BR112015030385B1

BR112015030385B1 - Composto, composto para uso e composição farmacêutica

Info

Publication number: BR112015030385B1
Application number: BR112015030385-4A
Authority: BR
Inventors: Swaroop K. V. S. Vakkalanka; Prashant K. Bhavar; Srikant Viswanadha; Govindarajulu BABU
Original assignee: Rhizen Pharmaceuticals S.A.
Priority date: 2013-06-07
Filing date: 2014-06-04
Publication date: 2020-08-18
Also published as: EP3004106A1; US10851107B2; TW201517908A; US20210032248A1; PT3004106T; KR102292853B1; US9790224B2; CL2015003562A1; HK1217949A1; KR20160017047A; CN105358560B; TWI615144B; NO3004106T3; CN105358560A; US20140364447A1; AR096543A1; IL242761B; JP6499165B2; ES2648094T3; ZA201508708B

Abstract

composto, composto para uso e composição farmacêutica a presente invenção refere-se a moduladores de proteína quinase delta (delta) e gama (upsilon)pi3k duplos, métodos de preparação dos mesmos, composições farmacêuticas que contêm os mesmos e métodos de tratamento, prevenção e/ou melhora de doenças ou distúrbios mediados por pi3k quinase com os mesmos.

Description

SAIS DO MESMO, E COMPOSIÇÃO CONTENDO O MESMO

[0001] O presente pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente ne IN 2501/CHE/2013, depositado em 7 de junho de 2013 e n^ IN 5567/CHE/2013, depositado em 3 de dezembro de 2013, cada uma dos quais é incorporado ao presente documento em sua totalidade a título de referência.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0002] A presente invenção fornece moduladores de proteína quinase delta (δ) e gama (y) PI3K duplos, métodos de preparar os mesmos, composições que contêm os mesmos e métodos de tratamento, prevenção e/ou melhora de doenças ou distúrbios mediados por quinase Pi3K com os mesmos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0003] Afosfoinositídeo-3 quinase (PI3K) pertence a uma classe de quinases lipídicas intracelulares que fosforilam o grupo hidroxila de posição 3 do anel de inositol dos lipídios fosfoinositídeo (Pis) gerando segundos mensageiros lipídicos. Embora as isoformas alfa e beta sejam ubíquas em sua distribuição, a expressão de delta e gama é restrita a células hematógenas e células endoteliais circulantes. Diferente da PI3K-alfa ou beta, camundongos que não têm expressão de gama ou delta não mostram qualquer fenótipo adverso indicando que o alvejamento dessas isoformas específicas não resultaria em toxicidade evidente.

[0004] Recentemente, inibidores alvejados da trajetória de fosfoinositide-3- quinase (PI3K) foram sugeridos como agentes imunomoduladores. Esse interesse é oriundo do fato de que a trajetória de PI3K serve múltiplas funções na sinalização de célula imunológica, primariamente através da geração de (3,4,5)-trisfosfato de fosfatidilinositol (PIP3), um segundo mensageiro ligado à membrana. PIP3 recruta as proteínas ao lado citoplasmático da bicamada de lipídio, incluindo as proteínas quinases e GTPases, iniciando uma rede complexa de cascatas de sinalização a jusante importantes na regulação da adesão de célula imunológica, migração e comunicação de célula para célula.

[0005] As quatro isoformas PI3K de classe I diferem-se significativamente em sua distribuição de tecido. PI3Kα e PI3Kβ são ubíquas e ativadas a jusante das tirosina quinases receptoras (RTK), enquanto que PI3K δ e PI3K y são primariamente limitadas a células hematopoiéticas e endoteliais e são ativadas a jusante de RTKs e receptores acoplados à proteína G (GPCR), respectivamente. Estudos genéticos de camundongo revelaram que PI3Kα e PBKβ são essenciais para o desenvolvimento normal, enquanto que a perda de PI3K δ e/ou PI3K y rende uma prole viável com déficits imunológicos seletivos.

[0006] O padrão de expressão e funções de PI3K δ e PI3K y têm gerado muito interesse no desenvolvimento de inibidores de PI3Kδ/y como agentes para muitas doenças, incluindo artrite reumatoide, alergias, asma, doença pulmonar obstrutiva crônica e esclerose múltipla (Hirsch et al, Pharmacol. Ther., 118, 192 a 205, 2008; Marone et al., Biochim. Biophys. Acte , 1784, 159 a 185, 2008; Rommel et al, Nat. Rev. Immunol , 7, 191 a 201, 2007; Ruckle et al, Nat. Rev. Drug Discov. , 5, 903 a 918 (2006); Os estudos que usam métodos tanto farmacológicos quanto genéticos mostraram que essas duas isoformas demonstram frequentemente interações sinérgicas uma com a outra (Konrad et al, J. Biol. Chem., 283, 33.296 a 3.303, 2008; Laffargue et al, Immunity, 16, 441 a 451, 2002). Em mastócitos, por exemplo, PBKδ é essencial para a degranulação em resposta à reticulação de IgE de receptores de Fc (Ali et al, J. Immunol , 180, 2.538 a 2.544, 2008), mas PBKy desempenha um papel importante na amplificação da resposta (Laffargue et al, Immunity, 16, 441 a 451, 2002). Efeitos similares foram vistos em outras funções celulares, incluindo retorno de linfócitos e a explosão respiratória em neutrófilos em que PBKy desempenha um papel crítico e PBKδ amplifica cada processo. Os papéis não redundantes, mas relacionados de PBKδ e PBKy tornaram difícil determinar qual das isoformas (sozinhas ou em combinação) é melhor alvejada em um distúrbio inflamatório particular. Estudos que usam camundongos que não possuem PBKδ e/ou PBKy ou expressam variantes sem atividade de quinase de PBKδ e PBKy foram ferramentas valiosas no entendimento de seus papéis. Por exemplo, os camundongos knockout de PBKδ demonstraram quimiotaxia de neutrófilo diminuída, produção de anticorpos diminuída (tanto dependente quanto independente de célula T) (Jou et al, Mol. Cell.Biol, 22, 8.580 a 8.591, 2002) e números menores de células B maduras (Clayton et al, J. Exp. Med., 196, 753 a 763, 2002; Jou et al, Mol. Cell.Biol, 22, 8.580 a 8.591,2002) e uma diminuição em sua proliferação em resposta à anti-lgM (Jou et al., 2002). Esse fenótipo foi replicado na variante sem atividade de PBKδ quinase e com inibidores seletivos de PBKδ juntamente com número diminuídos e proliferação de mastócitos e uma resposta alérgica atenuada. O knockout de PBKy continha números maiores de neutrófilos, mas menos responsivos, números menores de macrófagos e menos responsivos e as células dendríticas exibiram degranulação de mastócito diminuída (Laffargue et al., 2002), uma razão maior entre células T CD4+ e CD8+), apoptose de timócito aumentada, indução diminuída de CXCR3 em células T ativadas e contratilidade cardíaca diminuída. Esse último efeito no tecido cardíaco foi uma preocupação para a dosagem crônica de pacientes com inibidores de PBKy. Entretanto, essa preocupação foi amplamente mitigada quando a variante sem atividade de PBKy quinase (que melhor imita a inibição da quinase em vez da perda da proteína) mostrou fenótipos de célula imunológica similares, mas, com importância, não tinha nenhum defeito cardíaco. O efeito cardíaco foi posteriormente mostrado como sendo devido aos efeitos de arcabouço em vez da atividade catalítica de PBKy. O knockout de PI3KÔ/PI3Ky duplo foi viável, mas exibiu sérios defeitos no desenvolvimento de células T e sobrevivência de timócito. A combinação sem atividade de PBKδ/knockout de PI3Ky produziu um fenótipo similar sugerindo que, pelo menos dentro do sistema imunológico, o papel da PBKδ é provavelmente apenas um papel catalítico. A interpretação dos estudos que usam camundongos knockout e sem atividade de quinase pode ser desafiadora porque esses modelos fornecem apenas uma imagem estado estacionário do sistema imunológico, não possuem controle temporal e de dose e não permitem um entendimento completo de como a resposta imunológica dinâmica reagirá à inibição reversível. Os inibidores seletivos com perfis variáveis (PBKδ, PBKy e PBKδ/y) são necessários para os estudos de sinalização de leucócito a fim de avaliar as contribuições relativas de cada PBK para a ativação de célula imunológica (Olusegon et al., Chemistry &Biology, 1, 123 a 134 (2010), incluindo as referências citadas no mesmo).

[0007] A inibição dupla de δ/y é fortemente implicada como uma estratégia de intervenção na inflamação alérgica e não alérgica das vias respiratórias e outras doenças autoimunes. A evidência científica para o envolvimento de PBK-δ e y gama em vários processos celulares que subjazem arma e COPD é oriunda dos estudos de inibidor e abordagens de alvejamento de gene. Também, a resistência a terapias convencionais tais como corticoesteroides em diversos pacientes com COPD foi atribuída a uma regulação ascendente da trajetória de PBK δ/y. A interrupção da sinalização de PBK- δ/y fornece, portanto, uma estratégia inovadora voltada para cancelar a resposta imunoinflamatória. Devido ao papel essencial desempenhado por PBK- δ e Y na mediação da funcionalidade de célula inflamatória tal como migração e ativação de leucócito e degranulação de mastócito, bloquear essas isoformas pode também ser uma estratégia eficaz para o tratamento da artrite reumatoide. Dada a criticidade estabelecida dessas isoformas na inspeção imunológica, deve-se esperar que inibidores que alvejam especificamente as isoformas δ e y atenuem a progressão da resposta imunológica encontrada na inflamação das vias respiratórias e artrite reumatoide (William et.al Chemistry &Biology, 17, 123 a 134, 2010 e Thompson, et al. Chemistry &Biology, 17: 101 a 102, 2010).

[0008] Revisões e estudos em relação à PBK e trajetórias de proteína quinase relacionadas foram proporcionados por (Liu et. al., Nature Reviews Drug Discovery, 8, 627 a 644, 2009); Nathan T. et. al., Mol Cancer Ther., 8(1), 2009; Marone et, al, Biochimica et Biophysica Acta, 1784, 159 a 185, 2008 e Markman et. al, Annals of Oncology Advance Access, publicado em agosto de 2009. Similarmente, revisões e estudos em relação ao papel da PBK δ e y foram proporcionados por William et.al, Chemistry &Biology, 17, 123 a 134, 2010 e Timothy et.al. J. Med. Chem., 55, 20, 8.559 a 8.581,2012). Todas essas revelações de literatura são incorporadas ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

[0009] Os compostos tais como IPI-145 e CAL130 foram relatados como inibidores duplos de Pi3K δ/y. IPI-145 está sob investigação clínica para câncer, asma e artrite reumatoide. IPI-45 relatou ter uma dose máxima tolerada (MTD) de 75 mg de BID (55th ASH® Annula Meeting New Orleans-LA, 7 a 10 de dezembro de 2013). Não há nenhum relatório sobre CAL-130 ser investigado para propósitos clínicos.

[00010] Há ainda uma necessidade não satisfeita de moduladores de δ y PI3K duplos para o tratamento de doenças e distúrbios associadas a eventos mediados por δ/y PI3K quinases.

[00011] Referência adicional é feita no presente documento às Publicações Internacionais n— WO 11/055215 e WO 12/151525 e às Publicações n— U.S. 2011/0118257 e 2012/0289496, cada uma das quais e incorporada no presente documento a título de referência em sua totalidade.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[00012] A presente invenção é direcionada a inibidores duplos seletivos de proteínas quinases PI3K delta e gama. Esses compostos são adequados para o uso em uma composição farmacêutica para o tratamento de uma doença, distúrbio ou afecção associada à PI3K, por exemplo, uma doença proliferativa tal ramo câncer. A inibição das proteínas quinases PI3K delta e gama pode fornecer efeitos benéficos no tratamento de determinadas doenças e distúrbios.

[00013] Os inibidores duplos seletivos da presente invenção incluem os seguintes compostos, sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos e pró- fármacos dos mesmos:

[00014] (RS)-2-(l-(9H-purin-6-ilamino)propil)-3-(3-fluorofenil)-4H- cromen-4-ona.

(COMPOSTO A)

[00015] (S)-2-(l-(9H-purin-6-ilamino)propil)-3-(3-fluorofenil)-4H- cromen-4-ona.

(COMPOSTO A1)

[00016] (R)-2-(l-(9H-purin-6-ilamino)propil)-3-(3-fluorofenil)-4H- cromen-4-ona.

(COMPOSTO A2)

[00017] As estruturas químicas dos compostos da presente invenção são mostradas abaixo.

[00018] Em uma modalidade, a presente invenção refere-se aos composto (S)-2-(l- (9H-purin-6-ilamino)propil)-3-(3-fluorofenil)-4H-cromen-4-ona ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[00019] Em uma modalidade, o composto (S)-2-(l-(9H-purin-6- ilamino)propil)- 3-(3-fluorofenil)-4H-cromen-4-ona ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo é substancialmente livre (por exemplo, contém menos do que cerca de 10%, tal como menos do que cerca de 5%, menos do que cerca de 2,5%, menos do que cerca de 1%, menos do que cerca de 0,1% em peso ou é livre) de (R)-2-(l-(9H-purin-6-ilamino)propil)-3-(3-fluorofenil)-4H-cromen-4-ona e sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo.

[00020] Em outra modalidade, o composto (S)-2-(l-(9H-purin-6- ilamino)propil)-3-(3-fluorofenil)-4H-cromen-4-ona ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo tem um excesso enantiomérico maior do que cerca de 90%, tal como maior do que cerca de 91%, maior do que cerca de 92%, maior do que cerca de 93%, maior do que cerca de 94%, maior do que cerca de 95%, maior do que cerca de 96%, maior do que cerca de 97%, maior do que cerca de 98%, maior do que cerca de 99%, maior do que cerca de 99.5%, maior do que cerca de 99,9% ou maior do que cerca de 99,99%.

[00021] Em uma modalidade preferencial, a presente invenção refere- se aos composto (S)-2-(l-(9H-purin-6-ilamino)propil)-3-(3-fluorofenil)-4H-cromen-4- ona (Composto A1).

[00022] A invenção fornece adicionalmente uma composição farmacêutica que compreende um ou mais compostos da presente invenção (tal como o composto A1) juntamente com um carreador farmaceuticamente aceitável. A composição farmacêutica pode compreender adicionalmente um ou mais agentes ativos adicionais (tais como agentes anticâncer e os agentes ativos discutidos abaixo). Em uma modalidade, a composição farmacêutica inclui uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais compostos da presente invenção.

[00023] Outra modalidade é um método para inibir PI3K delta e gama em um paciente administrando-se ao paciente uma quantidade eficaz de pelo menos um composto da presente invenção.

[00024] Ainda outra modalidade é um método para tratar, prevenir e/ou inibir uma doença, distúrbio ou afecção mediada por proteína quinase PI3K (tal como câncer ou outra doença ou distúrbio proliferativo) em um paciente administrando-se ao paciente uma quantidade eficaz de pelo menos um composto da presente invenção.

[00025] Ainda outra modalidade da presente invenção é um método para inibir PI3K, particularmente, PI3K delta e gama quinase em um paciente administrando-se ao paciente uma quantidade eficaz de pelo menos um composto da presente invenção.

[00026] Ainda outra modalidade da presente invenção é um método para tratar uma doença inflamatória, autoimune ou proliferativa por meio da modulação de uma proteína quinase (tal como PI3 delta e gama quinase) administrando-se a um paciente que precisa de tal tratamento uma quantidade eficaz de pelo menos um composto da presente invenção. Em uma modalidade, o composto da presente invenção inibe a proteína quinase PI3K tanto delta quanto gama.

[00027] Ainda outra modalidade da presente invenção é um método para tratar uma doença inflamatória, autoimune ou proliferativa por meio da modulação de uma proteína quinase (tal como PI3 delta e gama quinase) administrando-se a um paciente que precisa de tal tratamento uma quantidade eficaz de pelo menos um composto da presente invenção, em combinação (simultânea ou sequencialmente) com pelo menos um outro agente anti- inflamatório, imunomodulador ou anticâncer (ou uma combinação dos mesmos). Em uma modalidade, o composto da presente invenção inibe a proteína quinase PI3K tanto delta quanto gama.

[00028] Os compostos da presente invenção são úteis no tratamento de uma variedade de cânceres, incluindo, porém, sem limitação:

[00029] carcinoma, incluindo, porém, sem limitação, essa da bexiga, mama, cólon, rim, fígado, pulmão, incluindo câncer de pulmão de célula pequena, esôfago, vesícula biliar, ovário, pâncreas, estômago, cérvice, tireoide, próstata e pele, incluindo carcinoma de célula escamosa;

[00030] tumores hematopoiéticos de linhagem linfoide, incluindo, porém, sem limitação, leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda, linfoma de célula B, linfoma de célula T, linfoma de Hodgkin, linfoma não Hodgkins, leucemia de células pilosas, linfoma de Burkett;

[00031] tumores hematopoiéticos de linhagem mieloide, incluindo, porém, sem limitação, leucemias mielógenas aguda e crônica, síndrome mielodisplásica e leucemia promielocítica;

[00032] tumores de origem mesenquimal, incluindo, porém, sem limitação, fibrossarcoma e rabdomiossarcoma;

[00033] tumores do sistema nervoso central e periférico, incluindo, porém, sem limitação, astrocitoma, neuroblastoma, glioma e schwannomas; e

[00034] outros tumores, incluindo, porém, sem limitação, melanoma, seminoma, teratocarcinoma, osteosarcoma, xenoderoma pigmentoso, queratoacantoma, câncer de tiroide folicular e sarcoma de Kaposi.

[00035] Em uma modalidade, os compostos da presente invenção são administrados para tratar uma leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda, linfoma das células B, linfoma de célula T, linfoma de Hodgkin, linfoma não-Hodgkin, linfoma de células pilosas, linfoma de Burkett, leucemias mielogênica aguda e crônica, síndrome mielodisplásica e leucemia promielocítica.

[00036] Devido ao papel chave das proteínas quinases na regulação da proliferação celular em geral, os inibidores de proteína quinase da presente invenção poderiam atuar como agentes citostáticos reversíveis e podem ser úteis, portanto, no tratamento de qualquer processo de doença que exibe proliferação celular anormal, por exemplo, hiperplasia prostática benigna, polipose adenomatosa familiar, neuro-fibromatose, aterosclerose, fibrose pulmonar, artrite, psoríase, glomerulonefrite, restenose após angioplastia ou cirurgia vascular, formação de cicatriz hipertrófica, doença inflamatória do intestino, rejeição de transplantes, choque endotóxico e infecções fúngicas.

[00037] Os compostos da presente invenção como moduladores de apoptose são úteis no tratamento de câncer (incluindo, porém, sem limitação, aqueles tipos mencionados no presente documento acima), infecções virais (incluindo, porém, sem limitação, herpesvirus, poxvirus, vírus de Epstein-Barr, vírus de Sindbis e adenovirus), doenças autoimunes (incluindo, porém, sem limitação, lúpus sistêmico, eritematoso, glomerulonefrite mediada autoimune, artrite reumatoide, psoríase, doença inflamatória do intestino e diabetes mellitus autoimune), distúrbios neurodegenerativos (incluindo, porém, sem limitação, doença de Alzheimer, demência relacionada à AIDS, doença de Parkinson, esclerose lateral amiotrófica, retinite pigmentosa, atrofia muscular espinhal e degeneração cerebelar), síndromes mielodisplásicas, anemia aplásica, lesão isquémica associada a enfartes do miocárdio, derrame e lesão de reperfusão, arritmia, aterosclerose, doenças hepáticas relacionadas ao álcool ou induzidas por toxinas, doenças hematológicas (incluindo, porém, sem limitação, anemia crônica e anemia aplástica), doenças degenerativas do sistema músculo- esquelético (incluindo, porém, sem limitação, osteoporose e artrite), rinossinusite sensível à aspirina, fibrose cística, esclerose múltipla, doenças renais e dor do câncer. Os compostos da presente invenção são também úteis na prevenção, inibição ou supressão do desenvolvimento de AIDS em indivíduos infectados por HIV.

[00038] Os compostos da presente invenção podem modular o nível da síntese de RNA e DNA celular. Esses agentes são, portanto, úteis no tratamento de infecções virais, incluindo, porém, sem limitação, HIV, vírus do papiloma humano, herpesvirus, poxvirus, vírus de Epstein-Barr, vírus de Sindbis e adenovirus.

[00039] Os compostos da presente invenção são úteis na quimioprevenção de câncer. A quimioprevenção é definida como inibindo o desenvolvimento do câncer invasivo ou bloqueando o início do evento mutagênico ou bloqueando a progressão de células pré-malignas que já sofreram um insulto ou inibindo a reincidência de tumor. Os compostos da presente invenção são também úteis na inibição da angiogênese e metástase de tumor. Uma modalidade da invenção é um método para inibir a angiogênese ou metástase de tumor em um paciente em necessidade do mesmo administrando-se uma quantidade eficaz de um ou mais compostos da presente invenção.

[00040] Outra modalidade da presente invenção é um método para tratar uma doença relacionada a sistema imunológico (por exemplo, uma doença autoimune), uma doença ou distúrbio que envolve inflamação (por exemplo, asma, doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), artrite reumatoide, doença inflamatória do intestino, glomerulonefrite, doenças neuroinflamatórias, esclerose múltipla, uveite e distúrbios do sistema imunológico), câncer ou outras doenças proliferativas, uma doença ou distúrbio hepático, uma doença ou distúrbio renal. O método inclui administrar uma quantidade eficaz de um ou mais compostos da presente invenção.

[00041] Os exemplos de distúrbios imunológicos incluem, porém, sem limitação, psoríase, artrite reumatoide, vasculite, doença inflamatória do intestino, dermatite, osteoartrite, asma, doença inflamatória do músculo, rinite alérgica, vaginite, cistite intersticial, esclerodermia, osteoporose, o eczema, transplante alogênico ou xenogênico (órgão, medula óssea, células-tronco e outras células e tecidos), rejeição de enxerto, doença do enxerto contra hospedeiro, lúpus eritematoso, doença inflamatória, diabetes tipo I, fibrose pulmonar, dermatomiosite, síndrome de Sjogren, tiroidite (por exemplo, tiroidite autoimune e de Hashimoto), miastenia grave, anemia hemolítica autoimune, esclerose múltipla, fibrose cística, hepatite recidiva crônica, cirrose biliar primária, conjuntivite alérgica e dermatite atópica.

[00042] Em uma modalidade, os compostos descritos no presente documento são úteis ramo imunossupressores para impedir rejeições de enxerto de transplante, rejeição de transplante alogênico ou xenogênico (órgão, medula óssea, células-tronco, outras células e tecidos) e doença do enxerto contra hospedeiro. Em outras modalidades, as rejeições de enxerto de transplante resultam de transplantes de tecido ou órgão. Em modalidades adicionais, a doença do enxerto contra hospedeiro resulta do transplante de medula óssea ou célula-tronco. Uma modalidade é um método para prevenir ou diminuir o risco de rejeição de enxerto de transplante, rejeição de transplante alogênico ou xenogênico (órgão, medula óssea, células-tronco, outras células e tecidos) ou doença do enxerto contra hospedeiro administrando-se uma quantidade eficaz de um ou mais compostos da presente invenção.

[00043] Os compostos da presente invenção são também úteis em combinação (administrados juntos ou sequencialmente) com tratamentos anticâncer conhecidos, tais como radioterapia ou com agentes anticâncer ou citotóxicos ou citostáticos, tais como, por exemplo, agentes interativos de DNA, tais como cisplatina ou doxorubicina; inibidores de topoisomerase II, tal como etoposídeo; inibidores de topoisomerase I tais como CPT-11 ou topotecano; agentes de interação de tubulinatais como paclitaxel, docetaxel ou as epotilonas (por exemplo ixabepilona), de ocorrência natural ou sintética; agentes hormonais, tais como tamoxifeno; inibidores de timidilato sintase, tal como 5-fluorouracila; e antimetabólitos, tal como metotrexato, outros inibidores de tirosina quinase tais como Iressa e OSI-774; inibidores de angiogênese; inibidores de EGF; inibidores de VEGF; inibidores de CDK; inibidores de SRC; inibidores de c-Kit; inibidores de Herl/2 e anticorpos monoclonais direcionados contra receptores de fator de crescimento tais como erbitux (EGF) e herceptina (Her2) e outros modulatores de proteína quinase também.

[00044] Os compostos da presente invenção são também úteis na combinação (administrados juntos ou sequencialmente) com um ou mais fármacos anti-inflamatórios esteroidais, fármacos anti-inflamatórios não esteroidais (NSAIDs) ou derivados anti-inflamatórios seletivos imunológicos (ImSAIDs).

[00045] A invenção fornece adicionalmente uma composição farmacêutica que compreende um ou mais compostos da presente invenção juntamente com um carreador farmaceuticamente aceitável. A composição farmacêutica pode compreender adicionalmente um ou mais dos ingredientes ativos identificados acima, tais como outros agentes anticâncer.

[00046] Ainda outra modalidade é um método para tratar leucemia em um paciente em necessidade do mesmo administrando-se uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto da presente invenção. Por exemplo, os compostos da presente invenção são eficazes para tratar leucemia linfocítica crônica (LLC), linfoma não-Hodgkin (NHL), linfoma de Hodgkin (LH), leucemia mieloide aguda (LMA), mieloma múltiplo (MM), linfoma linfocítico pequeno (SLL) e linfoma indolente não-Hodgkin (I -NHL).

[00047] Ainda outra modalidade é um método para tratar leucemia em um paciente em necessidade do mesmo administrando-se uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto da presente invenção. Por exemplo, os compostos da presente invenção são eficazes para tratar distúrbios autoimunes tais como asma, COPD, artrite reumatoide, psoríase, lúpus e encefalomielite autoimune experimental (EAE).

[00048] Ainda outra modalidade é um método para tratar rinite alérgica em um paciente em necessidade do mesmo administrando-se uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto da presente invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00049] A Figura 1 retrata um gráfico de barras da contagem de neutrófilos no fluido de lavagem broncoalveolar (BALF) de animais tratados com 0, 0,3, 1, 3 e 10 mg/kg do Composto A1 (po) de acordo com o modelo de neutrofilia pulmonar induzida por Lipopolissacarídeo descrito no Ensaio 7.

[00050] A Figura 2 retrata um gráfico de barras da contagem de neutrófilos no fluido de lavagem peritoneal de animais tratados com 0, 1, 3 e 10 mg/kg do Composto A1 (po) de acordo com o modelo de inflamação de bolsa de ar de rato induzida por Lipopolissacarídeo descrito no Ensaio 8.

[00051] A Figura 3 retrata um gráfico de barras da concentração de TNF-a plasmática induzida por Lipopolissacarídeo em ratos Wistar fêmeas em jejum seguindo a administração de 0, 1, 3 e 10 mg/kg do Composto A1 (po) de acordo com o procedimento descrito no Ensaio 9.

[00052] As Figuras 4A e 4B retratam gráficos da pausa aumentada (Penh) ou razão de PEF/PIF (fluxo expiratório de pico/fluxo inspiratório de pico), respectivamente, em cobaias machos sensibilizadas seguindo o estímulo com metacolina e tratamento com OVA/SAL ou OVA/OVA ou 0,3, 1 ou 3 mg/kg do Composto A1 de acordo com o procedimento no Ensaio 10A.

[00053] As Figuras 4C a 4E retratam gráficos de barras da contagem de eosinófilos em BALF, contagem de células totais em BALF e porcentagem de eosinófilos, respectivamente, em cobaias machos sensibilizadas com ovalbumina e tratamento com 0, 0,3, 1 ou 3 mg/kg do Composto A1 de acordo com o procedimento no Ensaio 10A.

[00054] As Figuras 5A e 5B retratam gráficos de Penh) ou razão de PEF/PIF, respectivamente, em camundongos sensibilizados com ovalbumina seguindo o estímulo com metacolina e tratamento com SAL/SAL, OVA/SAL ou OVA/OVA ou 3 mg/kg do Composto Al de acordo com o procedimento no Ensaio 10B.

[00055] As Figuras 5C a 5E retratam gráficos de barras da contagem de eosinófilos em BALF, contagem de células totais em BALF e porcentagem de eosinófilos, respectivamente, em camundongos sensibilizados com ovalbumina e tratados com 0 ou 3 mg/kg do Composto A1 de acordo com o procedimento no Ensaio 10B.

[00056] As Figuras 6A e 6B retratam gráficos de barras de pontuações histopatológicas individuais para tornozelo e joelho, respectivamente, em artrite induzida por colágeno com o uso de ratos de Lewis tratados com um controle ou 15 mg/kg/BID do composto A1 de acordo com o procedimento no Ensaio 11.

[00057] As Figuras 6C e 6D retratam gráficos de barras de pontuações histopatológicas somadas para tornozelo e joelho, respectivamente, em um modelo de artrite induzida por colágeno com o uso de ratos de Lewis tratados com um veículo ou 15 mg/kg/BID do composto A1 de acordo com o procedimento no Ensaio 11.

[00058] As Figuras 7A e 7B retratam gráficos de barras de contagens de células de macrófago e neutrófilo, respectivamente, em BALF seguindo a administração de 0,3, 1 ou 3 mg/kg/BID do Composto Al em camundongos Balb/c machos em um modelo de infiltração de células induzida por fumaça de cigarro conforme descrito no Ensaio 15.

[00059] A Figura 8 retrata um gráfico que mostra a inibição da fosforilação de AKT em linhagens celulares leucêmicas (MOLT-4, Jurkat, CCRF- CEM, Hut-78 e HuT-102) pelo Composto A1 de acordo com o procedimento no Ensaio 3.

[00060] A Figura 9 retrata um gráfico que mostra a inibição na porcentagem de células positivas CD63 induzida por fMLP ou anti-FceRI no sangue total humano pelo Composto A1 de acordo com o procedimento no Ensaio 4.

[00061] A Figura 10 retrata um gráfico que mostra a inibição de citocinas induzidas por CD3/CD28 anti-humanas (TNFa, IFNy e IL2) pelo Composto A1 de acordo com o Ensaio 6D.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[00062] Conforme usado no presente documento as definições a seguir devem se aplicar a não ser que indicado de outra maneira. Além disso, muitos outros grupos definidos no presente documento podem ser opcionalmente substituídos. A listagem dos substituintes na definição é exemplificativa e não deve ser interpretada para limitar os substituintes definidos em outra parte no relatório descritivo.

[00063] Determinados compostos descritos no presente documento contêm um ou mais centros assimétricos e pode, assim, originar enantiômeros, diastereômeros e outras formas estereoisoméricas que podem ser definidas, em termos de estereoquímica absoluta, como (R)- ou (S)-. A não ser que especificado de outra maneira, as presentes entidades químicas, composições farmacêuticas e métodos se destinam a incluir todos os isômeros possíveis, incluindo misturas racêmicas, formas opticamente puras e misturas intermediárias. Por exemplo, o exemplo não limitante de misturas intermediárias inclui uma mistura dos isômeros R:S ou S:R em uma razão de 10:90, 13:87, 17:83, 20:80 ou 22:78. Os isômeros (R) e (S) opticamente ativos podem ser preparados com o uso de síntons quirais ou reagentes quirais ou resolvidos com o uso de técnicas convencionais. Quando os compostos descritos no presente documento contêm ligações duplas olefínicas ou outros centros de assimetria geométrica e, a não ser que especificado de outra maneira, pretende-se que os compostos incluam ambos os isômeros geométricos EeZ.

[00064] O termo "tautômeros" refere-se a compostos que são caracterizados pela interconversão relativamente fácil das formas isoméricas em equilíbrio. Esses isômeros devem ser cobertos por esta invenção. Os "tautômeros" são isômeros estruturalmente distintos que interconvertem por tautomerização. "Tautomerização"é uma forma de isomerização e inclui tautomerização prototrópica ou de desvio de próton, que é considerada um subconjunto da química de ácido-base. "Tautomerização prototrópica" ou "tautomerização de desvio de próton" envolve a migração de um próton acompanhada por alterações na ordem de ligação, frequentemente a troca de uma ligação única por uma ligação dupla adjacente. Quando a tautomerização é possível (por exemplo, em solução), um equilíbrio químico de tautômeros pode ser alcançado. Um exemplo de tautomerização é a tautomerização de ceto-enol. Um exemplo específico de tautomerização de ceto-enol é a interconversão de tautômeros de pentano-2,4-diona e 4-hidroxipent-3-en-2-ona. Outro exemplo de tautomerização é a tautomerização fenol-ceto. Um exemplo específico da tautomerização de fenol-ceto é a interconversão de tautômeros de piridin-4-ol e piridin-4(IH)-ona.

[00065] O termo "pró-fármaco" refere-se a um composto, que é um precursor inativo de um composto que é convertido em sua forma ativa no corpo por processos metabólicos normais. O projeto de pró-fármaco é discutido de modo geral em Hardma, et al. (Eds.), Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9a edição, páginas 11 a 16 (1996). Uma discussão completa é fornecida em Higuchi, et al., Prodrugs as Novel Delivery Systems, Volume 14, ASCD Symposium Series e em Roche (ed.), Bioreversible Carriers in Drug Design, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press (1987). Para ilustra, os pró-fármacos podem ser convertidos em uma forma farmacologicamente ativa através da hidrólise de, por exemplo, uma ligação de éster ou amida, introduzindo ou expondo, assim, um grupo funcional no produto resultante. Os pró-fármacos podem ser projetados para reagir com um composto endógeno para formar um conjugado solúvel em água que aprimora adicionalmente as propriedades farmacológicas do composto, por exemplo, meia vida circulatória aumentada. Alternativamente, os pró-fármacos podem ser projetados para passar por modificação covalente em um grupo funcional com, por exemplo, ácido glicurônico, sulfato, glutationa, aminoácidos ou acetato. O conjugado resultante pode ser inativado e excretados na urina ou tornado mais potente do que o composto progenitor. Conjugados de alto peso molecular também podem ser excretados na bile, submetidos à clivagem enzimática e liberados de volta para a circulação, aumentado eficazmente, assim, a meia-vida biológica do composto originalmente administrado.

[00066] O termo "éster"refere-se a um composto, que é formado pela reação entre um ácido e um álcool com eliminação de água. Um éster pode ser representado pela fórmula geral RCOOR' (em que R é um fármaco e R' é um grupo químico).

[00067] Esses pró-fármacos e ésteres devem ser cobertos pelo escopo desta invenção.

[00068] Adicionalmente, a presente invenção também inclui os compostos que se diferem apenas na presença de um ou mais átomos isotopicamente enriquecidos, por exemplo, substituição de hidrogênio por deutério ou trítio ou a substituição de um carbono por carbono enriquecido com 13C ou 14C.

[00069] Os compostos da presente invenção podem também conter proporções não naturais de isótopos atômicos em um ou mais dos átomos que constituem tais compostos. Por exemplo, os compostos podem ser radiomarcados com isótopos radioativos, tais como, por exemplo, trítio (3H), iodo-125 (125l) ou carbono-14 (14C). Todas as variações isotópicas dos compostos da presente invenção, radiotivas ou não, são abrangidas dentro do escopo da presente invenção.

[00070] Os sais farmaceuticamente aceitáveis que formam parte desta invenção incluem sais derivados de bases inorgânicas tais como Li, Na, K, Ca, Mg, Fe, Cu, Zn e Mn; sais de bases orgânicas tais como N,N'- diacetiletilenodiamina, glucamina, trietilamina, colina, hidróxido, dicicloexilamina, metformina, benzilamina, trialquilamina e tiamina; bases quirais tais como alquilfenilamina, glicinol e fenil glicinol; sais de aminoácidos naturais tais como glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, norleucina, tirosina, cistina, cisteína, metionina, prolina, hidróxi prolina, histidina, ornitina, lisina, arginina e serina; sais de amónio quaternário dos compostos da invenção com haletos de alquila, sulfatos de alquila tais como Mel e (Me^SCX ; aminoácidos não naturais tais como isômeros D ou aminoácidos substituídos; guanidina; e guanidina substituída em que os substituintes são selecionados dentre nitro, amino, alquila, alquenila, alquinila, amónio ou sais de amónio substituído e sais de alumínio. Os sais podem incluir sais de adição de ácido quando apropriado que podem ser sulfatos, nitratos, fosfatos, percloratos, boratos, halogenidratos, acetatos, tartratos, maleatos, citratos, fumaratos, succinatos, palmoatos, metanossulfonatos, benzoatos, salicilatos, benzenossulfonatos, ascorbatos, glicerofosfatos e cetoglutaratos.

[00071] Quando faixas são usadas no presente documento para propriedades físicas, tal como peso molecular, ou propriedades químicas, tais como fórmulas químicas, todas as combinações e subcombinações de faixas e modalidades específicas nas mesmas devem ser incluídas. O termo "cerca de" ao se referir a um número ou uma faixa numérica significa que o número ou faixa numérica referida é uma aproximação dentro da variabilidade experimental (ou dentro de um erro experimental estatístico) e, assim, o número ou faixa numérica pode variar, por exemplo, dentre 1% e 15% do número ou faixa numérica determinado. O termo "compreender" (e termos relacionados tais como "compreendem" ou "compreende" ou "ter" ou "incluir") inclui aquelas modalidades, por exemplo, uma modalidade de qualquer composição de matéria, composição, método ou processo ou similar, que "consiste" ou "consiste essencialmente" nos recursos descritos.

[00072] As abreviações e termos a seguir têm os significados indicados por todo o documento: PI3-K = fosfoinositídeo 3-quinase; PI = fosfatidilinositol; AIDS = Síndrome da Imunodeficiência Adquirida HIV = Vírus da Imunodeficiência Humana; Mel = lodeto de Metila; ND: Não determinado.

[00073] As abreviações usadas no presente documento têm seu significado convencional dentro das técnicas químicas e biológicas.

[00074] O termo "proliferação celular"refere-se a um fenômeno pelo qual o número de células mudou como um resultado da divisão. Esse termo também abrange o crescimento celular pelo qual a morfologia celular mudou (por exemplo, aumentado em tamanho) consistente com um sinal proliferativo.

[00075] Os termos "coadministração", "administrado em combinação com" e seus equivalentes gramáticos, conforme usados no presente documento, abrangem a administração de dois ou mais agentes a um animal de modo que ambos os agentes e/ou seus metabolites estejam presentes no animal ao mesmo tempo. A coadministração inclui a administração simultânea em composições separadas, administração em diferentes tempos em composições separadas ou administração em uma composição na qual ambos os agentes estão presentes.

[00076] O termo "quantidade eficaz" ou "quantidade terapeuticamente eficaz"refere-se a essa quantidade de um composto descrito no presente documento que é suficiente para efetuar a aplicação pretendida incluindo, porém, sem limitação, tratamento de doença, conforme definido abaixo. A quantidade terapeuticamente eficaz pode variar dependendo da aplicação pretendida (in vitro ou in vivo) ou do indivíduo e afecção sendo tratada, por exemplo, o peso e a idade do indivíduo, a gravidade da afecção, a maneira de administração e similares, que podem ser prontamente determinados por um elemento de habilidade comum na técnica. O termo também se aplica a uma dose que induzirá uma resposta particular em células-alvo, por exemplo, a redução da adesão de plaqueta e/ou migração de células. A dose específica variará dependendo dos compostos particulares escolhidos, o regime de dosagem a ser seguido, se é administrada em combinação com outros compostos, temporização da administração, o tecido ao qual é administrado e o sistema de entrega física no qual o mesmo é carregado.

[00077] Conforme usado no presente documento, "tratamento", "tratar" ou "melhorar" são usados de modo intercambiável. Esses termos referem- se a uma abordagem para obter resultados benéficos ou desejados incluindo, porém, sem limitação, benefício terapêutico e/ou um benefício profilático. Por benefício terapêutico entende-se a erradicação ou melhora do distúrbio subjacente sendo tratado. Também, um benefício terapêutico é alcançado com a erradicação ou melhora de um ou mais dos sintomas fisiológicos associados ao distúrbio subjacente de modo que uma melhora seja observada no paciente, não obstante, o paciente pode ainda ser afligido com o distúrbio subjacente. Para o benefício profilático, as composições podem ser administradas a um paciente em risco de desenvolver uma doença particular ou a um paciente que relata um ou mais dos sintomas fisiológicos de uma doença, embora um diagnóstico dessa doença possa não ter sido feito.

[00078] Um "efeito terapêutico", conforme esse termo é usado no presente documento, abrange um benefício terapêutico e/ou um benefício profilático conforme descrito acima. Um efeito profilático inclui atrasar ou eliminar o aparecimento de uma doença ou afecção, atrasar ou eliminar o início dos sintomas de uma doença ou afecção, retardar, parar ou reverter a progressão de uma doença ou afecção ou qualquer combinação dos mesmos.

[00079] O termo "indivíduo" ou "paciente" refere-se a um animal (por exemplo, um cão, gato, cavalo ou porco), tal como um mamífero, por exemplo, um humano. Os métodos descritos no presente documento podem ser úteis tanto em terapêutica humana quanto em aplicações veterinárias. Em algumas modalidades, o paciente é um mamífero e, em algumas modalidades, o paciente é humano.

[00080] "Radioterapia" significa expor um paciente, com o uso de métodos de rotina e composições conhecidos pelo profissional, a emissores de radiação tais como radionuclídeos emissores de partícula alfa (por exemplo, radionuclídeos de actínio e tório), emissores de radiação de transferência de energia linear baixa (LET) (isto é, emissores beta), emissores de elétrons de conversão (por exemplo, estrôncio-89 e samário-153-EDTMP) ou radiação de alta energia, incluindo, sem limitação, raios x, raios gama e nêutrons.

[00081] "A transdução de sinal" é um processo durante o qual sinais estimuladores ou inibidores são transmitidos para e dentro de uma célula para obter uma resposta intracelular. Um modulador de uma trajetória de transdução de sinal refere-se a um composto que modula a atividade de uma ou mais proteínas celulares mapeadas Pa mesma trajetória de transdução de sinal específica. Um modulador pode aumentar (agonista) ou suprimir (antagonista) a atividade de uma molécula de sinalização.

[00082] O termo "inibição seletiva" ou "inibir seletivamente" conforme aplicado a um agente biologicamente ativo refere-se à capacidade do agente de reduzir seletivamente a atividade de sinalização de alvo em comparação à atividade de sinalização fora de alvo, por meio da interação direta ou indireta com o alvo.

[00083] O termo "carreador farmaceuticamente aceitável" ou "excipiente farmaceuticamente aceitável" inclui, porém, sem limitação, quaisquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes de atraso de absorção e isotônicos, um ou mais diluentes, cargas, sais, desintegradores, ligantes, lubrificantes, deslizantes, agentes umectantes, matrizes de liberação controlada, colorantes/flavorizantes, carreadores, excipientes, tampões, estabilizadores, solubilizantes adequados e combinações dos mesmos. Exceto na medida em que qualquer meio ou agente convencional é incompatível como ingrediente ativo, seu uso nas composições terapêuticas da invenção é contemplado. Ingredientes ativos complementares também podem ser incorporados nas composições.

[00084] Em determinadas modalidades, um ou mais dos compostos descritos no presente documento se ligam especificamente a uma PI3 quinase ou uma proteína quinase selecionada a partir do grupo que consiste em mTor, proteína quinase dependente de DNA (número de acesso de proteína no Pubmed (PPAN) AAA79184), Abl tirosina quinase (CAA52387), Bcr-Abl, quinase de célula hematopoiética (PPAN CA119695), Src (PPAN CAA24495), receptor de fator de crescimento endotelial vascular 2 (PPAN ABB82619), receptor de fator de crescimento epidérmico (PPAN AG43241), receptor de EPH B4 (PPAN EAL23820), receptor de fator de célula tronco (PPAN AAF22141), receptor de proteína tirosina quinase TIE-2 (PPAN Q02858), tirosina quinase 3 relacionada a fms (PPAN NP_004110), receptor alfa de fator de crescimento derivado de plaqueta (PPAN NP_990080), RET (PPAN CAA73131) e qualquer outras proteínas quinases relacionadas, assim como quaisquer mutantes funcionais das mesmas.

[00085] Em outras modalidades, a IC5o de um composto descrito no presente documento para pi 10a, pi 10β, pi 10y ou pi 10δ é menor do que cerca de 1 pM, menor do que cerca de 100 nM, menor do que cerca de 50 nM, menor do que cerca de 10 nM, menor do que 1 nM ou menor do que cerca de 0,5 nM. Em algumas modalidades, a IC50 de um composto descrito no presente documento para mTor é menor do que cerca de 1 pM, menor do que cerca de 100 nM, menor do que cerca de 50 nM, menor do que cerca de 10 nM, menor do que 1 nM ou menor do que cerca de 0,5 nM. Em algumas outras modalidades, um ou mais dos compostos descritos no presente documento exibem especificidade de ligação dupla e têm a capacidade de inibir uma PI3 quinase (por exemplo, uma PI3 quinase de classe I) assim como uma proteína quinase (por exemplo, mTor) com um valor de IC50 menor do que cerca de 1 pM, menor do que cerca de 100 nM, menor do que cerca de 50 nM, menor do que cerca de 10 nM, menor do que 1 nM ou menor do que cerca de 0,5 nM.

[00086] Em modalidades adicionais, os compostos da presente invenção exibem uma ou mais características funcionais reveladas no presente documento. Por exemplo, um ou mais dos compostos descritos no presente documento se ligam especificamente a uma PI3 quinase. Em algumas modalidades, a IC50 de um composto descrito no presente documento para pi 10a, pi 10β, pi 10y ou pi 10δ é menor do que cerca de 1 pM, menor do que cerca de 100 nM, menor do que cerca de 50 nM, menor do que cerca de 10 nM, menor do que cerca de 1 nM, menor do que cerca de 0,5 nM, menor do que cerca de 100 pM ou menor do que cerca de pM.

[00087] Em outras modalidades, os compostos da presente invenção inibem seletivamente um ou mais membros da fosfatidilinositol 3-quinases do tipo I ou classe I (PI3-quinase) com um valor de IC50 de cerca de 100 nM ou menos, cerca de 50 nM ou menos, cerca de 10 nM ou menos, cerca de 5 nM ou menos, cerca de 100 pM ou menos, cerca de 10 pM ou menos ou cerca de 1 pM ou menos conforme medido em um ensaio de quinase in vitro.

[00088] Em ainda um outro aspecto, um inibidor que inibe seletivamente um ou mais membros das PI3-quinases do tipo I ou um inibidor que inibe seletivamente uma ou mais trajetórias de sinalização mediadas por PI3- quinase do tipo I, alternativamente, pode ser entendido como se referido a um composto que exibe uma concentração inibidora de 50% (IC50) em relação a uma PI3-quinase do tipo I dada, que é pelo menos 10 vezes menor, pelo menos 20 vezes menor, pelo menos 50 vezes menor, pelo menos 100 vezes menor, pelo menos 1.000 vezes menor do que a IC50 do inibidor em relação ao resto das outras PI3-quinases do tipo I.

[00089] Conforme usado no presente documento, os termos "inibidor de PI3-quinase δ / y duplo" e "inibidor seletivo de PI3-quinase δ / y duplo"referem-se a um composto que inibe a atividade da isozima PI3-quinase δ e y mais eficazmente do que outras isozimas da família PI3K. Um inibidor de PI3- quinase δ / y duplo é, portanto, mais seletivo para PI3-quinase δ e y do que inibidores de PI3K convencionais tais como CAL-130, wortmanina e LY294002, que são inibidores de PI3K não seletivos.

[00090] A inibição da PI3-quinase δ e y pode ter benefício terapêutico no tratamento de várias afecções, por exemplo, afecções caracterizadas por uma resposta inflamatória incluindo, porém, sem limitação, doenças autoimunes, doenças alérgicas e doenças artríticas. Com importância, a inibição da função de PI3-quinase δ e y não parece afetar funções biológicas tais viabilidade e fertilidade.

[00091] A "resposta inflamatória" conforme usada no presente documento é caracterizada por vermelhidão, calor, inchaço e dor (isto é, inflamação) e envolve tipicamente destruição ou lesão de tecidos. Uma resposta inflamatória é usualmente uma resposta localizada protetora produzida pela lesão ou destruição de tecidos, que serve para destruir, diluir ou delimitar (sequestrar) tanto o agente lesivo quanto o tecido lesionado. As respostas inflamatórias são notavelmente associadas com o influxo de leucócitos e/ou quimiotaxia de leucócito (por exemplo, neutrófilo). As respostas inflamatórias podem resultar da infecção com vírus e organismos patogênicos, meios não infecciosos tal como trauma ou reperfusão após derrame ou infarto do miocárdio, respostas imunológicas a antígenos estranhos e doenças autoimunes. As respostas inflamatórias sensíveis ao tratamento com os métodos e compostos de acordo com a invenção abrangem afecções associadas às reações ao sistema de defesa específico assim como afecções associadas às reações do sistema de defesa não específico.

[00092] Os métodos terapêuticos da invenção incluem métodos para a melhora de afecções associadas à ativação de células inflamatórias. "Ativação de células inflamatórias"refere-se à indução por um estímulo (incluindo, porém, sem limitação, citocinas, antígenos ou autoanticorpos) de uma resposta celular proliferativa, a produção de mediadores solúveis (incluindo, porém, sem limitação, citocinas, radicais de oxigênio, enzimas, prostanoides ou aminas vasoativas) ou expressão de superfície celular de novos números ou números aumentados de mediadores (incluindo, porém, sem limitação, histocompatibilidade principal de antígenos ou moléculas de adesão de célula) em células inflamatórias (incluindo, porém, sem limitação, monócitos, macrófagos, linfócitos T, linfócitos B, granulócitos (leucócitos polimorfonucleares incluindo neutrófilos, basófilos e eosinófilos), mastócitos, células dendríticas, células de Langerhans e células endoteliais). Será observado por versados na técnica que a ativação de um ou uma combinação desses fenótipos nessas células pode contribuir para a iniciação, perpetuação ou exacerbação de uma afecção inflamatória.

[00093] "Doença autoimune", conforme usado no presente documento, se refere a qualquer grupo de distúrbios nos quais a lesão tecidual está associada a respostas mediadas por célula ou humorais para os constituintes do próprio corpo.

[00094] "Rejeição à transplante", conforme usado no presente documento, se refere qualquer resposta imunológica direcionada contra o tecido enxertado (que inclui órgãos ou células (por exemplo, medula óssea), caracterizada por uma perda de função dos tecidos circundantes ou enxertados, dor, inchamento, leucócitos e trombocitopenia).

[00095] "Doença alérgica", conforme usado no presente documento, se refere a quaisquer sintomas, danos ao tecido ou perda de função tecidual que resulta de alergia.

[00096] "Doença artrítica", conforme usado no presente documento, se refere a qualquer doença que é caracterizada por lesões inflamatórias das juntas atribuíveis a uma variedade de etiologias.

[00097] "Dermatite", conforme usado no presente documento, se refere a qualquer uma dentre uma grande família de doenças da pele que são caracterizadas por inflamação da pele atribuível a uma variedade de etiologias.

[00098] Conforme descrito anteriormente, o termo "inibidor seletivo de PI3-quinase δ / y duplo" geralmente se refere a um composto que inibe a atividade da isozima de PI3-quinase δ e y mais eficaz que outras isozimas da família PI3K. As eficácias relativas de compostos ramo inibidores de uma atividade de enzima (ou outra atividade biológica) podem ser estabelecidas através da determinação das concentrações nas quais cada composto inibe a atividade a uma extensão predeterminada e comparando, desse modo, os resultados. Tipicamente, a determinação preferencial é a concentração que inibe 50% da atividade em um ensaio bioquímico, isto é, a concentração inibitória de 50% ou "IC50". As determinações de IC50 podem ser realizadas com uso de técnicas convencionais conhecidas na técnica. Em geral, uma IC50 pode ser determinada através da medição da atividade de uma determinada enzima na presença de uma faixa de concentrações do inibidor sob estudo. Os valores experimentalmente obtidos de atividade de enzima são, então, plotados contra as concentrações inibidoras usadas. A concentração do inibidor que mostra 50% de atividade de enzima (conforme comparado à atividade na ausência de qualquer inibidor) é tomada como o valor de IC50. De modo análogo, outras concentrações inibitórias podem ser definidas através de determinações apropriadas de atividade. Por exemplo, em algumas configurações, pode ser desejável estabelecer uma concentração inibitória de 90%, isto é, IC90, etc.

[00099] Consequentemente, pode-se entender alternativamente que um inibidor seletivo de PI3-quinase δ / y duplo se refere a um composto que exibe uma concentração inibitória de 50% (IC50) em relação à PI3-quinase δ e y, que é pelo menos, 10 vezes menor, pelo menos, 20 vezes menor ou pelo menos 30 vezes menor que o valor de IC50 em relação a qualquer um ou todos os outros membros da família PI3K da classe I. Em uma modalidade alternativa da invenção, pode-se entender que 0 termo inibidor seletivo de PI3-quinase δ / y duplo se refere a um composto que exibe uma IC50 em relação à PI3-quinase δ e y que é pelo menos 30 vezes menor, pelo menos 50 vezes menor, pelo menos 100 vezes menor, pelo menos 200 vezes menor ou pelo menos 500 vezes menor que a IC50 θmrelação a qualquer um ou todos os outros membros da família PI3K da classe I. Um inibidor seletivo de PI3-quinase δ / y duplo é tipicamente administrado em uma quantidade de modo que iniba seletivamente a atividade de PI3-quinase tanto δ quanto y, conforme descrito acima.

[000100] Em certas modalidades, os compostos da presente invenção exibem inibição de PI3-quinase δ e y de modo praticamente igual (~ 1:1) ou em uma razão máxima de 1:5, isto é, o composto da presente invenção exibe valores de IC50 quase iguais para enzima PI3-quinase tanto δ quanto y ou, no máximo, uma diferença de 3 a 8 vezes entre as duas.

[000101] Os métodos da invenção podem ser aplicados à população de células in vivo ou ex vivo. "In vivo" significa dentro de um indivíduo vivo, como dentro de um animal ou humano ou em um corpo do indivíduo. Nesse contexto, os métodos da invenção podem ser usados terapêutica ou profilaticamente em um indivíduo. "Ex vivo” ou "in vitro”significa fora de um indivíduo vivo. Os exemplos de populações de células ex vivo incluem culturas celulares in vitro e amostras biológicas que incluem, mas não se limitam a, amostras de tecido ou fluido obtidas a partir de indivíduos. Essas amostras podem ser obtidas por meio de métodos conhecidos na técnica. As amostras de fluido biológicas exemplificativas incluem sangue, fluido cefalorraquidiano, urina e saliva. As amostras teciduais exemplificativas incluem tumores e biopses dos mesmos. Nesse contexto, a invenção pode ser usada para uma variedade de propósitos, que incluem propósitos experimental e terapêutico. Por exemplo, a invenção pode ser usada ex vivo ou in vitropara determinar o programação e/ou dosagem ideal de administração de um inibidor seletivo de PI3-quinase δ para uma determinada indicação, tipo celular, indivíduo e outros parâmetros. As informações coletadas a partir de tal uso podem ser usadas para protocolos experimentais ou diagnósticos ou no consultório para ajustar os protocolos para o tratamento in vivo. Outros usos ex vivo para os quais a invenção pode ser adaptada são descritos abaixo ou se tornarão evidentes àquele indivíduo versado na técnica.

[000102] Os compostos da presente invenção podem ser preparados através de métodos conhecidos na técnica, tais como aqueles descritos nas Publicações Internacionais n22 WO 2011/055215, WO 2012/151525 e WO 2013/164801, todos os quais são incorporados ao presente documento a título de referência.

COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS

[000103] A invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende um ou mais compostos da presente invenção e um ou mais carreadores ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Em uma modalidade, a composição farmacêutica inclui uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto da presente invenção. A composição farmacêutica pode incluir um ou mais ingredientes ativos adicionais conforme descrito no presente documento.

[000104] Os carreadores e/ou excipientes farmacêuticos podem ser selecionados a partir de diluentes, preenchedores, sais, desintegradores, aglutinantes, lubrificantes, deslizantes, agentes umectantes, matrizes de liberação controlada, colorantes, flavorizantes, tampões, estabilizadores, solubilizadores e combinações dos mesmos.

[000105] Em uma modalidade, as composições farmacêuticas descritas no presente documento contêm de cerca de 0,1 mg a cerca de 1.000 mg, tais como de cerca de 1 mg a cerca de 1.000 mg ou de cerca de 20 mg a cerca de 800 mg ou 50 mg a cerca de 600 mg ou 50 mg a cerca de 600 mg de um ou mais compostos da presente invenção. 100 mg a cerca de 400 mg de um ou mais compostos da presente invenção.

[000106] A composições farmacêuticas da presente invenção pode ser administrada sozinha ou em combinação com um ou mais outros agentes ativos. Quando desejado, os compostos da presente invenção e outro(s) agente(s) podem ser misturados em uma preparação ou ambos os componentes podem ser formulados em preparações separadas para usar os mesmos em combinação separadamente ou ao mesmo tempo.

[000107] Os compostos e as composições farmacêuticas da presente invenção podem ser administrados por qualquer rota que garanta a entrega dos compostos no local de atuação, tais como por via oral, por via intranasal, por via tópica (por exemplo, transdermicamente), por via intraduodenal, por via parenteral (que inclui intravenosa, por via intra-arterial, por via intramuscular, por via intravascular, por via intraperitonal ou por injeção ou infusão), intradermicamente, por via intramamária, por via intratecal, por via intraocular, por via retrobulbar, por via intrapulmonar (por exemplo, fármacos aerossolizados) ou por via subcutânea (incluindo administração de depósito para liberação a longo prazo, por exemplo, cápsula incorporada sob o esplénico, cérebro ou na córnea), por via sublingual, por via anal, por via retal, por via vaginal ou por meio de implantação cirúrgica (por exemplo, cápsula incorporada sob o esplénico, cérebro ou na córnea).

[000108] As composições podem ser administradas em forma gasosa, líquida, semissólida ou sólida ou podem estar em pó seco, tal como forma liofilizada. As composições farmacêuticas podem ser embaladas em formas convenientes para entrega, incluindo, por exemplo, formas de dosagem sólida tais como cápsulas, sachês, selos, gelatinas, papeis, tabletes, supositórios, péletes, pílulas, trociscos e losangos. O tipo de em embalagem dependerá geralmente na rota desejada de administração. As formulações com liberação sustentada implantável também são contempladas, à medida que são formulações transdérmicas.

MÉTODOS DE TRATAMENTO

[000109] A quantidade do composto a ser administrada é dependente do mamífero a ser tratado, da severidade do distúrbio ou afecção, da taxa de administração, da disposição do composto e do cuidado do médico que prescreve. No entanto, uma dosagem eficaz está na faixa de cerca de 0,001 a cerca de 100 mg/kg de peso corporal por dia, preferencialmente, cerca de 1 a cerca de 35 mg/kg/dia, em doses únicas ou divididas. Para um humano com 70 kg, isso equivaleria a cerca de 0,05 a 7 g/dia, preferencialmente, cerca de 0,05 a cerca de 2.5 g/dia. Uma quantidade eficaz de um composto da invenção pode ser administrada em uma única dose ou em múltiplas doses (por exemplo, duas vezes ou três vezes por dia).

[000110] Os compostos da presente invenção podem ser usados em combinação com um ou mais dentre agentes anticâncer (por exemplo, agentes quimioterapeuticos), anticorpos terapêuticos e tratamento com radiação.

[000111] Os compostos da invenção podem ser formulados ou administrados em conjunto com outros agentes que atuam para aliviar os sintomas de afecções inflamatórias tais como encefalomielite, asma e as outras doenças descritas no presente documento. Esses agentes incluem fármacos anti- inflamatórios não esteroidais (NSAIDs).

EXEMPLOS

[000112] Os exemplos e preparações fornecidos abaixo ilustram adicionalmente e exemplificam os compostos da presente invenção e métodos de preparação de tais compostos. Deve ser entendido que o escopo da presente invenção não é limitado, de qualquer maneira, pelo escopo dos exemplos e preparações a seguir. Nas moléculas exemplificativas a seguir com um centro quiral único, a menos que especificado o contrário, existem como uma mistura racêmica. Essas moléculas com dois ou mais centros quirais, a menos que especificado o contrário, existem como uma mistura racêmica de diastereômeros. Os diastereômeros/enantiômeros únicos podem ser obtidos por meio de métodos conhecidos pelos indivíduos versados na técnica.

[000113] Conforme usado no presente documento, sobrescrito 1 se refere à Publicação Internacional n- WO 11/055215 e sobrescrito 2 se refere à Publicação Internacional ne WO 12/151525. Essas referências descrevem como os vários intermediários são preparados.

INTERMEDIÁRIOS

[000114] Intermediário 1: 3-(3-fluorofenil)-2-(l-hidroxipropil)-4H-cromen- 4-ona: A uma solução de 2-(l-bromopropil)-3-(3-fluorofenil)-4H-cromen-4-ona1 (8,80 g, 24,36 mmol) em DMSO (85 ml), n-butanol (5 ml) foi adicionado e aquecido a 120° C por 3 horas. A mistura de reação foi resfriada a temperatura ambiente (RT), arrefecida bruscamente com água e extraída com acetato de etila. A camada orgânica foi seca com sulfato de sódio e concentrada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna com acetato de etila: éter de petróleo para se obter o composto de titulação como um sólido amarelo (2,10 g, 29 %) que foi usado sem purificação adicional na etapa seguinte.

[000115] Intermediário 2: 3-(3-fluorofenil)-2-propionll-4H-cromen-4-ona: DMSO (1,90 ml, 26,82 mmol) foi adicionado ao diclorometano (70 ml) e resfriado a -78 °C. O cloreto de oxalila (1,14 ml, 13,41 mmol) foi, então, adicionado. Após 10 minutos, o intermediário 1 (2,00 g, 6,70 mmol) em diclorometano (20 ml) foi adicionado por gotejamento e agitado por 20 minutos. Trietilamina (7 ml) foi adicionado e agitado por 1 hora. A mistura de reação foi arrefecida bruscamente com água e extraída com diclorometano. A camada orgânica foi seca com sulfato de sódio e concentrada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna com acetato de etila: éter de petróleo para se obter o composto de titulação como um líquido amarelado (1,20 g, 60%) que foi usado tal como na etapa seguinte.

[000116] Intermediário 3: (+)/(-)-3-(3-fluorofenil)-2-(l-hidroxipropil)-4H- cromen-4-ona:

[000117] A uma solução de intermediário 2 (0,600 g, 2,02 mmol) em DMF (7,65 ml) sob purga de nitrogênio, o ácido fórmico: trietilamina 5: 2 azeótropo(1,80 ml) foi adicionado seguido de [(S.S)tethTsDpenRuCI] (3,0 mg). A mistura de reação foi aquecida a 80 °C por 1 hora e meia sob purga de nitrogênio contínua. A mistura de reação foi arrefecida bruscamente com água, extraída com acetato de etila, seca com sulfato de sódio e concentrada. O produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna com acetato de etila: éter de petróleo para se obter o composto de titulação como um sólido amarelo (0,450 g, 74%). Massa: 299,0 (M+).

[000118] Excesso enantiomérico: 78%, enriquecido no isômero de eluição tardia (tempo de retenção: 9,72 minutos) conforme determinado por HPLC em uma coluna de chiralpak AD-H.

[000119] Intermediário 4: (+)/(-)-3-(3-fluorofenil)-2-(l-hidroxipropil)-4H- cromen-4-ona:

[000120] O composto de titulação foi obtido como sólido amarelo (0,500 g, 83%) através do uso de um procedimento similar àquele descrito para o intermediário 3, com uso do intermediário 2 (0,600 g, 2,02 mmol), DMF (7,65 ml), ácido fórmico: trietilamina 5: 2 azeótropos (1,80 ml) e [(R.R)tethTsDpenRuCI] (3,0 mg). Massa 298,9 pm). Excesso enantiomérico: 74,8%, enriquecido no isômero de eluição rápida (tempo de retenção: 8,52 minutos) conforme determinado por HPLC em uma coluna de chiralpak AD-H.

[000121] Intermediário 5: (R)-3-(3-fluorofenil)-2-(l-hidroxipropil)-4H- cromen-4-ona:

[000122] Etapa 1: (R)-2-(l-(benzilóxi)propil)-3-(3-fluorofenil)-4H-cromen- 4-ona: A 2-(3-fluorofenil)-l-(2-hidróxifenil)etanona (2,15 g, 9,36 mmol ), em diclorometano (20 ml), HATU (4,27 g, 11,23 mmol), ácido R-(+)2-benzilóxibutírico (2,00 g, 10,29 mmol) foi adicionado e agitado por 10 minutos, então, trietilamina (14,0 ml, 101,1 mmol) foi adicionada por gotejamento e agitada a temperatura ambiente por 24 horas. A mistura de reação foi arrefecida bruscamente com água, extraída com diclorometano, seca com sulfato de sódio e concentrada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna com acetato de etila: éter de petróleo para se obter o composto de titulação como sólido amarelo (1,65 g, 45%). RMN de 1H (δ ppm, CDCI3, 400 MHz): 8,24 (dd, J = 7,9,1,5 Hz, 1H), 7,74 (dt, J= 7,1,1,7 Hz, 1H), 7,58 (dd, J = 8,3,0,4 Hz, 1H), 7,44- 7,06 (m, 10H), 4,51 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 4,34 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 4,25 (dd, J = 7,8,6,2Hz, 1H), 2,17-1,90 (m, 2H), 0,95 (t, J= 7,5 Hz, 3H), Massa 389,0 (M+).

[000123] Etapa 2: (R)-3-(3-fluorofenil)-2-(l-hidroxipropil)-4H-cromen-4- ona: A (R)-2-(l-(benzilóxi)propil)-3-(3-fluorofenil)-4H-cromen-4-ona (1,50 g, 3,86 mmol) em diclorometano (15 ml) resfriada a 0 °C e cloreto de alumínio (1,00 g, 7,72 mmol) foi adicionado em porções e agitado a temperatura ambiente por 6 horas. A mistura de reação foi arrefecida bruscamente com solução de 2N HC1, extraída com diclorometano, seca com sulfato de sódio e concentrada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna com acetato de etila: éter de petróleo para se obter o composto de titulação como sólido amarelo (0,552 g, 48%). RMN de 1H (δ ppm, CDCI3, 400 MHz): 8,24 (dd, J = 8,0,1,6 Hz, 1H), 7,72 (m, 1H), 7,52 (dd, J = 8,4,0,5 Hz, 1H), 7,44 (m, 2H), 7,12- 7,01 (m,3H), 4,49 (t, J= 7,0 Hz, 1H), 1,94 (m, 2H), 0,93 (t, J = 7,5 Hz, 3H), Massa (299,0(M+). Pureza 96,93%.

[000124] [a] D -14,73 (c = 1, CHCI3). Excesso enantiomérico: 85,92%, enriquecido no isômero de eluição rápida (tempo de retenção: 8,57 minutos) conforme determinado por HPLC em uma coluna de chiralpak AS-3R.

COMPOSTO A

[000125] (RS)- 2-(l-(9H-purin-6-ilamino)propil)-3-(3-fluorofenil)-4H- cromen-4-ona A uma solução de intermediário 1 (2,50 g, 8,41 mmol) em THF (25 ml), 9-tritil-9H-purin-6-ilcarbamato de terc-butila (4,81 g, 10,09 mmol) e trifenilfosfina (3,31 g, 12,62 mmol) foram adicionados e agitados a temperatura ambiente por 5 minutos. Diisopropilazodicarboxilato (2,5 ml, 12,62 mmol) foi adicionado e agitado a temperatura ambiente por 2 horas. A mistura de reação foi concentrada e cromatografado em coluna com acetato de etila: éter de petróleo para se obter um intermediário de cor amarela. Ao intermediário, diclorometano (65 ml) e ácido trifluoroacético (7,9 ml) foram adicionados e a mistura resultante foi agitada a temperatura ambiente por 12 horas. A mistura de reação foi, então, basificada com solução de bicarbonato de sódio aquosa, extraída com diclorometano e seca com sulfato de sódio. O produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna com metanol: diclorometano para se obter o composto de titulação como sólido marrom-claro (1,05 g, 30%). MP: 148 a 150 °C. Massa: 415,6 (M+).

COMPOSTO A1

[000126] (S)-2-(l-(9H-purin-6-ilamino)propil)-3-(3-fluorofenil)-4H- cromen-4-ona

[000127] Método A: A uma solução de intermediário 3 (0,250 g, 0,838 mmol) em THF (5ml), 9-tritil-9H-purin-6-ilcarbamato de terc-butila (0,479 g, 1,00 mmol) e trifenilfosfina (0,329 g, 1,25 mmol) foram adicionados e a mistura resultante foi agitada a temperatura ambiente por 5 minutos. Diisopropilazodicarboxilato (0,25 ml, 1,25 mmol) foi, então, adicionado e agitado a temperatura ambiente por 12 horas. A mistura de reação foi concentrada e cromatografada em coluna com acetato de etila: éter de petróleo para se obter o intermediário de cor amarela. Ao intermediário em diclorometano (6 ml), o ácido trifluoroacético (1,2 ml) foi adicionado e agitado a temperatura ambiente por 12 horas. A mistura de reação foi basificada com a solução de bicarbonato de sódio aquosa, extraída com diclorometano e seca com sulfato de sódio. O produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna com metanol: diclorometano para se obter o composto de titulação como um sólido branco-sujo (0,015 g, 4%). MP: 137 a 140 °C. RMN de 1H (δ ppm, DMSO- , 400 MHz): 12,94 (s, 1H), 8,12-8,10 (m, 4H), 7,84-7,80 (m, 1H), 7,61 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 7,50-7,41 (m, 2H), 7,28-7,18 (m, 3H), 5,20-5,06 (m, 1H), 2,10-1,90 (m, 2H), 0,84 (t, J = 3,7 Hz, 3H). Excesso enantiomérico: 77,4% conforme determinado por HPLC em uma coluna de chiralpak AD-H, enriquecida no isômero de eluição rápida (tempo de retenção = 7,90 minutos).

[000128] Método B: A uma solução de intermediário 5 (2,60 g, 8,68 mmol) em THF (52 ml), 9-tritil-9H-purin-6-ilcarbamato de terc-butila (4,96 g, 10,42 mmol) e trifenilfosfina (2,76 g, 13,03 mmol) foram adicionados e a mistura resultante foi agitada a temperatura ambiente por 5 minutos. Diisopropilazodicarboxilato (0,25 ml, 1,25 mmol) foi, então, adicionado e agitado a temperatura ambiente por 12 horas. A mistura de reação foi concentrada e cromatografada em coluna com acetato de etila: éter de petróleo para se obter o intermediário de cor amarela. Ao intermediário em diclorometano (55 ml), o ácido trifluoroacético (14,2 ml) foi adicionado e agitado a temperatura ambiente por 12 horas. A mistura de reação foi basificada com a solução de bicarbonato de sódio aquosa, extraída com diclorometano e seca com sulfato de sódio. O produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna com metanol: diclorometano para se obter o composto de titulação como sólido amarelo-claro (1,00 g, 27 %). MP: 168 a 170 °C. Massa: 416,5(M++1) Excesso enantiomérico: 86,5% conforme determinado por HPLC em uma coluna de chiralpak AD-H, enriquecida no isômero de eluição rápida (tempo de retenção = 7,90 minutos.).

[000129] Método C: O composto de titulação foi separado por meio de afecções de SFC preparativo a partir do composto A (1,090 g) em uma coluna de CHIRALPAK AY-H (250 x 30 mm; 5pπi) com uso de metanol: C(% (35:65) como a fase móvel em uma taxa de fluxo de 80 g / minutos, sólido branco-sujo (0,378 g). e.e. 100%. Temperatura Ambiente: 2,37 minutos. Massa: 416,1(M++1). MP: 149 a 152 °C.

COMPOSTO A2

[000130] (R)-2-(l-(9H-purin-6-ilamino)propil)-3-(3-fluorofenil)-4H- cromen-4-ona Método A: O composto de titulação foi como um sólido branco-sujo (0,015 g, 4%) através do uso de um procedimento similar a um descrito para o composto A1 (Método A) com uso de 9-tritil-9H-purin-6-ilcarbamato de terc-butila (0,479 g, 1,00 mmol), intermediário 4 (0,250 g, 0,838 mmol), trifenilfosfina (0,329 g, 1,25 mmol), THF (5 ml) e dusopropilazodicarboxilato (0,25 ml, 1,25 mmol), seguido de segmentação do intermediário com ácido trifluoroacético (1,2 ml) e diclorometano (6 ml). MP: 139 a 141 °C. Massa: 415,6 (M+). Excesso enantiomérico: 81,6% conforme determinado por HPLC em uma coluna de chiralpak AD-H, enriquecida no isômero de eluição tardio (tempo de retenção = 10,81 minutos.).

[000131] Método B: O composto de titulação foi separado por meio de afecções de SFC preparativo a partir do composto A (1,090 g) em uma coluna de CHIRALPAK AY-H (250 x 30 mm; 5pπi) com uso de metanol: C(% (35:65) como a fase móvel em uma taxa de fluxo de 80 g / minutos, sólido branco-sujo (0,434 g). e.e. 98%. Temperatura Ambiente: 3,71 minutos. Massa: 416,1 (M++1). MP: 162 a 164 °C.

ENSAIOS BIOLÓGICOS

[000132] As propriedades farmacológicas dos compostos descritos no presente documento podem ser confirmadas por vários ensaios farmacológicos. Os ensaios farmacológicos que foram executados com os compostos, de acordo com a invenção e/ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, são exemplificados abaixo.

ENSAIO 1: DETERMINAÇÃO FLUORESCENTE DE ATIVIDADE ENZIMÁTICA DE PI3-QUINASE

[000133] O fosfoinositídeo-3-quinase (PI3K) pertence a uma classe de quinases de lipídio que tem um papel crítico na regulação de diversos processos celulares chave. O PI3K tem capacidade para realizar fosforilação da posição 3- hidroxi de fosfoinositóis gerando, desse modo, segundos mensageiros envolvidos em eventos de sinalização a jusante. O ensaio de fluorescência homogênea resolvida no tempo (HTRF) permite a detecção de 3,4,5-trifosfato (PIP3) formado como um resultado de fosforilação de isoformas de 4,5-bifosfato de fosfotidilinositol (PIP2) por isoformas PI3K tal como α, β, y OUδ.

[000134] A atividade de isoforma PI3K para α, β, y ou δ foi determinada com uso de um PI3K human HTRF™ Assay Kit (Millipore, Billerica, MA) com modificações. Todas as incubações foram executadas em temperatura ambiente. Brevemente, 0,5 pl de 40X inibidor (em 100% de DMSO) ou 100% de DMSO foram adicionados a cada cavidade de uma placa branca com 384 cavidades (Greiner Bio-ona, Monroe, NC) que contém a mistura de 14,5 pl 1X de tampão de reação/PIP2 (10 mM MgCI2, 5 mM DTT, 1,38 pM PIP2) com ou sem enzima, seguido de 5 pl/cavidade de 400 pM ATP e incubado por 30 minutos adicionais. A reação foi interrompida através da adição de solução de parada de 5 pl/cavidade (Millipore, Billerica, MA). 5 pl de mistura de detecção (Millipore, Billerica, MA) foram, então, adicionados a cada cavidade e foram incubados por 6 a 18 horas no escuro. A razão de HRTF foi medida em um leitor de microplaca (BMG Labtech., Alemanha) em um comprimento de onda de excitação de 337 nm e comprimentos de onda de excitação de 665 e 615 nm com um tempo de integração de 400 mseg que contam o atraso de 50 mseg. Os resultados para os compostos A1 e A2 são mostrados na Tabela 1 abaixo. Os dados comparativos para o composto A1 e Exemplo 47 do documento ne WO 11/055215 são fornecidos na Tabela 2. TABELA 1

ENSAIO 2: ENSAIO DE PROLIFERAÇÃO CELULAR IN VITROEM LINHAGENS CELULARES COM LEUCEMIA

[000135] Os ensaios de inibição de crescimento foram executados com uso de 10% de meios suplementados por FBS. As células foram semeadas em uma concentração de 5.000 a 20.000 células/cavidade em uma placa com 96 cavidades. Os compostos de teste em uma faixa de concentração de 0,01 a 10.000 nM foram adicionados após 24 horas. A proliferação foi avaliada com uso de teste de redução de corante de brometo de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5- difeniltetrazólio (MTT) a 0 h (antes da adição do composto de teste) e 72 h após a adição do composto de teste. A absorvância foi lida em um Fluostar Optima (BMG Labtech, Alemanha) em um comprimento de onda de 450 nm. Os dados horas analisados com uso de GraphPad Prism e porcentagem de inibição divido ao composto de teste comparado ao controle foi calculada consequentemente.

[000136] O composto A1 causou uma redução na viabilidade celular de T-linfoma (MOLT-4, Jurkat, CCRF-CEM, Hut-78 & HuT-102) com valores de GI50 que variam de 1 a 5 pM para a faixa de dose testada. Adicionalmente, o composto não exibiu qualquer citotoxicidade evidente no período de incubação de 72 horas até 10 pM.

ENSAIO 3: INIBIÇÃO DE FOSFORILAÇÃO DE AKT EM LINHAGENS DE CÉLULAS LEUCÊMICAS

[000137] MOLT-4, Jurkat, CCRF-CEM, Hut-78, HuT-102, Sez4 e células de HH foram incubadas com concentrações desejadas de composto por 48 horas. As células foram lisadas e pAKT determinado por Western Blotting. As faixas foram quantificadas com uso de ImageJ e normalizadas para actina.

[000138] O composto A1 causou uma redução na expressão de pAKT em linhagens de células de T-linfoma (MOLT-4, Jurkat, CCRF-CEM, Hut-78 & HuT-102) com os valores de EC50 que variam de 0,5 a 2 pM para a faixa de dose testada. Os resultados são mostrados na Figura 8.

ENSAIO 4: INIBIÇÃO DE SINALIZAÇÃO DE PI3K Δ E T EM BASÓFILOS DO SANGUE HUMANO TOTAL

[000139] A sinalização de PI3K δe yem basófilos manifestados por uma alteração de expressão de CD63 induzida por anti-FceRI ou fMLP é um marcador farmacodinamico útil determinado com uso do Flow2CAST kit (Buhlmann Laboratories, Suíça). Brevemente, isso envolve as seguintes etapas:

[000140] • Misturar a amostra de sangue anticoagulada através da inversão do tubo de venipuntura, diversas vezes;

[000141] • Preparar tubos de polipropileno ou poliestireno de 3,5 ml isento de pirogênio e frescos adequados para medições de citometria de fluxo;

[000142] • Adicionar 49 pl de sangue total do paciente em cada tubo;

[000143] • Adicionar 1 pl de 10% de DMSO (plano de fundo) ou composto (10% de DMSO) aos tubos atribuídos e misturar suavemente. Incubar em temperatura ambiente por 15 minutos;

[000144] • Medir com pipeta 50 pl do tampão de simulação (plano de fundo) ou anti- FceRI Ab ou fMLP para cada tubo;

[000145] • Adicionar 100 pl de tampão de simulação a cada tubo;

[000146] • Misturar suavemente. Adicionar 20 pl de Reagente de manchamento (mistura de 1: 1 de FITC-CD63 e PE- CCR3) a cada tubo;

[000147] • Misturar suavemente, cobrir os tubos e incubar por 15 minutos a 37 °C em um banho de água, (com uso de um incubador, terá cerca de 10 minutos a mais de tempo de incubação devido à transferência de calor menos eficiente);

[000148] • Adicionar 2 ml de Reagente de lise pré-aquecidos (18 a 28 °C) a cada tubo, misturar suavemente;

[000149] • Incubar por 5 a 10 minutos a 18 a 28 °C;

[000150] • Centrifugar os tubos por 5 minutos em 500 x g;

[000151] • Decantar o sobrenadante através do uso de mata-borrão;

[000152] • Ressuspender o pélete de célula com 300 a 800 pl de tampão de lavagem; e

[000153] • Vortexar suavemente e adquirir os dados na citometria de fluxo dentro do mesmo dia.

[000154] Células positivas de CD63 positive em porcentagem dentro da população de basófilo sincronizada foram determinadas em diferentes grupos de tratamento e normalizadas para controle de veículo.

[000155] Composto A1 exibiu um EC50 de < 40 nM para FceRI(PI3K δ) e um IC50 de < 40 nM para fMLP (PI3K y) (n=10). Os resultados são mostrados na Figura 9.

ENSAIO 4A: ATIVIDADE CELULAR QUE DEMOSTRA SELETIVIDADE DE COMPOSTO A1 PARA ISOFORMA DE PI3K DELTA E PI3K GAMA ENSAIO 4A1: PROLIFERAÇÃO DE CÉLULA B INDUZIDA POR ANTI-IGM (PARA SELETIVIDADE DE PI3KΔ)

[000156] O objetivo desse estudo foi de avaliar o potencial inibitório de composto A1 na proliferação de célula B humana induzida poranti-IgM.

PLAQUEAMENTO E TRATAMENTO

[000157] • As células B isoladas foram ressuspensas para 1,0 x 106 de células por ml. 100 pl de suspensão de células foi adicionado a cada cavidade de uma placa com 96 cavidades. Os triplicados foram mantidos.

[000158] • 50 pl de diluição de fármaco foi adicionado e bem misturado. Um bloco bruto de DMSO e bloco bruto de indutor foram mantidos.

[000159] • A placa tratada foi incubada por 30 minutos a 37 °C, 5% de CO2 e, então, 50 pl de indutor 4X foi adicionado e misturado através de pipetagem.

[000160] • A placa foi incubada a 37 °C, 5% de CO2 por 72 horas.

[000161] • Meio foi aspirado e 150 pl de DMSO foi adicionado para dissolver os cristais de formazan.

[000162] • Absorvência foi lida em A5βo θ Aβ4o nm.

[000163] Os dados demonstraram que o potencial inibitório de composto A1 em PI3K5 mediou a indução de proliferação de células B humanas. Consulte, por exemplo, Baeker et al. Journal of Immunology, 134: 3532 a 3538=1985

[000164] Ensaio 4A2: A fosforilação de AktS473 induzida por LPA em Fibroblastos 3T3 (para seletividade de PI3Kβ)

[000165] O objeto desse estudo foi de determinar o efeito de composto Al em PI3Kβ quinase mediado da fosforilação de AktS473 induzida por LPA em fibroblastos 3T3.

[000166] • células 3T3 foram tratadas com concentrações desejadas do composto de teste por 15 minutos. 1 ml de 2X LPA foi adicionado de modo que a concentração final foi 5 pM e foi incubado por 5 minutos.

[000167] • Meio foi descartado e lavado com 1 ml de IX PBS resfriado.

[000168] • 250 pl de tampão de lise celular foi adicionado e incubado em gelo por 30 minutos.

[000169] • Amostras foram centrifugadas e o sobrenadante estava a - 80 °C até análise.

[000170] • Amostras foram analisadas por Western Blotting com uso de pAKT (S473) como a primária e IgG-HRP de anti-coelho como um anticorpo secundário.

[000171] • Intensidade das faixas foi determinada com uso de ImageJ 1,42q (NIH, USA) e normalizada para Actina (controle de carregamento). Os dados foram plotados com uso de GraphPad Prism (Versão 5.02).

[000172] Os resultados demonstraram a seletividade de composto A1 sobre o isoforma beta de PI3K. Consulte Albuquerque et al, J. Biol. Chem. 278, 39.830 a 39.838 (2003).

ENSAIO 4A3: FOSFORILAÇÃO DE AKTS473 INDUZIDA POR C5A EM MACRÓFAGOS RAW 264.7 (PARA SELETIVIDADE DE P13KQ

[000173] O objetivo desse estudo foi de determinar o efeito de composto A1 em P13Ky quinase mediado da fosforilação de AktS473 induzida por c5a em magrófagos RAW 264.7.

[000174] • Células RAW 264.7 foram tratadas com concentrações desejadas do composto de teste por 15 minutos. 1 ml de 2X c5a foi adicionado de modo que a concentração final fosse 50 ng/ml e foi incubado por 15 minutos.

[000175] • Meio foi descartado e lavado com 1 ml de IX PBS resfriado.

[000176] • 250 pl de tampão de Use celular foi adicionado e incubado em gelo por 30 minutos.

[000177] • Amostras foram centrifugadas e o sobrenadante foi armazenado a -80 °C até análise

[000178] • Amostras foram analisadas por Western Blotting com uso de pAKT (S473) como a primária e IgG-HRP de anti-coelho como um anticorpo secundário.

[000179] • Intensidade das faixas foi determinada com uso de ImageJ 1,42q (NIH, USA) e normalizada para Actina (controle de carregamento). Os dados foram plotados com uso de GraphPad Prism (Versão 5.02).

[000180] A inibição de pAktS473, um marcador a jusante de sinalização de PI3K5 sugere uma função para composto A1 nas trajetórias oncogênicas reguladas bor Akt em células de RAW 264.7 induzidas por c5a. Consulte To et al. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 182, 897 a 904 (2010).

ENSAIO 4A4: FOSFORILAÇÃO DE AKT INDUZIDA POR PDGF EM CÉLULAS 3T3 (PARA SELETIVIDADE DE PI3K)

[000181] O objeto desse estudo foi de determinar o efeito de composto A1 em PI3Ka quinase mediado da fosforilação de AktS473 em 3T3 fibroblastos induzidos por PDGF.

[000182] • Células 3T3 foram tratadas com concentrações desejadas do composto de teste por 15 minutos. 1 ml de 2X PDGF foi adicionado de modo que a concentração final fosse 20 ng/ml e foi incubado por 10 minutos.

[000183] • Meio foi descartado e lavado com 1 ml de IX PBS resfriado.

[000184] • 250 pl de tampão de lise celular foi adicionado e incubado em gelo por 30 minutos.

[000185] • Amostras foram centrifugadas e o sobrenadante foi coletado e armazenado a -80 °C até análise

[000186] • Amostras foram analisadas por Western Blotting com uso de pAKT (S473) como a primária e IgG-HRP de anti-coelho como um anticorpo secundário.

[000187] • Intensidade das faixas foi determinada com uso de ImageJ 1,42q (NIH, USA)e

[000188] normalizada para Actina (controle de carregamento). Os dados foram plotados com uso de GraphPad Prism (Versão 5.02).

[000189] Nenhuma inibição foi observada a 10 pM de composto A1, que demostra a seletividade de composto Al sobre o isoforma alfa de PI3K. Consulte Albuquerque et al, J. Biol. Chem. 278, 39.830 a 39.838 (2003).

[000190] A Tabela abaixo resume os resultados dos Ensaios 4A1 a 4A4.

ENSAIO 5: INIBIÇÃO DE APOPTOSE EM LINHAGENS CELULARES COM LEUCEMIA

[000191] A apoptose em células leucêmicas foi determinada com uso de um kit Caspase 3 in-situ (Millipore, US) conforme delimitado abaixo:

[000192] • Semear as células leucêmicas - em uma densidade de 1 x106 células/cavidade em uma placa com 6 cavidades

[000193] • Adicionar composto de teste/DMSO em concentrações desejadas

[000194] • Incubar a placa por 24 horas a 37 °C em 5% de CO2 incubador

[000195] • Coletar as células em um tubo de centrífuga de 2 ml

[000196] • Adicionar 1,6 pl de reagente 5X FLICA recentemente preparado e misturar as células agitando-se

[000197] levemente os tubos

[000198] • Incubar os tubos por 1 hora a 37 °C sobre 5% de CO2

[000199] • Adicionar 2 ml de tampão de lavagem 1X a cada tubo e misturar

[000200] • Centrifugar as células a <400 x g por 5 minutos em temperatura ambiente.

[000201] • Remover e descartar cuidadosamente o sobrenadante e vortexar suavemente o pélete celular para interromper qualquer acúmulo de célula a célula.

[000202] • Ressuspender o pélete celular em 300 pl de tampão de lavagem 1X

[000203] • Colocar 100 pl de cada suspensão de células em cada uma dentre as duas cavidades de uma placa de microtitulação escura. Impedir a criação de bolhas.

[000204] • Ler a absorbância de cada microcavidade com uso de um comprimento de onda de excitação de 490 nm e um comprimento de onda de emissão de 520 nm

[000205] • Aumento em porcentagem na atividade da caspase-3 manifestado por um aumento na fluorescência em comparação ao bloco bruto de controle deve ser calculado.

[000206] Composto A1 causou uma indução de dose dependente em atividade da caspase-3 em linhagens celulares T-linfoma (MOLT-4, Jurkat, CCRF- CEM, Hut-78 & HuT-102).

ENSAIO 6: TRIAGEM PARA INIBIÇÃO DE PAKT EM CÉLULAS DE CTCL PRIMÁRIAS HUMANAS

[000207] Análise de citometria de fluxo de inibição de pAKT: As células T malignas purificadas foram isoladas dos doadores e cultivadas de um dia para o outro em RPMI/1% BSA. As células foram incubadas com o composto de teste por 1,5 horas com uma mistura de citocinas adicionada nos 30 minutos finais. A composição da mistura de citocinas foi 20 ng/ml IL2 + 5 ng/ml IL7 + 10 ng/ml IL15 + 10% FBS. A fosforilação de AKT foi determinada pela citometria de fluxo.

[000208] O tratamento com o composto A1 causou uma fosforilação de AKT de redução de dose-dependente com EC50 que varia a partir de 40 a 300 nM (% de dados de inibição).

ENSAIO 6A: TRIAGEM PARA ATIVIDADE ANTICÃNCER EM CÉLULAS DE CLL HUMANOS

[000209] As células de CLL primários foram enriquecidas com uso de células B de Rosette-Sep a partir da Tecnologia de células-tronco, em geral, gerando pureza de > 97% de células de CLL/células B. As células foram semeadas a 2,5 x 105 por cavidade em 96 cavidades com meio isento de soro (SFM) ou SFM + 10% de soro bovino fetal inativado por aquecimento (volume de 100 microlitros) na presença de concentrações desejadas do composto de teste e cultivadas por 3 dias a 37 °C em um incubador de dióxido de carbono. A citotoxicidade foi determinada com uso do ensaio de MTS.

[000210] O composto A1 induz a citotoxicidade em células de CLL com um EC50 mediano de < 100 nM em meio isento de soro < 700 nM em 10% de meio de FBS.

ENSAIO 6B: TRIAGEM PARA ATIVIDADE ANTICÂNCER EM CÉLULAS DE LINFOMA B DERIVADO DO PACIENTE

[000211] As células primárias dos tumores linfoides foram expostas ao composto de teste [composto A1] para avaliar a indução de óbto celular. As células foram derivadas de linfoma difuso de grandes células B (DLBCL), linfoma de células do manto (MCL), linfoma esplénico da zona marginal (SMZL), linfoma extranodal da zona marginal (EMZL) ou leucemia linfocítica crônica (CLL, no.=l). As células foram tratadas com concentrações desejadas do composto e a apoptose (Annexin V/PI) foi avaliada por citometria de fluxo após um período de incubação de 48 horas.

[000212] Quase todas as células primárias derivadas dos linfomas de célula B se submeteram a um aumento no óbito celular quando expostas ao composto de teste (composto A1) em uma concentração de 4 pM. O fenômeno mostrou-se mais evidente dentre as células primárias derivadas dos linfomas de células pequenas (MZL, MCL e CLL).

ENSAIO 6C: INIBIÇÃO DE FOSFORILAÇÃO DE AKT EM LINHAGENS DE LINFOMA DE CÉLULA B

[000213] As células de LY-1, LY-10, Daudi, JEKO, REC e MAVER foram incubadas com concentrações desejadas de [composto A1] por 48 horas. As células foram lisadas e pAKT foi determinado por Western Blotting. As faixas foram quantificadas com uso de ImageJ e normalizadas para actina.

[000214] O composto A1 exibiu um EC50 de 20 a 200 nM através das linhagens de linfoma de célula B testadas.

[000215] Ensaio 6D: Ensaio de citocina em células T primárias de CD3 anti-humano e CD28 Vo-estimulado

[000216] O objetivo desse estudo foi avaliar o potencial inibitório de composto A1 em citocinas produzidas por células T primárias de CD3/CD28 anti- humano coestimuladas.

PLAQUEAMENTO E TRATAMENTO

[000217] • Placas foram revestidas com 50 pl de CD3 anti-humano em uma concentração de 100 ng/ml de um dia para o outro a 4 °C ou por 2 horas a 37 °C. Após incubação, as placas foram lavadas duas vezes com PBS estéril para remover o anticorpo não ligado.

[000218] • As células T humanas isoladas fora ressuspensas a 0,625 x 106 células por ml em tubos de 1,5 ml e 1 pl de diluição de fármaco (1.000X) foi adicionado. Um bloco bruto de DMSO e bloco bruto não induzido foram mantidos.

[000219] • Células foram incubadas com composto em temperatura ambiente por 30 minutos e, então, adicionadas às cavidades revestidas de CD3 anti-humano de uma placa com 96 cavidades, 240 pl cada uma. CD28 anti- humano foi adicionado imediatamente, 10 pl (25X) por cavidade.

[000220] • A placa foi incubada a 37 °C, 5% de CO2 por 24 horas.

[000221] • Placas foram centrifugadas a 4.000 rpm em temperatura ambiente, o sobrenadante foi coletado e armazenado a -20 °C.

[000222] • Citocinas foram determinadas com uso de um kit ELISA comercial com absorbância lida em 450 e 570 nm.

[000223] Os valores de IC50 foram calculados a partir de oito experimentos independentes. O composto A1 inibiu as citocinas de célula T induzidas por CD3-CD28 anti-humano com um IC50 de 24, 9,54 e 20,6 nM para TNFa, IFNy e IL2 respectivamente. Os resultados são mostrados na Figura 10.

ENSAIO 7: NEUTROFILIA PULMONAR INDUZIDA POR LIPOPOLISSACARÍDEO EM MODELO DE RATO WISTAR FÊMEA

[000224] Uma ativação subsequente e recrutamento exagerado de neutrofila é provável de ser importante para o desenvolvimento e, certamente, de diversas doenças inflamatórias nas vias respiratórias e pulmões, tais como asma grave, doença pulmonar obstrutiva crônica, fibrose cística e síndrome do desconforto respiratório agudo. Os mecanismos pelos quais a neutrofila contribuem para essas doenças podem envolver a liberação de enzimas proteolíticas, tais como elastase de neutrófilo e radicais de oxigênio livre. Quando liberados, esses compostos podem causar broncoconstrição, hiperreatividade bronquial, hiperssecreção, danos epiteliais e remodelagem de tecido nas vias respiratórias.

[000225] Após o período de quarentena, os animais em jejum foram selecionados aleatoriamente e divididos em vários grupos dependendo de seus pesos corporais. O composto de teste [composto A1] foi preparada ramo uma suspensão em um veículo que consiste em 0,5% de metilcelulose em que Tween 80 como um agente de suspensão. O composto ou veículo foi administrado por gavagem oral em um volume de 10 ml/kg. Os ratos Wistar fêmeas foram anestesiados com cetamina e a solução de LPS foi administrada intratraquealmente uma hora após o composto administração em uma dose de 1 mg/kg. 6 horas após a instalação de LPS, os animais foram exsanguinados sob anestesia e, então, a traqueia foi canulada e os pulmões foram lavados com 5 ml de alíquotas de PBS tratado com heparina (1 unidade/ml) quatro vezes através da cânula traqueal (volume total de 20 ml). O fluido da lavagem broncoalveolar (BAL) tem sido armazenado a 2 a 8 °C até ser analisado para contagem de leucócito diferencial e célula total. O fluido de broncoalveolar foi centrifugado (500x g por 10 minutos) e o pélete de célula resultante foi ressuspenso em 0,5 ml de solução salina tratada com heparina. Os números de totais de leucócitos foram determinados em fluido ou sangue de BAL através do uso de uma contagem de célula sanguínea e foram ajustados a 1x106 célula/ml. A contagem de células diferencial foi calculada manualmente. Centenas de microlitros da suspensão de células foram centrifugados com uso de citospina 3 para preparar um esfregaço de célula. O esfregaço de célula foi manchado com uma solução de manchamento com sangue para diferenciação e os lados foram microscopicamente observados para identificar eosinofila de acordo com suas características morfológicas. O número de cada tipo de célula entre 300 leucócitos no esfregaço de célula foi determinado e expressado como uma porcentagem. O número de eosinofila em cada BALf ou sangue foi calculado.

[000226] O composto A1 mostrou uma redução dose-dependente de infiltração de neutrofila nos pulmões com um ED50 de 6,5 mg/kg que sugere uma função terapêutica em distúrbios inflamatórios. Os resultados são mostrados na Figura 1.

ENSAIO 8: MODELO DE INFLAMAÇÃO NA BOLSA DE AR EM RATOS INDUZIDA POR LIPOPOLISSACARÍDEO

[000227] A formação e o recrutamento de leucócito de mediadores pró inflamatórios, incluindo citoquinas diferentes, são a marca de uma resposta inflamatória. O modelo de bolsa de ar foi originalmente desenvolvido como uma sinóvia fac-símile para o estudo de processos inflamatórios que ocorrem em artrites reumatoides (RA). O modelo permite a quantificação diferencial de espécies de leucócito que acumulam na cavidade de bolsa de ar (tecido) bem como aquela que transmigra na cavidade de bolsa de ar (lavagem) e permite a caracterização das moléculas de adesão e quimiocinas responsáveis pela diapedese induzida por uma variedade de estímulos inflamatórios.

[000228] Ratos Wistar fêmeas (175 a 200 g) foram aclimatizados por sete dias antes do início do experimento. Os animais foram distribuídos de modo aleatório em vários grupos com base em seus pesos corporais. Os animais foram anestesiados com éter e bolsas de ar subcutâneas foram feitas injetando-se 20 ml de ar estéril sob a pele na área intraescapular (dia 0) e mantidas com uma segunda injeção de 10 ml de ar filtrado estéril no dia 4. No dia 6, tratamento oral foi iniciado 1 hora antes da indução de inflamação por injeção subcutânea de solução de LPS no dia 6. Um volume de 5 ml de solução de LPS dissolvida em solução salina estéril (100 pg/kg) foi injetado em cada bolsa. As amostras de fluido de bolsa foram tiradas 6 horas após a administração de LPS lavando-se a bolsa com 5 ml de solução salina estéril e retirando-se 4 ml de fluido. O número de leucócitos presente no fluido de bolsa foi determinado microscopicamente com o uso de um hemocitômetro. O conteúdo de célula diferencial foi determinado por exame microscópico de esfregaço de fluido colorido com Diff-Quik.

[000229] O composto A1 ocasionou uma redução dose-dependente de migração de neutrófilo para a bolsa de ar do rato com um ED50 de 2,6 mg/kg, que sugere uma função terapêutica em artrite reumatoide. Os resultados são mostrados na Figura 2.

ENSAIO 9: PRODUÇÃO DE TNF-A INDUZIDA POR LIPOPOLISSACARÍDEO

[000230] Ratos Wistar fêmeas em jejum foram selecionados aleatoriamente em diferentes grupos dependendo de seus pesos corporais. O composto de teste (Composto A1) foi preparado como uma suspensão em um veículo que consiste em 0,5% de metilcelulose. O composto ou veículo foi administrado por ingestão por sonda esofágica em um volume de 10 ml/kg. A solução de LPS foi administrada de modo intraperitonial uma hora após a administração do composto a uma dose de 0,3 mg/kg. O sangue foi coletado em tubos separadores de soro por meio de perfuração cardíaca noventa minutos após a injeção de LPS. O soro foi separado e armazenado a -20 °C e será analisado para TNFa por ELISA.

[000231] O Composto A1 teve as concentrações de TNFa de plasma reduzidas, o que sugere uma função terapêutica em distúrbios inflamatórios (percentual de inibição observado em 1, 3 e 10 mg/kg foi de 5%, 15% e 40%, respectivamente). Os resultados são mostrados na Figura 3.

ENSAIO 10A: EOSINOFILIA PULMONAR INDUZIDA COM OVALBUMINA EM COBAIAS MACHOS

[000232] A inflamação de via respiratória e hiperresposividade (AHR) são características e recursos distinguíveis de asma brônquica. A provocação de camundongos pré-sensibilizados com o mesmo alergênico induz inflamação de via respiratória com infiltração eosinofílica preferencial e, como consequência, AHR. A eosinofilia pulmonar e a remodelagem de via respiratória em conjunto com controle neural alterado de forma da via respiratória e descamação epitelial de via respiratória podem contribuir para AHR em asma.

[000233] Após o período de quarentena, 0,3 ml de amostras sanguíneas foram coletadas da veia orbital pelo método de plexo retro-orbital de cada animal individualmente e analisados em um analisador de célula (ADVIA 2120, Siemens). Com base em sua contagem de célula total, as cobaias foram selecionadas aleatoriamente e divididas em vários grupos. A pina da orelha foi marcada com uma caneta de marcação inapagável para identificação. No dia 0, os pesos foram registrados e os animais foram sensibilizados com 50 pg de ovalbumina (OVA) e 10 mg de solução de alume (1 ml) de modo intraperitonial. No dia 7 e dia 14, o protocolo de sensibilização acima foi repetido. Os animais foram observados para qualquer sinal de enfermidade ou reação à sensibilização até o dia 19 e os mesmos registrados se ocorridos. Nos dias 19, 20 e 21, após o tratamento com o composto de teste por ingestão por sonda esofágica, 30 minutos depois, os animais foram expostos a 0,5 % p/v, 0,5% e 1% de indução de ovalbumina, respectivamente. Os animas do grupo de controle e simulação foram tratados com 0,5% p/v de metil celulose (veículo). Os grupos de controle de simulação foram sensibilizados com 10 mg de alume nos dias 0, 7 e 14 e expostos à solução salina (SAL) com a mesma taxa de nebulização nos dias 19, 20 e 21. Vinte horas após a última indução de OVA, a hiperreponsividade da via respiratória foi medida por pletismografia de corpo inteiro contra doses cumulativas de indução de metacolina (75, 100, 125 e 150 pg/ml), após medir a resposta da via respiratória, as amostras sanguíneas e o fluido de BAL foram coletados. As amostras foram analisadas para a contagem de células totais usando-se câmara de neubauer sob microscópio e a contagem de leucócito diferencial foi realizada manualmente.

[000234] Conforme ilustrado nas Figuras 4A e 4B, o Composto A1 ocasionou uma redução dose-dependente significativa na hiperresposividade de via respiratória contra a indução de metacolina de cobaias sensibilizadas.

[000235] Conforme ilustrado nas Figuras 4C a 4E, o Composto A1 ocasionou uma redução dose-dependente significativa em infiltração de eosinófilo no fluido de lavado broncoalveolar de cobaias sensibilizadas.

ENSAIO 10B: MODELO DE ASMA MURINO

[000236] A inflamação de via respiratória e hiperresposividade (AHR) são características e recursos distinguíveis de asma brônquica. A provocação de camundongos pré-sensibilizados com o mesmo alergênico induz inflamação de via respiratória com infiltração eosinofílica preferencial e, como consequência, AHR. A eosinofilia pulmonar e a remodelagem de via respiratória em conjunto com controle neural alterado de forma da via respiratória e descamação epitelial de via respiratória podem contribuir para AHR em asma. Após o período de quarentena, com base em seus pesos corporais, os camundongos foram selecionados aleatoriamente e divididos em quatro grupos (n=7). As caudas foram marcadas com uma caneta de marcação inapagável para identificação. No dia 0, os pesos foram registrados e os animais foram sensibilizados com 100 pg de ovalbumina e 10 mg de solução de alume (0,2 ml) de modo intraperitonial. No dia 7 e dia 14, o protocolo de sensibilização acima foi repetido. Os animais foram observados para qualquer sinal de enfermidade ou reação à sensibilização até o dia 24 e os mesmos registrados se ocorridos. Nos dias 24, 25 e 26, após o tratamento com composto de teste por ingestão por sonda esofágica, 30 minutos depois, os animais foram expostos a 10 % p/v de indução de ovalbumina. Os grupos de controle e simulação foram tratados com 0,5% p/v de metil celulose (veículo). Os grupos de controle de simulação foram sensibilizados com 10 mg de alume nos dias 0, 7 e 14 e expostos a solução salina com a mesma taxa de nebulização nos dias 24, 25 e 26. Quarenta e oito horas após a última indução de OVA, a hiperreponsividade da via respiratória foi medida por pletismografia de corpo inteiro contra doses cumulativas de indução de metacolina (2,5, 10, 50 e 100 mg/ml), após medir a resposta da via respiratória, as amostras sanguíneas e o fluido de BAL foram coletados. As amostras foram analisadas para contagem de células totais usando-se câmara de neubauer sob microscópio e a contagem de leucócito diferencial foi realizada manualmente. Conforme ilustrado nas Figuras 5A e 5B, o Composto A1 a uma dose de 3 mg/kg ocasionou uma redução significativa na hiperresposividade de via respiratória contra a indução de metacolina de camundongos sensibilizados a ovalbumina.

[000237] Conforme ilustrado nas Figuras 5C a 5E, o Composto A1 a uma dose de 3 mg/kg ocasionou uma inibição significativa de infiltração de eosinófilo no fluido de lavado broncoalveolar de camundongos sensibilizados a ovalbumina.

ENSAIO 11: ARTRITE INDUZIDA POR COLÁGENO EM RATOS DE LEWIS

[000238] Os ratos Wistar fêmeas foram aclimatizados por sete dias antes do início do experimento e foram distribuídos de modo aleatório em vários grupos com base em seus pesos corporais. No dia 0, os animais foram tratados com injeção intradérmica de 500 pg de colágeno bovino do tipo II emulsificado com adjuvante de Freund completo (IFA) contendo MTB (4 mg/ml) entregue na base da cauda. No dia 7, após a imunização primária, os animais foram tratados por injeção de reforço de 300 pg de Cll em adjuvante de Freund incompleto por injeção intradérmica na base da cauda. O princípio de artrite nas juntas do tornozelo se tornou visivelmente aparente entre os dias 12 e 14. Os animais foram tratados com o composto de teste ou veículo (administrado oralmente) a partir do dia após o princípio de artrite até o final do experimento (dia 28) como um grupo terapêutico. As classificações de artrite foram tomadas por exame visual de sinais de inflamação de junta regularmente ao longo do período de estudo. Os pesos corporais e volumes de pata, espessura de pata foram tirados nos dias 0, 3, 7, 10, 12, 14, 17 21, 24 e 28. No d28, no final do estudo, sangue foi retirado na necropsia e processado para o soro ou plasma e todas as juntas foram tiradas e ambas as patas dianteiras e patas traseiras foram fixadas em formalina a 10% para análise de histopatologia após retirar um pequeno pedaço de tecido de cada junta e armazenadas a -80°C para análise de citocina em homogenato de tecido. Critérios de classificação clínica para patas dianteiras e traseiras: 0 = normal; 1 = uma pata traseira ou dianteira afetada ou eritema difuso e inchação mínimos; 2 = duas patas traseira ou dianteira afetadas ou eritema difuso e inchação brandos; 3 = três patas traseira ou dianteira afetadas ou eritema difuso e inchação moderados; 4 = eritema difuso e inchação marcados, ou = quatro juntas de dedo afetadas; 5 = eritema difuso grave e inchação grave na pata inteira, incapaz de flexionar os dedos.

[000239] O Composto A1 dosado terapeuticamente no modelo CIA de rato demonstra eficácia significativa na redução de inchação de joelho, assim como de tornozelo.

[000240] A análise histológica de juntas no final do estudo demonstra preservação estrutural completa em 15 mg/kg de Composto A1. Para comparação, um animal dosado com veículo mostra inflamação sinovial (S) e evidência significativa de reabsorção de osso, formação de pano e degradação de cartilagem e, conforme ilustrado nas Figuras 6A a 6D, o Composto A1 mostra uma redução significativa nas classificações histopatológicas individuais e somadas tanto para joelho como para tornozelo.

ENSAIO 12: INFILTRAÇÃO CELULAR AGUDA INDUZIDA POR CSE EM CAMUNDONGOS BALB/C MACHOS

[000241] Os animais (camundongos Balb/c machos) devem ser aclimatizados por sete dias antes do início do experimento. Os animais devem ser distribuídos de modo aleatório em vários grupos com base em seus pesos corporais. No dia 1, os camundongos devem ter o composto de teste ou veículo administrado por rota oral/intranasal e após 1 hora da administração do composto de teste os animais devem ser anestesiados com éter e extrato de fumaça de cigarro deve ser administrado por rota intranasal em volume de 50 pl/camundongo e repetir a exposição ao CSE nos animais diariamente após a administração do composto de teste por 4 dias (d1 a d4). No dia 5, 24 horas após a última exposição ao CSE, os animais devem ser dessangrados sob anestesia, e a traqueia deve ser canulada e os pulmões são lavados com alíquotas de 0,5 ml de PBS tratado com heparina (1 unidade/ml) 4 vezes através de cânula traqueal (volume total de 2 ml). O BAL armazenado a 2 a 8 °C até ser analisado para contagem de células totais e de leucócito diferencial. O fluido broncoalveolar deve ser centrifugado (500xg por 10 min) e o pélete de célula resultante tem que ser ressuspenso em 0,5 ml de solução salina tratada com heparina. O número total de leucócitos deve ser determinado em fluido de BAL e sangue com o uso de um contador de célula sanguínea e ajustado para 1x106 células/ml. A contagem de célula diferencial deve ser calculada manualmente. Quarenta microlitros de suspensão de células devem ser centrifugados com o uso do cytospin 3 para preparar um esfregaço celular. O esfregaço celular deve ser colorido com uma solução de coloração de sangue para a diferenciação e tem que ser observado microscopicamente para identificar eosinófilos de acordo com suas características morfológicas. O número de cada tipo de célula dentre 300 leucócitos no esfregaço celular deve ser determinado e ser expresso como uma porcentagem, e o número de neutrófilos e macrófagos em cada BALf devem ser calculados.

ENSAIO 13: INFILTRAÇÃO CELULAR SUBCRÔNICA INDUZIDA POR CSE EM CAMUNDONGOS BALB/C MACHOS

[000242] Os animais (camundongos Balb/c machos) devem ser aclimatizados por sete dias antes do início do experimento. Os animais devem ser distribuídos de modo aleatório em vários grupos com base em seus pesos corporais. No dia 1, os animais devem ser anestesiados com éter e extrato de fumaça de cigarro deve ser administrado por rota intranasal em volume de 50 pl/camundongo e repetir a exposição ao CSE nos animais diariamente por oito dias (d1 a d8). No dia 9, os camundongos devem ter o composto de teste ou veículo administrado por oral/rota intranasal e após 1 hora da administração do composto de teste os animais devem ser anestesiados com éter e extrato de fumaça de cigarro deve ser administrado por rota intranasal em volume de 50ul/camundongo e os animais devem ser expostos ao CSE diariamente após a administração do composto de teste pelos próximos três dias (d9 a d11), no dia 12, vinte e quatro horas após a última exposição a CSE, os animais devem ser dessangrados sob anestesia, e a traqueia deve ser canulada e os pulmões devem ser lavados com alíquotas de 0,5 ml de PBS tratado com heparina (1 unidade/ml) quatro vezes através de cânula traqueal (volume total de 2 ml). O BAL armazenado a 2 a 8 °C até ser analisado para contagem de células totais e de leucócito diferencial. O fluido broncoalveolar foi centrifugado (500xg por 10 min) e o pélete de célula resultante deve ser ressuspenso em 0,5 ml de solução salina tratada com heparina. Os números totais de leucócitos devem ser determinados em fluido de BAL e sangue com o uso de um contador de célula sanguínea e ajustados para 1x106 células/ml. A contagem de célula diferencial foi calculada manualmente. Quarenta microlitros de suspensão de células devem ser centrifugados com o uso do cytospin 3 para preparar um esfregaço celular. O esfregaço celular deve ser colorido com uma solução de coloração de sangue para a diferenciação e observado microscopicamente para identificar eosinófilos de acordo com suas características morfológicas. O número de cada tipo de célula dentre 300 leucócitos no esfregaço celular tem que ser determinado e expresso como uma porcentagem, e o número de neutrófilos e macrófagos em cada BALf deve ser calculado.

ENSAIO 14: REVERSÃO INSENSIBILIDADE DE CORTICQESTEROIDE EM MODELO DE INFLAMAÇÃO PULMONAR INDUZIDA POR EXTRATO DE FUMAÇA DE CIGARRO (COPD)

[000243] Os camundongos Balb/c fêmea devem ser aclimatizados por sete dias antes do início do experimento. Os animais devem, então, ser distribuídos de modo aleatório em vários grupos com base em seus pesos corporais. No dia 1, os animais devem ser anestesiados com éter e extrato de fumaça de cigarro deve ser administrado por rota intranasal em volume de 50 pl/camundongo e os animais devem ser expostos a CSE diariamente pelos próximos cinco dias (d1 a d6). No dia 7, os camundongos devem ter dexametasona administrada a 10 mg/kg por ingestão por sonda esofágica e, 60 minutos depois, os camundongos devem ser administrados com CSE por rota intranasal e o mesmo deve ser repetido pelos próximos quatro dias (d7 a d11). Do dia 9 ao dia 11, os animais devem ter o composto de teste ou veículo administrado por rota oral/intranasal e, 30 minutos depois, a administração de dexametasona e, 30 minutos depois, os animais devem ser anestesiados com éter e extrato de fumaça de cigarro deve ser administrado por rota intranasal em volume de 50 pl/camundongo e os animais devem ser expostos a CSE diariamente após a administração do composto de teste pelos próximos dois dias (isto é, d9 a d11), no d12, 24 horas após a última exposição a CSE, os animais devem dessangrados sob anestesia, e a traqueia deve ser canulada e os pulmões devem ser lavados com alíquotas de 0,5 ml de PBS tratado com heparina (1 unidade/ml) quatro vezes através de cânula traqueal (volume total de 2 ml). O BAL deve ser armazenado a 2 a 8 °C até ser analisado para contagem de células totais e de leucócito diferencial. O fluido broncoalveolar deve ser centrifugado (500xg por 10 min) e o pélete de célula resultante tem que ser ressuspenso em 0,5 ml de solução salina tratada com heparina. O número total de leucócitos deve ser determinado em fluido de BAL e sangue com o uso de um contador de célula sanguínea e ajustado para 1x106 células/ml. A contagem de célula diferencial deve ser calculada manualmente. Quarenta microlitros de suspensão de células devem ser contrifugados com o uso do cytospin 3 para preparar um esfregaço celular. O esfregaço celular deve ser colorido com uma solução de coloração de sangue para a diferenciação e tem que ser observado microscopicamente para identificar eosinófilos de acordo com suas características morfológicas. O número de cada tipo de célula dentre 300 leucócitos no esfregaço colular deve ser determinado e será expresso como uma porcentagem, e o número de neutrófilos e macrófagos em cada fluido de BAL deve ser calculado.

ENSAIO 15: INFILTRAÇÃO DE CÉLULA AGUDA INDUZIDA POR FUMAÇA DE CIGARRO EM CAMUNDONGOS BALB/C MACHOS

[000244] Os animais (camundongos Balb/c machos) devem ser aclimatizados por sete dias antes do início do experimento. Os animais devem, então, ser distribuídos de modo aleatório em vários grupos com base em seus pesos corporais. No dia 1, os camundongos devem ter o composto de teste ou veículo administrado por rota oral/intranasal e após 1 hora da administração do composto de teste, os animais devem ser colocados em uma caixa de exposição de corpo inteiro. Nos dias 1 e d2, os camundongos são expostos ao fluxo principal de fumaça de 6 cigarros e de 8 cigarros no dia 3, e de 10 cigarros no dia 4. A exposição à fumaça de cada cigarro dura 10 min (os cigarros são completamente queimados nos dois primeiros minutos e são seguidos de um fluxo de ar com ventilador de animal e, nos 20 min, uma exposição com ar ambiente fresco. Após cada segundo cigarro, uma pausa adicional de 20 min com exposição a ar ambiente fresco deve ser conduzida. Os animais de controle devem ser expostos à câmara de ar ambiente. Do dia 1 ao d4, os animais têm o composto de teste administrado ou por rota oral ou intranasal. No dia 5, 24 horas após a última exposição à fumaça de cigarro (CS), os animais devem ser dessangrados sob anestesia, e a traqueia deve ser canulada e os pulmões são lavados com alíquotas de 0,5 ml de PBS tratado com heparina (1 unidade/ml) 4 vezes através de cânula traqueal (volume total de 2 ml). O broncoalveolar (BAL) deve ser armazenado a 2 a 8 °C até ser analisado para contagem de células totais e de leucócito diferencial. O fluido de BAL deve ser centrifugado (500xg por 10 min) e o pélete de célula resultante é ressuspenso em 0,5 ml de solução salina tratada com heparina. O número total de leucócitos deve ser determinado em fluido de BAL e sangue com o uso de um contador de célula sanguínea e ajustado para 1x106 células/ml. A contagem de célula diferencial é calculada manualmente. Quarenta microlitros de suspensão de células são centrifugados com o uso do cytospin 3 para preparar um esfregaço celular. O esfregaço celular é colorido com uma solução de coloração de sangue para a diferenciação e observado microscopicamente para identificar eosinófilos de acordo com suas características morfológicas. O número de cada tipo de célula dentre 300 leucócitos no esfregaço celular deve ser determinado e expresso como uma porcentagem, e o número de neutrófilos e macrófagos em cada fluido de BAL deve ser calculado.

[000245] Resultados: Conforme ilustrado nas Figuras 7A e 7B, o Composto A1 reduziu a infiltração de macrófagos e neutrófilos no BALF, indicando, portanto, uma função terapêutica em doenças pulmonares obstrutivas crônicas.

ENSAIO 16: ACÚMULO NASAL DE EOSINÓFILOS E NEUTRÓFILOS INDUZIDO POR OVALBUMINA EM CAMUNDONGOS

[000246] Os animais (camundongos) devem ser aclimatizados por sete dias antes do início do experimento. Os animais devem, então, ser distribuídos de modo aleatório em vários grupos com base em seus pesos corporais. Os animais devem ser imunizados com OVA (40 pg/kg i.p.) nos dias 1 e 5. A fim de obter respostas inflamatórias locais no nariz, os camundongos devem ser induzidos de modo intranasal (10 pl/por narina) nos dias 12 a 19 com OVA (3% OVA em solução salina). No dia 19, os camundongos não submetidos a jejum devem ser dosas de maneira intranasal (10 pl/por narina) com veículo ou composto de teste 2 horas antes do início da última indução de OVA. Duas horas depois, cada animal deve receber uma última indução intranasal de OVA (3%). Após mais 8 horas, cada animal deve ser anestesiado e uma lavagem nasal deve ser realizada introduzindo-se gradualmente ml de PBS nas narinas posteriores por meio de uma cânula traqueal implantada pela rostral que se estende para uma posição que é aproximadamente 1 mm antes das narinas posteriores. Esse procedimento deve ser repetido para render aproximadamente 2 ml de fluido de lavagem. Os números de células totais nas amostras de fluido de lavagem nasal devem ser medidas com o uso de um hemocitômetro. Os esfregaços da Cytospin das amostras de fluido de lavagem nasal devem ser preparados por centrifugação a 1.200 rpm por 2 minutos em RT e coloridos com o uso de um sistema de coloração Diff-Quik (Dade Behring) para contagem de celular diferencial. As células devem ser contadas com o uso de microscopia de imersão em óleo.

ENSAIO 17: ACÚMULO DE CÉLULAS INDUZIDO POR POLI-I:C EM CAMUNDONGOS

[000247] Camundongos A/J isentos de patógenos específicos (machos, 5 semanas de vida) devem ser aclimatizados por sete dias antes do início do experimento. Os animais devem, então, ser distribuídos de modo aleatório em vários grupos com base em seus pesos corporais. Os animais devem ter poli (1:C)-LMW (poli-IC; 1 mg/ml, 40 pl) administrado de modo intranasal duas vezes ao dia por 3 dias sob anestesia com 3% de isoflurano. Os animais devem ser tratados com o composto de teste de modo intranasal (35 pl de solução em 50% de DMSO/PBS) 2 horas antes de cada tratamento com poli-1 :C. Vinte e quatro horas após a última indução de poli-l:C, os animais devem ser anestesiados, a traqueia deve ser canulado e o BALF deve ser coletado. As concentrações de macrófagos e neutrófilos alveolares no BALF devem ser determinadas com o uso de um contador de célula sanguínea e ajustadas para 1x106 células/ml. A contagem de célula diferencial é calculada manualmente. Quarenta microlitros de suspensão de células são centrifugados com o uso do cytospin 3 para preparar um esfregaço celular. O esfregaço celular é colorido com uma solução de coloração de sangue para a diferenciação e observado microscopicamente para identificar eosinófilos de acordo com suas características morfológicas. O número de cada tipo de célula dentre 300 leucócitos no esfregaço celular deve ser determinado e expresso como uma porcentagem, e o número de neutrófilos e macrófagos em cada fluido de BAL deve ser calculado.

[000248] Embora a invenção tenha sido descrita, no presente documento, com referência a modalidades específicas, deve-se compreender que essas modalidades são meramente ilustrativas dos princípios e aplicações da presente invenção. Deve-se, portanto, compreender que diversas modificações podem ser feitas às modalidades ilustrativas e que outras disposições podem ser desenvolvidas sem que se desvie do espírito e do escopo da presente invenção conforme descrita acima. Objetiva-se que as reivindicações em anexo definam o escopo da invenção e que métodos e estruturas dentro do escopo dessas reivindicações e seus equivalentes sejam abrangidos pelas mesmas.

COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA DO COMPOSTO A1 EXEMPLO I

[000249] As capsulas descritas abaixo que contêm 5 ou 10 mg do Composto A1 são preparados.

[000250] As capsulas descritas abaixo que contêm 25, 50 ou 100 mg do Composto A1 são preparadas.

[000251] Todas as publicações e patentes e/ou pedidos de patente citados neste pedido são incorporados no presente documento a título de referência como se cada publicação ou pedido de patente individual fosse específica e individualmente indicado a ser incorporado ao presente documento a título de referência.

Claims

1. Composto, caracterizado pelo fato de ser selecionado a partir de (S)-2- (1 -(9H-purin-6-ilamino)propil)-3-(3-fluorofenil)-4H-cromen-4-ona e sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo.

2. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser (S)-2-(1-(9H-purin-6-ilamino)propil)-3-(3-fluorofenil)-4H-cromen-4-ona.

3. Composto, de acordo a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de ser substancialmente isento de (R)-2-(1-(9H-purin-6-ilamino)propil)-3-(3- fluorofenil)-4H-cromen-4-ona e sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo.

4. Composto, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, o composto caracterizado pelo fato de ter um excesso enantiomérico maior que cerca de 95%.

5. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de compreender um composto conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4 e pelo menos um carreador farmaceuticamente aceitável.

6. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de ser para uso na inibição de atividade catalítica de uma PI3 δ quinase presente em uma célula através do contato da célula com uma quantidade eficaz do referido composto.

7. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de ser para uso na inibição de atividade catalítica de uma PI3 Y quinase presente em uma célula através do contato da célula com uma quantidade eficaz do referido composto.

8. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de ser para uso na inibição de atividade catalítica de uma PI3 δ quinase e uma PI3 y quinase presentes em uma célula através do contato da célula com uma quantidade eficaz do referido composto.

9. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, caracterizado pelo fato de que a inibição ocorre em um indivíduo que sofre de uma doença, distúrbio ou afecção selecionada dentre câncer, um distúrbio ósseo, uma doença inflamatória, uma doença imune, uma doença do sistema nervoso, uma doença metabólica, uma doença respiratória, trombose e doença cardíaca.

10. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de ser para uso no tratamento de leucemia em um paciente que necessite do mesmo, compreendendo a administração de uma quantidade eficaz do referido composto.

11. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de ser para uso no tratamento de asma ou doença pulmonar obstrutiva crônica em um paciente que necessite do mesmo, compreendendo a administração de uma quantidade eficaz do referido composto.

12. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de ser para uso no tratamento de artrite reumatoide, psoríase, lúpus ou encefalomielite autoimune experimental (EAE) em um paciente que necessite do mesmo, compreendendo a administração de uma quantidade eficaz do referido composto.

13. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de ser para uso no tratamento de doenças como leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma não Hodgkin (NHL), linfoma de Hodgkin (HL) leucemia mieloide aguda (AML), mieloma múltiplo (MM), linfoma linfocítico pequeno (SLL) ou linfoma não Hodgkin indolente (l-NHL), em um paciente que necessite do mesmo, compreendendo a administração de uma quantidade eficaz do referido composto.

14. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de ser para uso no tratamento de uma doença, distúrbio ou afecção que se beneficiaria da inibição da atividade catalítica de uma PI3 δ/y quinase.

15. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo fato de ser para uso no tratamento de uma doença, distúrbio ou afecção associada a PI3K compreendendo a administração a um indivíduo que necessite do mesmo de uma quantidade eficaz do referido composto.

16. Composto, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que compreende, adicionalmente, administrar um agente ativo adicional selecionado dentre agentes anticâncer, agentes anti-inflamatórios, agentes imunossupressores, esteroides, agentes anti-inflamatórios não esteroides, anti- histamínicos, analgésicos e misturas dos mesmos.

17. Composto, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a doença, distúrbio ou afecção associada a PI3K é uma doença relacionada ao sistema imune, uma doença ou distúrbio que envolve inflamação, câncer ou outra doença proliferativa, uma doença ou distúrbio hepático ou uma doença ou distúrbio renal.

18. Composto, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a doença, distúrbio ou afecção associada a PI3K é selecionado dentre leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda, linfoma de célula B, linfoma de célula T, linfoma de Hodgkin, linfoma não Hodgkin, leucemia de células pilosas, linfoma de Burkett, leucemias mielógenas aguda e crônica, síndrome mielodisplásica e leucemia promielocítica, psoríase, artrite reumatoide, osteoartrite, asma, COPD, rinite alérgica e lúpus eritematoso.