CN101485696A - 卷柏降血糖和调血脂成分的制备方法及其新用途 - Google Patents
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Abstract
利用大孔树脂和聚酰胺串联柱层析方法首次从卷柏科卷柏属(Selaginella)植物垫状卷柏S.pvlvinata(Hook.et Gev.)Maxim、卷柏S.tamariscina(beav.)spring和江南卷柏S.moellendorfii Hieron中大量制备高含量卷柏总黄酮和高纯度穗花杉双黄酮单体成分。并首次证明卷柏总黄酮和穗花杉双黄酮单体成分具有α-葡萄糖苷酶抑制作用、降血糖作用及具有调血脂的作用。是卷柏总黄酮和穗花杉双黄酮在预防和治疗高血糖及高血脂症方面的新用途。
Description
技术领域
本发明涉及卷柏的新用途,即卷柏经溶剂提取、大孔树脂和聚酰胺串联柱层析分离纯化得到卷柏总黄酮及穗花杉双黄酮单体成分。确切的说是从卷柏中提取的卷柏总黄酮及穗花杉双黄酮单体成分在制备降血糖(α-葡萄糖苷酶抑制剂)和调血脂方面的应用。也涉及该药物的药物制剂。属于医药技术领域。
背景技术
卷柏系卷柏科卷柏属(Selaginella)植物垫状卷柏S.pvlvinata(Hook.et Gev.)Maxim、卷柏S.tamariscina(beav.)spring和江南卷柏S.moellendorfii Hieron的干燥全草。卷柏属植物具有防癌治癌、抗炎、抗病毒、镇痛、降血压、降血糖、抗痛风和增强人体免疫功能等作用(国外医学植物药分册,2002年报17卷3期97-99页),特别是含有丰富的双黄酮类成分是该属植物的一大特征。到目前为止还未发现有比卷柏属植物含有双黄酮更高的植物。在以往的研究已报道了,从卷柏中提取穗花杉双黄酮提取物的生产工艺(200410048613.X),是一种较粗的提取物,在化妆品方面的用途。郑晓珂等报道卷柏水提取和正丁醇提取部分有雌激素样的作用(200610017494.X)。李方莲、吴奕富分别报道了卷柏粗提取物或含有卷柏的复方针剂对实验大鼠有降血糖的作用,但均为粗提取物,没有经过纯化,没有明确主要有效成分。康文艺等报道了用碱提取酸沉淀法制备了卷柏中的酸性部位,其中穗花杉双黄酮含量仅为10-12%,尚有90%左右的其他成分不清楚,实验报道了该酸性提取物具有α-葡萄糖苷酶抑制剂作用和降血脂的作用(精细化工,2008年12月,第25卷,第12期),该提取物仍然是一种非常复杂的混合物,不能确定其有效成分是什么。赵全成等利用大孔树脂和C-18反相柱等方法从卷柏中分离纯化了卷柏总黄酮和单体成分穗花衫双黄酮,并证明从卷柏中提取的总黄酮和穗花杉双黄酮单体成分具有预防和治疗老年痴呆的作用(200810050894.X)。
我们通过卷柏提取的总黄酮和穗花杉双黄酮单体成分的进一部研究证明卷柏总黄酮和穗花杉双黄酮单体成分具有α-葡萄糖苷酶抑制作用,降血糖和调血脂作用。
α-葡萄糖苷酶抑制剂是通过竞争性抑制α-葡萄糖苷酶的活性,可阻滞双糖水解为单糖,延缓糖的吸收,使血糖平稳并缓慢的维持在一定的水平,防治餐后高血糖症,同时还可以提高糖耐量,预防和治疗肥胖症,高脂血症,用于治疗应碳水化合物紊乱而引起的疾病。
本发明的特点在于卷柏用乙醇或甲醇提取后提取液不浓缩直接上大孔树脂柱,操作简单,并且解决了浓缩后有效成分部分析出,溶液浑浊不利于上柱的问题。并且与聚酰胺串联后吸附纯化,得到的卷柏总黄酮含量高。二次经过聚酰胺柱纯化后穗花杉双黄酮纯度高;此方法没有利用硅胶柱层析,高效液相色谱制备,整个生产工艺简单、生产周期短,安全、不污染环境,成本低,收率高,纯度高达95%以上,特别适合产业化大量生产。
本发明完成前未发现有关卷柏总黄酮及其穗花杉双黄酮作为α-糖苷酶抑制剂、在预防和治疗降血糖及调血脂方面应用的报道。本发明具有广泛的应用前景。
穗花杉双黄酮(amentofeavone)的结构:
发明内容
本发明的目的之一是提供穗花杉双黄酮和卷柏总黄酮具有抑制α-葡萄糖苷酶的活性,用于治疗和预防高血糖及高血脂症。具体的说是穗花杉双黄酮和卷柏总黄酮用于制备防治高血糖、高血脂药物的新用途。经动物试验,本发明的制剂具有显著抑制α-葡萄糖苷酶的活性;能延缓正常小鼠餐后血糖升高、能延缓四氧嘧啶诱导的高血糖小鼠餐后血糖升高;降低四氧嘧啶高血糖小鼠的血糖;降低正常小鼠血糖,促进胰岛素分泌,减少胰高血糖素含量,增加肝糖原、肌糖原含量。在本发明申请前未见有应用卷柏总黄酮及其穗花杉双黄酮单体成分预防和治疗高血糖、高血脂症的报道。
本发明目的之二是提供了卷柏总黄酮及其穗花杉双黄酮单体成分的提取分离方法,以往公开的提取分离卷柏总黄酮和单体穗花杉双黄酮的方法多是以石油醚脱脂和除叶绿素等脂溶性杂质或仅限于实验室的分离,不适合产业化生产。本发明采用了大孔树脂柱和聚酰胺柱串联的方法纯化卷柏总黄酮和穗花杉双黄酮,可操作性强,适合工业生产。本发明首次采用了乙醇或甲醇提取卷柏的提取液不经过浓缩,直接在大孔树脂上吸附纯化,解决了乙醇或甲醇提取液浓缩后部分有效成分析出药液混浊,不利于在大孔树脂柱和聚酰胺柱上吸附纯化的问题。也是本发明的创新点之一。大孔树脂柱串联聚酰胺柱吸附纯化,可以得到含量较高的卷柏总黄酮。
卷柏总黄酮用55-60%的乙醇或甲醇溶解、过滤,在聚酰胺柱上吸附纯化,被聚酰胺吸附部分用80%乙醇或甲醇洗脱,收集乙醇或甲醇洗脱液,加适量活性炭脱色,过滤,回收溶剂,放置析出,得穗花杉双黄酮单体成分,含量在95%以上。从而可以制备大量的穗花杉双黄酮单体成分,可操作性强,节约时间,成本低。简化了利用硅胶柱分离、高效液相制备的方法制备单体成分的方法。也是本发明的又一个主要的创新点。在本发明申请前未见有用该方法分离纯化穗花杉双黄酮单体成分的报道。
本发明的目的之三是提供卷柏总黄酮和穗花杉双黄酮单体成分的药物制剂。主要是口服制剂,主要选自片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、混悬剂、滴丸剂,口服制剂中的任何一种。
本发明目的之四是提供药物优选含有1%—99%的穗花杉双黄酮或卷柏总黄酮和99%—1%的药用赋形剂或其它可组方的药物。本发明药物中的其它配伍的药物,指的是以有效剂量的穗花杉双黄酮或卷柏总黄酮为一定的药物原料,再配伍其它允许合用的中药或化学药品。
穗花杉双黄酮、卷柏总黄酮及其药物制剂可以抑制α-葡萄糖苷酶的活性、具有预防和治疗高血糖及高血脂症。这些药理作用,通过以下药效学试验例得到证实。
1穗花杉双黄酮及卷柏总黄酮对α-葡萄糖苷酶的抑制剂作用
将卷柏总黄酮及穗花杉双黄酮用0.1M磷酸缓冲液配制成表1所示浓度的供试品溶液。取40μl供试品溶液与10μl α-葡萄糖苷酶抑制剂混合,37℃温浴10min,加入2.0mmol/L麦芽糖50μl,37℃继续温浴10min,沸水浴终止反应。氧化酶法酶标仪490nm测定OD值。以拜糖平为阳性对照,按照供试品方法制备阳性对照样品。以0.1M磷酸缓冲液为阴性对照。
表1、卷柏总黄酮及穗花杉双黄酮对α-葡萄糖苷酶的抑制剂作用
说明穗花杉双黄酮与卷柏总黄酮对α-葡萄糖苷酶有明显的抑制剂作用。
2、穗花杉双黄酮及卷柏总黄酮对正常小鼠糖耐量实验
取小鼠80只,随机分成8组,按表2分组。阴性对照组灌生理盐水,阳性对照为拜糖平灌胃拜糖平20mg/kg,按照表2给药,连续给药7天,末次给药前禁食8h,给药后蔗糖(3g/kg)灌胃,测定给蔗糖后0.5h,1h,2h的血糖值。眼眶静脉窦采血。用葡萄糖氧化酶试纸法测定血糖值。结果见表2。
表2、穗花杉双黄酮及卷柏总黄酮对正常小鼠糖耐量实验结果
*与阴性对照组比较,*P<0.01;
说明穗花杉双黄酮及卷柏总黄酮均能抑制正常小鼠餐后血糖升高。
3、穗花杉双黄酮及卷柏总黄酮对四氧嘧啶诱导的高血糖小鼠耐糖量实验
取雄性小鼠80只,禁食14h后,腹腔注射2%四氧嘧啶(30mg/kg)生理盐水溶液,注射72h后,眼眶静脉窦采血。测定空腹血糖(取血前禁食10h),用葡萄糖氧化酶试纸法测定血糖值。血糖高于11.1mmol/l的为糖尿病模型小鼠。模型按照表3分组。模型对照组灌生理盐水,阳性对照为拜糖平灌胃拜糖平20mg/kg,按照表2给药,连续给药10天,末次给药前禁食6h,给药后蔗糖(2g/kg)灌胃,测定给蔗糖后0.5h,1h,2h的血糖值。结果见表3。
表3、穗花杉双黄酮及卷柏总黄酮对高血糖小鼠糖耐量实验结果
*与模型对照组比较,*P<0.01;
说明穗花杉双黄酮及卷柏总黄酮均能延缓四氧嘧啶诱导的高血糖小鼠餐后血糖升高。
4、穗花杉双黄酮及卷柏总黄酮对四氧嘧啶诱导的高血糖小鼠血糖值实验
取雄性小鼠80只,禁食14h后,腹腔注射2%四氧嘧啶(30mg/kg)生理盐水溶液,注射72h后,眼眶静脉窦采血。测定空腹血糖(取血前禁食10h),用葡萄糖氧化酶试纸法测定血糖值。血糖高于11.1mmol/l的为糖尿病模型小鼠。模型按照表4分组。模型对照组灌生理盐水,阳性对照为拜糖平灌胃拜糖平20mg/kg,按照表2给药,连续给药10天,末次给药后禁食10h,眼眶静脉窦采血,离心取血清,按葡萄糖氧化酶法测定血糖水平,结果见表4。
表4、穗花杉双黄酮及卷柏总黄酮对四氧嘧啶诱导的高血糖小鼠血糖值实验结果
*与模型对照组比较,*P<0.05,**P<0.01;
说明穗花杉双黄酮高、中、低剂量组均能显著降低四氧嘧啶高血糖小鼠的血糖。卷柏总黄酮高、中剂量组能低剂量组均能显著降低四氧嘧啶高血糖小鼠的血糖。
5、穗花杉双黄酮及卷柏总黄酮对正常小鼠血糖、血清胰岛素、胰高血糖素、肝糖原、肌糖原影响
取小鼠70只,按照表5分组,给药,每天1次,连续14天,末次给药后2h,眼眶静脉取血,用葡萄糖氧化酶法测定血糖,用放射免疫法测定血清胰岛素、胰高血糖素,并取肝脏、膈肌用改良的蒽酮法测定肝糖原、肌糖原,结果见表5。
表5 穗花杉双黄酮及卷柏总黄酮对正常小鼠血糖、血清胰岛素、胰高血糖素、肝糖原、肌糖原影响结果
说明穗花杉双黄酮及卷柏总黄酮能降低正常小鼠血糖,促进胰岛素分泌,减少胰高血糖素含量,增加肝糖原、肌糖原含量。
6、穗花杉双黄酮及卷柏总黄酮对小鼠TC、TG、HDL-C的影响
取小鼠90只,按照表6分组,给药,每天1次,连续10天,正常对照组不给任何药,其余小鼠均给高脂乳剂0.5ml/只,形成实验性高血脂,10天用药后禁食12h,测定血清总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量,结果见表6。
表6、穗花杉双黄酮及卷柏总黄酮对小鼠TC、TG、HDL-C的影响结果
*与模型对照组比较,*P<0.05;
结果表明模型对照组血清TC、TG值明显升高,HDL-C下降,与模型对照组比较穗花杉双黄酮及卷柏总黄酮能明显降低血清TC、TG值,HDL-C稍微有所升高。说明穗花杉双黄酮及卷柏总黄酮能抑制高脂乳剂引起的小鼠血脂升高,具有降脂作用。
本发明是通过如下的实验施例得以实现(证实)
实施例1、卷柏总黄酮及穗花杉双黄酮单体成分的提取制备:
药材1kg,用30-95%乙醇(优选70%乙醇)8倍量回流提取2-3次,每次提取1~3小时,提取液直接通过预先处理好的D101或AB—8大孔树脂柱,树脂柱用2倍柱体积70%乙醇洗脱,70%乙醇液合并,调乙醇浓度为30-60%(优选50-55%)后,直接通过聚酰胺柱。聚酰胺柱用2倍柱体积30-60%乙醇洗脱,然后用60-95%(优选80%)乙醇洗脱聚酰胺柱,收集60-95%乙醇洗脱液,回收溶剂,干燥得卷柏总黄酮。卷柏总黄酮含量为89.6%。卷柏总黄酮用55-60%的乙醇或甲醇溶解、过滤,在聚酰胺柱上吸附纯化,被聚酰胺吸附部分用80%乙醇或甲醇洗脱,收集乙醇或甲醇洗脱液,加0.2%活性炭脱色,过滤,回收溶剂,放置析出,得穗花杉双黄酮单体成分。穗花杉双黄酮含量为98.8%。
实施例3、(胶囊剂)
穗花杉双黄酮或总黄酮原料100g,药用淀粉适量,混合均匀,制粒,干燥,整粒,装入1号胶囊,制成1000粒,即得。每次1粒、每日3次。
实施例4(片剂)
穗花杉双黄酮或总黄酮原料100g,药用淀粉适量,糊精适量,混合均匀,制粒,干燥,整粒,干燥,加入润滑剂适量,压片,制成1000片,即得。每次1片。每日3次。
实施例5(滴丸剂)
称取30g聚乙二醇4000,在水浴上熔化,加穗花杉双黄酮或总黄酮原料10g,搅拌均匀,倾入保温管中,调节恒温装置,使药液在80—90℃下滴入冷却过的液体石蜡中,滴完后,将药丸倾入滤纸上吸干石蜡油,制成1000粒,即得。穗花杉双黄酮每次10粒。每日3次。
实施例6(颗粒剂)
穗花杉双黄酮或总黄酮原料100g,糖粉400g,混合均匀,用适量乙醇制粒,干燥、整粒、分装,制成500袋,即得。穗花杉双黄酮每次0.5袋。每日3次。
Claims (9)
1、卷柏药材用30-95%的含水乙醇或甲醇(优选60-70%的乙醇或甲醇)回流提取2-3次,每次1-3小时。
2、根据权利要求1所述的乙醇或甲醇提取液经D101、D201、AB-8大孔树脂柱吸附纯化,(优选D101和AB-8树脂),再用聚酰胺柱吸附纯化。
3、根据权利要求2所述的大孔树脂柱和聚酰胺柱吸附纯化卷柏总黄酮和穗花杉双黄酮单体成分,其特征是大孔树脂柱和聚酰胺柱串联使用。
4、根据权利要求3所述的大孔树脂柱和聚酰胺柱串联使用吸附纯化卷柏总黄酮和穗花杉双黄酮单体成分的方法,其特征在于用乙醇或甲醇提取卷柏的提取液不经过浓缩,直接在大孔树脂柱上吸附纯化,经过大孔树脂柱纯化后的乙醇或甲醇提取液用去离子水调乙醇或甲醇浓度为30-60%(优选50-55%)后,直接在聚酰胺柱吸附纯化。用60-95%(优选80%)乙醇或甲醇洗脱聚酰胺柱,收集60-95%乙醇或甲醇洗脱液,回收溶剂,干燥得卷柏总黄酮。以穗花杉双黄酮为对照品测定,卷柏总黄酮的含量在85%以上。卷柏总黄酮用55-60%的乙醇或甲醇溶解、过滤,在聚酰胺柱上吸附纯化,被聚酰胺吸附部分用80%乙醇或甲醇洗脱,收集乙醇或甲醇洗脱液,加适量活性炭脱色,过滤,回收溶剂,放置析出,得穗花杉双黄酮单体成分,含量在95%以上。
5、根据权利要求4所述的高含量的卷柏总黄酮和高纯度穗花杉双黄酮具有α-葡萄糖苷酶抑制作用、降血糖作用和调血脂作用。
6、根据权利要求5所述的应用其特征在于:含有有效治疗剂量的穗花杉双黄酮或卷柏总黄酮和一种或多种药学上可接受的药用赋形剂,或可与穗花杉双黄酮或卷柏总黄酮组方的其它药物制成的制剂。
7、根据权利要求6所述的药物制剂,其特征在于优选含有1%—99%的穗花杉双黄酮或卷柏总黄酮和99%—1%的药用赋形剂或其它可组方的药物制成口服制剂的剂型。。
8、根据权利要求7所述的药物制剂,其特征在于所说的口服制剂选自于片剂、丸剂、胶囊剂、软胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、滴丸、口服液体制剂当中的任何一种。
9、权利要求8所述的药用赋形剂包括填充剂、崩解剂等,填充剂选自淀粉、乳糖、微晶纤维素、糊精、磷酸钙等;崩解剂选自羧甲基淀粉钠、羟丙纤维素、交联聚维酮;也可选加黏合剂、润湿剂和润滑剂。
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