CN109765319B - 一种六神丸hplc指纹图谱检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种六神丸HPLC指纹图谱检测方法，该方法包括：供试品溶液的制备、对照品溶液的制备、用高效液相色谱仪测定，以参照峰保留时间和峰面积为1，建立六神丸对照图谱及指纹图谱。六神丸指纹图谱与标准指纹图谱对比，相似度均大于0.9。本发明提供的六神丸指纹图谱检测方法，灵敏度和精密度高，稳定性和重复性好，可以客观、全面、准确的评价六神丸质量，对保证六神丸临床疗效具有重要意义。

Description

一种六神丸HPLC指纹图谱检测方法

技术领域

本发明涉及一种中药制剂的质量检测方法，具体涉及一种六神丸HPLC指纹图谱检测方法。

背景技术

六神丸源自吴门医派温病学说，为雷允上传承近两百年国家绝密处方，国家非物质文化遗产，全方由蟾酥、麝香等6味中药组成，具有清凉解毒，消炎止痛的功效，用于烂喉丹痧，咽喉肿痛，喉风喉痈，单双乳蛾，小儿热疖，痈疡疔疮，乳痈发背，无名肿毒。现代临床常用于治疗咽炎、扁桃体炎、流行性感冒、腮腺炎、寻常疣、带状疱疹和肿瘤等多种疾病。

六神丸现行质量标准为国家卫生部药品标准(标准号：WS3-B-3374-98)，其中鉴别项仅对麝香酮进行鉴别，含量测定项仅对胆酸进行控制，该质量标准仅仅测定其中的一味药材含量，故不足以全面对六神丸质量进行控制。现有文献报道中，已有学者采用HPLC法或HPLC-MS法对六神丸中多成分进行含量测定，如对比文件1：一种六神丸中蟾酥二烯内酯类成分检测方法(申请号：201710053340.4)公开了一种采用HPLC法同时测定六神丸中和蟾蜍他灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、去乙酰华蟾毒它灵、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基9种蟾蜍二烯内酯类成分的检测方法。该方法虽然对六神丸多指标成分进行了控制，但检测繁琐，且仅针对蟾酥一味中药，远不足以对六神丸质量进行全面控制。

中药指纹图谱是指中药材或中药制剂经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其化学特征的色谱图或光谱图。中药指纹图谱是一种综合的，可量化的鉴定手段，能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述和评价，具备专属性强、稳定性好、重现性好的优点，因此中药指纹图谱已经成为目前国际上较为先进的中药质量控制手段。同时，高效液相色谱法(HPLC)具有分离效率高，分析速度快，定量精密度高，检测器种类多，稳定性好等特点。不受样品挥发度和热稳定性的限制，样品中大多数成分均可在高效液相色谱仪上进行分析检测，是构建中药指纹图谱的主要方法之一。

因此为了更全面、有效的控制六神丸的质量，提高其质量控制水平，让临床用药安全及疗效更加有所保证，很有必要在现有技术的基础之上研究设计出一种能客观、准确、全面检测六神丸质量的HPLC指纹图谱测定方法。

发明内容

发明目的：本发明为了解决现有技术的不足，提供一种精密度高、重复性和稳定性好、能客观、全面、准确地评价六神丸质量的HPLC指纹图谱检测方法，从而更有效的保证六神丸成品的质量。

技术方案：为了实现上述目的，本发明提供六神丸HPLC指纹图谱的检测方法包括如下步骤：

(1)供试品溶液的制备：精密称取六神丸粉末，加入甲醇溶液作为提取溶剂，密塞，称重，超声或加热回流提取，放冷，准确称重，用甲醇溶液补足失重，吸取上清液，得六神丸供试品溶液；

(2)对照品溶液的制备：取和蟾蜍他灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、去乙酰华蟾毒它灵、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、脂蟾毒配基、华蟾酥毒基、胆酸、鹅去氧胆酸、去氧胆酸对照品中的一种或几种，精密称定，加甲醇溶解，得对照品溶液；

(3)六神丸HPLC指纹图谱的测定：分别精密吸取步骤(1)对照品溶液和步骤(2)供试品溶液，用高效液相色谱仪测定，以参照峰保留时间和峰面积为1，计算供试品相对保留时间和相对峰面积，建立六神丸HPLC对照图谱及指纹图谱。

高效液相色谱仪测定的色谱条件为：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶填充柱；流动相：乙腈为A相-酸水溶液为B相，梯度洗脱；流速0.8～1.2mL/min；柱温35℃～40℃；进样量10μL ～20μL；高效液相色谱仪的检测器为UV检测器、ELSD检测器中的一种或两种串联合用； UV检测波长为192nm、204nm、296nm中的一种；ELSD检测参数：增益150～200，喷雾器为冷却模式，漂移管温度50℃～100℃，气体压力25psi～50psi。

作为优选方案，上述步骤(1)供试品溶液的制备方案为：精密称取六神丸粉末0.2g，加入 10mL的75％甲醇作为提取溶剂，密塞，称重，超声处理(功率250W，频率40kHz)，时间为30min，放冷，准确称重，用75％甲醇补足失重，吸取上清液，使其过0.22μm的微孔滤膜，得六神丸供试品溶液。

上述步骤(2)对照品溶液的制备方案为：取和蟾蜍他灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、去乙酰华蟾毒它灵、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、脂蟾毒配基、华蟾酥毒基、胆酸、鹅去氧胆酸、去氧胆酸对照品，精密称定，置于10mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容到刻度，震荡摇匀，得到质量浓度分别为24.14、19.79、52.66、42.96、49.43、81.13、54.38、139.19、136.82、362.33、54.02、46.67μg/mL的和蟾蜍他灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、去乙酰华蟾毒它灵、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、脂蟾毒配基、华蟾酥毒基、胆酸、鹅去氧胆酸、去氧胆酸混合对照品溶液；

上述步骤(3)六神丸HPLC指纹图谱的测定：所述的色谱条件为：所述的色谱条件为：色谱柱为Kromasil C18柱(规格为250mm×4.6mm，5μm)、Xbridge C18柱(规格为250mm×4.6mm，5μm)或ODS-2柱(规格为250mm×4.6mm，5μm)中的一种；流动相：乙腈为A相-0.15％的磷酸水溶液、0.5％的磷酸水溶液或0.05％三氟乙酸水溶液中的一种为B相，梯度洗脱：0～80min，乙腈A相由6％→80％；流速1.0mL/min；柱温35℃；进样量20μL；高效液相色谱仪的检测器为UV检测器、ELSD检测器中的一种或两种串联合用；UV检测波长为192nm、204nm、296nm中的一种；ELSD检测参数：增益150，喷雾器为冷却模式，漂移管温度70℃，气体压力25psi。

作为更优选方案，步骤(3)所述的色谱条件为：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶填充柱；流动相：乙腈(A)-0.5％磷酸水溶液(B)，梯度洗脱；流速1.0mL/min；柱温35℃；进样量20μL；检测器为UV检测器，检测波长204nm；

所用的梯度洗脱条件为：

时间(min)	乙腈A(％)	0.5％磷酸水(％)
			0～3	6	94
3～6	6→10	94→90
			6～11	10	90
11～20	10→20	90→80
			20～35	20→25	80→75
35～45	25→30	75→70
			45～55	30	70
55～80	30→40	70→60
			80～85	40	60
85～90	40→90	60→10
			90～95	90	10
95～100	90→6	6→94
			100～105	6	94

作为更优选方案，步骤(3)所述的色谱条件为：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶填充柱；流动相：乙腈(A)-0.05％三氟乙酸溶液(B)，梯度洗脱；流速1.0mL/min；柱温35℃；进样量20μL；检测器为UV和ELSD检测器串联，检测波长296nm；ELSD参数：增益150，喷雾器为冷却模式，漂移管温度70℃，气体压力25psi。

所用的梯度洗脱条件为：

本发明六神丸HPLC指纹图谱的构建方法得到的HPLC指纹图谱，其特殊之处在于，其处方原料药材蟾酥的HPLC指纹图谱的构建方法，与六神丸制剂具有相同的检测条件并得到蟾酥药材的指纹图谱。本发明所述的六神丸制剂中蟾酥原料药材的指纹图谱检测方法，其包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：精密称取蟾酥药材粉末0.2g，加入10mL的75％甲醇作为提取溶剂，密塞，称重，超声处理(功率250W，频率40kHz)，时间为30min，放冷，准确称重，用75％甲醇补足失重，吸取上清液，使其过0.22μm的微孔滤膜，得蟾酥药材供试品溶液。

(2)对照品溶液的制备：精密称取和蟾蜍他灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、去乙酰华蟾毒它灵、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、脂蟾毒配基、华蟾酥毒基对照品，精密称定，置于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容到刻度，震荡摇匀，得到质量浓度分别为24.14、19.79、52.66、42.96、49.43、81.13、54.38、139.19、136.82μg/mL的和蟾蜍他灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、去乙酰华蟾毒它灵、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、脂蟾毒配基、华蟾酥毒基混合对照品溶液。

(3)蟾酥药材HPLC指纹图谱的测定：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液，用高效液相色谱仪测定，以参照峰保留时间和峰面积为1，计算供试品相对保留时间和相对峰面积，建立蟾酥药材HPLC对照图谱及指纹图谱。

色谱条件为：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶填充柱；流动相：乙腈(A)-0.5％磷酸水溶液(B)，梯度洗脱；流速1.0mL/min；柱温35℃；进样量20μL；检测器为UV检测器，检测波长204nm；

所用的梯度洗脱条件为：

本发明得到的六神丸指纹图谱包括HPLC-UV指纹图谱或HPLC-ELSD指纹图谱，数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)》进行评价，相似度均大于0.9。

其中六神丸HPLC-UV指纹图谱在204nm共有19个共有峰，其中16号峰蟾毒灵为参照峰。通过比对分析，共有峰中12号峰来自于牛黄，峰1、2、3、5、6、7、8、9、11、13、 14、15、16、18、19号峰来源于蟾酥，峰4、10、17号峰来自于麝香。其中6号峰为蟾蜍它灵、8号峰为沙蟾毒精、11号峰为远华蟾毒精、13号峰为蟾毒它灵、15号峰为华蟾毒它灵、 18号峰为脂蟾毒配基、19号峰为华蟾酥毒基。

其中六神丸HPLC-UV指纹图谱在296nm共有14个共有峰，其中13号峰蟾毒灵为参照峰。通过比对分析，14个共有峰均来源于蟾酥药材。其中3号峰为和蟾蜍他灵，5号峰为沙蟾毒精，9号峰为远华蟾毒精，11号峰为蟾毒它灵，12号峰为华蟾毒它灵，13号峰为蟾毒灵。六神丸HPLC-UV指纹图谱及对照图谱见说明书附图图1～图4。

六神丸HPLC-ELSD指纹图谱共有13个共有峰，其中9’号峰胆酸为参照峰。通过比对分析，共有峰中5’、9’、10’、12’、13’号峰来源于牛黄，峰1’、2’、3’、4’、6’、7’、8’、11’号峰来源于蟾酥，9’号峰来源于麝香。其中3’号峰为和蟾蜍他灵，6’号峰为远华蟾毒精，7’号峰为蟾毒它灵，8’号峰为蟾毒灵，12’号峰为鹅去氧胆酸，13’号峰为去氧胆酸。六神丸HPLC-ELSD指纹图谱及对照图谱见说明书附图图5、图6。

本发明提供的六神丸HPLC指纹图谱检测方法相比现有技术具有以下优点：

(1)本发明提供的六神丸指纹图谱的检测方法，同时建立了六神丸HPLC-UV指纹图谱，特别还可建立神丸HPLC-ELSD指纹图谱(可以同时检测牛黄，蟾酥和麝香中的多种有效成分)，可全面反映六神丸中多指标成分的质量水平，填补现有研究空白。

(2)本发明的六神丸HPLC指纹图谱的检测方法，其精密度试验、稳定性试验、重复性试验结果表明该方法准确度高、稳定性高、重复性好。

(3)本发明的六神丸HPLC指纹图谱的检测方法对六神丸中多成分既能定性又能定量，可适用于监控六神丸原料药材、中间体半成品的质量以及生产工艺的质量控制，对保证六神丸的质量具有重要意义，适用范围广。

附图说明

图1为六神丸HPLC-UV(204nm)指纹图谱。

图2为六神丸HPLC-UV(204nm)对照图谱(R)。

图3为六神丸HPLC-UV(296nm)指纹图谱。

图4为六神丸HPLC-UV(296nm)对照图谱(R)。

图5为六神丸HPLC-ELSD指纹图谱。

图6为六神丸HPLC-ELSD对照图谱(R)。

图7为六神丸HPLC-UV(296nm)指纹图谱中各共有峰归属色谱图。

图8为六神丸HPLC-ELSD指纹图谱中各共有峰归属色谱图。

图9为六神丸HPLC-UV(192nm)对照图谱(R)。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。

实施例1：六神丸HPLC-UV指纹图谱建立

1、供试品溶液的制备：

精密称取六神丸粉末0.2g，加入10mL的体积浓度75％甲醇作为提取溶剂，密塞，称重，超声处理(功率250W，频率40kHz)，时间为30min，放冷，准确称重，用75％甲醇补足失重，吸取上清液，使其过0.22μm的微孔滤膜，得六神丸供试品溶液。

2、对照品溶液制备：

取和蟾蜍他灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、脂蟾毒配基、华蟾酥毒基对照品，精密称定，置于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容到刻度，震荡摇匀，得到质量浓度分别为24.14、19.79、52.66、49.43、81.13、54.38、139.19、136.82μg/mL的和蟾蜍他灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、脂蟾毒配基、华蟾酥毒基混合对照品溶液。

3、色谱条件：

色谱柱：Waters Xbridge C18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈(A)-0.5％磷酸水溶液(B)，梯度洗脱如下；流速1.0mL/min；柱温35℃；进样量20μL；检测器为UV检测器，检测波长204nm；

所用的梯度洗脱条件为：

时间(min)	乙腈A(％)	0.5％磷酸水(％)
			0～3	6	94
3～6	6→10	94→90
			6～11	10	90
11～20	10→20	90→80
			20～35	20→25	80→75
35～45	25→30	75→70
			45～55	30	70
55～80	30→40	70→60
			80～85	40	60
85～90	40→90	60→10
			90～95	90	10
95～100	90→6	6→94
			100～105	6	94

4、方法学考察

4.1精度度试验

精密称取0.2g六神丸(S1)粉末，按“1”项所述方法制备六神丸供试品溶液，按照“3”项所述的色谱条件连续进样6次，记录色谱图，导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(国家药典委员会2012A版)，相似度计算均在0.99以上，仪器精密度良好。

4.2重复性试验

精密称取0.2g六神丸(S1)粉末6份，按“1”项所述方法制备六神丸供试品溶液，按照“3”项所述的色谱条件进样，记录色谱图，导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(国家药典委员会2012A版)，相似度计算均在0.99以上，表明方法的重复性合乎要求。

4.3稳定性试验

精密称取0.2g六神丸(S1)粉末，按“1”项所述方法制备六神丸供试品溶液，按照“3”项所述的色谱条件，分别在0、2、4、8、12、24h进样，导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(国家药典委员会2012A版)，相似度计算均在0.99以上，表明样品在24h内稳定。

5、六神丸HPLC-UV指纹图谱的建立

取15批不同批次的六神丸供试品溶液，按照“3”项下方法进样，记录色谱图。导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(国家药典委员会2012A版)，时间宽度为0.5min，进行全谱峰匹配后，生成六神丸共有模式指纹图谱(见附图1)，共有19个共有指纹峰，对8个色谱峰进行指认。分别为和蟾蜍它灵(6号峰)、沙蟾毒精(8号峰)、远华蟾毒精(11号峰)、蟾毒它灵(13号峰)、华蟾毒它灵(15号峰)、蟾毒灵(16号峰)、脂蟾毒配基(18号峰)、华蟾酥毒基(19号峰)。通过单味药、缺单味药的阴性制剂和六神丸供试品进行比对分析，共有峰中12号峰来自于牛黄，1、2、3、5、6、7、8、9、11、13、14、15、16、18、19号峰来源于蟾酥，4、10、17号峰来自于麝香。

6、相似度分析

取15批不同批次的六神丸供试品溶液，按照“3”项下方法进样，记录色谱图。导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(国家药典委员会2012A版)，相似度计算结果表明，15批六神丸样品的相似度在0.951～0.990，相似度良好。

实施例2：六神丸HPLC-UV/ELSD指纹图谱建立

1、供试品溶液的制备：

精密称取六神丸粉末0.2g，加入10mL的75％甲醇作为提取溶剂，密塞，称重，超声处理(功率250W，频率40kHz)，时间为30min，放冷，准确称重，用75％甲醇补足失重，吸取上清液，使其过0.22μm的微孔滤膜，得六神丸供试品溶液。同法制备各单味药溶液、阴性制剂溶液。

2、对照品溶液制备：

取和蟾蜍他灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、脂蟾毒配基、华蟾酥毒基、胆酸、鹅去氧胆酸、去氧胆酸对照品，精密称定，置于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容到刻度，震荡摇匀，得到质量浓度分别为24.14、19.79、52.66、49.43、81.13、54.38、139.19、136.82、362.33、54.02、46.67μg/mL的和蟾蜍他灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、脂蟾毒配基、华蟾酥毒基、胆酸、鹅去氧胆酸、去氧胆酸混合对照品溶液。

3、色谱条件：

色谱柱：Kromasil C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈(A)-0.05％三氟乙酸水溶液(B)，梯度洗脱；流速1.0mL/min；柱温35℃；进样量20μL；检测器为UV和ELSD 检测器串联，检测波长296nm；ELSD参数：增益150，喷雾器为冷却模式，漂移管温度70℃，气体压力25psi。

所用的梯度洗脱条件为：

4、方法学考察

4.1精度度试验

精密称取六神丸(S1)粉末0.2g，根据“1”项描述的方法制备六神丸供试品溶液，并且按照“3”项描述的色谱条件，连续进样6次，计算并统计所得谱图的保留时间以及峰面积的RSD，结果表明，六神丸HPLC-UV谱图的各主要色谱峰的保留时间以及峰面积的RSD分别在0.21％～0.56％、0.37％～1.54％，相似度均大于0.99，六神丸HPLC-ELSD谱图的各主要色谱峰的保留时间以及峰面积的RSD分别在0.05％～0.81％、1.40％～2.67％，相似度均大于0.99，显示精密度良好。

4.2重复性试验

精密称取六神丸(S1)粉末0.2g，根据“1”项描述的方法制备6份六神丸供试品溶液，并且按照“3”项描述的色谱条件进样，计算并统计所得谱图保留时间以及峰面积的RSD，结果表明，六神丸HPLC-UV谱图的各主要色谱峰的保留时间以及峰面积的RSD分别在0.06％～0.21％、0.13％～0.92％，相似度均大于0.99，六神丸HPLC-ELSD谱图的各主要色谱峰的保留时间以及峰面积的RSD分别在0.05％～0.31％、1.02％～2.85％，相似度均大于0.99，显示重复性良好。

4.3稳定性试验

精密称取六神丸(S1)粉末0.2g，根据“1”项描述的方法制备六神丸供试品溶液，并且分别在0、2、4、8、12、24h，按照“3”项描述的色谱条件进样，计算并统计所得谱图保留时间及峰面积的RSD，结果表明，六神丸HPLC-UV谱图的各主要色谱峰的保留时间以及峰面积的RSD分别在0.18％～0.53％、0.39％～2.25％，相似度均大于0.99，六神丸HPLC-ELSD 谱图的各主要色谱峰的保留时间以及峰面积的RSD分别为0.06％～0.58％、1.25％～2.88％，相似度均大于0.99，显示样品在24h内稳定。

5、结果与分析

5.1六神丸HPLC-UV指纹图谱的建立

精密称取14批六神丸粉末各0.2g，根据“1”项方法制备14批六神丸供试品溶液，按照“3”项描述的色谱条件进样。根据《中药色谱指纹图谱》的相关要求，记录14批六神丸供试品溶液的色谱图，并且导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)》中进行分析。以S1批为参照谱，时间窗宽度设定为0.50，自动匹配色谱峰，生成六神丸HPLC-UV指纹图谱(图3)以及对照图谱(图4)。

将分离度较好、峰面积较大的色谱峰进行标定，在HPLC-UV指纹图谱中标定14个共有峰，13号峰(蟾毒灵)具有较大的峰面积、适中的保留时间及稳定的峰型，因此选其为参比峰。分析六神丸HPLC-UV中共有峰的相对保留时间以及相对峰面积。实验结果表明，14个批次六神丸中各共有峰相对保留时间的RSD％均小于0.50，显示共有峰的出峰时间相对稳定。测得S1～S14批六神丸与对照指纹图谱间的相似度均大于0.90，相似度良好。

5.2六神丸HPLC-ELSD指纹图谱的建立

六神丸HPLC-ELSD指纹图谱软件处理参数与HPLC-UV指纹图谱一致，生成六神丸HPLC-ELSD指纹图谱(图5)及对照图谱(图6)。六神丸HPLC-ELSD指纹图谱共获得13 个共有峰，其中9’号峰(胆酸)具有最大的峰面积、分离度好及稳定的峰型，因此选其为参比峰。分析六神丸HPLC-ELSD中共有峰的相对保留时间以及相对峰面积。实验结果表明， 14个批次六神丸中各共有峰相对保留时间的RSD％均小于0.60，显示共有峰的出峰时间相对稳定。测得S1～S14批六神丸与对照指纹图谱间的相似度均大于0.90，相似度良好。

5.3主要色谱峰的药材归属

按“3”项下色谱进样分析，得到如图7所示的六神丸单味药、缺单味药的阴性制剂和六神丸供试品HPLC-UV色谱峰，通过比对分析，14个共有峰均来源于蟾酥。

按“3”项色谱条件分析，得到如图8所示的六神丸六神丸单味药、缺单味药的阴性制剂和六神丸供试品HPLC-ELSD色谱峰，通过比对分析，13个共有峰中5’、9’、10’、12’、13’号峰来源于牛黄，1’、2’、3’、4’、6’、7’、8’、11’号峰来源于蟾酥，9’号峰也来源于麝香。

5.4主要色谱峰的成分指认

通过分析对照品、单味药以及六神丸供试品的色谱图的保留时间和紫外光谱等方式进行指认，其中在HPLC-UV图谱中(图7)，3号峰为和蟾蜍他灵，5号峰为沙蟾毒精，9号峰为远华蟾毒精，11号峰为蟾毒它灵，12号峰为华蟾毒它灵，13号峰为蟾毒灵；在HPLC-ELSD 图谱中(图8)，3’号峰为和蟾蜍他灵，6’号峰为远华蟾毒精，7’号峰为蟾毒它灵，8’号峰为蟾毒灵，9’号峰为胆酸，12’号峰为鹅去氧胆酸，13’号峰为去氧胆酸。

实施例3：六神丸HPLC-UV指纹图谱建立

1、供试品溶液的制备

精密称取六神丸粉末0.2g，加入10mL的75％甲醇作为提取溶剂，密塞，称重，超声(工作频率50kHz，功率250W)处理1小时，放冷，准确称重，用75％甲醇补足失重，吸取上清液，使其过0.22μm的微孔滤膜，得六神丸供试品溶液。

2、对照品溶液的制备

分别取和蟾蜍它灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、去乙酰华蟾毒它灵、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基、胆酸对照品适量，精密称定，加甲醇溶液制成每1ml含和蟾蜍它灵70.39μg、沙蟾毒精257.78μg、远华蟾毒精257.78μg、去乙酰华蟾毒它灵42.96μg、蟾毒它灵214.73μg、华蟾毒它灵366.44μg、蟾毒灵241.56μg、华蟾酥毒基468.11μg、脂蟾毒配基331.56μg、胆酸0.5mg的混合对照品溶液，即得。

3、参照物溶液的制备

取蟾酥对照药材、牛黄对照药材和麝香对照药材0.2g，加10％冰醋酸甲醇10mL，超声 (工作频率50kHz，功率250W)处理1小时，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

4、色谱条件

色谱柱为ODS-2(250mm×4.6mm，5μm)；流动相为乙腈-0.15％磷酸水溶液，检测器为UV检测器。按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为192 nm。

时间(min)	乙腈A(％)	0.15％磷酸水溶液B(％)
			0～10	15	85
10～15	15→25	85→75
			15～25	25→30	75→70
25～35	30→40	70→60
			35～37	40→50	60→50
37～45	50	50
			45～47	50→90	50→10
47～52	90	10
			52～54	90→15	10→85
53～55	15	85

5、HPLC-UV指纹图谱建立

取15批不同批次的六神丸供试品溶液，按照“4”项下方法进样，记录色谱图。导入“中药色谱特征图谱相似度评价系统”，剪切掉前5min的溶剂峰，设定时间窗为0～60min，时间宽度为0.1min，进行Mark峰自动匹配后，经多点校正、中位数法生成六神丸HPLC-UV对照图谱(图9)，从中选出16个共有指纹峰，并对9个色谱峰进行指认。分别为和蟾蜍它灵(3 号峰)、沙蟾毒精(5号峰)、远华蟾毒精(10号峰)、去乙酰华蟾毒它灵(11号峰)、华蟾毒它灵(12号峰)、蟾毒灵(13号峰)、胆酸(14号峰)、华蟾酥毒基(15号峰)、脂蟾毒配基 (16号峰)。

取15批不同批次的六神丸供试品溶液，按照“4”项下方法进样，记录色谱图。导入“中药色谱特征图谱相似度评价系统”(国家药典委员会2004A版)，结果表明：15批六神丸样品的相似度在0.967～0.997，其中S4与对照特征图谱的相似度达到0.995以上。

Claims (7)

1.一种六神丸HPLC指纹图谱的检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

（1）供试品溶液的制备：精密称取六神丸粉末，加入甲醇溶液作为提取溶剂，密塞，称重，超声或加热回流提取，放冷，准确称重，用甲醇溶液补足失重，吸取上清液，得六神丸供试品溶液；

（2）对照品溶液的制备：取和蟾蜍他灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、去乙酰华蟾毒它灵、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、脂蟾毒配基、华蟾酥毒基、胆酸、鹅去氧胆酸和去氧胆酸对照品，精密称定，加甲醇溶解，得对照品溶液；

（3）六神丸HPLC指纹图谱的测定：分别精密吸取步骤（1）供试品溶液和步骤（2）对照品溶液，用高效液相色谱仪测定，以参照峰保留时间和峰面积为1，计算供试品相对保留时间和相对峰面积，建立六神丸HPLC对照图谱及指纹图谱；

步骤（3）色谱条件为：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶填充柱；流动相：乙腈为A相-0.5%磷酸水溶液为B相，梯度洗脱；流速1.0mL/min；柱温35℃；进样量20μL；检测器为UV检测器，检测波长204nm；

所用的梯度洗脱条件为：

时间/min 乙腈A/% 0.5%磷酸水/% 0~3 6 94 3~6 6→10 94→90 6~11 10 90 11~20 10→20 90→80 20~35 20→25 80→75 35~45 25→30 75→70 45~55 30 70 55~80 30→40 70→60 80~85 40 60 85~90 40→90 60→10 90~95 90 10 95~100 90→6 6→94 100~105 6 94

，

或者

步骤（3）色谱条件为：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶填充柱；流动相：乙腈为A相-0.05%三氟乙酸水溶液为B相，梯度洗脱；流速1.0mL/min；柱温35℃；进样量20μL；检测器为UV和ELSD 检测器串联，检测波长296 nm；ELSD参数为：增益150，喷雾器为冷却模式，漂移管温度70℃，气体压力25 psi；

所用的梯度洗脱条件为：

时间/min 乙腈A/% 0.05%三氟乙酸水溶液B/% 0~2 6 94 2~-6 10 90 6~11 10 90 11~16 10→15 90→85 16~20 15→25 85→75 20~42 25→40 75→60 42~52 40 60 52~64 40→70 60→30 64~68 70 30 68~78 70→6 30→94 78~80 6 94 105-110 95→100 5→0

。

2.根据权利要求1所述的六神丸HPLC指纹图谱的检测方法，其特征在于，步骤（1）供试品溶液的制备：精密称取六神丸粉末0.2 g，加入10 mL的体积浓度75%甲醇作为提取溶剂，密塞，称重，功率250 W，频率40 kHz下超声处理30 min，放冷，准确称重，用体积浓度75%甲醇补足失重，吸取上清液，使其过0.22μm的微孔滤膜，得六神丸供试品溶液；

步骤（2）对照品溶液的制备：取和蟾蜍他灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、去乙酰华蟾毒它灵、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、脂蟾毒配基、华蟾酥毒基、胆酸、鹅去氧胆酸、去氧胆酸对照品，精密称定，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容到刻度，震荡摇匀，得到质量浓度分别为24.14、19.79、52.66、42.96、49.43、81.13、54.38、139.19、136.82、362.33、54.02、46.67 μg/mL的和蟾蜍他灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、去乙酰华蟾毒它灵、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、脂蟾毒配基、华蟾酥毒基、胆酸、鹅去氧胆酸、去氧胆酸混合对照品溶液。

3.根据权利要求1或2所述的六神丸HPLC指纹图谱的检测方法，其特征在于，六神丸HPLC-UV指纹图谱在204nm共有19个共有峰，其中以16号峰蟾毒灵为参照峰，通过比对分析，共有峰中12号峰来自于牛黄，1、2、3、5、6、7、8、9、11、13、14、15、16、18、19号峰来源于蟾酥，4、10、17号峰来自于麝香；其中6号峰为蟾蜍它灵、8号峰为沙蟾毒精、11号峰为远华蟾毒精、13号峰为蟾毒它灵、15号峰为华蟾毒它灵、18号峰为脂蟾毒配基、19号峰为华蟾酥毒基。

4.根据权利要求1或2所述的六神丸HPLC指纹图谱的检测方法，其特征在于，六神丸HPLC-UV指纹图谱在296nm共有14个共有峰，其中以13号峰蟾毒灵为参照峰，通过比对分析，14个共有峰均来源于蟾酥药材，其中3号峰为和蟾蜍他灵，5号峰为沙蟾毒精，9号峰为远华蟾毒精，11号峰为蟾毒它灵，12号峰为华蟾毒它灵。

5.根据权利要求1或2所述的六神丸HPLC指纹图谱的检测方法，其特征在于，六神丸HPLC-ELSD指纹图谱共有13个共有峰，其中9’号峰胆酸为参照峰，通过比对分析，共有峰中5’、9’、10’、12’、13’号峰来源于牛黄，1’、2’、3’、4’、6’、7’、8’、11’号峰来源于蟾酥，9’号峰也来源于麝香；其中3’号峰为和蟾蜍他灵，6’号峰为远华蟾毒精，7’号峰为蟾毒它灵，8’号峰为蟾毒灵，12’号峰为鹅去氧胆酸，13’号峰为去氧胆酸。

6.根据权利要求1 所述的六神丸HPLC 指纹图谱的检测方法，其特征在于，步骤(3)将六神丸供试品HPLC指纹图谱数据导入2012 版中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行评价，相似度均大于0.9。

7.根据权利要求1所述的六神丸HPLC指纹图谱的检测方法，其特征在于，其处方原料药材蟾酥的HPLC指纹图谱的构建方法包括以下步骤：

（1）供试品溶液的制备：精密称取蟾酥药材粉末0.2 g，加入10 mL体积浓度75%甲醇作为提取溶剂，密塞，称重，功率250 W，频率40 kHz下超声处理30 min，放冷，准确称重，用体积浓度75%甲醇补足失重，吸取上清液，使其过0.22μm的微孔滤膜，得蟾酥药材供试品溶液；

（2）对照品溶液的制备：精密称取和蟾蜍他灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、去乙酰华蟾毒它灵、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、脂蟾毒配基、华蟾酥毒基对照品，精密称定，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容到刻度，震荡摇匀，得到质量浓度分别为24.14、19.79、52.66、42.96、49.43、81.13、54.38、139.19、136.82μg/mL的和蟾蜍他灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、去乙酰华蟾毒它灵、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、脂蟾毒配基、华蟾酥毒基混合对照品溶液；

（3）蟾酥药材HPLC指纹图谱的测定：分别精密吸取步骤（1）对照品溶液和步骤（2）供试品溶液，用高效液相色谱仪测定，以参照峰保留时间和峰面积为1，计算供试品相对保留时间和相对峰面积，建立蟾酥药材HPLC对照图谱及指纹图谱；

步骤（3）高效液相色谱条件为：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶填充柱；流动相：乙腈为A相-0.5%磷酸水溶液为B相，梯度洗脱；流速1.0mL/min；柱温35℃；进样量20μL；检测器为UV检测器，检测波长204nm；

梯度洗脱条件为：

时间/min 乙腈A/% 0.5%磷酸水/% 0~3 6 94 3~6 6→10 94→90 6~11 10 90 11~20 10→20 90→80 20~35 20→25 80→75 35~45 25→30 75→70 45~55 30 70 55~80 30→40 70→60 80~85 40 60 85~90 40→90 60→10 90~95 90 10 95~100 90→6 6→94 100~105 6 94

。

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