなわち、炎症）を特徴とし、典型的には組織損傷または組織破壊を伴う。炎症反応は、通常、組織の損傷または破壊によって誘発される局所的な防御反応であり、傷害性物質及び損傷組織の両方を破壊するか、希釈するか、または囲む（隔絶する）役割を果たす。炎症反応は、とりわけ、白血球の流入及び／または白血球（例えば、好中球）の走化性の流入に関連している。炎症反応は、病原体及びウイルスによる感染、心筋梗塞または脳卒中後の外傷または再灌流等の非感染性手段、外来抗原に対する免疫応答、ならびに自己免疫疾患等に起因し得る。本発明による方法及び化合物を用いた治療に適した炎症反応は、特定の防御システムの反応に関連する状態だけでなく、非特定の防御システムの反応に関連する状態も包含する。

本発明の治療方法は、炎症性細胞の活性化に関連する病態の寛解のための方法を含む。「炎症性細胞の活性化（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）」は、増殖細胞応答の刺激（サイトカイン、抗原、もしくは自己抗体を含むが、これに限定されない）、可溶性メディエーター（サイトカイン、酸素ラジカル、酵素、プロスタノイド、もしくは血管作動性アミンを含むが、これに限定されない）の産生、または炎症細胞（単球、マクロファージ、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、顆粒球（好中球、好塩基球、及び好酸球を含む多形核白血球）、マスト細胞、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、及び内皮細胞を含むが、これに限定されない）中の新しいまたは数の増加したメディエーター（主要組織適合抗原もしくは細胞接着分子を含むが、これに限定されない）の細胞表面発現による誘導を指す。当業者は、これらの細胞におけるこれらの表現型のうちの１つまたは組み合わせの活性化が、炎症性病態の開始、永続化、または増悪に寄与し得ることを理解するであろう。

「自己免疫疾患（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅ）」は、本明細書で使用される際、組織損傷が体自身の成分に対する液性反応または細胞媒介反応と関連する障害の任意の群を指す。

「移植拒絶（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ）」は、本明細書で使用される場合、移植された細胞（移植された組織及び周囲の組織の機能の喪失、疼痛、腫、白血球増加症、及び血小板減少症を特徴とする器官または細胞（例えば、骨髄）を含む）に対して向けられるあらゆる免疫反応を指す。

「アレルギー性疾患（ａｌｌｅｒｇｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ）」は、本明細書で使用される場合、アレルギーに起因するあらゆる症状、組織損傷、または組織機能の喪失を指す。

「関節炎疾患（ａｒｔｈｒｉｔｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ）」は、本明細書で使用される場合、様々な病因に起因する関節の炎症性病変を特徴とするあらゆる疾患を指す。

「皮膚炎（ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）」は、本明細書で使用される場合、様々な病因に起因する皮膚の炎症を特徴とする大きな一群の皮膚疾患のいずれかを一般的に指す。

先で説明したように、「二重ＰＩ３−キナーゼδ／γ選択的阻害剤（ｄｕａｌ ＰＩ３−ｋｉｎａｓｅ δ／γ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）」という用語は、ＰＩ３−キナーゼδ及びγアイソザイムの活性をＰＩ３Ｋファミリーの他のアイソザイムよりも効果的に阻害する化合物を一般的に指す。酵素活性（または他の生物学的活性）の阻害剤としての化合物の相対的有効性は、各化合物が活性を所定の程度まで阻害する濃度を判定し、結果を比較することによって確立され得る。典型的に、好ましい判定は、生化学的アッセイにおいて活性の５０％を阻害する濃度、すなわち、５０％の阻害濃度、または「ＩＣ_５０」である。ＩＣ_５０判定は、当該技術分野において既知である従来の技術を使用して達成され得る。一般的に、ＩＣ_５０は、様々な濃度の研究下の阻害剤の存在下で、所与の酵素の活性を測定することによって判定され得る。次いで、酵素活性の実験的に得られた値を、使用された阻害剤濃度に対してプロットする。（いかなる阻害剤も不在下での活性と比較して）５０％の酵素活性を示す阻害剤の濃度を、ＩＣ_５０値として取る。類似して、他の阻害濃度は、活性の適切な判定を通して定義され得る。例えば、いくつかの設定において、９０％の阻害濃度、すなわち、ＩＣ_９０を確立すること等が望ましくあり得る。

したがって、二重ＰＩ３−キナーゼδ／γ選択的阻害剤は、代替的に他のクラスＩ ＰＩ３Ｋファミリーメンバーのうちのいずれかまたは全てに関するＩＣ_５０値よりも少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍低い、ＰＩ３−キナーゼδ及びγに関する５０％の阻害濃度（ＩＣ_５０）を呈する化合物を指すと理解され得る。本発明の代替的な実施形態において、二重ＰＩ３−キナーゼδ／γ選択的阻害剤という用語は、ＰＩ３ＫクラスＩファミリーメンバーのうちのいずれかまたは全てに関するＩＣ_５０よりも少なくとも３０倍低い、少なくとも５０倍低い、少なくとも１００倍低い、少なくとも２００倍低い、または少なくとも５００倍低い、ＰＩ３−キナーゼδ及びγに関するＩＣ_５０を呈する化合物を指すと理解され得る。二重ＰＩ３−キナーゼδ／γ選択的阻害剤は、上で説明されるように、ＰＩ３−キナーゼδ及びγ活性の両方を選択的に阻害する量で典型的に投与される。

ある実施形態において、本発明の化合物は、ほぼ等しく（約１：１）または１：５の最大割合で、ＰＩ３−キナーゼδ及びγ阻害を呈する。すなわち、本発明の化合物は、ＰＩ３−キナーゼδ及びγ酵素の両方についてほぼ等しいＩＣ_５０値を呈するか、または最大でも２つの間で３〜８倍の差を呈する。

本発明の方法は、インビボまたはエクスビボの細胞集合に適用され得る。「インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）」は、動物もしくはヒト内、または対象の体内等の、生きている個体内を意味する。この文脈において、本発明の方法は、個体内で治療的または予防的に使用され得る。「エクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）」または「インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）」は、生きている個体外を意味する。エクスビボ細胞集合の例は、個体から得られた液体または組織を含むが、これに限定されないインビトロ細胞培養及び生物学的試料を含む。かかる試料は、当該技術分野において既知である方法によって得られ得る。例示的な生物学的液体試料は、血液、脳脊髄液尿、及び唾液を含む。例示的な組織試料は、腫瘍及びその生検を含む。この文脈において、本発明は、治療的及び実験的目的を含む様々な目的のために使用され得る。例えば、本発明は、所与の兆候、細胞型、個体、及び他のパラメータのための、ＰＩ３−キナーゼδ選択的阻害剤の投与の最適な予定及び／または投薬を判定するために、エクスビボまたはインビトロで使用され得る。かかる使用から収集される情報は、実験的または診断的目的のために、あるいはインビボ治療のための手順を設定するために診療所において使用され得る。本発明が好適であり得る他のエクスビボでの使用は、以下に説明されるか、または当業者に明らかになるであろう。

本発明の化合物は、その各々がその全体として参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ ２０１１／０５５２１５号、第ＷＯ ２０１２／１５１５２５号、及び第ＷＯ ２０１３／１６４８０１号に説明されるもの等の、当該技術分野において既知である方法によって調製することができる。

薬学的組成物
本発明はまた、本発明の１つ以上の化合物と、１つ以上の薬学的に許容可能な担体または賦形剤と、を含む、薬学的組成物を提供する。一実施形態において、薬学的組成物は、治療有効量の本発明の１つ以上の化合物を含む。薬学的組成物は、本明細書に説明されるような１つ以上の追加の活性成分を含み得る。

薬学的担体及び／または賦形剤は、例えば、希釈剤、充填剤、塩、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、流動促進剤、湿潤剤、制御放出マトリックス、着色剤、香味剤、緩衝剤、安定剤、可溶化剤、及びそれらの組み合わせから選択され得る。

一実施形態において、本明細書において説明される薬学的組成物は、約１ｍｇ〜約１，０００ｍｇ、約２０ｍｇ〜約８００ｍｇ、約５０ｍｇ〜約６００ｍｇ、または約５０ｍｇ〜約６００ｍｇ等の約０．１ｍｇ〜約１，０００ｍｇの１つ以上の本発明の化合物を含有する。別の実施形態において、本明細書において説明される薬学的組成物は、約１００ｍｇ〜約４００ｍｇの１つ以上の本発明の化合物を含有する。

本発明の薬学的組成物は、単独で、または１つ以上の他の活性剤と組み合わせて投与され得る。所望される場合、対象化合物及び他の薬剤（複数を含む）は調製物内に混合され得るか、または両方の成分はそれらを組み合わせで別個に、もしくは同時に使用するために、別個の調製物内に製剤化され得る。

本発明の化合物及び薬学的組成物は、経口的に、鼻腔内に、局所的に（例えば、経皮的に）、十二指腸内に、非経口的に（静脈内に、動脈内に、筋肉内に、血管内に、腹腔内に、または注射もしくは注入によるものを含む）、皮内に、乳房内に、髄腔内に、眼内に、眼球後に、肺内に（例えば、エアロゾル化した薬物）、または皮下に（例えば、脾膜下、脳、または角膜内に埋め込まれた長期放出のためのデポー投与を含む）、舌下に、経肛門的に、経直腸的に、経膣的に、または外科的移植によって（例えば、脾膜下、脳、または角膜内に埋め込まれる）によって等、作用部位に化合物を送達することができる任意の経路によって投与され得る。

組成物は、固体、半固体、液体、もしくは気体の形態で投与することができるか、または凍結乾燥形態等の乾燥粉末として投与されてもよい。薬学的組成物は、例えば、カプセル剤、サシェ剤、カシェ剤、ゼラチン剤、シート剤、錠剤、坐剤、ペレット剤、丸剤、トローチ剤、及びロゼンジ剤等の個体剤形を含む、送達に都合のよい形態に充填することができる。包装のタイプは、一般的に、所望の投与経路に依存する。移植可能な徐放製剤、同様に経皮製剤もまた企図される。

治療の方法
投与される化合物の量は、治療される哺乳動物、障害または病態の重症度、投与速度、化合物の処分、及び処方する医師の裁量に依存する。しかしながら、有効用量は、単回用量または分割用量で、１日に体重１ｋｇ当たり約０．００１〜約１００ｍｇ、好ましくは約１〜約３５ｍｇ／ｋｇ／日の範囲内である。７０ｋｇのヒトにおいて、これは約０．０５〜約７ｇ／日、好ましくは約０．０５〜約２．５ｇ／日に達する。本発明の化合物の有効量は、単回用量または複数用量（例えば、１日２回または３回）で投与され得る。

本発明の化合物は、１つ以上の抗癌剤（例えば、化学療法剤）、治療抗体、及び放射線治療との組み合わせで使用され得る。

本発明の化合物は、脳脊髄炎、喘息、及び本明細書に説明される他の疾患等の炎症性病態の症状を軽減するように作用する他の薬剤との組み合わせで製剤化または投与され得る。これらの薬剤は、非ステロイド性抗炎症性薬物（ＮＳＡＩＤ）を含む。

以下に提供される実施例及び調製物は、本発明の化合物及びかかる化合物を調製する方法を更に例解及び例示する。本発明の範囲は、以下の実施例及び調製物の範囲によっていかようにも限定されないことが理解されるべきである。以下の実施例において、別途記述されない限り、単一キラル中心を有する分子はラセミ混合物として存在する。別途記述されない限り、２つ以上のキラル中心を有するこれらの分子はジアステレオマーのラセミ混合物として存在する。単一エナンチオマー／ジアステレオマーは、当該技術分野において既知の方法によって得られ得る。

本明細書において説明される中間体は、国際公開第ＷＯ １１／０５５２１５号及び第ＷＯ １２／１５１５２５号において説明される方法によって調製され得、これらの両方は、参照により本明細書に組み込まれる。

中間体１：Ｎ−（５−ブロモ−２−メトキシフェニル）メタンスルホンアミド：ジクロロメタン（１０ｍｌ）中の５−ブロモ−２−メトキシアニリン（１．００ｇ、４．９４ｍｍｏｌ）の溶液に、ピリジン（０．８００ｍｌ、９．８９ｍｍｏｌ）を添加し、０℃まで冷却した。メタンスルホニルクロリド（０．４０ｍｌ、５．１９ｍｍｏｌ）を添加し、３０分間撹拌した。反応混合物を水でクエンチし、酢酸エチルで抽出し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。粗生成物を酢酸エチル：石油エーテルでクロマトグラフにかけ、表題化合物を赤みがかった固体として得た（１．２０ｇ、８７％）。

中間体２：Ｎ−（２−メトキシ−５−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）フェニル）メタンスルホンアミド：酢酸カリウム（０．８４１ｇ、８．５７ｍｍｏｌ）及びビス（ピナコラート）ジボロン（１．１９０ｇ、４．７１ｍｍｏｌ）を、ジオキサン（１７．５ｍｌ）中の中間体１（１．２０ｇ、４．２８ｍｍｏｌ）の溶液に添加し、該溶液を、３０分間脱気した。［１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］ジクロロパラジウム（ＩＩ）。ＣＨ_２Ｃｌ_２（０．１０４ｇ、０．１２８ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下で添加し、８０℃まで加熱した。２時間後、反応混合物をシリカを通して濾過し、濃縮した。粗生成物を、酢酸エチル：石油エーテルでのカラムクロマトグラフィによって精製し、表題化合物を黄色固体として得た（１．００ｇ、７１％）。^１Ｈ−ＮＭＲ（δ ｐｐｍ，ＣＤＣｌ_３，４００ＭＨｚ）：７．９１（ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，１Ｈ），７．６２（ｄｄ，Ｊ＝８．１，１．２Ｈｚ，１Ｈ），６．９２（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），６．７３（ｓ，１Ｈ），３．９１（ｓ，３Ｈ），２．９８（ｓ，３Ｈ），１．３２（ｓ，１２Ｈ）．

中間体３：（Ｓ）−２−（１−（４−アミノ−３−（４−メトキシ−３−ニトロフェニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル）エチル）−５−フルオロ−３−（３−フルオロフェニル）−４Ｈ−クロメン−４−オン：（Ｓ）−２−（１−（４−アミノ−３−（４−メトキシ−３−ニトロフェニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル）エチル）−５−フルオロ−３−（３−フルオロフェニル）−４Ｈ−クロメン−４−オン：ＴＨＦ（５ｍｌ）中の（Ｒ）−５−フルオロ−３−（３−フルオロフェニル）−２−（１−ヒドロキシエチル）−４Ｈ−クロメン−４−オン（０．５００ｇ、１．６４ｍｍｏｌ）の溶液に、３−（４−メトキシ−３−ニトロフェニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−アミン（０．５６４ｇ、１．９７ｍｍｏｌ）及びトリフェニルホスフィン（０．６４９ｇ、２．４７ｍｍｏｌ）を添加し、続いて、ジイソプロピラゾジカルボキシレート（０．５０ｍｌ、２．４７ｍｍｏｌ）を添加した。（（Ｒ）−５−フルオロ−３−（３−フルオロフェニル）−２−（１−ヒドロキシエチル）−４Ｈ−クロメン−４−オンは、国際公開第ＷＯ ２０１２／０１５１５２５号において中間体２３、２５、及び２６に関して説明されるように調製することができる。）。室温で４時間後、混合物を濃縮し、残渣を酢酸エチル：石油エーテルでのカラムクロマトグラフィによって精製し、表題化合物を茶色固体として得た（０．２７０ｇ、２９％）。^１Ｈ−ＮＭＲ（δ ｐｐｍ，ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ）：８．０４（ｓ，１Ｈ），７．８３（ｍ，１Ｈ），７．６３−７．５０（ｍ，３Ｈ），７．２９（ｍ，２Ｈ），７．０６（ｄｔ，Ｊ＝８．７，２．２Ｈｚ，１Ｈ），６．９４（ｍ，２Ｈ），６．７５（ｄｄ，Ｊ＝８．１，２．１Ｈｚ，１Ｈ），５．９５（ｑ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，１Ｈ），４．９８（ｓ，２Ｈ），３．８１（ｓ，３Ｈ），１．８６（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ）．

中間体４：（Ｓ）−２−（１−（４−アミノ−３−（３−アミノ−４−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル）エチル）−５−フルオロ−３−（３−フルオロフェニル）−４Ｈ−クロメン−４−オン：（Ｓ）−２−（１−（４−アミノ−３−（３−アミノ−４−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル）エチル）−５−フルオロ−３−（３−フルオロフェニル）−４Ｈ−クロメン−４−オン：エタノール（５ｍｌ）中の中間体３（０．２６０ｇ、０．４５５ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｒａｎｅｙ Ｎｉ（０．１３０ｇ）を添加し、２０ｐｓｉ、５０℃で２４時間水素化した。反応混合物をセライトパッドに通過させ、濃縮し、表題化合物を茶色固体として得た（０．１５０ｇ、６０％）。質量：５４０．８（Ｍ^＋）。

実施例Ａ
Ｎ−（５−（４−アミノ−１−（１−（５−フルオロ−３−（３−フルオロフェニル）−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−２−イル）エチル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）−２−メトキシフェニル）メタンスルホンアミド

ＤＭＥ（２．１ｍｌ）及び水（０．６７ｍｌ）中の２−（１−（４−アミノ−３−ヨード−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル）エチル）−５−フルオロ−３−（３−フルオロフェニル）−４Ｈ−クロメン−４−オン（０．２００ｇ、０．３６６ｍｍｏｌ）の溶液に、中間体２（０．１７９ｇ、０．５５０ｍｍｏｌ）及び炭酸ナトリウム（０．１１６ｇ、１．１０ｍｍｏｌ）を添加し、該系を３０分間脱気した。（２−（１−（４−アミノ−３−ヨード−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル）エチル）−５−フルオロ−３−（３−フルオロフェニル）−４Ｈ−クロメン−４−オンは、国際公開第ＷＯ ２０１２／０１５１５２５号において中間体２３、２５、及び２６に関して説明されるように調製することができる）。ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］ジクロロパラジウム（ＩＩ）（０．０５９ｇ、０．０７５ｍｍｏｌ）を添加し、マイクロ波照射下（マイクロ波電力＝１００Ｗ、温度＝１００℃）で４５分間維持した。反応混合物をセライト濾過し、濃縮し、酢酸エチルで抽出した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。粗生成物を、メタノール：ジクロロメタンでのカラムクロマトグラフィによって精製し、表題化合物を茶色固体として得た（０．０８０ｇ、３５％）。ＭＰ：２１６〜２１８℃。^１Ｈ−ＮＭＲ（δ ｐｐｍ，ＣＤＣｌ_３，４００ＭＨｚ）：８．２０（ｓ，１Ｈ），７．７３（ｓ，１Ｈ），７．５３（ｍ，２Ｈ），７．３１（ｍ，２Ｈ），７．０７−６．７３（ｍ，６Ｈ），６．０７（ｑ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，１Ｈ），３．９８（ｓ，３Ｈ），３．１４（ｓ，３Ｈ），２．０１（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，３Ｈ）．

実施例Ａ１及びＡ２
方法Ａ
（Ｓ）−Ｎ−（５−（４−アミノ−１−（１−（５−フルオロ−３−（３−フルオロフェニル）−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−２−イル）エチル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）−２−メトキシフェニル）メタンスルホンアミド
及び（Ｒ）−Ｎ−（５−（４−アミノ−１−（１−（５−フルオロ−３−（３−フルオロフェニル）−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−２−イル）エチル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）−２−メトキシフェニル）メタンスルホンアミド

２つの鏡像異性的に純粋な異性体を、８０ｇ／分の流速で、移動相としてメタノール：ＣＯ_２（５５：４５）を使用して、ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ ＡＳ−Ｈカラム（２５０×３０ｍｍ；５μｍ）上で、Ｎ−（５−（４−アミノ−１−（１−（５−フルオロ−３−（３−フルオロフェニル）−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−２−イル）エチル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）−２−メトキシフェニル）メタンスルホンアミド（０．５００ｇ）から、分取ＳＦＣ（超臨界流体）条件によって分離させた。

実施例Ａ１（Ｓ−異性体）：茶色固体（０．２４７ｇ）。鏡像体過剰率：９７．４％。保持時間：２．１４分。質量：６１９．１（Ｍ^＋＋１）。ＭＰ：１５６〜１５８℃。

実施例Ａ２（Ｒ−異性体）：茶色固体（０．１８２ｇ）。鏡像体過剰率：９９．３％。保持時間：３．４３分。質量：６１９．１（Ｍ^＋＋１）。ＭＰ：１６８〜１７１℃。

方法Ａ１
（Ｓ）−Ｎ−（５−（４−アミノ−１−（１−（５−フルオロ−３−（３−フルオロフェニル）−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−２−イル）エチル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）−２−メトキシフェニル）メタンスルホンアミド
及び（Ｒ）−Ｎ−（５−（４−アミノ−１−（１−（５−フルオロ−３−（３−フルオロフェニル）−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−２−イル）エチル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）−２−メトキシフェニル）メタンスルホンアミド

２つの鏡像異性的に純粋な異性体を、１２０ｇ／分の流速で、移動相としてメタノール：ＣＯ_２（４５：５５）を使用して、ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ ＡＳ−Ｈカラム（２５０×２０ｍｍ；５μｍ）上で、Ｎ−（５−（４−アミノ−１−（１−（５−フルオロ−３−（３−フルオロフェニル）−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−２−イル）エチル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）−２−メトキシフェニル） メタンスルホンアミド（１５．０ｇ）から、分取ＳＦＣ（超臨界流体）条件によって分離させた。

実施例Ａ１（Ｓ−異性体）：鏡像体過剰率：１００％。保持時間：２．２１分。質量：６１９．１（Ｍ^＋＋１）。ＭＰ：１７５〜１７８℃ 比旋光度（クロロホルム中Ｃ＝１、２５℃）：［α］_Ｄ＝＋１４７．１６。

実施例Ａ２（Ｒ−異性体）：鏡像体過剰率：９９．３％。保持時間：３．７２分。質量：６１９．１（Ｍ^＋＋１）。ＭＰ：１５４〜１５７℃。比旋光度（クロロホルム中Ｃ＝１、２５℃）：［α］_Ｄ＝−１５９．５４。

方法Ｂ
実施例Ａ１
（Ｓ）−Ｎ−（５−（４−アミノ−１−（１−（５−フルオロ−３−（３−フルオロフェニル）−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−２−イル）エチル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）−２−メトキシフェニル）メタンスルホンアミド

０℃まで冷却したジクロロメタン（５ｍｌ）中の中間体４（０．５００ｇ、０．９２３ｍｍｏｌ）の溶液に、ピリジン（０．２００ｍｌ、１．８４ｍｍｏｌ）を添加し、１０分間撹拌した。メタンスルホニルクロリド（０．１００ｍｌ、０．９２３ｍｍｏｌ）を添加し、３０分間撹拌した。反応混合物を水でクエンチし、ジクロロメタンで抽出し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。粗生成物をメタノール：ジクロロメタンでクロマトグラフにかけ、表題化合物をオフホワイト色の固体として得た（０．２４０ｇ、４２％）。ＭＰ：２１１〜２１３℃。^１Ｈ−ＮＭＲ（δ ｐｐｍ，ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ）：９．１５（ｓ，１Ｈ），８．０６（ｓ，１Ｈ），７．８３（ｍ，１Ｈ），７．４９（ｍ，４Ｈ），７．２８（ｍ，４Ｈ），７．０８（ｄｔ，Ｊ＝８．６，１．７Ｈｚ，１Ｈ），６．９２（ｓ，２Ｈ），５．９８（ｑ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，１Ｈ），３．８８（ｓ，３Ｈ），２．９９（ｓ，３Ｈ），１．８８（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ）．鏡像体過剰率：ｃｈｉｒａｌｐａｋ ＡＳ−３Ｒカラム上のＨＰＬＣによって判定される際、８５．４％、早期溶出異性体において濃縮（保持時間＝７．４６分）。

代謝的安定性
代謝的安定性研究は、マウス、ラット、イヌ、サル、及びヒト肝臓ミクロソームを使用して、化合物Ａ、Ａ１、及びＡ２、ならびに第ＷＯ ２０１２／１５１５２５号の実施例１２８において行った。マウス、ラット、及びヒト肝臓ミクロソーム（全てＢＤ Ｇｅｎｔｅｓｔ，ＵＳＡより）を用いた試験のためのプロトコルは、以下に提供される。０．４ｍｇのタンパク質を、３７℃で１５分間、リン酸緩衝液（ｐＨ約７．４）中の２ｍＭ ＮＡＤＰＨ（補因子）でプレインキュベートし、次いで、１μＭの試験アイテムを添加し、３連で６０分間更にインキュベートした。反応混合物を、内部標準を含有するメタノールで終了させ、遠心分離し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって、上清中に残存する試験アイテムを更に分析した。残存する親化合物の割合（％）は、０分で終了させた類似の試料と比較して計算した。結果を、以下の表１に提供する。

化合物Ａ１に関する代謝的安定性データは、それが、優れた薬物動態プロファイルを呈するということを示す。

タンパク質結合
以下では、血漿タンパク質結合を測定する（平衡透析方法を使用して）ための手順を提供する。７４５μＬの血漿を、２ｍｌの微小遠心管に移した。それに、５μＬの化合物Ａ１（１５０μＭ）を添加した。試料を、テーブルトップボルテクサで２分間混合した。５０μＬの血漿（ｎ＝２）を、０時間の試料として処理した、事前標識した１．５ｍＬの微小遠心管に移した。

残存する６５０μＬの血漿試料を、水浴において、３７℃で３０分間、インキュベートした。３０分のインキュベート後、５０μＬの血漿（ｎ＝２）を、０．５時間の試料として処理した、事前標識した１．５ｍＬの微小遠心管に取り出した。２００μＬの血漿試料（ｎ＝２）を、赤色のリングによって示された試料チャンバに移した。赤色のインサートを、ベースプレートに配置し、３５０μＬの緩衝液を、緩衝液チャンバに移した。プレートを３７℃で、オービタルシェーカ上で約１００ＲＰＭ、または上下シェーカ上で２０ＲＰＭで、４時間インキュベートした。緩衝液及び血漿チャンバからの５０μＬの透析後試料を、事前標識した微小遠心管に移した。５０μＬの血漿を緩衝液試料に、かつ等しい体積の緩衝液（ＫＨ_２ＰＯ_４ 緩衝液ｐＨ ７．４）を収集した血漿試料に添加した。１５０μＬの内部標準を含有するメエタノール（トルブタミド２５０ｎｇ／ｍｌ）を添加し、タンパク質及び放出化合物を沈殿させた。試料を、テーブルトップボルテクサで３分間、ボルテックスし、１４，０００ＲＰＭで５分間遠心分離した。上清をＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析に供した。

化合物Ａ１に関する血漿タンパク質結合データを、以下の表２に提供する。

薬物動態
化合物Ａ１（遊離塩基）の経口バイオアベイラビリティを、ラット及びマウスにおいて評価した。ラットにおける薬物動態研究のためのプロトコルを、以下に提供する。

全ての動物は、投薬前に終夜（１２時間）絶食し、試験アイテムの投与後４．０時間まで継続させた。試験アイテム製剤は、１％のＴｗｅｅｎ ８０及び９９％の培地（０．５％のメチルセルロース、４０００ｃＰｓ、ｐＨ ２．２）において調製した。血液試料（各動物から１５０μＬ）は、眼窩洞から収集し、抗凝固剤として２ナトリウムＥＤＴＡを含有する微小遠心管に配置した。血液試料を、４℃で１０分間、１０００ｇの速度で直ちに遠心分離し、分離した血漿試料を−８０℃以下で凍結し、分析まで保管した。全ての製剤における試験アイテムの濃縮物を、ＨＰＬＣによって分析した。全ての製剤における試験アイテムの血漿濃縮物を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析した。薬物動態パラメータ（Ｃ_ｍａｘ、ＡＵＣ_０−ｔ、Ｔ_ｍａｘ、及びｔ_１／２）を、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェアを使用することによって推定した。結果は、ラットにおける化合物Ａ、Ａ１、及び第ＷＯ ２０１２／１５１５２５号の実施例１２８、ならびにマウスにおける化合物Ａ１に関して、表３に提供する。

化合物Ａ及びＡ１は、第ＷＯ ２０１２／１５１５２５号の実施例１２８と比較して、優れた薬物動態プロファイルを示した。例えば、化合物Ａは、第ＷＯ ２０１２／１５１５２５号の実施例１２８と比較した際、約１．５倍のＣ_ｍａｘの増加、約４倍のＡＵＣ_０−ｔの増加、及び約２．８倍のｔ_１／２の増加を示した。化合物Ａ１は、第ＷＯ ２０１２／１５１５２５号の実施例１２８と比較した際、約１６倍のＣ_ｍａｘの増加、４８倍のＡＵＣ_０−ｔの増加、及び約１．６倍のｔ_１／２の増加を示した。

生物学的アッセイ
本明細書に説明される化合物の薬理的特性は、以下で例示されるように、いくつかの薬理的アッセイによって確認され得る。

アッセイ１：ＰＩ３キナーゼ酵素活性の蛍光判定
ホスホイノシチド３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）は、いくつかの重要な細胞プロセスの制御において重要な役割を果たす、脂質キナーゼのクラスに属する。ＰＩ３Ｋは、ホスホイノシトールの３−ヒドロキシ位置をリン酸化し、これにより下流シグナル伝達事象に関与するセカンドメッセンジャーを産生することができる。均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）アッセイは、α、β、γ、またはδ等のＰＩ３Ｋアイソフォームによるホスホチジルイノシトール４，５−二リン酸（ＰＩＰ２）のリン酸化の結果として形成される、３，４，５−三リン酸エステル（ＰＩＰ３）の検出を可能にする。

α、β、γ、またはδのＰＩ３Ｋアイソフォーム活性は、修正を有するＰＩ３ＫヒトＨＴＲＦ（商標）Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を使用して判定される。全てのインキュベーションは、室温で実施した。０．５μｌの４０×阻害剤（１００％のＤＭＳＯ中）または１００％のＤＭＳＯを、酵素を含む、または含まない、１４．５μｌの１×反応緩衝剤／ＰＩＰ２（１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、５ｍＭのＤＴＴ、１．３８μＭのＰＩＰ２）混合物を含有する、３８４ウェル白色プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−Ｏｎｅ，Ｍｏｎｒｏｅ，ＮＣ）の各ウェルに添加し、５μｌ／ウェルの４００μＭのＡＴＰを続け、更に３０分間インキュベートした。５μｌ／ウェルの停止溶液（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を添加することによって、反応を終了させた。次いで、５μｌの検出混合物（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を各ウェルに添加し、６〜１８時間暗所でインキュベートした。ＨＲＴＦ割合を、５０ミリ秒の遅延を計数する４００ミリ秒の統合時間を有する、３３７ｎＭの励起波長及び６６５及び６１５ｎＭの放出波長のマイクロプレート読み取り装置（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ．，Ｇｅｒｍａｎｙ）上で測定した。化合物Ａ、Ａ１、及びＡ２に関する結果を、以下の表４に示す。化合物Ａ１及び第ＷＯ２０１２／１５１５２５号の実施例１２８に関する比較データを、以下の表５に提供する。

アッセイ２：白血病細胞株におけるインビトロ細胞増殖アッセイ
１０％のＦＢＳ補足培地を使用して、増殖阻害アッセイを実施した。９６ウェルプレート内に５０００〜２０，０００個の細胞／ウェルの濃度で、細胞を播種した。０．０１〜１００００ｎＭの範囲の濃度の試験化合物を、２４時間後に添加した。０時間（試験化合物の添加前）及び試験化合物の添加の７２時間後で、３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−臭化ジフェニルテトラゾリウム（ＭＴＴ）色素還元試験を使用して、成長を評価した。４５０ｎｍの波長で、Ｆｌｕｏｓｔａｒ Ｏｐｔｉｍａ（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上で吸光度を読み取った。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用してデータを分析し、対照と比較した、試験化合物による阻害割合（％）をそれに従って計算した。

化合物Ａ１は、試験された用量範囲について、ＧＩ_５０値が２．５〜１２．８μＭの範囲内で、Ｔリンパ腫（ＭＯＬＴ−４、Ｊｕｒｋａｔ、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、Ｈｕｔ−７８、及びＨｕＴ−１０２）細胞生存能における低減を引き起こした。更に、化合物Ａ１は、７２時間のインキュベーション期間にわたっていかなる明らかな細胞毒性も示さなかった。

アッセイ３：白血病細胞株におけるＡＫＴリン酸化の阻害
ＭＯＬＴ−４、Ｊｕｒｋａｔ、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、及びＨｕｔ−７８細胞を、所望の濃度の化合物とともに４８時間インキュベートした。細胞を溶解させ、ウェスタンブロットによってｐＡＫＴ判定した。ＩｍａｇｅＪを使用してバンドを定量化し、アクチンに正規化した。

化合物Ａ１は、試験された用量範囲について、ＥＣ_５０値が０．０２〜１．６μＭの範囲内で、Ｔ−リンパ腫（ＭＯＬＴ−４、Ｊｕｒｋａｔ、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、及びＨｕｔ−７８）細胞株内のｐＡＫＴ発現における低減を引き起こした。

アッセイ４：ヒト全血からの好塩基球におけるＰＩ３Ｋδ及びγシグナル伝達の阻害
抗ＦｃεＲ１またはｆＭＬＰ誘導ＣＤ６３発現の変化によって明示される、好塩基球におけるＰＩ３Ｋδ及びγシグナル伝達は、Ｆｌｏｗ２ＣＡＳＴ（登録商標）キット（Ｂｕｈｌｍａｎｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して判定される、有用な薬力学的標識である。試験手順は、以下のステップを伴う。
・静脈穿刺管を何回か反転させることによって、抗凝血血液試料を混合する；
・フローサイトメトリ測定に好適な、新しくかつ発熱物質を含まない３．５ｍｌのポリプロピレンまたはポリスチレン管を調製する；
・４９μｌの患者の全血を各管に添加する；
・１μｌの１０％のＤＭＳＯ（バックグラウンド）または化合物（１０％のＤＭＳＯ）を指定された管に添加し、穏やかに混合する。室温で１５分間インキュベートする；
・５０μｌの刺激緩衝剤（バックグラウンド）あるいは抗ＦｃεＲＩ ＡｂまたはｆＭＬＰを各管にピペッティングする；
・１００μｌの刺激緩衝剤を各管に添加する；
・穏やかに混合する。２０μｌの染色試薬（ＦＩＴＣ−ＣＤ６３及びＰＥ−ＣＣＲ３の１：１混合物）を各管に添加する；
・穏やかに混合し、管を覆い、水浴中３７℃で１５分間インキュベートする。（インキュベータを使用すると、より効率的でない熱伝達のために、約１０分間長いインキュベーション時間がかかる）；
・２ｍｌの余熱（１８〜２８℃）した溶解試薬を各管に添加し、穏やかに混合する；
・１８〜２８℃で５〜１０分間インキュベートする；
・５００×ｇで管を５分間遠心分離する；
・ブロッティング紙を使用することによって、上清を傾瀉する；
・３００〜８００μｌの洗浄緩衝剤で細胞ペレットを再懸濁する；及び
・穏やかにボルテックスし、同一日内にフローサイトメーター上でデータを取得する。

ゲートされた好塩基球集合内のＣＤ６３陽性細胞パーセントを、異なる治療群において判定し、ビヒクル対照に正規化した。

化合物Ａ１は、ＦｃεＲ１（ＰＩ３Ｋδ）に対して＜３０ｎＭのＥＣ_５０、及びｆＭＬＰ（ＰＩ３Ｋγ）に対して＜７０ｎＭのＩＣ_５０を呈した（ｎ＝１）。

アッセイ４Ａ：ＰＩ３Ｋデルタ及びＰＩ３Ｋガンマアイソフォームについての化合物Ａ１の選択性を実証する、細胞活性
アッセイ４Ａ１：（ＰＩ３Ｋδ選択性のための）抗ＩｇＭ誘導Ｂ細胞増殖
本研究の目的は、抗ＩｇＭ誘導ヒトＢ細胞増殖に対する、化合物Ａ１の阻害潜在力を評価することであった。
プレーティング及び処理
・単離したＢ細胞を１ｍｌ当たり１．０×１０^６個の細胞に再懸濁した。１００μｌの細胞懸濁液を９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。３連を維持した。
・５０μｌの薬物希釈液を添加し、よく混合した。ＤＭＳＯブランク及び誘導因子ブランクを維持した。
・処理したプレートを、３７℃、５％ＣＯ_２で３０分間インキュベートし、その後５０μｌの４×誘導因子を添加し、ピペッティングによって混合した。
・プレートを、３７℃、５％ＣＯ_２で７２時間インキュベートした。
・培地を吸引し、１５０μｌのＤＭＳＯを添加して、ホルマザン結晶を溶解させた。
・Ａ_５６０及びＡ_６４０ｎｍで吸光度を読み取った。

データは、ヒトＢ細胞増殖のＰＩ３Ｋδ媒介誘導に対する、化合物Ａ１の阻害潜在力を実証した。例えば、Ｂａｅｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１３４：３５３２−３５３８，１９８５を参照されたい。

アッセイ４Ａ２：（ＰＩ３Ｋβ選択性のための）３Ｔ３線維芽細胞におけるＬＰＡ誘導ＡｋｔＳ４７３リン酸化
本研究の目的は、３Ｔ３線維芽細胞におけるＰＩ３Ｋβキナーゼ媒介ＬＰＡ誘導ＡｋｔＳ４７３リン酸化に対する化合物Ａ１の効果を判定することであった。
・３Ｔ３細胞を所望の濃度の試験化合物で１５分間処理した。最終濃度が５μＭであるように、１ｍｌの２Ｘ ＬＰＡを添加し、５分間インキュベートした。
・培地を処分し、１ｍｌの氷冷１Ｘ ＰＢＳで洗浄した。
・２５０μｌの細胞溶解緩衝剤を添加し、氷上で３０分間インキュベートした。
・試料を遠心分離し、上清は分析まで−８０℃で維持した。
・ｐＡＫＴ（Ｓ４７３）を一次抗体として、及び抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰを二次抗体として使用するウェスタンブロットによって試料を分析した。
・ＩｍａｇｅＪ１．４２ｑ（ＮＩＨ，ＵＳＡ）を使用して、バンドの強度を判定し、アクチン（負荷対照）に正規化した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（Ｖｅｒｓｉｏｎ５．０２）を使用して、データをプロットした。

結果は、ＰＩ３Ｋのベータアイソフォームに対する化合物Ａ１の選択性を実証する。Ａｌｂｕｑｕｅｒｑｕｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７８，３９８３０−３９８３８，２００３を参照されたい。

アッセイ４Ａ３：（ＰＩ３Ｋγ選択性のための）ＲＡＷ２６４．７マクロファージにおけるｃ５ａ誘導ＡｋｔＳ４７３リン酸化
本研究の目的は、ＲＡＷ２６４．７マクロファージにおけるＰＩ３Ｋγキナーゼ媒介ｃ５ａ誘導ＡｋｔＳ４７３リン酸化に対する化合物Ａ１の効果を判定することであった。
・ＲＡＷ２６４．７細胞を、所望の濃度の試験化合物で１５分間処理した。最終濃度が５０ｎｇ／ｍｌであるように、１ｍｌの２Ｘ ｃ５ａを添加し、１５分間インキュベートした。
・培地を処分し、１ｍｌの氷冷１Ｘ ＰＢＳで洗浄した。
・２５０μｌの細胞溶解緩衝剤を添加し、氷上で３０分間インキュベートした。
・試料を遠心分離し、上清を分析まで−８０℃で保管した。
・ｐＡＫＴ（Ｓ４７３）を一次抗体として、及び抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰを二次抗体として使用するウェスタンブロットによって試料を分析した。
・ＩｍａｇｅＪ１．４２ｑ（ＮＩＨ，ＵＳＡ）を使用して、バンドの強度を判定し、アクチン（負荷対照）に正規化した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（Ｖｅｒｓｉｏｎ５．０２）を使用して、データをプロットした。

ｐＡｋｔＳ４７３の阻害、ＰＩ３Ｋγシグナル伝達の下流マーカは、ｃ５ａ誘導ＲＡＷ２６４．７細胞内でＡｋｔによって制御される発癌経路における化合物Ａ１の役割を示唆する。Ｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．，１８２，８９７−９０４，２０１０を参照されたい。

アッセイ４Ａ４：（ＰＩ３Ｋα選択性のための）３Ｔ３細胞におけるＰＤＧＦ誘導Ａｋｔリン酸化
本研究の目的は、ＰＤＧＦ誘導３Ｔ３線維芽細胞におけるＰＩ３Ｋαキナーゼ媒介ＡｋｔＳ４７３リン酸化に対する化合物Ａ１の効果を判定することであった。
・３Ｔ３細胞を所望の濃度の試験化合物で１５分間処理した。最終濃度が２０ｎｇ／ｍｌであるように、１ｍｌの２Ｘ ＰＤＧＦを添加し、１０分間インキュベートした。
・培地を処分し、１ｍｌの氷冷１Ｘ ＰＢＳで洗浄した。
・２５０μｌの細胞溶解緩衝剤を添加し、氷上で３０分間インキュベートした。
・試料を遠心分離し、上清を収集し、分析まで−８０℃で保管した。
・ｐＡＫＴ（Ｓ４７３）を一次抗体として、及び抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰを二次抗体として使用するウェスタンブロットによって試料を分析した。
・ＩｍａｇｅＪ１．４２ｑ（ＮＩＨ，ＵＳＡ）を使用して、バンドの強度を判定し、アクチン（負荷対照）に正規化した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（Ｖｅｒｓｉｏｎ５．０２）を使用して、データをプロットした。

１０μＭの化合物Ａ１で阻害は観察されず、ＰＩ３Ｋのアイソフォームに対する化合物Ａ１の選択性を実証した。Ａｌｂｕｑｕｅｒｑｕｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８，３９８３０−３９８３８，２００３を参照されたい。

以下の表６は、アッセイ４Ａ１〜４Ａ４からの結果を要約する。

アッセイ５：白血病細胞株におけるアポトーシスの阻害
以下で概説されるように、ｉｎ ｓｉｔｕ Ｃａｓｐａｓｅ３キット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＳ）を使用して、白血病細胞におけるアポトーシスを判定した。
・６ウェルプレート内に１×１０^６個の細胞／ウェルの密度で、白血病細胞を播種する
・所望の濃度の試験化合物／ＤＭＳＯを添加する
・プレートを、５％ＣＯ_２インキュベータ内で３７℃で２４時間インキュベートする
・２ｍｌの遠心分離管内に細胞を収集する
・１．６μｌの新しく調製された５×ＦＬＩＣＡ試薬を添加し、管をわずかに弾くことによって、細胞を混合する
・５％ＣＯ_２下、３７℃で管を１時間インキュベートする
・２ｍｌの１×洗浄緩衝剤を各管に添加し、混合する
・細胞を、室温で５分間、＜４００×ｇで遠心分離する。
・上清を慎重に除去及び処分し、細胞ペレットを穏やかにボルテックスして、いかなる細胞間凝集塊も破壊する。
・３００ｕｌの１×洗浄緩衝剤中で細胞ペレットを再懸濁する
・１００μｌの各細胞懸濁液を、黒色マイクロタイタープレートの２つのウェルのそれぞれの中に定置する。気泡の形成を避ける。
・４９０ｎＭの励起波長及び５２０ｎＭの放出波長を使用して、各マイクロウェルの吸光度を読み取る。
・対照ブランクと比較した、蛍光における増加によって明示される、ｃａｓｐａｓｅ−３活性における増加割合（％）を計算する。

アッセイ６Ａ：ヒトＰＢＭＣにおけるサイトカインアッセイ
本研究の目的は、ヒトＰＢＭＣにおける抗原誘導サイトカイン放出に対する、化合物Ａ１の阻害潜在力を評価することであった。
プレーティング及び処理
・ヘパリン化されたヒト全血を、ＰＢＳで１：１に希釈し、白血球分離培地上に付加し、４００ｇで４０分間、遠心分離した。
・軟層を取り出し、ＰＢＳで洗浄した
・０．１５＊１０^６のＰＢＭＣを、ＲＰＭＩ培地に１ウェル当たり１００μｌでプレートし、２時間インキュベートした。
・培地内の５０μｌの３×の化合物希釈物を添加し、１５分間インキュベートした。
・最終濃度が１μｇ／ｍｌであるように、ＲＰＭＩ中５０μｌのＬＰＳでＴＮＦα誘導した。上清を６時間で収集した。
・最終濃度が２０μｇ／ｍｌであるように、ＲＰＭＩ中５０μｌのＰＨＡでＩＬ−２誘導した。上清を２４時間で収集した。
・最終濃度が２０μｇ／ｍｌであるように、ＲＰＭＩ中５０μｌのＰＨＡでＩＬ−４誘導した。上清を４８時間で収集した。
・ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅからのキットを使用して、ＥＬＩＳＡを実施した。
・ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５を使用して、ＥＣ_５０を計算した。

２〜３つの独立した実験からＥＣ_５０値を計算した。化合物Ａ１は、それぞれ、７．１、９．５、及び３．５ｎＭのＥＣ_５０で抗原誘導ＴＮＦα、ＩＬ−２、及びＩＬ−４を阻害した。

アッセイ６Ｂ：ヒトまたはマウス全血におけるＬＰＳ誘導ＣＤ１９またはＣＤ４５Ｒの阻害
ヒトまたはマウスＢリンパ球のＢ細胞受容体（ＢＣＲ）活性化増殖を調節するうえでの化合物Ａ１の効果を判定した。ＣＤ１９は、Ｂ芽細胞への発達中の最も早期に認識可能なＢ系細胞からの細胞上に存在するタンパク質であるが、血漿細胞への成熟までに失われる。ＬＰＳは、内毒素であり、かつＢＣＲシグナル伝達経路を介して、Ｂ細胞上に強力なマイトジェン活性を有する環境微生物の主要な構成要素である。

希釈したヒト全血を、ＤＭＳＯまたは所望の濃度の化合物Ａ１で処理した。試料を、化合物の添加の１５分後にＬＰＳで誘導し、３７℃及び５％ＣＯ_２で７２時間インキュベートした。ＣＤ４５及びＣＤ１９に対して陽性の細胞を、フローサイトメトリによって判定し、データを、総個体数におけるＣＤ１９陽性細胞のパーセンテージとして表す。化合物Ａ１での処理は、ＣＤ１９発現における低減によって明示される、ＬＰＳ誘導ヒト全血Ｂ細胞増殖の用量依存的阻害（ＥＣ_５０＝１１７．７ｎＭ）をもたらした。

ＣＤ１９と同様に、ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）は、早期プロＢ段階以降からのそれらの発達を通じて、マウスＢリンパ球上で発現され、血漿細胞への最終分化時に下方制御される。簡潔に述べると、希釈したマウス全血を、ＤＭＳＯまたは所望の濃度の化合物Ａ１で処理した。試料を、化合物添加の１５分後にＬＰＳで誘導し、３７℃及び５％ＣＯ_２で７２時間インキュベートした。ＣＤ４５及びＣＤ４５Ｒに対して陽性の細胞を、フローサイトメトリによって判定した。データを、総個体数におけるＣＤ４５Ｒ陽性細胞のパーセンテージとして表す。ＣＤ１９＋細胞増殖データと一致して、化合物Ａ１での処理は、ＣＤ４５Ｒ発現における低減によって明示される、ＬＰＳ誘導マウス全血Ｂ細胞増殖の用量依存的阻害（ＥＣ_５０＝１２８．２ｎＭ）をもたらした。

アッセイ６Ｃ：単離したマウス脾細胞におけるＡＫＴリン酸化の阻害
ＰＩ３Ｋ経路は、細胞増殖、成長、及び生存等のいくつかの発癌プロセスを調節する、セリン−トレオニンキナーゼである、ＡＫＴによって下流で制御される。脾臓は、多量のＢ及びＴリンパ球に対するレパートリであるため、ＬＰＳ誘導ＡＫＴリン酸化の阻害は、単離したマウス脾細胞を使用して、エクスビボで判定した。細胞をプレートし、所望の濃度の化合物Ａ１とともに１５分間インキュベートし、続いて、ＬＰＳ（２０μｇ／ｍＬ）で３０分間誘導した。誘導後、細胞を溶解させ、ｐＡＫＴは、ｐＡＫＴ^Ｓ４７３捕捉／検出抗体対及び抗マウスＨＲＰ二次抗体を使用したＥＬＩＳＡによって判定した。ブランクを差し引いた吸光度値を得て、試験試料におけるｐＡＫＴの阻害割合（％）を計算した。化合物Ａ１は、低濃度で下流マーカ、ＡＫＴのリン酸化における用量依存的低減（ＥＣ_５０＝３４７．４ｎＭ）を引き起こし、それによって、シグナル伝達経路を解明した。

アッセイ７：雌のウィスターラットモデルにおけるリポ多糖誘導肺好中球増加症
過剰動員及びそれに続く好中球の活性化は、重度の喘息、慢性閉塞性肺疾患、嚢胞性線維症、及び急性呼吸促迫症候群等の、気道及び肺におけるいくつかの炎症性疾患の発症及び経過にとって重要である可能性が高い。好中球がこれらの疾患に寄与する機序は、好中球エラスターゼ等のタンパク質分解酵素、及び酸素フリーラジカルの放出に関与し得る。これらの化合物は、放出されると、気道において気管支収縮、気管支過敏症、分泌過多、上皮損傷、及び組織のリモデリングを引き起こす可能性がある。

隔離期間後、絶食させた動物をランダム化し、それらの体重に応じて種々の群に分けた。０．５％のメチルセルロースからなるビヒクル中の懸濁液（Ｔｗｅｅｎ８０を懸濁剤として）として試験化合物（化合物Ａ１）を調製した。体積１０ｍＬ／ｋｇの強制経口投与によって化合物またはビヒクルを投与した。ケタミンを用いて雌のウィスターラットを麻酔し、化合物Ａの投与から１時間後に、１ｍｇ／ｋｇの用量でＬＰＳ溶液を気管内に投与した。ＬＰＳの滴下注入の６時間後、動物を麻酔下で失血させ、その後気管にカニューレを挿入し、ヘパリン処理したＰＢＳ（１ユニット／ｍｌ）の５ｍｌアリコートで気管カニューレを通して４回肺を洗浄した（総容量２０ｍｌ）。気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液は、総細胞数及び白血球分画数についてアッセイするまで２〜８℃で保存した。気管支肺胞液を遠心分離し（５００×ｇで１０分間）、得られた細胞ペレットをヘパリン処理した０．５ｍｌの食塩水に再懸濁した。血液細胞計数器を使用することによってＢＡＬ液または血液中の白血球の総数を判定し、１×１０^６個の細胞／ｍｌに調節した。細胞分画数を手動で計算した。サイトスピン３を使用して１００マイクロリットルの細胞懸濁液を遠心分離して、細胞スメアを調製した。細胞スメアを鑑別用血液染色液で染色し、スライドを顕微鏡的に観察して、好酸球をその形態学的特徴に従って識別した。細胞スメア中の３００個の白血球の間で各細胞型の数を判定し、パーセンテージとして表した。各ＢＡＬｆまたは血液中の好酸球の数を計算した。

化合物Ａ１は、対照群と比較して、１０ｍｇ／ｋｇで６５．２９％の阻害で、好中球浸潤の肺内への低減を示し、炎症性障害における治療的役割を示唆した。結果を図１に示す。

アッセイ８：リポ多糖誘導ラット空気嚢の炎症のモデル
雌のウィスターラット（１７５〜２００ｇ）を、実験の開始前に７日間気候順応させた。動物をそれらの体重に基づいて種々の群にランダムに割り付けた。動物をエーテルで麻酔し、２０ｍｌの無菌空気を皮下の肩甲骨内領域に注入する（０日目）ことによって皮下空気嚢を作製し、４日目に無菌濾過空気の第２の１０ｍｌの注入によって維持した。６日目に、６日目のＬＰＳ溶液の皮下注入による炎症の誘導１時間前に、経口処理を開始した。無菌食塩水（１００μｇ／ｋｇ）中に溶解した５ｍｌの体積のＬＰＳ溶液を、各嚢に注入した。ＬＰＳの投与の６時間後に、５ｍｌの無菌食塩水で嚢を流し、４ｍｌの液体を取り除くことによって嚢液の試料を取った。嚢液中に存在する白血球の数を、血球計算器を使用して顕微鏡的に判定した。Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｋで染色された液体スメアの顕微鏡検査によって、分画細胞内容物を判定した。

化合物Ａ１は、２．６５ｍｇ／ｋｇのＥＤ_５０での、好中球遊走のラット空気嚢内への用量依存的低減を引き起こし、これはリウマチ性関節炎における治療的役割を示唆した。結果を図２に示す。

アッセイ９：雄のモルモットにおける卵白アルブミン誘導肺好酸球増加症
隔離期間後、後眼窩叢法によって各個々の動物から眼窩静脈から０．３ｍＬの血液試料を収集し、細胞分析器（ＡＤＶＩＡ２１２０，Ｓｉｅｍｅｎｓ）上で分析する。それらの総細胞数に基づいて、モルモットをランダム化し、種々の群に分ける。識別のために、耳介を難消標識ペンでマークする。０日目に、重量を記録し、５０μｇの卵白アルブミン（ＯＶＡ）及び１０ｍｇのミョウバン溶液（１ｍＬ）で動物を腹腔内に感作させる。 ７日目及び１４日目に、上記の感作手順を反復する。疾病または感作に対する反応のあらゆる徴候について、１９日目まで動物を観察し、ある場合、記録する。１９、２０、及び２１日目に、強制経口投与による試験化合物での処理後、３０分後に動物を０．５％ｗ／ｖ、０．５％、及び１％の卵白アルブミン負荷にそれぞれ曝露する。対照及び偽群の動物を、０．５％ｗ／ｖのメチルセルロース（ビヒクル）で処理する。偽対照群を、０、７、及び１４日目に１０ｍｇのミョウバンで感作させ、１９、２０、及び２１日目に同一の噴霧速度で食塩水溶液（ＳＡＬ）に曝露させる。ＯＶＡ負荷の２０時間後、メタコリン負荷の累積用量（７５、１００、１２５、及び１５０μｇ／ｍｌ）に対する全身プレチスモグラフによって気道過敏性を測定する。気道反応を測定した後、血液試料及びＢＡＬ液を収集する。顕微鏡下で、ノイバウアー室を使用することによって総細胞数について試料を分析し、白血球分画の計数を手動で行う。

アッセイ１０：喘息モデル
隔離期間後、それらの体重に基づいて、マウスをランダム化し、４つの群に分けた（ｎ＝７）。識別のために、難消標識ペンで尾をマークした。０日目に、重量を記録し、腹腔内に１００μｇの卵白アルブミン及び１０ｍｇのミョウバン溶液（０．２ｍＬ）で感作させた。

７日目及び１４日目に、上記の感作プロトコルを反復した。疾病または感作に対する反応のあらゆる徴候について、２４日目まで動物を観察し、ある場合、記録した。２４、２５、及び２６日目に、強制経口投与による試験化合物での処理後、３０分後に動物を１０％ｗ／ｖの卵白アルブミン負荷に曝露した。

対照及び偽群の動物を、０．５％ｗ／ｖのメチルセルロース（ビヒクル）で処理した。偽対照群を、０、７、及び１４日目に１０ｍｇのミョウバンで感作させ、２４、２５、及び２６日目に同一の噴霧速度で食塩水溶液に曝露した。

最後のＯＶＡ負荷の４８時間後、メタコリン負荷の累積用量（２．５、１０、５０、及び１００ｍｇ／ｍｌ）に対する全身プレチスモグラフによって気道過敏性を測定した。気道反応を測定した後、血液試料及びＢＡＬ液を収集した。顕微鏡下で、ノイバウアー室を使用することによって総細胞数について試料を分析し、白血球分画の計数を手動で行った。

アッセイ１１：ウィスターラットにおけるコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）
雌のウィスターラットを、実験の開始前に７日間気候順応させ、それらの体重に基づいて種々の群にランダムに割り付けた。０日目に、尾の付け根で送達される、ＭＴＢ（４ｍｇ／ｍＬ）を含有する完全なフロイントアジュバント（ＩＦＡ）で乳化させた、５００μｇのウシコラーゲンＩＩ型の皮内注入によって動物を処理した。７日目の一次免疫化の後、尾の付け根での皮内注入による、不完全なフロイントアジュバント中、３００μｇのＣＩＩの追加免疫注入によって動物を処理した。足首の関節における関節炎の発現は、通常１２〜１４日目の間に視覚的に明らかになった。関節炎の発症後の日から、試験化合物またはビヒクル（経口投与）で、動物を処理し、処理は、更に連続で９日間継続した。研究期間中にわたって定期的に、関節炎の徴候について視覚的検査によって関節炎スコアを採点絵した。体重、肢体積、及び肢の厚さの測定を、０、１、３、５、７、９、及び１０日目に行った。１０日の処理後、研究の終了時に、剖検で血液を回収し、血清または血漿に処理し、全ての関節を取り、組織の小片を各関節から取った後、病理組織学的分析のために前足及び後足の両方を１０％のホルマリン内に固定し、組織ホモジネート内のサイトカイン分析のために−８０℃で保管した。前足及び後足の臨床点数化判断基準は、０＝正常、１＝１つの後足または前足の関節に発症、もしくは最小のびまん性紅斑、及び腫脹、２＝２つの後足または前足の関節に発症、もしくは中度のびまん性紅斑、及び腫脹、３＝３つの後足または前足の関節に発症、もしくは最小のびまん性紅斑、及び腫脹、４＝４つの指関節に発症、５＝足全体に重度のびまん性紅斑及び重度の腫脹、指を曲げることができない、である。

ラットＣＩＡモデルに治療的に投薬された化合物Ａ１は、予防的肢（図３Ｃ）及び治療的肢（図３Ｄ）の両方において観察される臨床スコア（図３Ａ及び３Ｂ）の低減において有意な有効性を実証する。

ラットＣＩＡモデルに治療的に投薬された化合物Ａ１は、後肢の両方（図４Ａ及び４Ｂ）の平均肢体積、ならびに足首直径（図４Ｃ及び４Ｄ）の低減において有意な有効性を実証する。

組織学的分析：ラットＣＩＡモデルに治療的に投薬された化合物Ａ１は、全ての後及び前肢の病理組織によって観察される、炎症（５８．３％、図４Ａを参照されたい）、軟骨（４６．５１％、図４Ｂを参照されたい）、及びパンヌス（４９．１８％、図４Ｃを参照されたい）の阻害において有意な有効性を実証する。

関節炎の発症及び進行は、対照群動物と比較して、処理群において有意に低減した（図５）。

アッセイ１２：雄のＢａｌｂ／ｃマウスにおける急性タバコ煙誘導細胞浸潤
動物（雄のＢａｌｂ／ｃマウス）を、実験の開始前に７日間気候順応させた。次いで、動物をそれらの体重に基づいて種々の群にランダムに割り付ける。１日目に、経口／鼻腔内経路によって、試験化合物またはビヒクルをマウスに投与し、１時間後、試験化合物を投与された動物を、全身曝露用ボックスに定置する。１日目及び２日目に６本、３日目に８本、４日目に１０本のタバコの主流煙にマウスを曝露する。各タバコの煙への曝露は、１０分間継続する。最初の２分間でタバコを完全に燃やした後、動物用換気装置を用いて気流を発生させ、次の２０分間は室内の新鮮な空気に曝露する。２本のタバコごとに室内の新鮮な空気に曝露することで更に２０分間休憩させる。対照動物は、室内空気室に曝露する。１日目〜４日目まで、経口または鼻腔内経路のいずれかによって、動物に試験化合物を投与する。５日目に、最後のタバコ煙（ＣＳ）曝露の２４時間後に、動物を麻酔下で失血させ、気管にカニューレを挿入し、ヘパリン処理したＰＢＳ（１ユニット／ｍｌ）の０．５ｍｌアリコートで気管カニューレを通して４回肺を洗浄する（総体積２ｍｌ）。採取した気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）は、総細胞数及び白血球分画数についてアッセイするまで２〜８℃で保存する。ＢＡＬ液を遠心分離し（５００×ｇで１０分間）、得られた細胞ペレットをヘパリン処理した０．５ｍｌの食塩水に再懸濁する。血液細胞計数器を使用してＢＡＬ液及び血液中の白血球の総数を判定し、１×１０^６個の細胞／ｍｌに調節した。細胞分画数を手動で計算する。サイトスピン３を使用して４０マイクロリットルの細胞懸濁液を遠心分離して、細胞スメアを調製する。細胞スメアを鑑別用血液染色液で染色し、顕微鏡的に観察して、好酸球をその形態学的特徴に従って識別する。細胞スメア中の３００個の白血球の間で各細胞型の数を判定してパーセンテージとして表し、各ＢＡＬ液中の好中球及びマクロファージの数を計算する。

アッセイ１３：Ｂａｌｂ／ｃマウスモデルにおけるイミキモド誘導尋常性乾癬
イミキモド（ＩＭＱ）は、もともと非黒色腫皮膚癌の治療のために使用された、ＴＬＲ７及びＴＬＲ８に対するリガンドである。マウスの剃毛した背中の皮膚へのＩＭＱの局所適用は、アカントーシス、錯角化、及び免疫細胞の浸潤、ならびにＩＬ２３／ＩＬ１７／ＩＬ２２経路の関与を含む、ヒト乾癬特有の病理学的特徴のほとんどを呈する、乾癬様皮膚病態を誘導する。動物（雄のＢａｌｂ／ｃマウス）を、実験の開始前に７日間気候順応させた。動物をそれらの体重に基づいて種々の群にランダムに割り付けた。０日目に、マウスの背中の皮膚を、除毛クリームの局所適用によって剃毛した。１日目に、経口経路によって、試験化合物またはビヒクルをマウスに投与し、１時間後、試験化合物を投与されたマウスに、６２．５ｍｇの商業的に入手可能なＩＭＱクリーム（５％；Ｂｅｓｅｌｎａ Ｃｒｅａｍ；Ｍｏｃｈｉｄａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を剃毛した背中の皮膚に適所適用した。マウスは、更に連続５日間、試験化合物またはビヒクル投与の１時間後に、イミキモドの適所適用で処理した。動物は、毎日、適所適用後、それらのケージに戻す前に１時間、乾燥させた。ＩＭＱクリームの最終適用の４時間後、マウスを殺処理し、皮膚試料を得た。背中の皮膚の厚さを、ダイヤルシックネスゲージを使用して測定した。皮膚の厚さを測定した後、皮膚試料を、１０％中性緩衝ホルマリン溶液中に固定し、パラフィンに埋め込んだ。脱パラフィン処理したセクションを、ヘマトキシリンエオジン（ＨＥ）で染色した。表皮の厚さを、１つのセクション当たり５つの独立したフィールドの値を平均することによって定量化した。背中の皮膚の炎症の重篤性を採点するために、ヒトでの臨床的な乾癬の面積と重症度（Ｐｓｏｒｉａｓｉｓ Ａｒｅａ ａｎｄ Ｓｅｖｅｒｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ（ＰＡＳＩ））に基づく、客観的採点システムを使用した。紅斑、落屑、及び肥厚を、０〜４：０＝なし；１＝わずか；２＝中程度；３＝顕著；及び４＝非常に顕著の尺度で独立して採点した。

図６Ａ及び６Ｂに示されるように、化合物Ａ１は、対照群動物と比較して、背中の皮膚の厚さ、紅斑、及び落屑（組織病理学的スコアによって示されるように）を低減した。

本明細書における本発明を、特定の実施形態を参照して説明してきたが、これらの実施形態は、本発明の原則及び用途の例解に過ぎないことを理解されたい。したがって、前述の本発明の主旨及び範囲から逸脱することなく、例解的な実施形態に数多くの修正がなされ得ること、及び他の構成が考案され得ることを理解されたい。添付の特許請求の範囲は、本発明の範囲を定義すること、かつ、これらの特許請求の範囲の範囲内の方法及び構造ならびにそれらの均等物が、それによって包含されることが意図される。

本出願に引用される全ての刊行物及び特許、及び／または特許出願は、参照により、各個々の刊行物または特許出願が、参照により本明細書に具体的かつ個々に組み込まれていることが示されていることと同程度に、参照によって本明細書に組み込まれる。

Claims (23)

1. Ｎ−（５−（４−アミノ−１−（１−（５−フルオロ−３−（３−フルオロフェニル）−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−２−イル）エチル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）−２−メトキシフェニル）メタンスルホンアミド、及びその薬学的に許容可能な塩から選択される化合物。
2. 前記化合物が、
   （ＲＳ）−Ｎ−（５−（４−アミノ−１−（１−（５−フルオロ−３−（３−フルオロフェニル）−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−２−イル）エチル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）−２−メトキシフェニル）メタンスルホンアミド；
   （Ｓ）−Ｎ−（５−（４−アミノ−１−（１−（５−フルオロ−３−（３−フルオロフェニル）−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−２−イル）エチル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）−２−メトキシフェニル）メタンスルホンアミド；
   （Ｒ）−Ｎ−（５−（４−アミノ−１−（１−（５−フルオロ−３−（３−フルオロフェニル）−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−２−イル）エチル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）−２−メトキシフェニル）メタンスルホンアミド；
   及びその薬学的に許容可能な塩から選択される、請求項１に記載の化合物。
3. （Ｓ）−Ｎ−（５−（４−アミノ−１−（１−（５−フルオロ−３−（３−フルオロフェニル）−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−２−イル）エチル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）−２−メトキシフェニル）メタンスルホンアミド、及びその薬学的に許容可能な塩から選択される、化合物。
4. 前記化合物が、（Ｒ）−Ｎ−（５−（４−アミノ−１−（１−（５−フルオロ−３−（３−フルオロフェニル）−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−２−イル）エチル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）−２−メトキシフェニル）メタンスルホンアミド、及びその薬学的に許容可能な塩を含まない、請求項３に記載の化合物。
5. 前記化合物が、９５％超の鏡像体過剰率を有する、請求項３に記載の化合物。
6. （Ｓ）−Ｎ−（５−（４−アミノ−１−（１−（５−フルオロ−３−（３−フルオロフェニル）−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−２−イル）エチル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）−２−メトキシフェニル）メタンスルホンアミド。
7. 前記化合物が、（Ｒ）−Ｎ−（５−（４−アミノ−１−（１−（５−フルオロ−３−（３−フルオロフェニル）−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−２−イル）エチル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）−２−メトキシフェニル）メタンスルホンアミドを含まない、請求項６に記載の化合物。
8. 前記化合物が、９５％超の鏡像体過剰率を有する、請求項６に記載の化合物。
9. 請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物と、少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体と、を含む、薬学的組成物。
10. 細胞内のＰＩ３δキナーゼの触媒活性を阻害するための組成物であって、有効量の請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物を含む、組成物。
11. 細胞内のＰＩ３γキナーゼの触媒活性を阻害するための組成物であって、有効量の請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物を含む、組成物。
12. 細胞内のＰＩ３δキナーゼ及びＰＩ３γキナーゼの触媒活性を阻害するための組成物であって、有効量の請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物を含む、組成物。
13. 前記阻害が、増殖性疾患、骨障害、炎症性疾患、免疫疾患、神経系疾患、代謝性疾患、呼吸器疾患、血栓症、及び心臓疾患から選択される疾患、障害、または病態に罹患する対象において生じる、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
14. 白血病の治療を必要とする患者においてそれを治療するための組成物であって、有効量の請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物を含む、組成物。
15. 喘息または慢性閉塞性肺疾患の治療を必要とする患者においてそれを治療するための組成物であって、有効量の請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物を含む、組成物。
16. リウマチ性関節炎、乾癬、ループス、または実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の治療を必要とする患者においてそれを治療するための組成物であって、有効量の請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物を含む、組成物。
17. 慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、または緩徐進行性非ホジキンリンパ腫（Ｉ−ＮＨＬ）疾患の治療を必要とする患者においてそれを治療するための組成物であって、有効量の請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物を含む、組成物。
18. ＰＩ３Ｋ関連疾患、障害、または病態の治療のための、請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物を含む組成物であって、前記疾患、障害、または病態が、免疫系関連疾患、炎症を伴う疾患もしくは障害、癌もしくは他の増殖性疾患、肝臓疾患もしくは障害、または腎臓疾患もしくは障害である、組成物。
19. 抗癌剤、抗炎症剤、免疫抑制剤、ステロイド、非ステロイド性抗炎症剤、抗ヒスタミン剤、鎮痛剤、及びこれらの混合物から選択される追加の活性剤を更に含む、請求項１８に記載の組成物。
20. 前記ＰＩ３Ｋ関連疾患、障害、または病態が、白血病、急性リンパ球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、有毛細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、急性及び慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、及び前骨髄球性白血病、乾癬、リウマチ性関節炎、骨関節炎、喘息、ＣＯＰＤ、アレルギー性鼻炎、ならびにループスエリテマトーデスから選択される、請求項１８に記載の組成物。
21. （Ｓ）−２−（１−（４−アミノ−３−（４−メトキシ−３−ニトロフェニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル）エチル）−５−フルオロ−３−（３−フルオロフェニル）−４Ｈ−クロメン−４−オン、
    （Ｓ）−２−（１−（４−アミノ−３−（３−アミノ−４−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル）エチル）−５−フルオロ−３−（３−フルオロフェニル）−４Ｈ−クロメン−４−オン、
    及びその塩から選択される、化合物。
22. 式（Ｉ）の化合物の調製のためのプロセスであって、
    

    

    （ａ）５−ブロモ−２−メトキシアニリンを、メタンスルホニルクロリドと反応させて、
    

    

    Ｎ−（５−ブロモ−２−メトキシフェニル）メタンスルホンアミド（中間体１）を得るステップと、
    

    

    （ｂ）中間体１を、ビス（ピナコラート）ジボロンと反応させて、Ｎ−（２−メトキシ−５−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）フェニル）メタンスルホンアミド（中間体２）を得るステップと、
    

    

    （ｃ）２−（１−（４−アミノ−３−ヨード−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル）エチル）−５−フルオロ−３−（３−フルオロフェニル）−４Ｈ−クロメン−４−オンを、
    

    

    好適な塩基の存在下で、中間体２と反応させて、式（Ｉ）の化合物を得るステップと、を含む、プロセス。
23. 式（Ａ１）の化合物の調製のためのプロセスであって、
    

    

    （ａ）（Ｒ）−５−フルオロ−３−（３−フルオロフェニル）−２−（１−ヒドロキシエチル）−４Ｈ−クロメン−４−オンを、
    

    

    ３−（４−メトキシ−３−ニトロフェニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−アミンと、
    

    

    トリフェニルホスフィン及びジイソプロピラゾジカルボキシレートを使用したＭｉｔｓｕｎｏｂｕ条件下で反応させて、（Ｓ）−２−（１−（４−アミノ−３−（４−メトキシ−３−ニトロフェニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル）エチル）−５−フルオロ−３−（３−フルオロフェニル）−４Ｈ−クロメン−４−オン（中間体３）を得るステップと、
    

    

    （ｂ）中間体３を還元して、（Ｓ）−２−（１−（４−アミノ−３−（３−アミノ−４−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル）エチル）−５−フルオロ−３−（３−フルオロフェニル）−４Ｈ−クロメン−４−オン（中間体４）を得るステップと、
    

    

    （ｃ）中間体４を、メタンスルホニルクロリドと反応させて、式（Ａ１）の化合物を得るステップと、を含む、プロセス。

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