CN102585029B

CN102585029B - 一种生理活性三七多糖的制备方法及其应用

Info

Publication number: CN102585029B
Application number: CN201210058942.6A
Authority: CN
Inventors: 杨崇仁; 丁艳芬; 李江霞; 王东; 张颖君
Original assignee: YUXI WINHEY BIO-TECH Co Ltd
Current assignee: YUXI WINHEY BIO-TECH Co Ltd
Priority date: 2012-03-08
Filing date: 2012-03-08
Publication date: 2014-03-12
Anticipated expiration: 2032-03-08
Also published as: CN102585029A

Abstract

本发明是一种具有生理活性的三七多糖的制备方法及其应用。该方法应用树脂柱层析、活性碳和膜分离技术纯化等步骤，精制纯化得到三七多糖。用本发明的制备方法得到的三七多糖具有蛋白质、重金属和灰分低，质量稳定的特点，并具有调节免疫、保护肝损伤、降低血糖、抗肿瘤等生理活性，可单独或组合作为天然药物和健康产品的原料。本发明提供的三七多糖制备方法操作简单，适于工业化生产，且成本低，达到节能降耗，实现中国名贵中药三七的综合开发、可持续利用的目的。

Description

一种生理活性三七多糖的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及天然药物制备技术领域，具体地说是一种具有生理活性的三七多糖的制备方法及其应用。

背景技术

三七（Panax notoginseng (Burk.) F.H.Chen），又名田七、金不换等，为五加科(Araliaceae)人参属(Panax)植物。三七为名贵中药，利用历史悠久。三七的主要活性成分为皂苷，已进行工业生产，并开发多种产品。近代药理学研究表明，除皂苷外，三七多糖亦有显著的生理活性。目前，三七多糖的提取多采取简单的提取、醇沉、浓缩、干燥等步骤。生产的三七多糖纯度低，重金属（特别是砷）和灰分含量过高，影响终端产品的质量。中国专利公开了三七多糖提取分离方法（申请号01108493.6和CN1329094A），即为三七粗多糖的制备方法，未进行纯化和精制。应用现代技术，工业化生产具有生理活性三七多糖，对于三七资源的综合利用，促进三七产业的持续发展均有积极的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种生理活性三七多糖的制备方法及其应用。

本发明的制备方法通过纯化和精制等步骤，得到三七多糖。按本发明制得的三七多糖具有含量高，蛋白质、重金属和灰分低，质量稳定，有显著生理活性等特点。本发明提供的制备方法生产周期短，所用溶剂为水及乙醇，安全无毒，成本低，易于工业化生产。

本发明提供的三七多糖的制备方法，其具体步骤如下：

三七的地下部位（根茎、主根、支根和须根）粉碎，过20目筛的颗粒，用乙醇提取三七总皂苷后，挥去残留乙醇，加入6-10倍质量的水，于80-100℃加热提取三次，提取液合并，置于离心机中，在5000-15000rm转速下高速离心10-15分钟。离心后的清液从经过预处理的树脂层析柱柱顶加入，上柱流速0.3-1.0 BV/h。提取液加入后，用相当于层析柱体积的1.0-2.0 BV的纯化水冲洗，流速为0.5-1.0 BV/h。合并洗脱液，洗脱液通过截留分子量300-500的芳香聚酰胺平板式超滤膜，截留液相对密度1.02-1.03，超滤液加入3-5倍的乙醇静置，沉淀，离心。沉淀物用水溶解至截留液相对密度1.02，喷雾干燥，得到三七多糖。

上述过程中：上树脂层析柱后可用活性炭脱色，活性炭用量为三七质量百分比的4-5%，在温度45℃以上搅拌30分钟，过滤，离心，合并清液。

按上述步骤使用的树脂须进行预处理。预处理方法为：将树脂用水浸泡，过滤，装入层析柱，用75-98%乙醇饱和，静置15～36h后，顺序用乙醇冲洗，至乙醇液用水稀释后不混浊，用水冲洗，至无乙醇，用相当于树脂体积0.5～5倍的质量浓度为3-5%盐酸洗涤，用水洗至中性，用相当于树脂体积0.5～5倍的质量浓度为1～8%氢氧化钠洗涤，用水洗至中性，至HPLC检测无有机物质残留。

按本发明提供的制备方法得到的三七多糖为淡黄色粉末，溶于水，不溶于乙醇、甲醇、丙酮等有机溶剂，水溶液为中性，pH=7.0。三七多糖按常法水解，用HPLC测定单糖组成，为半乳糖醛酸，半乳糖，葡萄糖醛酸，阿拉伯糖，葡萄糖,鼠李糖。其单糖的组成比例为：63:21:7:5:2:2。

三七多糖的红外光谱（IR）显示：3431.02 cm^-1为O-H伸缩振动的吸收，2928.25 cm^-1为C-H伸缩振动的吸收,这两组吸收峰是多糖的特征峰；1646.62cm^-1为C=O的伸缩振动的吸收峰，1400-1200cm^-1为C-H的变角振动的吸收峰，1200-1000 cm^-1是吡喃糖环的C-O（C-O-C和C-O-H）伸缩振动的吸收峰（图1）。

三七多糖的¹³C核磁共振谱(¹³C-NMR)显示：D-吡喃半乳糖的化学位移[δ 92.5 (C-1 ), 69.61 ( C-2 ), 70.13 ( C-3 ), 71.05 (C-4), 71.50 (C-5), 62.71 (C-6) ]；D-葡萄吡喃糖的化学位移[δ 94.74 (C-1), 74.90 (C-2), 77.05 (C-3), 70. 13 (C-4), 76.76 (C-5), 61. 71 (C-6) ]；D-吡喃半乳糖醛酸甲酯和D-葡萄吡喃糖醛酸的甲酯碳的化学位移（δ 215.55, 215.69, 215.81）；D-吡喃阿拉伯糖的化学位移[δ 104.88 (C-1) ,71. 13 (C-2) ,73. 75 (C-3 ) ,70. 13 (C-4), 64. 43 (C-5)] （图2）。

三七多糖经部分降解，制备寡糖，证明具有β-D-半乳吡喃糖基（1-3）-[α-L-阿拉伯呋喃糖基（1-6）]-β-D-半乳吡喃糖的寡糖单元结构。

按本发明提供的制备方法得到的三七多糖经药理学实验研究，结果表明，三七多糖具有调节免疫功能、保护肝损伤、促进骨缺损修复、抑制肿瘤、降低血糖、抗病毒等作用。

以下为实验研究的情况：

1、三七多糖增强创伤大鼠免疫功能的作用

创伤引起机体代谢和免疫功能紊乱，增加感染几率，诱发多器官衰竭。免疫抑制与创伤的严重程度及炎症反应成正比。表现为外周血淋巴细胞减少，功能降低，CD4 细胞减少，CD4 ／CD8 比值减少，自然杀伤细胞(NK)和淋巴因子激活杀伤细胞活力下降，由T细胞产生的白细胞介素-2（IL-2）水平降低。及时提供早期肠内营养支持（EN）治疗，能减轻肠黏膜萎缩，防止细菌移位，维护肠道屏障，纠正免疫功能异常，降低死亡率。

创伤模型大鼠在实施EN治疗的同时，加入三七多糖，观察三七多糖对机体免疫功能的影响。实验结果表明，仅提供蛋白质和热量的标准肠道营养支持（EN）对创伤机体免疫功能恢复虽有一定作用，但未能起到明显的促进作用。三七多糖可调节NK细胞，促进巨噬细胞活性，提高脾脏空斑形成细胞的数量。在提供EN的同时，加入三七多糖，不仅CD₄细胞数量和CD₄／CD₈ 比值均明显高于创伤组。而且血清的白细胞介素IL-2水平显著高于EN治疗组。加入三七多糖有利于创伤机体免疫抑制的全面恢复（表3,4）。

表3 创伤大鼠T细胞表型含量变化

组别	大鼠数量（只）	CD₄ ⁺（%）	CD₈ ⁺（%）	CD₄ ⁺/CD₈ ⁺
					正常组	10	46.92±4.45	22.21±2.09	2.12±0.13
创伤组	10	36.45±4.34	21.85±1.47	1.72±0.19
					EN组	10	41.98±3.73	22.22±1.75	1.98±0.10
三七多糖组	10	43.18±4.64	22.52±2.01	2.19±0.14

表4 创伤大鼠血清的白细胞介素IL-2含量变化

组别	大鼠数量（只）	IL-2（ng/L）	淋巴细胞(%)
				正常组	10	97.07±7.78	83.72±5.21
创伤组	10	80.76±6.61	81.08±6.71
				EN组	10	87.45±6.93	84.07±5.43
三七多糖组	10	92.81±9.43	79.94±5.40

2、三七多糖对小鼠免疫功能的促进作用

采用脾淋巴细胞转化实验(MTT法)，检测三七多糖对小鼠的细胞免疫的影响，结果提示，三七多糖有增强小鼠淋巴细胞增殖能力（表5）。二硝基氟苯(DNFB)诱导的小鼠迟发性变态反应（DTH）试验结果表明，三七多糖可增强小鼠产生抗体生成细胞的能力（表5）。

体液免疫功能试验：检测抗体生成细胞空斑数，结果提示，三七多糖具有增强小鼠产生抗体生成细胞的能力（表6）。测定NK细胞活性的结果表明，三七多糖具有增强小鼠NK细胞活性的作用（表7）。

表5 三七多糖的细胞免疫功能

组别	光密度差	P值	肿胀度（mg）	P值
					对照组	0.063±0.028	-	15.06±3.12	-
100mg/kg,wt组	0.076±0.019	>0.05	19.35±3.39	>0.01
					200mg/kg,wt组	0.540±0.025	>0.01	19.42±2.81	>0.01
600mg/kg,wt组	0.064±0.012	>0.05	20.91±4.40	>0.01

表6 三七多糖的体液免疫功能

组别	空斑数/10⁶脾细胞	P值	半数溶血数(HC₅₀)	P值
					对照组	111.6±51.8	-	108.00±11.14	-
100mg/kg,wt组	207.8±57.4	>0.01	115.09±6.62	>0.05
					200mg/kg,wt组	181.3±59.7	>0.01	110.77±8.68	>0.05
600mg/kg,wt组	169.7±61.9	>0.01	108.56±4.88	>0.05

表7 三七多糖的NK细胞活性

组别	NK细胞活性（%）	P值
			对照组	41.3±25.2	-
100mg/kg,wt组	45.4±28.0	>0.05
			200mg/kg,wt组	73.1±21.7	>0.01
600mg/kg,wt组	80.1±23.8	>0.01

3、三七多糖对肝损伤的保护作用

四氯化碳（CCl₄）和D-氨基半乳糖（D-Gal）诱发的实验性肝损伤动物模型在功能和形态变化方面与临床病毒性肝炎类似。ALT和AST为高度器官特异性酶，主要分布于肝细胞中。肝细胞受损时从细胞内渗入血液，导致血清酶活性升高，其水平可间接反映肝细胞受损程度，是评价肝功能损害的灵敏指标。慢性肝损伤病理改变特点为结缔组织增生和胶原纤维形成。羟脯氨酸为胶原纤维所特有，羟脯氨酸含量可反映肝脏纤维化程度。

采用ICR小鼠，随机分为正常对照组、肝损伤模型组、阳性对照组、三七多糖组，ig给药后，摘除眼球取血，分离血清，并取肝脏，测定相关指标，结果表明，三七多糖对CCL4和D-GalN所致的小鼠急性肝损伤和CCL4所致慢性肝损伤血清ALT和AST升高有显著的抑制作用，对实验性肝损伤有明显保护作用。三七多糖能显著降低小鼠慢性肝损伤肝组织羟脯氨酸及胶原蛋白含量，减轻肝纤维化程度，对慢性肝损伤有防治作用。三七多糖能显著降低肝组织MDA水平，具有抗脂质过氧化作用（表8-11）。病理照片如图3。

表8 NPS对CCL4所致小鼠急性肝损伤的影响 (n=10, x±s)

分组	ALT （U/L）	AST （U/L）	MDA （nmol/g肝组织）
				正常对照组	38.1±4.7	119.8±26.9	236.6±60.4
三七多糖125mg/kg/d	62.1±21.2*	136.4±29.6	312.4±110.2*
				250mg/kg/d	45.1±15.1**	112.6±30.8*	174.9±42.2**
500mg/kg/d	41.7±12.3**	162.3±31.7	282.0±70.8**
				联苯双酯 0.2g/kg	30.1±5.5**	111.3±33.4*	312.5±142.4*
CCL4模型对照组	95.0±32.9	162.6±32.9	477.9±176.4

与模型组比 * P＜0.05 ** P＜0.01

表9 三七多糖对D-GalN所致小鼠急性肝损伤的影响 (n=10, x±s)

分组	ALT （U/L）	AST （U/L）	MDA（nmol/g肝组织）
				正常对照组	25.8±16.5	110.7±14.2	320.1±67.9
三七多糖 125mg/kg/d	90.1±33.7	154.8±40.3	459.6±179.7
				250mg/kg/d	79.6±36.9	158.9±63.1	387.8±86.8*
500mg/kg/d	49.6±25.3**	113.4±36.7**	552.9±170.5
				联苯双酯 0.2g/kg	56.8±22.3**	153.9±38.2	331.1±89.1**
D-GalN模型对照组	91.4±17.5	190.6±31.3	552.9±146.3

与模型对照组比 *P＜0.05 **P＜0.01

表10 三七多糖对CCL4小鼠慢性肝损伤血清ALT、AST的影响 (n=10, x±s)

分组	ALT （U/L）	AST （U/L）
			正常对照组	27.0±7.8	64.3±9.2
三七多糖 250mg/kg/d	759.5±226.8**	385.0±82.8**
			500mg/kg/d	859.5±298.0*	407.5±67.2*
联苯双酯 0.2g/kg	345.0±125.2**	361.0±79.2**
			CCL4模型对照组	1222±404.5	519.0±64.8

与模型对照组比 *P＜0.05 **P＜0.01

表11 三七多糖对CCL4小鼠慢性肝损伤肝组织MDA、HyP含量的影响 (n=10, x±s)

与模型对照组比 *P＜0.05 **P＜0.01

4、三七多糖的骨损伤修复作用

自固化磷酸钙人工骨(CPC)为新型生物材料，植入骨内能与宿主骨形成牢固的骨性愈合，修复骨缺损，具有骨引导作用，但无骨诱导作用。大鼠牙骨缺损模型试验结果表明，三七多糖与CPC的复合材料在体内可使炎症反应轻，组织修复过程短，不出现组织坏死。骨缺损区骨与软骨比例升高，对骨缺损的修复有促进作用（表12）。

表12 骨缺损区修复中骨或软骨的比例( ±s，％)

组别	大鼠数	2周	4周	8周
					模型组	5	10.06±0.07	23.54±0.42	38.60±1.24
CPC组	5	12.93±0.14	39.76±0.53	58.81±0.69
					三七多糖组	5	15.29±0.39	47.24±0.60	60.65±1.81

5、三七多糖对动物移植性肿瘤生长的影响

三七多糖剂量100mg/kg及 200mg/kg，每日一次，连用8天，对动物移植性肿瘤肉瘤S₁₈₀实体型的瘤重抑制率分别为23.8%及37.3% ,大剂量组与对照组相比具有明显差异（p＜0.05）。

三七多糖剂量100mg/kg及 200mg/kg，每日一次，连用8天，对动物移植性肿瘤肝癌（H ₂₂）的瘤重抑制率分别为34.6%及46.5% ，与对照组相比均具有明显差异（p＜0.05）。

6、三七多糖抗柯萨奇病毒（CVB3）的活性

试验结果表明，三七多糖抗CVB3的作用TI值为3.29。按照抗病毒药物筛选疗效的评价标准，属有效低毒类。

本发明提供的三七多糖制备方法与现有技术相比较，具有以下的特点：

1、本发明的制备过程中增加纯化步骤，使三七多糖转移率增高，有效降低重金属（特别是砷）的含量。常规方法制备得到的三七粗多糖的砷含量通常为2mg/kg以上，高于国标。按本发明的制备方法得到的三七多糖用AFS-930双通道原子荧光光度计测定，总砷含量能达到0.3mg/kg以下，能达到日本食品标准规定（日本食品中砷含量限量为1.0mg/kg），（表1）。

表1 纯化前后三七多糖的总砷含量

Figure 2012100589426100002DEST_PATH_IMAGE003

2、本发明的制备过程中增加纯化步骤，使三七多糖含量较高。采用苯酚-硫酸法，用紫外分光光度计测多糖含量，结果如表2。

表2 纯化前后三七多糖的含量和转移率

样品	取样量（g）	未纯化（%）	纯化（%）	转移率（%）
					1	1.0031	52.53	68.76	93.1
2	1.0152	49.89	67.34	91.9
					3	1.0389	53.92	70.24	93.4

3、本发明在制备过程中增加纯化步骤，有效降低三七多糖中的灰分，使三七多糖的灰分在13%以下。

4、本发明在制备过程中增加纯化步骤，有效降低三七多糖中的蛋白质含量，使三七多糖的蛋白质含量在1%以下。蛋白质的氨基酸组成如下(mol%)：甘氨酸（Gly）（16）,丙氨酸（Ala）（14）,半胱氨酸（Cys）（14）,天冬氨酸（Asx）（13）,谷氨酸（Glx）（9）,苏氨酸（Thr）（9）,缬氨酸（Val）（8）,亮氨酸（Leu）（7）,丝氨酸（Ser）（6），异亮氨酸（Ileu）（4）等。

5、本发明所用的溶剂为水和乙醇，安全无毒，且乙醇用量少，成本低，有利于产品的安全生产及对环境的保护。

6、本发明可用提取三七皂苷后的残渣为原料提取三七多糖，提高三七原料的综合利用率，降低成本。

附图说明

图1是三七多糖的红外光谱图。

图2是三七多糖的¹³C核磁共振谱图。

图3是三七多糖对肝纤维化的修复作用的对比图，图a为使用前状态图，图b为使用后状态图。

具体实施方式

结合实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1

取三七主根1kg，粉碎，用8kg水于80℃加热提取，提取三次，合并提取液，冷却，离心，转速9000rm，离心10分钟。离心后的清液用经过预处理的聚苯乙烯型大孔吸附树脂OU-291纯化，上柱流速0.3BV/h，用相当于层析柱体积的1.0 BV的纯化水冲洗，流速1.5 BV/h，合并洗脱液。洗脱液通过芳香聚酰胺平板式超滤膜，截留分子量300，截留液相对密度1.02。截留液加入3倍量乙醇，静置1小时，沉淀，离心。沉淀物用水溶解至截留液相对密度1.02，喷雾干燥，得到三七多糖45g。制得的三七多糖经高温灰化法处理，双道原子荧光光度计检测，总砷含量0.213mg/kg。灰分含量12.10%，蛋白质含量1%。

实施例2：

取三七剪口1kg，粉碎，用质量浓度70%的乙醇提取三次，残渣用水加热至90℃提取三次，每次用水量6kg，合并提取液，冷却，离心，转速5000rm，离心15分钟，离心后的清液用经过预处理的阳离子交换树脂纯化，上柱流速1.0 BV/h，用相当于层析柱体积的2.0 BV的纯化水冲洗，流速0.5 BV/h，合并洗脱液，用颗粒状活性炭40g于60℃搅拌30分钟脱色，过滤得清液，清液通过截留分子量500的醋酸纤维素超滤膜超滤膜，截留液相对密度1.03。截留液加入5倍量乙醇，静置1小时，沉淀，离心。沉淀物真空干燥，得到三七多糖38g。制得的三七多糖经高温灰化法处理，双道原子荧光光度计检测，总砷含量0.271mg/kg。灰分含量为12.59%，蛋白质含量1%。

实施例3

取三七筋条1kg，粉碎，用7kg水于100℃加热提取，提取三次，合并提取液，冷却，离心，转速10000rm，离心10分钟。离心后的清液用经过预处理的聚苯乙烯型大孔吸附树脂LAR-714纯化，上柱流速1.0BV/h，用相当于层析柱体积的2.0 BV的纯化水冲洗，流速0.8 BV/h，合并洗脱液。洗脱液通过芳香聚酰胺平板式超滤膜，截留分子量400，截留液相对密度1.03。截留液加入3倍量乙醇，静置1小时，沉淀，离心。沉淀物用水溶解至截留液相对密度1.02，喷雾干燥，得到三七多糖42g。制得的三七多糖经高温灰化法处理，双道原子荧光光度计检测，总砷含量0.153mg/kg，灰分含量12.26%，蛋白质含量1%。

实施例4

取提取皂苷后的三七渣1kg，用10kg 水于80℃加热提取，提取三次，合并提取液，冷却，离心，转速9000rm，10分钟。离心后的清液用经过预处理的聚苯乙烯型大孔吸附树脂LX-68纯化，上柱流速0.3BV/h，用相当于层析柱体积的1.0 BV的纯化水冲洗，流速1.5 BV/h，合并洗脱液。洗脱液通过无机陶瓷超滤膜，截留分子量500，截留液相对密度1.03。截留液加入3倍量乙醇，静置1小时，沉淀，离心。沉淀物用水溶解至截留液相对密度1.02，喷雾干燥，得到三七多糖45g。制得的三七多糖经高温灰化法处理，双道原子荧光光度计检测，总砷含量0.213mg/kg。灰分含量12.10%，蛋白质含量1%。

树脂的预处理方法为：将树脂用水浸泡，过滤，装入层析柱，用75-98%乙醇饱和，静置15～36h后，顺序用乙醇冲洗，至乙醇液稀释后不混浊，用水冲洗，至无乙醇，用相当于树脂体积0.5～5倍的质量浓度为3-5%盐酸洗涤，用水洗至中性，用相当于树脂体积0.5～5倍的质量浓度为1～8%氢氧化钠洗涤，用水洗至中性，至HPLC检测无有机物质残留。

Claims

1.一种具有生理活性的三七多糖的制备方法，其特征在于，三七多糖的制备按以下步骤进行：三七的地下部位粉碎，过20目筛的颗粒，用乙醇提取三七总皂苷后，挥去残留乙醇，加入6-10倍质量的水，于80-100℃加热提取三次，提取液合并，置于离心机中，在5000-15000r/min转速下高速离心10-15分钟，离心后的清液从经过预处理的树脂层析柱柱顶加入，上柱流速0.3-1.0 BV/h，提取液加入后，用相当于层析柱体积的1.0-2.0 BV的纯化水冲洗，流速为0.5-1.0 BV/h，合并洗脱液，洗脱液通过截留分子量300-500的芳香聚酰胺平板式超滤膜，截留液相对密度1.02-1.03，超滤液加入3-5倍的乙醇静置，沉淀，离心，沉淀物用水溶解至截留液相对密度1.02，喷雾干燥，得到三七多糖。

2.根据权利要求1所述的具有生理活性的三七多糖的制备方法，其特征在于所述的树脂层析柱包括LSA-8、LSA-21、LSA-30、LSA-10、LSC-AS、LSC-100、LX-20、LX-68、OU-29、LAR-714、D-101型号的树脂。

3.根据权利要求1所述的具有生理活性的三七多糖的制备方法，其特征在于上述过程中：上树脂层析柱后用活性炭脱色，活性炭用量为三七质量百分比的5%以下，在温度45℃以上搅拌30分钟，过滤，离心。

4.权利要求1所述的具有生理活性的三七多糖的制备方法制备的三七多糖的应用，其特征在于三七多糖具有调节免疫功能、保护肝损伤、促进骨缺损修复、抑制肿瘤、降低血糖、抗病毒的作用，单独或组合用做医药品和健康产品的原料。