CN101991578A - 积雪草酸与羟基积雪草酸在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

从积雪草(Centella asiatica(L.)Urban)中提取制备了积雪草酸(asiatic acid)与羟基积雪草酸(madecassic acid)，经药理实验证明具有抑制α-葡萄糖苷酶活性。本发明公开了积雪草酸与羟基积雪草酸在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂药物中的新用途，在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂药物中可以是积雪草酸与羟基积雪草酸，也可以是含积雪草酸与羟基积雪草酸的组合物。同时也公开了积雪草酸与羟基积雪草酸新的制备方法。

Description

积雪草酸与羟基积雪草酸在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂的药物中的应用

技术领域

本发明涉及中药提取积雪草酸与羟基积雪草酸的方法，经药理实验证明具有新的医药用途。具体的说是积雪草酸与羟基积雪草酸作为α-葡萄糖苷酶抑制剂在制备降血糖药物中的应用。属于医药技术领域。

背景技术

糖尿病是一组由遗传和环境因素相互作用而引起的临床综合征，系因胰岛素分泌绝对或相对不足及靶组织对胰岛素敏感性降低，引起机体糖、脂肪、蛋白质、水和电解质等一系列代谢紊乱，临床以高血糖为主要共同标志。久病可引起多系统损害，病情严重或应激时可发生急性代谢紊乱如酮症酸中毒等。α-葡萄糖苷酶抑制剂是通过竞争性抑制α-葡萄糖苷酶的活性，可阻滞双糖水解为单糖，延缓糖的吸收，使血糖平稳并缓慢的维持在一定的水平，防治餐后高血糖症，同时还可以提高糖耐量，预防和治疗肥胖症，高三酰甘油血症，用于治疗因碳水化合物紊乱而引起的疾病。实验研究表明阿卡波糖治疗糖尿病动物模型的慢性并发症有效，通过降低餐后血糖浓度而减少蛋白糖基化，延迟或阻止肾、视网膜神经病变发生以及缺血性心肌病的发展。文献报道主要α-葡萄糖苷酶抑制剂有多糖、生物碱、苷类、多肽、糖苷类、黄酮类、皂苷和酚类等。

积雪草酸与羟基积雪草酸是从伞形科Umbelliferae植物积雪草Centella asiatica(L.)Urban的干燥全草或带根全草提取纯化水解分离而得。积雪草性寒，味苦、辛，具有清热利湿、解毒消肿之功效。我国民间常用于治疗感冒、扁桃腺炎、传染性肝炎、痢疾、跌打损伤、疔疮肿毒、流行性脑脊髓膜炎等。并且傣族民间积雪草用于食疗治疗很多疾病。积雪草主要成分为积雪草苷和羟基积雪草苷。另外含有黄酮类、挥发油类、多炔烯炔类等，还含有少量积雪草酸与羟基积雪草酸(赵宇新等报道积雪草研究进展，中国中医药信息杂志，2002年8月第9卷第8期，81-84)。资料表明积雪草酸与羟基积雪草酸是积雪草苷与羟基积雪草苷在胃肠道内代谢的活性形式，给药时直接使用积雪草酸与羟基积雪草酸来代替积雪草苷与羟基积雪草苷，则无须经过胃肠道细菌的代谢，使活性作用更直接，从而克服用皂苷给药剂量不好控制的难题。植物中游离的积雪草酸与羟基积雪草酸的含量较低，从积雪草中直接获得的三萜酸的量相对较少，而积雪草中皂苷的含量远高于三萜酸，所以我们从积雪草中提取总皂苷，然后经过水解得总三萜酸，经过分离得积雪草酸与羟基积雪草酸。

国外专利公开了积雪草酸及衍生物有治疗创伤、皮肤溃疡、抗癌、保肝、痴呆和知识别紊乱的作用(WO96/17819、WO98/23575、WO98/23278、WO98/23574、WO98/37899)。国内专利公开了积雪草酸及衍生物有治疗皮肤创伤、抗抑郁、抗阿尔茨海默病以及保肝、保护心脑血管和诱导肿瘤细胞调亡等多种作用(CN1238692、CN1248918、CN1543964及CN1582946)。积雪草酸还有治疗肝纤维化、肺纤维化作用(专利申请号：200610122561.4、200610118041.6)。

我们在α-葡萄糖苷酶抑制药物筛选过程中出人意料地发现积雪草酸与羟基积雪草酸具有很强的抑制α-葡萄糖苷酶的作用。在本专利申请之前还未有文献报道积雪草酸与羟基积雪草酸具有抑制α-葡萄糖苷酶的作用。也未发现积雪草酸与羟基积雪草酸在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂的药物中的应用的报道。

以往制备积雪草酸与羟基积雪草酸是从植物中分离积雪草苷与羟基积雪草苷单一成分然后在进行水解纯化得到单一成分积雪草酸与羟基积雪草酸；另种方法就是直接从积雪草中提取，经过繁琐的萃取、层次等分离过程而获得，较为费时费力，而且消耗大量的溶剂，并且收率低。为克服以上技术方面的不足，我们先制备总的三萜酸，然后分离单一成分积雪草酸与羟基积雪草酸，本发明的特点在于我们提取分离总皂苷，利用积雪草中的苷元大部分为五环三萜酸的特点，用含水乙醇提取时加氧化钙，既提高了积雪草苷的溶解度又除去了大量杂质，水解后再进行纯化分离，可以得到总的三萜酸及单一成分。收率大大提高。具体操作为：积雪草用乙醇或甲醇提取后，提取液不经过浓缩直接通过大孔树脂柱，操作简单，并且解决了浓缩后有效成分部分析出，溶液浑浊不利于上柱、有效成分流失的问题。浓缩液不经过干燥直接水解成积雪草三萜酸，还可以节省时间。制备积雪草酸与羟基积雪草酸时利用常压或中低压0DS柱层析，可跟据需要设计柱的规格，可大量制备高纯度积雪草酸与羟基积雪草酸，分离柱具有可反复使用，易操作、成本低，纯度高的特点。整个生产过程没有使用大量有害有机试剂，操作简单、成本低，纯度高的特点。积雪草酸与羟基积雪草酸含量均在95％以上，特别适合产业化大量生产，与以往公开的技术相比具有明显的区别和技术进步。

我们通过对积雪草酸与羟基积雪草酸的进一步研究证明，积雪草酸与羟基积雪草酸具有α-葡萄糖苷酶抑制剂的活性。

本发明完成前未发现有关积雪草酸与羟基积雪草酸作为α-糖苷酶抑制剂、在预防和治疗降血糖方面应用的报道。本发明具有良好的应用前景。

积雪草酸(asiatic acid)的结构式：

羟基积雪草酸(madecassic acid)结构式：

发明内容

本发明的目的之一是提供了积雪草酸与羟基积雪草酸具有抑制α-糖苷酶的活性。具体的说是积雪草酸与羟基积雪草酸用于制备防治高血糖药物的新用途。发明人经动物试验，积雪草酸与羟基积雪草酸具有显著抑制α-糖苷酶的活性；能延缓正常小鼠餐后血糖升高、能延缓四氧嘧啶诱导的高血糖小鼠餐后血糖升高；降低四氧嘧啶高血糖小鼠的血糖。在本发明申请前未见积雪草酸与羟基积雪草酸作为α-糖苷酶抑制剂、在制备预防和治疗降血糖药物的应用及报道。

本发明的另一个目的是公开了积雪草酸与羟基积雪草酸新的制备方法，本发明利用积雪草苷元五环三萜酸的特点，用含水乙醇提取时加氧化钙，既提高了积雪草苷的溶解度又除去了大量杂质，水解后再进行纯化分离，可以得到总的三萜酸及单一成分。与以往的技术相比收率明显提高。本发明的另一个创新点是积雪草用乙醇或甲醇提取后提取液不经过浓缩直接上大孔树脂柱纯化，可除去大量脂溶性杂质，操作简单，并且解决了浓缩后有效成分部分析出，溶液浑浊不利于上柱的问题，并且避免有效成分流失。制备积雪草酸与羟基积雪草酸时利用常压或中低压ODS柱层析，可跟据需要设计柱的规格，可大量制备高纯度积雪草酸与羟基积雪草酸，分离柱具有可反复使用、易操作、成本低、纯度高的特点，为本发明的又一个创新点。本发明制备的积雪草酸与羟基积雪草酸含量均在95％以上。特别适合产业化大量生产。

积雪草酸与羟基积雪草酸及其药物制剂的药理作用，通过以下药效学试验例得到证实。

1积雪草酸与羟基积雪草酸对α-糖苷酶的抑制作用

1.1标准反应体系67mmol/L磷酸钾缓冲液(pH6.8)150ul，1mg/ml谷胱甘肽溶液50μl，0.1mg/mlα-葡萄糖苷酶溶液100μl，37℃保温10min，20mmol/LPNPG溶液100ul，37℃反应20min后加入0.2mol/L Na₂CO₃溶液400ul终止反应，测定400nm处光吸收值。样品对酶活性的抑制率计算公式：

抑制率(％)＝(A对照-A样品)/A对照×100％

1.2拜糖平对α-葡萄糖苷酶活性的影响取研磨后的拜糖平配制成10mg/ml的原溶液，并以此稀释成20，10，5，2.5，1mg/ml不同浓度。将100ul拜糖平加入到酶反应体系中，先与酶在37℃保温10min，再加底物反应20min，用Na₂CO₃溶液终止反应，测定400nm处光吸收值。

1.3积雪草酸与羟基积雪草酸对α-葡萄糖苷酶活性的影响积雪草酸与羟基积雪草酸用浓度小于1％二甲基亚砜溶解，用缓冲液稀释至1.0mg/ml，抑制率高于70％，然后进行复筛。用缓冲液将积雪草酸与羟基积雪草酸稀释至浓度为1.0，0.5，0.25，0.125，0.0625，0.03125mg/ml。将100ul积雪草酸与羟基积雪草酸加入到反应体系中，测定积雪草酸与羟基积雪草酸对α-葡萄糖苷酶的抑制作用。实验结果见表1。

表1积雪草酸与羟基积雪草酸对α-葡萄糖苷酶的抑制作用

结果表明，改变拜糖平的浓度，拜糖平对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用具有良好的量效关系。积雪草酸与羟基积雪草酸在浓度为1.0，0.5，0.25，0.125，0.0625，0.03125mg/ml浓度下，对α-葡萄糖苷酶的抑制作用存在良好的量效关系，有很强的抑制作用。单一成分积雪草酸与羟基积雪草酸对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用是阳性药拜糖平的20倍以上，对α-葡萄糖苷酶表现出非常强的抑制作用。

2、积雪草酸与羟基积雪草酸对正常小鼠糖耐量实验

取小鼠80只，每组10只，随机分成5组，按表2分组。阴性对照组灌生理盐水，阳性对照为拜糖平灌胃25mg/kg，按照表2给药，连续给药7天，末次给药前禁食8h，同时给药及淀粉(5g/kg)灌胃，测定给淀粉后0.5h，1h，2h，3h的血糖值。眼眶静脉窦采血。用葡萄糖氧化酶试纸法测定血糖值。结果见表2。

表2、积雪草酸与羟基积雪草酸对正常小鼠糖耐量实验结果

^*与阴性对照组比较，^*P＜0.01；^**P＜0.001

说明积雪草酸与羟基积雪草酸能抑制正常小鼠餐后血糖升高，各组均有显著性差异。

3、积雪草酸与羟基积雪草酸对四氧嘧啶诱导的高血糖小鼠耐糖量实验

取雄性小鼠80只，每组10只，禁食14h后，腹腔注射四氧嘧啶(200mg/kg)，注射72h后，眼眶静脉窦采血。测定空腹血糖(取血前禁食10h)，用葡萄糖氧化酶试纸法测定血糖值。血糖高于11.1mmol/l的为糖尿病模型小鼠。模型按照表3分组。模型对照组灌生理盐水，阳性对照为灌胃拜糖平25mg/kg，按照表3给药，连续给药10天，末次给药前禁食6h，同时给药及淀粉(5g/kg)灌胃，测定给淀粉后0.5h，1h，2h的血糖值。结果见表3。

表3、积雪草酸与羟基积雪草酸对高血糖小鼠糖耐量实验结果

^*与模型对照组比较，^*P＜0.05；^**P＜0.01

说明积雪草酸与羟基积雪草酸能延缓四氧嘧啶诱导的高血糖小鼠餐后血糖升高。各剂量组均有显著性差异。

4、积雪草酸与羟基积雪草酸对四氧嘧啶诱导的高血糖小鼠血糖值实验

取雄性小鼠80只，每组10只，禁食14h后，腹腔注射四氧嘧啶(200mg/kg)，注射72h后，眼眶静脉窦采血。测定空腹血糖(取血前禁食10h)，用葡萄糖氧化酶试纸法测定血糖值。血糖高于11.1mmol/l的为糖尿病模型小鼠。模型按照表4分组。模型对照组灌生理盐水，阳性对照为灌胃拜糖平25mg/kg，按照表2给药，连续给药10天，末次给药后禁食10h，眼眶静脉窦采血，离心取血清，按葡萄糖氧化酶法测定血糖水平，结果见表4。

表4、积雪草酸与羟基积雪草酸对四氧嘧啶诱导的高血糖小鼠血糖值实验结果

^*与模型对照组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01；

积雪草酸与羟基积雪草酸高、中、低剂量组均能显著降低四氧嘧啶高血糖小鼠的血糖。

本发明是通过如下的实验施例得以实现(证实)，但不意味着本发明仅限于此，具体实施方式如下：

实施例1、积雪草酸与羟基积雪草酸的制备

取积雪草药材1kg，用含0.2％氧化钙的8倍量70％乙醇回流提取3次。每次2小时，合并提取液，加入50g药用活性炭，搅拌，滤过，滤液直接通过已处理好的D101大孔树脂柱，用70％乙醇洗脱1200ml，收集流出液及洗脱液，回收溶剂，浓缩至500ml；加1mol/l氢氧化钠溶液1000ml，100℃水解3小时。放冷，用稀盐酸调PH值为4，滤过，弃去水解液，滤饼用去离子水洗至中性；再用1500ml90％乙醇加热至沸，加入5g药用活性炭，搅拌，趁热滤过，滤液减压浓缩回收至无醇味、加水至1000ml，放置过夜，过滤，水洗，干燥。再重结晶2次，得积雪草总三萜酸。取积雪草总三萜酸，用含75％乙腈醋酸调PH为3.5水溶液溶解，在常压C-18反相柱上分离纯化，用含75％乙腈醋酸调PH为3.5水溶液为洗脱剂，分别收集积雪草酸与羟基积雪草酸流分，薄层鉴定后合并，挥去部分溶剂，分别获得积雪草酸与羟基积雪草酸。积雪草酸含量为97.9％；羟基积雪草酸含量为98.7％。

实施例2、积雪草酸与羟基积雪草酸的制备

取积雪草药材1kg，用含0.2％氧化钙的10倍量60％乙醇回流提取2次。每次3h，合并提取液，加入25g药用活性炭，搅拌，虑过，滤液直接通过已处理好的D201大孔树脂柱，用50％乙醇洗脱18000ml，收集流出液及洗脱液，回收溶剂，浓缩至500ml；加0.2mol/l氢氧化钾溶液1000ml，100℃水解5小时。放冷，用稀盐酸调PH值为2，滤过，弃去水解液，滤饼用去离子水洗至中性；再用95％乙醇加热至沸，加入药液体积的8g活性炭，趁热滤过，滤液减压浓缩回收至无醇味、加水至1000ml，放置过夜，过滤，水洗，干燥，再重结晶3次，得积雪草总三萜酸。取积雪草总三萜酸，用含75％乙腈醋酸调PH为3.5水溶液溶解，在C-18中低压反相柱上分离纯化，用含75％乙腈醋酸调PH为3.5水溶液为洗脱剂，分别收集积雪草酸与羟基积雪草酸流分，薄层鉴定后合并，挥去部分溶剂，分别获得积雪草酸与羟基积雪草酸。积雪草酸含量为95.9％；羟基积雪草酸含量为96.2％。

实施例3、积雪草酸与羟基积雪草酸的制备

取积雪草药材1kg，用含0.2％氧化钙的6倍量80％乙醇回流提取3次。每次3h，合并提取液，加入50g药用活性炭，搅拌，虑过，滤液直接通过已处理好的AB-8大孔树脂柱，用80％乙醇洗脱9000ml，收集流出液及洗脱液，回收溶剂，浓缩至500ml；加2mol/l碳酸钠溶液1000ml，100℃水解4小时。放冷，用稀盐酸调PH值为6，滤过，弃去水解液，滤饼用去离子水洗至中性；再用85％乙醇加热至沸，加入药液体积的5g活性炭，趁热滤过，滤液减压浓缩回收至无醇味、加水至1000ml，放置过夜，过滤，水洗，干燥，再重结晶3次，得积雪草总三萜酸。取积雪草总三萜酸，用含75％乙腈醋酸调PH为3.5水溶液溶解，在常压C-18反相柱上分离纯化，用含75％乙腈醋酸调PH为3.5水溶液为洗脱剂，分别收集积雪草酸与羟基积雪草酸流分，薄层鉴定后合并，挥去部分溶剂，分别获得积雪草酸与羟基积雪草酸。积雪草酸含量为97.9％；羟基积雪草酸含量为96.8％。

Claims (6)

1.积雪草酸与羟基积雪草酸在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用其特征在于：积雪草酸与羟基积雪草酸是从伞形科积雪草属植物积雪草中提取纯化分离而得。积雪草酸与羟基积雪草酸含量均在95％以上。

3.根据权利要求2所述的积雪草酸与羟基积雪草酸制备方法为：取积雪草药材，用含0.1-0.4％氧化钙或氢氧化钙的50-90％乙醇或甲醇回流提取2-3次。合并提取液，加入药液体积0.1-1％的药用活性炭，搅拌，滤过，滤液直接通过已处理好的大孔树脂柱，用50-90％乙醇或甲醇洗脱，收集流出液及洗脱液，回收溶剂，浓缩至每1ml含2g药材；加0.2～2mol/L的碱溶液1-4倍量，100℃水解1-5小时。放冷，用稀酸调PH值为2-6，滤过，弃去水解液，滤饼用去离子水洗至中性；再用60-95％乙醇或甲醇加热至沸，加入药液体积0.2-2％的药用活性炭，趁热滤过，滤液减压浓缩回收至无醇味，加水至每1ml含1g药材，放置，过滤，水洗，干燥，再重结晶1-3次，得积雪草总三萜酸。取积雪草总三萜酸，用含60-90％乙腈醋酸水溶液溶解，在常压或中低压C-18反相柱上分离纯化，用含60-90％乙腈醋酸水溶液为洗脱剂，分别收集积雪草酸与羟基积雪草酸流分，薄层鉴定后合并，挥去部分溶剂，分别获得积雪草酸与羟基积雪草酸。含量均在95％以上。

4.根据权利要求3所述的纯化得到积雪草酸与羟基积雪草酸的特征在于：提取药材乙醇或甲醇用量为5～10倍量；提取时间为1-3小时；水解用的碱为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钾、碳酸钠等；调PH值为2-6的稀酸溶液为盐酸或硫酸溶液。

5.根据权利要求3所述的应用其特征在于：所选用的大孔树脂为D101、D201、AB-8。

6.根据权利要求1所述的应用其特征在于：在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂的药物中的应用是指含有有效治疗剂量的积雪草酸与羟基积雪草酸和一种或多种药学上可接受的药用赋形剂，或用积雪草酸与羟基积雪草酸组方，并用于制备α-葡萄糖苷酶抑制药物的其它制剂中的应用。