CN101297823A - 预防和治疗老年痴呆症的药物 - Google Patents

Abstract

以卷柏科卷柏属(Selaginella)植物垫状卷柏S.pvlvinata(Hook.et Gev.)Maxim、卷柏S.tamariscina(beav.)spring和江南卷柏S.moellendorfii Hieron等为原料提取、分离卷柏总黄酮及其单一成分穗花杉双黄酮，并制成药物制剂，用于老年痴呆症的预防和治疗。

Description

预防和治疗老年痴呆症的药物

技术领域

本发明是关于卷柏总黄酮及穗花杉双黄酮的医药新用途，具体的说是卷柏总黄酮及其单一成分穗花杉双黄酮在预防和治疗老年痴呆症药物中的应用，也涉及该药物的提取分离和药物制剂，本发明属于医药技术领域。

背景技术

老年痴呆是一种中枢神经衰退性疾病。主要表现在中老年期间有进行性记忆损伤以及智力丧失，记忆障碍、抽象思维障碍、语言能力失常、行为和方向障碍等症状。其发病机理不十分清楚，是一种非常复杂的神经和细胞衰老过程。因此老年痴呆症的预防和治疗目前仍是一个世界难题。目前对老年痴呆症预防基本上是以病理特征为切入点，可分为抗β-淀粉样蛋白沉积药物，拟胆碱药物，促乙酸胆碱释放药物，细胞生长因子促进剂，脑功能改善药物等。已上市或正在进入临床研究的药物有乙酰卡尼汀、他可林、维那克林、水飞蓟素、毒扁豆碱和知母皂苷等(中草药2001年32卷8期附4-5)。已上市的药品毒副作用都较大。因此研究开发毒副作用小，安全有效的抗老年痴呆药物具有重要意义。

卷柏属植物卷柏资源丰富，我国约有50多种，民间称为“九死还魂草、长生不老草、万年青”等。全草入药，历代医家认为其能破血散瘀，活血止血，主治腹痛、闭经、吐血、便血、尿血等。现代药理及临床研究表明，卷柏属植物具有防癌治癌、抗炎、抗病毒、镇痛、降血压、降血糖、抗痛风和增强人体免疫功能等作用(国外医学植物药分册，2002年报17卷3期97-99页)，特别是含有丰富的双黄酮类成分是该属植物的一大特征。到目前为止还未发现有比卷柏属植物含有双黄酮更高的植物。本发明完成前未发现有关卷柏总黄酮及穗花杉双黄酮用于预防和治疗老年痴呆症的报道。本发明具有广泛的应用前景。

穗花杉双黄酮(amentofeavone)的结构：

发明内容

本发明的目的之一是提供卷柏总黄酮和穗花杉双黄酮在治疗和预防老年痴呆症中的应用。具体的说是卷柏总黄酮和穗花杉双黄酮用于制备防治老年痴呆药物的新用途。经动物试验，本发明的制剂具有显著改善痴呆小鼠学习记忆功能，并能明显提高SOD的活性，降低MDA的含量，提高脑系数，最终提供防治老年痴呆症安全有效的药物制剂。

本发明目的之二是提供了卷柏总黄酮及其穗花杉双黄酮的提取分离方法，以往公开的提取分离卷柏总黄酮和单体穗花杉双黄酮的方法多是以石油醚脱脂和除叶绿素等脂溶性杂质或仅限于实验室的分离，不适合产业化生产。本发明采用了安全有效的活性炭在乙醇提取液中脱脂除叶绿素等杂质的方法，可操作性强，适合工业生产。乙醇提取液回收乙醇后，在大孔树脂柱上分离之前，先调节PH值为弱酸性沉淀出卷柏双黄酮，除去大量水溶性非双黄酮类杂质。提高了大孔树脂的分离能力和分离样品的纯度。将沉淀用乙醇溶解再拌入预处理好的大孔树脂中，挥去乙醇，装在大孔树脂柱上端，再进行分离，也是本发明主要创新之一，解决了水不溶性样品在大孔树脂柱上难以分离的难题。本发明分离纯化卷柏总黄酮和穗花杉双黄酮的方法，成本低，易操作，获得的样品纯度高，卷柏总黄酮中穗花杉双黄酮含量高达35％～45％，总黄酮含量在50％以上。

利用C-18反相(常压或中低压)柱分离纯化穗花杉双黄酮单体成分也是一项新的技术。该方法分离的穗花杉双黄酮纯度高(含量98％)由于采用常压或中低压分离柱，可根据需要设计柱的规格，可大量制备高纯度穗花杉双黄酮，分离柱可反复清洗使用，易操作，在本发明申请前未见有用该方法分离纯化穗花杉双黄酮的报道。

本发明的目的之三是提供卷柏总黄酮和穗花杉双黄酮单体成分的药物制剂。主要是口服制剂，主要选自片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、混悬剂、滴丸剂，口服制剂中的任何一种。

本发明目的之四是提供药物优选含有1％-99％的穗花杉双黄酮或卷柏总黄酮和99％-1％的药用赋形剂或其它可组方的药物。本发明药物中的其它配伍的药物，指的是以有效剂量的卷柏总黄酮或穗花杉双黄酮为一定的药物原料，再配伍其它允许合用的中药或化学药品。

卷柏总黄酮、穗花杉双黄酮及其药物制剂具有预防和治疗老年痴呆疾病的作用，这些药理作用，通过以下药效学试验例得到证实。

1、卷柏总黄酮及穗花杉双黄酮对AlCl₃致小鼠记忆障碍的影响

取小鼠90只，随机分成9组，按表1分组。第1天至第7天，对照组每天皮下注射生理盐水，其余各组小鼠皮下注射AlCl3 50mg/kg。用药组分别灌胃连续给药2周。进行避暗试验，记录3min内小鼠进入暗室的错误次数，24h后以错误次数及错误百分率测验记忆成绩。

表1、卷柏总黄酮及穗花杉双黄酮对AlCl3致小鼠记忆障碍的影响(n＝10，X±S)

*与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；_△与模型组比较，_△P＜0.05，_△△P＜0.01

说明穗花杉双黄酮与卷柏总黄酮不同计量对AlCl₃致记忆障碍均有不同程度的对抗效果。减少小鼠的错误发生次数及错误发生率。

2、卷柏总黄酮及穗花杉双黄酮对东莨菪碱致小鼠记忆障碍的影响

取小鼠90只，随机分成9组，按表2分组。第1天至第7天，对照组及模型组给蒸馏水，其余各组按表2给药。每天一次，连续7天，末次给药1h后，正常组给生理盐水0.1ml/10g，其余各组给氢溴酸东莨菪碱3mg/kg，10min后进行跳台实验，训练3min，24h后进行测试成绩。结果见表2。

表2卷柏总黄酮及穗花杉双黄酮对东莨菪碱致小鼠记忆障碍的影响(n＝10，X±S)

*与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；_△与模型组比较，_△P＜0.05，_△△P＜0.01

氢溴酸东莨菪碱组小鼠错误次数较正常组显著增加，用药组明显减少了小鼠的错误次数，对氢溴酸东莨菪碱组所致的小鼠记忆障碍有明显的对抗作用。明显减少小鼠的错误发生次数及错误发生率。

3、穗花杉双黄酮及卷柏总黄酮对30％乙醇致小鼠记忆障碍的影响

取小鼠90只，随机分成9组，按表3分组。第1天至第7天，对照组及模型组给蒸馏水，其余各组按表3给药。每天一次，连续7天，末次给药1h后，正常组给生理盐水0.1ml/10g，其余各组给30％乙醇，15min后进行跳台实验，测试记录5min内每之小鼠的错误次数。结果见表3。

表3卷柏总黄酮及穗花杉双黄酮对30％乙醇致小鼠记忆障碍的影响(n＝10，X±S)

*与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；_△与模型组比较，_△P＜0.05，_△△P＜0.01

30％乙醇组小鼠错误次数较正常组显著增加，用药组除小剂量总黄酮外，其余各组对30％乙醇所致的小鼠记忆障碍有明显的对抗作用。

4、卷柏总黄酮及穗花杉双黄酮对老年痴呆模型小鼠脑线粒体超氧化物歧化酶SOD活性、丙二醛(MDA)含量及脑系数的影响。

取小鼠90只，随机分为正常对照组和模型组。模型组给AlCl₃溶液，开始70天按400mg/kg/d灌胃，以后一直用2000mg/L AlCl₃溶液饮用；正常对照组灌胃等量的蒸馏水。将模型组随机分为8组，按表4所示，灌胃给药60天，正常对照组痴呆模型组灌以量的蒸馏水。整个实验过程避免与铝制品接触。处死小鼠，于冰浴中迅速取出脑组织，并精确称取，分别测定SOD、MDA和计算脑系数。

表4对老年痴呆模型小鼠脑SOD活性、MDA含量及脑系数的影响(n＝10，X±S)

*与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；_△与模型组比较，_△P＜0.05，_△△P＜0.01

模型对照组脑SOD活性降低，MDA含量增加，脑系数减少(P＜0.05)。与模型组比较，穗花杉双黄酮高、中、低剂量组SOD活性升高，MDA含量降低，总黄酮高、中剂量组SOD活性升高，MDA含量降低(P＜0.05或P＜0.01)说明穗花杉双黄酮及总黄酮具有明显的抗氧化作用，改善自由基在体内的过量代谢。增加SOD含量，增强抗氧化能力，加速自由基的清除，抑制过氧化反应，抑制过氧化产物MDA产生及清除过量的MDA的作用，穗花杉双黄酮及总黄酮高、中剂量组脑系数显著增加，从而说明有抗脑萎缩的作用。

5、穗花杉双黄酮及卷柏总黄酮对老年痴呆模型乙酰胆碱含量的影响。

取小鼠90只，随机分为正常对照组和模型组。模型组给AlCl₃溶液，开始70天按400mg/kg/d灌胃，以后一直用2000mg/L AlCl₃溶液饮用；正常对照组灌胃等容的蒸馏水。将模型组随机分为8组，按表5所示，灌胃给药60天，正常对照组痴呆模型组灌以等体积的蒸馏水。整个实验过程避免与铝制品接触。大鼠断头处死，迅速开颅剥离脑组织(去除小脑组织)，取部分脑组织生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，加入冷生理盐水放入匀浆管在冰浴中充分研碎，制成10％的脑匀浆，离心，取上清用比色法测定脑组织乙酰胆碱酶含量。

表5穗花杉双黄酮及总黄酮对老年痴呆模型乙酰胆碱含量的影响(n＝10.X±S)

*与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；_△与模型组比较，_△P＜0.05，_△△P＜0.01

各治疗组和模型组比较，乙酰胆碱含量降低，并有显著性差异。

6、小鼠的急性毒性实验

以动物能耐受的最大给药浓度(0.5g/ml)、小鼠最大给药容积(0.4ml/10g体重)一日内灌胃给药1次，连续观察7天内有无毒性反应及动物死亡。测得结果是：小鼠7天内动物均无一死亡，在此剂量下未观察到明显急性毒性反应。其小鼠最大给药量为20g/kg体重/d。

具体实施方式

结合实施例对本发明作进一步描述，但本发明不受实施例的任何限制。

实施例1卷柏总黄酮的提取制备：

药材1kg，用30-95％乙醇(优选75％乙醇)8倍量回流提取2-3次，每次提取1～3小时，用提取液1.5％(w/v)的活性炭脱色，回收乙醇至无醇味，加去离子水调浓度至1.5g/ml药材，调ph4～5，静置24小时，抽滤或离心，取沉淀，用乙醇溶解，将乙醇可溶部分拌入预先处理好的D101或AB-8大孔树脂中，充分吸附，许挥去乙醇，将吸附样品的大孔树脂加到预先装好的大孔树脂柱上端，先用30-40％的乙醇洗脱3-4BV，再用60-70％乙醇洗脱3-4BV，收集60-70％乙醇洗脱部分，回收乙醇，干燥得卷柏总黄酮。

实施例2穗花杉双黄酮的制备

将卷柏总黄酮在C-18反相柱(常压)上分离纯化，用20-50％含水甲醇为洗脱剂，收集穗花杉双黄酮流分，薄层鉴定后合并，挥去部分溶剂，得穗花杉双黄酮结晶。

实施例3(胶囊剂)

穗花杉双黄酮或总黄酮原料100g，药用淀粉适量，混合均匀，制粒，干燥，整粒，装入1号胶囊，制成1000粒，即得。穗花杉双黄酮每次1粒、总黄酮每次2粒，每日3次。

实施例4(片剂)

穗花杉双黄酮或总黄酮原料100g，药用淀粉适量，糊精适量，混合均匀，制粒，干燥，整粒，干燥，加入润滑剂适量，压片，制成1000片，即得。穗花杉双黄酮每次1片、总黄酮每次2片。每日3次。

实施例5(滴丸剂)

称取30g聚乙二醇4000，在水浴上熔化，加穗花杉双黄酮或总黄酮原料10g，搅拌均匀，倾入保温管中，调节恒温装置，使药液在80-90℃下滴入冷却过的液体石蜡中，滴完后，将药丸倾入滤纸上吸干石蜡油，制成1000粒，即得。穗花杉双黄酮每次10粒、总黄酮每次20粒。每日3次。

实施例6(颗粒剂)

穗花杉双黄酮或总黄酮原料100g，糖粉400g，混合均匀，用适量乙醇制粒，干燥、整粒、分装，制成500袋，即得。穗花杉双黄酮每次0.5袋、总黄酮每次1袋。每日3次。

Claims (9)

1、从卷柏属植物提取制备卷柏总黄酮及其穗花杉双黄酮，其特征在于卷柏总黄酮中含有穗花杉双黄酮(amentoflavone)、异柳杉双黄酮(isocryptomixin)、扁柏双黄酮(hinokiflavone)、苏铁双黄酮(sotatsuflavone)等。

2、根据权利要求1所述的卷柏总黄酮和穗花杉双黄酮单体成分，其特征在于卷柏总黄酮中含有穗花杉双黄酮为35％～45％，以穗花杉双黄酮为对照品测定卷柏总黄酮含量在50％以上。穗花杉双黄酮单体成分纯度为98％以上。

3、根据权利要求1～2所述的卷柏总黄酮及其单体成分穗花杉双黄酮，其特征在于以卷柏属植物为药材制备卷柏总黄酮和单体穗花杉双黄酮的方法是：

(1)药材用8-10倍量30-95％的乙醇回流提取两次，每次提取时间为1～3小时，滤过，合并提取液，用1.5％(w/v)的活性炭脱色，回收乙醇至无醇味，加去离子水至1.5g/ml药材，调pH值4～5，静置24小时，抽滤或离心，取沉淀，用乙醇溶解，将乙醇可溶部分拌入预先处理好的D101或AB-8大孔树脂中，充分吸附，并挥去乙醇，将吸附样品的大孔树脂加到预先装好的大孔树脂柱上端，先用20-40％的乙醇洗脱3-4BV，再用60-70％乙醇洗脱3-4BV，收集60-70％乙醇洗脱部分，回收乙醇，干燥得卷柏总黄酮。

(2)将卷柏总黄酮在C-18反相柱(常压或中低压)上分离纯化，用20-50％含水甲醇为洗脱剂，收集穗花杉双黄酮流分，薄层鉴定后合并，挥去部分溶剂，得穗花杉双黄酮晶体。

4、根据权利要求1～3所述的卷柏总黄酮及其穗花杉双黄酮单体成分在预防和治疗老年痴呆药物中的应用。

5、根据权利要求4所述的应用其特征在于：含有有效治疗剂量的穗花杉双黄酮或总黄酮和一种或多种药学上可接受的药用赋形剂，或可与穗花杉双黄酮或总黄酮组方的其它药物制成的制剂。

6、根据权利要求5所述的药物制剂，其特征在于优选含有1％-99％的穗花杉双黄酮或总黄酮和99％-1％的药用赋形剂或其它可组方的药物。

7、根据权利要求4所述的药物制剂，其特征在于所说的药物是口服制剂的剂型。

8、根据权利要求7所述的药物制剂，其特征在于所说的口服制剂选自于片剂、丸剂、胶囊剂、软胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、滴丸、口服液体制剂当中的任何一种。

9、权利要求6所述的药用赋形剂包括填充剂、崩解剂等，填充剂选自淀粉、乳糖、微晶纤维素、糊精、磷酸钙等；崩解剂选自羧甲基淀粉钠、羟丙纤维素、交联聚维酮；也可选加黏合剂、润湿剂和润滑剂。