WO2022205518A1 - 一种野菠萝多糖的制备方法 - Google Patents
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Definitions
- the invention relates to the technical field of medicine, in particular to a preparation method of wild pineapple polysaccharide.
- the invention provides a preparation method of wild pineapple polysaccharide, comprising the following steps:
- the number of times of steaming and drying is 2 to 3 times, and the conditions for one steaming and drying are: steaming for 30-180 min, and drying at 60-100° C. for 30-120 min.
- the number of times of water extraction is 2 to 3 times, and the conditions of one water extraction are: add 8 to 18 times the weight of water of dried fruit powder, and extract at 90 to 100° C. for 30 to 120 minutes.
- the concentration is concentrated to 40%-60% of the solid
- the drying is vacuum drying at 50-80°C
- the pulverized mesh number is 40-120 mesh.
- the amount of water required for dissolving is 5 to 15 times the weight of the water extract of wild pineapple, the centrifugation is 8000 to 10000 rpm for 6 to 10 minutes, and the filtration aperture is 0.2 to 0.3 nm.
- alcohol precipitation is as follows: adding 95% ethanol to the solution alcohol concentration to 70%, and centrifuging at 8000 rpm for 6-10 min.
- the amount of water required for dissolving is 5 to 15 times the weight of the primary product; the enzymatic hydrolysis concentration of neutral protease is 40000-100000 IU/kg, and the enzymatic hydrolysis conditions are 45 ⁇ 55 °C enzymatic hydrolysis 30 ⁇ 60min; the conditions for inactivating the enzyme are: 90 ⁇ 100°C for 5 ⁇ 20min.
- the concentration is concentrated until the solid content is 40% to 60%; the alcohol precipitation is: add 90% to 100% ethanol to the solution alcohol concentration to 60% to 80%, and let stand for 60 to 60% after stirring. 180min, centrifuge at 7000-9000 rpm for 6-10min.
- the extraction of wild pineapple polysaccharide of the present invention takes fresh and plump wild pineapple fruit as raw material, double-steaming, pulverizing, secondary extraction, ethanol alcohol precipitation to remove impurities, enzymatic hydrolysis and ultrafiltration to remove protein, salt and impurities, concentrated again, ethanol alcohol precipitation
- the purity of the extracted wild pineapple polysaccharide reaches more than 90%, and the wild pineapple polysaccharide exists in the wild pineapple fruit.
- the wild pineapple polysaccharide is continuously improved. Purity, enhance the biological activity of wild pineapple polysaccharide, and enhance the hypoglycemic and hypolipidemic effects of wild pineapple polysaccharide.
Abstract
一种野菠萝多糖的制备方法，包括如下步骤：将野菠萝果进行蒸制、烘干，得到野菠萝干果；将野菠萝干果粉碎，干果粉经水提、浓缩、干燥、粉碎，得到野菠萝水提物；将野菠萝水提物溶解于水，离心，将上清液过滤，得到澄清液体；将澄清液体进行醇沉，将沉淀物烘干、粉碎过筛，得到初级产物；将初级产物溶解于水，过滤后采用中性蛋白酶进行酶解，灭酶、超滤后得到截留液；将截留液浓缩，再次进行醇沉，干燥，粉碎。
Description
本申请要求于2021年03月30日提交中国专利局、申请号为202110341729.5、发明名称为“一种野菠萝多糖的制备方法”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
本发明涉及医药技术领域，特别涉及一种野菠萝多糖的制备方法。
野菠萝是露兜树属植物露兜簕的果实。因形状类似菠萝，岭南民间习称野菠萝。野菠萝在海南分布广泛，资源丰富，民间可作为野果食用，果肉甜味，但果肉中富含维管组织，口感较差，因此不太受欢迎，在海南民间用于疾、咳嗽的治疗。露兜簕的根、叶等部位可作药用，具有清热祛湿、利尿解表、行气平肝等功效。现代药理学研究表明，野菠萝有效成分可以调节糖尿病小鼠的脂质代谢，减少体内脂肪堆积，改善胰岛素抵抗。野菠萝有长期作为野果食用的历史，目前尚未见食用后产生毒副作用的报道，安全性较高，非常有利于开发。
据清《澄海县志》载：露兜树为村俗坊间与筋竹为园，用以为界，谓之露头园，一名露兜。露兜树多用作防风林及园篱，叶的纤维是佳品，可用之编织帽、席、笼屉等工艺品；花香，可提芳香油；果肥厚多肉可食，含氨基酸、糖类，可治肾炎、水肿。
露兜树含有维生素、丰富的矿质元素和多种营养成分，至少含有17种氨基酸，其中7种为人体必需的氨基酸。其中总糖、丝氨酸和谷氨酸质量分数、维生素C、钾质量分数较高。
公开号为CN103784623A发明专利实施例1公开了野菠萝药用植物提取物及其有效部位制备例，取新鲜成熟的野菠萝，置于容器中，加入10-20倍水，浸泡2h后，煎煮3次，每次2h，过滤，浓缩至干得药用植物提取物。药用植物提取物经水溶解后，经D-101大孔吸附树脂分离，以不同浓度的乙醇-水溶液进行洗脱至无色，洗脱液经减压浓缩制得水洗脱物、70％乙 醇洗脱物，浓缩，喷雾干燥后即得有效部位。公开号为CN111265600A发明专利实施例1公开了野菠萝提取物的制备方法：取野菠萝，水洗净，干燥后，每千克加入3升水，浸泡过夜。加热至沸腾后提取1.5h，过滤收集提取液，同法再加水提取一次，合并两次提取液，加热浓缩至流浸膏状，得野菠萝提取物。但上述制备方法得到的多糖含量均较低。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种野菠萝多糖的制备方法。该方法可大大提高野菠萝多糖的纯度及活性，增强野菠萝多糖的降血糖、降血脂功效。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种野菠萝多糖的制备方法，包括如下步骤：
(1)将野菠萝果进行蒸制、烘干，得到野菠萝干果；
(2)将野菠萝干果粉碎，干果粉经水提、浓缩、干燥、粉碎，得到野菠萝水提物；
(3)将野菠萝水提物溶解于水，离心，将上清液过滤，得到澄清液体；
(4)将澄清液体进行醇沉，将沉淀物烘干、粉碎过筛，得到初级产物；
(5)将初级产物溶解于水，过滤后采用中性蛋白酶进行酶解，灭酶、超滤后得到截留液；
(6)将截留液浓缩，再次进行醇沉，干燥，粉碎。
作为优选，步骤(1)中，蒸制、烘干的次数为2～3次，一次蒸制、烘干的条件为：蒸制30～180min，60～100℃烘干30～120min。
优选地，步骤(1)中，蒸制、烘干的次数为2次，第一次蒸制、烘干为：蒸制30～180min，60～100℃烘干30～120min；第二次蒸制、烘干为：蒸制30～120min，60～100℃烘干30～120min。
作为优选，步骤(2)中，水提的次数为2～3次，一次水提的条件为：加入干果粉8～18倍重量的水，90～100℃提取30～120min。
优选地，步骤(2)中，水提的次数为2次，第一次水提的条件为： 加入干果粉10～18倍重量的水，90～100℃提取60～120min；第二次水提的条件为：加入干果粉8～15倍重量的水，90～100℃提取30～90min。
作为优选，步骤(2)中，浓缩为浓缩至固形物40％～60％，干燥为50～80℃真空干燥，粉碎的目数为40～120目。
作为优选，步骤(3)中，溶解所需水量为野菠萝水提物重量的5～15倍，离心为8000～10000转/min离心6～10min，过滤的孔径为0.2～0.3nm。
优选地，步骤(3)中，溶解所需水量为野菠萝水提物重量的5～15倍，离心为8000转/min离心6～10min，过滤的孔径为0.22nm。
作为优选，步骤(4)中，醇沉为：加入90％～100％乙醇至溶液醇浓度至60％～80％，7000～9000转/min离心6～10min；烘干的温度为50～80℃。
优选地，步骤(4)中，醇沉为：加入95％乙醇至溶液醇浓度至70％，8000转/min离心6～10min。
作为优选，步骤(5)中，溶解所需水量为初级产物重量的5～15倍；中性蛋白酶的酶解浓度为40000-100000IU/kg，酶解的条件为45～55℃酶解30～60min；灭酶的条件为：90～100℃灭酶5～20min。
作为优选，步骤(5)中，超滤所用超滤膜的截留分子量为8000Da。
作为优选，步骤(6)中，浓缩为浓缩至固形物为40％～60％；醇沉为：加入90％～100％乙醇至溶液醇浓度至60％～80％，搅拌后静置60～180min，7000～9000转/min离心6～10min。
优选地，步骤(6)中，醇沉为：加入95％乙醇至溶液醇浓度至70％，搅拌后静置60～180min，8000转/min离心6～10min。
作为优选，步骤(6)中，干燥的温度为40～80℃。
本发明提供了一种野菠萝多糖的制备方法。该制备方法包括如下步骤：将野菠萝果进行蒸制、烘干，得到野菠萝干果；将野菠萝干果粉碎，干果粉经水提、浓缩、干燥、粉碎，得到野菠萝水提物；将野菠萝水提物溶解于水，离心，将上清液过滤，得到澄清液体；将澄清液体进行醇沉，将沉淀物烘干、粉碎过筛，得到初级产物；将初级产物溶解于水，过滤后采用中性蛋白酶进行酶解，灭酶、超滤后得到截留液；将截留液浓缩，再次进行醇沉，干燥，粉碎。本发明具有的技术效果为：
本发明野菠萝多糖的提取以新鲜饱满的野菠萝果为原料，经双蒸，粉碎，二次提取，乙醇醇沉除杂，酶解超滤除蛋白、盐及杂质，再次浓缩，乙醇醇沉除杂，干燥，粉碎过筛等工艺，提取的野菠萝多糖纯度达到90％以上，野菠萝多糖存在于野菠萝果中，提取过程中，经过不断的除杂工艺，不断的提高野菠萝多糖的纯度，提升野菠萝多糖的生物活性，增强野菠萝多糖的降血糖、降血脂功效。
本发明公开了一种野菠萝多糖的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的野菠萝多糖的制备方法中所用原料、试剂或仪器等均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：
取野菠萝果80kg，洗净，蒸30min，取出，60℃烘干30min，第二次蒸30min，取出，60℃烘干30min，取出，得野菠萝干果13.5kg，粉碎，得野菠萝干粉13.2kg，加10倍水，加热至90℃，提取60min，过滤，得滤液①；滤渣加8倍水，加热至90℃以上，提取30min，过滤，得滤液②，合并滤液①和②，浓缩至固形物为40％，50℃真空干燥，粉碎，过40目筛网，得野菠萝提取物3.23kg。
野菠提取物加5倍水，搅拌溶解，8000转/min离心6min，取澄清液体，溶液过0.22nm的膜，加入95％的乙醇至溶液醇浓度至70％，8000转/min离心6min，取沉淀，沉淀用无水乙醇洗两遍，50℃烘干，粉碎过筛，得野菠萝粗多糖1.13kg。
野菠萝粗多糖加5倍水溶解，过滤，按每kg加入40000国际单位比活力的中性蛋白酶，45℃水解30min，酶解结束后加热至90℃，维持5min进行酶灭活，酶解液过8000Da的超滤膜，得截留液1.6kg，浓缩至固形物为40％，得浓缩液加入95％的乙醇至溶液乙醇含量达到70％，充分搅拌，静置60min，8000转/min离心6min，取沉淀，沉淀用无水乙醇洗两遍，40℃干燥，粉碎过筛，得野菠萝多糖226.15g。
实施例2：
取野菠萝果80kg，洗净，蒸105min，取出，80℃烘干75min，第二次蒸75min，取出，80℃烘干75min，取出，得野菠萝干果13.8kg，粉碎，加14倍水，加热至95℃，提取90min，过滤，得滤液①；滤渣加11.5倍水，加热至95℃以上，提取60min，过滤，得滤液②，合并滤液①和②，浓缩至固形物为50％，65℃真空干燥，粉碎，过80目筛网，得野菠萝提取物3.45kg.
野菠提取物加10倍水，搅拌溶解，8000转/min离心8min，取澄清液体，溶液过0.22nm的膜，加入95％的乙醇至溶液醇浓度至70％，8000转/min离心8min，取沉淀，沉淀用无水乙醇洗两遍，65℃烘干，粉碎过筛，得野菠萝粗多糖1.21kg。
野菠萝粗多糖加10倍水溶解，过滤，按每kg加入70000国际单位比活力的中性蛋白酶，50℃水解45min，酶解结束后加热至95℃，维持12.5min进行酶灭活。酶解液过8000Da的超滤膜，取截留液，浓缩至固形物为50％，加入95％的乙醇至溶液乙醇含量达到70％，充分搅拌，静置120min，8000转/min离心8min，取沉淀，沉淀用无水乙醇洗两遍，60℃干燥，粉碎过筛，得野菠萝多糖238.11g。
实施例3：
取野菠萝果80kg，洗净，蒸180min，取出，100℃烘干120min，第二次蒸120min，取出，100℃烘干120min，取出，得野菠萝干果13.0kg，粉碎，加18倍水，加热至100℃，提取120min，过滤，得滤液①；滤渣 加15倍水，加热至100℃，提取90min，过滤，得滤液②，合并滤液①和②，浓缩至固形物为60％，80℃真空干燥，粉碎，过120目筛网，得野菠萝提取物3.48kg；
野菠萝提取物加15倍水，搅拌溶解，8000转/min离心10min，取澄清液体，溶液过0.22nm的膜，加入95％的乙醇至溶液醇浓度至70％，8000转/min离心10min，取沉淀，沉淀用无水乙醇洗两遍，80℃烘干，粉碎过筛，得野菠萝粗多糖1.20kg。
野菠萝粗多糖加15倍水溶解，过滤，按每kg加入100000国际单位比活力的中性蛋白酶，55℃水解60min，酶解结束后加热至100℃，维持20min进行酶灭活，酶解液过8000Da的超滤膜，取截留液，浓缩至固形物为60％，加入95％的乙醇至溶液乙醇含量达到70％，充分搅拌，静置180min，8000转/min离心10min，取沉淀，沉淀用无水乙醇洗两遍，80℃干燥，粉碎过筛，得野菠萝多糖240.20g。
试验例1：检测试验
多糖检测方法(苯酚-硫酸法)：以D-无水葡萄糖为对照，采用硫酸-苯酚显色法，测定多糖含量，标准曲线方程为y＝7.66812x+0.00000(r＝0.99926)，式中x为D-无水葡萄糖质量浓度(mg/mL)、y为吸光度，测定吸光度后，根据回归方程，计算多糖含量。
表1：产品检测
| 序号 | 产品 | 多糖含量 |
| 1 | 实施例1 | 92.3％ |
| 2 | 实施例2 | 93.6％ |
| 3 | 实施例3 | 93.0％ |
| 4 | CN103784623A样品 | 62.8％ |
| 5 | CN111265600A样品 | 26.1％ |
试验例2：野菠萝多糖降血糖试验
1.材料
选取健康、雄性、清洁级大鼠70只，体重205-230g，由辽宁长生生物技术有限公司提供动物批准文号：SCXK(辽)2019-0008，实验均符合实验动物伦理学要求。
2.主要仪器设备
血糖仪，德国罗氏公司产品；
全自动生化分析仪，日本日立公司产品；
ELISA检测试剂盒，南京森贝伽生物科技有限公司。
3.实验方法
3.1样品制备
本发明制备的野菠萝多糖。
3.2糖尿病模型建立
大鼠禁食不禁水12h，腹腔注射pH4.4的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液新鲜配制的链脲佐菌素，50mg/kg，造模24h后，尿糖试纸检测尿糖，并尾静脉血采血，检测空腹血糖，尿糖强阳性，空腹血糖≥16.5mmol/L，即为造模成功。
3.3实验
建模成功，将大鼠随机分为厄贝沙坦组、样品低剂量组、中剂量组、高剂量组、CN103784623A样品组及CN111265600A样品组，各10只。
模型组给予生理盐水；厄贝沙坦组给予厄贝沙坦17.5mg/kg；低剂量组给予野菠萝多糖30mg/kg；中剂量组给予野菠萝多糖60mg/kg；高剂量组给予野菠萝多糖120mg/kg；CN103784623A样品组给予CN103784623A样品120mg/kg；CN111265600A样品组给予CN111265600A样品120mg/kg。各组大鼠每日灌胃1次，连续7d。
3.4 FBG、BUN水平检测
末次灌胃后60min，剪尾取血。采用血糖仪检测空腹血糖(FPG)水平；采用全自动生化仪测定尿素氮(BUN)水平。
4.结果及讨论
研究显示，厄贝沙坦组、样品低剂量组、中剂量组、高剂量组的FBG、BUN水平与模型组相比降低较为明显，具有明显差异。其中高剂组FBG 为9.45mmol/L、BUN为9.23mmol/L水平显著降低，具有差异。
CN103784623A样品组及CN111265600A样品组的FBG、BUN水平与模型组相比降低不明显。
表2：野菠萝多糖对大鼠FBG、BUN水平的影响
| 组别 | 只数 | FBG/(mmol/L) | BUN/(mmol/L) |
| 模型组 | 10 | 18.02±3.22 | 24.60±3.34 |
| 厄贝沙坦组 | 10 | 11.87±2.98 ** | 13.73±2.51 ** |
| 样品低剂量组 | 10 | 15.80±2.61 * | 18.68±2.47 * |
| 样品中剂量组 | 10 | 11.56±2.08 ** | 13.30±1.99 ** |
| 样品高剂量组 | 10 | 9.45±1.80 ** | 9.23±1.71 ** |
| CN103784623A样品组 | 10 | 15.75±3.24 | 18.71±3.30 |
| CN111265600A样品组 | 10 | 17.42±3.11 | 23.52±3.28 |
注：表中可以看出，厄贝沙坦组、样品中剂量组及高剂量组的FBG、BUN水平与模型组相比显著降低(p<0.01)，样品低剂量组及CN103784623A样品组的FBG、BUN水平与模型组相比明显降低(p<0.05)。CN111265600A样品组的FBG、BUN水平与模型组相比降低不明显。
试验例3：野菠萝多糖降血脂功效
1、实验药品与器材
阳性对照组的他汀类药物：“辛伐他汀”；
样品：本发明产品野菠萝多糖；
高脂饲料成份:20％猪油，1％胆固醇，0.2％胆盐，18％糖，高营养基础饲料。
器材所用的为16#大鼠灌胃器，精确度为0.1g的台秤及1mL容量的注射器。
2、实验动物
4周龄的健康雄性大白鼠80只，随机分为8组。
3、实验方法
将80只大鼠随机分成8组。分为对照组，高脂模型组，辛伐他汀组，野菠萝多糖高剂量组、中剂量组、低剂量组、CN103784623A样品组及CN111265600A样品组。采用高脂膳食法将高脂模型组，辛伐他汀组，野菠萝多糖高剂量组、中剂量组、低剂量组、CN103784623A样品组及CN111265600A样品组通过喂养高脂饲料4周，为确保造模能够及时成功，每隔一周进行采血化验，直至高脂大鼠造模成功。
对照组高脂模型给予生理盐水，辛伐他汀组给予20mg/kg的辛伐他汀，高剂量组给予160mg/kg的野菠萝多糖、中剂量组给予80mg/kg的野菠萝多糖、低剂量组给予40mg/kg的野菠萝多糖、CN103784623A样品组给予160mg/kg的样品、CN111265600A样品组给予160mg/kg的样品。
实验采用高脂膳食法、对照分析法和腹腔灌胃法及腹腔采血法进行。我们的实验对象选择大白鼠，因为大白鼠不但在药物试剂吸收方面，比小白鼠效果好，无需进行血管注射，而且在采血上也能够顺利采取3-4mL的全血。
表3：血脂四项
注：表中可以看出，样品低剂量组、中剂量组及高剂量组的血脂四项与高脂对照组相比显著降低(p<0.01)，辛伐他汀组的血脂四项与高脂对照组相比明显降低(p<0.05)。CN103784623A样品组及CN111265600A样品组的血脂四项与高脂对照组相比无明显降低。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
- 一种野菠萝多糖的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将野菠萝果进行蒸制、烘干，得到野菠萝干果；(2)将野菠萝干果粉碎，干果粉经水提、浓缩、干燥、粉碎，得到野菠萝水提物；(3)将野菠萝水提物溶解于水，离心，将上清液过滤，得到澄清液体；(4)将澄清液体进行醇沉，将沉淀物烘干、粉碎过筛，得到初级产物；(5)将初级产物溶解于水，过滤后采用中性蛋白酶进行酶解，灭酶、超滤后得到截留液；(6)将截留液浓缩，再次进行醇沉，干燥，粉碎。
- 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述蒸制、烘干的次数为2～3次，一次蒸制、烘干的条件为：蒸制30～180min，60～100℃烘干30～120min。
- 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述水提的次数为2～3次，一次水提的条件为：加入干果粉8～18倍重量的水，90～100℃提取30～120min。
- 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述浓缩为浓缩至固形物40％～60％，干燥为50～80℃真空干燥，粉碎的目数为40～120目。
- 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述溶解所需水量为野菠萝水提物重量的5～15倍，离心为8000～10000转/min离心6～10min，过滤的孔径为0.2～0.3nm。
- 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述醇沉为：加入90％～100％乙醇至溶液醇浓度至60％～80％，7000～9000转/min离心6～10min；烘干的温度为50～80℃。
- 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，所 述溶解所需水量为初级产物重量的5～15倍；中性蛋白酶的酶解浓度为40000-100000IU/kg，酶解的条件为45～55℃酶解30～60min；灭酶的条件为：90～100℃灭酶5～20min。
- 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，所述超滤所用超滤膜的截留分子量为8000Da。
- 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(6)中，所述浓缩为浓缩至固形物为40％～60％；所述醇沉为：加入90％～100％乙醇至溶液醇浓度至60％～80％，搅拌后静置60～180min，7000～9000转/min离心6～10min。
- 根据权利要求1至9中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(6)中，所述干燥的温度为40～80℃。
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|---|
| PENG LIHUA: "Phytochemical Studies on the Roots of Pandanus tectorius Soland.-A Medical Plant", MASTER THESES OF GUANGZHOU UNIVERSITY OF CHINESE MEDICINE, 30 May 2011 (2011-05-30), XP055974288 * |
| WU QIANG: "The Research of Effective Component in the Pandanus Tectorius Sol.", MASTER THESES OF HAINAN UNIVERSITY, 30 June 2011 (2011-06-30), XP055974292 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113072650A (zh) | 2021-07-06 |
| CN113072650B (zh) | 2022-01-21 |
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