CN109394596A - 一种复活草提取物的制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种复活草提取物的制备方法与应用。该方法包括如下步骤：(1)向粉碎后的复活草中加入溶剂，于0～80℃条件进行提取，然后离心去除药渣，得到离心液；再将离心液浓缩并调节pH值至碱性，静置，离心，收集沉淀，得到沉淀物；(2)将沉淀物加水溶解后，调节pH值至酸性，然后脱色，得到复活草提取物。本发明的方法操作简单，提取效率高，获得的复活草提取物中的总多酚含量高，在相对密度为1.010～1.090时，复活草提取物的总多酚含量≥50mg/mL。该复活草提取物安全性好，具有显著的清除自由基、抗氧化以及促进人胚肾细胞增殖的效果，且是液体产品，方便添加到化妆品中，适合产业化推广应用。

Description

一种复活草提取物的制备方法与应用

技术领域

本发明属于植物提取化工技术领域，特别涉及一种复活草提取物的制备方法与应用。

背景技术

复活草学名叫卷柏，因其极耐干旱的本领和“死”而复生的特性，所以又名还魂草。主要分布中国、俄罗斯的西伯利亚、朝鲜半岛、日本、印度和菲律宾，等。多生于向阳的山坡岩石上，或干旱的沙漠、岩石缝中。它既可观赏，又可药用，全草有止血、收敛的效能。现有研究表明，复活草提取物具有增强细胞活力和新陈代谢、激活再生皮肤细胞、增强皮肤细胞的抗氧化性、减轻皮肤发红，对抗红疹、有加速伤口愈合及组织修复的作用、还能减缓真皮层纤维细胞的老化进程、能将老化细胞中胶原蛋白生成量提高等作用。因此，其在化妆品抗衰老领域中具在广阔的市场应用前景。

复活草植物中含有多种黄酮、生物碱、炔多酚、木脂素类、有机酸及糖类等化合物。其中总多酚作为复活草中具有抗衰老功效的重要物质，主要由炔酚类化合物和木脂素类等化合物组成。目前对于复活草中有效成分的研究主要集中在黄酮以及生物碱类化合物，未见有对复活草总多酚提取分离及其应用报道，也未见复活草总多酚关于抗衰老方面的报道。如尹胜等(中国专利ZL103588616B)从卷柏中运用多种柱色谱分离技术获得炔酚类化合物并且应用于PDE4抑制剂中；郑晓珂等(中国专利ZL101306023B)指出卷柏水提取物具有抗辐照损伤、提高机体免疫功能等作用；康文艺[精细化工2008，12(25)]用碱提酸沉法提取卷柏富含穗花衫双黄酮的酸性部位,提取部位穗花衫双黄酮的质量分数稳定在10％～12％；邱丹缨[食品工业科技，2013，10(34)]用超声法提取卷柏中的生物碱并证明含该活性部位的提取物对肝癌H22细胞有明显的抑制作用。

因此，非常有必要为复活草总多酚提供一种简单有效、方便工业化生产的制备方法以及应用。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种复活草提取物的制备方法。

本发明的另一目的在于提供所述方法制备得到的复活草提取物。

本发明的再一目的在于提供所述复活草提取物的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种复活草提取物的制备方法，包括如下步骤：

(1)向粉碎后的复活草中加入溶剂，于0～80℃条件进行提取，然后离心去除药渣，得到离心液；再将离心液浓缩并调节pH值至碱性，静置，离心，收集沉淀，得到沉淀物；

(2)将步骤(1)中得到的沉淀物加水溶解后，调节pH值至酸性，然后脱色，得到复活草提取物。

步骤(1)中所述的粉碎后的复活草的颗粒大小为10～100目；优选为20～100目。

步骤(1)中所述的溶剂为水，低碳醇，或低碳醇与水的混合溶液。

所述的低碳醇为C1～C4的有机醇；优选为甲醇、乙醇，丙二醇和丁二醇中的一种以上；更优选50％(w/w)的乙醇溶液，70％(w/w)的1，3丁二醇溶液，或乙醇与丁二醇按重量比1：1混合得到的溶液。

步骤(1)中所述的复活草与溶剂的重量比为1:20～300。

步骤(1)中所述的提取的温度优选为40～80℃。

步骤(1)中所述的提取的时间优选为60～120min。

步骤(1)中所述的浓缩为浓缩至复活草重量的0.5～3倍。

步骤(1)中所述的pH值的大小为7～12；优选为10～12；更优选为10.6～12。

步骤(1)中所述的调节pH值至碱性为采用氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化铁和氢氧化氨中的一种或两种以上混合物进行调节；优选为采用浓度为6～10％(w/w)的Ca(OH)₂溶液，浓度为10％(w/w)的Fe(OH)₃溶液或浓度为10％(w/w)的Mg(OH)₂溶液进行调节。

步骤(1)中所述的静置的时间优选为5～24h。

步骤(2)中所述的沉淀物与水的重量比为1：2～8。

步骤(2)中所述的复活草提取物在25℃条件下的相对密度为1.010～1.090，复活草提取物中的总多酚含量≥50mg/mL。

步骤(2)中所述的pH值的大小为3～6；优选为3.5～5.5。

步骤(2)中所述的调节pH值至酸性为采用盐酸、磷酸和醋酸中的一种或两种以上混合物进行调节；优选为采用浓度为5～10％(w/w)的盐酸溶液或浓度为10％(w/w)醋酸溶液进行调节。

步骤(2)中所述的脱色为采用物理方法或化学方法去除色素。

所述的物理方法为采用活性碳或树脂吸附分离去除色素；优选为通过如下方法实现：加入活性碳或树脂后，室温搅拌10～30min，再过滤去除活性碳或树脂。

所述的活性碳为果壳颗粒活性炭和/或粉状炭；优选为经过活化处理的果壳颗粒活性炭和/或粉状炭。

所述的活化处理的条件为：105℃常压条件下烘干2小时。

所述的果壳颗粒活性炭优选为202型果壳颗粒活性炭。

所述的活性碳的添加量按所述复活草重量的5～30％添加。

所述的树脂优选为D309脱色树脂；优选为经过预处理的D309脱色树脂。

所述的预处理树脂使用说明进行预处理。

所述的树脂的添加量按所述复活草重量的5～30％添加；优选为按所述复活草重量的10％添加。

一种复活草提取物，通过上述任一项所述的方法制备得到。

所述的复活草提取物的相对密度为1.010～1.090(25℃)，复活草提取物中的总多酚含量≥50mg/mL。

所述的复活草提取物在抗衰老或化妆品领域中的应用。

所述的复活草提取物的添加量占化妆品重量的1～50％；优选为占化妆品重量的5％。

所述的抗衰老领域包括用于制备抗衰老化妆品或药品领域。

所述的化妆品优选为抗衰老系列化妆品，包括膏霜乳液类，膜粉类，嗜喱类，气雾剂类，粉饼类和唇膏口红等。

一种复活草美白润肤霜，包含如下按重量百分数计的组分：

A相：

上述复活草提取物1～50％；

B相：

所述的A相中的复活草提取物的添加量优选为占所述复活草爽肤水重量的1～10％；更优选为占所述复活草爽肤水重量的5％。

所述的B相中的羊毛脂为油溶性羊毛脂。

所述的复活草美白润肤霜的制备方法，包括如下步骤：将B相中的甘油和苯氧乙醇混合后搅拌均匀，然后加入B相中的其余组分，并在80℃搅拌保温30分钟，再降温至45℃后加入A相，搅拌均匀，得到复活草美白润肤霜。

一种复活草爽肤水，包含如下按重量分数计的组分：

A相：

丁二醇3％；

B相：

上述复活草提取物1～50％；

C相：

所述的A相还含有香精。

所述的香精优选为柠檬香精。

所述的香精的添加量优选为占所述复活草爽肤水重量的0.1％。

所述的B相中复活草提取物的添加量优选为占所述复活草爽肤水重量的1～10％；更优选为占所述复活草爽肤水重量的5％。

所述的C相中还含有防腐剂。

所述的防腐剂优选为杰马BP。

所述的防腐剂的添加量优选为占所述复活草爽肤水重量的0.3％。

所述的C相中透明质酸的分子量优选为120万。

所述的复活草爽肤水的制备方法，包括如下步骤：将C相中甘油、透明质酸和卡波加入到水中，搅拌均匀，然后加入C相中的其余组分并升温到80℃搅拌保温30分钟，再降温至45℃后加入A相，搅拌均匀后加入B相，搅拌均匀，得到复活草爽肤水。

所述的复活草提取物在制备促进细胞增殖的药物中的应用。

所述的细胞优选为人胚肾细胞；更优选为293T人胚肾细胞。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1、本发明提供了一种复活草提取物的制备方法，包括：将复活草粉末用醇水提取，提取液通过调节pH值进行成盐沉淀后收集沉淀物，把沉淀物脱色处理后得到提取物。该提取方法效率高，对复活草的总多酚类化合物破坏少，该方法制备的复活草提取物总多酚含量高，有助于复活草提取物在抗衰老作用的发挥，在相对密度为1.010～1.090时，复活草提取物的总多酚含量≥50mg/mL。并且，该提取方法易于操作，适用于产业化推广应用。功效实验证明，本发明制备的复活草提取物具有显著的清除自由基、抗氧化以及促进293T人胚肾细胞增殖效果，且是液体产品，方便在抗衰老系列化妆品中应用添加。

2、本发明利用螯合沉淀原理，在碱性条件下把总多酚成盐沉淀出来，然后在酸性条件下，成盐的总多酚分解复溶在液体中，但是鞣质、部分蛋白质、有机酸、极性色素、多糖等结合了金属离子成盐后在酸性条件下却不能分解/复溶，从而保证获得了纯度较高的复活草多酚提取物。与现有技术相比，是简单的沉淀溶解过程，对仪器设备以及生产场所要求不高，节能环保，适合于工业化生产，值得进一步推广。

3、本发明的复活草提取物的功效实验结果证明，该提取方法提取的复活草提取物安全性好，具有显著抗衰老效果，且是液体产品，方便在化妆品中应用添加，在化妆品中的添加量为1～50％，其可以在水剂，膏霜乳液类，膜粉类，嗜喱类，气雾剂类，粉饼类，唇膏口红等化妆品中的应用添加。

附图说明

图1为细胞培养后经Edu染色后的效果图。

图2为细胞培养后经DAPI染色后的效果图。

图3为细胞培养后经Edu、DAPI染色后两张重叠对比图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备；除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。本发明所用复活草药材购自广州市药材公司中药饮片厂，符合中国药典标准要求。本发明中所有试剂，包括滴定液、试液的浓度等均符合中国药典的标准。

实施例1

将100g复活草药材粉碎成40目粉未，加入3kg的50％(W/W)的乙醇溶液，在60℃条件下搅拌提取120分钟，离心除去药渣，离心液浓缩至200g后加入10％(w/w)浓度的Ca(OH)₂溶液调节pH值至12.0，静置过夜，离心，收集沉淀，沉淀加入150g纯水，60℃搅拌溶解后，加入10％(w/w)盐酸溶液，调节pH值至4.0，加入己活化处理(105℃常压烘干2小时)的5g颗粒型活性碳(江苏诚森炭业科技有限公司202型果壳颗粒活性炭)，室温搅拌30分钟后过滤去除活性碳，即为复活草提取物，此时测得相对密度为1.045(25℃)。

实施例2

将5kg复活草药材，粉碎成70目粉未，加入100kg的70％(W/W)的1，3丁二醇溶液，在80℃条件下搅拌提取60分钟，离心除去药渣，离心液浓缩至15kg后加入10％(w/w)浓度的Fe(OH)₃溶液调节pH值至11.5，静置5小时，离心，收集沉淀，沉淀加入5kg纯水，80℃搅拌溶解后，加入5％(w/w)盐酸溶液，调节pH值至4.5，加入己处理干净(处理方法按树脂的使用说明操作)的500g D309脱色树脂(上海争光树脂厂)，室温搅拌30分钟后过滤去除树脂，即为复活草提取物，此时测得相对密度为1.068(25℃)。

实施例3

将1kg复活草药材粉碎成100目粉未，加入100kg的丙二醇，在70℃条件下提取120分钟，离心除去药渣，离心液浓缩至0.5kg后加入10％(w/w)浓度的Mg(OH)₂溶液调节pH值至10.6，静置24小时，离心，收集沉淀，沉淀加入5kg纯水，70℃搅拌溶解后，加入10％(w/w)醋酸溶液，调节pH值至5.0，加入己活化处理(105℃常压烘干2小时)的300g活性碳(江苏诚森炭业科技有限公司，粉状炭)，70℃保温搅拌60分钟后过滤去除活性碳，即为复活草提取物，此时测得相对密度为1.023(25℃)。

实施例4

将1kg复活草药材粉碎成20目粉未，加入150kg乙醇/丁二醇(1：1，W/W)溶液，在40℃条件下搅拌提取90分钟，离心除去药渣，离心液浓缩至2.3kg后加入6％(w/w)浓度的Ca(OH)₂溶液调节pH值至12.0，静置8小时，离心，收集沉淀，沉淀加入2kg纯水，80℃搅拌溶解后，加入5％(w/w)盐酸溶液，调节pH值至3.5，加入活化处理(105℃常压烘干2小时)的50g的活性碳(江苏诚森炭业科技有限公司，粉状炭)，室温搅拌30分钟后过滤去除活性碳，即为复活草提取物，此时测得相对密度为1.040(25℃)。

实施例5

将1kg复活草药材粉碎成50目粉未，加入300kg的纯水，在65℃条件下搅拌提取100分钟，离心除去药渣，离心液浓缩至2.8kg后加入10％(w/w)浓度的Ca(OH)₂溶液调节pH值至11.0，静置12小时，离心，收集沉淀，沉淀加入1kg纯水，80℃搅拌溶解后，加入5％(w/w)盐酸溶液，调节pH值至5.5，加入己活化处理(105℃常压烘干2小时)的100g颗粒型活性碳(江苏诚森炭业科技有限公司202型果壳颗粒活性炭)，室温搅拌10分钟后过滤去除活性碳，即为复活草提取物，此时测得相对密度为1.073(25℃)。

对比例1

同实施例3，区别在于提取离心后直接浓缩，无后续工序。

将1kg复活草药材粉碎成100目粉未，加入100kg的丙二醇，在70℃条件下提取120分钟，离心除去药渣，离心液浓缩至密度为1.023(25℃)。

对比例2

同实施例5，区别在于加入纯水后在100℃条件下搅拌提取。

将1kg复活草药材粉碎成50目粉未，加入300kg的纯水，在100℃条件下搅拌提取100分钟，离心除去药渣，离心液浓缩至2.8kg后加入10％(w/w)浓度的Ca(OH)₂溶液调节pH值至11.0，静置12小时，离心，收集沉淀，沉淀加入1kg纯水，80℃搅拌溶解后，加入5％(w/w)盐酸溶液，调节pH值至5.5，加入己活化处理(105℃常压烘干2小时)的100g颗粒型活性碳(江苏诚森炭业科技有限公司202型果壳颗粒活性炭)，室温搅拌10分钟后过滤去除活性碳，即为复活草提取物，此时测得相对密度为1.073(25℃)。

实施例6

一种复活草美白润肤霜，由如下按重量百分数计的组分组成:

A相：

实施例3中制备的复活草提取物5％

B相：

其中，羊毛脂为旭星，油溶性羊毛脂。

取B相中的甘油和苯氧乙醇，预先搅拌均，然后加入B相中的其余物质，在80℃搅拌保温30分钟，降温至45℃后加入A相，得到复活草美白润肤霜。

实施例7

一种复活草爽肤水，由如下按重量百分数计的组分组成：

A相：

丁二醇3％；

柠檬香精(芬美意)0.1％；

B相：

实施例1中制备的复活草提取物3.5％；

C相：

其中，透明质酸的分子量为120万。

取C相中的水、甘油、透明质酸和卡波预先溶胀(将水、甘油、透明质酸和卡波搅拌均匀)后，然后加入C相中的其余物质并升温到80℃搅拌保温30分钟，降温至45℃后加入A相(己混均)，搅拌均匀后加入B相，搅匀，得到复活草爽肤水。

实施例8总多酚含量测试

1.福林试液的配制：取钨酸钠10g与钼酸钠2.5g，加水70ml、85％(w/w)磷酸5ml与盐酸10ml，置200ml烧瓶中，缓缓加热回流10小时，放冷，再加硫酸锂15g、水5ml与溴滴定液1滴煮沸约15分钟，至溴除尽，放冷至室温，加水使成100ml。过滤，滤液作为贮备液。置棕色瓶中，于冰箱中保存。临用前，取贮备液2.5ml，加水稀释至10ml，摇匀，即得。

2.Na₂CO₃溶液的配制：取Na₂CO₃·10H₂O 15.0克，用纯水定容至100ml，摇匀即得。

3.标准曲线绘测：

(1)用10mL 95％(v/v)乙醇溶液溶解0.5000g没食子酸，定容至100mL，分别移取0.1ml、0.5ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、5.0ml到100mL容量瓶中，用蒸馏水定容，得到没食子酸样品液；

(2)取步骤(1)中得到的没食子酸样品液0.5ml，加入福林试液0.5ml，摇匀，静置5分钟后加入1.0ml Na₂CO₃溶液，摇匀静置30分钟后，在765nm波长下测定吸光度。每个浓度做三个平行试验，取平均值，求得标准曲线。

4.样品测定：分别将实施例1～5中制备的复活草提取物(0.5ml)替换步骤3(2)中的样品液，重复步骤3(2)的操作，测定其吸光度，每个样品做三个平行试验，取平均值，根据标准曲线方程计算样品中的多酚含量。

5.实验结果：结果如表1所示。

表1总多酚含量测定结果

从表1可看出，实施例1～5在最终产品相对比重1.010～1.090范围内，总多酚含量≥50mg/ml。对比例2中，由于高温(100℃)作用，总多酚被分解，导致含量降低。

实施例9清除DPPH自由基能力测定

材料：DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)，无水乙醇(分析醇)。

仪器：分光光度计。

1.1DPPH贮备液的制备：准确称取DPPH试剂3.5mg，用无水乙醇溶解，并定量转入10mL容量瓶中，用无水乙醇定容至10mL，然后取2mL至100ml容量瓶中，并定容至100mL，摇匀得浓度为0.0178mmol/L DPPH贮备液，置于冰箱中冷藏备用。

1.2样品液的配制：实施例1～5及对比例1～2中制备的复活草提取物用纯水稀释至5％(W/W)，加无水乙醇配成1mg/mL浓度，即得。

1.3测量

A₀值的测量：取DPPH贮备液2mL加入到小试管(或玻璃瓶)中，加无水乙醇1mL，充分混合，于519nm处测A₀值。

A值的测量：取DPPH贮备液2mL加入到小试管(或玻璃瓶)中，加样品液300μL，再加(300～1000)μL无水乙醇，混合，静置30分钟后，于519nm处测A值。

清除率的计算公式：(A₀-A)/A₀×100％。

1.4结果：结果如表2所示。

表2 DPPH自由基清除率结果

表2为试样在浓度5％(W/W)下的试验结果，表明在添加浓度5％情况下，上述实施例1-5制备的复活草提取物具有70％以上的DPPH自由基清除率效果，而对比例1～2效果与实施例1～5有显著性差异。

实施例10清除超氧阴离子自由基(O2·-)

采用邻苯三酚自氧化法。

试剂：Tris-HCl缓冲液、邻苯三酚，HCl，均为分析纯。

仪器：紫外分光光度计(岛津UV-1800)；微量移液器(Eppendorf)。

实验过程：

取4.50mL 0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液(PH8.2)于具塞试管中，于25℃恒温20min，加入1ml样品(实施例1～5中制备的复活草提取物)溶液，再加入0.40mL 50.0mmol/L邻苯三酚溶液，混匀后于25℃恒温反应4min，立即加入0.10mL 8.0mol/L HCl终止反应。以蒸馏水做参比，在320nm处测定吸光度值。每个样品平均测定3次，按下式计算清除率。

清除率(％)＝[1-(A_样品-A_样品空白)/A_空白]×100％

式中：

A空白—加邻苯三酚但不加样品的吸光度；

A样品—加邻苯三酚和样品的吸光度；

A样品空白—不加邻苯三酚只加样品的吸光度。

实验结果：结果如表3所示。

表3清除超氧阴离子实验结果

实施例11总抗氧化能力测定

用FRAP法。

试剂：FRAP工作液(300mmol/L醋酸盐缓冲液)，10mmol/L TPTZ(2,4,6-三吡啶基三嗪)，20mmol/L FeCl₃，现配现用。

仪器：紫外分光光度计(岛津UV-1800)；微量移液器(Eppendorf)。

1.试剂配置

FRAP工作液配制：0.3M pH3.6醋酸缓冲液：0.364g无水醋酸钠+3.2mL冰乙酸，定容至200mL，用1M HCl溶液调节pH至3.6；

10mmol/L TPTZ溶液25mL：0.078g TPTZ用40mM盐酸溶液定容至25mL；20mmol/LFeCl₃溶液50mL：2.78g用RO水定容至50mL；

上述溶液以10:1:1的体积比混合(现配现用)。

2.试样：取样品(样品为：实施例1～5中制备的复活草提取物用纯水稀释至5％(W/W)，VC用纯水稀释至5％(W/W)，茶多酚用纯水稀释至5％(W/W))，用纯水稀释至10mg/ml浓度，即得。

3.取样品溶液，适当稀释后用移液器取100μl，加入FRAP工作液3ml，混匀反应20min，于593nm处读取吸光度，以FeSO₄为标准物质绘制标准曲线，求得回归方程，根据样品A值，从回归方程求得样品的抗氧化能力，以FRAP值表示，1FRAP单位＝1mmol/LFeSO₄，即样品的抗氧化能力相当于FeSO₄的mmol/L数。

4.结果：结果如表4所示。

表4总抗氧化能力测定结果

样品	实施例1	实施例2	实施例3	实施例4	实施例5	VC	茶多酚	对比例1	对比例2
										FRAP	12.8	12.4	10.3	13.2	14.9	13.6	8.1	7.2	6.7

VC：维生素C，食品级，99.5％；

茶多酚：医药级，总酚含量99％。

上述试验浓度均为5％(W/W)添加量。FRAP值越大表明抗氧化物质还原三价铁生成的二价铁越多，即样品抗氧化活性越强。结果表明，本发明复活草提取物总抗氧化能力与VC相当，优于茶多酚。对比例1～2抗氧化能力均与实施例有较大差别。

实施例12细胞增殖率测定

试剂配制：称取MTT固体粉末0.5g，溶于100mL PBS缓冲液中，用灭菌的0.22um滤膜过滤后分装于EP管(每管1mL)中，-20℃保存，配制过程注意避光。

样品液配置：取实施例2中制备的复活草提取物，用纯水稀释成1.0％，3.0％，5.0％，10.0％(w/w)浓度的样品液。

细胞悬液的制作：将处于对数期的293T人胚肾细胞(购自上海研谨生物科技有限公司)按照传代的方法制成5*10⁴/ml浓度的细胞悬液。利用血球计数板进行计数。

样品测定：将上述培养好的细胞悬液利用多道移液枪加入96孔板中，培养24h后进行加样。每个样品加入体积为20μl，每个浓度设不加样品的对照孔，同时以只加样品为对照，以纯水为空白对照。3个平行实验。

MTT显色测定：样品作用24h后，弃去培养基，并用PBS缓冲液清洗1遍，每孔加入MTT20μl，继续孵育4h后，每孔加入150μl DMSO(二甲基亚砜)，震荡10min使其充分溶解后于492nm测定吸光度。以样品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制生长曲线。细胞增殖率％＝(OD_{加样细胞孔}一OD_{加样对照孔})/(OD_{空白细胞孔}一OD_{空白对照孔})×100％；式中，

OD_{加样细胞孔}：细胞中加入样品的OD值；

OD_{加样对照孔}：只加入样品的OD值；

OD_{空白细胞孔}：细胞中不加入样品的OD值；

OD_{空白对照孔}：空白对照的OD值。

实验结果如表5及图1～3所示；其中，图1为加样细胞培养后经Edu(5-乙炔基-2'-脱氧尿苷)染色后的效果图(10×10拍照效果图)，图2为加样细胞培养后经DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)染色后的效果图，图3为加样细胞培养后经Edu、DAPI染色后两张重叠对比图。

表5 293T人胚肾细胞增殖率测定结果

浓度	1.0％	3.0％	5.0％	10.0％
					细胞增殖率％	25.3±0.6	39.6±1.1	47.6±0.7	58.1±0.8

从表5及附图1～3可知，本发明复活草提取物具有较好的细胞增殖效果，而且随着浓度的增加，增殖率呈上升趋势。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种复活草提取物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)向粉碎后的复活草中加入溶剂，于0～80℃条件进行提取，然后离心去除药渣，得到离心液；再将离心液浓缩并调节pH值至碱性，静置，离心，收集沉淀，得到沉淀物；

(2)将步骤(1)中得到的沉淀物加水溶解后，调节pH值至酸性，然后脱色，得到复活草提取物。

2.根据权利要求1所述的复活草提取物的制备方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的溶剂为水，低碳醇，或低碳醇与水的混合溶液；其中，所述的低碳醇为C1～C4的有机醇；

步骤(1)中所述的pH值的大小为7～12；

步骤(2)中所述的pH值的大小为3～6。

3.根据权利要求2所述的复活草提取物的制备方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的溶剂为甲醇、乙醇，丙二醇和丁二醇中的一种以上；

步骤(1)中所述的pH值的大小为10～12；

步骤(2)中所述的pH值的大小为3.5～5.5。

4.根据权利要求1所述的复活草提取物的制备方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的提取的温度为40～80℃；

步骤(1)中所述的提取的时间为60～120min；

步骤(1)中所述的复活草与溶剂的重量比为1:20～300；

步骤(1)中所述的浓缩为浓缩至复活草重量的0.5～3倍；

步骤(2)中所述的沉淀物与水的重量比为1：2～8。

5.根据权利要求1所述的复活草提取物的制备方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的脱色为采用物理方法或化学方法去除色素；

所述的物理方法为采用活性碳或树脂吸附分离去除色素；具体为：加入活性碳或树脂后，室温搅拌10～30min，再过滤去除活性碳或树脂；

所述的活性碳为经过活化处理的果壳颗粒活性炭和/或粉状炭；其活化处理的条件为：105℃常压条件下烘干2小时；

所述的活性碳的添加量按所述复活草重量的5～30％添加；

所述的树脂为D309脱色树脂；

所述的树脂的添加量按所述复活草重量的5～30％添加。

6.根据权利要求1所述的复活草提取物的制备方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的粉碎后的复活草的颗粒大小为10～100目；

步骤(1)中所述的调节pH值至碱性为采用氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化铁和氢氧化氨中的一种或两种以上混合物进行调节；

步骤(1)中所述的静置的时间为5～24h；

步骤(2)中所述的调节pH值至酸性为采用盐酸、磷酸和醋酸中的一种或两种以上混合物进行调节；

步骤(2)中所述的复活草提取物在25℃条件下的相对密度为1.010～1.090；复活草提取物中的总多酚含量≥50mg/mL。

7.一种复活草提取物，其特征在于：通过权利要求1～6任一项所述的方法制备得到。

8.权利要求7所述的活草提取物在抗衰老或化妆品领域中的应用。

9.一种复活草美白润肤霜，其特征在于：包含如下按重量百分数计的组分：

A相：

权利要求7所述的复活草提取物1～50％；

B相：

所述的B相中的羊毛脂为油溶性羊毛脂；

所述的复活草美白润肤霜的制备方法，包括如下步骤：将B相中的甘油和苯氧乙醇混合后搅拌均匀，然后加入B相中的其余组分，并在80℃搅拌保温30分钟，再降温至45℃后加入A相，搅拌均匀，得到复活草美白润肤霜。

10.一种复活草爽肤水，其特征在于：包含如下按重量分数计的组分：

A相：

丁二醇 3％；

B相：

权利要求7所述的复活草提取物 1～50％；

C相：

所述的A相还含有香精；

所述的香精为柠檬香精；

所述的香精的添加量为占所述复活草爽肤水重量的0.1％；

所述的C相中还含有防腐剂；

所述的防腐剂为杰马BP；

所述的防腐剂的添加量为占所述复活草爽肤水重量的0.3％；

所述的复活草爽肤水的制备方法，包括如下步骤：将C相中甘油、透明质酸和卡波加入到水中，搅拌均匀，然后加入C相中的其余组分并升温到80℃搅拌保温30分钟，再降温至45℃后加入A相，搅拌均匀后加入B相，搅拌均匀，得到复活草爽肤水。