CN108929351A - 一种贵州獐牙菜中獐牙菜苦苷的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于中药技术领域，公开了一种贵州獐牙菜中獐牙菜苦苷的制备方法包括：大孔吸附树脂分离，取贵州獐牙菜提取物过滤，吸附于D101大孔树脂柱，吸附8小时后分别用纯水和10％乙醇/水洗脱；硅胶柱色谱纯化，硅胶G为柱填料，以二氯甲烷:乙醇＝9:1，V/V或乙酸乙酯:乙醇＝9:1，V/V为洗脱剂；重结晶精制，取獐牙菜苦苷纯品加入15倍量无水乙醇加热溶解过滤，放置到冰箱中冷置过夜析出白色固体，过滤，少量无水乙醇洗涤，冷冻干燥后纯度达到97％，色泽浅白，无色素残留乙醇提取、大孔吸附树脂分离、硅胶柱色谱纯化、重结晶精制。本发明操作步骤简单、分离效率高、制备量大的獐牙菜苦苷制备方法。

Description

一种贵州獐牙菜中獐牙菜苦苷的制备方法

技术领域

本发明属于中药技术领域，尤其涉及一种贵州獐牙菜中獐牙菜苦苷的制备方法。

背景技术

目前，业内常用的现有技术是这样的：獐牙菜属(Swertia)植物为龙胆科(Gentianaceae)双子叶植物纲菊亚纲，一年生或多年生草本。全世界獐牙菜属植物约有170种，主要分布在亚洲，少数分布在北美洲和非洲，仅一种分布于欧洲。我国约有79种和10个变种，分布于全国26个省(区)。獐牙菜属植物在我国西南部和喜马拉雅地区的分布占全国分布的90％以上，其中云南、贵州、四川和西藏四省区的分布占全国分布的80％以上。贵州獐牙菜(Swertia kouitchensis)又名四棱獐牙菜，为龙胆科(Gentianaceae)獐牙菜属植物，一年生草本，产于贵州的盘县、水城、威宁、湄潭、遵义、江口、印江、凯里、贵阳等县、市。在贵州地区主要用于治小儿高烧、口苦渐热、湿热黄疸、咽喉肿痛及蛇咬伤。由于本属植物药理作用显著，对其研究与开发也越来越受重视。迄今为止，约有50余种獐牙菜属植物的化学成分研究有文献报道。从该属植物中已分离得到270多个化合物。结构类型主要为裂环烯醚萜类、口山酮类、黄酮类以及三萜类等。环烯醚萜类化合物是龙胆科植物的主要药效成分之一，也是本科植物的特征性成分，在化学分类学上具有重要意义。贵州獐牙菜中环烯醚萜类化合物主要为獐牙菜苦苷(Swertiamarin)。该化合物具有保肝、利胆、抗炎及解痉止痛等作用。近年来，世界各国积极推进该类化合物的开发，并广泛应用于医药保健、日用化工和食品加工等领域。研究獐牙菜苦苷的提取分离纯化方法和生产工艺具有重要的现实意义。

目前对獐牙菜苦苷原药材的提取分离一般用溶剂粗提、脱酯、萃取后浓缩得粗提物，再经反复色谱柱层析分离及TLC检测。洗脱剂一般为氯仿-甲醇或氯仿-甲醇-水以适当比例混合的溶液。显色剂一般为20％硫酸水溶液，或对二甲氨基苯甲醛。獐牙菜苦苷的精制纯化方法主要有大孔树脂色谱法，硅胶柱色谱法，反相色谱法，凝胶柱色谱法，半制备高效液相色谱法、高速逆流色谱法和纳滤膜分离等。但是，凝胶和反相柱色谱分离法材料昂贵、制备量小等问题无法工业化生产；半制备型高效液相色谱法的仪器和色谱柱价格高昂，设备精细，操作复杂，且制备量少；高速逆流色谱法在分离多组分混合物时如何确定洗脱溶剂种类与配比，保持柱效率长期稳定及扩大生产能力等方面在理论与实践上均有待完善，研究仅限于实验室少量标准样品的试制，离工业化规模生产还有相当大的距离。纳滤膜分离法在植物化学成分制备方面应用尚不广泛，是一种正处于工业开发阶段的化学分离工程技术，目前的报道还多见于实验室研究。现有采用大孔树脂、硅胶和重结晶等方法的工艺过程较多，导致工业化成本增加。同时，由于獐牙菜属各种植物中化学成分具有一定差异，其中獐牙菜苦苷的制备方法各有差异，目前还没有针对贵州獐牙菜中獐牙菜苦苷的制备方法。贵州獐牙菜在贵州省的分布较多，蕴藏量丰富，由于贵州省特有的气候条件，使得其中的獐牙菜苦苷含量较大，是制备獐牙菜苦苷的较好的植物来源。

综上所述，现有技术存在的问题是：凝胶和反相柱色谱分离法材料昂贵、制备量小等问题无法工业化生产；半制备型高效液相色谱法的仪器和色谱柱价格高昂，设备精细，操作复杂，且制备量少；高速逆流色谱法在分离多组分混合物时如何确定洗脱溶剂种类与配比，保持柱效率长期稳定及扩大生产能力等方面在理论与实践上均有待完善，研究仅限于实验室少量标准样品的试制，离工业化规模生产还有相当大的距离。纳滤膜分离法在植物化学成分制备方面应用尚不广泛，是一种正处于工业开发阶段的化学分离工程技术，目前的报道还多见于实验室研究。现有采用大孔树脂、硅胶和重结晶等方法的工艺过程较多，导致工业化成本增加。同时，由于獐牙菜属各种植物中化学成分具有一定差异，其中獐牙菜苦苷的制备方法各有差异，目前还没有针对贵州獐牙菜中獐牙菜苦苷的制备方法。

解决上述技术问题的难度和意义：

为解决现有从獐牙菜属植物中制备獐牙菜苦苷的针对性不强、制备工艺过程较多、所用试剂和材料多，部分试剂不方便购买等问题，通过针对贵州獐牙菜中獐牙菜苦苷的提取分离制备方法的探索优化得到该制备方法。实现该制备过程的难度在于：提取液需回收至无醇味，料液上柱后需静止吸附8小时；大孔树脂溶剂洗脱流速控制在2BV/h；大孔树脂10％的乙醇/水洗脱部分，需经检测后合并含獐牙菜苦苷的馏分；为保证硅胶柱色谱装柱的平整和均匀，需用湿法装柱；为保证分离度，硅胶柱径高比约为1:5；硅胶柱色谱洗脱的前4个柱体积馏分集中接收，从第5个柱体积开始按三分之一个柱体积一个馏分分别接收，需经检测后合并第5～10个柱体部分中含獐牙菜苦苷的馏分。该方法能在保证含量和纯度的基础上，更有针对性的，重现性更好，更简单、快捷、经济的从贵州獐牙菜中制备獐牙菜苦苷，为该化合物的制备提供新的途径和方法。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种贵州獐牙菜中獐牙菜苦苷的制备方法。

本发明是这样实现的，一种贵州獐牙菜中獐牙菜苦苷的制备方法，所述贵州獐牙菜中獐牙菜苦苷的制备方法包括：

步骤一，大孔吸附树脂分离，取贵州獐牙菜提取物过滤，吸附于D101大孔树脂柱，吸附8小时后分别用纯水和10％乙醇/水洗脱；

步骤二，硅胶柱色谱纯化，硅胶G为柱填料，以二氯甲烷:乙醇＝9:1，V/V或乙酸乙酯:乙醇＝9:1，V/V为洗脱剂；

步骤三，重结晶精制，取獐牙菜苦苷纯品加入15倍量无水乙醇加热溶解过滤，放置到冰箱中冷置过夜析出白色固体，过滤，少量无水乙醇洗涤，冷冻干燥后纯度达到97％，色泽浅白，无色素残留。

进一步，所述步骤一之前需要：乙醇提取，用70％含水乙醇以贵州獐牙菜药材重量的8倍量回流提取1次、再用50％含水乙醇以贵州獐牙菜药材重量的8倍量回流提取1次，从贵州獐牙菜提取獐牙菜苦苷，合并提取液回收溶剂至无醇味后得贵州獐牙菜提取物。

进一步，所述步骤二的工艺条件为：大孔树脂用纯水装柱；树脂用量为贵州獐牙菜提取物重量的20倍；径高比为1:5；洗脱流速为2BV/h；先用纯水洗脱3BV，再用10％的乙醇/水洗脱15BV，经检测后收集合并10％乙醇/水洗脱液部分含獐牙菜苦苷的馏分，浓缩回收溶剂后真空干燥得獐牙菜苦苷粗品。

进一步，所述步骤三的工艺条件为：用乙醇溶解獐牙菜苦苷粗品，用獐牙菜苦苷粗品重量1.5倍的硅胶拌样，柱层析硅胶用量为獐牙菜苦苷粗品重量的20倍，湿法装柱，柱径高比为1:5；以二氯甲烷:乙醇＝9:1，V/V或乙酸乙酯:乙醇＝9:1，V/V为洗脱剂洗脱，从第4个柱体积开始以三分之一个柱体积为一个馏分分开接收，根据硅胶薄层板检测结果，收集和合并第5～10个柱体积中含獐牙菜苦苷的馏分，得到獐牙菜苦苷纯品。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：本发明针对性强，方法可重复性高。同时，本发明在保证含量和纯度的基础上，制备过程中步骤更少更简单，所用材料和试剂更少，所用试剂价格经济并且容易购买，能有效的提高生产效率和降低了生产成本。本发明的优点和积极效果如下:

附图说明

图1是本发明实施例提供的贵州獐牙菜中獐牙菜苦苷的制备方法流程图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有采用大孔树脂、硅胶和重结晶等方法的工艺过程较多，导致工业化成本增加。同时，由于獐牙菜属各种植物中化学成分具有一定差异，其中獐牙菜苦苷的制备方法各有差异，目前还没有针对贵州獐牙菜中獐牙菜苦苷的制备方法。本发明在保证含量和纯度的基础上，制备过程中步骤更少更简单，所用材料和试剂更少，所用试剂价格经济并且容易购买，能有效的提高生产效率和降低了生产成本。

下面结合附图对本发明的制备方法作详细的描述。

如图1所示，本发明实施例提供的贵州獐牙菜中獐牙菜苦苷的制备方法包括：

S101：乙醇提取；

S102：大孔吸附树脂分离；

S103：硅胶柱色谱纯化；

S104：重结晶精制。

本发明实施例提供的贵州獐牙菜中獐牙菜苦苷的制备方法具体包括以下步骤：

步骤一，乙醇提取，用70％含水乙醇以贵州獐牙菜重量的8倍量回流提取1次(1h)、再用50％含水乙醇以贵州獐牙菜重量的5倍量回流提取1次(1h)，从贵州獐牙菜提取獐牙菜苦苷，合并提取液回收溶剂至无醇味后得贵州獐牙菜提取物；

步骤二，大孔吸附树脂分离，取贵州獐牙菜提取物过滤，吸附于D101大孔树脂柱上，吸附8小时后分别用纯水和10％乙醇/水洗脱；工艺条件为：大孔树脂用纯水装柱；树脂用量为贵州獐牙菜提取物重量的20倍；径高比为1:5；洗脱流速为2BV/h；先用纯水洗脱3BV，再用10％的乙醇/水洗脱15BV，经检测后收集合并10％乙醇/水洗脱液部分含獐牙菜苦苷的馏分，浓缩回收溶剂后真空干燥得獐牙菜苦苷粗品；

步骤三，硅胶柱色谱纯化，硅胶G为柱填料，以二氯甲烷:乙醇(9:1，V/V)或乙酸乙酯:乙醇(9:1，V/V)为洗脱剂；工艺条件为：用乙醇溶解獐牙菜苦苷粗品，用獐牙菜苦苷粗品重量1.5倍的硅胶拌样，柱层析硅胶用量为獐牙菜苦苷粗品重量的20倍，湿法装柱，柱直径与柱高比约为1:5；以二氯甲烷:乙醇(9:1，V/V)或乙酸乙酯:乙醇(9:1，V/V)为洗脱剂洗脱，从第4个柱体积开始以三分之一柱体积为一个馏分分开接收，根据硅胶薄层板检测结果，收集和合并第5～10个柱体积中的獐牙菜苦苷馏分，得到獐牙菜苦苷纯品；

步骤四，重结晶精制，取獐牙菜苦苷纯品加入15倍量无水乙醇加热溶解过滤，放置到冰箱中(3℃)冷置过夜析出白色固体，过滤，少量无水乙醇洗涤，冷冻干燥后纯度可以达到97％，色泽浅白，无色素残留。

下面结合实验对本发明的应用效果做详细的描述。

取贵州獐牙菜干燥药材1.5kg，乙醇提取，用12升70％含水乙醇回流提取1次(1h)、再用12升50％含水乙醇回流提取1次(1h)，合并提取液，浓缩到无醇味后得贵州獐牙菜提取物。取预处理好的D101大孔树脂30kg用纯水湿法装柱，径高比为1:5，把无醇味的提取物从大孔树脂柱上方以2BV/h的流速通过并吸附于树脂上，关闭大孔树脂柱阀门并静止吸附8小时。先用纯水洗脱3BV集中接收，再用10％的乙醇/水洗脱15BV，以三分之一个BV分开接收各馏分，洗脱流速为2BV/h。经检测后收集合并10％乙醇/水洗脱液部分中含獐牙菜苦苷的馏分，浓缩回收溶剂后真空干燥得獐牙菜苦苷粗品117g(73.62％)。取硅胶G2.4kg湿法装于玻璃柱上，柱径高比1:5。取獐牙菜苦苷粗品乙醇溶解后用180g硅胶拌样，湿法装于硅胶柱上。以二氯甲烷:乙醇(9:1，V/V)为流动相进行洗脱，从第5个柱体积开始以三分之一柱体积为一个馏分分开接收，根据硅胶薄层板检测结果，收集和合并第6～10个柱体积中含獐牙菜苦苷的馏分，得到獐牙菜苦苷纯品(96g，84.57％)。取獐牙菜苦苷纯品加入1.5L无水乙醇加热溶解过滤，放置到冰箱中(3℃)冷置过夜析出白色固体，过滤，少量无水乙醇洗涤，冷冻干燥后得含量97.84％獐牙菜苦苷71g。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种贵州獐牙菜中獐牙菜苦苷的制备方法，其特征在于，所述贵州獐牙菜中獐牙菜苦苷的制备方法包括：

步骤一，大孔吸附树脂分离，取贵州獐牙菜提取物过滤，吸附于D101大孔树脂柱，吸附8小时后分别用纯水和10％乙醇/水洗脱；

步骤二，硅胶柱色谱纯化，硅胶G为柱填料，以二氯甲烷:乙醇＝9:1，V/V或乙酸乙酯:乙醇＝9:1，V/V为洗脱剂；

步骤三，重结晶精制，取獐牙菜苦苷纯品加入15倍量无水乙醇加热溶解过滤，放置到冰箱中冷置过夜析出白色固体，过滤，少量无水乙醇洗涤，冷冻干燥后纯度达到97％，色泽浅白，无色素残留。

2.如权利要求1所述的贵州獐牙菜中獐牙菜苦苷的制备方法，其特征在于，所述步骤一之前需要：乙醇提取，用70％含水乙醇以贵州獐牙菜药材重量的8倍量回流提取1次、再用50％含水乙醇以贵州獐牙菜药材重量的8倍量回流提取1次，从贵州獐牙菜提取獐牙菜苦苷，合并提取液回收溶剂至无醇味后得贵州獐牙菜提取物。

3.如权利要求1所述的贵州獐牙菜中獐牙菜苦苷的制备方法，其特征在于，所述步骤二的工艺条件为：大孔树脂用纯水装柱；树脂用量为贵州獐牙菜提取物重量的20倍；径高比为1:5；洗脱流速为2BV/h；先用纯水洗脱3BV，再用10％的乙醇/水洗脱15BV，经检测后收集合并10％乙醇/水洗脱液部分含獐牙菜苦苷的馏分，浓缩回收溶剂后真空干燥得獐牙菜苦苷粗品。

4.如权利要求1所述的贵州獐牙菜中獐牙菜苦苷的制备方法，其特征在于，所述步骤三的工艺条件为：用乙醇溶解獐牙菜苦苷粗品，用獐牙菜苦苷粗品重量1.5倍的硅胶拌样，柱层析硅胶用量为獐牙菜苦苷粗品重量的20倍，湿法装柱，柱径高比为1:5；以二氯甲烷:乙醇＝9:1，V/V或乙酸乙酯:乙醇＝9:1，V/V为洗脱剂洗脱，从第4个柱体积开始以三分之一个柱体积为一个馏分分开接收，根据硅胶薄层板检测结果，收集和合并第5～10个柱体积中含獐牙菜苦苷的馏分，得到獐牙菜苦苷纯品。