CN102101879A - 一种沙蟾毒精空间异构体化合物及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种沙蟾毒精空间异构体化合物及其制备和应用，通过大孔树脂和二维制备色谱分离技术从传统中药蟾皮中制备沙蟾毒精空间异构体化合物，其主要制备步骤为将蟾皮剪碎，乙醇提取，总提物经大孔树脂分离得蟾蜍二烯内酯提取物，再经过二维制备色谱分离纯化得到该化合物。经体外实验证明其具有较好的抑制肿瘤细胞的作用。
Description
技术领域
本发明涉及二烯内酯类化合物，具体地说是一种沙蟾毒精空间异构体新化合物及其制备方法，其是一种通过大孔树脂处理和二维制备色谱分离技术从传统中药蟾皮中制备分离出来的新化合物。
背景技术
蟾蜍是中医临床应用较早的药物，在我国已有上千年的临床应用历史。其药用部位为：皮、蟾酥、干燥全体。蟾皮有清热解毒、利水消胀之功效，辛、凉、微毒，主治痈疽、肿毒，我国民间多用来治疗原发性肝癌、肺癌等，具有较好的临床效果(代丽萍等.药学学报，2007，42(8)：858-861)。
二烯内酯类化合物是蟾皮中的主要的活性成分，现代药理学研究表明其具有强心、抗菌、抗肿瘤等作用(贾彩云等.中草药，2005，36(2)：244；Enomoto A，et al.J Nat Prod，2004，67(12)：2070；Cunha Filho GA，et al.Toxicon，2005，45(6)：777；Usanova IV，et al.Eksp Klin Farmakol，2002，65(4)：23)。
目前报道的该类化合物有250多种，但空间异构体的报道极少。然而空间异构体，尤其是手性异构体在生物活性上可能有较大差异，是制药领域的研究热点之一。
发明内容
鉴于此，本发明人经过深入研究，从中华大蟾蜍干燥皮中提取分离得到一种沙蟾毒精空间异构体新化合物，经体外实验证明其具有较好的抑制肿瘤细胞的作用。
本发明提供了一种沙蟾毒精空间异构体新化合物，所述化合物具有如下所示五种结构式之一，
化合物II，
本发明提供了蟾蜍二烯内酯提取物的提取方法：蟾皮用乙醇提取，回收乙醇后浓缩液上大孔树脂，先用水及低浓度乙醇洗脱，再用高浓度乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂即得蟾蜍二烯内酯类提取物，蟾蜍二烯内酯提取物中蟾蜍二烯内酯的重量百分含量为60％～90％。
其中所说的低浓度乙醇是指5％～50％的乙醇，高浓度乙醇是指70％～100％的乙醇。
其中所说的大孔树脂可以选择非极性或极性大孔树脂，所说的非极性大孔树脂可以选择AB-8，D-101，XAD-4，X-5，HPD-100；所说的极性大孔树脂可以选择HPD-400，S-8，NAK-9。
本发明还提供了蟾蜍二烯内酯类化合物的制备方法：取蟾蜍二烯内酯提取物，采用二维HPLC制备色谱纯化后可获得高纯度单体，第一维采用反相色谱柱，第二维采用环糊精色谱柱。
所述化合物具体制备方法为：
1)取的蟾蜍二烯内酯提取物，经制备型HPLC分离，色谱条件为：反相Xterra C18色谱柱，A：0.1％(v/v)甲酸水；B：0.1％(v/v)甲酸乙腈，梯度洗脱：5％B～95％B，60min；分离过程中采用紫外检测器检测，检测波长300nm；按检测过程中不同样品峰的保留时间分别收集各馏分；共收集20个馏分；
2)取Fraction 8回收溶剂，经HPLC分离，色谱条件为：环糊精色谱柱，A：水；B：乙腈，梯度洗脱：5％B～30％B，55min，收集各个色谱峰，分别回收溶剂，经核磁实验确定，获得含化合物I的馏分；
取Fraction 11回收溶剂，经HPLC分离，色谱条件为：环糊精色谱柱，A：正己烷；B：异丙醇，等度洗脱：25％B，30min，收集各个色谱峰，分别回收溶剂，经核磁实验确定，获得含化合物II的馏分；
取Fraction 12回收溶剂，经HPLC分离，色谱条件为：环糊精色谱柱，A：正己烷；B：异丙醇，梯度洗脱：5％B～30％B，55min，收集各个色谱峰，分别回收溶剂，经核磁实验确定，获得含化合物III的馏分；
取Fraction 14回收溶剂，经HPLC分离，色谱条件为：环糊精色谱柱，A：0.1％(v/v)甲酸水；B：0.1％(v/v)甲酸乙腈，梯度洗脱：95％B～60％B，40min，收集各个色谱峰，分别回收溶剂，经核磁实验确定，获得含化合物IV的馏分；
取Fraction 17回收溶剂，经HPLC分离，色谱条件为：环糊精色谱柱，A：水；B：甲醇，梯度洗脱：5％B～50％B，35min，收集各个色谱峰，分别回收溶剂，经核磁实验确定，获得含化合物V的馏分。
所述的化合物可在制备治疗和预防实体瘤的药物中的应用，如：宫颈癌、乳腺癌等。
本发明提供了一种通过大孔树脂和二维制备色谱分离技术从传统中药蟾皮中制备沙蟾毒精空间异构体新化合物的方法。经体外实验证明其具有较好的抑制肿瘤细胞的作用。
具体实施方案
现结合实例，对本发明做进一步说明。实例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。
实施例1：蟾蜍二烯内酯提取物的制备
取蟾皮10Kg用95％乙醇提取3次，用醇量为10倍，每次提取时间为120分钟，合并滤液，滤液减压浓缩至10L，上大孔树脂，先用水洗脱，再用5％～50％乙醇洗脱，再用70％～100％的乙醇洗脱，收集后者，减压回收溶剂，干燥得到蟾蜍二烯内酯提取物125g。
实施例2：蟾蜍二烯内酯馏分制备
取实施例1所得到的蟾蜍二烯内酯提取物，经制备型HPLC分离(XterraC18，A：0.1％(v/v)甲酸水；B：0.1％(v/v)甲酸乙腈，梯度条件：5％B～95％B，60min；)，分离过程中采用紫外检测器检测，检测波长300nm。按检测过程中不同样品峰的保留时间分别收集各馏分；共收集20个馏分(Fraction1～20)。
实施例3：化合物I的制备
Fraction 8回收溶剂，经HPLC分离(环糊精色谱柱，A：水；B：乙腈，梯度条件：5％B～30％B，55min)，收集其中主要的色谱峰，分别回收溶剂，经核磁实验确定，获得含化合物I(峰5)的馏分4mg，HPLC检测含量为98％，经理化测定，数据如下：白色粉末，HR-MS，[M+H]+(m/z)：417.2273，UV：298nm，1HNMR(CD3OD，400MHz)δ：7.81(1H，dd，J＝9.6，2.4)，7.42(1H，d，J＝1.6)，6.21(1H，d，J＝9.2)，4.26(1H，d，J＝11.6)，4.04(1H，dd，J＝13.6，7.6)，2.65(1H，td，J＝14，3.2)，1.06(1H，s)，0.81(1H，s)等；13CNMR(CD3OD，100MHz)δ：213.4，163.0，150.2，147.7，121.7，114.5，84.7，73.7，71.0，62.3，43.5，40.6，39.5，37.1，36.0，35.9，31.8，30.5，27.7，26.8，22.0，21.5，16.7。
实施例4：化合物II的制备
Fraction 11回收溶剂，经HPLC分离(环糊精色谱柱，A：正己烷；B：异丙醇，等度条件：25％B，30min)，收集其中主要的色谱峰，分别回收溶剂，经核磁实验确定，获得含化合物II(峰6)的馏分2mg，HPLC检测含量为96％，经理化测定，数据如下：白色粉末，HR-MS，[M+H]+(m/z)：417.2295，UV：298nm，1HNMR(CD3OD，400MHz)δ：8.24(1H，dd，J＝10，2.1)，7.81(1H，d，J＝1.8)，6.54(1H，d，J＝9.9)，4.44(1H，d，J＝12.3)，3.85(1H，dd，J＝13.6，8.1)，2.77(1H，td，J＝13.7，2.8)，0.98(1H，s)，0.67(1H，s)等；13CNMR(CD3OD，100MHz)δ：211.5，165.3，152.5，149.5，123.4，117.8，86.7，75.7，73.5，64.5，47.5，40.9，41.5，36.7，36.0，34.5，33.4，32.7，29.4，28.5，27.1，21.2，18.6。
实施例5：化合物III的制备
Fraction 12回收溶剂，经HPLC分离(环糊精色谱柱，A：正己烷；B：异丙醇，梯度条件：5％B～30％B，55min)，收集其中主要的色谱峰，分别回收溶剂，经核磁实验确定，获得含化合物III(峰1)的馏分2mg，HPLC检测含量为99％，经理化测定，数据如下：白色粉末，HR-MS，[M+H]+(m/z)：417.2264，UV：298nm，1HNMR(CD3OD，400MHz)δ：7.98(1H，dd，J＝9.2，2.6)，7.35(1H，d，J＝1.5)，6.57(1H，d，J＝9.3)，5.93(1H，d，J＝11.8)，4.13(1H，dd，J＝13.8，7.6)，2.90(1H，td，J＝13.9，3.4)，1.32(1H，s)，0.69(1H，s)等；13CNMR(CD3OD，100MHz)δ：209.2，165.3，154.2，148.3，124.3，117.8，85.3，79.4，75.1，67.9，42.5，44.5，39.8，35.2，359，35.9，33.4，31.6，28.4，27.3，20.6，18.5，17.3。
实施例6：化合物IV的制备
Fraction 14回收溶剂，经HPLC分离(环糊精色谱柱，A：0.1％(v/v)甲酸水；B：0.1％(v/v)甲酸乙腈，梯度条件：95％B～60％B，40min)，收集其中主要的色谱峰，分别回收溶剂，经核磁实验确定，获得含化合物IV(峰4)的馏分2mg，HPLC检测含量为98％，经理化测定，数据如下：白色粉末，HR-MS，[M+H]+(m/z)：417.2273，UV：300nm，1HNMR(CD3OD，400MHz)δ：7.98(1H，dd，J＝9.2，2.6)，7.35(1H，d，J＝1.5)，6.57(1H，d，J＝9.3)，5.93(1H，m)，4.13(1H，dd，J＝13.8，7.6)，2.90(1H，m)，1.32(1H，s)，0.69(1H，s)等；13CNMR(CD3OD，100MHz)δ：210.2，165.3，154.2，148.3，124.3，117.8，85.3，79.4，75.1，73.2，42.5，44.5，39.8，35.2，359，35.9，33.4，31.6，30.2，27.3，20.6，18.5，15.9。
实施例7：化合物V的制备
Fraction 17回收溶剂，经HPLC分离(自主合成的色谱柱，A：水；B：甲醇，梯度条件：5％B～50％B，35min)，收集其中主要的色谱峰，分别回收溶剂，经核磁实验确定，获得含化合物V的(峰1)馏分5mg，HPLC检测含量为99％，经理化测定，数据如下：白色粉末，HR-MS，[M+H]+(m/z)：417.2265，UV：299nm，1HNMR(CD3OD，400MHz)δ：8.01(1H，dd，J＝9.6，2.3)，7.35(1H，d，J＝1.5)，6.57(1H，d，J＝9.5)，5.93(1H，d，J＝11.8)，4.32(1H，dd，J＝13.9，7.8)，2.90(1H，d，J＝3.6)，1.32(1H，s)，0.81(1H，s)等；13CNMR(CD3OD，100MHz)δ：212.6，168.4，154.2，148.3，124.3，117.8，85.3，79.4，75.1，67.9，42.5，46.6，39.8，35.2，359，35.9，33.4，31.6，28.4，27.3，21.9，19.3，16.9。
实施例8：沙蟾毒精空间异构体新化合物I～V对HeLa细胞和MCF细胞毒活性
材料：宫颈癌HeLa细胞和人乳腺癌MCF购自中国第二军医大学
实施例3～7得到的化合物I～V
华蟾素注射液：安徽金蟾生化股份有限公司
分别以宫颈癌HeLa细胞和人乳腺癌MCF为细胞模型，初筛了化合物I～V。实验设计如下：
分别将对数生长期HeLa和MCF细胞以10％小牛血清RPMI1640培养基调整至5×104个/ml，分设对照组、华蟾素注射液组和实验组，每组3个复孔，每孔104个，接于96孔板中，置于37℃、含5％CO2的培养箱中，待24h贴壁后，换10％小牛血清RPMI-1640培养基；实验组分别加入含4×10-4mg/ml各化合物(化合物I～V)的甲醇溶液(折合干蟾皮浓度为6×10-3g/ml)，华蟾素注射液组加入相同折合浓度的华蟾素注射液，对照组加入相同量的甲醇溶液。48h后取出，生理盐水洗一次细胞后，结晶紫染色半小时，洗去结晶紫，并用100μl的甲醇溶解，用酶标仪测定490nm的吸收值。细胞死亡率％＝(A490对照-A490样品)/A490对照×100％，结果见表1。
表1化合物I～III对HeLa和MCF细胞死亡率(％)
由表中数据可知，化合物I～V对HeLa和MCF细胞死亡率明显高于相同干蟾皮浓度下的华蟾素注射液。
Claims (7)
1.一种沙蟾毒精空间异构体化合物，其特征在于：所述化合物具有如下所示五种结构式之一，
2.一种权利要求1所述化合物的制备方法，其特征在于：
1)取的蟾蜍二烯内酯提取物，经制备型HPLC分离，色谱条件为：反相Xterra C18色谱柱，A：0.1％(v/v)甲酸水；B：0.1％(v/v)甲酸乙腈，梯度洗脱：5％B～95％B，60min；分离过程中采用紫外检测器检测，检测波长300nm；按检测过程中不同样品峰的保留时间分别收集各馏分；共收集20个馏分；
2)取Fraction 8回收溶剂，经HPLC分离，色谱条件为：环糊精色谱柱，A：水；B：乙腈，梯度洗脱：5％B～30％B，55min，收集各个色谱峰，分别回收溶剂，经核磁实验确定，获得含化合物I的馏分；
取Fraction 11回收溶剂，经HPLC分离，色谱条件为：环糊精色谱柱，A：正己烷；B：异丙醇，等度洗脱：25％B，30min，收集各个色谱峰，分别回收溶剂，经核磁实验确定，获得含化合物II的馏分；
取Fraction 12回收溶剂，经HPLC分离，色谱条件为：环糊精色谱柱，A：正己烷；B：异丙醇，梯度洗脱：5％B～30％B，55min，收集各个色谱峰，分别回收溶剂，经核磁实验确定，获得含化合物III的馏分；
取Fraction 14回收溶剂，经HPLC分离，色谱条件为：环糊精色谱柱，A：0.1％(v/v)甲酸水；B：0.1％(v/v)甲酸乙腈，梯度洗脱：95％B～60％B，40min，收集各个色谱峰，分别回收溶剂，经核磁实验确定，获得含化合物IV的馏分；
取Fraction 17回收溶剂，经HPLC分离，色谱条件为：环糊精色谱柱，A：水；B：甲醇，梯度洗脱：5％B～50％B，35min，收集各个色谱峰，分别回收溶剂，经核磁实验确定，获得含化合物V的馏分。
3.根据权利要求2的制备方法，其特征在于：
所述蟾蜍二烯内酯提取物的制备过程为：蟾皮用乙醇提取，回收乙醇后浓缩液上大孔树脂，先用水及低浓度乙醇洗脱，再用高浓度乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂即得蟾蜍二烯内酯类提取物。
4.根据权利要求3的制备方法，其特征在于：低浓度乙醇是指10％～50％的乙醇，高浓度乙醇是指70％～100％的乙醇。
5.根据权利要求3的制备方法，其特征在于：所述蟾蜍二烯内酯提取物中蟾蜍二烯内酯的重量百分含量为60％～90％。
6.一种权利要求1所述的化合物在制备治疗和预防实体瘤的药物中的应用。
7.按照权利要求6所述的化合物在制备中的应用，其特征在于：所述治疗和预防实体瘤的药物为治疗和预防宫颈癌及乳腺癌的药物。
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20130109 Termination date: 20161216 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |