CN113577131A - 一种蒙药肋柱花提取物的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种蒙药肋柱花提取物的应用;所述蒙药肋柱花提取物在制备调节肠胃的药物中的应用。本发明所涉及的肋柱花提取物经化学成分检测结果,选择含量最高的獐牙菜苦苷,进而证明肋柱花提取物和獐牙菜苦苷对小鼠胃排空和小肠推进的影响,再用DA和5‑HT建立胃肠动力障碍模型,证明蒙药肋柱花提取物对神经递质紊乱性胃肠动力障碍疾病具有一定的影响。
Description
技术领域
本发明属于蒙药肋柱花提取物领域;尤其涉及一种蒙药肋柱花提取物的应用。
背景技术
肋柱花是一种蒙医特色药材。味极苦,具有平息“协日”、健胃、愈伤、清热 的功效,常用于治疗“协日”热、伤寒、黄疸、流感、中暑发热、瘟疫、肝胆热、 伤热、胃“协日”等病症。肋柱花也是蒙医治疗肝胆疾病的主要传统药物。曾研究 表明,它对消化不良、胆囊肿胀、黄疸和肝胆炎症有治疗作用。随后又发现蒙药肋 柱花的黄酮类化合物具有降低血脂和治疗肥胖的功能。此外,有研究报道,龙胆科 植物獐牙菜是治疗恶心、胃轻瘫、胃迟缓等胃肠疾病的传统药物。然而,肋柱花作 为蒙医特色药材对胃肠功能及机制方面的实验研究较少。
近年来,随着人们生活水平的改善,我国胃肠动力障碍性疾病的发病率越来越高,已经成为消化门诊的研究热点。胃肠动力是一种极其复杂的神经肌肉活动,它 能够保证人的正常消化功能,其胃肠动力紊乱可能会导致多种胃肠动力障碍疾病。 但随着现代医学的发展,越来越多的研究发现调节胃肠动力因素的多样性,主要包 括胃肠激素、肠道菌群、神经递质、一些蛋白和离子通道,除此之外苦味及其受体 也参与胃肠动力的调节。有研究报道,苦味物质苯甲地那胺可抑制胃排空,减少食 物摄入量,奎宁可抑制胃肠运动功能,影响胃动素和胃饥饿素的释放。
在消化门诊患者中,约40%的病人被确诊为胃肠动力障碍,这严重影响患者的 身体健康和生活质量。虽然市场上已经开发了许多治疗此类疾病的药物,如目前临 床上常用的多潘立酮,西沙比利等,但此类药物长期使用会引发心血管不良。研究 发现天然植物药对治疗胃肠疾病很有疗效,并且植物药副作用小,成本低,已有很 多研究者开始对植物药深入研究。据报道,诱导此类疾病的发病因素有很多,近几 年研究发现苦味及其受体可参与胃肠功能,调节胃肠动力。
苦味蒙药肋柱花作为治疗肝胆疾病传统植物药,在调节胃肠动力方面也有一定的作用。但是其作用机制未曾报道。
苦味化合物通过位于舌头味蕾和肠内分泌细胞中的T2Rs调节胃肠激素分泌和 胃肠运动。Vida Bitarafan等通过临床试验,在健康男性饮食中混合奎宁,观察血 糖反应、胃排空以及随后的能量摄入情况后,发现胃内给药奎宁可降低餐后血糖, 刺激胰岛素和GLP-1,但不会减慢胃排空或减少能量摄入。David Wicks等为了验 证功能性消化不良的恶心,呕吐与胃排空有关,给健康女性假喂苦味改良的瘦身棒 或带有愉快草莓味的棒,通过电阻抗断层扫描和胃电图无创性观察胃排空时间和胃 窦运动时间,发现与愉悦棒相比,苦味假喂组胃排空时间明显延长,认为令人不愉 快的苦味会延缓胃排空,但不会明显损害胃窦动力。
发明内容
本发明的目的是提供了一种蒙药肋柱花提取物的应用。
本发明是通过以下技术方案实现的:
本发明涉及一种蒙药肋柱花提取物的应用,蒙药肋柱花提取物在制备调节肠胃的药 物中的应用。
优选地,所述蒙药肋柱花提取物的制备,所述方法包括以下步骤:
步骤1,取肋柱花,粉碎、过筛,加二氯甲烷,回流提取,滤过;
步骤2,将滤液进行处理,回收二氯甲烷,滤渣中加入乙醇,回流提取,滤过,将 滤液进行处理,回收乙醇至浸膏状;
步骤3,将浸膏进行干燥,即可。
优选地,步骤1中,所述肋柱花与所述二氯甲烷的用量比为1:10。
优选地,步骤1中,所述回流提取的次数为2次,每次时间均为4小时。
优选地,步骤2中,所述回收的仪器为旋转蒸发仪RE-2010。
优选地,步骤2中,所述滤渣与所述乙醇的用量比为1:10。
优选地,步骤2中,所述回流提取的次数为2次,每次时间均为6小时。
优选地,步骤2中,所述乙醇的浓度为95wt%。
优选地,步骤3中,所述干燥的仪器为冷冻干燥机FD-1A-50。
优选地,步骤3中,所述干燥的时间为(3-5h),干燥的温度为(-50℃)。
本发明的原理:采用胃排空和小肠推进实验,验证苦味蒙药肋柱花对胃肠运动的调 节作用。为验证肋柱花提取物对胃肠功能的影响,根据肋柱花提取物的化学成分检测结果,选择含量最高的獐牙菜苦苷,证明肋柱花提取物和獐牙菜苦苷对小鼠胃排空和小肠 推进的影响,再用DA和5-HT建立胃肠动力障碍模型,证明蒙药肋柱花对神经递质紊乱 性胃肠动力障碍疾病具有一定的影响。
本发明具有以下优点:
(1)本发明利用Ach和CaCl2诱导离体回肠平滑肌,引起痉挛性收缩后发现,肋柱花提取物及其主要化学成分橙皮素和香豆素可显著抑制突发的痉挛性收缩,使收缩作用趋于正常态。故猜测肋柱花提取物对神经递质紊乱性胃肠动力障碍疾病可能有潜在的治疗作用,并且初步认为有效成分可能是橙皮素和香豆素。
(2)本发明所涉及的肋柱花提取物化学成分检测结果,选择含量最高的獐牙菜苦苷,证明肋柱花提取物和獐牙菜苦苷对小鼠胃排空和小肠推进的影响,再用DA和5-HT 建立胃肠动力障碍模型,证明蒙药肋柱花对神经递质紊乱性胃肠动力障碍疾病具有一定 的影响。
附图说明
图1是肋柱花提取物中的獐牙菜苦苷对小鼠的影响图;其中A为獐牙菜苦苷对小鼠的胃排空的影响图;B为獐牙菜苦苷对小鼠的小肠推进的影响图;
图2是肋柱花提取物对注射DA小鼠的影像图;其中A为对小鼠的胃排空的影响图;B为对小鼠的小肠推进的影响图;
图3是肋柱花提取物对注射5-HT小鼠的影像图;其中A为对小鼠的胃排空的影响图;B为对小鼠的小肠推进的影响图;
图4是小鼠不同部位离体小肠平滑肌收缩活动示意图;
图5是肋柱花提取物对小鼠离体回肠平滑肌的影响图;其中A为收缩振幅的影响图; B为频率的影响图;
图6是肋柱花提取物对小鼠离体回肠平滑肌的影响图;其中A为收缩振幅的影响图; B为频率的影响图;
图7是多次重洗均可恢复正常收缩状态图;
图8是肋柱花提取物对Ach诱导的小鼠离体回肠平滑肌的影响图;其中A为收缩振幅的影响图;B为频率的影响图;
图9是肋柱花提取物对CaCl2诱导的小鼠离体回肠平滑肌的影响图;其中A为收缩振幅的影响图;B为频率的影响图;
图10是HC和HP对Ach诱导的小鼠离体回肠平滑肌的影响图;其中A为收缩振幅 的影响图;B为频率的影响图;
图11是HC和HP对CaCl2诱导的小鼠离体回肠平滑肌的影响图;其中A为收缩振幅的影响图;B为频率的影响图;
图12是肋柱花提取物(LR)对gallein诱导的小鼠离体回肠平滑肌的影响图;其 中A为收缩振幅的影响图;B为频率的影响图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。应当指出的是,以下的实施实例只是 对本发明的进一步说明,但本发明的保护范围并不限于以下实施例。
实施例1
本实施例涉及蒙药肋柱花提取物的应用,蒙药肋柱花提取物对小鼠胃排空和小肠推 进的影响。
1.对正常小鼠胃排空和小肠推进的影响
取18只小鼠,随机分为3组,每组6只;
分别:正常对照组、肋柱花提取液低剂量组(1g·kg-1)、肋柱花提取液高剂量组(4g·kg-1)。
具体步骤为:各给药组灌胃给与相应的药物溶液0.1mL·10g-1,正常对照组给与等体 积的CMC-Na溶液。各组给药前禁食,不禁水16h。在第二天给药后5min,灌胃蓝色半 固体营养糊,灌胃体积为每只0.5mL,10min后,脱颈处死各组小鼠,迅速剖腹,取出 胃,用滤纸擦净后称胃全重,然后沿胃大弯剪开胃体,冲洗胃内容物后擦干,称胃净重。 同时立即取出小肠,轻轻剥离后直放在手术台布上,测量幽门至蓝色半固体营养糊推进 的距离及小肠全长。按以下公式计算胃蓝色半固体营养糊排空率和小肠推进率。胃蓝色 半固体营养糊排空率(%)=1-(胃全重-胃净重/胃全重)×100%;小肠推进率(%)=幽 门至蓝色半固体营养糊距离/小肠全长×100%。
结果:肋柱花提取物对正常小鼠胃排空和小肠推进率结果显示,与正常组相比,肋柱花提取物低剂量可促进胃排空(P<0.001),而高剂量组时延缓小鼠胃排空率,降低 小肠推进率(P<0.0001);獐牙菜苦苷也显著降低小鼠胃排空(P<0.01),而对小肠推 进率无明显影响(P>0.05)。獐牙菜苦苷对小鼠胃排空和对小肠推进的影响见图1所示, 数值为:平均值±标准误,每组六只小鼠。注:与正常组比较,**P<0.01,****P<0.0001 (n=4-6)。其中,A为獐牙菜苦苷对小鼠的胃排空的影响图;B獐牙菜苦苷对小鼠的小 肠推进的影响图。
2.对盐酸多巴胺(DA)所致小鼠胃排空和小肠推进抑制的影响
取24只小鼠,随机分为4组,分别为正常对照组、多巴胺模型组(1mg·kg-1)、 肋柱花提取物低剂量+DA组、肋柱花提取物高剂量+DA组。各给药组灌胃给于相应的 药物溶液0.1mL·10g-1,空白组给于等体积的CMC-Na溶液。各组给药前禁食,不禁水16 h。次日给药5min后,除正常对照组外,各组腹腔注射DA,5min后各组给蓝色半 固体营养糊,灌胃体积为每只0.5mL,10min后脱颈处死小鼠,计算胃蓝色液体饮食 排空率和小肠推进率。
结果:肋柱花提取物对腹腔注射DA所致胃肠动力障碍模型小鼠胃排空和小肠推进结果显示,见图2所示,数值为:平均值±标准误,每组六只小鼠。注:模型组与正常 组比较,#P<0.05;给药组与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01。与正常组相比,多巴 胺模型组的小鼠胃排空率和小肠推进率显著降低(P<0.05)。与DA模型组相比, 肋柱花提取物对DA所致小鼠胃蓝色半固体营养糊排空延迟有显著促进作用(分别 P<0.05、P<0.01)。
3.对五羟色胺(5-HT)所致小鼠胃排空和小肠推进亢进的影响
取24只小鼠,随机分为4组,分别为正常对照组、5-HT模型组(4mg·kg-1)、肋 柱花提取物低剂量+DA组、肋柱花提取物高剂量+DA组。各给药组灌胃给于相应的药 物溶液0.1mL·10g-1,空白组给于等体积的CMC-Na溶液。各组给药前禁食,不禁水16 h。次日给药5min后,除正常对照组外,各组腹腔注射5-HT,10min后各组给蓝色 半固体营养糊,灌胃体积为每只0.5mL,10min后脱颈处死小鼠,计算胃蓝色液体饮 食排空率和小肠推进率。
结果:肋柱花提取物对腹腔注射5-HT所致胃肠动力障碍模型小鼠胃排空和小肠推进结果显示,见图3所示,数值为:平均值±标准误,每组六只小鼠。注:模型组与正 常组比较,#P<0.05;给药组与模型组比较,*P<0.05,***P<0.001,****P<0.0001。5-HT 模型组与正常组相比,胃排空率显著增加(P<0.05)。与5-HT模型组相比,肋柱花提取 物高、低剂量均对小鼠胃蓝色半固体营养糊排空率和小肠推进率有显著降低的作用(分 别P<0.05、P<0.001、P<0.0001)。
本实施例用神经递质DA和5-HT建立了胃肠动力障碍模型小鼠,DA是肾上腺素 和去甲肾上腺素的前体,也是一种通过特异性受体发挥作用的神经递质,具有舒张 胃平滑肌、松弛肠管、扩张肠系膜、抑制胃体和胃窦的推进,使幽门收缩,延缓胃 排空等作用。由于DA在胃肠道中的分布很广,是一种重要的胃肠道神经递质,也 是胃肠道黏膜的保护因子之一。据药理学书中所记,DA主要激动α、β肾上腺素 和外周多巴胺受体,抑制胃体和胃窦的推进,使胃排空减慢。5-HT也是一种重要的 神经递质之一,主要分布于肠黏膜嗜铬细胞,具有促进胃肠壁收缩,促进胃肠蠕动 的作用。人体内此类神经递质增多也会引起很多胃肠动力疾病。经试验证明:肋柱 花提取物可促进DA引起的小鼠胃排空延迟和小肠推进;且对5-HT引起的促进胃 排空和小肠推进作用,具有抑制作用。所以,本发明所涉及的蒙药肋柱花可降低5-HT 增多而引起的胃肠动力障碍症状。
本发明采用不同浓度肋柱花提取物诱导小鼠胃排空和小肠推进率,惊喜的发现,肋柱花提取物1g/kg剂量可显著促进小鼠胃排空,而4g/kg剂量的肋柱花提取物延 缓小鼠胃排空,抑制小肠推进,故初步认为肋柱花提取物可能双向调节胃排空。本 发明还用肋柱花提取物主要苦味成分獐牙菜苦苷诱导后发现,獐牙菜苦苷0.2g/kg 剂量显著延缓胃排空。
综合上述,蒙药肋柱花可双向调节小鼠胃排空,即低剂量促进胃排空,高剂量 延缓胃排空,其抑制作用的有效成分可能是獐牙菜苦苷。并且与DA具有协同性; 可抑制5-HT增多而导致的胃肠疾病症状,其发病机制需进一步研究。本实验为临 床应用蒙药肋柱花改善胃肠动力障碍疾病提供实验依据。
实施例2
本实施例涉及蒙药肋柱花提取物的应用,蒙药肋柱花提取物对离体小肠平滑肌的作 用研究。
首先用Organ bath技术对小鼠小肠各个片段进行筛选,选出收缩活性较高的小肠片段。再根据第二章化学成分检测结果,选择含量较高的獐牙菜苦苷(ST)、獐牙菜苷 (SO)、京尼平苷酸(GA)、橙皮素(HP)和羟基香豆素(HC)等五种化学成分,验证蒙 药肋柱花提取物及其五种化学成分对离体回肠平滑肌的作用。利用Ach和CaCl2预处理 回肠平滑肌,导致痉挛性收缩,阐明肋柱花提取物与有效成分HP、HC对痉挛性收缩的 作用。苦味是即出六位之中的一味,由机体中25个T2Rs感知,从而调节多种生理功能。 此外,已经有研究证明了苦味物质对小肠平滑肌收缩的调节作用。因此本实验中我们利 用苦味抑制剂gallein验证了肋柱花苦味作用机制。
Organ bath是一种设计新颖、结构简单、使用便捷,易维护,可测定任何体外组织张力的先进仪器。目前Organ bath技术广泛应用于体外动力研究中,如体外平滑肌、 动脉血管环、子宫组织和输精管等。Ach是一种兴奋性神经递质由胆碱能神经释放,在 体内与胃肠平滑肌细胞上的M受体特异性结合,从而调节胃肠蠕动,促进胃肠道平滑肌 收缩。钙离子是一种重要的第二信使,可调控细胞运动、分泌、代谢和分化等功能,从 而调节胃肠平滑肌收缩和舒张功能。此外,有研究表明钙离子高浓度时收缩平滑肌,低 浓度时舒张平滑肌。
具体步骤如下:
一、实验材料与方法
健康雄性昆明种小鼠,SPF级,体重28-32g,购自辽宁长生生物技术股份有限 公司,实验动物使用许可证号SCXK(辽)2015-0001,饲养与SPF级实验动物室,温 度20±5℃,湿度40%-50%,自由进食和饮水,实验前适应性饲养至少7天,小鼠饲 料由辽宁长生生物技术股份有限公司提供。所有实验小鼠的处理根据中华人民共和 国国家科学技术委员会所修订的“实验动物伦理委员会章程”。
1、实验药品与仪器设备
具体见表1所示。
表1
2.溶液的配制
krebs液的配制:将6.2g NaCl,0.315g KCI,0.535g MgSO4,0.145g KH2PO4,1.87gNaHCO3,1.8g葡萄糖和0.011 CaCl2溶于1L蒸馏水混合均匀,现配现用。
药物配制:实验药物均用二甲基亚砜(DMSO)溶解,首先用DMSO将药物溶解为100mmoL/L,使用前用蒸馏水稀释至10mmoL/L。
3.离体肠道平滑肌条的制备和收缩性测定
取健康小鼠,禁食不禁水16h。颈椎脱臼处死,迅速沿腹正中线剖开腹部,取出小肠,放入含krebs液(通95%O2和5%CO2混合气体)的器皿中,剪去粘附在肠管的脂肪 组织,再将肠内容物冲洗干净,剪成1-1.5cm长的肠段备用。离体平滑肌张力记录:打 开RM6240E多道生理信号采集处理系统(成都仪器厂)并与JZ100张力换能器(北京新 航兴业科贸有限公司)连接,调零。KWB-05恒温循环水浴(北京金工鸿泰科技有限公司) 中加入蒸馏水,使水温保持在37.5℃。在浴槽中加入10mL krebs液,并持续通入95%O2和5%CO2混合气体。待仪器稳定后取肠管在其两端对角壁处用手术针穿线结扎,一端固 定在浴槽固定器上,另一端连接于L型张力换能器上,放入浴槽中,并适当调节换能器 的位置与高度,使离体肠段垂直悬浮于浴槽中央,避免与管壁内侧接触而影响实验结果, 并给与肠管1g左右的负荷,平衡30min。待肠管出现稳定的收缩活动后加入药物,记录 肠管收缩活动的变化情况,计算收缩振幅抑制率和收缩频率抑制率[12]。收缩振幅抑制 率(%)=1-给药后平均收缩振幅/给药前平均收缩振幅×100%;收缩频率抑制率(%)=1- 给药后平均收缩频率/给药前平均收缩频率×100%。
3.1小鼠离体小肠的取样部位考察
分别取小鼠不同部位离体小肠,即胃幽门部、十二指肠、小肠上端、小肠下段和回肠,各取1-1.5cm悬浮于含10mL krebs液的浴槽中,持续通入95%O2和5%CO2混合气 体,并给与1g负重,待肠管收缩稳定后,开始记录各个肠段的收缩振幅和频率,并比 较不同部位肠段的收缩活性差异,筛选出收缩振幅较强,活性较好,频率稳定的肠段。 结果图4,小鼠不同部位离体小肠平滑肌收缩活动示意图。
3.2肋柱花提取物及其主要化学成分对小鼠离体回肠收缩力的影响
根据检测的肋柱花提取物化学成分的结果,观察LR、ST、SO、GA、HP和HC(DMSO 配制)等对离体回肠平滑肌的影响。取肠管垂直悬浮于10mL krebs液的浴槽中,持续 通入95%O2和5%CO2混合气体,并给与1g负重,稳定30min。待离体肠管有稳定的收 缩活动后,利用浓度累加法微量累积加入肋柱花提取液(终浓度分别为0.1mg/mL、 0.3mg/mL、0.6mg/mL、1mg/mL、3mg/mL、6mg/mL,)和五种化学成分(终浓度分别达到 10uM、30uM、100uM、300uM、1mM、3mM),各浓度加药间隔为5min,同时设置空白组, 仅用含相同浓度的DMSO溶液进行实验。统计加药前1min和加药后1min的收缩曲线的 变化,并计算收缩幅度和频率变化率。
3.3肋柱花提取物对Ach和CaCl2诱导的小鼠离体回肠平滑肌收缩力的影响
待肠管收缩曲线稳定后,分别加入终浓度为0.1uM乙酰胆碱(Ach)和1mM CaCl2作用20min,再累积加入不同浓度的肋柱花提取物使其终浓度分别达到0.1mg/mL、 0.3mg/mL、0.6mg/mL、1mg/mL、3mg/mL、6mg/mL,每次加药间隔为5min,观察肋柱花提 取物对Ach和CaCl2诱导的痉挛性收缩的作用,并记录加药前1min和加药后1min的收 缩振幅和频率,计算收缩幅度和频率变化率。
3.4HC和HP对Ach和CaCl2诱导的小鼠离体回肠平滑肌收缩力的影响
待肠管收缩曲线稳定后,分别加入终浓度为0.1uM乙酰胆碱(Ach)和1mM CaCl2作用20min,再累积加入不同浓度的HC和HP使其终浓度分别达到10uM、30uM、100uM、 300uM、1mM、3mM,每次加药间隔为5min,观察HC和HP对Ach和CaCl2诱导的痉挛性 收缩的作用,并记录加药前1min和加药后1min的收缩振幅和频率,计算收缩幅度和频 率变化率。
3.5肋柱花提取物对苦味抑制剂gallein诱导的小鼠离体回肠的影响
待肠管收缩曲线稳定后,加入G蛋白βγ亚基抑制剂gallein(终浓度为75uM) 阻断T2Rs信号通路,阻断20min后,累积加入不同浓度的肋柱花提取物使其终浓度分 别达到0.1mg/mL、0.3mg/mL、0.6mg/mL、1mg/mL、3mg/mL和6mg/mL,每次加药间隔为 5min,观察肋柱花提取对gallein诱导的小鼠回肠平滑肌收缩力的影响,并记录加药前 1min和加药后1min的收缩振幅和频率,计算收缩幅度和频率变化率。
本实施例采用Graphpad prism 8.0.2统计分析软件进行数据的统计学分析处理。实验数据以平均值加减标准误(X±SEM)表示。实验中的两组数据比较采用t检验分 析,多组数据比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),两两比较采用最小显著性 差异(LSD)检验,P<0.05为差异有统计学意义。
二、结果
1、离体肠道平滑肌条的制备和收缩性测定
小鼠离体小肠不同部位平滑肌的自发收缩活动结果表明,回肠段的收缩振幅明显大 于胃幽门部、十二指肠和小肠上,下段;频率也比较稳定(见表2和图4)。
表2
肠段 | 振幅(g) | 频率(次/min) |
幽门部 | 0.156±0.027 | 27.00±1.140 |
十二指肠 | 0.181±0.155 | 24.33±3.445 |
小肠上端 | 0.138±0.096 | 22.50±1.643 |
小肠下段 | 0.171±0.093 | 20.50±2.345 |
回肠 | 0.319±0.225 | 17.50±1.378 |
2、肋柱花提取物及其主要化学成分对小鼠离体回肠收缩力的影响
2.1肋柱花提取物对小鼠离体回肠收缩力的影响
肋柱花提取物对离体回肠收缩力的作用如图5所示。与给药前相比,肋柱花提取物对小鼠离体回肠收缩力有双向调节作用,低浓度时兴奋肠管收缩(P<0.001),收缩率 在0.3mgmL时可达到45.10%;高浓度时抑制肠管收缩(分别P<0.001,P<0.0001)), 抑制率在6mg/mL时可达到83.21%;肋柱花提取物在低浓度时对肠管的收缩频率无明显 影响(P>0.05),随着药物浓度的增加抑制作用显著增强(分别P<0.05,P<0.0001), 抑制率在6mg/mL时可达到94.1%。
2.2肋柱花提取物主要化学成分对小鼠离体回肠收缩力的影响
肋柱花提取物中5种化学成分对小鼠离体回肠收缩力的作用如图6所示。与DMSO组相比较,ST,SO和GA对小鼠离体回肠平滑肌收缩振幅和频率均无显著差异(均P> 0.05);而HC和HP能够剂量依赖的抑制小鼠离体回肠的自发性收缩振幅(分别P<0.05, P<0.01,P<0.001,P<0.0001),并且随着药物浓度的增加对肠管收缩频率的抑制作 用增强,在3mM时抑制作用最强,分别可达到85.60%和72.73%;与DMSO组相比较,HC 和HP低浓度对收缩频率无明显影响(P>0.05),但随着浓度的升高抑制作用加强(分 别P<0.01,P<0.0001),在终浓度3mM时HC可完全抑制收缩频率HP的收缩频率抑制 率在3mM时可达到72.71%;但经过多次重洗均可恢复正常收缩状态(如图7)。
3.肋柱花提取物对Ach和CaCl2诱导的小鼠离体回肠平滑肌收缩力的影响
3.1不同浓度肋柱花提取物对Ach预处理后的小鼠离体回肠收缩活动的作用如图8所示。
由图8可见,加入0.1uM的工具药Ach干预后,小鼠离体回肠平滑肌的基线均有上升趋势,与加药前相比,回肠平滑肌收缩振幅(P<0.001)变化明显,具有显著差异, 而对收缩频率无影响;与Ach对照组相比,用不同浓度肋柱花提取物诱导后可显著抑制 Ach所致的收缩振幅和频率,并且随浓度的增加抑制作用增强(分别P<0.05,P<0.001, P<0.0001),终浓度为6mg/mL时对收缩振幅和频率的的抑制作用最强,其收缩振幅抑 制率为88.27%,收缩频率抑制率为94.92%。
3.2不同浓度肋柱花提取物对CaCI2预处理后的小鼠离体回肠收缩活动的作用如图9 所示。
由图9可见,预先用1mM CaCI2诱导后,小鼠离体回肠平滑肌的基线迅速上升,与加药前相比,回肠平滑肌收缩振幅(P<0.0001)和频率(P<0.0001)变化明显,具有 显著差异;与CaCI2对照组相比,加入不同浓度肋柱花提取物后,低浓度范围内对CaCI2所致痉挛性收缩无显著影响,但加到适当浓度时可显著抑制CaCI2所致的收缩振幅和频 率,并且随浓度的增加抑制作用增强(分别P<0.01,P<0.0001),终浓度为6mg/mL 时对收缩振幅和频率的的抑制作用最强,其收缩振幅抑制率为88.90%,收缩频率抑制率 为55.19%。
4.HC和HP对Ach和CaCl2诱导的小鼠离体回肠平滑肌收缩力的影响
4.1不同浓度HC和HP对Ach预处理后的小鼠离体回肠收缩活动的作用如图10所示。
由图10可见,加入0.1uM的工具药Ach干预后,小鼠离体回肠平滑肌的基线均有 上升趋势,与加药前相比,回肠平滑肌收缩振幅(P<0.01)变化明显,具有显著差异, 而对收缩频率无影响;与Ach对照组相比,用不同浓度HC和HP诱导后可显著抑制Ach 所致的收缩振幅和频率,并且随浓度的增加抑制作用增强(分别P<0.01,P<0.001,P <0.0001),终浓度为3mM时对收缩振幅和频率的抑制作用最强,其收缩振幅抑制率为 93.23%,收缩频率抑制率为90.48%。
4.2不同浓度HC和HP对CaCI2预处理后的小鼠离体回肠收缩活动的作用如图11所示。
由图11可见,预先用1mM CaCI2诱导后,小鼠离体回肠平滑肌的基线迅速上升,与加药前相比,回肠平滑肌收缩振幅(P<0.0001)和频率(P<0.0001)变化明显,具有 显著差异;与CaCI2对照组相比,加入不同浓度HC和HP后,低浓度范围内对CaCI2所致 痉挛性收缩无显著影响,但加到适当浓度时可显著抑制CaCI2所致的收缩振幅和频率, 并且随浓度的增加抑制作用增强(分别P<0.01,P<0.0001),终浓度为3mM时对收缩 振幅和频率的的抑制作用最强,其收缩振幅抑制率分别为90.96%和67.20%,而HC和HP 对收缩频率的作用不强,只在最高浓度3mM时抑制收缩频率,抑制率分别为67.15%和 65.40%。
5.肋柱花提取物对苦味抑制剂gallein诱导的小鼠离体回肠的影响
5.1不同浓度肋柱花提取物对G蛋白βγ亚基抑制剂gallein阻断回肠平滑肌苦味受体后的小鼠离体回肠收缩活动的作用如图12所示。
由图12可见,gallein对小鼠离体回肠平滑肌收缩力无影响(P>0.05);与肋柱花提取物组相比,用gallein诱导回肠平滑肌后,肋柱花提取物低浓度范围内的收缩肠管 作用消失(分别P<0.05,P<0.01),但对高浓度抑制肠管收缩作用无显著影响(P>0.05); 对肋柱花提取物抑制回肠平滑肌收缩频率作用无影响(P>0.05)。
胃肠平滑肌的运动受自主神经系统和分布于胃肠管壁内的壁内神经丛的支配,离体小肠平滑肌尽管失去了外来神经的支配,但壁内神经丛仍然存在,因此在一定 程度上离体小肠能独立地进行胃肠功能的调控。
本发明利用Organ bath技术首先考察了小鼠小肠各个片段的自发性收缩,发 现小鼠小肠各段均有节律性收缩活动,其中回肠段的收缩振幅最大。再用肋柱花提 取物诱导离体回肠平滑肌后惊喜的发现肋柱花提取物低浓度范围内(0.1-0.3mg/mL) 促进离体回肠平滑肌收缩振幅,而浓度达到0.4mg/mL以上时逐渐抑制离体回肠平 滑肌收缩振幅,直到完全舒张。故认为肋柱花提取物对回肠平滑肌具有双向调节作 用,并且双向调节结果与体内实验结果一致。这进一步验证了这一有趣的现象。“双 向调节作用”是指当机体处于失衡状态时,某一种药物可使机体从亢进状态向正常 状态转化,又可使机体从低下状态向正常状态转化,也就是让病态的机体趋于正常, 最终使机体达到正常平衡状态。据报道,中药和方剂在消化、泌尿、循环、呼吸、 神经、免疫等人体系统中均表现出双向调节作用。如,山楂可双向调节胃肠蠕动,对 便秘者可促进胃肠蠕动,而对腹泻者可延缓胃肠蠕动。徐佳蘅等利用Organ bath 技术进行了体外实验,发现不同浓度人参皂苷对离体蟾蜍心脏收缩运动有双向调节 作用,即在低钙任式液条件下,促进受到抑制的蟾蜍心脏收缩,但对高钙任式液诱 导后导致的强烈收缩,能够剂量依赖的抑制心脏收缩。由此可见,双向调节作用对 治疗机体各种疾病,提高临床疗效具有极其重要的意义。此外,Bert Avau等用苦 味物质苯甲地那铵诱导胃窦平滑肌发现,苯甲地那铵可双向调节胃窦平滑肌,但对 苯甲地那铵双向调节胃窦平滑肌收缩功能没有进一步阐释,推测收缩作用可能与钙 离子升高相关,舒张作用可能与激活ROCK通路相关。众所周知,研究已经证明苦 味物质通过T2Rs发挥重要的生理作用,并且T2Rs在肠道各个片段均有较高的表达。 因此为了验证苦味蒙药肋柱花调节胃肠动力的作用机制,本实验中用苦味受体抑制 剂gallein诱导回肠平滑肌,阻断T2Rs通路后发现,肋柱花提取物低浓度范围内 的收缩作用被明显抑制,故猜测肋柱花提取物的收缩肠管作用可能是通过T2Rs介 导的。
肠平滑肌自发收缩活动的产生和传导易受神经递质、胃肠激素等生物活性物质和药物的影响,如乙酰胆碱(Ach)、组胺及CaCl2等。Ach是一种兴奋性神经递质, 通过M受体激活受体调控型钙通道引起平滑肌收缩,促进胃肠蠕动。钙离子作为非 常重要的第二信使在胃肠运动中发挥重要作用,其细胞外钙离子内流和细胞内钙离 子释放是胃肠平滑肌细胞钙离子的主要来源。研究表明,胃肠平滑肌的收缩、舒张 运动受细胞内游离钙离子变化的影响,当细胞内钙离子升高到一定程度时会与肌钙 蛋白或肌钙调节蛋白结合,引起平滑肌收缩。本发明利用Ach和CaCl2诱导离体回 肠平滑肌,引起痉挛性收缩后发现,肋柱花提取物及其主要化学成分橙皮素和香豆 素可显著抑制突发的痉挛性收缩,使收缩作用趋于正常态。故猜测肋柱花提取物对 神经递质紊乱性胃肠动力障碍疾病可能有潜在的治疗作用,并且初步认为有效成分 可能是橙皮素和香豆素。
综合上述,肋柱花提取物可双向调节小鼠回肠,即低浓度收缩肠管,高浓度舒 张肠管,其作用机制可能部分通过T2Rs信号通路介导。此外肋柱花提取物对神经 递质紊乱引起的胃肠动力障碍疾病有潜在的治疗作用。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是,本发明并不局限于上 述特定实施方式,本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改, 这并不影响本发明的实质。
Claims (10)
1.一种蒙药肋柱花提取物的应用,其特征在于,蒙药肋柱花提取物在制备调节肠胃的药物中的应用。
2.如权利要求1所述的蒙药肋柱花提取物的应用,其特征在于,所述蒙药肋柱花提取物的制备,所述方法包括以下步骤:
步骤1,取肋柱花,粉碎、过筛,加二氯甲烷,回流提取,滤过;
步骤2,将滤液进行处理,回收二氯甲烷,滤渣中加入乙醇,回流提取,滤过,将滤液进行处理,回收乙醇至浸膏状;
步骤3,将浸膏进行干燥,即可。
3.如权利要求2所述的蒙药肋柱花提取物的应用,其特征在于,步骤1中,所述肋柱花与所述二氯甲烷的用量比为1:10。
4.如权利要求2所述的蒙药肋柱花提取物的应用,其特征在于,步骤1中,所述回流提取的次数为2次,每次时间均为4小时。
5.如权利要求2所述的蒙药肋柱花提取物的应用,其特征在于,步骤2中,所述回收的仪器为旋转蒸发仪RE-2010。
6.如权利要求2所述的蒙药肋柱花提取物的应用,其特征在于,步骤2中,所述滤渣与所述乙醇的用量比为1:10。
7.如权利要求2所述的蒙药肋柱花提取物的应用,其特征在于,步骤2中,所述回流提取的次数为2次,每次时间均为6小时。
8.如权利要求2所述的蒙药肋柱花提取物的应用,其特征在于,步骤2中,所述乙醇的浓度为95wt%。
9.如权利要求2所述的蒙药肋柱花提取物的应用,其特征在于,步骤3中,所述干燥的仪器为冷冻干燥机FD-1A-50。
10.如权利要求2所述的蒙药肋柱花提取物的应用,其特征在于,步骤3中,所述干燥的时间为(3-5h),干燥的温度为(-50℃)。
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