CN103589811B - 一种复方丹参浸膏中单糖、二糖的分离纯化方法 - Google Patents
一种复方丹参浸膏中单糖、二糖的分离纯化方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103589811B CN103589811B CN201210290204.4A CN201210290204A CN103589811B CN 103589811 B CN103589811 B CN 103589811B CN 201210290204 A CN201210290204 A CN 201210290204A CN 103589811 B CN103589811 B CN 103589811B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- compound
- column
- danshen root
- medicinal extract
- water
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
本发明涉及一种复方丹参浸膏中单糖、二糖成分的分离纯化方法，本发明采用固相萃取法，对复方丹参浸膏中的糖类成分进行分离纯化，先得到复方丹参浸膏总糖提取物，然后采用凝胶色谱法，对复方丹参浸膏总糖提取物中的低聚糖成分实现了很好的分离，得到了三个单糖、二糖成分，分别是果糖、D‑葡萄糖和蔗糖。
Description
技术领域：
本发明属于中药领域，具体涉及一种复方丹参浸膏中单糖、二糖的分离纯化方法。
背景技术：
复方丹参滴丸是由丹参、三七和冰片制成的滴丸剂，在临床上广泛用于冠心病、心绞痛的预防、治疗、急救，现已成为国内心血管市场上的主导品牌之一。复方丹参浸膏为复方丹参滴丸的制剂中间体，是由丹参和三七药材，经水提、醇沉、浓缩后得到的浸膏（复方丹参浸膏的制备方法属于现有技术）。
复方丹参滴丸上市十余年中逐步建立了完善的工艺质量控制体系，目前正在以药品的形式进行FDA申报研究。但是相对于西药，复方丹参浸膏目前的已知组分仍然较低，提升产品工艺质量控制水平，需要针对其中更多的中药化学成分进行深入研究，从而更加准确地把握产品质量，降低用药风险，同时为国际注册提供支持。
糖类在中草药中分布十分广泛，也是中药材及中药产品中的主要组成成分，所占含量比例很高。测定结果表明，复方丹参浸膏中的糖类成分含量达到约50%，因此糖类成分的研究对于复方丹参浸膏的全面质量控制有着重要意义。
从复方丹参浸膏中分离出了多种糖类成分，获得这些成分可以用于分析复方丹参滴丸中不同糖类成分的比例关系，了解它们的作用，同时可以用于控制产品的质量。本发明在于提供一种从复方丹参浸膏中分离单糖、二糖成分的方法，该方法快速，准确，操作简单，分离效果好，得到的产品纯度高，收率高，可用于糖类成分的定性和定量检测。
发明内容：
本发明经过长期反复的摸索，最终得到一种复方丹参浸膏中单糖、二糖成分的分离纯化方法，并分离得到三个糖类成分，经结构确认，确认该三个化合物为果糖、D-葡萄糖和蔗糖。
该分离纯化方法包括如下步骤：
（1）复方丹参浸膏总糖提取物的制备；
（2）复方丹参浸膏总糖提取物过聚丙烯酰胺凝胶层析柱；
（3）单糖、二糖成分的收集。
其中步骤（1）所述复方丹参浸膏总糖提取物的制备方法为：
复方丹参浸膏加水超声溶解，上至已处理好的固相萃取柱，流速为0.5-1.0mL/min，再用水分次洗涤，收集上样液和洗涤流出液，蒸干，得复方丹参浸膏总糖提取物。
其中所述固相萃取柱采用Cleanert PS-SPE萃取柱，使用前经过处理，处理方法为：将固相萃取柱用甲醇冲洗，之后再用水冲洗。
其中所述复方丹参浸膏为丹参和三七药材经水提、醇沉、浓缩后得到的浸膏，其制备方法具体为：分别取41.06份丹参、8.03份三七药材，粉碎，放入提取罐中，加入上述生药5倍量的碱水（pH=7.0），提取2小时，过滤，收集初滤液，药渣加入4倍量水，煎煮1小时，滤过，与第一次提取的滤液混合，减压浓缩，直至溶液体积(L)与生药质量(Kg)的比为0.9-1.1，加入95%的乙醇直至含醇量至69-71%，静置12小时，滤过，滤液浓缩回收乙醇成浸膏，相对密度为1.32-1.40。该方法属于现有技术。
其中步骤（2）所述过聚丙烯酰胺凝胶层析柱是将得到的复方丹参浸膏总糖提取物用超纯水溶解，溶解后上样至已处理好的层析柱，层析柱的柱温为25-35℃，用超纯水进行洗脱，每10min收集1管洗脱液，收集相当于0.80-0.95柱体积的流份。
其中，聚丙烯酰胺凝胶层析柱为现有技术，可以用以下方法得到：
称取一定量的聚丙烯酰胺凝胶，倒入超纯水中，在室温下润涨12小时以上，真空脱气，用自动沉降法装柱到需要的高度（100~120cm），再用2～3倍床体积的超纯水以恒定的流速平衡层析柱。
优选的，步骤（2）中层析柱的柱温为30℃。
步骤（2）中所述上样量为0.075-0.125g复方丹参浸膏总糖提取物/100克聚丙烯酰胺凝胶。
步骤（2）中所述层析柱的洗脱流速为0.0184-0.0367柱体积/小时。
其中步骤（3）所述的单糖、二糖成分的收集方法为：用HPLC方法对洗脱液进行检测，分别收集保留时间为10.1±0.2min、13.0±0.2min和18.0±0.2min的色谱峰的洗脱液合并，蒸干，得到三种洗脱物，分别为化合物1，2，3。
所述HPLC对洗脱液进行检测的方法为：
采用HPLC-ELSD法，HPLC采用Prevail TM Carbohydrate ES色谱柱，色谱条件为以乙腈为流动相A，水为流动相B，梯度洗脱设置为：
流速0.8mL/min，柱温30℃；采用ELSD检测器，检测器参数设置为增益10，气压25psi，漂移管60℃，Neb heater为60%。
对化合物1,2,3分别通过高分辨质谱、1H-NMR、13C-NMR方法进行结构确认，结果为：
化合物1为易溶于水、稀醇、乙醇。Molish反应呈阳性。说明该化合物可能是糖类。
ESI-MS（m/z）：高分辨质谱测得化合物1的[M+Na]+峰的质量数分别为203.0，与C6H12O6的理论计算值一致，表明由高分辨质谱给出的最为匹配的分子式为C6H12O6，故待测化合物的化学式为C6H12O6。
分别进行了1H-NMR和13C-NMR扫描，图谱数据经比较，与对照品一致，因此确定该化合物为果糖。
化合物2易溶于水、稀醇、乙醇。Molish反应呈阳性。说明该化合物可能是糖类。
ESI-MS（m/z）：高分辨质谱测得化合物1的[M+Na]+峰的质量数分别为203.0，与C6H12O6的理论计算值一致，表明由高分辨质谱给出的最为匹配的分子式为C6H12O6，故待测化合物的化学式为C6H12O6。
分别进行了1H-NMR和13C-NMR扫描，图谱数据经比较，与对照品一致，因此确定该化合物为D-葡萄糖。
化合物3易溶于水、稀醇、乙醇。Molish反应呈阳性。说明该化合物可能是糖类。
ESI-MS（m/z）：高分辨质谱测得化合物3的[M+Na]+峰的质量数为365.1，与C12H22O11的理论计算值一致，表明由高分辨质谱给出的最为匹配的分子式为C12H22O11，故待测化合物的化学式为C12H22O11。
分别进行了1H-NMR和13C-NMR扫描，图谱数据经比较，与对照品一致，因此确定该化合物为蔗糖。
附图说明：
图1复方丹参浸膏总糖提取物ELSD-HPLC色谱图
图2本发明化合物1的ESI-MS图谱
图3本发明化合物1的13C-NMR图谱
图4本发明化合物1的1H-NMR图谱
图5果糖对照品的1H-NMR图谱
图6本发明化合物2的ESI-MS图谱
图7本发明化合物2的13C-NMR图谱
图8本发明化合物2的1H-NMR图谱
图9葡萄糖对照品的1H-NMR图谱
图10本发明化合物3的ESI-MS图谱
图11本发明化合物3的13C-NMR图谱
图12本发明化合物3的1HNMR图谱
图13蔗糖对照品的1H-NMR图谱
具体实施方式：
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，下述实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制，根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
实施例1
1、仪器
AKTA prime蛋白质纯化系统（美国通用电气公司GE医疗集团）；高压水冷夹层层析柱（2.5cm×100cm，上海楚柏实验室设备有限公司）；Waters 2695高效液相色谱仪（美国Waters公司）；Waters 2420ELSD检测器（美国Waters公司）；Bio-Gel P-2聚丙酰胺凝胶（美国Bio-Red公司）；Milli-Q Academic超纯水处理系统（美国Millipore公司）；固相萃取柱（Cleanert PS-SPE，500mg/6mL，Agela科技有限公司）；恒温水浴锅（宁波天恒仪器厂）。
2、试剂与试药
乙腈（色谱纯，Merck公司）；甲醇（分析纯，天津康科德科技有限公司）；超纯水（Milli-Q超纯水处理系统制得，电导率18.2MΩ·cm）。
3、复方丹参浸膏总糖提取物的制备
将固相萃取柱（Cleanert PS-SPE，500mg/6mL）用10mL甲醇冲洗，之后再用10mL水冲洗，冲洗后即可备用。
精密称取0.4g复方丹参浸膏，加10mL水，超声使其完全溶解。上至已处理好的固相萃取柱（Cleanert PS-SPE，500mg/6mL），流速约1mL/min，再用水分次洗涤，收集上样液和洗涤流出液约45mL，蒸干，称重，共得到0.2g复方丹参浸膏总糖提取物，备用。
4、聚丙酰胺凝胶层析柱的制备
称取200g聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Gel P-2），缓慢倒入超纯水中，在室温下润涨12小时以上。将上层细小颗粒倾倒出去，反复数次，至无悬浮的细小颗粒为止。
将处理好的聚丙酰胺凝胶真空脱气，之后用自动沉降法装柱到100cm。再用2～3倍床体积的超纯水以恒定的流速平衡层析柱，即可供后续分离使用。
5、上样、洗脱、收集洗脱液
将得到的0.2g处理后样品用0.5mL的超纯水溶解，溶解后上样至已处理好的层析柱，层析柱温度要始终保持在30℃。
用超纯水以0.2mL/min（0.0245柱体积/小时）的速度进行洗脱，每10min收集1管洗脱液，收集相当于0.80-0.95柱体积时的流份（即收集196-233管、392-466ml的流份），进行HPLC-ELSD检视。
6、洗脱液的检测
色谱条件：采用Prevail TM Carbohydrate ES色谱柱，以乙腈为流动相A，水为流动相B，梯度设置为：
流速为0.8mL/min，柱温30℃；采用WATERS 2420ELSD检测器，参数设置为增益10，气压25psi，漂移管60℃，Neb heater为60%。
将收集得到的各管洗脱液，按照上述色谱条件，直接依次进样，进行检测，记录响应值。
7、单糖、二糖成分的收集
分别收集保留时间为10.1±0.2min、13.0±0.2min和18.0±0.2min的色谱峰的洗脱液合并，蒸干，得到三个化合物1、2、3。
8、单糖、二糖成分的结构确认
化合物1为易溶于水、稀醇、乙醇。Molish反应呈阳性。说明该化合物可能是糖类。经ESI-MS（m/z）、1H-NMR和13C-NMR等方法确定该化合物为果糖。
化合物2易溶于水、稀醇、乙醇。Molish反应呈阳性。说明该化合物可能是糖类。经ESI-MS（m/z）、1H-NMR和13C-NMR等方法确定该化合物为D-葡萄糖。
化合物3易溶于水、稀醇、乙醇。Molish反应呈阳性。说明该化合物可能是糖类。经ESI-MS（m/z）、1H-NMR和13C-NMR等方法确定该化合物为蔗糖。
实施例2
1、仪器
AKTA prime蛋白质纯化系统（美国通用电气公司GE医疗集团）；高压水冷夹层层析柱（5.0cm×100cm，上海楚柏实验室设备有限公司）；Waters 2695高效液相色谱仪（美国Waters公司）；Waters 2420ELSD检测器（美国Waters公司）；Bio-Gel P-2聚丙酰胺凝胶（美国Bio-Red公司）；Milli-Q Academic超纯水处理系统（美国Millipore公司）；固相萃取柱（Cleanert PS-SPE，500mg/6mL，Agela科技有限公司）；恒温水浴锅（宁波天恒仪器厂）。
2、试剂与试药
乙腈（色谱纯，Merck公司）；甲醇（分析纯，天津康科德科技有限公司）；超纯水（Milli-Q超纯水处理系统制得，电导率18.2MΩ·cm）。
3、复方丹参浸膏总糖提取物的制备
将固相萃取柱（Cleanert PS-SPE，500mg/6mL）用10mL甲醇冲洗，之后再用10mL水冲洗，冲洗后即可备用。
精密称取1.6g复方丹参浸膏，加10mL水，超声使其完全溶解。上至已处理好的固相萃取柱（Cleanert PS-SPE，500mg/6mL），流速约1mL/min，再用水分次洗涤，收集上样液和洗涤流出液约45mL，蒸干，称重，共得到0.8g复方丹参浸膏总糖提取物，备用。
4、聚丙酰胺凝胶层析柱的制备
称取800g聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Gel P-2），缓慢倒入超纯水中，在室温下润涨12小时以上。将上层细小颗粒倾倒出去，反复数次，至无悬浮的细小颗粒为止。
将处理好的聚丙酰胺凝胶真空脱气，之后用自动沉降法装柱到100cm。再用2～3倍床体积的超纯水以恒定的流速平衡层析柱，即可供后续分离使用。
5、上样、洗脱、收集洗脱液
将得到的0.8g处理后样品用2.0mL的超纯水溶解，溶解后上样至已处理好的层析柱，层析柱温度要始终保持在25℃。
用超纯水以0.8mL/min（0.0245柱体积/小时）的速度进行洗脱，每10min收集1管洗脱液，收集相当于0.80-0.95柱体积时的流份（即收集196-233管、1568-1864ml的流份），进行HPLC-ELSD检视。
6、洗脱液的检测
色谱条件：采用Prevail TM Carbohydrate ES色谱柱，以乙腈为流动相A，水为流动相B，梯度设置为：
流速为0.8mL/min，柱温30℃；采用WATERS 2420ELSD检测器，参数设置为增益10，气压25psi，漂移管60℃，Neb heater为60%。
将收集得到的各管洗脱液，按照上述色谱条件，直接依次进样，进行检测，记录响应值。
7、单糖、二糖成分的收集
分别收集保留时间为10.1±0.2min、13.0±0.2min和18.0±0.2min的色谱峰的洗脱液合并，蒸干，得到三个化合物1、2、3。
8、单糖、二糖成分的结构确认
化合物1为易溶于水、稀醇、乙醇。Molish反应呈阳性。说明该化合物可能是糖类。经ESI-MS（m/z）、1H-NMR和13C-NMR等方法确定该化合物为果糖。
化合物2易溶于水、稀醇、乙醇。Molish反应呈阳性。说明该化合物可能是糖类。经ESI-MS（m/z）、1H-NMR和13C-NMR等方法确定该化合物为D-葡萄糖。
化合物3易溶于水、稀醇、乙醇。Molish反应呈阳性。说明该化合物可能是糖类。经ESI-MS（m/z）、1H-NMR和13C-NMR等方法确定该化合物为蔗糖。
实施例3
1、仪器
AKTA prime蛋白质纯化系统（美国通用电气公司GE医疗集团）；高压水冷夹层层析柱（2.5cm×120cm，美国Bio-Red公司）；Waters 2695高效液相色谱仪（美国Waters公司）；Waters 2420ELSD检测器（美国Waters公司）；Bio-Gel P-2聚丙酰胺凝胶（美国Bio-Red公司）；Milli-Q Academic超纯水处理系统（美国Millipore公司）；固相萃取柱（Cleanert PS-SPE，500mg/6mL，Agela科技有限公司）；恒温水浴锅（宁波天恒仪器厂）。
2、试剂与试药
乙腈（色谱纯，Merck公司）；甲醇（分析纯，天津康科德科技有限公司）；超纯水（Milli-Q超纯水处理系统制得，电导率18.2MΩ·cm）。
3、复方丹参浸膏总糖提取物的制备
将固相萃取柱（Cleanert PS-SPE，500mg/6mL）用10mL甲醇冲洗，之后再用10mL水冲洗，冲洗后即可备用。
精密称取0.4g复方丹参浸膏，加10mL水，超声使其完全溶解。上至已处理好的固相萃取柱（Cleanert PS-SPE，500mg/6mL），流速约0.8mL/min，再用水分次洗涤，收集上样液和洗涤流出液约45mL，蒸干，称重，共得到0.2g复方丹参浸膏总糖提取物，备用。
4、聚丙酰胺凝胶层析柱的制备
称取240g的聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Gel P-2），缓慢倒入超纯水中，在室温下润涨12小时以上。将上层细小颗粒倾倒出去，反复数次，至无悬浮的细小颗粒为止。
将处理好的聚丙酰胺凝胶真空脱气，之后用自动沉降法装柱到120cm。再用2～3倍床体积的超纯水以恒定的流速平衡层析柱，即可供后续分离使用。
5、上样、洗脱、收集洗脱液
将得到的0.2g处理后样品用0.5mL的超纯水溶解，溶解后上样至已处理好的层析柱，层析柱温度要始终保持在35℃。
用超纯水以0.2mL/min（0.0245柱体积/小时）的速度进行洗脱，每10min收集1管洗脱液，收集相当于0.80-0.95柱体积时的流份（即收集236-280管、472-560ml的流份），进行HPLC-ELSD检视。
6、洗脱液的检测
色谱条件：采用Prevail TM Carbohydrate ES色谱柱，以乙腈为流动相A，水为流动相B，梯度设置为：
流速为0.8mL/min，柱温30℃；采用WATERS 2420ELSD检测器，参数设置为增益10，气压25psi，漂移管60℃，Neb heater为60%。
将收集得到的各管洗脱液，按照上述色谱条件，直接依次进样，进行检测，记录响应值。
7、单糖、二糖成分的收集
分别收集保留时间为10.1±0.2min、13.0±0.2min和18.0±0.2min的色谱峰的洗脱液合并，蒸干，得到三个化合物1、2、3。
8、单糖、二糖成分的结构确认
化合物1为易溶于水、稀醇、乙醇。Molish反应呈阳性。说明该化合物可能是糖类。经ESI-MS（m/z）、1H-NMR和13C-NMR等方法确定该化合物为果糖。
化合物2易溶于水、稀醇、乙醇。Molish反应呈阳性。说明该化合物可能是糖类。经ESI-MS（m/z）、1H-NMR和13C-NMR等方法确定该化合物为D-葡萄糖。
化合物3易溶于水、稀醇、乙醇。Molish反应呈阳性。说明该化合物可能是糖类。经ESI-MS（m/z）、1H-NMR和13C-NMR等方法确定该化合物为蔗糖。
实施例4
1、仪器
AKTA prime蛋白质纯化系统（美国通用电气公司GE医疗集团）；高压水冷夹层层析柱（2.5cm×100cm，上海楚柏实验室设备有限公司）；Waters 2695高效液相色谱仪（美国Waters公司）；Waters 2420ELSD检测器（美国Waters公司）；Bio-Gel P-2聚丙酰胺凝胶（美国Bio-Red公司）；Milli-Q Academic超纯水处理系统（美国Millipore公司）；固相萃取柱（Cleanert PS-SPE，500mg/6mL，Agela科技有限公司）；恒温水浴锅（宁波天恒仪器厂）。
2、试剂与试药
乙腈（色谱纯，Merck公司）；甲醇（分析纯，天津康科德科技有限公司）；超纯水（Milli-Q超纯水处理系统制得，电导率18.2MΩ·cm）。
3、复方丹参浸膏总糖提取物的制备
将固相萃取柱（Cleanert PS-SPE，500mg/6mL）用10mL甲醇冲洗，之后再用10mL水冲洗，冲洗后即可备用。
精密称取0.5g复方丹参浸膏，加10mL水，超声使其完全溶解。上至已处理好的固相萃取柱（Cleanert PS-SPE，500mg/6mL），流速约0.5mL/min，再用水分次洗涤，收集上样液和洗涤流出液约45mL，蒸干，称重，共得到0.25g复方丹参浸膏总糖提取物，备用。
4、聚丙酰胺凝胶层析柱的制备
称取200g聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Gel P-2），缓慢倒入超纯水中，在室温下润涨12小时以上。将上层细小颗粒倾倒出去，反复数次，至无悬浮的细小颗粒为止。
将处理好的聚丙酰胺凝胶真空脱气，之后用自动沉降法装柱到100cm。再用2～3倍床体积的超纯水以恒定的流速平衡层析柱，即可供后续分离使用。
5、上样、洗脱、收集洗脱液
将得到的0.25g处理后样品用0.5mL的超纯水溶解，溶解后上样至已处理好的层析柱，层析柱温度要始终保持在30℃。
用超纯水以0.15mL/min（0.0184柱体积/小时）的速度进行洗脱，每10min收集1管洗脱液，收集相当于0.80-0.95柱体积时的流份（即收集196-233管、392-466ml的流份），进行HPLC-ELSD检视。
6、洗脱液的检测
色谱条件：采用Prevail TM Carbohydrate ES色谱柱，以乙腈为流动相A，水为流动相B，梯度设置为：
流速为0.8mL/min，柱温30℃；采用WATERS 2420ELSD检测器，参数设置为增益10，气压25psi，漂移管60℃，Neb heater为60%。
将收集得到的各管洗脱液，按照上述色谱条件，直接依次进样，进行检测，记录响应值。
7、单糖、二糖成分的收集
分别收集保留时间为10.1±0.2min、13.0±0.2min和18.0±0.2min的色谱峰的洗脱液合并，蒸干，得到三个化合物1、2、3。
8、单糖、二糖成分的结构确认
化合物1为易溶于水、稀醇、乙醇。Molish反应呈阳性。说明该化合物可能是糖类。经ESI-MS（m/z）、1H-NMR和13C-NMR等方法确定该化合物为果糖。
化合物2易溶于水、稀醇、乙醇。Molish反应呈阳性。说明该化合物可能是糖类。经ESI-MS（m/z）、1H-NMR和13C-NMR等方法确定该化合物为D-葡萄糖。
化合物3易溶于水、稀醇、乙醇。Molish反应呈阳性。说明该化合物可能是糖类。经ESI-MS（m/z）、1H-NMR和13C-NMR等方法确定该化合物为蔗糖。
实施例5
1、仪器
AKTA prime蛋白质纯化系统（美国通用电气公司GE医疗集团）；高压水冷夹层层析柱（2.5cm×100cm，上海楚柏实验室设备有限公司）；Waters 2695高效液相色谱仪（美国Waters公司）；Waters 2420ELSD检测器（美国Waters公司）；Bio-Gel P-2聚丙酰胺凝胶（美国Bio-Red公司）；Milli-Q Academic超纯水处理系统（美国Millipore公司）；固相萃取柱（Cleanert PS-SPE，500mg/6mL，Agela科技有限公司）；恒温水浴锅（宁波天恒仪器厂）。
2、试剂与试药
乙腈（色谱纯，Merck公司）；甲醇（分析纯，天津康科德科技有限公司）；超纯水（Milli-Q超纯水处理系统制得，电导率18.2MΩ·cm）。
3、复方丹参浸膏总糖提取物的制备
将固相萃取柱（Cleanert PS-SPE，500mg/6mL）用10mL甲醇冲洗，之后再用10mL水冲洗，冲洗后即可备用。
精密称取0.3g复方丹参浸膏，加10mL水，超声使其完全溶解。上至已处理好的固相萃取柱（Cleanert PS-SPE，500mg/6mL），流速约0.6mL/min，再用水分次洗涤，收集上样液和洗涤流出液约45mL，蒸干，称重，共得到0.15g复方丹参浸膏总糖提取物，备用。
4、聚丙酰胺凝胶层析柱的制备
称取200g聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Gel P-2），缓慢倒入超纯水中，在室温下润涨12小时以上。将上层细小颗粒倾倒出去，反复数次，至无悬浮的细小颗粒为止。
将处理好的聚丙酰胺凝胶真空脱气，之后用自动沉降法装柱到100cm。再用2～3倍床体积的超纯水以恒定的流速平衡层析柱，即可供后续分离使用。
5、上样、洗脱、收集洗脱液
将得到的0.2g处理后样品用0.5mL的超纯水溶解，溶解后上样至已处理好的层析柱，层析柱温度要始终保持在30℃。
用超纯水以0.3mL/min（0.0367柱体积/小时）的速度进行洗脱，每10min收集1管洗脱液，收集相当于0.80-0.95柱体积时的流份（即收集196-233管、392-466ml的流份），进行HPLC-EL SD检视。
6、洗脱液的检测
色谱条件：采用Prevail TM Carbohydrate ES色谱柱，以乙腈为流动相A，水为流动相B，梯度设置为：
流速为0.8mL/min，柱温30℃；采用WATERS 2420ELSD检测器，参数设置为增益10，气压25psi，漂移管60℃，Neb heater为60%。
将收集得到的各管洗脱液，按照上述色谱条件，直接依次进样，进行检测，记录响应值。
7、单糖、二糖成分的收集
分别收集保留时间为10.1±0.2min、13.0±0.2min和18.0±0.2min的色谱峰的洗脱液合并，蒸干，得到三个化合物1、2、3。
8、单糖、二糖成分的结构确认
化合物1为易溶于水、稀醇、乙醇。Molish反应呈阳性。说明该化合物可能是糖类。经ESI-MS（m/z）、1H-NMR和13C-NMR等方法确定该化合物为果糖。
化合物2易溶于水、稀醇、乙醇。Molish反应呈阳性。说明该化合物可能是糖类。经ESI-MS（m/z）、1H-NMR和13C-NMR等方法确定该化合物为D-葡萄糖。
化合物3易溶于水、稀醇、乙醇。Molish反应呈阳性。说明该化合物可能是糖类。经ESI-MS（m/z）、1H-NMR和13C-NMR等方法确定该化合物为蔗糖。
Claims (9)
1.一种复方丹参浸膏中单糖、二糖成分的分离纯化方法，包括如下步骤：
(1)复方丹参浸膏总糖提取物的制备；
(2)复方丹参浸膏总糖提取物过聚丙烯酰胺凝胶层析柱：将步骤(1)得到的复方丹参浸膏总糖提取物用超纯水溶解，溶解后上样至已处理好的层析柱，层析柱的柱温为25-35℃，用超纯水进行洗脱，收集相当于0.80-0.95柱体积的流份；
(3)单糖、二糖成分的收集。
2.如权利要求1所述的方法，其中步骤(1)所述复方丹参浸膏总糖提取物的制备方法为：
复方丹参浸膏加水超声溶解，上至已处理好的固相萃取柱，流速为0.5-1.0mL/min，再用水分次洗涤，收集上样液和洗涤流出液，蒸干，得复方丹参浸膏总糖提取物。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述固相萃取柱采用Cleanert PS-SPE萃取柱，使用前经过处理，处理方法为：将固相萃取柱用甲醇冲洗，之后再用水冲洗。
4.如权利要求1所述的方法，其中，聚丙烯酰胺凝胶层析柱用以下方法得到：
称取聚丙烯酰胺凝胶，倒入超纯水中，在室温下润涨12小时以上，真空脱气，装柱，装柱高度为100-120cm，再用2～3倍床体积的超纯水以恒定的流速平衡层析柱。
5.如权利要求1所述的方法，其中层析柱的柱温为30℃。
6.如权利要求1所述的方法，其中聚丙烯酰胺凝胶层析柱上样量为0.075-0.125g复方丹参浸膏总糖提取物/100克聚丙烯酰胺凝胶。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述层析柱的洗脱流速为0.0184-0.0367柱体积/小时。
8.如权利要求1所述的方法，其中步骤(3)所述的单糖、二糖成分的收集方法为：用HPLC方法对洗脱液进行检测，分别收集保留时间为10.1±0.2min、13.0±0.2min和18.0±0.2min的色谱峰的洗脱液，合并，蒸干，得到三种洗脱物：果糖、葡萄糖、蔗糖。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述HPLC对洗脱液进行检测的方法为：
采用HPLC-ELSD法，HPLC采用PrevailTM Carbohydrate ES色谱柱，色谱条件为以乙腈为流动相A，水为流动相B，梯度洗脱设置为：
流速0.8mL/min，柱温30℃；采用ELSD检测器，检测器参数设置为增益10，气压25psi，漂移管60℃，Neb heater为60％。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210290204.4A CN103589811B (zh) | 2012-08-15 | 2012-08-15 | 一种复方丹参浸膏中单糖、二糖的分离纯化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210290204.4A CN103589811B (zh) | 2012-08-15 | 2012-08-15 | 一种复方丹参浸膏中单糖、二糖的分离纯化方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103589811A CN103589811A (zh) | 2014-02-19 |
| CN103589811B true CN103589811B (zh) | 2017-06-23 |
Family
ID=50080122
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201210290204.4A Active CN103589811B (zh) | 2012-08-15 | 2012-08-15 | 一种复方丹参浸膏中单糖、二糖的分离纯化方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103589811B (zh) |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1329094A (zh) * | 2001-05-31 | 2002-01-02 | 中国科学院昆明植物研究所 | 三七多糖的提取分离方法 |
| CN1164601C (zh) * | 2001-10-26 | 2004-09-01 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 酶法制备不同聚合度低聚糖的调控方法 |
| CN1286465C (zh) * | 2004-09-10 | 2006-11-29 | 中国医学科学院医药生物技术研究所 | 一种丹参寡糖及其在抗艾滋病、调节免疫和升白细胞中的用途 |
| CN1839936A (zh) * | 2006-01-24 | 2006-10-04 | 山东省医学科学院药物研究所 | 具抗血栓活性的丹参提取物和制备方法 |
| CN101337995A (zh) * | 2008-08-12 | 2009-01-07 | 山西大学 | 从大枣中提取低聚糖的方法 |
| CN102585029B (zh) * | 2012-03-08 | 2014-03-12 | 玉溪市维和生物技术有限责任公司 | 一种生理活性三七多糖的制备方法及其应用 |
-
2012
- 2012-08-15 CN CN201210290204.4A patent/CN103589811B/zh active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103589811A (zh) | 2014-02-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101167788B (zh) | 一种用于久病虚损,气阴不足的贞芪扶正中药制剂质控方法 | |
| CN108802255A (zh) | 测定复方制剂中灵芝酸a和灵芝三萜类成分含量的方法 | |
| CN105111255A (zh) | 一种肉苁蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷的提取分离方法 | |
| CN104415070A (zh) | 一种人参中人参总皂苷的分离纯化方法 | |
| CN101096378B (zh) | 白花蛇舌草中环烯醚萜类化合物单体的提取、分离方法 | |
| CN104345110B (zh) | 一种中药组合物制剂中七种成分的含量测定方法 | |
| CN108218927A (zh) | 沙枣花中黄酮苷类化合物及其制备方法 | |
| CN107823237A (zh) | 一种牛蒡根总黄酮的提取方法 | |
| CN106290599B (zh) | 一种中药组合物的含量测定方法 | |
| CN103852531B (zh) | 一种利用hplc-elsd测定啤酒中麦芽低聚糖的方法 | |
| CN103830306B (zh) | 一种忍冬叶有效提取物的制备方法 | |
| CN106370756B (zh) | 一种防治鸡传染性支气管炎的中药制剂的检测方法 | |
| CN102643258B (zh) | 皮寒药中化学成分的分离纯化方法 | |
| CN110579553A (zh) | 一种参葵通脉颗粒的质量检测方法 | |
| CN103588827B (zh) | 一种复方丹参浸膏中低聚三糖的分离纯化方法 | |
| CN101732379B (zh) | D101大孔吸附树脂富集纯化竹节参总皂苷工艺 | |
| CN102670951B (zh) | 一种中药组合物中橙皮苷的含量测定方法 | |
| CN101337882B (zh) | 利用高速逆流色谱法纯化一枝蒿酮酸和金腰素乙的方法 | |
| CN103588826B (zh) | 一种复方丹参浸膏中低聚四糖的分离纯化方法 | |
| CN103589811B (zh) | 一种复方丹参浸膏中单糖、二糖的分离纯化方法 | |
| CN108929351A (zh) | 一种贵州獐牙菜中獐牙菜苦苷的制备方法 | |
| CN104892620B (zh) | 一种高纯度水黄皮素的制备方法 | |
| CN102532077B (zh) | 一种快速制备色谱分离制备丹酚酸b的方法 | |
| CN101274036B (zh) | 苁黄补肾制剂的检测方法 | |
| CN105675734A (zh) | 一种复方丹参浸膏中低聚糖成分的含量测定方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |