CN104774235A - 一种基于亲水固相萃取技术的蟾蜍二烯内酯类化合物类分离纯化方法 - Google Patents

一种基于亲水固相萃取技术的蟾蜍二烯内酯类化合物类分离纯化方法 Download PDF

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CN104774235A CN201410010818.1A CN201410010818A CN104774235A CN 104774235 A CN104774235 A CN 104774235A CN 201410010818 A CN201410010818 A CN 201410010818A CN 104774235 A CN104774235 A CN 104774235A
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梁鑫淼
李晓龙
刘艳芳
张云
张秀莉
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Abstract

本发明提供了一种基于亲水固相萃取技术的蟾蜍二烯内酯类化合物类分离纯化方法。采用键合两性离子基团的Click XIon亲水固相萃取柱联合半制备反相色谱柱选择性类分离蟾蜍二烯内酯类化合物的纯化方法。选取蟾蜍皮95%乙醇提取物反相色谱制备分离所得的一个馏分，采用Click Xion亲水固相萃取柱分成氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯类组分和非氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯类组分，通过反相色谱对两组分分别制备，共获得七个化合物。该方法可以实现氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯类和非氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯类化合物的类分离及高效制备，解决了两类化合物在反相柱上疏水性相似，洗脱窗口窄的问题，实现了类分离，并表现出较好的分离效果。

Description

一种基于亲水固相萃取技术的蟾蜍二烯内酯类化合物类分离纯化方法
技术领域
本发明涉及蟾蜍二烯内酯类化合物的类分离纯化，具体地说是一种新型的亲水固相萃取柱（Click XIon）联合高效液相色谱选择性类分离蟾蜍二烯内酯类化合物的纯化制备方法。该方法对氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯类化合物和非氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯类化合物表现出较优的分离效果。
背景技术
蟾蜍二烯内酯（bufadienolides）是一类C24甾，并且在甾体母核的C17位接有β六元不饱和内酯环，该类化合物也常被称为蟾蜍二烯内酯。Liselotte.Krenn,Pieter S.Steyn和高慧敏等分别对蟾蜍二烯内酯类化合物具有的生物活性进行了综述。这些活性主要包括局麻、强心、升压、Na+/K+-ATP酶抑制活性及抗肿瘤等作用（L.Krenn,B.Kopp,Bufadienolides fromanimal and plant sources,Phytochemistry,48(1998)1-29.；P.S.Steyn,Fanie R.van Heerden,Bufadienolides of plant and animal origin,Nat.Prod.Rep,15(1998)397-413.；H.Gao,R.Popescu,B.Kopp,Z.Wang,Bufadienolides and their antitumor activity,Nat.Prod.Rep.,28(2011)953-969.）。另外，此类蟾蜍二烯内酯类成分中的许多化合物都具有较高的毒性和较严重的副作用，给使用者带来一定的安全隐患，从而制约了此类制剂的使用（D.Wang,F.Qi,W.Tang,F.Wang,Chemical Constituents and Bioactivities of the Skin of Bufo bufo gargarizans Cantor,Chem.Biodivers.,8(2011)559-567.）。从天然产物（蟾蜍皮、蟾酥）中分离纯化是获得蟾蜍二烯内酯单体的主要途径。由于蟾蜍二烯内酯类化合物数量多、结构复杂，常规的分离纯化方法较为耗时、低效(L.Krenn,B.Kopp,Bufadienolides from animal and plant sources,Phytochemistry,48(1998)1-29.)。由于氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯和非氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯类化合物疏水性相似，在反相高效液相纯化制备时常常出现共流出现象，给分离纯化带来一定的困难。因此，发展较为高效的方法从蟾蜍皮中分离出高纯度的蟾蜍二烯内酯类化合物进而开展相关药理毒理方面的研究是十分迫切的。
发明内容
本发明提供了一种基于亲水固相萃取技术的蟾蜍二烯内酯类化合物类分离纯化方法。
基于亲水条件下，氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯类化合物和非氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯类化合物亲水性质的不同，我们采用亲水固相萃取柱联合半制备反相色谱柱发展了一种选择性类分离蟾蜍二烯内酯类化合物的纯化方法。其中所述亲水色谱柱为两性离子柱（Click XIon，北京华谱新创科技有限公司）。流动相组成为乙腈、甲醇、乙醇、甲酸、乙酸、三氟乙酸、水。采用线性梯度、台阶梯度或等度洗脱方式。选取蟾蜍皮95%乙醇提取物反相色谱制备分离所得的一个馏分，采用Click XIon亲水固相萃取柱分成氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯类组分和非氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯类组分，通过反相色谱对两组分分别制备，共获得七个化合物，其中两个为氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯，另外五个为非氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯。所述化合物的结构信息见式1、表1。
式1氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯（1-2）和非氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯（3-7）的结构式
表1纯化制得的7个蟾蜍二烯内酯类化合物信息
所述化合物具体制备方法为：
蟾蜍皮95%乙（V/V）醇提取物先经制备型RPLC分离，色谱条件：色谱柱为碳十八柱（C18TDE柱）；水（A）和甲醇（B）流动相体系；洗脱梯度为0-7min,体积浓度25%→40%B;7-60min,体积浓度40%→65%B;60-65min,体积浓度65%→100%B;65-75min,100%B；流速为330mL/min；检测波长为300nm；样品溶液浓度为440mg/mL，其采用体积浓度65%甲醇-水溶解；进样体积为40mL；按各色谱峰的保留时间分别收集各馏分，共计22个组分，每个组分浓缩至干后备用；针组分F14（分离过程中F14组分对应的流动相中甲醇的体积浓度为58.3%-59.6%）采用采用Click XIon亲水固相萃取柱分成氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯类组分和非氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯类组分，通过反相色谱对两组分分别制备，共获得七个化合物，其中两个为氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯，另外五个为非氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯。选取组分F14（分离过程中F14组分对应的流动相中甲醇的体积浓度为58.3%-59.6%）采用Click XIon亲水固相萃取柱对两类化合物进行类分离，固相萃取条件：固相萃取柱为两性离子亲水固相萃取柱（ClickXIon，20g/60mL）；淋洗条件为：淋洗1：95%（V/V）乙腈-水80mL，回收溶剂得F14-F1;淋洗2：50%（V/V）乙腈-0.5%（V/V）甲酸-水80mL，回收溶剂得F14-F2。选取组分F14-F1和F14-F2,采用半制备反相色谱进行进一步分离，色谱条件：色谱柱为半制备反相色谱柱（XCharge C18,250×20mm,i.d.,5μm）；水（A）和乙腈（B）流动相体系；流速为19mL/min；检测波长为300nm；进样次数：3；进样量为2mL；按各色谱峰的保留时间分别收集各馏分，分别回收溶剂，经核磁实验确定，获得1,2,3,4,5,6,7七个化合物；
本发明基于亲水条件下，氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯类化合物和非氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯类化合物亲水性质的不同，我们采用键合两性离子基团的Click XIon亲水固相萃取柱联合半制备反相色谱柱发展了一种选择性类分离蟾蜍二烯内酯类化合物的纯化方法。流动相无缓冲盐添加，便于样品制备后处理。选取蟾蜍皮95%乙醇提取物反相色谱制备分离所得的一个馏分，采用Click Xion亲水固相萃取柱分成氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯类组分和非氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯类组分，通过反相色谱对两组分分别制备，共获得七个化合物。该方法可以实现氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯类和非氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯类化合物的类分离及高效制备，解决了两类化合物在反相柱上疏水性相似，洗脱窗口窄的问题，实现了类分离，并表现出较好的分离效果。从而提供了一种蟾蜍二烯内酯类化合物分类分离纯化的新方法，为该类化合物的抗癌活性研究和单一成分的新药开发提供物质基础和技术支撑。
附图说明
图1蟾皮提取物的高效液相制备色谱图。
具体实施方式
现结合实例，对本发明做进一步说明。实例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。
实施例：
1）蟾蜍皮95%（V/V）乙醇提取物先经制备型RPLC分离，色谱条件：色谱柱为碳十八柱（C18TDE柱）；水（A）和甲醇（B）流动相体系；洗脱梯度为0-7min,体积浓度25%→40%B;7-60min,体积浓度40%→65%B;60-65min,体积浓度65%→100%B;65-75min,100%B；流速为330mL/min；分离过程中采用紫外检测器检测，检测波长为300nm；其采用体积浓度65%甲醇-水溶解，样品溶液浓度为440mg/mL，进样体积为40mL；按各色谱峰的保留时间分别收集各馏分，共计收集22个组分，每个组分浓缩至干后备用；针对组分F14（分离过程中F14组分对应的流动相中甲醇的体积浓度为58.3%-59.6%）采用Click XIon亲水固相萃取柱对两类化合物进行类分离，固相萃取条件：固相萃取柱为两性离子亲水固相萃取柱（Click XIon，20g/60mL）；淋洗条件为：淋洗1：95%乙腈-水80mL，回收溶剂得F14-F1；淋洗2：50%（V/V）乙腈-0.5%（V/V）甲酸-水80mL，回收溶剂得F14-F2。选取组分F14-F1和F14-F2，采用半制备反相色谱进行制备，色谱柱为XCharge C18柱；以乙腈-酸水为流动相体系，采用线性梯度洗脱方式制备蟾蜍二烯内酯单体化合物1,2,3,4,5,6,7的制备：
2）选取组分F14采用半制备反相色谱进行分离纯化，选取组分F14-F1和F14-F2,采用半制备反相色谱进行进一步分离，色谱条件：色谱柱为半制备反相色谱柱（XCharge C18,250×20mm,i.d.,5μm）；水（A）和乙腈（B）流动相体系；流速为19mL/min；检测波长为300nm；洗脱梯度为0-20min,体积浓度23%→23%B;20-25min,体积浓度23%→25%B;25-30min,体积浓度25%→30%B;30-35min,30%→30%B；35-50min,体积浓度30%→40%B;50-60min,体积浓度40%→40%B;流速为19mL/min；检测波长为300nm；进样量为2mL；按各色谱峰的保留时间分别收集各馏分，分别回收溶剂，经核磁实验确定，获得1,2,3,4,5,6,7七个化合物。HPLC检测纯度大于95%，经理化测定，数据如下：化合物1，ESI-MS m/z:729.4[M+H]+;1H-NMR(600MHz,CH3OH-d4):δ,5.08(1H,s,H-3),2.50-2.54(2H br d,H-15),1.64(2H,br d,H-16),0.94(3H,s,H-18),1.22(3H,s,H-19),7.55(1H,br s H-21),7.93(1H,br d,J=9.7Hz,H-22),6.33(1H,br d,J=9.7Hz,H-23),1.78(2H,m,H-2″),2.28(2H,m,H-7′).13C NMR见表2。化合物2，ESI-MS m/z:715.4[M+H]+;1H-NMR(600MHz,CH3OH-d4):δ,5.15(1H,s H-3),1.74-2.12(2H,m,H-15),2.21(2H,br d,H-16),0.71(3H,s,H-18),0.96(3H,s,H-19),7.43(1H,br s,H-21),7.99(1H,br d,J=9.7Hz,H-22),6.28(1H,br d,J=9.7Hz,H-23),1.74-1.89(2H,m,H-2″),2.28(2H,m,H-7′).13C NMR见表2。化合物3,ESI-MS m/z:403.4[M+H]+;1H-NMR(600MHz,CH3OH-d4):δ,3.59(1H,s,H-3),1.83(2H br d,H-15),4.54(2H,br d,H-16),2.79(H,br d,H-17),0.80(3H,s,H-18),0.96(3H,s,H-19),8.17(1H,br s H-21),7.42(1H,br d,J=9.7Hz,H-22),6.21(1H,br d,J=9.7Hz,H-23).13C NMR见表2。化合物4,ESI-MS m/z:403.4[M+H]+;1H-NMR(600MHz,CH3OH-d4):δ,4.12(1H,s,H-3),1.72(2H,m,H-15),2.10(2H,m,H-16),0.74(3H,s,H-18),0.96(3H,s,H-19),7.45(1H,br s,H-21),8.05(1H,br d,J=9.6Hz,H-22),6.30(1H,br d,J=9.6Hz,H-23).13C NMR见表2。化合物5,ESI-MS m/z:401.4[M+H]+;1H-NMR(600MHz,CH3OH-d4):δ,4.05(1H,s,H-3),3.59(1H,s,H-15),4.77(1H,br d,J=9.2Hz,H-16),0.78(3H,s,H-18),0.99(3H,s,H-19),7.39(1H,br s,H-21),8.10(1H,br d,J=9.6Hz,H-22),6.20(1H,br d,J=9.6Hz,H-23).13C NMR见表2。化合物6,ESI-MS m/z:445.4[M+H]+;1H-NMR(600MHz,CH3OH-d4):δ,3.58(1H,s,H-3),1.23,1.59(2H br d,H-15),5.54(2H,br d,H-16),2.99(H,br d,H-17),0.80(3H,s,H-18),0.96(3H,s,H-19),1.87(3H,s,CH3-OAc),7.42(1H,br s H-21),8.17(1H,br d,J=9.8Hz,H-22),6.21(1H,br d,J=10.0Hz,H-23).The data of13C-NMR was shown in Table2.The1H-NMR and13C-NMR spectral data were in agreement with those of bufotalin[32-33,35].13CNMR见表2。化合物7,ESI-MS m/z:387.4[M+H]+;1H-NMR(600MHz,CH3OH-d4):δ,4.08(1H,s,H-3),2.13(2H br d,H-15),2.22(2H,br d,H-16),2.57(1H,br d,H-17),0.73(3H,s,H-18),0.99(3H,s,H19),6.30(1H,br s H-21),8.00(1H,br d,J=9.7Hz,H-22),6.30(1H,br d,J=9.7Hz,H-23).13C NMR见表2。
表2化合物1-7的13C NMR数据(150MHz，氘代甲醇)
该方法可以实现蟾蜍二烯内酯化合物的高效制备，解决了两类化合物在反相柱上疏水性相似，洗脱窗口窄的问题，实现了类分离，并表现出的较好分离效果。从而提供了一种高效分离蟾蜍二烯内酯类化合物的新方法，为该类化合物的抗癌活性研究和单一成分的新药开发提供物质基础。

Claims (8)

1.一种蟾蜍二烯内酯类化合物选择性分离的纯化方法，其特征在于：
1）蟾蜍皮乙醇提取物先经制备型RPLC分离，水（A）和甲醇（B）流动相体系；洗脱梯度为体积浓度25%→100%B（v/v）；按各色谱峰的保留时间分别收集各馏分，每个组分浓缩至干后备用；
2）针对富含蟾蜍二烯内酯的组分F14，分离过程中F14组分对应的流动相中甲醇的体积浓度为58.3%-59.6%；采用Click XIon亲水固相萃取柱对两类化合物进行类分离，固相萃取条件：亲水固相萃取柱为两性离子固相萃取柱（Click XIon，20g/60mL）；淋洗条件为：淋洗1：95%（v/v）乙腈-水或乙醇-水80mL，回收溶剂得F14-F1；淋洗2：50%（v/v）乙腈-甲酸水或乙醇-甲酸水80mL，（酸水体积浓度为0.1%-0.5%）回收溶剂得F14-F2；
3）针对F14-F1和F14-F2，采用半制备反相色谱进行进纯化制备，色谱柱为XCharge C18柱；采用乙腈-水溶液或甲醇-水溶液流动相体系，对蟾蜍二烯内酯类化合物进行选择性地分离。
2.按照权利要求1所述蟾蜍二烯内酯分离纯化方法，其特征在于：固相萃取柱为含两性离子的亲水固相萃取柱（Click XIon），采用台阶等度洗脱方式，对氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯类化合物和非氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯类化合物进行类分离。
3.按照权利要求1所述蟾蜍二烯内酯类分离方法，其特征在于：固相萃取操作参数如下：色谱柱内径为10-1000mm；采用体积浓度85%-100%乙醇-水溶解或体积浓度90%-100%甲醇-水溶解，蟾蜍皮95%乙醇提取物上样浓度为1mg/mL-1-1g/mL；上样量为1mL-400mL；流速为5-1000mL/min。
4.按照权利要求1所述蟾蜍二烯内酯分离纯化方法，其特征在于：色谱操作参数如下：色谱柱内径为4.6-100mm；采用体积浓度65%-80%甲醇-水溶解，蟾蜍皮95%乙醇提取物上样浓度为1mg/mL-1-1g/mL；进样量为1μL-40mL；流速为1-480mL/min；柱温为10-60℃。
5.按照权利要求1所述蟾蜍二烯内酯固相萃取类分离方法，其特征在于：所述洗脱溶剂流动相组成为乙腈-水或乙醇-水体系。
6.按照权利要求1所述蟾蜍二烯内酯分离纯化方法，其特征在于：所述流动相组成为乙腈-水、甲醇-水、乙醇-水。
7.按照权利要求1所述蟾蜍二烯内酯分离纯化方法，其特征在于：所述蟾蜍皮提取物为50%-95%（V/V）乙醇回流提取物。
8.按照权利要求1所述蟾蜍二烯内酯分离纯化方法，其特征在于：
1）蟾蜍皮50%-95%（V/V）乙醇提取物先经制备型RPLC分离，色谱条件：色谱柱为碳十八柱（C18TDE柱）；水（A）和甲醇（B）流动相体系；洗脱梯度为0-7min,体积浓度25%→40%B;7-60min,体积浓度40%→65%B;60-65min,体积浓度65%→100%B;65-75min,100%B；流速为330mL/min；检测波长为300nm；其采用体积浓度65%甲醇-水溶解，样品溶液浓度为440mg/mL，其采用体积浓度65%甲醇-水溶解；进样体积为40mL；按各色谱峰的保留时间分别收集各馏分，共计22个组分，每个组分浓缩至干后备用；针对组分F14(分离过程中F14组分对应的流动相中甲醇的体积浓度为58.3%-59.6%)，采用含两性离子的Click XIon亲水固相萃取柱台阶等度洗脱方式实现了蟾蜍二烯内酯类化合物的类分离，通过半制备反相色谱进行进纯化制备，色谱柱为XCharge C18柱；采用乙腈-水流动相体系，采用线性梯度洗脱方式制备蟾蜍二烯内酯单体化合物；
2）选取组分F14采用Click XIon亲水固相萃取柱对两类化合物进行类分离，固相萃取条件：亲水固相萃取柱为两性离子固相萃取柱（Click XIon，20g/60mL）；淋洗条件为：淋洗1：95%（V/V）乙腈-水或95%（V/V）乙醇-水80mL，回收溶剂得F14-F1;淋洗2：50%（v/v）乙腈-甲酸水或乙醇-甲酸水（酸水体积浓度为0.1%-0.5%）80mL，回收溶剂得F14-F2；
3）选取组分F14-F1和F14-F2,采用半制备反相色谱进行进一步分离，色谱条件：色谱柱为半制备反相色谱柱（XCharge C18,250×20mm,i.d.,5μm）；水（A）和乙腈（B）流动相体系；流速为19mL/min；检测波长为300nm；进样次数：3；进样量为2mL；按各色谱峰的保留时间分别收集各馏分，分别回收溶剂，经核磁实验确定，获得1-7七个化合物；
通过反相色谱制备获得两类八个高纯度蟾蜍二烯内酯化合物；所述两类化合物分别为两个氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯类化合物：化合物1为沙蟾毒精-3-庚二酰精氨酸酯，化合物2为远华蟾毒精-3-己二酰精氨酸酯，五个非氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯：化合物3为远华蟾毒精，化合物4为乙酰华蟾毒精,化合物5为乙酰华蟾毒精，化合物6为蟾蜍它灵，化合物7为蟾蜍灵。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101177445A (zh) * 2006-11-08 2008-05-14 山东绿叶制药有限公司 新的蟾蜍二烯内酯类化合物及其制备方法与应用
CN102101879A (zh) * 2009-12-16 2011-06-22 中国科学院大连化学物理研究所 一种沙蟾毒精空间异构体化合物及其制备和应用

Patent Citations (2)

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