CN103550200B - 一种药物组合物在制备抑制血糖升高药物及降血脂药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种从田基黄中提取的酮药物组合物的制备方法，通过该方法得到的组合物中主要含有6-脱氧异巴西红厚壳素、异巴西红厚壳素占、田基黄双酮占、1，3，5，6-四羟基-4-异戊烯基酮、田基黄双

Description

一种药物组合物在制备抑制血糖升高药物及降血脂药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种从田基黄中提取的酮药物组合物在制备抑制血糖升高药物及降血脂药物中的应用，可用于预防和治疗由高血糖引起的糖尿病综合症及高血脂。本发明也涉及该药物的药物制剂，属于医药技术领域。

背景技术

糖尿病、高血脂均为代谢性疾病，糖尿病常伴有脂代谢紊乱及高脂血症。目前，代谢性疾病的发病率越来越高，可涉及心、脑、肾、肺、血管、神经、皮肤、眼、耳、足等组织的慢性进行性病变，引起功能缺陷及衰竭，已经严重威胁到人们的正常生活。长期高血糖、高血脂极易诱发糖尿病性心脑血管病变。在糖尿病的治疗中，降血脂几乎与降血糖同等重要。况且，目前还没有副作用小疗效确切的治疗这两种代谢性疾病的天然药物。糖尿病及高血脂症是近年来的常见病，本发明基于α-葡萄糖苷酶抑制剂的优势及同时降低血脂的双重作用，发明既可以降低血糖又可以防治高血脂症的一种酮药物组合物。

田基黄为藤黄科植物地耳草（Hypericum japonicum Thunb.）的干燥全草。本品始载于《生草药性备要》，《植物名实图考》中称田基黄。味甘、微苦，性凉，具有清热利湿，消肿解毒的功效。民间常用田基黄治疗各种肝炎。临床试验表明，田基黄三氯甲烷提取物对HBsAH或HBeAH具有明显的抑制作用，利用田基黄治疗黄疸型肝炎，能降 低谷丙转氨酶，田基黄注射液对急性、黄疸性和非黄疸性肝炎有效率达95%，对迁延性和慢性肝炎有效率为74%。李沛波报道了田基黄中槲皮苷(Quercetin-3-β-D-rhamnose)、异槲皮苷(Quercetin-3-β-D-glucoside)、田基黄苷(Quercetin-7-β-D-rhamnose)3个黄酮类化合物具有保肝退黄作用（2007年，中山大学学报，第1期，40-43页）；夏隆江报道了田基黄提取物具有抗痛风的作用（2007年，中国药房，第24期，1858-1861页）；李沛波报道了田基黄具有保肝的作用（2006年，中药材，第1期，55-56页）；黎七雄报道了田基黄对肿瘤具有抑制作用（1993年，华西药学杂志，第2期，第91页）；方正达报道了含有田基黄的中药复方制剂具有治疗高血脂症的作用（专利申请号：CN103110846A）；苏薇薇报道了田基黄总黄酮具有治疗肝纤维化作用（专利公开号：CN102210725A）；米军报道了田基黄及提取物具有防治肾功能不全作用（专利公开号：CN101028317B）；胡向阳报道了田基黄水煎液对应激负荷下高脂血症大鼠的血脂、免疫功能有改善作用（2011年，北方药学，第7期，43-45页），但是这种提取物是一种水煎粗提物，包括了田基黄中多种物质，没有明确的药效物质。田基黄对正常组织细胞无毒副作用，有实验研究，小鼠灌服田基黄流浸膏10-100g/kg，每天早晚各1次，连用16d，未见毒性反应，说明田基黄长期服用安全。

本发明是从田基黄中提取的酮组成的组合物，与以往报道的田基黄总黄酮具有明显的区别，以往报道的田基黄总黄酮是利用芦丁为对照品测定总黄酮（检测波长一般用370nm）的含量，成分主要包括 槲皮苷、异槲皮苷、槲皮素等；本发明主要目的是富集酮，总酮的测定方法是利用异巴西红厚壳素为对照品进行测定（检测波长为254nm），所以本发明制备的酮组合物与以往报道的田基黄总黄酮具有本质的区别。

在本发明完成前还没有文献报道主要由6-脱氧异巴西红厚壳素、异巴西红厚壳素、田基黄双酮、1，3，5，6-四羟基-4-异戊烯基酮、田基黄双酮素C组成的组合物具有抑制血糖升高作用及降血脂的作用。

发明内容

本发明目的是提供一种田基黄酮组合物，用于预防和治疗糖尿病及高血脂症的作用。本发明对田基黄的有效成分进行了研究，寻找到了活性更强、实用性强的有效部位，用于糖尿病及高血脂症的预防和治疗。更进一步地，本发明的发明人通过进一步的研究发现，主要由6-脱氧异巴西红厚壳素、异巴西红厚壳素、田基黄双酮、1，3，5，6-四羟基-4-异戊烯基酮、田基黄双酮素C组成的组合物在抑制α-葡萄糖苷酶及调节血脂方面有很强的活性。这种天然的药物组合物是本发明人首次通过实验筛选得到，具有突出的贡献及显著的技术进步。

本发明突出贡献在于：采用温水浸出及聚酰胺柱层析除去一些黄酮苷和酚酸类水溶性杂质成分，再经大孔树脂柱将田基黄中的酮类成分进行富集，得到酮组合物，与以往报道的田基黄总黄酮具有明显的区别，以往报道的田基黄总黄酮是利用芦丁为对照品测定总黄酮 的含量，成分主要包括槲皮苷、异槲皮苷、槲皮素等，本发明主要目的是富集酮，酮黄酮的测定方法是利用异巴西红厚壳素为对照品进行测定，所以本发明制备的酮组合物与以往报道的田基黄总黄酮具有本质的区别。同时，将本发明组合物药理活性与田基黄中含有的槲皮苷、异槲皮苷药理活性进行了比较，实验结果显示，本发明组合物具有很强的抑制α-葡萄糖苷酶及调节血脂的药理活性，但是槲皮苷及异槲皮苷活性不明显，验证了本发明了的活性物质是酮类化合物，说明本发明具有明显的技术进步及创新性。

本发明的另一个突出贡献在于，本发明提取的酮组合物具有治疗糖尿病及高血脂症并发症的作用，本发明组合物不但可以抑制α-葡萄糖苷酶的活性及调血脂的活性，还可以保肝、预防心脑血管疾病的作用。同时，本发明所用的原料安全，制成的制剂已经销售多年，临床应用无不良作用，所以，本发明组合物长期服用安全、有效，适合本发明针对的使用人群的服用特点，体现了本发明的实用性。

本发明采用了水温浸除去一些水溶性杂质及黄酮苷类成分，再用乙醇提取和树脂柱层析的方法纯化酮组合物，可操作性强，适合工业生产。本发明首次采用了温水浸提，除去一下黄酮苷类成分及水溶性杂质，使制备的酮类成分纯度更高、活性更强，是本发明的主要创新点。首次将乙醇提取田基黄的提取液不经过浓缩，直接在聚酰胺柱上吸附纯化，吸附大量的酚酸及鞣质，解决了乙醇提取液浓缩后药液粘度大，不利于在大孔树脂柱上吸附纯化的问题。由于通过试验选择使用合适型号的大孔树脂进行纯化，使有效成分更加富集，更利于 今后制成药品或者保健食品的应用。也是本发明的创新点之一。

本发明的另一目的是提供一种由田基黄提取的酮药物组合物的制备方法，其特征在于：将田基黄药材粉碎成粗粉，先用8-10倍量去离子水温浸（40-60℃）3次，每次3-6小时，滤过，药渣再用7-10倍量药材重量的60-80％的乙醇回流提取2-3次，每次2-3小时，滤过，滤液通过已处理好的聚酰胺柱，回收乙醇至每1mL含1g药材，滤过，得沉淀物Ⅰ；滤液通过已处理好的D101大孔树脂柱，先用水洗至无色，再用40-80％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩，得提取物Ⅱ；将提取物Ⅰ及提取物Ⅱ合并，干燥得田基黄酮药物组合物。

本发明的另一突出贡献在于，提供一种具有抑制α-葡萄糖苷酶的作用及调节血脂的作用的药物组合物，其特征在于：主要由6-脱氧异巴西红厚壳素、异巴西红厚壳素、田基黄双酮、1，3，5，6-四羟基-4-异戊烯基酮、田基黄双酮素C组成。组合物中各成分按重量百分比计：6-脱氧异巴西红厚壳素占10-30％、异巴西红厚壳素占15-35％、田基黄双酮占5-20％、1，3，5，6-四羟基-4-异戊烯基酮占3-10％、田基黄双酮素C占3-10%。组合物中酮的含量以异巴西红厚壳素计，不低于80%。

为实现以上发明，采用以下方案确定确定田基黄酮组合物中主要化学成分的配比组成。

取提取的田基黄酮组合物，用甲醇溶解，利用常压或中低压ODS柱进行分离，以乙腈-0.05%磷酸水溶液为流动相，分别收集6-脱氧异巴西红厚壳素、异巴西红厚壳素、田基黄双酮、1，3，5， 6-四羟基-4-异戊烯基酮、田基黄双酮素C流分，点样，合并，得到高纯度的6-脱氧异巴西红厚壳素、异巴西红厚壳素、田基黄双酮、1，3，5，6-四羟基-4-异戊烯基酮、田基黄双酮素C。还可以利用硅胶柱层析，得到单体化合物。

为实现以上技术方案，田基黄酮组合物中各化合物含量及总酮含量通过以下方法测定：

6-脱氧异巴西红厚壳素、异巴西红厚壳素、田基黄双酮、1，3，5，6-四羟基-4-异戊烯基酮、田基黄双酮素C含量测定方法：

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈－0.05%磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱；检测波长为254nm。理论板数按异巴西红厚壳素峰计算不低于3000。梯度洗脱比例如下表。

高效液相色谱检测流动相比例

对照品溶液的制备精密称取6-脱氧异巴西红厚壳素、异巴西红厚壳素、田基黄双酮对照品各10mg，1，3，5，6-四羟基-4-异戊烯基酮、田基黄双酮素C对照品各4mg，置同一25mL量瓶中， 用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取2mL，置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

供试品溶液的制备取本品25mg，置50mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取5mL，置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

测定方法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

田基黄酮含量测定方法：

对照品溶液的制备精密称取异巴西红厚壳素对照品5.0mg，置50mL量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

标准曲线的制备：取对照品5mg，用无水乙醇配制成每1mL含0.1mg的溶液，依次取0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.8mL、1.6mL置于10mL容量瓶中，随行空白，于波长254nm处测吸收度，以含量为横坐标，吸收度为纵坐标绘制标准曲线。

供试品溶液的制备取本品内容物10.0mg，置100mL量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

测定法精密量取供试品溶液0.3mL，置10mL量瓶中，随行空白。照分光光度法，在波长254nm处分别测定吸收度，计算。

田基黄酮组合物（简称组合物）具有抑制血糖升高的活性及降血脂活性，通过以下药效学实验得到证实。

实验原料：本药效学中用到的组合物为本发明人提供。按照实例1制备而成。

本药效学试验中用到的血脂康胶囊为北京北大维信生物科技有 限公司生产，批号为：20120301；阿卡波糖为拜耳医药保健有限公司生产（批号：20120928）。

本药效学试验用的α-葡萄糖苷酶为sigma公司生产（G5003-100UN）,大鼠肠内粘膜酶自制。

1、田基黄酮组合物对α-糖苷酶的抑制作用

1.1标准反应体系67mmol/L pH为6.8磷酸钾缓冲液150uL，1mg/mL谷胱甘肽溶液50μL，2.5U/mLα-葡萄糖苷酶溶液100μL，37℃保温10min，20mmol/L PNPG溶液100ul，37℃反应20min后加入0.2mol/L Na₂CO₃溶液400uL终止反应，测定400nm处光吸收值。样品对酶活性的抑制率计算公式：

抑制率（%）＝（A对照-A样品）/A对照×100%

1.2拜糖平对α-葡萄糖苷酶活性的影响取研磨后的拜糖平配制成50mg/ml的原溶液，并以此稀释成20.0，10.0，5.0，2.5，1.0，0.2，0.05mg/ml不同浓度。将100ul拜糖平加入到酶反应体系中，先与酶在37℃保温10min，再加底物反应20min，用Na₂CO₃溶液终止反应，测定400nm处光吸收值。

1.3组合物对α-葡萄糖苷酶活性的影响组合物用二甲基亚砜溶解，然后用缓冲液稀释至5.0，2.5，1.0，0.5，0.25，0.1，0.05mg/ml，二甲基亚砜于反应体系中终含量﹤1%。将100ul组合物加入到反应体系中，测定组合物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用。实验结果见表1。

表1组合物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用

结果表明，拜糖平对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用具有良好的量效关系。组合物在浓度为5.0，2.5，1.0，0.5，0.25，0.1，0.05，条件下，对α-葡萄糖苷酶的抑制作用存在良好的量效关系，组合物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用是阳性药拜糖平的2倍以上，对α-葡萄糖苷酶表现出非常强的抑制作用。但是、槲皮苷及异槲皮苷对α-葡萄糖苷酶抑制作用不强。

2、田基黄酮组合物对大鼠肠内粘膜酶的抑制作用

2.1大鼠肠内粘膜酶的提取

取正常大鼠1只，处死后，立即取出小肠，洗净内容物，按质量体积比1：3加入4℃预冷的0.1mol/L，pH=6.8PBS，匀浆，4℃、8000rpm，离心20分钟，取上清液分装入EP管中，-20℃冷冻备用。

2.2田基黄酮组合物对大鼠肠内粘膜酶的抑制作用

2.2.1标准反应体系67mmol/L pH为6.8磷酸钾缓冲液150uL，1mg/mL谷胱甘肽溶液50μL，大鼠肠内粘膜酶溶液100μL，37℃保温10min，20mmol/L PNPG溶液100ul，37℃反应20min后加入0.2mol/L Na₂CO₃溶液400uL终止反应，测定400nm处光吸收值。样 品对酶活性的抑制率计算公式：

抑制率（%）＝（A对照-A样品）/A对照×100%

1.2拜糖平对大鼠肠内粘膜酶活性的影响取研磨后的拜糖平配制成50mg/ml的原溶液，并以此稀释成20.0，10.0，5.0，2.5，1.0，0.2，0.05mg/ml不同浓度。将100ul拜糖平加入到酶反应体系中，先与酶在37℃保温10min,，再加底物反应20min，用Na₂CO₃溶液终止反应，测定400nm处光吸收值。

1.3组合物对大鼠肠内粘膜酶活性的影响组合物用二甲基亚砜溶解，然后用缓冲液稀释至5.0，2.5，1.0，0.5，0.25，0.1，0.05mg/ml，二甲基亚砜于反应体系中终含量﹤1%。将100ul组合物加入到反应体系中，测定组合物对大鼠肠内粘膜酶的抑制作用。实验结果见表2。

表2组合物对大鼠肠内粘膜酶的抑制作用

结果表明，拜糖平对大鼠肠内粘膜酶活性的抑制作用具有良好的量效关系。组合物在浓度为5.0，2.5，1.0，0.5，0.25，0.1，0.05， 条件下，对大鼠肠内粘膜酶的抑制作用存在良好的量效关系，组合物对大鼠肠内粘膜酶活性的抑制作用是阳性药拜糖平的4倍以上，对大鼠肠内粘膜酶表现出非常强的抑制作用。但是、槲皮苷及异槲皮苷对大鼠肠内粘膜酶抑制作用较弱。

3、本品组合物对大鼠TC、TG、HDL-C、LDL-C的影响

取雄性大鼠80只，随机分为8组，除空白对照组外，其余各组每天给予高脂饲料：2％胆固醇，10％猪油，0.5％胆酸钠，0.2％丙基硫氧嘧啶，87％基础饲料。除空白对照组自由饮水外，高脂模型组给予等量生理盐水，其余各组灌胃给药，每日1次，按照表1分组，给药，连续给药15d。用药后禁食12h，测定血清总胆固醇（TC）、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、血清低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）含量，结果见表1。

表1、本品组合物对高脂血症大鼠血脂指标的影响结果

与模型对照组比较，*P<0.05；**P<0.01；

与正常组比较，^△P<0.05；^△△P<0.01；

结果表明，模型对照组血清TC、TG、LDL-C值明显升高，HDL-C明显下降。与模型对照组比较，本品组合物能明显降低血清TC、TG含量，显著降低血清低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）含量，显著升高 血清高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）含量。同时，实验结果表明槲皮苷及异槲皮苷的活性较弱。

实施例

本发明是通过如下的实验施例得以实现（证实），但不仅限于本实例。

实例1田基黄 酮的制备方法

将田基黄药材粉碎成粗粉，先用10倍量去离子水温浸（50℃）3次，每次3-6小时，滤过，滤液弃去，药渣用8倍量药材重量的70％的乙醇回流提取2-3次，每次3小时，滤过，滤液通过已处理好的聚酰胺柱，回收乙醇至每1mL含1g药材，滤过，得沉淀物Ⅰ；滤液通过已处理好的D101大孔树脂柱，先用水洗至无色，再用55％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩，得提取物Ⅱ；将提取物Ⅰ及提取物Ⅱ合并，干燥得田基黄酮药物组合物。收率为3.8%，以异巴西红厚壳素为对照品测定总酮的含量为87.5%。利用高效液相色谱法测定，6-脱氧异巴西红厚壳素含量为17.6%、异巴西红厚壳素含量为25.9%、田基黄双酮含量为13.8%、1，3，5，6-四羟基-4-异戊烯基酮含量为5.8%、田基黄双酮素C含量为6.5%。

Claims (7)

1.一种田基黄酮药物组合物，其制备方法为：将田基黄药材粉碎成粗粉，先用8-10倍量40-60℃去离子水温浸3次，每次3-6小时，滤过，弃去滤液，药渣再用7-10倍量药材重量的60-80％的乙醇回流提取2-3次，每次2-3小时，滤过，滤液通过已处理好的聚酰胺柱，回收乙醇至每1mL含1g药材，滤过，得沉淀物Ⅰ；滤液通过已处理好的D101大孔树脂柱，先用水洗至无色，再用40-80％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩，得提取物Ⅱ；将提取物Ⅰ及提取物Ⅱ合并，干燥得田基黄酮药物组合物。

2.根据权利要求1所述的田基黄酮药物组合物，其特征在于：主要由6-脱氧异巴西红厚壳素、异巴西红厚壳素、田基黄双酮、1，3，5，6-四羟基-4-异戊烯基酮、田基黄双酮素C组成。

3.根据权利要求2所述的田基黄酮药物组合物，其特征在于：按重量百分比计：6-脱氧异巴西红厚壳素占10-30％、异巴西红厚壳素占15-35％、田基黄双酮占5-20％、1，3，5，6-四羟基-4-异戊烯基酮占3-10％、田基黄双酮素C占3-10％。

4.根据权利要求1-3任意一项所述田基黄酮药物组合物，其特征在于：总酮的含量以异巴西红厚壳素计，不少于80％。

5.一种口服药物制剂，其特征在于：含有权利要求1-4中任意一项所述的田基黄酮药物组合物和一种或多种药学上可接受的赋形剂。

6.根据权利要求5所述的药物制剂，其特征在于：所述的口服制剂选自片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、混悬剂、口服液中的一种。

7.根据权利要求1所述的田基黄酮药物组合物，在制备抑制血糖升高药物及降血脂药物中的应用。