CN111499678A

CN111499678A - 一种中药委陵菜五环三萜类单体的制备及其应用

Info

Publication number: CN111499678A
Application number: CN201911233461.2A
Authority: CN
Inventors: 韦锦斌; 林兴; 冯钟文; 庞丽君; 陈思韵; 黄瑀莘; 李文凯
Original assignee: Guangxi Medical University
Current assignee: Guangxi Medical University
Priority date: 2019-12-05
Filing date: 2019-12-05
Publication date: 2020-08-07

Abstract

本发明公开了一种中药委陵菜五环三萜类单体的制备及其应用。通过运用先进的植化提取、分离方法，从中药委陵菜中分离出五环三萜类单体积雪草酸，并证明其可有效减轻肝脏病理损伤、抑制脂质沉积、抗炎、抗脂质过氧化，对非酒精性脂肪肝具有明显的保护作用，能缓解非酒精性脂肪肝治疗效果较差的问题，为非酒精性脂肪肝治疗提供化学结构明确、高效的新型化合物。

Description

一种中药委陵菜五环三萜类单体的制备及其应用

技术领域

本发明涉及一种药物的制备方法及应用，具体来说，涉及委陵菜五环三萜类单体积雪草酸的提取、分离方法；积雪草酸的降脂、抗氧化应激和脂质过氧化及对非酒精性脂肪肝的保护作用。

背景技术

积雪草酸存在于多种植物中，如伞形科植物积雪草 (Centella asiatca)，唇形科植物夏枯草 (Prunella vulgaris)，印度猫薄荷 (Nepeta hindostana)，桃金娘科桉属植物自旋桉 (Eucalyptus perriniana)，蔷薇科委陵属植物委陵菜（Potentilla chinensis Ser.）等。现代研究表明，积雪草酸具有抗炎护肤、保肝护肺、抗抑郁、降血糖、降血脂、神经保护、抗肿瘤等作用。

中药委陵菜（Potentilla chinensis Ser.）是我国的一种传统中草药，为蔷薇科委陵属植物，是广西壮族地区抗肝脏疾病习用草药，用于治疗免疫系统疾病和肝脏疾病。本发明人对委陵菜进行了大量的药学、药效学研究，发现委陵菜五环三萜类单体积雪草酸对高脂饲料（High Fat Diet）诱导的大鼠非酒精性脂肪肝具有明显的保护作用。进一步研究发现，积雪草酸能改善肝脏病理学改变；减少脂滴形成；改善血脂水平及肝损伤；增强超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和谷胱甘肽还原酶（GSH-Rd）的活性及减少丙二醛（MDA）和髓过氧化氢酶（MPO）的水平；其机制可能与减轻内质网应急有关。

发明内容

本发明是对中药委陵菜的深度开发，通过中药现代化的思维模式，以药理活性为靶点，运用先进的提取、分离技术获得委陵菜五环三萜类单体积雪草酸，并进一步明确其作用机制，为非酒精性脂肪肝治疗提供了化学结构明确、高效的新型化合物。

本发明采取的技术方案如下：

1、中药委陵菜五环三萜类单体积雪草酸的制备方法，是按照以下步骤制备而得：

提取方法：将干燥的委陵菜粉碎后，用75%乙醇加热回流提取3 次，合并3次乙醇提取液，回收乙醇，得到乙醇提取物；将粗提液与氢氧化钠溶液混合，混合后溶液的pH值为7.5-8.5；将粗提液进大孔树脂柱，先水洗至无色，再分别用20-25％乙醇溶液和50-75％乙醇溶液洗柱，收集50-75％乙醇洗脱液，得到醇提物，再进行浓缩干燥得到浸提膏；将浸提膏溶于3-5倍体积45-55℃的水中，再加入乙酸乙酯作为溶剂进行萃取1-3次，合并萃取液，浓缩至1.02-1.05g/ml；将萃取液过硅胶柱，先用30-35％乙醇溶液洗柱，再用60-75％乙醇溶液洗柱，收集60-75％乙醇洗脱液，加入3-5％活性炭脱色，将积雪草酸洗脱液回收乙醇，干燥，得到积雪草酸。

2、所述的积雪草酸是应用于治疗高脂饮食引起的慢性肝损伤。

3、所述的积雪草酸是应用于治疗高脂饮食引起的肝脏炎症。

4、所述的积雪草酸是应用于治疗高脂饮食引起的非酒精性脂肪肝。

本发明的优点和积极效果：

本发明通过运用先进的植化提取、分离方法，从中药委陵菜中分离出五环三萜类单体积雪草酸，有效的避免了常规萃取法生产积雪草酸活性物质高耗能、重污染的缺点，经过该工艺制备的积雪草酸纯度达91.3%，收率为54.8%，为高效地生产制备积雪草酸三萜化合物，合成新的积雪草酸或者羟基积雪草酸衍生物提供了基础。

委陵菜五环三萜类单体能够显著改善肝细胞脂滴形成，可有效减轻肝脏病理损伤、抑制脂质沉积、抗炎、抗脂质过氧化，对非酒精性脂肪肝具有明显的保护作用，能缓解非酒精性脂肪肝治疗效果较差的问题，为非酒精性脂肪肝治疗提供化学结构明确、高效的新型化合物。

具体实施方式

一、委陵菜五环三萜类单体积雪草酸的制备

提取分离方法：将干燥的委陵菜10 kg粉碎后，用80L的75%乙醇加热回流回流提取3次，合并3次乙醇提取液，回收乙醇，得到乙醇提取物；将粗提液与氢氧化钠溶液混合，混合后溶液的pH值为7.5-8.5；将粗提液进大孔树脂柱，先水洗至无色，再分别用20-25％乙醇溶液和50-75％乙醇溶液洗柱，收集50-75％乙醇洗脱液，得到醇提物，再进行浓缩干燥得到浸提膏；将浸提膏溶于3-5倍体积45-55℃的水中，再加入乙酸乙酯630ml作为溶剂进行萃取1-3次，合并萃取液，浓缩至1.02-1.05g/ml；将萃取液过硅胶柱，先用30-35％乙醇溶液洗柱，再用60-75％乙醇溶液洗柱，收集60-75％乙醇洗脱液，加入3-5％活性炭脱色，将积雪草酸洗脱液回收乙醇，干燥，得到26.8mg积雪草酸。

二、委陵菜五环三萜类单体积雪草酸对非酒精性脂肪肝的保护作用

1. 动物模型的制备、分组及处理

80只雄性SD大鼠分为2组：I 组（28只）和 II 组（52只），I 组大鼠给予基础饲料喂养，II 组大鼠则采用高脂饲料喂养制备NAFLD模型，共 8 周。第8周末随机挑选 I 组和 II 组大鼠进行肝脏病理检查，确定造模成功后，将 I 组大鼠随机分为2 组，即正常对照组和委陵菜积雪草酸对照组（AAPC对照组）；II 组则设为模型组；水飞蓟宾阳性对照组（Silibinin组）；委陵菜积雪草酸低、高剂量组（AAPC低、高剂量组）。在实验期间，除了每天继续给予高脂饲料喂养外，阳性对照组灌胃给予 Silibinin 26.25 mg/kg/d，AAPC 低、高剂量组分别灌胃给予AAPC 4、8 mg/kg/d，AAPC对照组灌胃给予AAPC 8 mg/kg/d，正常对照组及模型组则灌胃给予等量生理盐水。给药干预10周后，各组大鼠腹主动脉取血，并取出肝组织备用。

2. 检测指标

①肝组织病理学观察；

②检测血清TG、TC、LDL和HDL水平；

③检测血清ALT、AST、ALB和GLB水平；

④检测肝组织SOD、GSH-Px、GSH-Rd和MDA水平；

⑤检测肝组织IL-6和TNF-α水平；

⑥检测内质网应激蛋白水平。

3. 实验结果

（1）积雪草酸显著减轻肝脏病理学改变

H&E染色结果显示，正常组大鼠肝细胞未见明显脂肪变性，肝小叶结构清晰完整，肝细胞索排列整齐，肝细胞未见炎细胞浸润和病理性改变；模型组大鼠发现肝细胞脂肪变性严重，且肝细胞排列紊乱，同时观察到汇管区炎性细胞、坏死细胞增多，肝细胞呈明显空泡、气球样变； AAPC低、高剂量组可观察到肝组织病理损伤有明显减轻。

油红O 染色结果显示，正常组与AAPC对照组见少量脂滴形成，模型组大鼠肝细胞内出现大量红色脂滴，脂质含量显著高于正常对照组。与模型组比较，给予药物干预后，Silibinin组与AAPC 低、高剂量组肝细胞内脂滴形成明显减少，脂质含量显著降低。

（2）积雪草酸显著降低血清TC、TG和LDL水平，升高HDL水平

与正常对照组相比，模型组大鼠血清TC、TG和LDL水平均显著升高（p<0.01），经药物Silibinin和AAPC干预后，血清中TC、TG和LDL水平均显著降低（p<0.01）；模型组大鼠血清HDL含量显著低于正常对照组，给予药物干预后，Silibinin组和AAPC组HDL水平显著升高（p<0.01）。结果见表 1。

（3）积雪草酸明显降低血清ALT、AST和A/G活性

模型组大鼠血清AST、ALT和A/G水平均显著高于正常对照组（ p<0.05或 p<0.01），而给予Silibinin和AAPC药物干预后，血清中的AST、ALT和A/G水平显著降低（p<0.05或 p<0.01）。结果见表2。

（4）积雪草酸显著降低肝组织SOD、GSH-Px、GSH-Rd和MDA水平

模型组大鼠肝组织SOD、GSH-Rd和GSH-Px水平显著低于正常组，MDA水平显著高于正常对照组，给予药物AAPC干预后，大鼠肝组织 SOD、GSH-Rd和GSH-Px水平显著升高，而MDA水平显著降低（p<0.05 或 p<0.01）。结果见表3，表4。

（5）积雪草酸显著降低肝组织炎症因子TNF-α和IL-6释放

模型组大鼠肝组织IL-6和TNF-α含量均高于正常对照组大鼠，经药物干预后，AAPC低、高剂量均能显著降低肝组织中IL-6和TNF-α的含量（p<0.01）。结果见表 5。

（6）积雪草酸显著降低肝组织GRP78蛋白的表达

实验结果显示，与正常对照组比较，模型组大鼠肝组织中GRP78的蛋白表达水平显著升高（p<0.01），经药物干预后，AAPC 低、高剂量均能显著下调肝组织GRP78蛋白的表达（p<0.05或 p<0.01）。结果见表 6。

4. 结论

委陵菜五环三萜类单体能够显著改善肝细胞脂滴形成，对非酒精性脂肪肝具有明显的保护作用，其机制与抗炎、抗氧化应激和脂质过氧化及下调内质网应激相关蛋白表达有关。

Claims

1.一种中药委陵菜五环三萜类单体积雪草酸的制备方法，其特征是按照以下步骤制备而得：

将干燥的委陵菜粉碎后，用75%乙醇加热回流提取3 次，合并3次乙醇提取液，回收乙醇，得到乙醇提取物；将粗提液与氢氧化钠溶液混合，混合后溶液的pH值为7.5-8.5；将粗提液进大孔树脂柱，先水洗至无色，再分别用20-25％乙醇溶液和50-75％乙醇溶液洗柱，收集50-75％乙醇洗脱液，得到醇提物，再进行浓缩干燥得到浸提膏；将浸提膏溶于3-5倍体积45-55℃的水中，再加入乙酸乙酯作为溶剂进行萃取1-3次，合并萃取液，浓缩至1.02-1.05g/ml；将萃取液过硅胶柱，先用30-35％乙醇溶液洗柱，再用60-75％乙醇溶液洗柱，收集60-75％乙醇洗脱液，加入3-5％活性炭脱色，将积雪草酸洗脱液回收乙醇，干燥，得到积雪草酸。

2.所述的积雪草酸是应用于治疗高脂饮食引起的慢性肝损伤。

3.所述的积雪草酸是应用于治疗高脂饮食引起的肝脏炎症。

4.所述的积雪草酸是应用于治疗高脂饮食引起的非酒精性脂肪肝。