CN1768787A - 一种华蟾素冻干粉针剂的制备方法 - Google Patents

一种华蟾素冻干粉针剂的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种华蟾素冻干粉针剂的制备方法，它是由干蟾皮提取的吲哚生物碱有效部位与药用辅料经冷冻干燥而成，华蟾素有效部位采用温水提取、离心、超滤纯化的方法获得，其中的主要有效成分吲哚类总生物碱含量大于 60％，含量测定结果说明，本发明华蟾素提取工艺及其冻干粉针剂的有效成分含量更高、毒副作用更低、药理作用更强。

Description

一种华蟾素冻干粉针剂的制备方法
技术领域
本发明属中药制药技术领域，具体涉及一种华蟾素提取工艺及其冻干粉针剂制备方法。
背景技术
华蟾素(Cinobufotalin)系蟾蜍科动物中华大蟾蜍(Bufobufo gargarizansCantor)或黑眶蟾蜍(B.melanostictus Schneider)等的全皮提取制剂，主要含有蟾毒内脂等有效成分，具有清热解毒，利水消肿，化瘀溃坚等作用。蟾蜍作为药物治疗疾病由来已久，其药性理论记载，首见于我国第一部药物学专著《神农本草经》：“嘏蟆，味辛、寒，主邪气，破瘸坚血，痈肿，阴疮，服之不患热病”。“蟾蜍”之名，首见于《名医别录》，陶弘景注云，嘏蟆“一名蟾蜍”。蟾皮单独入药，始见于《本经逢原》：“蟾皮，辛、凉，微毒”。当代本草学巨著《中华本草》记载道：蟾蜍“味辛、性凉，有毒。归心、肝、脾、肺经”，能“解毒散结，消积利水，杀虫消疳。主治痈疽，疔疮，发背，瘰疬，恶疮，瘾瘕癖积，臌胀，水肿，小儿疳积，破伤风，慢性咳喘”，并进一步指出“蟾蜍还被应用于肿瘤治疗，对胃癌、食管癌、膀胱癌、肝癌、白血病有一定疗效”。其水溶性成分中除含有有效成分吲哚类生物碱外，如5-羟色胺，蟾蜍色胺、蟾蜍特尼啶、蟾蜍硫胺等，另外还含有一定量的肽类、氨基酸、还原糖、甾类、蟾蜍毒甙元与精氨酸复合物等。
研究表明，蟾皮中含有的蟾毒内酯类成分虽是抗肿瘤活性成分之一，但又是毒性成分，心律失常是华蟾素的主要副作用，它是由蟾毒内酯类成分造成的。
近年来临床上采用华蟾素治疗原发性肝癌、中晚期肺癌等恶性肿瘤，取得了较好的疗效，有关研究进展如下：
1.治疗恶性肿瘤
华蟾素是通过抑制癌细胞的RNA的合成，阻碍细胞的分裂繁殖，抑制癌细胞的生长，诱导癌细胞的凋亡，参与癌细胞的直接杀伤，抑制抗凋亡基因的表达，提高机体免疫水平，发挥抗肿瘤作用。化疗药物抗癌的一个重要机制是诱导细胞凋亡，华蟾素具有较强的诱导细胞凋亡的作用。华蟾素的增强免疫作用也有助于其抗肿瘤作用的发挥。
2.治疗乙型肝炎
华蟾素具有抑制乙肝病毒DNA复制作用，并具有一定的改善肝脏病理损害作用。钱世萍等进行的临床观察研究表明，采用华蟾素治疗50例慢型乙肝患者，华蟾素组与干扰素组在抑制乙肝病毒复制、提高机体免疫功能方面无明显差。证明华蟾素可抑制乙肝病毒复制，提高细胞免疫功能、抗肝纤维化。
3.治疗银屑病
陈可采用静滴华蟾素注射液治疗寻常型银屑病40例，痊愈率47％，总有效率达90％。周毅成等应用华蟾素注射液治疗寻常型银屑病36例，有效率为83.3％。
4.治疗带状疱疹
华蟾素可增强机体免疫，并具有解毒、消肿、止痛作用。陈可等采用华蟾素注射液治疗50例带状疱疹患者，显效率为70％，总有效率为94％。董岩等应用华蟾素治疗恶性肿瘤并发带状疱疹11例，3日内病情均好转，9日后均痊愈。
5.治疗病毒性角膜炎
姚念杰等采用滴注华蟾素注射液治疗65例病毒性角膜炎患者，同时采用无环鸟苷滴眼液或病毒唑滴眼液点眼，5日内所有病例均痊愈，平均3.5日治愈。
6.治疗流行性出血
病毒可作为直接的启动因素，从而导致I型与III型变态反应，而引起机体的免疫病理损伤。陈富等报道，除应用流行性出血热综合治疗措施外，治疗组加用华蟾素注射液，对照组不用。结果治疗组取得退热快，尿蛋白消失早，恢复快等良好效果。
7.治疗慢性鼻炎
姜彦等用华蟾素贴敷法治疗慢性鼻炎60例，治愈率66.7％(40例)，显效30％(18例)，好转3.3％(2例)。用药方法：取2ml华蟾素注射液浸润棉片，送入鼻腔下鼻道深处贴敷30分钟后取出，隔日1次，5次为一疗程。
8.治疗慢性咽炎
朱以服等利用华蟾素的抗炎、麻醉及激素样作用治疗慢性咽炎，取得了满意疗效。
9.治疗顽固性呃逆
李晓敏等采用静滴华蟾素治疗顽固性呃逆20例，治疗7～9日后，其中14例症状消失，2例症状缓解。
10.治疗翼状胬肉
邸平估采用局部注射华蟾素治疗翼状胬肉41例，在用地卡因滴眼液点眼作表面麻醉后，在胬肉体注射华蟾素0.5～1ml，隔日1次，10次为一疗程，结果总有效率为87％.可能的作用机理为华蟾素可抑制胬肉细胞DNA、RNA合成，干扰胬肉代谢，从而使之萎缩。
目前以华蟾素为主要成分的制剂有华蟾素口服液、华蟾素片、华蟾素注射液等。华蟾素注射液(WS3-B-30)是干蟾皮经提取加工的灭菌水溶液，该注射液的制备方法未能有效除去蟾毒内酯类成分，及其它大分子物质。注射液对稳定性要求高，而水针剂存在的固有缺陷就是稳定性问题和携带、贮藏、运输时容易破碎，带来许多不便。
中国专利(申请号200410083994.4)“一种华蟾素冻干粉针剂及其制备方法”描述了用乙醇提取有效成分制成粉针剂，该发明工艺含有大量脂溶性成分，人体应用有毒副作用，会产生心律异常等副作用，工艺中对可能产生异原过敏作用的大分子也未有效去除。
本发明经过研究，找到了解决现有技术中存在的毒副作用的问题，本发明优选考虑了通过超滤技术解决遗留问题，超滤技术是通过膜表面的微孔结构对物质进行选择性分离。能有效地除去药液中可能引起过敏反应的蛋白质，以及细菌、热原等大分子杂质。本发明经反复试验，制剂工艺中采用截留分子量2000～8000dalton的超滤膜进行超滤，使本发明的制剂质量大大提高。药理实验表明，本发明的华蟾素冻干粉针剂具有更好的药理作用和更少的毒副作用。
发明内容：
本发明的目的是公开一种有效成分含量高、疗效好、脂溶性成分较少，毒性小、工艺方便的华蟾素冻干粉针制剂。
本发明的另一个目的是提供上述冻干粉针制剂的制备方法。
本发明通过以下技术方案实现：
1.原料：干蟾皮；
2.取干蟾皮，洗净，加10倍和8倍蒸馏水，温热提取，第一次30分钟，第二次30分钟，合并水提液，滤过，滤液浓缩至含1g生药/ml，以3000r/min转速离心20分钟，取上清液，超滤，得蟾皮水提物，该水提物成分为吲哚碱有效部位；
3.取上述吲哚碱有效部位和药用辅料混合，加注射用水溶解，加注射用水至规定量，调节pH，过滤，灌装，冷冻干燥，即得。
4.制剂处方：华蟾素水提物25～50mg，药用辅料9g，制成1000支，25～50μg/支。
以上所述调节pH值是调节至6.0-7.0，所述超滤，采用2000～8000dalton的超滤膜进行超滤，所述药用辅料选自：低分子右旋糖酐、甘露醇、环糊精、可溶性淀粉、糖类物质、聚乙烯吡咯烷酮、氯化钠、葡萄糖、苯甲酸、纤维素类物质等。优选的是低分子右旋糖酐、甘露醇、环糊精、可溶性淀粉、乳糖，聚乙烯吡咯烷酮，最优选的是甘露醇，所述采用采用2000-8000dalton的超滤膜，优选的是3000～5000dalton的超滤膜，最优选的是4000dalton的超滤膜，其中所述温热为加热到60～85℃。
其中所述的吲哚碱有效部位和药用辅料之间的重量比例为1∶10～10∶1，优选的是1∶5～5∶1，最优选的是1∶2～2∶1。
本发明的冻干粉针制剂，每支注射用冻干粉针剂中华蟾素水提物的量为25～50mg，药用辅料的量为50～100mg。
本发明的冻干粉针制剂，其中的有效成分含量高，杂质少，有效成分吲哚类总生物碱含量测定如下：
1.仪器与试药：UV-756PC紫外分光光度计，华蟾素注射液(安徽金蟾药业有限公司)；本发明华蟾素冻干粉针剂(辽宁玉皇药业有限公司提供)；5-羟色胺对照品(美国SIGMA公司)。
2.实验方法：参照华蟾素注射液(WS3-B-30)质量标准中的含量测定方法进行测定。
(1)对照品溶液的制备精密称取5-羟色胺对照品15mg；置100ml量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置50ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得。
(2)标准曲线的制备精密量取对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml，分别置10ml量瓶中，加水使成5ml，摇匀，加15％对二甲氨基苯甲醛盐酸(2→3)溶液至刻度，摇匀，室温放置30分钟。照分光光度法(中国药典2000年版二部附录V B)，以水为空白，在555nm的波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标。浓度为横坐标，绘制标准曲线图。
(3)测定法精密量取本品5ml，置10ml量瓶中，按“标准曲线的制备”项下规定的方法，自“加15％对二甲氨基苯甲醛盐酸(2→3)溶液……”起，依法测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中5-羟色胺的量，计算，即得。
结果表明，用本发明方法制备的华蟾素冻干粉针剂有效成分吲哚类总生物碱含量明显提高。
本发明经过毒理学研究，证明本发明的华蟾素冻干粉针剂毒副作用较小。
本发明的华蟾素冻干粉针剂的动物急性毒性试验资料：
1.受试药物
本发明的华蟾素冻干粉针剂、西林瓶包装，含量为25μg/支。由辽宁玉皇药业有限公司制备，批号20050206。
2.实验动物
昆明种小鼠50只，体重18～22g，雌雄各半。由吉林省实验动物中心提供，吉林省实验动物管理委员会实验动物质量合格证书(No：0002428)。
3.实验药物的制备
华蟾素冻干粉针剂、西林瓶包装，含量为50μg/支，相当于5g/ml生药，加入生理盐水溶解备用。由辽宁玉皇药业有限公司制备，批号20050206。
4.实验方法
预试实验：以1ml注射用生理盐水溶解华蟾素的制备浓度为5g生药/ml的溶液，以最大体积(0.5ml/20g体重)对小鼠(10只，雄雄各5只)作1次尾静脉给药。此剂量(125g生药/kg体重)相当于成年人每日剂量(0.18g生药/kg)的694倍。观察3天，不引起小鼠死亡，无法测定药物的半数致死量(LD50)，故进行本品的动物最大给药量测定试验。
小鼠尾静脉注射给药急性毒性实验：选择小鼠20只，雌雄各10只，禁食不禁水16小时后。按0.5ml/20g体重/次，小鼠尾静脉注射华蟾素溶液(5g生药/ml)，每隔2.5小时注射1次，共3次。按体重计算，此剂量相当于成年人每日剂量(0.18g生药/kg)的2083倍。给药后即刻并逐日进行观察小鼠14天(对死亡动物进行尸检)。
小鼠腹腔注射给药急性毒性实验：选择小鼠20只，雌雄各10只，禁食不禁水16小时后。按0.5ml/20g体重/次，小鼠腹腔注射华蟾素溶液(5g生药/ml)，每隔2.0小时注射1次，共4次。按体重计算，此剂量相当于成年人每日剂量(0.18g生药/kg)的2778倍。给药后即刻并逐日进行观察小鼠14天(对死亡动物进行尸检)。
5.实验结果
小鼠在注射了华蟾素后的14天内，除第1天每次给药后动物有短暂不适、活动减少外，未见动物发生中毒症状和死亡。试验结果表明，24小时内分3次对小鼠尾静脉注射华蟾素的剂量共375g生药/kg，在观察的14天内不引起动物死亡。按体重计算，即小鼠能耐受华蟾素的剂量(375g生药/kg)相当于成年人每日剂量(0.18g生药/kg)的2083倍而不致死亡。24小时内分4次对小鼠腹腔注射华蟾素的剂量共500g生药/kg，在观察的14天内不引起动物死亡。按体重计算，即小鼠能耐受华蟾素的剂量(500g生约/kg)相当于成年人每日剂量(0.18g生药/kg)的2778倍而不致死亡。据文献(徐叔云等主编.药理实验方法学。北京：人民卫生出版杜，1982.412)报道：“一般认为按体重计算，小鼠最大耐受量相当于人用量的100倍以上则较为安全，可以提供临床试用”。因此，可认为华蟾素注射给药对动物的急性毒性甚小，安全，可以提供临床试用。
结语
受药物的浓度和给药体积的限制，对小鼠1次腹腔给药无法测出LD50。经最大给药量测定，1日内分3次对小鼠尾静脉给药、1日内分4次对小鼠尾静脉给药、其最大给药量分别相当于临床用药量的2083倍和2778倍。故可认为本品的急性毒性低，静脉给药安全。
本发明的华蟾素冻干粉针剂的大鼠长期毒性试验资料：
1.受试药物
华蟾素，冻干粉针剂、西林瓶包装，含量为25μg/支。由辽宁玉皇药业有限公司制备，批号20050206。
2.实验动物
健康Wistar大鼠，一级，平均体重90.2±10.17g，雌雄各半，由吉林大学实验动物中心提供。吉林省实验动物管理委员会实验动物质量合格证明(No：0000687)。
3.实验方法
将大鼠按性别及体重随机搭配分成2组，每组20只。分别作为华蟾素高剂量给药组(剂量分别为50g生药/kg，给药体积均为1ml/100g体重，为成年人用量的278倍)和空白对照组(生理盐水1ml/100g体重)。各组均尾静脉给药，于每天上午尾静脉给药1次，连续给药3个月。给药前及给药期间每周称动物体重1次，并按体重变化调整给药量。末次给药后24小时，每组抽取大鼠各14只(雌、雄各7只)，从左髂外静脉处放血并收集血液作为第1批杀取动物检查。每组余下的大鼠停止给药，常规饲养2周后作为第2批杀取动物检查。
对两批次杀取的大鼠的血液进行血液学、肝脏功能和肾脏检查。
血液学检查的项目有：血红蛋白含量(Hb)、红细胞数(RBC)、血小板数(PLT)、网织红细胞数、白细胞数(WBC)和白细胞分类计数(WDC)。肝脏功能检查项目有：丙氨酸氨基转移酶(ALT)、血清总蛋白含量(TP)、血清白蛋白含量(ALb))、血清球蛋白含量(Glob)和计算白蛋白与球蛋白之比值(A/G)。肾脏功能检查的项目有：血尿素氮(BUN)和血肌酐(Cr)。
取血后，将各组动物处死，立即剖取动物的心、肝、脾、肺、肾、胸腺和肾上腺各器官称重，根据体重计算器官重量系数。并取各器官组织块用10％的甲醛溶液浸泡固定，进行石蜡包埋，切片，HE染色，置光学显微镜下观察。与空白对照组比较、先对比检查高剂量给药组动物器官组织形态有无毒性损伤变化。
4.实验结果
①华蟾素对大鼠一般情况的影响：
在华蟾素连续给药的3个月内，对各给药组与对照动物比较观察。动物的活动、饮食、大便和皮肤毛发光泽情况相似，未见明显异常情况发生。
②华蟾素对大鼠体重增长的影响：
实验结果见表1。
           表1华蟾素连续给药3个月对大鼠体重增长的影响(体重：X±S，g)
  组别   给药前体重   连续给药不同时间后的体重
  2W   4W   6W   8W   10W   12W   13W
  对照组(20只)高剂量组(20只)   89.78±15.1190.75±12.86   152.85±21.98162.50±18.76   187.05±27.34199.75±27.34   240.70±37.82262.50±23.19   289.95±49.31293.42±42.75   319.25±58.38323.50±56.45   350.50±64.52358.25±65.82   358.65±66.13366.25±68.93
注：1限于表1宽度，未列出1、3、5、7、9、11周的体重值。
2各给药组在各给药时间的体重，与空白对照组比较，P均＞0.05。
从表1可见，华蟾素高、中、低3种剂量对大鼠连续给药不同时间后的体重(1W、2W、3W、4W、5W、6W、7W、8W、9W、10W、11W、12W、13W)，各给药组动物在各时间的体重分别与空白对照织体重比较，其差异无统计学意义(P均＞0.05)。但高剂量组和中剂量组在给药期间平均体重增长略高于空白对照组。因此，实验结果表明，华蟾素在较大剂量、较长疗程(3个月)用药，对大鼠的生长发育(体重增长)无毒性影响。
③华蟾素对大鼠血液学的影响：
实验结果见表2和表3。
             表2华蟾素连续给药3个月对大鼠血象的影响(X±S)
  组别 动物数(只) Hb(g/L) RBC(×1012/L) 网织红细胞(％) PLT(×109/L) WBC(×109/L)   WDC(％)
  中性粒细胞   淋巴细胞   嗜酸性粒细胞   单核细胞
  对照组高剂量组   1414   134.14±8.54133.43±7.85   7.66±0.607.24±0.96   2.47±0.952.55±1.11   594.29±80.04566.21±53.33   11.78±2.9210.78±2.97   23.71±3.2720.21±12.04   74.36±3.3778.64±12.02   0.85±0.770.64±0.84   1.07±0.990.50±0.94
注：各给药组动物血液学各项指标数值，分别与空白对照组相应指标数值比较，P均＞0.05。
                         表3华蟾素连续给药3个月后停药2周对大鼠血象的影(X±S)
  组别 动物数(只) Hb(g/L) RBC(×1012/L) 网织红细胞(％) PLT(×109/L) WBC(×109/L)   WDC(％)
  中性粒细胞   淋巴细胞   嗜酸性粒细胞   单核细胞
  对照组高剂量组   66   126.33±9.16127.33±11.67   6.71±0.696.82±0.58   2.47±0.952.55±1.11   560.67±48.31521.67±81.86   11.33±3.2011.37±4.80   20.33±2.9420.17±6.65   78.67±3.1478.00±5.29   1.00±1.101.67±2.16   000.17±0.41
注：各给药组动物血液学各项指标数值，分别与空白对照组相应指标数值比较，P均＞0.05。
从表2和表3可见，华蟾素口服高、中、低3种剂量对大鼠连续给药3个月及停药后2周，对大鼠的血液学均未见显著影响。各给药组动物的Hb、RBC、网织红细胞、PLT、WBC及WDC数值均和空白对照组的数值接近，且都在正常值范围内。与空白对照组比较，经统计学处理，P均＞0.05。因此，认为华蟾素较大剂量较长时期用药(3个月)及停药后2周，对大鼠的造血功能无显著毒性影响。
④华蟾素对大鼠肝脏功能和肾脏功能的影响：
实验结果见表4和表5。
             表4华蟾素连续给药3个月对大鼠肝脏功能和肾脏功能的影响(X±S)
  组别   动物数(只)   肝脏功能   肾脏功能
  ALT(u/L)   SP(g/L)   Alb(g/L)   Glob(g/L)   A/G   BUN(mmol/L)   Cr(μmol/L)
  对照组高剂量组   1414   41.69±14.3440.33±11.81   68.92±4.4964.18±13.99   45.37±6.8243.46±7.74   22.97±8.2322.11±12.36   1.99±1.082.16±0.79   3.01±0.203.11±0.27   96.30±11.7495.28±2.94
注：各组动物的各项指标数值均在正常范围内。各给药组各项指标数值分别与空白对照组相应指标数值相比较，P均＞0.05。
             表5华蟾素连续给药3个月停药2周对大鼠肝脏功能和肾脏功能的影响(X±S)
  组别   动物数(只)   肝脏功能   肾脏功能
  ALT(u/L)   SP(g/L)   Alb(g/L)   Glob(g/L)   A/G   BUN(mmol/L)   Cr(μmol/L
  对照组高剂量组   1414   33.66±6.1234.34±8.14   77.44±4.4278.64±1.86   45.74±2.5647.98±1.80   31.70±4.3030.78±1.58   1.47±0.261.56±0.11   2.20±0.261.56±0.11   92.66±5.00100.34±11.06
注：各给药组各项指标数值分别与空白对照组相应指标数值相比较，P均＞0.05。
从表4和表5中可见，华蟾素高、中、低3种剂量对大鼠连续给药3个月以及停药2周，大鼠的月肝脏功能(ALT、SP、Alb、Glob、A/G)和肾脏功能(BUN、Cr)各项指标数值分别与空白对照组相应指标的数值比较，均未见有明显的差异，P均＞0.05，且都在正常值范围内。故实验结果表明华蟾素较大剂量连续用药3个月以及停药2周后，对大鼠的肝脏功能和肾脏功能均无显著毒性作用。
⑤华蟾素对大鼠主要器官系数的影响：
实验结果见表6和表7。
         表6华蟾素连续给药3个月对大鼠主要器官重量系数的影响(X±S，mg/100g体重)
  组别   动物数(只)   心   肝   脾   肺   肾   胸腺   肾上腺
  对照组高剂量组   66   341.46±25.58337.10±26.78   2874.61±416.962870.38±372.90   320.34±108.91890.85±80.45   493.59±69.36568.61±118.67   580.21±33.30591.73±85.82   120.98±31.36116.62±32.89   13.81±6.2413.77±6.65
注：各给药组各指标数值分别与对照组相应指标数值相比较，P均＞0.05。
   表7华蟾素连续给药3个月后停药2周对大鼠重要器官重量系数的影响(X±S，mg/100g体重)
  组别   动物数(只)   心   肝   脾   肺   肾   胸腺   肾上腺
  对照组高剂量组   66   353.83±25.90333.33±27.04   2733.50±286.902622.83±217.10   333.50±86.17272.83±36.10   553.67±149.99552.67±51.20   580.21±33.30591.73±85.82   94.50±52.73104.33±25.32   19.50±10.9719.85±10.27
注：各给药组各指标数值分别与对照组相应指标数值相比较，P均＞0.05。
从表6和表7可见，华蟾素高、中、低3种剂量对大鼠连续给药3个月以及停药后2周，大鼠重要器官(心、肝、脾、肺、肾、胸腺和肾上腺)重量系数的数值与空白对照组均相近。经统汁学处理，各给药组各项指标的数值与空白对照组相比较，其差异均无显著性(P＞0.05)。实验结果表明，华蟾素较大剂量长期(3个月)服用以及停药后2周，对大鼠重要器官的重量系数均无显著的影响。
⑥华蟾素对大鼠重要器官组织的病理形态的影响：
对华蟾素连续给药3个月，以及停药2周的两批次杀取的大鼠，将各组大鼠的心、肝、脾、肺、肾、胸腺和肾上腺在相同部位取材用10％甲醛溶液固定。将空白对照组和高剂量组各20只大鼠(分两时期杀取)的上述器官组织制作组织切片和进行病理学检查。检查结论如下：经对两组动物的各器官观察，空白对照组和高剂量组各种器官结构正常，细胞染色均匀，无明显改变。
由于高剂量组动物各器官未出现病理变化，故对中剂量组和低剂量组未进行器官组织切片检查。
结语：
经大鼠长期毒性试验结果表明，以华蟾素28、14、2g生药/kg3种剂量(分别为成年人用量的70倍、35倍和5倍)，每日1次，连续3个月对大鼠腹腔给药以及停药后2周，与腹腔蒸馏水的空白对照组比较，各剂量给药对大鼠的一般状态(外观形态、活动、大便形状等)、生长发育(体重增长)、造血功能(血液学检查)、肝脏功能、肾脏功能和重要器官重量系数，均未发现有明显毒性作用；且经病理学检查证明，高剂量组与空白对照组比较观察，对大鼠心、肝、脾、肺、肾、胸腺、肾上腺等器官组织亦均未发现有明显毒性损伤变化。故可以认为较大剂量和较长疗程服用华蟾素的毒性甚低，服用安全，可提供临床试用。待进一步考查其有无毒副反应。
本发明的华蟾素冻干粉针剂经过药效学研究，证明效果有更大的提高。
华蟾素对动物移植性肿瘤的抑制作用：
1.实验材料
(1)实验药物：
①试验药物：华蟾素冻干粉针剂、西林瓶包装，浓度为25μg/支。由辽宁玉皇药业有限公司制备，批号20050206。
②阳性对照药物：
氟尿嘧啶注射液：天津市氨基酸公司人民制药厂出品，批号：20041102
注射用环磷酰胺：上海华联制药有限公司出品，批号：20040902。
(2)实验动物：
小鼠，C37BL/6N和昆明种系，体重20±2g，雌雄各半。均由华西医科大学实验动物中心提供。实验动物质量合格证明书号为No：0000624。
(3)动物肿瘤瘤株：
①小鼠肉瘤180(S180)、②小鼠肝癌(H22：腹水型)、③小鼠肺癌(Lewis肺癌)：由吉林大学药学院生物药物室提供。
2.实验方法与结果
(1)华蟾素对移植性小鼠肉瘤180(S180)的抑瘤实验：
实验于不同的时间分3批次进行。第1批次采用接种S18010天实体型供试小鼠的瘤组织，切成0.2×0.2×0.2cm3大小，在每只小鼠右前肢腋下皮下植入1块肉瘤组织块。第2和第3批次实验，选择接种小鼠肉瘤180(S180)后7-10天腹水生长良好的瘤源动物，脱颈椎处死。在无菌条件下接抽取腹水，计数肿瘤细胞，用无菌生理盐水稀释混匀，置冰水中存放。于每只小鼠右前肢腋下皮下注射细胞S180混悬液0.2ml(约2×106个瘤细胞)。动物移植瘤细胞后24小时，随机分组、编号、称体重，开始依组别不同给予药物治疗。每批次实验均各分四组，分别作为：空白对照组；华蟾素高剂量组和低剂量组(剂量分别为12.5g生药/kg和6.25g生药/kg)，腹腔给药；阳性对照药组(环磷酰胺：10mg/kg，腹腔注射，间日1次)；各批次实验均连续用药10天。末次给药后24小时，称动物体重后脱颈椎处死，剥取瘤体组织称重。按下列公式计算瘤重抑制率和进行统计学(t检验)处理。
实验结果见表8。
             表8华蟾素对移植性小鼠S180瘤体生长的影响
组别   动物数(只)   瘤重X±S，g   抑瘤率(％)
  给药前/给药后
  空白对照组华蟾素高剂量组华蟾素低剂量组环磷酰胺组   20/2021/2121/2114/14   1.37±0.790.63±0.59**0.97±0.380.43±0.19   --54.0129.2068.61
注：与空白对照组比较，*P＜0.05；**P＜0.01。
从表8可见，在重复进行的3批次实验中，华蟾素腹腔给药对小鼠肉瘤180(S180)有明显的抑瘤作用，有一定的量效依赖关系，在高剂量组(12.5g生药/kg)时抑瘤作用较强，瘤重抑制率达39.58％-54.01％，且重复实验时作用稳定，重现性好；实验中观察到已知抗瘤药物环磷酰胺和氟尿嘧啶对小鼠S180亦有显著的抗肿瘤作用。
(2)华蟾素小鼠移植性肝癌(H22)的抑瘤实验：
实验分3批次进行。瘤细胞混悬液的制备方法和移植方法均同小鼠S180实验。接种后24小时，将小鼠随机分成4组；分别作为：空白对照组(生理盐水)；华蟾素高剂量组与低剂量组(12.5g生药/kg和6.25g生药/kg，腹腔给药)；阳性药物对照组(氟尿嘧啶10mg/kg，皮下注射)。各组每日给药1次，连续10天。末次给药后24小时将动物称体重后脱颈椎处死，剥取瘤体组织称重，并按前述公式计算瘤重抑制率和进行统计学(t检验)处理，实验结果见表9。
                      表9华蟾素对移植性小鼠肝癌H22瘤体生长的影响
组别   动物数(只) 体重(X±S，g)   瘤重(X±S，g)   抑瘤率(％)
  给药前/给药后   给药前   给药后
  空白对照组华蟾素高剂量组华蟾素低剂量组氟尿嘧啶组   13/1312/1212/1210/10   17.21±3.2717.94±2.4318.09±3.0718.88±4.22   22.73±4.1521.66±3.0423.38±3.5223.33±7.31   1.95±0.791.28±0.29*1.72±0.831.15±0.68*   --34.3611.7941.03
  空白对照组华蟾素高剂量组华蟾素低剂量组氟尿嘧啶组   12/1212/1210/1011/11   19.88±1.3819.78±0.9020.11±1.1920.27±0.77   31.37±5.0030.88±1.9531.70±3.3330.18±2.01   1.49±0.671.32±0.61*1.54±0.531.10±0.39   --11.41-3.3626.17
  空白对照组华蟾素高剂量组华蟾素低剂量组氟尿嘧啶组   11/1111/1110/1010/10   18.82±1.2818.63±1.3018.55±0.9119.08±1.71   23.61±3.3724.98±2.3425.71±2.5822.98±0.91   1.53±0.531.08±0.22*1.30±0.260.91±0.30**   --29.4115.0340.52
注：与空白对照组比较，*P＜0.05；**P＜0.01。
从表9可见，在不同时间3批次的实验中，华蟾素高剂量(12.5g生药/kg)腹腔给药，有两次实验结果具有显著的抗癌作用。瘤重抑制率可达34.36％和29.41％(P均＜0.05)。表明华蟾素腹腔给药对移植性小鼠肝癌(H22)的抗癌作用稍弱。
(3)华蟾素对移植性小鼠Lewis肺癌的抑瘤实验：
实验分3批次在不同的时间进行。选择接种Lewis肺癌7-10天而肿瘤生长旺盛的C57瘤源小鼠，脱颈椎处死。在无菌条件下剥取瘤块组织，称重后剪碎，与生理盐水按1∶3(g/v)用无菌匀浆器研磨成匀浆，置冰水中存放备用。实验时取健康C57小鼠，于右前肢腋下皮下注射上述Lewis肺癌细胞混悬液0.2ml/只。接种后24小时，将小鼠按性别随机搭配分成4组。组别、给药剂量及途径、疗程均同小鼠肝癌实验。末次给药后24小时，称动物体重后脱颈椎处死，剥取瘤块组织称重，按前述公式计算瘤重抑制率和进行统计学(t检验)处理。实验结果见表10。
                   表10华蟾素对移植性小鼠Lewis肺癌生长的影响
组别   动物数(只) 体重(X±S，g)   瘤重(X±S，g)   抑瘤率(％)
  给药前/给药后   给药前   给药后
  空白对照组华蟾素高剂量组华蟾素低剂量组氟尿嘧啶组   12/1210/1010/1010/10   20.32±3.1520.73±2.1620.99±3.4720.90±3.06   22.39±3.1422.62±2.6522.80±3.5520.54±2.49   1.50±0.460.93±0.37**1.01±0.24**0.19±0.08**   --38.0032.6187.33
  空白对照组华蟾素高剂量组华蟾素低剂量组氟尿嘧啶组   12/1211/1110/1010/10   18.88±3.1918.46±3.0618.86±2.4918.10±2.68   21.25±2.9220.95±3.2420.77±3.1818.22±2.76   1.49±0.671.32±0.61*1.54±0.531.10±0.39   --31.4841.3690.12
  空白对照组华蟾素高剂量组华蟾素低剂量组氟尿嘧啶组   12/1210/1010/1010/10   19.38±1.6119.01±2.9119.07±2.2019.19±1.78   21.73±1.7221.20±2.5421.24±2.5318.95±1.76   1.53±0.531.08±0.22*1.30±0.260.91±0.30**   --44.2430.9178.18
注：与空白对照组比较，*P＜0.05；**P＜0.01。
从表10可见，在不同时间重复进行的3批次实验，华蟾素腹腔给药，在所用的高、低两个剂量下，对移植性小鼠Lewis肺癌都具有明显的抗癌作用，重复实验的抗癌作用稳定，重现性好。
小结：华蟾素腹腔给药，对移植件小鼠肿瘤(肉瘤S180、肝癌H22、Lewis肺癌)具有肯定的抑瘤作用。其中对小鼠Lewis肺癌和小鼠肉瘤180的效果好，较低剂量(6g生药/kg)时就有显著作用，且重复实验的抑瘤作用稳定，重现性好；对小鼠肝癌(H22)仅较高剂量(12g生药/kg)时才有明显抗癌作用。
具体实施方式：
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
实施例1：
(1)原料药为：干蟾皮1000g；
(2)取干蟾皮，洗净，加10倍和8倍蒸馏水，温热提取，第一次30分钟，第二次30分钟，合并水提液，滤过，滤液浓缩至含1g生药/ml，以3000r/min转速离心20分钟，取上清液，以3000 dalton的超滤膜超滤，得蟾皮水提物；
(3)制剂处方：华蟾素水提物25mg，甘露醇90mg。
(4)取上述华蟾素水提取物和药用辅料混合，加注射用水溶解，加注射用水至规定量，调节pH值至6.5～7.0，除菌过滤，灌装，冷冻干燥，即得。
实施例2：
(1)原料药为：干蟾皮1000g；
(2)取干蟾皮，洗净，加10倍和8倍蒸馏水，温热提取，第一次30分钟，第二次30分钟，合并水提液，滤过，滤液浓缩至含1g生药/ml，以3000r/min转速离心20分钟，取上清液，以4000 dalton的超滤膜超滤，得蟾皮水提物；
(3)制剂处方：华蟾素水提物25mg，右旋糖酐90mg。
(4)取上述华蟾素水提取物和药用辅料混合，加注射用水溶解，加注射用水至规定量，调节pH值至6.5-7.0，除菌过滤，灌装，冷冻干燥，即得。
实施例3：
(1)原料药为：干蟾皮1000g；
(2)取干蟾皮，洗净，加10倍和8倍蒸馏水，温热提取，第一次30分钟，第二次30分钟，合并水提液，滤过，滤液浓缩至含1g生药/ml，以3000r/min转速离心20分钟，取上清液，以4000 dalton的超滤膜超滤，得蟾皮水提物；
(3)制剂处方：华蟾素水提物50mg，右旋糖酐90mg。
(4)取上述华蟾素水提取物和药用辅料混合，加注射用水溶解，加注射用水至规定量，调节pH值至6.5-7.0，除菌过滤，灌装，冷冻干燥，即得。
实施例4：
(1)原料药为：干蟾皮1000g；
(2)取干蟾皮，洗净，加10倍和8倍蒸馏水，温热提取，第一次30分钟，第二次30分钟，合并水提液，滤过，滤液浓缩至含1g生药/ml，以3000r/min转速离心20分钟，取上清液，以5000 dalton的超滤膜超滤，得蟾皮水提物；
(3)制剂处方：华蟾素水提物25mg，聚乙烯吡咯烷酮90mg。
(4)取上述华蟾素水提取物和药用辅料混合，加注射用水溶解，加注射用水至规定量，调节pH值至6.5-7.0，除菌过滤，灌装，冷冻干燥，即得。

Claims (10)

1、一种华蟾素冻干粉针剂的制备方法，其特征在于，包括华蟾素水提物和药用辅料混合的步骤，其中华蟾素水提物中吲哚类总生物碱含量大于或等于60％。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述华蟾素水提物其制备方法包括以下步骤：
(1)原料：干蟾皮；
(2)取干蟾皮，洗净，加10倍和8倍蒸馏水，温热提取，第一次30分钟，第二次30分钟，合并水提液，滤过，滤液浓缩至含1g生药/ml，以3000r/min转速离心20分钟，取上清液，超滤，得蟾皮水提物；
(3)取上述蟾皮水提物和药用辅料混合，加注射用水溶解，加注射用水至规定量，调节pH，过滤，灌装，冷冻干燥，即得。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，其中所述药用辅料选自：低分子右旋糖酐、甘露醇、环糊精、可溶性淀粉、糖类物质、聚乙烯吡咯烷酮、氯化钠、葡萄糖、苯甲酸、纤维素类物质。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，其中所述华蟾素水提物和药用辅料是以1∶10～10∶1的比例配比的。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，其中所述华蟾素水提物和药用辅料是以1∶5～5∶1的比例配比的。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，其中所述华蟾素水提物和药用辅料是以1∶2～2∶1的比例配比的。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，其中所述超滤是用超滤膜截留分子量为3000～5000dalton的超滤膜。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，其中所述超滤是用超滤膜截留分子量为4000dalton的超滤膜。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，其中所述温热为加热到60-85℃。
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，每支注射用冻干粉针剂中华蟾素水提物的量为25～50mg，药用辅料的量为50～100mg。
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