CN104161772A - 一种蟾皮组合物、其制备方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种蟾皮提取物、其制备方法及其用途。特别是该蟾皮提取物由蟾皮提取，并利用葡聚糖凝胶等高分子填料进行分离纯化得到多肽类有效部位，其分子量在1000～10000(Da)。利用本方法制备的多肽类纯度能够控制在70％以上。经过药理学实验结果表明，本组合物具有抗肿瘤作用和镇痛效果，可用于抗癌辅助药物，或者治疗或缓解疼痛的医药产品的开发。

Description

一种蟾皮组合物、其制备方法及用途

技术领域

本发明属中药技术领域，具体涉及一种蟾皮组合物、其制备方法及用途。其中特别涉及一种主要为多肽类成分的蟾皮提取物，其分子量范围是1000～10000(Da)。

背景技术

蟾皮为蟾蜍科动物中华大蟾蜍或黑眶蟾蜍等的干燥皮，具有清热解毒、利水消胀之功效，临床用于治疗痈疽、肿毒、肿瘤、疳积腹胀、慢性气管炎等病症。蟾皮水溶性部位开发的药品已有多个上市，尤其华蟾素注射液，是从中华大蟾蜍皮经加工制成的水溶性制剂，治疗原发性肝癌和中晚期肺癌分别获得44％和56％的综合有效率，瘤体缩小率分别为10％和16％，且对化疗和放疗具有协同作用。临床应用表明华蟾素注射液具有解毒、消肿、止痛之功效，用于治疗中、晚期肿瘤、慢性乙型肝炎等症，其生理活性物质主要是蟾蜍毒素类(bufotoxins)及其水解产物蟾毒配基类(bufageins)、蟾毒色胺类(bufoteinines)等。

从蟾蜍(主要是蟾皮)中已经确定的化合物来看，其成分主要可以分为：蟾毒配基类、蟾蜍毒素类、蟾毒色胺类三大类以及胆甾醇、多肽、氨基酸等其他化合物。但蟾皮的药用价值还没有得到充分的开发利用。目前为止，国内外关于蟾蜍以及华蟾素的研究焦点主要集中在其脂溶性蟾毒配基类等成分。该类成分具有明显的细胞毒性抗肿瘤活性，同时也具有较强的毒副作用。可见，华蟾素在肿瘤治疗方面的良好表现，不仅来源于蟾毒内酯类成分。根据我们的研究结果，多肽类成分在该类产品中占有极大的比例。

本发明对蟾皮进行提取后制备得到多肽类组合物，该组合物除有一定的抗癌活性外，还具有良好的镇痛效果，具有抗肿瘤及镇痛类药物开发的良好前景。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种具有抗肿瘤、镇痛作用的蟾皮提取物。

本发明的另一个目的是提供一种主要为多肽类成分的蟾皮提取物，其分子量范围是1000～10000(Da)。

本发明的另一个目的是提供所述蟾皮提取物的制备方法。

本发明还有一个目的是提供所述蟾皮提取物的应用。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

一种蟾皮提取物，其特征在于它是以干蟾皮为原料经过水提醇沉的方法制成中间提取物后，进行凝胶色谱分离纯化得到的。尤其是一种蟾皮提取物，其特征在于它是以干蟾皮为原料经过水提醇沉的方法制成中间提取物后，进行凝胶色谱分离纯化得到多肽类组合物，其分子量分布范围是1000～10000Da。

一种由所述蟾皮提取物与医学上可接受的辅料组成的制剂，蟾皮提取物(按照干燥后所得固体物质量)与所述的辅料的质量比为1∶0-1∶110。

所述蟾皮提取物的制备方法为：

(1)干蟾皮洗净，用5～15倍的水提取2次，浓缩至小体积后分别用50～70％、75～90％的乙醇沉淀，滤过，回收乙醇得到中间提取物；

(2)中间提取物运用凝胶色谱进行分离，得到多肽类组合物；

(3)所述的多肽类组合物，经过紫外及尺寸排阻色谱分析，与固定分子量对照品进行比对，确定该多肽组合物分子量分布在1000-10000Da，纯度在70％或以上。

或者

(1)干蟾皮洗净，用5～15倍的水提取2次，浓缩至相对密度为1.01～1.35(80℃)后，分别用40～70％、75～90％的乙醇沉淀，滤过，将滤液回收乙醇得到中间提取物；

(2)将所述的中间提取物运用凝胶色谱进行分离，得到多肽类组合物；

(3)所述的多肽类组合物，经过紫外及尺寸排阻色谱分析，与固定分子量对照品进行比对，确定该多肽组合物分子量分布在1000-10000Da，纯度在70％或以上。

其中本发明所述蟾皮提取物的制备方法优选为：运用凝胶色谱进行分离时，所用填料包括Sephadex G10、G15、G25、G50、G75、LH20葡聚糖基质凝胶；或HW40、HW50、HW65聚甲基丙烯酸基质凝胶填料。

更优选的是，中间提取物与凝胶色谱填料的重量比为：1∶10～1∶100，洗脱液体积为柱体积的0.1～1倍，流速为0.5～2cm柱体积/min。

本发明所得到的多肽类组合物具有抗肿瘤和镇痛的活性：

1.体外抗癌试验结果显示，蟾皮提取物多肽类组合物对胃癌细胞系BGC823，MCG803，结肠癌细胞系DLD-1，HT-29及胰腺癌细胞系MIAPACA-2等5种细胞表现出较强的细胞毒性作用，并呈现出良好剂量依存性；

2.动物实验表明，蟾皮多肽类组合物有良好的镇痛作用。

本发明的意义在于：从蟾皮中制备得到较高纯度的多肽类组合物成分，证明其分子量主要分布在1000～10000(Da)；这类成分具有较好的的抗肿瘤活性以及良好的镇痛效果。现有的制备方法能够适宜工业化生产，具有重要的意义。本发明的组合物属于小分子蛋白，与抗菌肽相似，与其他抗肿瘤药物相比毒副作用小，具有更高的临床安全性，必将在肿瘤治疗与镇痛类药物开发上有所建树。

附图说明

图1不同分子量对照品尺寸排阻HPLC色谱图

图2蟾皮多肽类组合物尺寸排阻HPLC色谱图(a-实施例1所得组合物；b-实施例2所得组合物)

具体实施方式

实施例

1.华蟾素多肽类组合物的制备-1：

(1)取干蟾皮水煮醇沉处理后得到中间提取物；

具体操作方法为：取干蟾皮进行修治后，加入8倍水(V/m)，煎煮2次，每次30min，滤过，合并滤液，浓缩。浓缩至小体积(相对密度在1.01～1.35，80℃)，冷却至40℃，加入95％乙醇调节醇浓度为40～60％进行一次醇沉，后倾出上清液；将上清液回收乙醇至无醇味，加入95％乙醇调节醇浓度为75～90％进行二次醇沉，静置后常压滤过，滤液浓缩至稠膏，冷藏24h，离心，即得中间体。

(2)使用葡聚糖凝胶Sephadex G10、G15、G25、G50、G75或LH20对中间体进行分离纯化，装柱径高比1∶15，上样体积比1∶40，恒流速3ml/min去离子水洗脱，按照柱体积1/10进行收集，采用双缩脲反应进行跟踪，收集反应阳性馏分合并后冷冻干燥，得到多肽类组合物；

(3)将上述组合物用高纯水溶解，0.22μm滤过，运用TSK排阻色谱分析柱进行高效液相检测，检测波长212nm，与1000Da和10000Da分子量的对照品进行比对(见图1、2-a)，证明该组合物分子量分布在1000-10000Da；

(4)精密称取200mg该多肽类组合物样品，采用氨基酸自动分析仪结合紫外分光光度计，按GB/T5009.124-2003测定水解氨基酸与游离氨基酸含量，计算二者差值，结果见表1。由氨基酸分析结果可见：(水解氨基酸-游离氨基酸)/多肽类组合物*100％＝186.87/200*100％＝93.435％。此多肽类组合物多肽含量在90％以上。

2.华蟾素多肽类组合物的制备-2：

(1)取干蟾皮水煮醇沉处理后得到中间提取物；

具体操作方法为：取干蟾皮进行修治后，加入15倍水(V/m)，煎煮2次，每次120min，滤过，合并滤液，浓缩。浓缩至小体积(相对密度在1.01～1.3，80℃)，冷却至40℃，加入95％乙醇调节醇浓度为40％进行一次醇沉，后倾出上清液；将上清液回收乙醇至无醇味，加入95％乙醇调节醇浓度为90％进行二次醇沉，静置后常压滤过，滤液浓缩至稠膏，冷藏24h，离心，即得中间体。

(2)使用聚甲基丙烯酸酯凝胶HW40、HW50或HW65对中间体进行分离纯化，装柱径高比1∶15～20，上样体积比1∶10～40，恒流速3～10ml/min去离子水洗脱，按照柱体积1/10每份进行收集，采用双缩脲反应进行跟踪，收集反应阳性馏分合并后冷冻干燥，得到多肽类组合物；

(3)将上述组合物用高纯水溶解，0.22μm滤过，运用TSK排阻色谱分析柱进行高效液相检测，检测波长212nm，与1000Da和10000Da分子量的对照品进行比对(见图1、2-b)，证明该组合物分子量分布在1000-10000Da；

(4)精密称取200mg该多肽类组合物样品，采用氨基酸自动分析仪结合紫外分光光度计，按GB/T5009.124-2003测定水解氨基酸与游离氨基酸含量，计算二者差值，结果见表1。由氨基酸分析结果可见：(水解氨基酸-游离氨基酸)/多肽类组合物*100％＝186.87/200*100％＝93.435％。此多肽类组合物多肽含量在90％以上。

表1 多肽类组合物氨基酸分析结果

主要药效学实验

1多肽类组合物对肿瘤细胞的抑制作用

细胞  人胃癌细胞系BGC-823、MCG803，人胰腺癌细胞系MIAPACA-2，人结肠癌细胞系DLD-1、HT-29，由中美冠科生物技术有限公司提供。

药品及试剂  华蟾素注射液，由安徽金蟾生化股份有限公司提供。由实施例1制备得到的蟾皮多肽类组合物。顺铂(批号810048CF，齐鲁制药有限公司)；丝裂霉素(批号101102，浙江海正药业有限公司)。发光法细胞活力检测试剂盒(Promega公司)；葡聚糖凝胶G-50(瑞典Pharmacia公司)；分子量标记蛋白SM1811(Fermentas公司)；考马斯亮蓝R-250(北京华美生物公司)。

主要仪器  Synergy2多功能酶标仪(基因有限公司)；XDS-1B型倒置显微镜(中国重庆光电公司)；Agilent1200系列高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)，四元泵，DAD检测器；L8900型全自动氨基酸自动分析仪(日立公司)。

细胞培养  BGC823，DLD-1细胞系采用RPMI-1640培养基；MCG803，MIAPACA-2，HT-29细胞系分别采用DMEM(低糖)、DMEM(+2.5％马血清)、McCoys’5a培养基。所有细胞培养液均含10％胎牛血清、100u·mL^-1青霉素和100μg·mL^-1链霉素，所有细胞均在37℃、5％CO2、95％湿度条件下培养。

体外抗肿瘤活性检测(CTG法)  收集处于对数生长期的细胞并采用血小板计数器进行细胞计数。用台盼蓝排除法检测细胞活力，确保各细胞系活力均在98％以上。用培养基稀释调整细胞浓度至5.56×104/mL，添加90μL细胞悬液至96孔板中，细胞终密度为5×103个/孔。次日，用二甲基亚砜配制储备液，用生理盐水稀释为系列浓度：顺铂与丝裂霉素1000、316、100、31.6、10、3.16、1、0.316和0.1μmol·L^-1；华蟾素注射液2×10³、633、200、63、20、6.33、2.00、0.63和0.20μg·mL^-1；蟾皮多肽组合物2×10⁴、6.33×10³、2×10³、633，200、63.3、20.0、6.33和2.00μg·mL^-1。每孔加测试样品溶液及阳性对照药溶液10μL，每个浓度设3个复孔，培养基及加相应溶媒的细胞各作为对照。培养72h，然后用CTG法检测。将培养板和检测试剂放于室温平衡30min，加试剂100μL到含100μL培养基的96孔板中，置于振荡器上震荡2min使细胞裂解，于室温静置10min。用Synergy2检测冷光。

数据分析  采用GraphPad Prism5.0软件对数据进行分析。计算IC50(50％inhibitory concentration，半数抑制浓度)。

结果  利用实施例1分离得到的蟾皮多肽组合物，观察其对胃癌细胞系BGC823，MCG803，结肠癌细胞系DLD-1，HT-29及胰腺癌细胞系MIAPACA-2等5种细胞体外增殖的影响。结果表明多肽部位表现出较强的抑制增殖作用，并在10～103μg·mL^-1内呈现出一定的剂量依赖性，其半数抑制率(IC50)在25～123μg·mL^-1。结果见表2。

表2 华蟾素及蟾皮多肽类组合物对肿瘤BGC823，MCG803，DLD-1，HT-29，MIAPACA-2细胞系的体外抑制增值作用(n＝3)

与华蟾素比较^#P＜0.05，^##P＜0.01.

本实验结果说明，本发明多肽类组合物具有一定的抗癌活性，效果明显好于市面上流通的华蟾素注射液。

2蟾皮多肽类组合物对小鼠的镇痛作用

动物  ICR小鼠，雌性/雄性，18-22g。

器材  YLS-6B型热板仪(淮北正华生物仪器设备有限公司)等。

药物  盐酸哌替啶(青海制药厂有限公司，50mg/ml)、华蟾素注射液(安徽金蟾生化股份有限公司，批号：100124)、蟾皮多肽类组合物(实施例2)。

方法  热板法、醋酸扭体法(实验分组及给药方式见表3)

2.1热板法(采用雌性小鼠)

第一天，将小鼠依次编号，放在(55±1)℃的热板上，测定每鼠的痛阈(即痛反应潜伏期，指小鼠从足接触热板到舔足和跳跃后足所用时间)，选择痛反应潜伏期在5-30s的小鼠为合格鼠，剔除过敏(＜5s)、反应迟钝(＞30s)以及易跳跃的个体。小鼠称重，按其编号记录，由小鼠体重与痛阈值随机分为6组，每组10只。分别为生理盐水对照组、盐酸哌替啶组、华蟾素组、多肽低剂量组、多肽中剂量组及高剂量组。24h后进行实验。

第二天，将小鼠置于55±1℃的热板上，首先测定6个实验组的基础痛阈。然后，按剂量给药(表)，给药后30min，60min，90min，120min测定痛觉反应。超过60s无反应者，痛阈按60s计，痛阈提高的百分率＝(给药后的痛阈-基础痛阈)/基础痛阈×100％，结果见表4。

2.2醋酸扭体法

将60只小鼠按体重，随机分为6组，分别给药，30min后，各组小鼠均腹腔注射0.8％醋酸(v/v)0.25ml。记录各组小鼠的在20min内扭体潜伏期及扭体次数。抑制率＝(生理盐水组扭体均数-给药组扭体均数)/生理盐水组扭体均数×100％。结果见表5。

表3 实验分组与给药方法

表4 热板法实验结果

与对照组比较，^*P＜0.05；^**P＜0.01.；与华蟾素比较^#P＜0.05..

表5 扭体法实验结果

与对照组比较，^*P＜0.05；^**P＜0.01.与华蟾素比较^#P＜0.05.

结论  热板法实验：阳性对照组在给药后30min、60min与对照组比较有显著差异；多肽中、高剂量组在给药后60min与对照组比较有显著差异。而包括华蟾素在内的其他组与对照组比较均没有显著差异；扭体法实验：与对照组比较，多肽组在给药后小鼠扭体潜伏期有不同程度的增加，其扭体次数均有减少，且有显著的统计学意义。结果提示：本发明多肽类组合物具有显著的镇痛作用。

Claims (6)

1.一种蟾皮提取物，其特征在于该蟾皮提取物由以下步骤制备得到：(1)取干蟾皮，洗净，加5～15倍蒸馏水提取，第一次30分钟，第二次30分钟，合并水提液，滤过，滤液浓缩至含1g生药/ml，以3000r/min转速离心20分钟，取上清液，超滤，即得。 

2.一种蟾皮提取物，是以干蟾皮为原料经过水提醇沉的方法制成中间提取物后，进行凝胶色谱分离纯化得到的多肽类组合物，其分子量分布范围是1000～10000Da。 

3.根据权利要求1-2所述的蟾皮提取，其中所述多肽组合物分子量分布在1000-10000Da，纯度在70％以上。 

4.根据权利要求1-3任一项所述蟾皮提取物的制备方法，其特征在于：(1)干蟾皮洗净，用5～15倍的水提取2次，浓缩至小体积后分别用50～70％、75～90％的乙醇沉淀，滤过，回收乙醇得到中间提取物； 

(2)中间提取物运用凝胶色谱进行分离，得到多肽类组合物。

5.如权利要求4所述凝胶色谱分离，所用填料选自Sephadex G10、G15、G25、G50、G75、LH20等葡聚糖基质凝胶；或HW40、HW50、HW65等聚甲基丙烯酸基质凝胶填料中的一种或多种。 

6.权利要求1-3任一项所述的蟾皮提取物，在制备抗肿瘤、镇痛药物中的应用。