JP6499165B2 - 二重選択的pi3デルタ及びガンマキナーゼ阻害剤 - Google Patents
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Description
(RS)−2−(1−(9H−プリン−6−イルアミノ)プロピル)−3−(3−フルオロフェニル)−4H−クロメン−4−オン。(化合物A)
(S)−2−(1−(9H−プリン−6−イルアミノ)プロピル)−3−(3−フルオロフェニル)−4H−クロメン−4−オン。(化合物A1)
(R)−2−(1−(9H−プリン−6−イルアミノ)プロピル)−3−(3−フルオロフェニル)−4H−クロメン−4−オン。(化合物A2)
本発明は、本発明の1つ以上の化合物及び1つ以上の薬学的に許容される担体または賦形剤を含む薬学的組成物を提供する。一実施形態において、薬学的組成物は、治療有効量の本発明の化合物を含む。薬学的組成物は、本明細書に記載されるような1つ以上の更なる活性成分を含み得る。
投与される化合物の量は、治療される哺乳動物、障害または病態の重症度、投与速度、化合物の処分、及び処方する医師の裁量に依存する。しかしながら、有効投与量は、単回用量または分割用量で、1日に体重1kg当たり約0.001〜約100mg、好ましくは約1〜約35mg/kg/日の範囲内である。70kgのヒトにおいて、これは約0.05〜7g/日、好ましくは約0.05〜約2.5g/日に達する。本発明の化合物の有効量は、単回用量または複数用量(例えば、1日2回または3回)で投与され得る。
以下に提供される実施例及び調製物は、本発明の化合物及びそのような化合物を調製する方法を更に例証及び図示する。本発明の範囲は、以下の実施例及び調製物の範囲によって決して限定されないことが理解されるべきである。以下の実施例において、別段記述されない限り、単一キラル中心を有する分子はラセミ混合物として存在する。別段記述されない限り、2つ以上のキラル中心を有するこれらの分子はジアステレオマーのラセミ混合物として存在する。単一エナンチオマー/ジアステレオマーは、当該技術分野において既知である方法によって取得され得る。
中間体
中間体1:3−(3−フルオロフェニル)−2−(1−ヒドロキシプロピル)−4H−クロメン−4−オン:DMSO(85ml)中、2−(1−ブロモプロピル)−3−(3−フルオロフェニル)−4H−クロメン−4−オン1(8.80g、24.36mmol)の溶液に、n−ブタノール(5ml)を添加し、120℃まで3時間加熱した。反応混合物を、室温(RT)まで冷却し、水で急冷し、酢酸エチルで抽出した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。酢酸エチル:石油エーテルを有するカラムクロマトグラフィーによって粗生成物を精製し、表題の化合物を黄色固体(2.10g、29%)として得て、これを更に精製せずに次のステップにおいて使用した。
中間体2:3−(3−フルオロフェニル)−2−プロピオニル−4H−クロメン−4−オン:DMSO(1.90ml、26.82mmol)をジクロロメタン(70ml)に添加し、−78℃まで冷却した。その後、塩化オキサリル(1.14ml、13.41mmol)を添加した。10分後、ジクロロメタン(20ml)中、中間体1(2.00g、6.70mmol)を液加し、20分間撹拌した。トリエチルアミン(7ml)を添加し、1時間撹拌した。反応混合物を、水で急冷し、ジクロロメタンで抽出した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。酢酸エチル:石油エーテルを有するカラムクロマトグラフィーによって粗生成物を精製し、表題の化合物を黄色液体(1.20g、60%)として得て、これを次のステップにおいて使用した。
中間体3:(+)/(−)−3−(3−フルオロフェニル)−2−(1−ヒドロキシプロピル)−4H−クロメン−4−オン:窒素パージ下、DMF(7.65ml)中、中間体2(0.600g、2.20mmol)の溶液に、ギ酸:トリエチルアミン5:2共沸混合物(1.80ml)を添加し、[(S,S)tethTsDpenRuCl](3.0mg)を続けた。反応混合物を、連続的な窒素パージ下、80℃で1.5時間加熱した。反応混合物を、水で急冷し、酢酸エチルで抽出し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮した。酢酸エチル:石油エーテルを有するカラムクロマトグラフィーによって粗生成物を精製し、表題の化合物を黄色固体(0.450g、74%)として得た。質量:299.0(M+)。鏡像体過剰率:78%、Chiralpak AD−Hカラム上、HPLCによって決定される遅く溶出する異性体(保持時間:9.72分)において濃縮する。
中間体4:(+)/(−)−3−(3−フルオロフェニル)−2−(1−ヒドロキシプロピル)−4H−クロメン−4−オン:中間体3について記載されたものと同様の手順を使用することによって、中間体2(0.600g、2.02mmol)、DMF(7.65ml)、ギ酸:トリエチルアミン5:2共沸混合物(1.80ml)、及び[(R,R)tethTsDpenRuCl](3.0mg)を使用して、表題の化合物を黄色固体(0.600g、2.02mmol)として取得した。質量:298.9(M+)。鏡像体過剰率:74.8%、Chiralpak AD−Hカラム上、HPLCによって決定される速く溶出する異性体(保持時間:8.52分)において濃縮する。
中間体5:(R)−3−(3−フルオロフェニル)−2−(1−ヒドロキシプロピル)−4H−クロメン−4−オン:
ステップ1:(R)−2−(1−(ベンジルオキシ)プロピル)−3−(3−フルオロフェニル)−4H−クロメン−4−オン:ジクロロメタン(20ml)中、2−(3−フルオロフェニル)−1−(2−ヒドロキシフェニル)エタノン(2.15g、9.36mmol)に、HATU(4.27g、11.23mmol)、R−(+)2−酪酸ベンジルオキシ(2.00g、10.29mmol)を添加し、10分間撹拌し、その後トリエチルアミン(14.0ml101.1mmol)を液加し、室温で24時間撹拌した。反応混合物を、水で急冷し、ジクロロメタンで抽出し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。酢酸エチル:石油エーテルを有するカラムクロマトグラフィーによって粗生成物を精製し、表題の化合物を黄色固体(1.65g、45%)として得た。1H−nMR(δppm、CDCl3、400MHz):8.24(dd,J=7.9、1.5Hz、1H)、7.74(dt,J=7.1、1.7Hz、1H)、7.58(dd,J=8.3、0.4Hz、1H)、7.44−7.06(m,10H)、4.51(d,J=7.8Hz、1H)、4.34(d,J=7.8Hz、1H)、4.25(dd,J=7.8、6.2Hz、1H)、2.17−1.90(m,2H)、0.95(t,J=7.5Hz、3H)。質量:389.0(M+)。
ステップ2:(R)−3−(3−フルオロフェニル)−2−(1−ヒドロキシプロピル)−4H−クロメン−4−オン:0℃に冷却したジクロロメタン(15ml)中、(R)−2−(1−(ベンジルオキシ)プロピル)−3−(3−フルオロフェニル)−4H−クロメン−4−オン(1.50g、3.86mmol)に、塩化アルミニウム(1.00g、7.72mmol)を液加し、室温で6時間撹拌した。反応混合物を、2N HCl溶液で急冷し、ジクロロメタンで抽出し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。酢酸エチル:石油エーテルを有するカラムクロマトグラフィーによって粗生成物をを精製し、表題の化合物を黄色固体(0.552g、48%)として得た。1H−NMR(δppm、CDCl3、400MHz):.8.24(dd,J=8.0、1.6Hz、1H)、7.72(m,,1H)、7.52(dd,J=8.4、0.5Hz、1H)、7.44(m,2H)、7.12−7.01(m,3H)、4.49(t,J=7.0Hz、1H)、1.94(m,2H)、0.93(t,J=7.5Hz、3H)。質量:(299.0(M+)。純度:96.93%。[α]25 D−14.73(c=CHCl3)。鏡像体過剰率:85.92%、Chiralpak AS−3Rカラム上、カラムHPLCによって決定される速く溶出する異性体(保持時間:8.57分)において濃縮する。
化合物A
(RS)−2−(1−(9H−プリン−6−イルアミノ)プロピル)−3−(3−フルオロフェニル)−4H−クロメン−4−オン
THF(25ml)中、中間体1(2.50g、8.41mmol)の溶液に、tert−ブチル9−トリチル−9H−プリン−6−カルバミン酸イル(4.81g、10.09mmol)及びトリフェニルホスフィン(3.31g、12.62mmol)を添加し、室温で5分間撹拌した。アゾジカルボン酸ジイソプロピル(2.5ml、12.62mmol)を添加し、室温で2時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、酢酸エチル:石油エーテルとともにカラムクロマトグラフし、黄色の中間体として得た。中間体に、ジクロロメタン(65ml)及びトリフルオロ酢酸(9.9ml)を添加し、得られた混合物を室温で12時間撹拌した。その後、反応混合物を、水溶性重炭酸ナトリウム溶液で塩基化し、ジクロロメタンで抽出し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。メタノール:ジクロロメタンを有するカラムクロマトグラフィーによって粗生成物を精製し、表題の化合物を淡褐色固体(1.05g、30%)として得た。MP:148〜150℃。質量:415.6(M+)。
化合物A1
(S)−2−(1−(9H−プリン−6−イルアミノ)プロピル)−3−(3−フルオロフェニル)−4H−クロメン−4−オン
方法A:THF(5ml)中、中間体3(0.250g、0.838mmol)の溶液に、tert−ブチル9−トリチル−9H−プリン−6−カルバミン酸イル(0.479g、1.00mmol)及びトリフェニルホスフィン(0.329g、1.25mmol)を添加し、得られた混合物を室温で5分間撹拌した。その後、アゾジカルボン酸ジイソプロピル(0.25ml、1.25mmol)を添加し、室温で12時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、酢酸エチル:石油エーテルとともにカラムクロマトグラフし、黄色の中間体として得た。ジクロロメタン(6ml)中、中間体に、トリフルオロ酢酸(1.2ml)を添加し、室温で12時間撹拌した。反応混合物を、水溶性重炭酸ナトリウム溶液で塩基化し、ジクロロメタンで抽出し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。メタノール:ジクロロメタンを有するカラムクロマトグラフィーによって粗生成物を精製し、表題の化合物を灰白色固体(0.015g、4%)として得た。MP:137〜140℃.1H−NMR(δppm、DMSO−d6、400MHz):12.94(s,1H)、8.12−8.10(m,4H)、7.84−7.80(m,1H)、7.61(d,J=8.3Hz、1H)、7.50−7.41(m,2H)、7.28−7.18(m,3H)、5.20−5.06(m,1H)、2.10−1.90(m,2H)、0.84(t,J=3.7Hz、3H)。鏡像体過剰率:77.4%、Chiralpak AD−Hカラム上、HPLCによって決定され、速く溶出する異性体(保持時間:7.90分)において濃縮する。
方法B:THF(52ml)中、中間体5(2.60g、8.68mmol)の溶液に、tert−ブチル9−トリチル−9H−プリン−6−カルバミン酸イル(4.96g、10.42mmol)及びトリフェニルホスフィン(2.76g、13.03mmol)を添加し、得られた混合物を室温で5分間撹拌した。その後、アゾジカルボン酸ジイソプロピル(0.25ml、1.25mmol)を添加し、室温で12時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、酢酸エチル:石油エーテルとともにカラムクロマトグラフし、黄色の中間体として得た。ジクロロメタン(55ml)中、中間体に、トリフルオロ酢酸(14.2ml)を添加し、室温で12時間撹拌した。反応混合物を、水溶性重炭酸ナトリウム溶液で塩基化し、ジクロロメタンで抽出し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。メタノール:ジクロロメタンを有するカラムクロマトグラフィーによって粗生成物を精製し、表題の化合物を淡黄色固体(1.00g、27%)として得た。MP:168〜170℃。質量:416.5(M++1)鏡像体過剰率:86.5%、Chiralpak AD−Hカラム上、HPLCによって決定され、速く溶出する異性体(保持時間:7.90分)において濃縮する。
方法C:メタノール:CO2(35:65)を80g/分の流量の移動相として使用して、Chiralpak AY−Hカラム(250×30mm、5μM)上、調製用SFC条件によって、化合物A(1.090g)から表題の化合物を分離した。灰白色固体(0.378g)。鏡像体過剰100%。Rt:2.37分。質量:416.1(M++1)。MP:149〜152℃。
化合物A2
(R)−2−(1−(9H−プリン−6−イルアミノ)プロピル)−3−(3−フルオロフェニル)−4H−クロメン−4−オン
方法A:tert−ブチル9−トリチル−9H−プリン−6−カルバミン酸イル(0.479g、1.00mmol)、中間体4(0.250g、0.838mmol)、トリフェニルホスフィン(0.329g、1.25mmol)、THF(5ml)、及びアゾジカルボン酸ジイソプロピル(0.25ml、1.25mmol)を使用する、化合物A1について記載された手順(方法A)と同様の手順を使用することによって、表題の化合物を灰白色固体(0.015g、4%)として取得し、トリフルオロ酢酸(1.2ml)及びジクロロメタン(6ml)で中間体の切断を続けた。MP:139〜141℃。質量:415.6(M+)。鏡像体過剰率:81.6%、Chiralpak AD−Hカラム上、HPLCによって決定され、遅く溶出する異性体(保持時間:10.81分)において濃縮する。
方法B:メタノール:CO2(35:65)を80g/分の流量の移動相として使用して、Chiralpak AY−Hカラム(250×30mm、5μM)上、調製用SFC条件によって、化合物A(1.090g)から表題の化合物を分離した。灰白色固体(0.434g)。鏡像体過剰98%。Rt:3.71分。質量:416.1(M++1)。MP:162〜164℃。
本明細書に記載される化合物の薬理的特性は、いくつかの薬理的アッセイによって確認され得る。本発明に従う化合物及び/またはそれらの薬学的に許容される塩とともに実施された薬理的アッセイは、以下に例証される。
ホスホイノシチド3キナーゼ(PI3K)は、いくつかの重要な細胞プロセスの制御において重要な役割を果たす、脂質キナーゼのクラスに属する。PI3Kは、ホスホイノシトールの3−ヒドロキシ位置をリン酸化し、これにより下流シグナル伝達事象に関与するセカンドメッセンジャーを産生することができる。均一時間分解蛍光(HTRF)アッセイは、α、β、γ、またはδ等のPI3Kアイソフォームによるホスホチジルイノシトール4,5−二リン酸(PIP2)のリン酸化の結果として形成される、3,4,5−三リン酸エステル(PIP3)の検出を可能にする。
10%のFBS補足培地を使用して、増殖阻害アッセイを実施した。96ウェルプレート内に5000〜20,000個の細胞/ウェルの濃度で、細胞を播種した。0.01〜10000nMの濃度範囲の試験化合物を、24時間後に添加した。0時間(試験化合物の添加前)及び試験化合物の添加の72時間後で、3−[4,5−ジメチルチアゾール−2−イル]−2,5−臭化ジフェニルテトラゾリウム(MTT)色素還元試験を使用して、増殖を評価した。450nmの波長で、Fluostar Optima(BMG Labtech,Germany)上で吸光度を読み取った。GraphPad Prismを使用してデータを分析し、対照と比較した、試験化合物による阻害パーセントをそれに従って計算した。
MOLT−4、Jurkat、CCRF−CEM、Hut−78、HuT−102、Sez4、及びHH細胞を所望の濃度の化合物とともに48時間インキュベートした。細胞を溶解させ、ウェスタンブロットによってpAKT決定した。ImageJを使用してバンドを定量化し、アクチンに正規化した。
抗FcεR1またはfMLP誘導CD63発現の変化によって明示される、好塩基球におけるPI3Kδ及びγシグナル伝達は、Flow2CAST(登録商標)キット(Buhlmann Laboratories,Switzerland)を使用して決定される、有用な薬力学的標識である。簡潔には、それは以下のステップを伴う。
●静脈穿刺管を何回か反転させることによって、抗凝血血液試料を混合する、
●フローサイトメトリー測定に好適な、新しくかつ発熱物質を含まない3.5mlのポリプロピレンまたはポリスチレン管を調製する、
●49μlの患者の全血を各管に添加する、
●1μlの10%のDMSO(バックグラウンド)または化合物(10%のDMSO)を指定された管に添加し、穏やかに混合する、室温で15分間インキュベートする、
●50μlの刺激緩衝剤(バックグラウンド)あるいは抗FcεRI AbまたはfMLPを各管にピペッティングする、
●100μlの刺激緩衝剤を各管に添加する、
●穏やかに混合する、20μlの染色試薬(FITC−CD63及びPE−CCR3の1:1混合物)を各管に添加する、
●穏やかに混合し、管を覆い、水浴中37℃で15分間インキュベートする、(インキュベーターを使用すると、より効率的でない熱伝達のために、約10分間長いインキュベーション時間がかかる)
●2mlの余熱(18〜28℃)した溶解試薬を各管に添加し、穏やかに混合する、
●18〜28℃で5〜10分間インキュベートする、
●500×gで管を5分間遠心分離する、
●ブロッティング紙を使用することによって、上清を傾瀉する、
●300〜800μlの洗浄緩衝剤で細胞ペレットを再懸濁する、及び
●穏やかにボルテックスし、同一日内にフローサイトメーター上でデータを取得する。
アッセイ4A1:(PI3Kδ選択性のための)抗IgM誘導B細胞増殖
本研究の目的は、抗IgM誘導ヒトB細胞増殖に対する、化合物A1の阻害潜在力を評価することであった。
プレーティング及び処理
●単離したB細胞を1ml当たり1.0×106個の細胞に再懸濁した。100μlの細胞懸濁液を96ウェルプレートの各ウェルに添加した。3連を維持した。
●50μlの薬物希釈液を添加し、よく混合した。DMSOブランク及び誘導因子ブランクを維持した。
●処理したプレートを、37℃、5%CO2で30分間インキュベートし、その後50μlの4×誘導因子を添加し、ピペッティングによって混合した。
●プレートを、37℃、5%CO2で72時間インキュベートした。
●培地を吸引し、150μlのDMSOを添加して、ホルマザン結晶を溶解させた。
●A560及びA640nmで吸光度を読み取った。
本研究の目的は、3T3線維芽細胞におけるPI3Kβキナーゼ媒介LPA誘導AktS473リン酸化に対する化合物A1の効果を決定することであった。
●3T3細胞を所望の濃度の試験化合物で15分間処理した。最終濃度が5μMであるように、1mlの2×LPAを添加し、5分間インキュベートした。
●培地を処分し、1mlの氷冷1×PBSで洗浄した。
●250μlの細胞溶解緩衝剤を添加し、氷上で30分間インキュベートした。
●試料を遠心分離し、上清は分析まで−80℃であった。
●pAKT(S473)を一次抗体として、及び抗ウサギIgG−HRPを二次抗体として使用するウェスタンブロットによって試料を分析した。
●ImageJ1.42q(NIH,USA)を使用して、バンドの強度を決定し、アクチン(負荷対照)に正規化した。GraphPad Prism(Version5.02)を使用して、データをプロットした。
本研究の目的は、RAW264.7マクロファージにおけるPI3Kγキナーゼ媒介c5a誘導AktS473リン酸化に対する化合物A1の効果を決定することであった。
●RAW264.7細胞を所望の濃度の試験化合物で15分間処理した。最終濃度が50ng/mlであるように、1mlの2×c5aを添加し、15分間インキュベートした。
●培地を処分し、1mlの氷冷1×PBSで洗浄した。
●250μlの細胞溶解緩衝剤を添加し、氷上で30分間インキュベートした。
●試料を遠心分離し、上清を分析まで−80℃で保管した。
●pAKT(S473)を一次抗体として、及び抗ウサギIgG−HRPを二次抗体として使用するウェスタンブロットによって試料を分析した。
●ImageJ1.42q(NIH,USA)を使用して、バンドの強度を決定し、アクチン(負荷対照)に正規化した。GraphPad Prism(Version5.02)を使用して、データをプロットした。
本研究の目的は、PDGF誘導3T3線維芽細胞におけるPI3Kαキナーゼ媒介AktS473リン酸化に対する化合物A1の効果を決定することであった。
●3T3細胞を所望の濃度の試験化合物で15分間処理した。最終濃度が20ng/mlであるように、1mlの2×PDGFを添加し、10分間インキュベートした。
●培地を処分し、1mlの氷冷1×PBSで洗浄した。
●250μlの細胞溶解緩衝剤を添加し、氷上で30分間インキュベートした。
●試料を遠心分離し、上清を収集し、分析まで−80℃で保管した。
●pAKT(S473)を一次抗体として、及び抗ウサギIgG−HRPを二次抗体として使用するウェスタンブロットによって試料を分析した。
●ImageJ1.42q(NIH,USA)を使用して、バンドの強度を決定し、アクチン(負荷対照)に正規化した。GraphPad Prism(Version5.02)を使用して、データをプロットした。
以下に概要を述べるように、in−situ Caspase3キット(Millipore,US)を使用して、白血病細胞におけるアポトーシスを決定した。
●6ウェルプレート内に1×106個の細胞/ウェルの密度で、白血病細胞を播種する
●所望の濃度の試験化合物/DMSOを添加する
●プレートを、5%CO2インキュベーター内で、37℃で24時間インキュベートする
●2mlの遠心分離管内に細胞を収集する
●1.6μlの新しく調製された5×FLICA試薬を添加し、管をわずかに弾くことによって、細胞を混合する
●5%CO2下、37℃で管を1時間インキュベートする
●2mlの1×洗浄緩衝剤を各管に添加し、混合する
●細胞を、<400×g、室温で5分間遠心分離する。
●上清を慎重に除去及び処分し、細胞ペレットを穏やかにボルテックスして、いかなる細胞間凝集塊も破壊する。
●300ulの1×洗浄緩衝剤中で細胞ペレットを再懸濁する
●100μlの各細胞懸濁液を、黒色マイクロタイタープレートの2つのウェルのそれぞれの中に定置する。気泡の形成を避ける。
●490nMの励起波長及び520nMの放出波長を使用して、各マイクロウェルの吸光度を読み取る
●対照ブランクと比較した、蛍光における増大によって明示される、カスパーゼ−3活性における増大パーセントを計算する。
pAKT阻害のフローサイトメトリー分析:精製された悪性T細胞をドナーから単離し、RPMI/1%BSA内で一晩培養した。細胞を、試験化合物とともに1.5時間インキュベートし、最後の30分間にサイトカイン混合物を添加した。サイトカイン混合物の組成物は、20ng/mlのIL2+5ng/mlのIL7+10ng/mlのIL15+10%FBSであった。フローサイトメトリーによって、AKTリン酸化を決定した。
一般的に>97%のB細胞/CLL細胞の純度を生じる、Stem Cell TechnologyからのRosette−Sep B細胞を使用して、一次CLL細胞を濃縮した。細胞を、所望の濃度の試験化合物の存在下、無血清培地(SFM)またはSFM+10%の熱非活性ウシ胎児血清(体積100マイクロリットル)のいずれかを有する96ウェル内に1ウェル当たり、2.5×105個で播種し、二酸化炭素インキュベーター内で、37℃で3日間培養した。MTSアッセイを使用して、細胞毒性を決定した。
リンパ球系腫瘍からの一次細胞を、試験化合物[化合物A1]に暴露して、細胞死の誘導を評価した。細胞は、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)、マントル細胞リンパ腫(MCL)、脾性辺縁帯リンパ腫(SMZL)、節外性辺縁帯B細胞リンパ腫(EMZL)、または慢性リンパ球性白血病(CLL、no.=1)に由来した。細胞を、所望の濃度の化合物で処理し、48時間のインキュベーション期間の後、フローサイトメトリーによってアポトーシス(アネキシンV/PI)を評価した。
LY−1、LY−10、Daudi、JEKO、REC、及びMAVER細胞を、所望の濃度の[化合物A1]とともに48時間インキュベートした。細胞を溶解させ、ウェスタンブロットによってpAKTを決定した。ImageJを使用してバンドを定量化し、アクチンに正規化した。
本研究の目的は、抗ヒトCD3/CD28同時刺激一次T細胞によって生成されるサイトカインに対する、化合物A1の阻害潜在力を評価することであった。
プレーティング及び処理
●プレートを、100ng/mlの濃度の50μlの抗ヒトCD3で、4℃で一晩または37℃で2時間のいずれかでコーティングした。インキュベーション後、無菌PBSでプレートを2回洗浄して、未結合の抗体を除去した。
●単離ヒトT細胞を、1.5mlの管中、1ml当たり0.625×106個の細胞に再懸濁し、1μlの薬物希釈液(1000×)を添加した。DMSOブランク及び未誘導ブランクを維持した。
●細胞を、化合物とともに室温で30分間インキュベートし、それぞれ240μlの96ウェルプレートの、抗ヒトCD3をコーティングしたウェルに添加した。1ウェル当たり10μl(25×)で抗ヒトCD28を直ちに添加した。
●プレートを、37℃、5%CO2で24時間インキュベートした。
●プレートを4000rpm、室温で遠心分離し、上清を収集し、−20℃で保管した。
●商業的ELISAキットを使用して、吸光度を450nM及び570nMで読み取って、サイトカインを決定した。
過剰動員及びそれに続く好中球の活性化は、重度の喘息、慢性閉塞性肺疾患、嚢胞性線維症、及び急性呼吸促迫症候群等の、気道及び肺におけるいくつかの炎症性疾患の発症及び経過にとって重要である可能性が高い。好中球がこれらの疾患に寄与する機序は、好中球エラスターゼ等のタンパク質分解酵素、及び酸素フリーラジカルの放出に関与し得る。これらの化合物は、放出されると、気道において気管支収縮、気管支過敏症、分泌過多、上皮損傷、及び組織のリモデリングを引き起こす可能性がある。
白血球動員、及び異なるサイトカインを含む炎症促進性媒介物の形成が、炎症反応の特質である。空気嚢モデルは、リウマチ性関節炎(RA)において発生する炎症性プロセスの研究のために、最初に模倣滑膜として開発された。モデルは、空気嚢壁(組織)内に蓄積する白血球種、及び空気嚢腔(肺胞)内に遊出する白血球種の分画定量を可能にし、それは、様々な炎症性刺激によって誘導される血管外漏出に対して反応性の、ケモカイン及び接着分子の特徴付けを可能にする。
絶食時の雌のウィスターラットを、それらの体重に応じて異なる群にランダム化した。0.5%のメチルセルロースからなるビヒクル中の懸濁液として試験化合物(化合物A1)を調製した。体積10mL/kgの強制経口投与によって化合物またはビヒクルを投与した。0.3mg/kgの用量での化合物投与の1時間後に、LPS溶液を腹腔内投与した。LPS注入の90分後に、心臓穿刺によって血清分離管内に血液を収集した。血清を分離し、−20℃で保管し、ELISAによってTNFαについて分析する。
気道炎症及び気道過敏性(AHR)は、気管支炎の特質であり、際立った特徴である。同一のアレルゲンを有する事前感作されたマウスの誘発は、優先的好酸球性浸潤を有する気道炎症、結果として、AHRを誘導する。気道音の変更された神経系細胞の制御、及び気道上皮剥離との組み合わせでの肺好酸球増多症及び気道の再モデル化は、喘息におけるAHRに寄与し得る。
気道炎症及び気道過敏性(AHR)は、気管支炎の特質であり、際立った特徴である。同一のアレルゲンを有する事前感作されたマウスの誘発は、優先的好酸球性浸潤を有する気道炎症、結果として、AHRを誘導する。気道音の変更された神経系細胞の制御、及び気道上皮剥離との組み合わせでの肺好酸球増多症及び気道の再モデル化は、喘息におけるAHRに寄与し得る。隔離期間後、それらの体重に基づいて、マウスをランダム化し、4つの群に分けた(n=7)。同定のために、難消標識ペンで尾を標識化した。0日目に、重量を記録し、100μgの卵白アルブミン及び10mgのミョウバン溶液(0.2mL)で動物を腹腔内に感作させた。7日目及び14日目に、上記の感作手順を反復した。疾病または感作に対する反応のあらゆる徴候について、24日目まで動物を観察し、もしあれば記録した。24、25、及び26日目に、強制経口投与による試験化合物での処理後、30分後に動物を10%w/vの卵白アルブミン負荷に暴露した。対照及び偽群の動物を、0.5%w/vのメチルセルロース(ビヒクル)で処理した。偽対照群を、0、7、及び14日目に10mgのミョウバンで感作させ、24、25、及び26日目に同一の噴霧速度で食塩水溶液に暴露した。OVA負荷の48時間後、メタコリン負荷の累積用量(2.5、10、50、及び100mg/ml)に対する全身プレチスモグラフによって気道過敏性を測定し、気道反応を測定した後、血液試料及びBAL液を収集した。顕微鏡下で、ノイバウアー室を使用することによって総細胞数について試料を分析し、白血球分画の計数を手動で行った。図5A及び5Bに図示するように、3mg/kgの用量の化合物A1は、卵白アルブミン感作されたマウスのメタコリン負荷に対する気道過敏性において、有意な減少を引き起こした。
雌のウィスターラットを、実験の開始前に7日間気候順応させ、それらの体重に基づいて様々な群にランダムに割り付けた。0日目に、尾の付け根で送達される、MTB(4mg/mL)を含有する完全なフロイントアジュバント(IFA)で乳化させた、500μgのウシコラーゲンII型の皮内注入によって動物を処理した。7日目の一次免疫化の後、尾の付け根での皮内注入による、不完全なフロイントアジュバント中、300μgのCIIの追加免疫注入によって動物を処理した。足首の関節における関節炎の発現は、通常12〜14日目の間に視覚的に明らかになった。関節炎の発現後の日から実験の終了(28日目)まで、治療群として試験化合物またはビヒクル(経口投与)で、動物を処理した。研究期間中にわたって定期的に、関節炎の徴候について視覚的検査によって関節炎点数を取得した。体重及び足の体積、足の厚さを、0、3、7、10、12、14、17、21、24、及び28日目に取得した。28日目、研究の終了時に、剖検で血液を回収し、血清または血漿に処理し、全ての関節を取得し、組織の小片を各関節から取得した後、病理組織学的分析のために前足及び後足の両方を10%のホルマリン内に固定し、組織ホモジネート内のサイトカイン分析のために−80℃で保管した。前足及び後足の臨床点数化判断基準は、0=正常、1=1つの後足または前足の関節に発症、もしくは最小のびまん性紅斑、及び腫脹、2=2つの後足または前足の関節に発症、もしくは中度のびまん性紅斑、及び腫脹、3=3つの後足または前足の関節に発症、もしくは最小のびまん性紅斑、及び腫脹、4=4つの指関節に発症、5=足全体に重度のびまん性紅斑及び重度の腫脹、指を曲げることができない、である。
動物(雄のBalb/cマウス)を、実験の開始前に7日間気候順応させた。動物をそれらの体重に基づいて様々な群にランダムに割り付ける。1日目に、経口/鼻腔内経路によって、試験化合物またはビヒクルをマウスに投与し、試験化合物投与の1時間後に、動物をエーテルで麻酔し、50μl/マウスの体積のタバコ煙抽出物を、鼻腔内経路によって投与し、4日間(1日目〜4日目)の試験化合物投与の後、毎日動物に対するCSE暴露を反復する。5日目、最終CSE暴露の24時間後に、動物を麻酔下で失血させ、気管にカニューレを挿入し、ヘパリン処理したPBS(1ユニット/ml)の0.5mlのアリコートで気管カニューレを通して4回肺を洗浄した(総体積2ml)。BALは、総細胞数及び白血球分画数についてアッセイするまで2〜8℃で保管した。気管支肺胞液を遠心分離し(500×gで10分間)、得られた細胞ペレットをヘパリン処理した0.5mlの食塩水に再懸濁しなくてはならない。血液細胞計数器を使用してBAL液及び血液中の白血球の総数を決定し、1×106個の細胞/mlに調節した。細胞分画数を手動で計算する。サイトスピン3を使用して40マイクロリットルの細胞懸濁液を遠心分離して、細胞スメアを調製する。細胞スメアを鑑別用血液染色液で染色し、好酸球をその形態学的特徴に従って同定するために、顕微鏡的に観察しなくてはならない。細胞スメア中の300個の白血球の間で各細胞型の数を決定し、パーセンテージとして表し、各BALf中の好中球及びマクロファージの数を計算する。
動物(雄のBalb/cマウス)を、実験の開始前に7日間気候順応させた。動物をそれらの体重に基づいて様々な群にランダムに割り付ける。1日目に、動物をエーテルで麻酔し、50μl/マウスの体積のタバコ煙抽出物を、鼻腔内経路によって投与し、8日間(1日目〜8日目)毎日動物に対するCSE暴露を反復する。9日目に、経口/鼻腔内経路によって、試験化合物またはビヒクルをマウスに投与し、試験化合物投与の1時間後に、動物をエーテルで麻酔し、50μl/マウスの体積のタバコ煙抽出物を、鼻腔内経路によって投与し、その後の3日間(9日目〜11日目)の試験化合物投与の後、毎日動物をCSEに対して暴露し、12日目、最終CSE暴露の24時間後に、動物を麻酔下で失血させ、気管にカニューレを挿入し、ヘパリン処理したPBS(1ユニット/ml)の0.5mlのアリコートで気管カニューレを通して4回肺を洗浄する(総体積2ml)。BALは、総細胞数及び白血球分画数についてアッセイするまで2〜8℃で保管した。気管支肺胞液を遠心分離し(500×gで10分間)、得られた細胞ペレットをヘパリン処理した0.5mlの食塩水に再懸濁する。血液細胞計数器を使用してBAL液及び血液中の白血球の総数を決定し、1×106個の細胞/mlに調節する。細胞分画数を手動で計算した。サイトスピン3を使用して40マイクロリットルの細胞懸濁液を遠心分離して、細胞スメアを調製する。細胞スメアを鑑別用血液染色液で染色し、顕微鏡的に観察して、好酸球をその形態学的特徴に従って同定する。細胞スメア中の300個の白血球の間で各細胞型の数を決定し、パーセンテージとして表さなくてはならず、各BALf中の好中球及びマクロファージの数を計算する。
雌のBalb/cマウスを、実験の開始前に7日間気候順応させた。その後、動物をそれらの体重に基づいて様々な群にランダムに割り付ける。1日目に、動物をエーテルで麻酔し、50μl/マウスの体積のタバコ煙抽出物を、鼻腔内経路によって投与し、その後の5日間(1日目〜6日目)毎日動物をCSEに暴露する。7日目に、経口/鼻腔内経路によって、10mg/kgのデキサメタゾンを強制経口投与によってマウスに投与し、60分後、鼻腔内経路によってCSEをマウスに投与し、これをその後の4日間(7日目〜11日目)反復しなければならない。9日目〜11日目まで、経口/鼻腔内経路によって、試験化合物またはビヒクルを動物に投与し、デキサメタゾン投与の30分後に、30分後に、動物をエーテルで麻酔し、50μl/マウスの体積のタバコ煙抽出物を、鼻腔内経路によって投与し、その後の2日間(すなわち、9日目〜11日目)の試験化合物投与の後、毎日動物をCSEに対して暴露し、12日目、最終CSE暴露の24時間後に、動物を麻酔下で失血させ、気管にカニューレを挿入し、ヘパリン処理したPBS(1ユニット/ml)の0.5mlのアリコートで気管カニューレを通して4回肺を洗浄する(総体積2ml)。BALは、総細胞数及び白血球分画数についてアッセイするまで2〜8℃で保管しなければならない。気管支肺胞液を遠心分離し(500×gで10分間)、得られた細胞ペレットをヘパリン処理した0.5mlの食塩水に再懸濁しなくてはならない。血液細胞計数器を使用してBAL液及び血液中の白血球の総数を決定し、1×106個の細胞/mlに調節した。細胞分画数を手動で計算する。サイトスピン3を使用して40マイクロリットルの細胞懸濁液を遠心分離して、細胞スメアを調製する。細胞スメアを鑑別用血液染色液で染色し、好酸球をその形態学的特徴に従って同定するために、顕微鏡的に観察しなくてはならない。細胞スメア中の300個の白血球の間で各細胞型の数を決定してパーセンテージとして表し、各BAL液中の好中球及びマクロファージの数を計算する。
動物(雄のBalb/cマウス)を、実験の開始前に7日間気候順応させた。その後、動物をそれらの体重に基づいて様々な群にランダムに割り付ける。1日目に、経口/鼻腔内経路によって、試験化合物またはビヒクルをマウスに投与し、試験化合物投与の1時間後、動物を全身曝露用ボックスに定置する。1日目及び2日目に6本、3日目に8本、4日目に10本のタバコの主流煙にマウスを曝露する。各タバコの煙への曝露を10分間継続し(最初の2分間でタバコを完全に燃やした後、動物用換気装置を用いて気流を発生させた)、次の20分間は室内の新鮮な空気に曝露する。2本のタバコごとに室内の新鮮な空気に曝露することで更に20分間休憩させる。対照動物は、室内空気室に曝露する。1日目〜4日目まで、経口経路または鼻腔内経路により動物に試験化合物を投与する。5日目に、最後のタバコ煙(CS)曝露の24時間後に、動物を麻酔下で失血させ、気管にカニューレを挿入し、ヘパリン処理したPBS(1ユニット/ml)の0.5mlアリコートで気管カニューレを通して4回肺を洗浄する(総体積2ml)。採取した気管支肺胞洗浄液(BAL)は、総細胞数及び白血球分画数についてアッセイするまで2〜8℃で保存する。BAL液を遠心分離し(500×gで10分間)、得られた細胞ペレットをヘパリン処理した0.5mlの食塩水に再懸濁する。血液細胞計数器を使用してBAL液及び血液中の白血球の総数を決定し、1×106個の細胞/mlに調節した。細胞分画数を手動で計算する。サイトスピン3を使用して40マイクロリットルの細胞懸濁液を遠心分離して、細胞スメアを調製する。細胞スメアを鑑別用血液染色液で染色し、顕微鏡的に観察して、好酸球をその形態学的特徴に従って同定する。細胞スメア中の300個の白血球の間で各細胞型の数を決定してパーセンテージとして表し、各BAL液中の好中球及びマクロファージの数を計算する。
結果:図7A及び7Bに図示するように、化合物A1は、マクロファージ及びBALFへの好中球浸潤を減少させ、これにより慢性閉塞性肺疾患における治療的役割を示す。
動物(マウス)を、実験の開始前に7日間気候順応させる。その後、動物をそれらの体重に基づいて様々な群にランダムに割り付ける。1及び5日目に、動物をOVA(40μg/kg腹腔内)で免疫化する。鼻内の局所炎症反応を誘発するために、12〜19日目に、マウスをOVA(食塩水中3%のOVA)で鼻腔内に繰り返し負荷(1つの鼻孔当たり10μl)する。19日目、最終OVA負荷の開始前に、非絶食時のマウスに、ビヒクルまたは試験化合物のいずれかを鼻腔内(1つの鼻孔当たり10μl)に投薬する。2時間後、各動物に、最終鼻腔内OVA(3%)負荷を受けさせる。更に8時間後、各動物を麻酔し、後鼻孔前の約1mmの位置に伸長する、吻側移植した気管カニューレによって、mlのPBSを後鼻孔内に滴下注入することによって鼻洗浄を実施する。この手順は、約2mlの洗浄液の収率を生じさせるために反復しなければならない。鼻洗浄液試料中の総細胞数を、血球計算器を使用して測定する。室温、1200rpmで2分間遠心分離することによって、鼻洗浄液試料のサイトスピンスメアを調製し、細胞分画数のために、Diff−Quik染色システム(Dade Behring)を使用して染色する。油浸顕微鏡を使用して細胞を計数する。
特異的病原体を含まないA/Jマウス(雄、生後5週間)を、実験の開始前に7日間気候順応させた。その後、動物をそれらの体重に基づいて様々な群にランダムに割り付ける。ポリ(I:C)−LMW(ポリ−IC、1mg/mL、40μl)を、3%のイソフルランでの麻酔下、動物に1日2回、3日間鼻腔内投与する。各ポリ−I:C処理の2時間前に、鼻腔内(50%のDMSO/PBS中、35μlの溶液)によって、試験化合物で動物を処理する。最終ポリ−I:C負荷の24時間後、動物を麻酔し、気管にカニューレを挿入しなければならず、BALFを収集する。血液細胞計数器を使用することによって、BALF中の肺胞マクロファージ及び好中球の濃度を決定し、1×106個の細胞/mlに調節した。細胞分画数を手動で計算する。サイトスピン3を使用して40マイクロリットルの細胞懸濁液を遠心分離して、細胞スメアを調製する。細胞スメアを鑑別用血液染色液で染色し、顕微鏡的に観察して、好酸球をその形態学的特徴に従って同定する。細胞スメア中の300個の白血球の間で各細胞型の数を決定してパーセンテージとして表し、各BAL液中の好中球及びマクロファージの数を計算する。
実施例I
5または10mgの化合物A1を含有する、以下に記載されるカプセルを調製する。
25、50、または100mgの化合物A1を含有する、以下に記載されるカプセルを調製する。
Claims (21)
- 2−(1−(9H−プリン−6−イルアミノ)プロピル)−3−(3−フルオロフェニル)−4H−クロメン−4−オンから選択される化合物及びその薬学的に許容される塩。
- (S)−2−(1−(9H−プリン−6−イルアミノ)プロピル)−3−(3−フルオロフェニル)−4H−クロメン−4−オンから選択される化合物及びその薬学的に許容される塩。
- 前記化合物が、(R)−2−(1−(9H−プリン−6−イルアミノ)プロピル)−3−(3−フルオロフェニル)−4H−クロメン−4−オンを実質的に含まない、請求項2に記載の前記化合物及びその薬学的に許容される塩。
- 前記化合物が、約95%を超える鏡像体過剰率を有する、請求項2に記載の前記化合物。
- (S)−2−(1−(9H−プリン−6−イルアミノ)プロピル)−3−(3−フルオロフェニル)−4H−クロメン−4−オン。
- 前記化合物が、(R)−2−(1−(9H−プリン−6−イルアミノ)プロピル)−3−(3−フルオロフェニル)−4H−クロメン−4−オンを実質的に含まない、請求項5に記載の前記化合物。
- 前記化合物が、約95%を超える鏡像体過剰率を有する、請求項5に記載の前記化合物。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載の化合物及び少なくとも1つの薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
- 細胞内に存在するPI3δキナーゼの触媒活性を阻害するための組成物であって、有効量の請求項1〜7のいずれか1項に記載の化合物を含む、前記組成物。
- 細胞内に存在するPI3γキナーゼの触媒活性を阻害するための組成物であって、有効量の請求項1〜7のいずれか1項に記載の化合物を含む、前記組成物。
- 細胞内に存在するPI3δキナーゼ及びPI3γキナーゼの触媒活性を阻害するための組成物であって、有効量の請求項1〜7のいずれか1項に記載の化合物を含む、前記組成物。
- 前記阻害が、癌、骨障害、炎症性疾患、免疫疾患、神経系疾患、代謝性疾患、呼吸器疾患、血栓症、及び心疾患から選択される疾患、障害、または病態を患う対象において生じる、請求項9〜11のいずれか1項に記載の前記組成物。
- 白血病の治療を必要とする患者においてそれを治療するための組成物であって、前記組成物が、有効量の請求項1〜7のいずれか1項に記載の化合物を含む、前記組成物。
- 喘息または慢性閉塞性肺疾患の治療を必要とする患者においてそれを治療するための組成物であって、前記組成物が、有効量の請求項1〜7のいずれか1項に記載の化合物を含む、前記組成物。
- リウマチ性関節炎、乾癬、ループス、または実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)の治療を必要とする患者においてそれを治療するための組成物であって、前記組成物が、有効量の請求項1〜7のいずれか1項に記載の化合物を含む、前記組成物。
- 慢性リンパ球性白血病(CLL)、非ホジキンリンパ腫(NHL)、ホジキンリンパ腫(HL)、急性骨髄性白血病(AML)、多発性骨髄腫(MM)、小リンパ球性リンパ腫(SLL)、または緩徐進行性非ホジキンリンパ腫(I−NHL)疾患の治療を必要とする患者においてそれを治療するための組成物であって、前記組成物が、有効量の請求項1〜7のいずれか1項に記載の化合物を投与することを含む、前記組成物。
- PI3δ/γキナーゼの触媒活性の阻害による、疾患、障害、または病態の治療のための薬物の製造における、請求項1〜7のいずれか1項に記載の化合物の使用。
- PI3K関連疾患、障害、または病態の治療のための組成物であって、有効量の請求項1〜7のいずれか1項に記載の前記化合物を含む、前記組成物。
- 抗癌剤、抗炎症剤、免疫抑制剤、ステロイド、非ステロイド性抗炎症剤、抗ヒスタミン剤、鎮痛剤、及びこれらの混合物から選択される更なる活性剤を更に含む、請求項18に記載の前記組成物。
- 前記PI3K関連疾患、障害、または病態が、免疫系関連疾患、炎症を伴う疾患もしくは障害、癌もしくは他の増殖性疾患、肝臓疾患もしくは障害、または腎臓疾患もしくは障害である、請求項18に記載の前記組成物。
- 前記PI3K関連疾患、障害、または病態が、白血病、急性リンパ球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、B細胞リンパ腫、T細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、有毛細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、急性及び慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、及び前骨髄球性白血病、乾癬、リウマチ性関節炎、骨関節炎、喘息、COPD、アレルギー性鼻炎、ならびにループスエリテマトーデスから選択される、請求項18に記載の前記組成物。
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